タンパク質の製造方法
【課題】本発明は、動物細胞を培養して有用タンパク質を製造する方法において、分離膜を用いる連続濾過培養によって目的の有用タンパク質を効率よく製造する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、動物細胞の連続濾過培養により有用タンパク質を製造する方法において、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の有機高分子分離膜を用いて膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理することにより、長期間安定した培養を行って生産効率よく有用タンパク質を製造する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、動物細胞の連続濾過培養により有用タンパク質を製造する方法において、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の有機高分子分離膜を用いて膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理することにより、長期間安定した培養を行って生産効率よく有用タンパク質を製造する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液の濾過に多孔性膜を使用した動物細胞の連続培養によるタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞を培養して、タンパク質を製造する培養方法は、大きく（１）回分培養法（Ｂａｔｃｈ培養法）および流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh培養法）と（２）濾過培養法に分類することができる。
【０００３】
回分および流加培養法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし培養期間とともに、培養液中の栄養源が枯渇していき、また一方で動物細胞の産生するアンモニア、乳酸などの老廃物が培養液に蓄積し、細胞増殖を阻害する。また、これらの細胞増殖阻害は、細胞密度を低下させ培養容積当たりのタンパク質の製造効率を低下させる要因となる。
【０００４】
一方、濾過培養法では、栄養源が枯渇し、蓄積した老廃物を、目的タンパク質を含む培養液から濾過処理により間欠的にあるいは連続的に除去し、その代わりに新鮮培地を供給することで、培養槽内での老廃物の蓄積を回避させつつ、細胞の生存率、細胞密度、およびタンパク質の生産性を高い状態で維持することができる。これにより、動物細胞のタンパク質の生産性を、長期間にわたって維持できるという特徴がある。
【０００５】
このような動物細胞の濾過培養法では、動物細胞と培養液を分離する分離装置を培養槽内あるいは培養槽外に設置する必要がある。この分離装置として、これまで有機高分子膜、デプスフィルター、セラミックフィルター、金属フィルターを用いた例が開示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの従来技術において、培養経過に伴う分離膜の目詰まりが課題としてあった。分離膜の目詰まりは、動物細胞と培養液の分離ができなくなるばかりではなく、膜間差圧を高める要因となる。従来技術として、細孔径が０．２５μｍ以下の分離膜を使用して、細菌を培養し、化合物を製造する例が開示されているが、細菌と培養液の膜分離において、高い膜間差圧（約２００ｋＰａ）が必要であった（特許文献１）。高い膜間差圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において動物細胞が圧力によって物理的なダメージをうけることから、動物細胞を連続的に培養液に戻す濾過培養においては適切ではない。
【０００７】
また、このような動物細胞培養時の分離膜の目詰まりを解消するために、膜分離装置自身が回転し、その遠心力を利用して膜の目詰まりを抑制する方法が開示されている（特許文献２，３）。しかしながら、上記手法においては、培養装置に新たな駆動箇所を設置する必要があり、特に大量培養用の装置には適応が困難である。
【０００８】
また、動物細胞を濾過培養するための分離膜として、セラミックフィルター（非特許文献１）や金属フィルター（特許文献４）を使用した例が開示されているが、これらの分離膜装置は非常に高価なものとなる。また、これら分離膜は洗浄して、再利用することも可能であるが、多孔性形状であるため完全な洗浄操作は難しく、また洗浄操作をバリデーションすることも困難である。
【特許文献１】特開２００５−３３３８８６号公報
【特許文献２】特開平１０−２１６４２２号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９７７号公報
【特許文献４】特開平６−２３７７５４号公報
【非特許文献１】ドング・ハオディら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００５，２１，１４０−１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決しようとするものであって、低い膜間差圧で、動物細胞と培養液とを濾過分離して、長期間培養を行うことができる分離膜を使用することで、従来技術と比べて効率的に動物細胞を培養してタンパク質製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満有機高分子からなる分離膜を作製し、これを用いることによって、動物細胞が培養液中に製造するタンパク質を効率的に製造できることを見出し本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔８〕から構成される。
〔１〕タンパク質を培養液中に生産する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続濾過培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法。
〔２〕多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である〔１〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔３〕多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔４〕多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔５〕多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔６〕多孔性膜の膜素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔７〕動物細胞がハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｂｍ細胞の群から選ばれるいずれかの動物細胞である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔８〕タンパク質がモノクローナル抗体である〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のタンパク質製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のタンパク質の製造方法では、培養液を濾過し、新鮮培地を培養液に供給することで、動物細胞におけるタンパク質の製造速度を高めることが可能で、効率的なタンパク質の製造が可能となる。本発明において動物細胞と培養液との分離に使用する分離膜は、動物細胞の濾過を非常に低い膜間差圧で実施することが可能である。したがって、従来の高い濾過圧を必要とする製造方法に比べ、動物細胞に与えるダメージが少なくて済むため、タンパク質製造効率が向上する。また、本発明で使用する分離膜は、目詰まりを起こしにくい膜であるので、濾過培養によるタンパク質の製造を、長期間安定してまた低い濾過圧で実施することが可能であり、非常に経済的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、タンパク質を培養液中に製造する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液からタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法である。
【００１４】
本発明において分離膜として用いられる多孔性膜は、培養に使用される動物細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。
【００１５】
次に、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜としての多孔性膜に強度を与えるものである。
【００１６】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００１７】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔性膜を構成する多孔質樹脂層の素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００１８】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、その他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００１９】
本発明で用いられる多孔性膜の作製方法の概要を説明する。まず、上述した多孔質基材の表面に、上述した樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原液を多孔質基材に含浸させる。しかる後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。原液にさらに非溶媒を含ませることもできる。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。
【００２０】
ここで、原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００２１】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯが好ましく用いられる。
【００２２】
さらに、原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００２３】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００２４】
上述のように、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸膜の内部に含んでいても良い。
【００２５】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００２６】
分離膜としての多孔性膜の平均細孔径が上記のように０．０１μｍ以上１μｍ未満の範囲内にあると、動物細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。微生物として細菌類を用いた場合、多孔性膜の平均細孔径は好ましくは０.４μｍ以下であり、平均細孔径は０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径を０．２μｍ未満にすることにより、分離膜を介した好ましくない細菌の混入あるいは流出を抑制することが可能になる。これにより、特に濾液からの細菌の混入のリスクを低減できる。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、本発明では、平均細孔径は０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００２７】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００２８】
また、上記の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、培養運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。
【００２９】
平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００３０】
【数１】
【００３１】
本発明で用いられる多孔性膜においては、培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００３２】
本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。好ましくは膜表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で連続培養が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより安定した濾過培養が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００３３】
また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることにより、動物細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、動物細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００３４】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００３５】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００３６】
【数２】
【００３７】
本発明において、動物細胞を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、動物細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は、好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下の範囲である。上記の膜間差圧０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲を外れた場合、微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、濾過培養運転に不具合を生じることがある。
【００３８】
濾過の駆動力としては、培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができる。また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００３９】
また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができる性能を有するものであることが好ましい。また、本発明で使用される多孔性膜は、上述のように、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。
【００４０】
本発明のタンパク質の製造方法に用いることができる動物細胞について説明する。本発明で使用される動物細胞には、哺乳動物由来細胞及び昆虫細胞のいずれも含まれる。また、本発明のタンパク質の製造方法で使用される動物細胞としては、タンパク質を培養液中に分泌する細胞または細胞内に蓄積する細胞のいずれも使用することができるが、前者の培養液にタンパク質を分泌生産する細胞であることが好ましい。
【００４１】
本発明のタンパク質の製造方法に用いることができるタンパク質を分泌生産することができる好適な動物細胞種として、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｂｍ細胞などが使用される。これらの動物細胞は、接着依存性細胞と、浮遊細胞に分類される。本発明で使用される動物細胞は、接着依存性細胞および浮遊細胞の双方に使用可能である。ただし、接着依存性細胞に関しては、付着のための細胞支持体が存在しないと、増殖速度が極めて遅くなる。したがって、接着依存性細胞を接着状態で培養する際は、マイクロキャリアと呼ばれる細胞接着のための粒子を培養液に加えて培養することが好ましい。マイクロキャリアに関しては、“サイトデックス”（ＧＥヘルスケア社製）、“セルヤードビーズ”（ペンタックス社製）、“２Ｄマイクロヘクス”（ヌンク社製）など一般に市販の製品を使用することができる。また、これらの接着依存性細胞は、攪拌培養あるいは振とう培養を行い、浮遊性の細胞を選択していくことで、浮遊細胞に馴化することも可能である。
【００４２】
ハイブリドーマ細胞とは、２種類の異なる細胞株を人工的に融合した雑種細胞株のことをいう。特に本発明では、抗体生産細胞と、骨髄腫（ミエローマ）細胞との融合したハイブリドーマのことをいう。上記ハイブリドーマ細胞は、培養液中にタンパク質として、モノクローナル抗体を生産する。
【００４３】
ＣＨＯ細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のことであり、チャイニーズハムスター卵巣組織から樹立された細胞株である。ＣＨＯ細胞は、高いタンパク質生産能力を有する細胞であることから、タンパク質をコードする遺伝子を導入することで、タンパク質生産株として使用できる。
【００４４】
ＨＥＫ２９３は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株のことをいう。
【００４５】
ＣＯＳ細胞は、アフリカミドリザル腎臓由来の細胞株であって、複製開始点を欠失したＳＶ４０で形質転換した細胞株である。ＳＶ４０の複製開始点をもつプラスミドＤＮＡを核内増幅させることが可能である。
【００４６】
Ｓｆ９細胞およびＢｍ細胞は、双方とも鱗翔目昆虫由来細胞株であって、Ｓｆ９がヨトウガ卵巣由来細胞、Ｂｍ細胞がカイコガ卵巣由来細胞である。これらの細胞は、目的遺伝子を連結したバキュロウイルスベクターにより形質転換することができ、タンパク質を培養液に生産する細胞株を取得することが可能である。
【００４７】
本発明のタンパク質の製造方法で製造されるタンパク質としては、上記動物細胞が培養液中に生産するタンパク質であって、サイトカイン類や抗体など挙げることができる。例えば、抗体としては、マウスハイブリドーマ細胞やラビットハイブリドーマ細胞、ヒトハイブリドーマ細胞などを用いることによってモノクローナル抗体の製造が可能である。また、マウスの可変領域とヒト定常領域を連結したキメラ抗体、あるいはマウス可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ領域）を、ヒト由来ＦＲ配列に置換したヒト型抗体などもタンパク質として製造可能である。また、サイトカイン類としては、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー形成促進因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ウロキナーゼ、インターフェロン、プラスミノーゲン・アクチベーター、インターロイキン、エリスロポエチンなどが製造可能なタンパク質として例示できる。
【００４８】
本発明のタンパク質の製造方法には、動物細胞を培養するための培地を使用する。本発明でいう培地は、（ｉ）動物細胞の培養に使用している培地、すなわち培養液自体、（ｉｉ）動物細胞の培養に使用していないものであって培養液に外部より新たに追加する新鮮培地、の両方を意味する。本発明では、目的タンパク質の種類および濃度によって、血清培地、無血清培地、無タンパク質培地を選択して用いることができる。一般に、動物細胞を用いたタンパク質の製造には、無血清培地あるいは無タンパク質培地が好ましく使用される。これは無血清培地であると、動物細胞が培養液中に生産したタンパク質を効率的に精製することが可能となるためである。したがって、本発明の製造方法においても、無血清培地あるいは無タンパク質培地で動物細胞を培養した方が、タンパク質の精製が容易となるため好ましい。ただし、本発明の製造方法で使用する分離膜は、血清成分であるタンパク質成分をすべて透過させることができるので、分離膜を使用して血清培地を除去し、無血清培地を代わりに添加し、培養槽内で異なる成分の培地に交換することも可能である。このような培養方法は、無血清条件下で増殖性が低い動物細胞を用いてタンパク質を製造する際に、有効な手段である。すなわち、血清培地で動物細胞を高密度状態まで増殖させ、その後培地を無血清培地に変更しタンパク質の製造を行うことが可能である。
【００４９】
本発明の濾過培養によるタンパク質の製造方法は、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に培養槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と培養槽間で培養液を循環させる動力手段が不要となる。分離膜エレメントは、培養槽の外側に設置しても良いし、培養槽内部に設置して培養装置をコンパクト化することもできる。
【００５０】
まず、本発明の濾過培養によるタンパク質の製造方法で用いられる培養装置のうち、分離膜エレメントが、培養槽の外部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。図１は、本発明で用いられる培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００５１】
図１において、培養装置は、動物細胞を培養させるための培養槽１と、その培養槽１に培養液循環ポンプ１１を介して接続され内部に分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、培養槽１の内の培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することが好適である。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００５２】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を培養槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で培養槽１内の培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって培養液の温度を調節することにより、生産性の高いタンパク質の製造を行うことができる。また、ＤＯ（溶存酸素）センサ２３およびこれと連動するガス混合機によって、気体供給装置４を通じて培養液中にパージする酸素分圧を設定・制御することが可能である。さらに、装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって培養槽１と膜分離槽１２の間を循環する。タンパク質を含む培養液は、分離膜エレメント２によって動物細胞が濾過・分離され、タンパク質を含む培養液は装置系から取り出される。
【００５３】
ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、培養液の溶存酸素や酸化還元電位（ＯＲＰ）の制御を行うことができ、更には、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中のタンパク質の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、上記計装・制御装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００５４】
また、濾過・分離された動物細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の動物細胞濃度を高く維持することができ、生産性の高いタンパク質の製造を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行なうことができ、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の培養液量を適当に調節することができる。また、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。
【００５５】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を調整制御することができる。
【００５６】
次に、本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置のうち、分離膜エレメントが培養槽の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる他の培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００５７】
図２において、濾過培養装置は、動物細胞を培養させるための培養槽１と、その培養槽１の内の培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。培養槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００５８】
次に、図２の濾過培養装置による培養の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を培養槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、培養槽１に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。製造時には、必要に応じて、培養槽１内の攪拌機５で培養槽１内の培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を培養槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養槽１内の培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって培養槽１内の培養液の温度を調節することにより生産性の高い製造を行うことができる。また、ＤＯセンサ２３およびこれと連動するガス混合器、および気体供給装置４により、培養液中の溶存酸素濃度を一定にすることができる。
【００５９】
計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節には、図１の培養装置と同様の調節を行うことができる。
【００６０】
培養液は、培養槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、動物細胞は濾過・分離されタンパク質を含む培地は装置系から取り出される。また、濾過・分離された動物細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の動物細胞濃度を高く維持することができ、生産性の高いタンパク質の製造を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は培養槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび培養槽１内の培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００６１】
本発明で用いられる分離膜エレメントの好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントについて、次に図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【００６２】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１７を介して濾過培養装置外部に取り出される。
【００６３】
図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成されている。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して濾過培養装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過されたタンパク質を含む濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して濾過培養装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００６４】
本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。濾過培養装置内が滅菌可能であれば、濾過培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した濾過培養が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材には、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置では、分離膜エレメントは、図１のように培養槽外に設置しても良いし、図２のように培養槽内に設置しても良い。分離膜エレメントを培養槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、培養槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。
【００６６】
本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、図１又は図２の概要図に示す装置を用いたタンパク質の製造例に関して、実施例を挙げて説明する。
【００６８】
参考例１ 多孔性膜の作製（その１）
樹脂として、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドをそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００６９】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８７．０重量％。
【００７０】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質樹脂層が形成された多孔質基材を得た。
【００７１】
水：３０．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：７０．０重量％。
【００７２】
この多孔質基材をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。
【００７３】
多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、０．１μｍであった。
【００７４】
次に、上記分離膜について、純水透過係数を評価した。５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【００７５】
また、平均細孔径の標準偏差 は、０．０３５μｍ、膜表面粗さは０．０６μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は、本発明に好適に用いることができた。
【００７６】
参考例２ 多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、開孔剤として、分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドと、非溶媒として純水を、それぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００７７】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
ポリエチレングリコール：５．５重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：７８．０重量％
純水：３．５重量％。
【００７８】
次に、上記原液を２５℃に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ３、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の熱水に３回浸漬して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびポリエチレングリコールを洗い出し、分離膜を得た。
【００７９】
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。
【００８０】
この分離膜について、純水透過係数を評価した。純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【００８１】
平均細孔径の標準偏差 は、０．００５５μｍ、膜表面粗さは、０．１μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることができた。
【００８２】
参考例３ 多孔性膜の作製（その３）
以下に示す組成の原液を用いたほかは、参考例３と同様にして、分離膜を得た。
【００８３】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
ポリエチレングリコール ：５．５重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８１．５重量％。
【００８４】
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は０．１９μｍであった。
【００８５】
この分離膜について、純水透過係数を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【００８６】
また、平均細孔径の標準偏差は、０．０６０μｍ、膜表面粗さは、０．０８μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることができた。
【００８７】
参考例４ 多孔性膜の作製（その４）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドをそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００８８】
ポリフッ化ビニリデン：１５．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８５．０重量％。
【００８９】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ３、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質樹脂層が形成された多孔質基材を得た。
【００９０】
水：１００．０重量％。
【００９１】
この多孔質基材をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．００８μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、０．３×１０−９ｍ３／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は、０．００２μｍ、膜表面粗さは、０．０６μｍであった。
【００９２】
参考例５ 多孔性膜の作製（その５）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【００９３】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を中空糸膜表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた中空糸膜を製作した。得られた中空糸膜は被処理水側表面の平均孔径が０．０５μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０−９ｍ３／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【００９４】
参考例６ 組換えモノクローナル抗体を生産するＣＨＯ細胞株の調製
（１）無血清培地への馴化
組換えモノクローナル抗体生産CHO細胞株としては、CHO DP12 clone#1934（細胞・微生物・遺伝子バンクであるAmerican Type Cell Culture Collection（ATCC）より、ATCC# CRL-12445として入手可能）を用いた。本細胞は、anti IL8 antibodyを生産し、そのIsotypeはhuman IgG1である。本細胞を撹拌培養可能な無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、20μg/mLインスリンおよび抗生物質としてペニシリン(25U/mL)、ストレプトマイシン(25μg/mL)を添加したDMEM/F12（インビトロジェン社製）を準備した。CHO DP12 clone #1934は10%FBSを含むIMDM培地（血清培地）で継代しており、本細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地A），５０：５０(培地B)，１００：０(培地C)の混合液をそれぞれ用意し、２５０mL三角フラスコを用いて細胞接種時に細胞密度５×105cells/mLとなるように調製し、まず培地Aで37度5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Bで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Cで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。得られた細胞株を、「DP12/CHOSF」とした。これらの細胞は、20ug/mLインスリン存在下生育可能なインスリン要求性の細胞であり、浮遊性細胞である。
【００９５】
（２）組換えモノクローナル抗体の定量
上記（１）の培養上清中に製造された組換えモノクローナル抗体（anti-IL8 antibody）の定量は、Human IgG ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定により行った。
【００９６】
参考例７ マウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の調製
（１）無血清培地への馴化
マウスモノクローナル抗体製造細胞として、マウスハイブリドーマ細胞株Ａ−ＨＥＲ２（American Type Cell Culture CollectionよりATCC# CRL-10463として入手可能）を用いた。本細胞は、ＨＥＲ２受容体に対するマウスモノクローナル抗体を製造し、そのIsotypeはマウスＩｇＧ１である。本細胞を無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ―ＳＦＭ（インビトロジェン社製）を準備した。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ―ＳＦＭは、細胞増殖因子としてトランスフェリンおよびインシュリンを各１０μｇ／ｍＬ含む無血清培地である。A-HER2は10%FBSを含むＤＭＥＭ培地（血清培地）で継代しており、本細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地A），５０：５０(培地B)，１００：０(培地C)の混合液をそれぞれ用意し、２５０mL三角フラスコを用いて細胞接種時に細胞密度５×105cells/mLとなるように調製し、まず培地Aで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Bで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Cで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。得られた細胞株を、「A-HER2SF」とした。
【００９７】
（２）マウスモノクローナル抗体の定量
上記（１）の培養上清中に製造されたマウスモノクローナル抗体（anti-HER2 antibody）の定量は、Mouse IgG ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ロシュ社製）による測定により行った。
【００９８】
参考例８ 組換えネコエリスロポエチン（ネコＥＰＯ）を生産するＣＨＯ細胞株の調製
（１）CHO細胞へのネコEPO遺伝子およびマウスdhfr遺伝子のトランスフェクション
ネコＥＰＯ遺伝子およびマウスdhfr遺伝子をそれぞれ含む発現用遺伝子ベクターDNAをそれぞれ100μg,10μgを調製し、CHO-DG44/dhfr-細胞（インビトロジェン社製）１×107cells/750μL DMEM/F12培地を調製したものと混合した。室温で３０分静置し、エレクトロポレーション装置（バイオラッド社製）に設置し、330μF,400Vで通電した。５分間静置後、氷上でさらに１０分静置し、10%FBS、CHO-SFM培地（インビトロジェン社製）１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍシャーレにまいた。３７℃、５％CO2条件下２日間培養し、細胞を遠心操作により回収し、10%FBS、0.3mg/mLG-418を含むCHO-SFM培地（インビトロジェン社製）１０ｍＬに懸濁し、100μL/wellの割合で９６穴プレートに処理した。３日毎に10%FBS、0.3mg/mL G-418を含むCHO-SFM培地で交換し、１５日間培養を行った。１５日後、顕微鏡観察を行い、生存している細胞を選択し、コロニー単離を行った。
【００９９】
（２）メトトレキセートによる遺伝子増幅
上記（１）で得られたクローンを0.3mg/mLG-418を含むCHO-SFM培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、2×105cells/10ｍＬ/10cmシャーレを準備し、最終濃度5nMメトトレキセート（MTX）を添加した。３日毎に5nM MTXを含む上記培地と交換し、10-15日間培養を継続し、細胞が生存していてコロニーを形成しているものについて、細胞を回収し、2×105cells/10ｍＬ/10cmシャーレを準備し、最終濃度50nMメトトレキセート（MTX）を添加した。同様の方法で、500 nM MTXまで処理を行い、細胞の生存が確認できるクローンを選別した。ここで作製したネコＥＰＯをコードするＤＮＡ及びマウスdhfrをコードするＤＮＡを含む組換えCHO細胞を、「rFeEPO/CHO11」とした。
【０１００】
（３）ネコＥＰＯの活性測定
上記（２）の培養上清中に製造されたネコＥＰＯの活性測定は、ヒトＥＰＯの活性測定法を適応し、ＴＦ−１細胞（American Type Cell Culture CollectionよりATCC# CRL-2003として入手可能）を用いて以下のようにして行った。
【０１０１】
ＴＦ−１細胞をRPMI1640/10%FBS培地に懸濁し、2×105cells/mLに調製し、96穴microplateに100μL添加した。さらに標準品として、ヒトＥＰＯの10U、5U、1U、0.5U、0.1U、0Uをそれぞれ10μL、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製サンプルの原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液、１０００倍希釈液それぞれを10μL添加し、５％CO2、37℃条件下、24時間培養し、cell counting kit-8（ドージンドウ社製）を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、kitのWST-8を各穴10μＬずつ添加し、1時間培養後、ELISA Plate reader(アマシャム社製)により吸光度A450を測定した。
【０１０２】
標準品として用いたヒトＥＰＯの各添加量（10U、5U、1U、0.5U、0.1U、0U）における吸光度A450をプロットしたグラフを検量用に用いて、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製液×1000、×100希釈液の吸光度から、各ネコＥＰＯ精製液中のネコＥＰＯ含有量を定量した。
（４）ネコＥＰＯの検出
上記（２）で得られた培養上清中のネコＥＰＯをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、rFeEPO/CHO11の約30〜35ｋＤのバンドを検出した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（R & D system社製）を用いて、培養液中のネコＥＰＯの定量を行った。その結果、ネコＥＰＯの生産速度は４００〜６００U/106 cells/48hであった。ネコEPOの推定分子量がおよそ30〜35kDaであり、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定の結果、ＥＰＯの定量が可能であったことから、上記（２）の培養上清中にネコEPOが発現したものと考えられる。
【０１０３】
実施例１ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その１）
図１の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μｇ／ｍＬヒトインスリン（組換え体））を用い、組換えモノクローナル抗体の製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。実施例１における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１０４】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１０５】
動物細胞として、参考例６で調整したＣＨＯ細胞株「ＤＰ１２／ＣＨＯＳＦＭ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１０６】
まずDP12/CHOSF株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、モノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１０７】
３００時間の濾過培養を行った結果を表１に示す。
【０１０８】
表中、タンパク質生産総重量は、各装置で培養期間中（本実施例では３００時間）に生産された目的のタンパク質の総重量を示している。回収した濾液中に含まれる目的タンパク質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、さらに使用培地量（Ｌ）を乗じて、タンパク質生産総重量とした。タンパク質生産総重量（ｍｇ）を、培養時間（ｈ）および使用培地量（Ｌ）で除した値を、タンパク質生産速度（ｍｇ／ｈ・ｄａｙ）とした。最大到達生細胞密度は、培養全期間中における、生細胞数の最大値である。生細胞数は、培養液を少量分取し、トリパンブルー染色を行い、未染色の細胞を生細胞として、血球計算板を用い細胞数（ｃｅｌｌｓ/ｍＬ）を測定した。
【０１０９】
図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１０】
実施例２ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その２）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様にモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１１】
実施例３ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その３）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様にモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１２】
実施例４ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その４）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例１と同様にモノクローナル抗体の製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１３】
実施例５ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その５）
図２の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μｇ／ｍＬヒトインスリン（組換え体））を用い、組換えモノクローナル抗体の製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１１４】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１１５】
動物細胞として、参考例６で調整したＣＨＯ細胞株「ＤＰ１２／ＣＨＯＳＦＭ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１１６】
まずDP12/CHOSF株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、モノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１１７】
３００時間の濾過培養を行った結果を表１に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１８】
実施例６ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その６）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例５と同様のモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１９】
実施例７ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その７）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例５と同様のモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２０】
実施例８ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その８）
分離膜として参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例５と同様のモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２１】
比較例１ 回分培養による組換えモノクローナル抗体の製造
動物細胞を用いたタンパク質の製造形態として最も典型的な回分培養を行い、そのタンパク質の生産性を評価した。図１の膜分離型濾過培養装置の培養槽１のみを用いた回分培養試験を行った。本比較例でも、動物細胞として、参考例６で調製したＣＨＯ細胞株「ＤＰ１２／ＣＨＯＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。比較例１の運転条件を以下に示す。
【０１２２】
培養槽容量（培地量）：１（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。
【０１２３】
まずＤＰ１２／ＣＨＯＳＦ株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させることなく回分培養を行った。
【０１２４】
回分培養の結果を表１に示す。
【０１２５】
比較例２ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その９）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例１と同様に行った。
【０１２６】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけ組換えモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１２７】
比較例３ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その１０）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例４と同様に行った。
【０１２８】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
以上、表１に示す実施例１〜８及び比較例１の結果、また比較例２及び３の結果からわかるように、図１および図２に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、組換えモノクローナル抗体を効率よく製造することができた。また、従来の方法に比べて、その生産量および生産速度が大幅に向上した。
【０１３１】
実施例９ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その１）
図１の濾過培養装置とＣＤ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ−ＳＦＭ（インシュリン、トランスフェリン含）を用い、マウスモノクローナル抗体製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。実施例９における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１３２】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１３３】
動物細胞として、参考例７で調製したハイブリドーマ細胞株「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１３４】
まず「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ハイブリドーマ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、マウスモノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたマウスモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１３５】
３００時間の濾過培養を行った結果を表２に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したハイブリドーマ細胞の濾過培養およびその製造物であるマウスモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３６】
実施例１０ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その２）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例９と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したマウスモノクローナル抗体製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３７】
実施例１１ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その３）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例９と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３８】
実施例１２ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その４）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例９と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３９】
実施例１３ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その５）
図２の濾過培養装置とＣＤ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ−ＳＦＭ（インシュリン、トランスフェリン含）を用い、組換えモノクローナル抗体製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１４０】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１４１】
動物細胞として、参考例７で調整したハイブリドーマ細胞株「「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１４２】
まずＨＥＲ２／ＨＢＳＦ株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ハイブリドーマ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、マウスモノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたマウスモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１４３】
３００時間の濾過培養を行った結果を表２に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したハイブリドーマ細胞の濾過培養およびその製造物であるマウスモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４４】
実施例１４ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その６）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１３と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４５】
実施例１５ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その７）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１３と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４６】
実施例１６ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その８）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例１３と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４７】
比較例４ 回分培養によるハイブリドーマ細胞株を用いマウスモノクローナル抗体の生産
動物細胞を用いた有用タンパク質の生産形態として最も典型的な回分培養を行い、その有用タンパク質の生産性を評価した。図１の膜分離型濾過培養装置の培養槽１のみを用いた回分培養試験を行った。本比較例でも、動物細胞として、参考例７で調整したハイブリドーマ細胞株「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」を使用し、有用タンパク質の定量には、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キットを使用した。比較例４の運転条件を以下に示す。
【０１４８】
培養槽容量（培地量）：１（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。
【０１４９】
まずDP12/CHOSF株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ハイブリドーマ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させることなく回分培養を行った。
【０１５０】
回分培養の結果を表２に示す。
【０１５１】
比較例５ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その９）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例９と同様に行った。
【０１５２】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけマウスモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１５３】
比較例６ ハイブリドーマ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その１０）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例１３と同様に行った。
【０１５４】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけマウスモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
以上、表２に示す実施例９〜１６及び比較例４の結果、また比較例５及び６の結果からわかるように、図１および図２に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、マウスモノクローナル抗体を効率よく製造することができた。また、従来の方法に比べて、その生産量および生産速度が大幅に向上した。
【０１５７】
実施例１７ ＣＨＯ細胞株を用いたネコエリスロポエチン（ネコＥＰＯ）の製造（その１）
図１の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μｇ／ｍＬヒトインシュリン）を用い、ネコＥＰＯ製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。実施例７における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１５８】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１５９】
動物細胞として、参考例８で調整したＣＨＯ細胞株「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトエリスロポエチン ＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。
【０１６０】
まず「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、ネコＥＰＯの製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたネコＥＰＯ濃度を測定した。
【０１６１】
３００時間の濾過培養を行った結果を表３に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるネコＥＰＯの製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６２】
実施例１８ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その２）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１７と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したモノクローナル抗体製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６３】
実施例１９ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その３）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１７と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６４】
実施例２０ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その４）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例１７と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６５】
実施例２１ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その５）
図２の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μ／ｍＬ ヒトインシュリン）を用い、ネコＥＰＯ製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１６６】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１６７】
動物細胞として、参考例８で調整したＣＨＯ細胞株「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトエリスロポエチン ＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。
【０１６８】
まず「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、ネコＥＰＯの製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたネコＥＰＯ濃度を測定した。
【０１６９】
３００時間の濾過培養を行った結果を表３に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるネコＥＰＯの製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１７０】
実施例２２ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その６）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例２１と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１７１】
実施例２３ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その７）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例２１と同様のネコＥＰＯ製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した
実施例２４ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その８）
離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例２１と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１７２】
比較例７ 回分培養によるＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造
動物細胞を用いたタンパク質の製造形態として最も典型的な回分培養を行い、そのタンパク質の生産性を評価した。図１の膜分離型濾過培養装置の培養槽１のみを用いた回分培養試験を行った。本比較例でも、動物細胞として、参考例８で調整したＣＨＯ細胞株ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦを使用し、タンパク質の定量には、ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。比較例４の運転条件を以下に示す。
【０１７３】
培養槽容量（培地量）：１（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養槽攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。
【０１７４】
まずＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させることなく回分培養を行った。
【０１７５】
回分培養の結果を表３に示す。
【０１７６】
比較例８ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その７）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例７と同様に行った。
【０１７７】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけネコＥＰＯの製造に不適であることが明らかになった。
【０１７８】
比較例９ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その８）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例１０と同様に行った。
【０１７９】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけネコＥＰＯの製造に不適であることが明らかになった。
【０１８０】
【表３】
【０１８１】
以上、表３に示す実施例１７〜２４及び比較例７の結果、また比較例８及び９の結果からわかるように、図１および図２に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、ネコエリスロポエチンを効率よく製造することができた。また、従来の方法に比べて、その生産量および生産速度が大幅に向上した。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型濾過培養装置の例を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型濾過培養装置の例を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの例を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【符号の説明】
【０１８３】
１ 培養槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ
２３ ＤＯセンサ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液の濾過に多孔性膜を使用した動物細胞の連続培養によるタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞を培養して、タンパク質を製造する培養方法は、大きく（１）回分培養法（Ｂａｔｃｈ培養法）および流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh培養法）と（２）濾過培養法に分類することができる。
【０００３】
回分および流加培養法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし培養期間とともに、培養液中の栄養源が枯渇していき、また一方で動物細胞の産生するアンモニア、乳酸などの老廃物が培養液に蓄積し、細胞増殖を阻害する。また、これらの細胞増殖阻害は、細胞密度を低下させ培養容積当たりのタンパク質の製造効率を低下させる要因となる。
【０００４】
一方、濾過培養法では、栄養源が枯渇し、蓄積した老廃物を、目的タンパク質を含む培養液から濾過処理により間欠的にあるいは連続的に除去し、その代わりに新鮮培地を供給することで、培養槽内での老廃物の蓄積を回避させつつ、細胞の生存率、細胞密度、およびタンパク質の生産性を高い状態で維持することができる。これにより、動物細胞のタンパク質の生産性を、長期間にわたって維持できるという特徴がある。
【０００５】
このような動物細胞の濾過培養法では、動物細胞と培養液を分離する分離装置を培養槽内あるいは培養槽外に設置する必要がある。この分離装置として、これまで有機高分子膜、デプスフィルター、セラミックフィルター、金属フィルターを用いた例が開示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの従来技術において、培養経過に伴う分離膜の目詰まりが課題としてあった。分離膜の目詰まりは、動物細胞と培養液の分離ができなくなるばかりではなく、膜間差圧を高める要因となる。従来技術として、細孔径が０．２５μｍ以下の分離膜を使用して、細菌を培養し、化合物を製造する例が開示されているが、細菌と培養液の膜分離において、高い膜間差圧（約２００ｋＰａ）が必要であった（特許文献１）。高い膜間差圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において動物細胞が圧力によって物理的なダメージをうけることから、動物細胞を連続的に培養液に戻す濾過培養においては適切ではない。
【０００７】
また、このような動物細胞培養時の分離膜の目詰まりを解消するために、膜分離装置自身が回転し、その遠心力を利用して膜の目詰まりを抑制する方法が開示されている（特許文献２，３）。しかしながら、上記手法においては、培養装置に新たな駆動箇所を設置する必要があり、特に大量培養用の装置には適応が困難である。
【０００８】
また、動物細胞を濾過培養するための分離膜として、セラミックフィルター（非特許文献１）や金属フィルター（特許文献４）を使用した例が開示されているが、これらの分離膜装置は非常に高価なものとなる。また、これら分離膜は洗浄して、再利用することも可能であるが、多孔性形状であるため完全な洗浄操作は難しく、また洗浄操作をバリデーションすることも困難である。
【特許文献１】特開２００５−３３３８８６号公報
【特許文献２】特開平１０−２１６４２２号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９７７号公報
【特許文献４】特開平６−２３７７５４号公報
【非特許文献１】ドング・ハオディら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００５，２１，１４０−１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決しようとするものであって、低い膜間差圧で、動物細胞と培養液とを濾過分離して、長期間培養を行うことができる分離膜を使用することで、従来技術と比べて効率的に動物細胞を培養してタンパク質製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満有機高分子からなる分離膜を作製し、これを用いることによって、動物細胞が培養液中に製造するタンパク質を効率的に製造できることを見出し本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔８〕から構成される。
〔１〕タンパク質を培養液中に生産する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続濾過培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法。
〔２〕多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である〔１〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔３〕多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔４〕多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔５〕多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔６〕多孔性膜の膜素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔７〕動物細胞がハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｂｍ細胞の群から選ばれるいずれかの動物細胞である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔８〕タンパク質がモノクローナル抗体である〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のタンパク質製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のタンパク質の製造方法では、培養液を濾過し、新鮮培地を培養液に供給することで、動物細胞におけるタンパク質の製造速度を高めることが可能で、効率的なタンパク質の製造が可能となる。本発明において動物細胞と培養液との分離に使用する分離膜は、動物細胞の濾過を非常に低い膜間差圧で実施することが可能である。したがって、従来の高い濾過圧を必要とする製造方法に比べ、動物細胞に与えるダメージが少なくて済むため、タンパク質製造効率が向上する。また、本発明で使用する分離膜は、目詰まりを起こしにくい膜であるので、濾過培養によるタンパク質の製造を、長期間安定してまた低い濾過圧で実施することが可能であり、非常に経済的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、タンパク質を培養液中に製造する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液からタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法である。
【００１４】
本発明において分離膜として用いられる多孔性膜は、培養に使用される動物細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。
【００１５】
次に、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜としての多孔性膜に強度を与えるものである。
【００１６】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００１７】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔性膜を構成する多孔質樹脂層の素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００１８】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、その他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００１９】
本発明で用いられる多孔性膜の作製方法の概要を説明する。まず、上述した多孔質基材の表面に、上述した樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原液を多孔質基材に含浸させる。しかる後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。原液にさらに非溶媒を含ませることもできる。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。
【００２０】
ここで、原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００２１】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯが好ましく用いられる。
【００２２】
さらに、原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００２３】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００２４】
上述のように、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸膜の内部に含んでいても良い。
【００２５】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００２６】
分離膜としての多孔性膜の平均細孔径が上記のように０．０１μｍ以上１μｍ未満の範囲内にあると、動物細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。微生物として細菌類を用いた場合、多孔性膜の平均細孔径は好ましくは０.４μｍ以下であり、平均細孔径は０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径を０．２μｍ未満にすることにより、分離膜を介した好ましくない細菌の混入あるいは流出を抑制することが可能になる。これにより、特に濾液からの細菌の混入のリスクを低減できる。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、本発明では、平均細孔径は０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００２７】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００２８】
また、上記の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、培養運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。
【００２９】
平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００３０】
【数１】
【００３１】
本発明で用いられる多孔性膜においては、培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００３２】
本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。好ましくは膜表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で連続培養が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより安定した濾過培養が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００３３】
また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることにより、動物細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、動物細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００３４】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００３５】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００３６】
【数２】
【００３７】
本発明において、動物細胞を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、動物細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は、好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下の範囲である。上記の膜間差圧０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲を外れた場合、微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、濾過培養運転に不具合を生じることがある。
【００３８】
濾過の駆動力としては、培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができる。また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００３９】
また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができる性能を有するものであることが好ましい。また、本発明で使用される多孔性膜は、上述のように、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。
【００４０】
本発明のタンパク質の製造方法に用いることができる動物細胞について説明する。本発明で使用される動物細胞には、哺乳動物由来細胞及び昆虫細胞のいずれも含まれる。また、本発明のタンパク質の製造方法で使用される動物細胞としては、タンパク質を培養液中に分泌する細胞または細胞内に蓄積する細胞のいずれも使用することができるが、前者の培養液にタンパク質を分泌生産する細胞であることが好ましい。
【００４１】
本発明のタンパク質の製造方法に用いることができるタンパク質を分泌生産することができる好適な動物細胞種として、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｂｍ細胞などが使用される。これらの動物細胞は、接着依存性細胞と、浮遊細胞に分類される。本発明で使用される動物細胞は、接着依存性細胞および浮遊細胞の双方に使用可能である。ただし、接着依存性細胞に関しては、付着のための細胞支持体が存在しないと、増殖速度が極めて遅くなる。したがって、接着依存性細胞を接着状態で培養する際は、マイクロキャリアと呼ばれる細胞接着のための粒子を培養液に加えて培養することが好ましい。マイクロキャリアに関しては、“サイトデックス”（ＧＥヘルスケア社製）、“セルヤードビーズ”（ペンタックス社製）、“２Ｄマイクロヘクス”（ヌンク社製）など一般に市販の製品を使用することができる。また、これらの接着依存性細胞は、攪拌培養あるいは振とう培養を行い、浮遊性の細胞を選択していくことで、浮遊細胞に馴化することも可能である。
【００４２】
ハイブリドーマ細胞とは、２種類の異なる細胞株を人工的に融合した雑種細胞株のことをいう。特に本発明では、抗体生産細胞と、骨髄腫（ミエローマ）細胞との融合したハイブリドーマのことをいう。上記ハイブリドーマ細胞は、培養液中にタンパク質として、モノクローナル抗体を生産する。
【００４３】
ＣＨＯ細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のことであり、チャイニーズハムスター卵巣組織から樹立された細胞株である。ＣＨＯ細胞は、高いタンパク質生産能力を有する細胞であることから、タンパク質をコードする遺伝子を導入することで、タンパク質生産株として使用できる。
【００４４】
ＨＥＫ２９３は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株のことをいう。
【００４５】
ＣＯＳ細胞は、アフリカミドリザル腎臓由来の細胞株であって、複製開始点を欠失したＳＶ４０で形質転換した細胞株である。ＳＶ４０の複製開始点をもつプラスミドＤＮＡを核内増幅させることが可能である。
【００４６】
Ｓｆ９細胞およびＢｍ細胞は、双方とも鱗翔目昆虫由来細胞株であって、Ｓｆ９がヨトウガ卵巣由来細胞、Ｂｍ細胞がカイコガ卵巣由来細胞である。これらの細胞は、目的遺伝子を連結したバキュロウイルスベクターにより形質転換することができ、タンパク質を培養液に生産する細胞株を取得することが可能である。
【００４７】
本発明のタンパク質の製造方法で製造されるタンパク質としては、上記動物細胞が培養液中に生産するタンパク質であって、サイトカイン類や抗体など挙げることができる。例えば、抗体としては、マウスハイブリドーマ細胞やラビットハイブリドーマ細胞、ヒトハイブリドーマ細胞などを用いることによってモノクローナル抗体の製造が可能である。また、マウスの可変領域とヒト定常領域を連結したキメラ抗体、あるいはマウス可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ領域）を、ヒト由来ＦＲ配列に置換したヒト型抗体などもタンパク質として製造可能である。また、サイトカイン類としては、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー形成促進因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ウロキナーゼ、インターフェロン、プラスミノーゲン・アクチベーター、インターロイキン、エリスロポエチンなどが製造可能なタンパク質として例示できる。
【００４８】
本発明のタンパク質の製造方法には、動物細胞を培養するための培地を使用する。本発明でいう培地は、（ｉ）動物細胞の培養に使用している培地、すなわち培養液自体、（ｉｉ）動物細胞の培養に使用していないものであって培養液に外部より新たに追加する新鮮培地、の両方を意味する。本発明では、目的タンパク質の種類および濃度によって、血清培地、無血清培地、無タンパク質培地を選択して用いることができる。一般に、動物細胞を用いたタンパク質の製造には、無血清培地あるいは無タンパク質培地が好ましく使用される。これは無血清培地であると、動物細胞が培養液中に生産したタンパク質を効率的に精製することが可能となるためである。したがって、本発明の製造方法においても、無血清培地あるいは無タンパク質培地で動物細胞を培養した方が、タンパク質の精製が容易となるため好ましい。ただし、本発明の製造方法で使用する分離膜は、血清成分であるタンパク質成分をすべて透過させることができるので、分離膜を使用して血清培地を除去し、無血清培地を代わりに添加し、培養槽内で異なる成分の培地に交換することも可能である。このような培養方法は、無血清条件下で増殖性が低い動物細胞を用いてタンパク質を製造する際に、有効な手段である。すなわち、血清培地で動物細胞を高密度状態まで増殖させ、その後培地を無血清培地に変更しタンパク質の製造を行うことが可能である。
【００４９】
本発明の濾過培養によるタンパク質の製造方法は、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に培養槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と培養槽間で培養液を循環させる動力手段が不要となる。分離膜エレメントは、培養槽の外側に設置しても良いし、培養槽内部に設置して培養装置をコンパクト化することもできる。
【００５０】
まず、本発明の濾過培養によるタンパク質の製造方法で用いられる培養装置のうち、分離膜エレメントが、培養槽の外部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。図１は、本発明で用いられる培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００５１】
図１において、培養装置は、動物細胞を培養させるための培養槽１と、その培養槽１に培養液循環ポンプ１１を介して接続され内部に分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、培養槽１の内の培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することが好適である。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００５２】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を培養槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で培養槽１内の培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって培養液の温度を調節することにより、生産性の高いタンパク質の製造を行うことができる。また、ＤＯ（溶存酸素）センサ２３およびこれと連動するガス混合機によって、気体供給装置４を通じて培養液中にパージする酸素分圧を設定・制御することが可能である。さらに、装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって培養槽１と膜分離槽１２の間を循環する。タンパク質を含む培養液は、分離膜エレメント２によって動物細胞が濾過・分離され、タンパク質を含む培養液は装置系から取り出される。
【００５３】
ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、培養液の溶存酸素や酸化還元電位（ＯＲＰ）の制御を行うことができ、更には、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中のタンパク質の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、上記計装・制御装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００５４】
また、濾過・分離された動物細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の動物細胞濃度を高く維持することができ、生産性の高いタンパク質の製造を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行なうことができ、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の培養液量を適当に調節することができる。また、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。
【００５５】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を調整制御することができる。
【００５６】
次に、本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置のうち、分離膜エレメントが培養槽の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる他の培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００５７】
図２において、濾過培養装置は、動物細胞を培養させるための培養槽１と、その培養槽１の内の培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。培養槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００５８】
次に、図２の濾過培養装置による培養の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を培養槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、培養槽１に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。製造時には、必要に応じて、培養槽１内の攪拌機５で培養槽１内の培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を培養槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養槽１内の培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって培養槽１内の培養液の温度を調節することにより生産性の高い製造を行うことができる。また、ＤＯセンサ２３およびこれと連動するガス混合器、および気体供給装置４により、培養液中の溶存酸素濃度を一定にすることができる。
【００５９】
計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節には、図１の培養装置と同様の調節を行うことができる。
【００６０】
培養液は、培養槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、動物細胞は濾過・分離されタンパク質を含む培地は装置系から取り出される。また、濾過・分離された動物細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の動物細胞濃度を高く維持することができ、生産性の高いタンパク質の製造を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は培養槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび培養槽１内の培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００６１】
本発明で用いられる分離膜エレメントの好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントについて、次に図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【００６２】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１７を介して濾過培養装置外部に取り出される。
【００６３】
図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成されている。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して濾過培養装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過されたタンパク質を含む濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して濾過培養装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００６４】
本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。濾過培養装置内が滅菌可能であれば、濾過培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した濾過培養が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材には、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置では、分離膜エレメントは、図１のように培養槽外に設置しても良いし、図２のように培養槽内に設置しても良い。分離膜エレメントを培養槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、培養槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。
【００６６】
本発明のタンパク質の製造方法で用いられる濾過培養装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、図１又は図２の概要図に示す装置を用いたタンパク質の製造例に関して、実施例を挙げて説明する。
【００６８】
参考例１ 多孔性膜の作製（その１）
樹脂として、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドをそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００６９】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８７．０重量％。
【００７０】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質樹脂層が形成された多孔質基材を得た。
【００７１】
水：３０．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：７０．０重量％。
【００７２】
この多孔質基材をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。
【００７３】
多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、０．１μｍであった。
【００７４】
次に、上記分離膜について、純水透過係数を評価した。５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【００７５】
また、平均細孔径の標準偏差 は、０．０３５μｍ、膜表面粗さは０．０６μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は、本発明に好適に用いることができた。
【００７６】
参考例２ 多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、開孔剤として、分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドと、非溶媒として純水を、それぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００７７】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
ポリエチレングリコール：５．５重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：７８．０重量％
純水：３．５重量％。
【００７８】
次に、上記原液を２５℃に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ３、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の熱水に３回浸漬して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびポリエチレングリコールを洗い出し、分離膜を得た。
【００７９】
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。
【００８０】
この分離膜について、純水透過係数を評価した。純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【００８１】
平均細孔径の標準偏差 は、０．００５５μｍ、膜表面粗さは、０．１μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることができた。
【００８２】
参考例３ 多孔性膜の作製（その３）
以下に示す組成の原液を用いたほかは、参考例３と同様にして、分離膜を得た。
【００８３】
ポリフッ化ビニリデン：１３．０重量％
ポリエチレングリコール ：５．５重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８１．５重量％。
【００８４】
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は０．１９μｍであった。
【００８５】
この分離膜について、純水透過係数を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【００８６】
また、平均細孔径の標準偏差は、０．０６０μｍ、膜表面粗さは、０．０８μｍであった。このようにして作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることができた。
【００８７】
参考例４ 多孔性膜の作製（その４）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂と、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドをそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００８８】
ポリフッ化ビニリデン：１５．０重量％
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド：８５．０重量％。
【００８９】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ３、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質樹脂層が形成された多孔質基材を得た。
【００９０】
水：１００．０重量％。
【００９１】
この多孔質基材をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．００８μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、０．３×１０−９ｍ３／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は、０．００２μｍ、膜表面粗さは、０．０６μｍであった。
【００９２】
参考例５ 多孔性膜の作製（その５）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【００９３】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を中空糸膜表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた中空糸膜を製作した。得られた中空糸膜は被処理水側表面の平均孔径が０．０５μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０−９ｍ３／ｍ２・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【００９４】
参考例６ 組換えモノクローナル抗体を生産するＣＨＯ細胞株の調製
（１）無血清培地への馴化
組換えモノクローナル抗体生産CHO細胞株としては、CHO DP12 clone#1934（細胞・微生物・遺伝子バンクであるAmerican Type Cell Culture Collection（ATCC）より、ATCC# CRL-12445として入手可能）を用いた。本細胞は、anti IL8 antibodyを生産し、そのIsotypeはhuman IgG1である。本細胞を撹拌培養可能な無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、20μg/mLインスリンおよび抗生物質としてペニシリン(25U/mL)、ストレプトマイシン(25μg/mL)を添加したDMEM/F12（インビトロジェン社製）を準備した。CHO DP12 clone #1934は10%FBSを含むIMDM培地（血清培地）で継代しており、本細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地A），５０：５０(培地B)，１００：０(培地C)の混合液をそれぞれ用意し、２５０mL三角フラスコを用いて細胞接種時に細胞密度５×105cells/mLとなるように調製し、まず培地Aで37度5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Bで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Cで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。得られた細胞株を、「DP12/CHOSF」とした。これらの細胞は、20ug/mLインスリン存在下生育可能なインスリン要求性の細胞であり、浮遊性細胞である。
【００９５】
（２）組換えモノクローナル抗体の定量
上記（１）の培養上清中に製造された組換えモノクローナル抗体（anti-IL8 antibody）の定量は、Human IgG ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定により行った。
【００９６】
参考例７ マウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の調製
（１）無血清培地への馴化
マウスモノクローナル抗体製造細胞として、マウスハイブリドーマ細胞株Ａ−ＨＥＲ２（American Type Cell Culture CollectionよりATCC# CRL-10463として入手可能）を用いた。本細胞は、ＨＥＲ２受容体に対するマウスモノクローナル抗体を製造し、そのIsotypeはマウスＩｇＧ１である。本細胞を無血清培地への馴化を行った。無血清培地として、ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ―ＳＦＭ（インビトロジェン社製）を準備した。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ―ＳＦＭは、細胞増殖因子としてトランスフェリンおよびインシュリンを各１０μｇ／ｍＬ含む無血清培地である。A-HER2は10%FBSを含むＤＭＥＭ培地（血清培地）で継代しており、本細胞を用いて以下の方法で馴化した。無血清培地：血清培地＝０：１００（培地A），５０：５０(培地B)，１００：０(培地C)の混合液をそれぞれ用意し、２５０mL三角フラスコを用いて細胞接種時に細胞密度５×105cells/mLとなるように調製し、まず培地Aで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Bで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。継代を４−６回行い、次に培地Cで37℃5%CO2存在下細胞培養を行った。得られた細胞株を、「A-HER2SF」とした。
【００９７】
（２）マウスモノクローナル抗体の定量
上記（１）の培養上清中に製造されたマウスモノクローナル抗体（anti-HER2 antibody）の定量は、Mouse IgG ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ロシュ社製）による測定により行った。
【００９８】
参考例８ 組換えネコエリスロポエチン（ネコＥＰＯ）を生産するＣＨＯ細胞株の調製
（１）CHO細胞へのネコEPO遺伝子およびマウスdhfr遺伝子のトランスフェクション
ネコＥＰＯ遺伝子およびマウスdhfr遺伝子をそれぞれ含む発現用遺伝子ベクターDNAをそれぞれ100μg,10μgを調製し、CHO-DG44/dhfr-細胞（インビトロジェン社製）１×107cells/750μL DMEM/F12培地を調製したものと混合した。室温で３０分静置し、エレクトロポレーション装置（バイオラッド社製）に設置し、330μF,400Vで通電した。５分間静置後、氷上でさらに１０分静置し、10%FBS、CHO-SFM培地（インビトロジェン社製）１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍシャーレにまいた。３７℃、５％CO2条件下２日間培養し、細胞を遠心操作により回収し、10%FBS、0.3mg/mLG-418を含むCHO-SFM培地（インビトロジェン社製）１０ｍＬに懸濁し、100μL/wellの割合で９６穴プレートに処理した。３日毎に10%FBS、0.3mg/mL G-418を含むCHO-SFM培地で交換し、１５日間培養を行った。１５日後、顕微鏡観察を行い、生存している細胞を選択し、コロニー単離を行った。
【００９９】
（２）メトトレキセートによる遺伝子増幅
上記（１）で得られたクローンを0.3mg/mLG-418を含むCHO-SFM培地（インビトロジェン社製）で増殖させ、2×105cells/10ｍＬ/10cmシャーレを準備し、最終濃度5nMメトトレキセート（MTX）を添加した。３日毎に5nM MTXを含む上記培地と交換し、10-15日間培養を継続し、細胞が生存していてコロニーを形成しているものについて、細胞を回収し、2×105cells/10ｍＬ/10cmシャーレを準備し、最終濃度50nMメトトレキセート（MTX）を添加した。同様の方法で、500 nM MTXまで処理を行い、細胞の生存が確認できるクローンを選別した。ここで作製したネコＥＰＯをコードするＤＮＡ及びマウスdhfrをコードするＤＮＡを含む組換えCHO細胞を、「rFeEPO/CHO11」とした。
【０１００】
（３）ネコＥＰＯの活性測定
上記（２）の培養上清中に製造されたネコＥＰＯの活性測定は、ヒトＥＰＯの活性測定法を適応し、ＴＦ−１細胞（American Type Cell Culture CollectionよりATCC# CRL-2003として入手可能）を用いて以下のようにして行った。
【０１０１】
ＴＦ−１細胞をRPMI1640/10%FBS培地に懸濁し、2×105cells/mLに調製し、96穴microplateに100μL添加した。さらに標準品として、ヒトＥＰＯの10U、5U、1U、0.5U、0.1U、0Uをそれぞれ10μL、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製サンプルの原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液、１０００倍希釈液それぞれを10μL添加し、５％CO2、37℃条件下、24時間培養し、cell counting kit-8（ドージンドウ社製）を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、kitのWST-8を各穴10μＬずつ添加し、1時間培養後、ELISA Plate reader(アマシャム社製)により吸光度A450を測定した。
【０１０２】
標準品として用いたヒトＥＰＯの各添加量（10U、5U、1U、0.5U、0.1U、0U）における吸光度A450をプロットしたグラフを検量用に用いて、実施例３または４で得られたネコＥＰＯ精製液×1000、×100希釈液の吸光度から、各ネコＥＰＯ精製液中のネコＥＰＯ含有量を定量した。
（４）ネコＥＰＯの検出
上記（２）で得られた培養上清中のネコＥＰＯをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、rFeEPO/CHO11の約30〜35ｋＤのバンドを検出した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（R & D system社製）を用いて、培養液中のネコＥＰＯの定量を行った。その結果、ネコＥＰＯの生産速度は４００〜６００U/106 cells/48hであった。ネコEPOの推定分子量がおよそ30〜35kDaであり、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔによる測定の結果、ＥＰＯの定量が可能であったことから、上記（２）の培養上清中にネコEPOが発現したものと考えられる。
【０１０３】
実施例１ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その１）
図１の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μｇ／ｍＬヒトインスリン（組換え体））を用い、組換えモノクローナル抗体の製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。実施例１における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１０４】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１０５】
動物細胞として、参考例６で調整したＣＨＯ細胞株「ＤＰ１２／ＣＨＯＳＦＭ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１０６】
まずDP12/CHOSF株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、モノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１０７】
３００時間の濾過培養を行った結果を表１に示す。
【０１０８】
表中、タンパク質生産総重量は、各装置で培養期間中（本実施例では３００時間）に生産された目的のタンパク質の総重量を示している。回収した濾液中に含まれる目的タンパク質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、さらに使用培地量（Ｌ）を乗じて、タンパク質生産総重量とした。タンパク質生産総重量（ｍｇ）を、培養時間（ｈ）および使用培地量（Ｌ）で除した値を、タンパク質生産速度（ｍｇ／ｈ・ｄａｙ）とした。最大到達生細胞密度は、培養全期間中における、生細胞数の最大値である。生細胞数は、培養液を少量分取し、トリパンブルー染色を行い、未染色の細胞を生細胞として、血球計算板を用い細胞数（ｃｅｌｌｓ/ｍＬ）を測定した。
【０１０９】
図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１０】
実施例２ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その２）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様にモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１１】
実施例３ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その３）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様にモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１２】
実施例４ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その４）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例１と同様にモノクローナル抗体の製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１３】
実施例５ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その５）
図２の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μｇ／ｍＬヒトインスリン（組換え体））を用い、組換えモノクローナル抗体の製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１１４】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１１５】
動物細胞として、参考例６で調整したＣＨＯ細胞株「ＤＰ１２／ＣＨＯＳＦＭ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１１６】
まずDP12/CHOSF株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、モノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１１７】
３００時間の濾過培養を行った結果を表１に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１８】
実施例６ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その６）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例５と同様のモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１１９】
実施例７ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その７）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例５と同様のモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２０】
実施例８ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その８）
分離膜として参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例５と同様のモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表１に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１２１】
比較例１ 回分培養による組換えモノクローナル抗体の製造
動物細胞を用いたタンパク質の製造形態として最も典型的な回分培養を行い、そのタンパク質の生産性を評価した。図１の膜分離型濾過培養装置の培養槽１のみを用いた回分培養試験を行った。本比較例でも、動物細胞として、参考例６で調製したＣＨＯ細胞株「ＤＰ１２／ＣＨＯＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。比較例１の運転条件を以下に示す。
【０１２２】
培養槽容量（培地量）：１（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。
【０１２３】
まずＤＰ１２／ＣＨＯＳＦ株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させることなく回分培養を行った。
【０１２４】
回分培養の結果を表１に示す。
【０１２５】
比較例２ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その９）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例１と同様に行った。
【０１２６】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけ組換えモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１２７】
比較例３ ＣＨＯ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その１０）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例４と同様に行った。
【０１２８】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
以上、表１に示す実施例１〜８及び比較例１の結果、また比較例２及び３の結果からわかるように、図１および図２に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、組換えモノクローナル抗体を効率よく製造することができた。また、従来の方法に比べて、その生産量および生産速度が大幅に向上した。
【０１３１】
実施例９ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その１）
図１の濾過培養装置とＣＤ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ−ＳＦＭ（インシュリン、トランスフェリン含）を用い、マウスモノクローナル抗体製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。実施例９における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１３２】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１３３】
動物細胞として、参考例７で調製したハイブリドーマ細胞株「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１３４】
まず「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ハイブリドーマ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、マウスモノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたマウスモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１３５】
３００時間の濾過培養を行った結果を表２に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したハイブリドーマ細胞の濾過培養およびその製造物であるマウスモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３６】
実施例１０ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その２）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例９と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したマウスモノクローナル抗体製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３７】
実施例１１ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その３）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例９と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３８】
実施例１２ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その４）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例９と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１３９】
実施例１３ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その５）
図２の濾過培養装置とＣＤ Ｈｙｂｒｏｄｏｍａ−ＳＦＭ（インシュリン、トランスフェリン含）を用い、組換えモノクローナル抗体製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１４０】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１４１】
動物細胞として、参考例７で調整したハイブリドーマ細胞株「「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（ロシュ社製）を使用した。
【０１４２】
まずＨＥＲ２／ＨＢＳＦ株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ハイブリドーマ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、マウスモノクローナル抗体の製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたマウスモノクローナル抗体濃度を測定した。
【０１４３】
３００時間の濾過培養を行った結果を表２に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したハイブリドーマ細胞の濾過培養およびその製造物であるマウスモノクローナル抗体の製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４４】
実施例１４ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その６）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１３と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４５】
実施例１５ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その７）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１３と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４６】
実施例１６ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その８）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例１３と同様のマウスモノクローナル抗体製造を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したハイブリドーマ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１４７】
比較例４ 回分培養によるハイブリドーマ細胞株を用いマウスモノクローナル抗体の生産
動物細胞を用いた有用タンパク質の生産形態として最も典型的な回分培養を行い、その有用タンパク質の生産性を評価した。図１の膜分離型濾過培養装置の培養槽１のみを用いた回分培養試験を行った。本比較例でも、動物細胞として、参考例７で調整したハイブリドーマ細胞株「ＨＥＲ２／ＨＢＳＦ」を使用し、有用タンパク質の定量には、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キットを使用した。比較例４の運転条件を以下に示す。
【０１４８】
培養槽容量（培地量）：１（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。
【０１４９】
まずDP12/CHOSF株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ハイブリドーマ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させることなく回分培養を行った。
【０１５０】
回分培養の結果を表２に示す。
【０１５１】
比較例５ ハイブリドーマ細胞株を用いたマウスモノクローナル抗体の製造（その９）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例９と同様に行った。
【０１５２】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけマウスモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１５３】
比較例６ ハイブリドーマ細胞株を用いた組換えモノクローナル抗体の製造（その１０）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例１３と同様に行った。
【０１５４】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけマウスモノクローナル抗体の製造に不適であることが明らかになった。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
以上、表２に示す実施例９〜１６及び比較例４の結果、また比較例５及び６の結果からわかるように、図１および図２に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、マウスモノクローナル抗体を効率よく製造することができた。また、従来の方法に比べて、その生産量および生産速度が大幅に向上した。
【０１５７】
実施例１７ ＣＨＯ細胞株を用いたネコエリスロポエチン（ネコＥＰＯ）の製造（その１）
図１の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μｇ／ｍＬヒトインシュリン）を用い、ネコＥＰＯ製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。実施例７における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１５８】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１５９】
動物細胞として、参考例８で調整したＣＨＯ細胞株「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトエリスロポエチン ＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。
【０１６０】
まず「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、ネコＥＰＯの製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたネコＥＰＯ濃度を測定した。
【０１６１】
３００時間の濾過培養を行った結果を表３に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるネコＥＰＯの製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６２】
実施例１８ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その２）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１７と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したモノクローナル抗体製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６３】
実施例１９ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その３）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１７と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６４】
実施例２０ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その４）
分離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例１７と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１６５】
実施例２１ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その５）
図２の濾過培養装置とＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０μ／ｍＬ ヒトインシュリン）を用い、ネコＥＰＯ製造を行った。新鮮培地は、０．０２μｍの無菌濾過（ミリポア）を行い使用した。分離膜エレメント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
【０１６６】
培養槽容量：２（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整
培養槽容量：２（Ｌ）
新鮮培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（濾過培養開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。
【０１６７】
動物細胞として、参考例８で調整したＣＨＯ細胞株「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」を使用し、タンパク質の定量には、ヒトエリスロポエチン ＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。
【０１６８】
まず「ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ」株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、新鮮培地の連続供給を行い、膜分離型濾過培養装置の培養液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら濾過培養し、ネコＥＰＯの製造を行った。濾過培養を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過培養液中の製造されたネコＥＰＯ濃度を測定した。
【０１６９】
３００時間の濾過培養を行った結果を表３に示す。図１に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、安定したＣＨＯ細胞の濾過培養およびその製造物であるネコＥＰＯの製造が可能であった。濾過培養の全期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１７０】
実施例２２ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その６）
分離膜としては参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例２１と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１７１】
実施例２３ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その７）
分離膜としては参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例２１と同様のネコＥＰＯ製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した
実施例２４ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その８）
離膜としては参考例５で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が１２０平方ｃｍの図４に示す分離膜エレメントを用い、実施例２１と同様のネコＥＰＯの製造を行った。その結果を表３に示す。その結果、安定したＣＨＯ細胞の培養が可能であった。濾過培養の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１７２】
比較例７ 回分培養によるＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造
動物細胞を用いたタンパク質の製造形態として最も典型的な回分培養を行い、そのタンパク質の生産性を評価した。図１の膜分離型濾過培養装置の培養槽１のみを用いた回分培養試験を行った。本比較例でも、動物細胞として、参考例８で調整したＣＨＯ細胞株ＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦを使用し、タンパク質の定量には、ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡ キット（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。比較例４の運転条件を以下に示す。
【０１７３】
培養槽容量（培地量）：１（Ｌ）
温度調整：３７（℃）
培養槽溶存酸素濃度：３０％
培養槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養槽攪拌速度：１５０（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７に調整。
【０１７４】
まずＦｅＥＰＯ／ＣＨＯＳＦ株を１Ｌスピナーフラスコ（５００ｍＬ培地）を使用し、５×105cells/mLまで培養を行った（前々培養液）。前々培養液を、図１に示す濾過培養装置の１．５Ｌの培地に移し、培養槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、液循環ポンプ１０を稼働させることなく、４日間培養を行った（前培養）。前培養完了後ＣＨＯ細胞数は５×105cells/mLまで達した。その後、濾過ポンプ１０を稼働させることなく回分培養を行った。
【０１７５】
回分培養の結果を表３に示す。
【０１７６】
比較例８ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その７）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例７と同様に行った。
【０１７７】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけネコＥＰＯの製造に不適であることが明らかになった。
【０１７８】
比較例９ ＣＨＯ細胞株を用いたネコＥＰＯの製造（その８）
分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（濾過培養全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、それ以外は、実施例１０と同様に行った。
【０１７９】
その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、濾過培養を停止した。このことから、参考例５で作製した多孔性膜は、タンパク質の製造、とりわけネコＥＰＯの製造に不適であることが明らかになった。
【０１８０】
【表３】
【０１８１】
以上、表３に示す実施例１７〜２４及び比較例７の結果、また比較例８及び９の結果からわかるように、図１および図２に示す濾過培養装置を用いた本発明のタンパク質の製造方法により、ネコエリスロポエチンを効率よく製造することができた。また、従来の方法に比べて、その生産量および生産速度が大幅に向上した。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型濾過培養装置の例を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型濾過培養装置の例を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの例を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【符号の説明】
【０１８３】
１ 培養槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ
２３ ＤＯセンサ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を培養液中に生産する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続濾過培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の膜素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
動物細胞がハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｂｍ細胞の群から選ばれるいずれかの動物細胞である請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
タンパク質がモノクローナル抗体である請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質製造方法。
【請求項１】
タンパク質を培養液中に生産する動物細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、新鮮培地を培養液に追加する連続濾過培養によりタンパク質を製造する方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１ｋＰａから２０ｋＰａの範囲で濾過処理するタンパク質の製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の膜素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
動物細胞がハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｂｍ細胞の群から選ばれるいずれかの動物細胞である請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
タンパク質がモノクローナル抗体である請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−４５０１９（Ｐ２００９−４５０１９Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１４９０４（Ｐ２００７−２１４９０４）
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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