センサ
【課題】細胞分類方法及び装置を提供する。
【解決手段】精子細胞を分類・配向する装置は、導入口を有するフローチャンバーを形成する対向し合う一対の壁面と、下流側導出口と、中間検出領域とを備える。導入口は、導入流体による第１、第２の隔離した流れと、分類すべき細胞を含有する試料流体による第３の流れを受け取る。第１、第２の流れは、第３の流れが収縮して比較的狭い試料流れを形成しそれにより細胞が壁面に対して平行に配向されるような、第３の流れに対して相対的な流量をそれぞれ有している。検出器は所望の細胞を検出し、検出器の下流側の分類器は流れから所望の細胞を分類する。
【解決手段】精子細胞を分類・配向する装置は、導入口を有するフローチャンバーを形成する対向し合う一対の壁面と、下流側導出口と、中間検出領域とを備える。導入口は、導入流体による第１、第２の隔離した流れと、分類すべき細胞を含有する試料流体による第３の流れを受け取る。第１、第２の流れは、第３の流れが収縮して比較的狭い試料流れを形成しそれにより細胞が壁面に対して平行に配向されるような、第３の流れに対して相対的な流量をそれぞれ有している。検出器は所望の細胞を検出し、検出器の下流側の分類器は流れから所望の細胞を分類する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を分類するための、多角度判別可能な検出・撮像システムを用いた流量分類器に関する。本発明の別の側面は、光を検出して物体を撮像する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の撮像システムは、方位角的に対称的であることが多く、撮像システムの開口数（ＮＡ）により規定される特定の角度範囲内において光を受光する。光学系又は開口が過度に小さいことによる収差又は口径食がない状態では、ＮＡ範囲内の物体面から出射する光の全てが撮像面へと均一に、理想的に転送される。このような設計を行う理由は、適度に集光効率（即ち、ＮＡ）が高いことが望ましく、かつ、強度が角度により異なることには重要な情報が含まれないことが多いためである。
【０００３】
典型的な撮像システムとは、単一の円形レンズ又は一対の円形レンズである。撮像が不鮮明であるシステムの場合等、高集光率が望まれる場合には、物体の大きさに比較して大きく、自身の大きさに比較して近接した光学素子を用いて高ＮＡとなるシステムを設計する。この方法によると、光の多くの部分がレンズに受光される。高ＮＡであることは、分解能を最大化するためにも、また焦点深度を狭めるためにも重要である。
【０００４】
流量血球計算器は、光拡散及び蛍光発光を利用して細胞と、蛍光ビーズ等のその他の小物体とを判別し、判別した光の測定値に基づいて細胞を分類するデバイスである。物体が狭い噴流を流れるときに、そこへ導入したレーザー光が散乱して物体に衝突し、蛍光発光を生じる。散乱光と蛍光光の信号は多様な角度から検出され、物体を様々な特徴によって特性化して判別させる。
【０００５】
性別を分類するための精子の難点は、特にウシの精子のように、形状が扁平であることである。形状が扁平であることにより、ＤＮＡの屈折率が水性の環境に比較して高いことと重なって、精子頭部から出射する蛍光光も含め光がレンズ効果と内部反射を起こす。このレンズ効果により、光は精子の縁からの出射に偏り、精子頭部の二扁平面からの出射はずっと少ない。それゆえ、光強度の検出、及び精子がＸ、又はＹ染色体を含有するかの判別は、精子のアラインメントを信頼できる程度に行えること、及び精子の蛍光発光を多様な角度から観察できることに依存している。
【０００６】
既存のアラインメントシステムにおいては、たとえばＲｅｎｓらへ発行された米国特許５，９８５，２１６号に示すようなノズルにより、精子細胞を配向させて検出ゾーンへと吹き付けるデバイスが用いられる。このようなデバイスにおいて、当該分類ノズルは、扁平な細胞を配向させるために楕円形の断面を有している。Ｒｅｎｓにおける欠点は、流量が１秒当たり精子細胞が約５０００個より多いものである場合に、細胞を信頼できる程度に撮像して特性化することができないことである。１秒当たり精子細胞５０００個の精子流量では、効率が悪く時間を浪費する。精子を分類するためのより実際的な流量は、１秒当たり精子細胞約１００，０００個か、それより多い。
【０００７】
微粒子を操作するために用いる撮像システムの一形態が、２００４年１０月２８日出願の米国特許出願１０／９７４，９７６号、発明の名称「ホログラフィーによる光トラッピングを利用したナノ材料の操作・処理システム及び方法」、及び２００４年９月３日出願の米国特許出願１０／９３４，５９７号、発明の名称「レーザー運転による、粒子と細胞の多層流分離」に記載されており、両出願の開示を本明細書に参照として取り込む。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、細胞を分類するための、多角度判別可能な検出・撮像システムを用いた流量分類器に関する。本発明の一側面は、光を検出して物体を撮像する方法及び装置に関する。特に、本発明は、ウシ精子を性別により特性化かつ分類する方法及び装置に関する。しかし、本発明を用いてその他の種の哺乳類の精子細胞等を分類してよいことは理解されるべきである。
【０００９】
本発明は、細胞を分類・配向する流量分類器は、導入口を有するフローチャネル、導出口、中間検出領域、及び、任意に分類領域を用いるという発見に基づく。導入口は、導入シース流体による互いに離れた複数の流れと、複数のシース流れの間の分類すべき細胞を含有する試料流れとを、互い違いに受け取る。シース流れと試料流れは、試料流れが収縮して検出領域において比較的狭い試料流れとなり、それによって細胞が入力光に対して選択した方向に配向されるような、流量又は圧力をフローチャンバー内においてそれぞれ有する。多角度、又はＫベクトルによる撮像装置を採用した検出器が、検出領域において所望の細胞と所望でない細胞とを判別するために設定されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
図１は、物体を、特にウシ精子細胞を、低温保存することを目的として、特性化、分類、及び処理するための工程を説明するフロー図を示す。
【００１１】
収集１００から、伸長１０１、低速冷却１０２までの第１段階は、多様な方法における題目であり、それら方法のうちいくつかは新規であり、その他は既知である。
【００１２】
分類すべき細胞を用意するための新規なシステムが、２００５年２月１日出願の米国同時係属出願（願番未付与）、発明の名称「細胞を生体内染色して同定・分類するための新規な方法」に記載されており、当出願の開示を本明細書に参照として取り込むものとする。
【００１３】
工程には、試料を使い捨てチップに盛ること２００、試料をろ過して卵黄会合体等の大きな会合体材料を除去すること２０１、以下に述べる流量に基づくアラインメントを用いること２０２、並列的に性別の検出２０３、識別（即ち、性別識別２０４）、及び駆動（即ち、性別駆動２０５）を行うこと、受動的濃縮と均衡化を行うこと２０６、及び出力容器へと送出すること２０７が含まれる。本方法においては、任意にいくつかの工程を省き、生きた精子の所望でないものを判別し死滅させて除去する工程を含めてよい。
【００１４】
上述の工程を含む性別分類工程１０３の後には、摂氏４度へと低速冷却して沈殿させる工程１０４、最終伸長１０５、ストロー詰め１０６、沈殿１０７、及び冷凍１０８の工程が続く。
【００１５】
図２及び図３においては、本発明に係る流量血球計算器３００を多様な形態において示す。このデバイスは、単一チャネルシステムであってよい。しかし、本発明は、特に大量の精子細胞を適度な長さの時間内に分類しなければならない精子細胞分類用途においては、マルチチャネル用法にも十分に対応している。
【００１６】
図２及び図３において、デバイス３００は、一対の対向面３１４、一対の端面３１６（そのうちの一方のみを図１に示す）、開放上面すなわち導入口３１８、及び開放底面すなわち導出口３２０から形成される本体すなわちフローチャンバー３１２を備える。
【００１７】
導入口３１８は、複数の外面側導入口３２２、及び中央すなわち試料導入口３２４を含む３つの部分に分割されている。外面側導入口３２２は、シース流体３２６を内部に受け入れ、中央導入口３２４は液状媒質及び細胞３３０を分散させた試料流体３２８を受け入れる。
【００１８】
導出口３２０は、複数の外面側導出口３３２、及び複数の中央試料回収チャネル、つまり、左側導出試料チャネル３３４Ｌ、中央導出試料チャネル３３４Ｃ，及び右側導出試料チャネル３３４Ｒを備える。チャネル３３４Ｌは第１分類試料用であり、３３４Ｃは第２分類試料用であり、３３４Ｌは更に別の分類の試料用である。
【００１９】
シース流体３２６は、選択した流量にて外面側導入口３２２から導入される。試料流体３２６は、シース流体により試料流が圧縮・収縮されて図示するように比較的狭い試料流路３３６を取るようにシース流量又は圧力に対して相対的に選択された流量又は圧力にて中央導入口３２４に導入される。典型的な実施形態において、試料流路３３６の幅は、中央導入口３２４での試料流体の幅の約１０％以下であり、たとえば約５０ミクロンである。
【００２０】
細胞３３０は円形であるが、扁平である。その結果、試料流体が収縮することにより、細胞３３０はその扁平面がほぼ対向面３１４に平行になるよう向きが定まる。向きが異なれば細胞から出射する光の強度は変わる。２又はそれより多くの細胞の強度を比較するためには、細胞に同一の向きを持たせなければならない。それゆえ、向きにバラツキのある異方性の光出射体が存在することにより生じるノイズ又は定誤差は、細胞をアラインメントすることにより減少する。
【００２１】
互い違いに導入するシース流体３２６及び試料又は物体含有溶液３２８（図３参照）はシステムに入り、少量の収縮（直交方向での収縮に比較して）４０１を起こし、それによりせん断が生じ、当該せん断流により細胞４００がアラインメントされる。この互い違いの流れパターンによると、長いシース流体流を２本導入するとその２本の間ではより激しい収縮が起き、それにより必要なアラインメントが達成される。この処理を以下に述べる検出と組み合わせて、何本もの流れを検査する並列的システムを提供してよい。
【００２２】
具体的には、収縮流は物体が焦点面４０２へと移動させ、検出領域４０３の通過を速める。システム内の曲線４０４は流体の境界線４０４を示しており、検出領域４０５において特性化が行われる。光円錐４０６により検査が可能であり、既定の導出位置４０７は複数の導出口の間で移動することができる。
【００２３】
３つの導出チャネル４０９〜４１１内でそれぞれ流量を変えることにより、溶液内の細胞又はその他の物体を複数の導出流のうちの一つに分類することができる。駆動は、先に挙げたように多様な方法にて行うことができる。装置、又は使い捨ての流れチャネルカートリッジに備えてよい圧電素子によって高速の流れ切り替えを行ってよい。流れ切り替え領域４０８においては、精密に流量が制御され、流量を経時的に変えて導出チャネル４０９〜４１１間で切り替える（但し、Ｖ２＜Ｖ１、Ｖ４〜ｖ２）。
【００２４】
検出器３４０（図２）は、導入口と導出口との間の検出域３３８において試料流路３３６に向けられる出力ビーム３４４を発生するレーザー３４２又はその他の適切な出力源を備える。ビーム３４４は検出域３３８において細胞３３０に衝突して散乱し、出力ビーム３４６となる。細胞は蛍光物質を含んでいるので蛍光光を発生し、それは出力ビーム３４６に含まれる。出力ビーム３４６の散乱蛍光成分３４６Ｓ及び３４６Ｆのそれぞれは、光学システム３４８及び電子検出システム３５０を含む光検出器へと入力される。光学システム及び電子検出システムは、後に説明する。
【００２５】
出力ビーム３４６により検出器３４０へと情報が運ばれ、検出器３４０は細胞３３０を判別して分類器３５６への出力３５４を生成する。分類器３５６は、各細胞３３０がふさわしいチャネルへと分類されるように流量比を切り替える目的で、導出チャネル３３４と動的に連携するようにドライバ３５８を制御する。又は、細胞を要不要により分類して、必要な細胞を回収し不要な細胞を破壊してもよい。
【００２６】
図３は、２つのシース流源３２６と１つの試料流源３２８のみを備える単一チャネルシステムを示す。図４は、４つの試料流源３２８と共有シース流源３２６を備えるマルチチャネルシステムを示す。図４Ａは、フローチャンバーと流路の上面図を示す。
【００２７】
図４及び図４Ａにおいては、導入する溶液を多数の平行流５００とするための並列的設計の一つの可能な方法を示す。流れは平面方向においても、平面の垂直方向においても収縮する。しかし、ウシ精子等のように、細胞のアラインメントが必要である場合、入射光の垂直方向のアラインメントを確保するためには、入射光方向に沿ったせん断はより大きくなければならない。光検査領域５０２は、レーザーの散乱と蛍光発光が生じる場所である。
【００２８】
本例においては、各シースに、専用のレンズシステムと、各々対応の流れに用いられる複数のＰＭＴ素子が用意されている。本システムにおいては、全てのチャネルに対して１つのレンズ検出システム、同様に全てのチャネルに対して１つのレーザー光システムを用意してもよいことが理解されるべきである。各流れが取り得る導出チャネル５０３が複数ある。
【００２９】
検出器６４０の光学システムの簡単な上面図を図５に示す。試料６６０は対物面６６２内にある。この図において、出力ビーム、すなわち光線６４６は試料６６０からビームレット６４６Ｃ、６４６Ｌ、及び６４６Ｒとして発散する。ビームレット６４６Ｃは、中央光軸Ｃ近傍の中央部のビーム団であり、ビームレット６４６Ｌ及び６４６Ｒは中央軸Ｃの左側及び右側に集まっている。ビームレットにより、試料６００の様々な面が観察される。集光レンズ６６４（顕微鏡の対物レンズであってよい）は、対物面６６２から、レンズの有効焦点距離（ＥＦＬ）に等しい距離を置いて設置される。レンズ６６４は、望ましいのであれば複合レンズであってよいが、簡略化の目的で、ＥＦＬを有する単体レンズとして示されている。このようにレンズ６６４を位置付けることにより、物体からの光６４６は集光レンズ６６４を出射し、図示のように同様に６６６Ｒ、６６６Ｃ、６６６Ｌに分割された平行なビームレット６６６となる。これにより、撮像システム内に無限空間が形成される。本発明においては、この無限空間は必須ではないが、便利な構成である。各々の平行光の横方向の位置付けは、対物面から進行してきた角度により主に決定される。ビームレット６６６Ｌ、６６６Ｒ、及び６６６Ｃはそれぞれビームレット６４２ｌ、６４２Ｒ、及び６４２Ｃに連続している。
【００３０】
中央光ビームレット６６６Ｃは、レンズ６６４を中央軸Ｃに沿って出射し、光を前方の画像プレーン６８０Ｃへと集中する集束レンズ６７６Ｃに到達する。ミラー６７２Ｌ及び６７２Ｒにより、集光レンズ６６４を出射した軸上にないビームレット６６６Ｌ及び６６６Ｒが分離される。これを、当該領域におけるビームの大きさに比較して小型の検出器６７４Ａ（図５Ａ）、又は光ファイバー６７４Ｂ（図５Ｂ）を当該領域に設置することによって実現してもよい。また、集光レンズ６６４から出射する光の角度範囲を制限するための、又は共焦点顕微鏡測定におけるように光を集める焦点深度を制御（再設定、又は拡大）するための、付加的レンズ６７４Ｃ（図５Ｃ）、又はピンホール６７４Ｄ（図５Ｄ）等の、付加的な光学素子を当該領域に挿入してもよい。状況によっては、一対の付加的レンズをピンホールとともに用いてよい。その他の場合においては、大きさ、形状、又は位置の調整が可能なマスクを用いて所定の検出器に到達する光を制御してよい。
【００３１】
ビームレット６６６Ｌの光はミラー６７２Ｌにより屈折して左側集束レンズ６７６Ｌに到達し、ビームレット６６６Ｒの光はミラー６７２Ｒによりレンズ６７６Ｒ及び右側画像プレーン６７８Ｒへと方向付けられる。光検出器６８０Ｌ，６８０Ｒ，及び６８０Ｃを各画像焦点プレーン６７０Ｌ，６７０Ｒ，及び６７０Ｃに設置して各像を検出してよい。これらの光検出器は、ＣＣＤ、光ダイオード、光電子増倍管、マルチアノード光電子増倍管、又はその他のセンサであってよい。
【００３２】
多くの場合、散乱光と蛍光光の両方を回収することが望ましく、得られる画像又は検出結果の少なくとも１つにおいて、試料からの光線の角度範囲が減少していなければならない。図６において、上述のようなＫベクトル撮像装置を、必要に応じてフィルターとビームスプリッタとともに用いて、これを達成する方法を示す。類似の要素には同一の参照番号を付す。
【００３３】
図６において、照明・励起光８００は、集光レンズ８０１を透過し、ミラー８０２又は８０３で反射して放射フィルター６８８ＥＬ又は６８８ＥＲを介して集束レンズ８０４又は８０５、及び左側又は右側蛍光画像プレーンを構成する光検出器６９０Ｌ又は６９０Ｒへとそれぞれ到達する。
【００３４】
６８６Ｃにおけるビームスプリッタは、中央フィールド６６６Ｃにおいて光を方向付け直して、放射フィルター６８８Ｅを介して集束レンズ６７６ＦＣへと到達させる。放射フィルター６８８Ｅからの出力６８９Ｅは、細胞からの蛍光発光の放射に対応する。中央光軸内のレーザー線フィルター６８８Ｌが散乱レーザー光をフィルタリングしてレンズ６７６Ｃ、及び前方散乱光画像プレーンが形成されている光検出器６９０Ｃへと導く。
【００３５】
デバイスの処理量と全般的性能を向上するためには、並列化が望ましい。図７にこれを実現する方法を示す。レーザー６４２が入力レーザービーム６４４を放射し、入力レーザービーム６４４は蛍光発光を励起してビームスプリッタ６９０（たとえば、回折格子、又はホログラム）によりＮ個のビームへと分割される。ビーム６９２Ａと６９２Ｎは扇状に散開してそれぞれ対応する試料シース（図４参照）の検出域へと方向付けられる。ビームレット６９２Ａ〜６９２Ｎは平行化レンズ６９４により平行なビームとなるよう平行化される。平行化レンズ６９４からの出力６９６は円筒状レンズ６９８を通過して方向付けられ、円筒状レンズ６９８により各ビーム７００Ａ〜７００Ｎは対物面７０１において試料流へと集中する。図示のように、（図４）、導入した流れは多くの流れへと分割される。図示例におけるビームレット７００Ａ〜７００Ｎの１つ又は全ての光と試料流は集光レンズ７０２Ｋへと進入して、図６おいて上述した通りに処理される。しかし、本例においては、検出器アレイデバイス（マルチアノードＰＭＴ等）デバイス７２０（７２０Ｃ、７２０Ｒ、７２０Ｌ、７２０ＣＦ...）を各検出ビーム群につき１つ用いる。最良の検出は、各撮像位置に単一の検出器を設置することによってではなく、３２要素の直線ＰＭＴアレイ７２０等の、アレイ状検出器を採用することにより達成される。
【００３６】
多くの物体を撮像又は測定するシステムの処理量は、部分的には検出器の数とそれらの速度に依存する。多くの用途においては、各画像プレーンにつき光電子増倍管（ＰＭＴ）等の検出器を１つ用いる。これは、物体が対物面を一列に並んで通過する場合に適する。
【００３７】
分類器８５６を以下に詳述する。単一チャネル分類器を図８に示す。分類器８５６は、構造部材８１２、フローチャネル８２０を規定するスロット８１８が形成されたチャネル規定層８１６、チャネル規定層８１６上の柔軟膜層８２２、構成を完成させる構造部材８２４を備える。圧電性の、又はその他の種類のアクチュエータ８２６がコントローラ８２８に接続される。アクチュエータ８２６により駆動されるピストン８６０がフローチャネル８２０に対向する部分において柔軟膜８２２に陥入し、圧電への電圧供給に従ってチャネル内での流れパターンを変化させる。複数のこのような構造を小型化してアクチュエータの窓部に設置し、それにより複数本の試料流を分類してよい。
【００３８】
１つ、又はそれより多いアクチュエータ８２６は、電気信号を流量の機械的駆動力に変換する圧電変換器、流体、材料、又は気泡をすばやく膨張させるために領域を加熱するヒータ、溶液流を収縮するための気泡を形成する熱気泡生成、膜の容量運動デバイス、材料、壁面、膜、気泡、又はその他の材料又は物体を加熱し、又は動かして流れの速度に作用を与えて１つ又はそれより多くの導出チャネル９３４へと到達させる光学デバイスを含んでよい。駆動力を、デバイスに備えてよく、又は外部から印加してよい。たとえばアクチュエータ８２６とピストン８６０は、使い捨てのフローデバイス８５６から独立した外部装置であってよい（つまり、使い捨てチップと使い捨てでない外部アクチュエータ）。
【００３９】
図９は、導入チャネル９００からフローチャネルへとシース流を供給し、導出チャネル９０１において様々に分類された精子細胞を受け取る、マルチチャネル並列構成を示す。並列検出器の各試料チャネルへと検査光をつなぐことを目的として、窓９３０が設けられる。分類窓９３２に、複数のアクチュエータと使い捨て分類エレメントを設置する。デバイス１００のチップ登録ピンを９４０として特定する。
【００４０】
図１０Ａ〜図１０Ｒは、精子を分類するフローデバイスにおいて多様なアクチュエータ９３４を用いた、細胞を案内するための別の実施形態を示す。各ケースにおいて、１つ又はそれより多くのアクチュエータが用いられており、各アクチュエータは、圧電素子（カートリッジに内在又は外在）、容量アクチュエータ、熱膨張、又は先行開示に記載のその他の技術に基づいてよい。多くの場合、特定の細胞又は物体がどの導出チャネル９３６へと進入するかを制御するには、少なくとも２つのアクチュエータ９３４が望ましく、また２つより多くのアクチュエータが望まれる可能性もある。アクチュエータにより、流れを大変高速に制御及び変化することが可能となる。流れを一時的に一つの導出口から別の導出口へと転じるには、流れへの微小な摂動のみが必要である。
【００４１】
図１１Ａ〜図１１Ｂは、分類を行わずに、所望の結果を得るための殺細胞又は活性化装置の例を示す。図１１Ａにおいて、レーザー９４０は、物体・精子流９４２に衝突する。このレーザーは、検査の結果に基づいて、特定の精子又は物体にのみ致死的エネルギーを衝突させるように制御される。たとえば、このレーザーにより、所望のとおりに特定の精子又は他の細胞を死滅させてよい。たとえば、所定の性別の、又は性別が不確定な精子を全て死滅させてよい。または、レーザーにより細胞を直接的に死滅させずに、反対に「活性化」してよい。たとえば、事前に精子に導入したある種の化学物質を活性化することにより、全体の結果としては、精子を死滅させるか又は受精能力を弱めることもできる。より一般的な用途においては、活性化にはより多様な操作を含めてよい。
【００４２】
図１１Ｂは、中央流９４２に局所的に接触させる目的で流れへと差し込まれる電極９４４を通じて導入される致死電気パルスを用いる殺細胞又は活性化を示す。レーザーによる方法においてと同様に、電極は検査結果に基づいてすばやく発振・停止させることができる。
【００４３】
細胞を光トラッピング装置により操作する光学的案内を行ってもよい。または、駆動処理を、細胞を死滅させるか又はその他の効果を与え得る、細胞の電気穿孔により行ってよい。
【００４４】
以下の技術においては、収縮流を用いて精子細胞をアラインメントする。
【００４５】
蠕動ポンプを用いて３本の流れをフローチップへ供給した。流れが互いに交じり合わないように各流れを層流態勢に維持した。精子含有流は、水である上層流と下層流との間を流れる。上層及び下層の流れの速度を互いに等しく保ちつつこれらの精子流に対する比を変化させることにより、精子流の収縮を観察することができた。
【００４６】
収縮流により精子が流れ方向へと配向されることが想定される。
【００４７】
流れの中の精子の画像を、我々の顕微鏡に装備されたＣＣＤカメラにより撮影した。
【００４８】
上の表は、流れの中の精子配向の角度を示しており、Ｒｅは、Ｄがフローチャネルの直径、Ｕが速度、ｒが流体の密度、ｍが粘性であるＤｕｒ／ｍとして定義されるレイノルズ数である。
【００４９】
Ｒｅにより、流れが層流であるか否かが示される。１０００未満のＲｅである場合には層流であると考えられるが、ある用途においてはたとえば１未満等の大変に小さいＲｅが要求される。
【００５０】
精子流の速度が増大するにつれ、チャネル導入部のＲｅは増大するが、層流を得られる範囲に維持されており、我々の実験範囲では流れは妨げられないことを示している。
【００５１】
精子配向を、これらを精子頭部の流れ方向に対するアラインメント角度関数として数値化することにより定量化した。
【００５２】
実験範囲においては、撮像した精子の約８０％が流れ方向に対して１５度未満に配向された。
【００５３】
より高い速度においては、流れ方向に対してより良好なアラインメントが示されたが、損傷した精子がより多く観察された。
【００５４】
この結果により、本システムが当該技術を用いて精子をアラインメントすることができたことが示される。
【００５５】
精子を延命する目的でシース流体と試料流体の温度管理を行うことができることが理解されるべきである。典型的実施形態においては、精子細胞の動きを封じて寿命を延長する目的で、フローデバイス内での流体温度を約摂氏２〜１０度に維持してよい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】蛍光染料で着色した細胞を分類するための工程のフロー図である。
【００５７】
【図２】本発明に係るフローデバイス又はカートリッジの斜視概略図である。
【００５８】
【図３】分類用の単一チャネルフローデバイスの概略図である。
【００５９】
【図４】分類用のマルチチャネルフローデバイスの側面図である。
【００６０】
【図４Ａ】図４に示すマルチチャネルシステムの導入口に面した上面（境界）図である。
【００６１】
【図５】散乱光を検知するための単一チャネルセンサ（つまり、Ｋベクトル撮像のための光学システム）の概略図である。
【００６２】
【図５Ａ−５Ｄ】図５の構成に採用する別の光学素子を示す。
【００６３】
【図６】Ｋベクトル撮像を用いて蛍光光と散乱光を検出する単一チャネルセンサの概略図である。
【００６４】
【図７】散乱光と蛍光光の励起と検出を行うＫベクトル撮像のためのマルチチャネルデバイスである。
【００６５】
【図８】細胞を分類するチャネル又はデバイス内の流速を調整する外部アクチュエータの概略図である。
【００６６】
【図９】細胞を検出・分類するマルチチャネルデバイス又はカートリッジの上面の概略図である。
【００６７】
【図１０Ａ−１０Ｄ】Ｍ、Ｗ、Ｆに３つのアクチュエータ（図１０Ａ）、Ｓ１、Ｓ２に２つのアクチュエータ（図１０Ｂ）、Ｓ１に１つのアクチュエータ（図１０Ｃ）、Ｍ、Ｆに２つのアクチュエータ（図１０Ｄ）を用いて細胞を案内する多様な代替的方法を示す。
【００６８】
【図１１Ａ−１１Ｂ】レーザー死滅又は活性化（図１１Ａ）と、電気死滅又は活性化（図１１Ｂ）による細胞を死滅させるための多様な代替的方法を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を分類するための、多角度判別可能な検出・撮像システムを用いた流量分類器に関する。本発明の別の側面は、光を検出して物体を撮像する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の撮像システムは、方位角的に対称的であることが多く、撮像システムの開口数（ＮＡ）により規定される特定の角度範囲内において光を受光する。光学系又は開口が過度に小さいことによる収差又は口径食がない状態では、ＮＡ範囲内の物体面から出射する光の全てが撮像面へと均一に、理想的に転送される。このような設計を行う理由は、適度に集光効率（即ち、ＮＡ）が高いことが望ましく、かつ、強度が角度により異なることには重要な情報が含まれないことが多いためである。
【０００３】
典型的な撮像システムとは、単一の円形レンズ又は一対の円形レンズである。撮像が不鮮明であるシステムの場合等、高集光率が望まれる場合には、物体の大きさに比較して大きく、自身の大きさに比較して近接した光学素子を用いて高ＮＡとなるシステムを設計する。この方法によると、光の多くの部分がレンズに受光される。高ＮＡであることは、分解能を最大化するためにも、また焦点深度を狭めるためにも重要である。
【０００４】
流量血球計算器は、光拡散及び蛍光発光を利用して細胞と、蛍光ビーズ等のその他の小物体とを判別し、判別した光の測定値に基づいて細胞を分類するデバイスである。物体が狭い噴流を流れるときに、そこへ導入したレーザー光が散乱して物体に衝突し、蛍光発光を生じる。散乱光と蛍光光の信号は多様な角度から検出され、物体を様々な特徴によって特性化して判別させる。
【０００５】
性別を分類するための精子の難点は、特にウシの精子のように、形状が扁平であることである。形状が扁平であることにより、ＤＮＡの屈折率が水性の環境に比較して高いことと重なって、精子頭部から出射する蛍光光も含め光がレンズ効果と内部反射を起こす。このレンズ効果により、光は精子の縁からの出射に偏り、精子頭部の二扁平面からの出射はずっと少ない。それゆえ、光強度の検出、及び精子がＸ、又はＹ染色体を含有するかの判別は、精子のアラインメントを信頼できる程度に行えること、及び精子の蛍光発光を多様な角度から観察できることに依存している。
【０００６】
既存のアラインメントシステムにおいては、たとえばＲｅｎｓらへ発行された米国特許５，９８５，２１６号に示すようなノズルにより、精子細胞を配向させて検出ゾーンへと吹き付けるデバイスが用いられる。このようなデバイスにおいて、当該分類ノズルは、扁平な細胞を配向させるために楕円形の断面を有している。Ｒｅｎｓにおける欠点は、流量が１秒当たり精子細胞が約５０００個より多いものである場合に、細胞を信頼できる程度に撮像して特性化することができないことである。１秒当たり精子細胞５０００個の精子流量では、効率が悪く時間を浪費する。精子を分類するためのより実際的な流量は、１秒当たり精子細胞約１００，０００個か、それより多い。
【０００７】
微粒子を操作するために用いる撮像システムの一形態が、２００４年１０月２８日出願の米国特許出願１０／９７４，９７６号、発明の名称「ホログラフィーによる光トラッピングを利用したナノ材料の操作・処理システム及び方法」、及び２００４年９月３日出願の米国特許出願１０／９３４，５９７号、発明の名称「レーザー運転による、粒子と細胞の多層流分離」に記載されており、両出願の開示を本明細書に参照として取り込む。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、細胞を分類するための、多角度判別可能な検出・撮像システムを用いた流量分類器に関する。本発明の一側面は、光を検出して物体を撮像する方法及び装置に関する。特に、本発明は、ウシ精子を性別により特性化かつ分類する方法及び装置に関する。しかし、本発明を用いてその他の種の哺乳類の精子細胞等を分類してよいことは理解されるべきである。
【０００９】
本発明は、細胞を分類・配向する流量分類器は、導入口を有するフローチャネル、導出口、中間検出領域、及び、任意に分類領域を用いるという発見に基づく。導入口は、導入シース流体による互いに離れた複数の流れと、複数のシース流れの間の分類すべき細胞を含有する試料流れとを、互い違いに受け取る。シース流れと試料流れは、試料流れが収縮して検出領域において比較的狭い試料流れとなり、それによって細胞が入力光に対して選択した方向に配向されるような、流量又は圧力をフローチャンバー内においてそれぞれ有する。多角度、又はＫベクトルによる撮像装置を採用した検出器が、検出領域において所望の細胞と所望でない細胞とを判別するために設定されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
図１は、物体を、特にウシ精子細胞を、低温保存することを目的として、特性化、分類、及び処理するための工程を説明するフロー図を示す。
【００１１】
収集１００から、伸長１０１、低速冷却１０２までの第１段階は、多様な方法における題目であり、それら方法のうちいくつかは新規であり、その他は既知である。
【００１２】
分類すべき細胞を用意するための新規なシステムが、２００５年２月１日出願の米国同時係属出願（願番未付与）、発明の名称「細胞を生体内染色して同定・分類するための新規な方法」に記載されており、当出願の開示を本明細書に参照として取り込むものとする。
【００１３】
工程には、試料を使い捨てチップに盛ること２００、試料をろ過して卵黄会合体等の大きな会合体材料を除去すること２０１、以下に述べる流量に基づくアラインメントを用いること２０２、並列的に性別の検出２０３、識別（即ち、性別識別２０４）、及び駆動（即ち、性別駆動２０５）を行うこと、受動的濃縮と均衡化を行うこと２０６、及び出力容器へと送出すること２０７が含まれる。本方法においては、任意にいくつかの工程を省き、生きた精子の所望でないものを判別し死滅させて除去する工程を含めてよい。
【００１４】
上述の工程を含む性別分類工程１０３の後には、摂氏４度へと低速冷却して沈殿させる工程１０４、最終伸長１０５、ストロー詰め１０６、沈殿１０７、及び冷凍１０８の工程が続く。
【００１５】
図２及び図３においては、本発明に係る流量血球計算器３００を多様な形態において示す。このデバイスは、単一チャネルシステムであってよい。しかし、本発明は、特に大量の精子細胞を適度な長さの時間内に分類しなければならない精子細胞分類用途においては、マルチチャネル用法にも十分に対応している。
【００１６】
図２及び図３において、デバイス３００は、一対の対向面３１４、一対の端面３１６（そのうちの一方のみを図１に示す）、開放上面すなわち導入口３１８、及び開放底面すなわち導出口３２０から形成される本体すなわちフローチャンバー３１２を備える。
【００１７】
導入口３１８は、複数の外面側導入口３２２、及び中央すなわち試料導入口３２４を含む３つの部分に分割されている。外面側導入口３２２は、シース流体３２６を内部に受け入れ、中央導入口３２４は液状媒質及び細胞３３０を分散させた試料流体３２８を受け入れる。
【００１８】
導出口３２０は、複数の外面側導出口３３２、及び複数の中央試料回収チャネル、つまり、左側導出試料チャネル３３４Ｌ、中央導出試料チャネル３３４Ｃ，及び右側導出試料チャネル３３４Ｒを備える。チャネル３３４Ｌは第１分類試料用であり、３３４Ｃは第２分類試料用であり、３３４Ｌは更に別の分類の試料用である。
【００１９】
シース流体３２６は、選択した流量にて外面側導入口３２２から導入される。試料流体３２６は、シース流体により試料流が圧縮・収縮されて図示するように比較的狭い試料流路３３６を取るようにシース流量又は圧力に対して相対的に選択された流量又は圧力にて中央導入口３２４に導入される。典型的な実施形態において、試料流路３３６の幅は、中央導入口３２４での試料流体の幅の約１０％以下であり、たとえば約５０ミクロンである。
【００２０】
細胞３３０は円形であるが、扁平である。その結果、試料流体が収縮することにより、細胞３３０はその扁平面がほぼ対向面３１４に平行になるよう向きが定まる。向きが異なれば細胞から出射する光の強度は変わる。２又はそれより多くの細胞の強度を比較するためには、細胞に同一の向きを持たせなければならない。それゆえ、向きにバラツキのある異方性の光出射体が存在することにより生じるノイズ又は定誤差は、細胞をアラインメントすることにより減少する。
【００２１】
互い違いに導入するシース流体３２６及び試料又は物体含有溶液３２８（図３参照）はシステムに入り、少量の収縮（直交方向での収縮に比較して）４０１を起こし、それによりせん断が生じ、当該せん断流により細胞４００がアラインメントされる。この互い違いの流れパターンによると、長いシース流体流を２本導入するとその２本の間ではより激しい収縮が起き、それにより必要なアラインメントが達成される。この処理を以下に述べる検出と組み合わせて、何本もの流れを検査する並列的システムを提供してよい。
【００２２】
具体的には、収縮流は物体が焦点面４０２へと移動させ、検出領域４０３の通過を速める。システム内の曲線４０４は流体の境界線４０４を示しており、検出領域４０５において特性化が行われる。光円錐４０６により検査が可能であり、既定の導出位置４０７は複数の導出口の間で移動することができる。
【００２３】
３つの導出チャネル４０９〜４１１内でそれぞれ流量を変えることにより、溶液内の細胞又はその他の物体を複数の導出流のうちの一つに分類することができる。駆動は、先に挙げたように多様な方法にて行うことができる。装置、又は使い捨ての流れチャネルカートリッジに備えてよい圧電素子によって高速の流れ切り替えを行ってよい。流れ切り替え領域４０８においては、精密に流量が制御され、流量を経時的に変えて導出チャネル４０９〜４１１間で切り替える（但し、Ｖ２＜Ｖ１、Ｖ４〜ｖ２）。
【００２４】
検出器３４０（図２）は、導入口と導出口との間の検出域３３８において試料流路３３６に向けられる出力ビーム３４４を発生するレーザー３４２又はその他の適切な出力源を備える。ビーム３４４は検出域３３８において細胞３３０に衝突して散乱し、出力ビーム３４６となる。細胞は蛍光物質を含んでいるので蛍光光を発生し、それは出力ビーム３４６に含まれる。出力ビーム３４６の散乱蛍光成分３４６Ｓ及び３４６Ｆのそれぞれは、光学システム３４８及び電子検出システム３５０を含む光検出器へと入力される。光学システム及び電子検出システムは、後に説明する。
【００２５】
出力ビーム３４６により検出器３４０へと情報が運ばれ、検出器３４０は細胞３３０を判別して分類器３５６への出力３５４を生成する。分類器３５６は、各細胞３３０がふさわしいチャネルへと分類されるように流量比を切り替える目的で、導出チャネル３３４と動的に連携するようにドライバ３５８を制御する。又は、細胞を要不要により分類して、必要な細胞を回収し不要な細胞を破壊してもよい。
【００２６】
図３は、２つのシース流源３２６と１つの試料流源３２８のみを備える単一チャネルシステムを示す。図４は、４つの試料流源３２８と共有シース流源３２６を備えるマルチチャネルシステムを示す。図４Ａは、フローチャンバーと流路の上面図を示す。
【００２７】
図４及び図４Ａにおいては、導入する溶液を多数の平行流５００とするための並列的設計の一つの可能な方法を示す。流れは平面方向においても、平面の垂直方向においても収縮する。しかし、ウシ精子等のように、細胞のアラインメントが必要である場合、入射光の垂直方向のアラインメントを確保するためには、入射光方向に沿ったせん断はより大きくなければならない。光検査領域５０２は、レーザーの散乱と蛍光発光が生じる場所である。
【００２８】
本例においては、各シースに、専用のレンズシステムと、各々対応の流れに用いられる複数のＰＭＴ素子が用意されている。本システムにおいては、全てのチャネルに対して１つのレンズ検出システム、同様に全てのチャネルに対して１つのレーザー光システムを用意してもよいことが理解されるべきである。各流れが取り得る導出チャネル５０３が複数ある。
【００２９】
検出器６４０の光学システムの簡単な上面図を図５に示す。試料６６０は対物面６６２内にある。この図において、出力ビーム、すなわち光線６４６は試料６６０からビームレット６４６Ｃ、６４６Ｌ、及び６４６Ｒとして発散する。ビームレット６４６Ｃは、中央光軸Ｃ近傍の中央部のビーム団であり、ビームレット６４６Ｌ及び６４６Ｒは中央軸Ｃの左側及び右側に集まっている。ビームレットにより、試料６００の様々な面が観察される。集光レンズ６６４（顕微鏡の対物レンズであってよい）は、対物面６６２から、レンズの有効焦点距離（ＥＦＬ）に等しい距離を置いて設置される。レンズ６６４は、望ましいのであれば複合レンズであってよいが、簡略化の目的で、ＥＦＬを有する単体レンズとして示されている。このようにレンズ６６４を位置付けることにより、物体からの光６４６は集光レンズ６６４を出射し、図示のように同様に６６６Ｒ、６６６Ｃ、６６６Ｌに分割された平行なビームレット６６６となる。これにより、撮像システム内に無限空間が形成される。本発明においては、この無限空間は必須ではないが、便利な構成である。各々の平行光の横方向の位置付けは、対物面から進行してきた角度により主に決定される。ビームレット６６６Ｌ、６６６Ｒ、及び６６６Ｃはそれぞれビームレット６４２ｌ、６４２Ｒ、及び６４２Ｃに連続している。
【００３０】
中央光ビームレット６６６Ｃは、レンズ６６４を中央軸Ｃに沿って出射し、光を前方の画像プレーン６８０Ｃへと集中する集束レンズ６７６Ｃに到達する。ミラー６７２Ｌ及び６７２Ｒにより、集光レンズ６６４を出射した軸上にないビームレット６６６Ｌ及び６６６Ｒが分離される。これを、当該領域におけるビームの大きさに比較して小型の検出器６７４Ａ（図５Ａ）、又は光ファイバー６７４Ｂ（図５Ｂ）を当該領域に設置することによって実現してもよい。また、集光レンズ６６４から出射する光の角度範囲を制限するための、又は共焦点顕微鏡測定におけるように光を集める焦点深度を制御（再設定、又は拡大）するための、付加的レンズ６７４Ｃ（図５Ｃ）、又はピンホール６７４Ｄ（図５Ｄ）等の、付加的な光学素子を当該領域に挿入してもよい。状況によっては、一対の付加的レンズをピンホールとともに用いてよい。その他の場合においては、大きさ、形状、又は位置の調整が可能なマスクを用いて所定の検出器に到達する光を制御してよい。
【００３１】
ビームレット６６６Ｌの光はミラー６７２Ｌにより屈折して左側集束レンズ６７６Ｌに到達し、ビームレット６６６Ｒの光はミラー６７２Ｒによりレンズ６７６Ｒ及び右側画像プレーン６７８Ｒへと方向付けられる。光検出器６８０Ｌ，６８０Ｒ，及び６８０Ｃを各画像焦点プレーン６７０Ｌ，６７０Ｒ，及び６７０Ｃに設置して各像を検出してよい。これらの光検出器は、ＣＣＤ、光ダイオード、光電子増倍管、マルチアノード光電子増倍管、又はその他のセンサであってよい。
【００３２】
多くの場合、散乱光と蛍光光の両方を回収することが望ましく、得られる画像又は検出結果の少なくとも１つにおいて、試料からの光線の角度範囲が減少していなければならない。図６において、上述のようなＫベクトル撮像装置を、必要に応じてフィルターとビームスプリッタとともに用いて、これを達成する方法を示す。類似の要素には同一の参照番号を付す。
【００３３】
図６において、照明・励起光８００は、集光レンズ８０１を透過し、ミラー８０２又は８０３で反射して放射フィルター６８８ＥＬ又は６８８ＥＲを介して集束レンズ８０４又は８０５、及び左側又は右側蛍光画像プレーンを構成する光検出器６９０Ｌ又は６９０Ｒへとそれぞれ到達する。
【００３４】
６８６Ｃにおけるビームスプリッタは、中央フィールド６６６Ｃにおいて光を方向付け直して、放射フィルター６８８Ｅを介して集束レンズ６７６ＦＣへと到達させる。放射フィルター６８８Ｅからの出力６８９Ｅは、細胞からの蛍光発光の放射に対応する。中央光軸内のレーザー線フィルター６８８Ｌが散乱レーザー光をフィルタリングしてレンズ６７６Ｃ、及び前方散乱光画像プレーンが形成されている光検出器６９０Ｃへと導く。
【００３５】
デバイスの処理量と全般的性能を向上するためには、並列化が望ましい。図７にこれを実現する方法を示す。レーザー６４２が入力レーザービーム６４４を放射し、入力レーザービーム６４４は蛍光発光を励起してビームスプリッタ６９０（たとえば、回折格子、又はホログラム）によりＮ個のビームへと分割される。ビーム６９２Ａと６９２Ｎは扇状に散開してそれぞれ対応する試料シース（図４参照）の検出域へと方向付けられる。ビームレット６９２Ａ〜６９２Ｎは平行化レンズ６９４により平行なビームとなるよう平行化される。平行化レンズ６９４からの出力６９６は円筒状レンズ６９８を通過して方向付けられ、円筒状レンズ６９８により各ビーム７００Ａ〜７００Ｎは対物面７０１において試料流へと集中する。図示のように、（図４）、導入した流れは多くの流れへと分割される。図示例におけるビームレット７００Ａ〜７００Ｎの１つ又は全ての光と試料流は集光レンズ７０２Ｋへと進入して、図６おいて上述した通りに処理される。しかし、本例においては、検出器アレイデバイス（マルチアノードＰＭＴ等）デバイス７２０（７２０Ｃ、７２０Ｒ、７２０Ｌ、７２０ＣＦ...）を各検出ビーム群につき１つ用いる。最良の検出は、各撮像位置に単一の検出器を設置することによってではなく、３２要素の直線ＰＭＴアレイ７２０等の、アレイ状検出器を採用することにより達成される。
【００３６】
多くの物体を撮像又は測定するシステムの処理量は、部分的には検出器の数とそれらの速度に依存する。多くの用途においては、各画像プレーンにつき光電子増倍管（ＰＭＴ）等の検出器を１つ用いる。これは、物体が対物面を一列に並んで通過する場合に適する。
【００３７】
分類器８５６を以下に詳述する。単一チャネル分類器を図８に示す。分類器８５６は、構造部材８１２、フローチャネル８２０を規定するスロット８１８が形成されたチャネル規定層８１６、チャネル規定層８１６上の柔軟膜層８２２、構成を完成させる構造部材８２４を備える。圧電性の、又はその他の種類のアクチュエータ８２６がコントローラ８２８に接続される。アクチュエータ８２６により駆動されるピストン８６０がフローチャネル８２０に対向する部分において柔軟膜８２２に陥入し、圧電への電圧供給に従ってチャネル内での流れパターンを変化させる。複数のこのような構造を小型化してアクチュエータの窓部に設置し、それにより複数本の試料流を分類してよい。
【００３８】
１つ、又はそれより多いアクチュエータ８２６は、電気信号を流量の機械的駆動力に変換する圧電変換器、流体、材料、又は気泡をすばやく膨張させるために領域を加熱するヒータ、溶液流を収縮するための気泡を形成する熱気泡生成、膜の容量運動デバイス、材料、壁面、膜、気泡、又はその他の材料又は物体を加熱し、又は動かして流れの速度に作用を与えて１つ又はそれより多くの導出チャネル９３４へと到達させる光学デバイスを含んでよい。駆動力を、デバイスに備えてよく、又は外部から印加してよい。たとえばアクチュエータ８２６とピストン８６０は、使い捨てのフローデバイス８５６から独立した外部装置であってよい（つまり、使い捨てチップと使い捨てでない外部アクチュエータ）。
【００３９】
図９は、導入チャネル９００からフローチャネルへとシース流を供給し、導出チャネル９０１において様々に分類された精子細胞を受け取る、マルチチャネル並列構成を示す。並列検出器の各試料チャネルへと検査光をつなぐことを目的として、窓９３０が設けられる。分類窓９３２に、複数のアクチュエータと使い捨て分類エレメントを設置する。デバイス１００のチップ登録ピンを９４０として特定する。
【００４０】
図１０Ａ〜図１０Ｒは、精子を分類するフローデバイスにおいて多様なアクチュエータ９３４を用いた、細胞を案内するための別の実施形態を示す。各ケースにおいて、１つ又はそれより多くのアクチュエータが用いられており、各アクチュエータは、圧電素子（カートリッジに内在又は外在）、容量アクチュエータ、熱膨張、又は先行開示に記載のその他の技術に基づいてよい。多くの場合、特定の細胞又は物体がどの導出チャネル９３６へと進入するかを制御するには、少なくとも２つのアクチュエータ９３４が望ましく、また２つより多くのアクチュエータが望まれる可能性もある。アクチュエータにより、流れを大変高速に制御及び変化することが可能となる。流れを一時的に一つの導出口から別の導出口へと転じるには、流れへの微小な摂動のみが必要である。
【００４１】
図１１Ａ〜図１１Ｂは、分類を行わずに、所望の結果を得るための殺細胞又は活性化装置の例を示す。図１１Ａにおいて、レーザー９４０は、物体・精子流９４２に衝突する。このレーザーは、検査の結果に基づいて、特定の精子又は物体にのみ致死的エネルギーを衝突させるように制御される。たとえば、このレーザーにより、所望のとおりに特定の精子又は他の細胞を死滅させてよい。たとえば、所定の性別の、又は性別が不確定な精子を全て死滅させてよい。または、レーザーにより細胞を直接的に死滅させずに、反対に「活性化」してよい。たとえば、事前に精子に導入したある種の化学物質を活性化することにより、全体の結果としては、精子を死滅させるか又は受精能力を弱めることもできる。より一般的な用途においては、活性化にはより多様な操作を含めてよい。
【００４２】
図１１Ｂは、中央流９４２に局所的に接触させる目的で流れへと差し込まれる電極９４４を通じて導入される致死電気パルスを用いる殺細胞又は活性化を示す。レーザーによる方法においてと同様に、電極は検査結果に基づいてすばやく発振・停止させることができる。
【００４３】
細胞を光トラッピング装置により操作する光学的案内を行ってもよい。または、駆動処理を、細胞を死滅させるか又はその他の効果を与え得る、細胞の電気穿孔により行ってよい。
【００４４】
以下の技術においては、収縮流を用いて精子細胞をアラインメントする。
【００４５】
蠕動ポンプを用いて３本の流れをフローチップへ供給した。流れが互いに交じり合わないように各流れを層流態勢に維持した。精子含有流は、水である上層流と下層流との間を流れる。上層及び下層の流れの速度を互いに等しく保ちつつこれらの精子流に対する比を変化させることにより、精子流の収縮を観察することができた。
【００４６】
収縮流により精子が流れ方向へと配向されることが想定される。
【００４７】
流れの中の精子の画像を、我々の顕微鏡に装備されたＣＣＤカメラにより撮影した。
【００４８】
上の表は、流れの中の精子配向の角度を示しており、Ｒｅは、Ｄがフローチャネルの直径、Ｕが速度、ｒが流体の密度、ｍが粘性であるＤｕｒ／ｍとして定義されるレイノルズ数である。
【００４９】
Ｒｅにより、流れが層流であるか否かが示される。１０００未満のＲｅである場合には層流であると考えられるが、ある用途においてはたとえば１未満等の大変に小さいＲｅが要求される。
【００５０】
精子流の速度が増大するにつれ、チャネル導入部のＲｅは増大するが、層流を得られる範囲に維持されており、我々の実験範囲では流れは妨げられないことを示している。
【００５１】
精子配向を、これらを精子頭部の流れ方向に対するアラインメント角度関数として数値化することにより定量化した。
【００５２】
実験範囲においては、撮像した精子の約８０％が流れ方向に対して１５度未満に配向された。
【００５３】
より高い速度においては、流れ方向に対してより良好なアラインメントが示されたが、損傷した精子がより多く観察された。
【００５４】
この結果により、本システムが当該技術を用いて精子をアラインメントすることができたことが示される。
【００５５】
精子を延命する目的でシース流体と試料流体の温度管理を行うことができることが理解されるべきである。典型的実施形態においては、精子細胞の動きを封じて寿命を延長する目的で、フローデバイス内での流体温度を約摂氏２〜１０度に維持してよい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】蛍光染料で着色した細胞を分類するための工程のフロー図である。
【００５７】
【図２】本発明に係るフローデバイス又はカートリッジの斜視概略図である。
【００５８】
【図３】分類用の単一チャネルフローデバイスの概略図である。
【００５９】
【図４】分類用のマルチチャネルフローデバイスの側面図である。
【００６０】
【図４Ａ】図４に示すマルチチャネルシステムの導入口に面した上面（境界）図である。
【００６１】
【図５】散乱光を検知するための単一チャネルセンサ（つまり、Ｋベクトル撮像のための光学システム）の概略図である。
【００６２】
【図５Ａ−５Ｄ】図５の構成に採用する別の光学素子を示す。
【００６３】
【図６】Ｋベクトル撮像を用いて蛍光光と散乱光を検出する単一チャネルセンサの概略図である。
【００６４】
【図７】散乱光と蛍光光の励起と検出を行うＫベクトル撮像のためのマルチチャネルデバイスである。
【００６５】
【図８】細胞を分類するチャネル又はデバイス内の流速を調整する外部アクチュエータの概略図である。
【００６６】
【図９】細胞を検出・分類するマルチチャネルデバイス又はカートリッジの上面の概略図である。
【００６７】
【図１０Ａ−１０Ｄ】Ｍ、Ｗ、Ｆに３つのアクチュエータ（図１０Ａ）、Ｓ１、Ｓ２に２つのアクチュエータ（図１０Ｂ）、Ｓ１に１つのアクチュエータ（図１０Ｃ）、Ｍ、Ｆに２つのアクチュエータ（図１０Ｄ）を用いて細胞を案内する多様な代替的方法を示す。
【００６８】
【図１１Ａ−１１Ｂ】レーザー死滅又は活性化（図１１Ａ）と、電気死滅又は活性化（図１１Ｂ）による細胞を死滅させるための多様な代替的方法を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入口を有する１つのフローチャンバーを形成する対向し合う一対の壁面と、１つの下流側導出口と、１つのフローチャネルを形成する中間検出領域とを備え、前記導入口は、導入シース流体による第１、第２の複数の隔離した流れと、分類すべき複数の細胞を含有する試料流体による、前記第１と第２の複数のシース流れの間の１つの第３の流れを受け取り、前記第１と第２の複数のシース流れは、前記第３の流れがそれらの間において収縮して少なくとも前記検出領域において比較的狭い１つの試料流れを形成し、それにより前記複数の細胞が前記複数の壁面に対して選択される１つの方向へと配向されるような、前記第３の流れの１つの流量又は圧力に相対的な流量又は圧力を前記フローチャンバーにおいてそれぞれ有しており、前記検出領域における１つの検出器は複数の所望の細胞を検出してそれを示す出力を生成する、複数の細胞を分類・配向する１つのフローデバイス装置。
【請求項２】
前記流れから前記複数の所望の細胞を分類する、前記検出器の下流に存在する１つの分類器を更に含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記分類器は、前記検出器の下流において、少なくとも一方が前記複数の所望の細胞を受け取る第１、第２の複数の隔離した領域が形成された、前記チャンバーの１つの部分を含むことを特徴とする、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記分類器は、前記複数の所望の細胞を１つの第１領域へと案内し、複数の所望でない細胞を１つの第２領域へと案内する目的で、前記検出器に応答して、１つの領域又はそれより多くの複数の領域へと選択的に圧力を印加する１つの圧力変換器を含むことを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
複数の所望の細胞を複数の所望でない細胞から分離する１つの分類器を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記複数の壁面は、複数の平面部材であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記第１、第２の流れは１つの液状媒質を含み、前記第３の流れは複数の細胞又は複数の粒子が懸濁した１つの液状媒質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記第１、第２の複数の流れの、前記第３の流れに相対的な前記流量又は圧力は、少なくとも前記検出領域において前記第３の流れが前記第１、第２の複数の流れの幅の約１０パーセント以下となるように前記第３の流れを収縮させ、それにより前記検出領域に進入する複数の細胞を互いに対して、また前記複数の壁面に対して略平行な１つの方向に配向させることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記検出領域は、１つの入力光信号を集中させる比較的狭い領域を含むことを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記導出口は、第１と第２の複数の隔離した領域により形成され、前記第１の領域は１つの所望の細胞を受け取り、前記第２の領域は、１つの所望でない種の複数の細胞を受け取ることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記検出器は、前記検出領域において、前記複数の細胞に入力光を光学的に照射する１つの光源を備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記複数の細胞は前記入力光に反応して出力光を生成する反応性を有しており、前記検出器は前記複数の細胞が生成する光に反応する１つの光検出器を備えることを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１３】
前記出力光は、前記複数の細胞から散乱する光と、前記複数の細胞が生成する蛍光光の少なくとも一方を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記検出器は、前記複数の細胞からの出力光を受光するための、また、当該出力光を集光してそれによる複数の集光光ビームレットを生成する１つの第１光学素子を含む、１つの光学系配列を備え、前記複数のビームレットは、前記細胞の前記入力光との相互作用に従って生成される、前記細胞の多様な角度における複数の画像を示すことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記検出器は、前記光学系配列の１つの中央光軸に沿っており、前記中央軸に沿った複数の選択された軸上ビームレットを複数の対応する光検出器へと方向付ける１つの光検出器を更に備えることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記検出器は、前記中央光軸からずれて方向付けられる複数の光路を有する複数の軸ずれビームレットを検出するための、１つの対応する軸ずれ光路を有する少なくとも１つの軸ずれ光検出器を更に備えることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの軸ずれ光検出器の前記光路内の1つの光スプリッタであって、前記複数の集光光ビームレットから選択される複数のビームレットを前記対応する軸ずれ検出器へと方向づける1つの光スプリッタを更に備える、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記複数の集光光ビームレットは、散乱光と蛍光光を含み、前記検出器は、前記集光光から前記散乱光と前記蛍光光の少なくとも一方をフィルタリングする複数の光フィルターを更に備えることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
前記分類器は、細胞種ごとに1つのチャネルと、前記フローチャネルに接続され、前記試料流れの複数の選択位置において前記流体流量を変更して前記複数の細胞を前記複数のチャネルうちの選択した複数のチャネルへと案内するための1つの駆動部材とを備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
駆動部材は、フローチャネルへと印加する変化する前記圧力用の1つの圧力変換器を備えることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記駆動部材は、1つの圧電変換器、1つの加熱器、1つの容量膜、及び、1つの光加熱器の少なくとも1つを備えることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
1つの対物面内の1つの物体を撮像するための1つのセンサであって、前記センサの1つの中心軸に対して複数の異なる角度にて前記対物面を離れる光という形態にて前記物体の複数の像を定義する複数のビームを発生する前記物体を照射する１つの光源と、前記物体からの光に反応する1つの検出器を備えるセンサ。
【請求項２３】
前記検出器は、前記センサの前記光軸に沿って方向付けられる光と、前記検出器の前記軸からずれて方向付けられる光の少なくとも一方に反応することを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記軸ずれ検出器は、前記対物面内の複数の異なる位置に対応する軸ずれ光を検出するための、前記中心軸に対して横に変位した少なくとも２つの光検出器を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
各ビームからの蛍光光と散乱光の少なくとも一方をフィルタリングするための1つのフィルターを更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記光検出器は、複数の光ビームを検出する、1つのマルチエレメント光電子増倍管を備えることを特徴とする、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記光源はレーザーを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２８】
各物体からの前記光を平行化して複数の別個のビームにする1つのレンズを更に含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
各ビーム用に集光レンズを更に含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
軸ずれ光から軸上光を分割する1つのスプリッタを更に含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３１】
複数の所望でない細胞を死滅させるための、前記検出器の下流に存在する1つの殺細胞器を更に含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項３２】
前記殺細胞器は、前記複数の所望でない細胞へ致死エネルギーを当てるための1つのレーザーと電極の少なくとも一方を備えることを特徴とする、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記殺細胞器は、前記細胞内の致死ターゲットを活性化するための光の、1つの発生源をそなえることを特徴とする、請求項３１に記載の装置。
【請求項３４】
複数の所望でない細胞を効果的に処理し、又は死滅させる1つの細胞電気穿孔をさらに含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項３５】
細胞寿命を延長するためには、前記フローデバイスを、約摂氏２度から１０度にて運転することができることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項１】
導入口を有する１つのフローチャンバーを形成する対向し合う一対の壁面と、１つの下流側導出口と、１つのフローチャネルを形成する中間検出領域とを備え、前記導入口は、導入シース流体による第１、第２の複数の隔離した流れと、分類すべき複数の細胞を含有する試料流体による、前記第１と第２の複数のシース流れの間の１つの第３の流れを受け取り、前記第１と第２の複数のシース流れは、前記第３の流れがそれらの間において収縮して少なくとも前記検出領域において比較的狭い１つの試料流れを形成し、それにより前記複数の細胞が前記複数の壁面に対して選択される１つの方向へと配向されるような、前記第３の流れの１つの流量又は圧力に相対的な流量又は圧力を前記フローチャンバーにおいてそれぞれ有しており、前記検出領域における１つの検出器は複数の所望の細胞を検出してそれを示す出力を生成する、複数の細胞を分類・配向する１つのフローデバイス装置。
【請求項２】
前記流れから前記複数の所望の細胞を分類する、前記検出器の下流に存在する１つの分類器を更に含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記分類器は、前記検出器の下流において、少なくとも一方が前記複数の所望の細胞を受け取る第１、第２の複数の隔離した領域が形成された、前記チャンバーの１つの部分を含むことを特徴とする、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記分類器は、前記複数の所望の細胞を１つの第１領域へと案内し、複数の所望でない細胞を１つの第２領域へと案内する目的で、前記検出器に応答して、１つの領域又はそれより多くの複数の領域へと選択的に圧力を印加する１つの圧力変換器を含むことを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
複数の所望の細胞を複数の所望でない細胞から分離する１つの分類器を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記複数の壁面は、複数の平面部材であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記第１、第２の流れは１つの液状媒質を含み、前記第３の流れは複数の細胞又は複数の粒子が懸濁した１つの液状媒質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記第１、第２の複数の流れの、前記第３の流れに相対的な前記流量又は圧力は、少なくとも前記検出領域において前記第３の流れが前記第１、第２の複数の流れの幅の約１０パーセント以下となるように前記第３の流れを収縮させ、それにより前記検出領域に進入する複数の細胞を互いに対して、また前記複数の壁面に対して略平行な１つの方向に配向させることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記検出領域は、１つの入力光信号を集中させる比較的狭い領域を含むことを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記導出口は、第１と第２の複数の隔離した領域により形成され、前記第１の領域は１つの所望の細胞を受け取り、前記第２の領域は、１つの所望でない種の複数の細胞を受け取ることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記検出器は、前記検出領域において、前記複数の細胞に入力光を光学的に照射する１つの光源を備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記複数の細胞は前記入力光に反応して出力光を生成する反応性を有しており、前記検出器は前記複数の細胞が生成する光に反応する１つの光検出器を備えることを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１３】
前記出力光は、前記複数の細胞から散乱する光と、前記複数の細胞が生成する蛍光光の少なくとも一方を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記検出器は、前記複数の細胞からの出力光を受光するための、また、当該出力光を集光してそれによる複数の集光光ビームレットを生成する１つの第１光学素子を含む、１つの光学系配列を備え、前記複数のビームレットは、前記細胞の前記入力光との相互作用に従って生成される、前記細胞の多様な角度における複数の画像を示すことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記検出器は、前記光学系配列の１つの中央光軸に沿っており、前記中央軸に沿った複数の選択された軸上ビームレットを複数の対応する光検出器へと方向付ける１つの光検出器を更に備えることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記検出器は、前記中央光軸からずれて方向付けられる複数の光路を有する複数の軸ずれビームレットを検出するための、１つの対応する軸ずれ光路を有する少なくとも１つの軸ずれ光検出器を更に備えることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの軸ずれ光検出器の前記光路内の1つの光スプリッタであって、前記複数の集光光ビームレットから選択される複数のビームレットを前記対応する軸ずれ検出器へと方向づける1つの光スプリッタを更に備える、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記複数の集光光ビームレットは、散乱光と蛍光光を含み、前記検出器は、前記集光光から前記散乱光と前記蛍光光の少なくとも一方をフィルタリングする複数の光フィルターを更に備えることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
前記分類器は、細胞種ごとに1つのチャネルと、前記フローチャネルに接続され、前記試料流れの複数の選択位置において前記流体流量を変更して前記複数の細胞を前記複数のチャネルうちの選択した複数のチャネルへと案内するための1つの駆動部材とを備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
駆動部材は、フローチャネルへと印加する変化する前記圧力用の1つの圧力変換器を備えることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記駆動部材は、1つの圧電変換器、1つの加熱器、1つの容量膜、及び、1つの光加熱器の少なくとも1つを備えることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
1つの対物面内の1つの物体を撮像するための1つのセンサであって、前記センサの1つの中心軸に対して複数の異なる角度にて前記対物面を離れる光という形態にて前記物体の複数の像を定義する複数のビームを発生する前記物体を照射する１つの光源と、前記物体からの光に反応する1つの検出器を備えるセンサ。
【請求項２３】
前記検出器は、前記センサの前記光軸に沿って方向付けられる光と、前記検出器の前記軸からずれて方向付けられる光の少なくとも一方に反応することを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記軸ずれ検出器は、前記対物面内の複数の異なる位置に対応する軸ずれ光を検出するための、前記中心軸に対して横に変位した少なくとも２つの光検出器を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
各ビームからの蛍光光と散乱光の少なくとも一方をフィルタリングするための1つのフィルターを更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記光検出器は、複数の光ビームを検出する、1つのマルチエレメント光電子増倍管を備えることを特徴とする、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記光源はレーザーを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２８】
各物体からの前記光を平行化して複数の別個のビームにする1つのレンズを更に含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
各ビーム用に集光レンズを更に含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
軸ずれ光から軸上光を分割する1つのスプリッタを更に含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３１】
複数の所望でない細胞を死滅させるための、前記検出器の下流に存在する1つの殺細胞器を更に含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項３２】
前記殺細胞器は、前記複数の所望でない細胞へ致死エネルギーを当てるための1つのレーザーと電極の少なくとも一方を備えることを特徴とする、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記殺細胞器は、前記細胞内の致死ターゲットを活性化するための光の、1つの発生源をそなえることを特徴とする、請求項３１に記載の装置。
【請求項３４】
複数の所望でない細胞を効果的に処理し、又は死滅させる1つの細胞電気穿孔をさらに含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項３５】
細胞寿命を延長するためには、前記フローデバイスを、約摂氏２度から１０度にて運転することができることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４Ａ】
【図５】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４Ａ】
【図５】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−１３７１４（Ｐ２０１２−１３７１４Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２２６０９５（Ｐ２０１１−２２６０９５）
【出願日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【分割の表示】特願２００７−５５３３６６（Ｐ２００７−５５３３６６）の分割
【原出願日】平成１８年２月１日（２００６．２．１）
【出願人】（５０３４１９７６７）アリックス インコーポレイテッド (13)
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２６０９５（Ｐ２０１１−２２６０９５）
【出願日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【分割の表示】特願２００７−５５３３６６（Ｐ２００７−５５３３６６）の分割
【原出願日】平成１８年２月１日（２００６．２．１）
【出願人】（５０３４１９７６７）アリックス インコーポレイテッド (13)
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