タンパク質を精製する方法
【課題】タンパク質を精製する方法を提供すること。
【解決手段】本出願において、可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法が、記載される。この本発明の方法は、以下の工程：可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質を含む細胞を提供する工程；この細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；およびこの目的タンパク質（ＰＯＩ）の特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態でこの目的タンパク質（ＰＯＩ）がこの細胞から放出されるのを引き起こす工程、を包含する。
【解決手段】本出願において、可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法が、記載される。この本発明の方法は、以下の工程：可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質を含む細胞を提供する工程；この細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；およびこの目的タンパク質（ＰＯＩ）の特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態でこの目的タンパク質（ＰＯＩ）がこの細胞から放出されるのを引き起こす工程、を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）の放出を補助する膜抽出組成物を使用して、可溶性かまたは膜に結合したＰＯＩを放出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞内ＰＯＩ（例えば、酵素）を回収するための伝統的な方法は、ビーズミルまたはフレンチプレス原理で作動する細胞ホモジナイザーのような、機械的破壊方法（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）を使用することであった。しかし、これらの機械的破壊方法は、これらが低い能力でエネルギーを消費する方法であるという欠点、および機械的破壊のために必要とされる細胞ホモジナイザーまたは類似の設備が、購入に高価であるという欠点に、悩まされている。さらに、機械的方法は、細胞、および従って抽出されたＰＯＩを、非常に厳しい条件に曝露する。特に、大部分のタンパク質は、機械的デバイスおよび／またはホモジネートが効率的に冷却されない限り発生する熱によって、変性するからである。さらに、酵母細胞（例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来の細胞）のようないくつかの細胞は、機械的に破壊することが困難であり、そして細胞ホモジナイザーに１回より多く通過させることを必要とする。細胞ホモジネートはまた、細胞壁フラグメントおよびＤＮＡを含み得、これは、高い粘度を生じる。このことは、ＰＯＩからの細胞の破片の分離が、困難な操作を示し得ることを意味する。さらに、得られる無細胞ホモジネートは、細胞内ＰＯＩのみでなく、一般的な細胞代謝に関連する多数（時々数千）の異なる細胞内タンパク質および酵素をもまた含み得る。このことは、得られる無細胞ホモジネートが、限外濾過によって濃縮することが困難であり得るのみでなく、所定のＰＯＩの正しい市販の濃度を得ることに関する問題を提供し得ることをもまた意味する。
【０００４】
いくつかの機械的破壊方法の潜在的な有害な効果を最小にするために、酵母細胞を透過性にするための、例えば界面活性剤を使用する、化学的方法が開発された。例示として、非イオン性界面活性剤であるポリエトキシ化オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００として市販されている）が、単独でかまたは凍結解凍サイクルとの組み合わせかのいずれかで使用された（Ｎａｇｌａｋら、１９９０で参照される）。さらに、米国特許第５１２４２５６号（Ｃｒａｈａｙら、１９９２）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母を水性培地中で、中性の水溶性無機塩および非イオン性水溶性ポリエトキシ化アルキルフェノール界面活性剤（８と１５との間の親水性親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）（ＨＬＢ）を有する）で処理することによる、この酵母からタンパク質が抽出された方法を開示する。しかし、これらの非イオン性水溶性ポリエトキシ化アルキルフェノール界面活性剤（これには、ポリエトキシ化オクチルフェノール、ノニルフェノールおよびトリブチルフェノール（特に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０およびＳａｐｏｇｅｎａｔ Ｔ−０８０の商品名で市販されているもの）が挙げられる）は、以下の欠点に悩まされる：（ｉ）これらは、単独で使用される場合に有意な抽出効果を有さないかもしれない；および（ｉｉ）これらの界面活性剤は、引き続くＰＯＩの酵素活性の測定を妨害し得る。
【０００５】
いくつかの有機溶媒もまた、インサイチュ酵素アッセイにおいて酵素細胞を透過性にするためと、酵素細胞からタンパク質を除去するためとの両方に、使用されてきた。このような溶媒の例としては、トルエン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、およびグリセロールと混合されたベンゼンが挙げられるが、これらに限定されない（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）。しかし、これらの溶媒は、２００ｍ3までの醗酵槽容量が必要とされる場合に、産業規模での製造における使用に対して魅力的ではない。
【０００６】
ジギトニンおよび天然に存在する他のサポニンもまた、多数の真核生物細胞を透過性にすることが示された（Ｊｏｓｈｉら、１９８９を参照のこと）。ジギトニン透過性化の正確な機構は未知であるが、ジギトニンが、細胞膜に存在するコレステロールと複合体を形成し、そしてその膜を漏出性にすると考えられる。酵母細胞のジギトニン透過性化もまた、酵母膜のエルゴステロールの複合体化に起因し得る。Ｊｏｓｉら（１９８９）は、ジギトニン（０．１％）を使用して、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓを透過性化し、これは、ラクトースのグルコースおよびガラクトースへの細胞内触媒を容易にした。非イオン性界面活性剤であるサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｂａｒｋから）は、別のコレステロール複合体化剤であり、これは、少なくとも哺乳動物細胞を透過性化することが公知である（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）。再度、上で概説したような非イオン性界面活性剤と同様に、ジギトニンおよび天然に存在する他のサポニンの使用は、単独で使用される場合に有意な抽出効果を有さないかもしれないという欠点に悩まされ得る。
【０００７】
カオトロピック剤もまた、細胞内酵素の抽出を容易にするために、使用されてきた。例示として、米国特許第３８０１４６１号（ＭｉｙａｋｅおよびＳｈｉｏｓａｋａ、１９７４）は、尿素溶液のようなカオトロピック溶液を使用して、真菌または細菌の菌糸体または細胞において産生される細胞内酵素を抽出するための、プロセスを開示する。米国特許第４６８３２９３号（Ｃｒａｉｇ、１９８７）はまた、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、臭化リチウム、グアニジン塩酸塩および尿素のような、カオトロピック塩の存在下での細胞溶解による、Ｐｉｃｈｉａ属の形質転換された細胞からの親油性タンパク質の選択的な抽出のための方法を、開示する。しかし、カオトロピック剤は、尿素のようなカオトロピック剤へのＰＯＩの曝露が、ＰＯＩの変性を介して酵素活性の実際の損失を生じ得るという欠点に悩まされる。
【０００８】
上記で引用した欠点に加えて、上記で引用した従来技術は、宿主細胞の低分子量分子への透過性化のみに関連し、一方でＰＯＩは、細胞内で変化しないままである。特に、上記で引用した従来技術のいずれも、ＰＯＩの性質および／または活性に影響を与えない条件下での、膜結合細胞内ＰＯＩの抽出に関連しない。さらに具体的には、上記で引用される従来技術のいずれも、トラップされて宿主細胞から分泌され得ない、膜結合細胞内ＰＯＩの放出を補助するための方法に関しない。
【０００９】
従って、本発明は、従来技術の抽出方法に関連する問題を克服することを追求する。
【００１０】
従って、本発明は、可溶性かまたは膜に結合した、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を、宿主生物から放出するための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、トラップされそして／または宿主細胞から分泌され得ない、可溶性かまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩの放出において、補助するための方法に関する。本発明の方法を使用する、細胞内ＰＯＩの抽出を、従来の細胞破壊方法、ならびに他のイオン性／非イオン性の界面活性剤および乳化剤を使用する抽出手順と、比較した。プロテアーゼおよび塩との界面活性剤の組み合わせもまた、調査した。本発明の結果は、本発明の方法を使用する、可溶性かまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩの抽出が、以下の理由により有利であることを示す：
（ｉ）伝統的な細胞破壊技術が回避され得る；
（ｉｉ）細胞内ＰＯＩがＤＮＡおよび細胞壁フラグメントを含まずに回収され得る；
（ｉｉｉ）細胞内ＰＯＩが、グリコシル化が起こる前に、酵母のような真核生物宿主生物から回収され得る。分泌タンパク質の過剰のグリコシル化は、酵母のような真核生物宿主生物において特に、周知の問題である。酵母発現系に関するこの欠点は、酵母発現ベクターが、多量のバイオマスで高い発現レベルでタンパク質を産生し得、そしてさらに、酵母が食物において認可された用途を有するとしても、酵母を産生系として使用することの嫌悪をもたらした。ＰＯＩを細胞内で発現させ、次いでこのＰＯＩを本発明の方法で抽出することによって、このＰＯＩはグリコシル化されない。なぜなら、このＰＯＩは、グリコシル化が起こる分泌経路を通らなかったからである；
（ｉｖ）本発明の方法を進行させる醗酵手順が、宿主細胞のために適切な任意のｐＨにおいて実施され得る。分泌ＰＯＩがその細胞外培養培地のｐＨによって影響を受け得ることは、当該分野において周知である。現在まで、宿主生物増殖培地のｐＨを、おおよそ中性のｐＨに維持することがしばしば必要であった。なぜなら、このようなｐＨが細菌夾雑の危険性を通常増加させるとしても、このようなｐＨにおける醗酵が、分泌ＰＯＩの安定性を維持するために必要であると考えられたからである。本発明の方法を用いると、ＰＯＩは分泌されない。従って、宿主生物増殖培地のｐＨは、無関係である。なぜなら、培地ｐＨにかかわらず、細胞内ｐＨが一定に保たれるからである。従って、本発明は、より低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）における宿主生物（例えば、酵母）の増殖を可能にし、このことは、バイオマスにもＰＯＩ産生のいずれにも影響を与えることなく、細菌夾雑の危険を低下させる；
（ｖ）本発明の方法を使用して、細胞内ＰＯＩの、細胞外増殖培地との接触を防止し得る。このことは、ＰＯＩが、例えばプロテアーゼ感受性に起因して細胞外培地中において不安定である場合に、有利である。このタンパク質を細胞内で発現させ、次いで本発明の方法を用いて抽出することによって、細胞外培地との接触が回避される。
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
１つの広い局面において、本発明は、細胞から目的のタンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：可溶性であるかまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；この細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにこのＰＯＩを、ＰＯＩの放出に十分な条件下で、かつ可溶性形態で、細胞から放出させる工程。ここで、ＰＯＩは、目的の細胞内タンパク質であり得、そして／またはＰＯＩは、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）であり得る。
【００１３】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１） 細胞から可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法であって、以下の工程：
可溶性または膜結合性の細胞内のＰＯＩを含む細胞を提供する工程；
該細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および
該ＰＯＩの特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＰＯＩを該細胞から放出させる工程、
を包含する、方法。
(項目２） 項目１に記載の方法であって、前記細胞が形質転換された細胞である、方法。
(項目３） 形質転換細胞からＰＯＩを放出させるための項目１または項目２に記載の方法であって、該ＰＯＩがＨＯＸ酵素であり、該方法は、以下の工程：
ＨＯＸ酵素を含む形質転換細胞を提供する工程；
該形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および
該ＨＯＸ酵素の特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＨＯＸ酵素を該形質転換細胞から放出させる工程、
を包含する、方法。
(項目４） 形質転換細胞からＰＯＩを放出させるための方法であって、該ＰＯＩがインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）であり、該方法は、以下の工程：
ＩＬ−１ｒａを含む形質転換細胞を提供する工程；
該形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および
該ＩＬ−１ｒａの特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＩＬ−１ｒａが該形質転換細胞から放出させる工程、
を包含する、方法。
(項目５） 項目１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、酵母細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群より選択され、好ましくは酵母細胞および真菌細胞から選択される、方法。
(項目６） 項目１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞内ＰＯＩが、組換えＤＮＡ技術によって産生される、方法。
(項目７） 項目１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記膜抽出組成物が、四級アンモニウム化合物を含む、方法。
(項目８） 項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記四級アンモニウム化合物が、ラウロイルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＭＴＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、セトリミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ステアロイルトリメチルアンモニウムクロリド（ＳＴＡＣ）、ステアロイルトリメチルアンモニウムブロミド（ＳＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウム（アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）、Ｎ−セチルピリジニウムブロミド（Ｎ−ヘキサデシルピリジニウムブロミド）、Ｎ−セチルピリジニウムクロリド（Ｎ−ヘキサデシルピリジニウムクロリド）、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリドおよびこれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、方法。
(項目９） 項目１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記膜抽出組成物が、約０．０５重量％〜約０．６重量％の前記四級アンモニウム化合物を含み、好ましくは約０．１重量％〜約０．５重量％の前記四級アンモニウム化合物を含み、好ましくは約０．２重量％〜約０．４５重量％の前記四級アンモニウム化合物を含み、より好ましくは約０．４重量％の前記四級アンモニウム化合物を含む、方法。
(項目１０） 項目１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、温度約４℃〜４０℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃、より好ましくは約２５℃で、前記膜抽出組成物と接触される、方法。
(項目１１） 項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、ｐＨ約２．０〜約１１．０（より特には約５．０〜約７．０、より特には約６．３）で、前記膜抽出組成物と接触される、方法。
(項目１２） 上昇したレベルの可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを産生する変異細胞または形質転換細胞についてスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）該変異細胞を３０℃で増殖させる工程；
（ｂ）該変異細胞または形質転換細胞を、項目７または項目８に規定されるような膜抽出組成物とともにインキュベートする工程；
（ｃ）前記細胞フリー培地を回収する工程；
（ｄ）上昇したレベルの該細胞内ＰＯＩについて該細胞フリー培地をスクリーニングする工程；
を包含し、該細胞フリー培地中の該細胞内ＰＯＩの存在が、該細胞内ＰＯＩが放出されたことを示す、方法。
(項目１３） 可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを特異的に放出するために適切な、膜抽出組成物であって、該組成物は、以下の条件：
（ａ）四級アンモニウム化合物の重量パーセンテージ約０．０５％〜約０．６％（より特には約０．１％〜約０．５％、より特には約０．２％〜約０．４５％、より特には約０．４％）；
（ｂ）最適ｐＨ約２．０〜約１１．０（より特には約５．０〜約７．０、より特には約６．３）；
（ｃ）最適温度約４℃〜４０℃（より特には約２０℃〜約３０℃、より特には約２５℃）；
の下で、細胞と接触させられ、混入タンパク質を実質的に含まない細胞内ＰＯＩが得られる、組成物。
(項目１４） 可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを選択的に放出するための、四級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物の使用。
(項目１５） 項目１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＰＯＩがＨＯＸ酵素である、方法。
(項目１６） 項目１５に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントを含む、方法。
(項目１７） 項目１５または項目１６に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントによりコードされる、方法。
(項目１８） 項目１５または項目１６または項目１７に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってか、あるいは該ハイブリダイズし得る配列と相補的な配列によってコードされる、方法。
(項目１９） 項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって生成可能なＨＯＸ酵素であって、該ＨＯＸ酵素は、項目１６〜１８のうちのいずれか１項にて規定されるようなヌクレオチド配列によりコードされ、そして該ヌクレオチド配列は、配列番号２〜２２に示されるようなオリゴヌクレオチドによって合成される、ＨＯＸ酵素。
(項目２０） 項目１またはそれに従属する任意の項目にて規定されるようなＰＯＩであって、該ＰＯＩが、真核生物宿主生物から実質的に非グリコシル化形態で放出される、ＰＯＩ。
(項目２１） 真核生物宿主生物から放出された、実質的に非グリコシル化されたＰＯＩ。
(項目２２） 項目２１に記載の実質的に非グリコシル化されたＰＯＩであって、該ＰＯＩは、項目１〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法によって放出される、ＰＯＩ。
(項目２３） 実質的には、本明細書中および添付の図面を参照して記載されるような、方法および組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、遺伝子構築物を提供する。
【図２Ａ】図２Ａは、遺伝子構築物を提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、写真図を提供する。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、写真図提供する。
【図４】図４は、グラフを提供する。
【図５−１】図５は、配列表を提供する。
【図５−２】図５は、配列表を提供する。
【図６−１】図６は、配列表を提供する。
【図６−２】図６は、配列表を提供する。
【図７】図７Ａ−Ｄは、写真図を提供する。
【図８】図８は、グラフを提供する。
【図９】図９は、グラフを提供する。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１１】図１１Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１２】図１２Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な局面）
本発明の１つの局面に従って、可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）を、形質転換細胞から放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性または膜結合性細胞内ＰＯＩを含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；およびＰＯＩの特異的放出およびＰＯＩの可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＰＯＩを放出させる工程、を包含する。
【００１６】
本発明の別の局面に従って、形質転換細胞からＨＯＸ酵素を放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：ＨＯＸ酵素を含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにＨＯＸ酵素の特異的放出およびＨＯＸ酵素の可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＨＯＸ酵素を放出させる工程、を包含する。
【００１７】
本発明の別の局面に従って、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を形質転換細胞から放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：ＩＬ−１ｒａを含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにＩＬ−１ｒａの特異的放出およびＩＬ−１ｒａの可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＩＬ−１ｒａを放出させる工程、を包含する。
【００１８】
本発明の別の局面に従って、上昇したレベルの、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを産生する変異体についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、以下の工程：変異した細胞を３０℃で成長させる工程；この変異した細胞を膜抽出組成物と共にインキュベートする工程；無細胞培地を回収する工程；この無細胞培地を上昇したレベルの細胞内ＰＯＩについてスクリーニングする工程；を包含し、その結果、無細胞培地内の細胞内ＰＯＩの存在が、細胞内ＰＯＩが放出されたことを示す。
【００１９】
本発明の別の局面に従って、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを放出するために適切な膜抽出組成物が提供され、ここでこの組成物は、以下の条件下で細胞と接触される：約０．０５％〜約０．６％（より特に約０．１％〜約０．５％、より特に約０．２％〜約０．４５％、より特に約０．４％）の重量％の４級アンモニウム化合物；および約２．０〜約１１．０（より特に約５．０〜約７．０、より特に約６．３）の最適ｐＨ；約４℃〜約４０℃、（より特に約２０℃〜約３０℃、より特に約２５℃）の最適温度。
【００２０】
本発明の別の局面に従って、可溶性または膜結合性細胞内ＰＯＩの放出に適切な４級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物が提供される。
【００２１】
本発明の別の局面に従って、真核生物宿主生物から放出される実質的にグリコシル化されていないＰＯＩが提供される。
【００２２】
本発明の１つの局面および利点は、添付の特許請求の範囲ならびに以下の説明および議論に提示される。これらの局面は、別々の節の見出しの下に提示される。しかし、各説の見出しの下の教示は、特定の節の見出しに限定される必要はない。
（発明の詳細な説明）
本発明は、４級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物を使用して、伝統的細胞破壊技術の使用にたよらずに、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩの高速、特異的かつ経済的に効率の良い抽出が得られ得るという、非常に驚くべき発見を実証する。有利に、かつ予期されず、得られた細胞抽出物は、非常に少ない混入細胞内ＤＮＡを含有し、そして細胞壁断片を比較的含まず、それにより、ＰＯＩがかけられ得る任意のさらなる精製工程を単純化する。これは、従来技術の機械的抽出方法と対比される。
【００２３】
（細胞内タンパク質）
本明細書中で使用される場合、用語「細胞内」ＰＯＩは、細胞（単数または複数）内または細胞の内側で見出されるＰＯＩを意味する。細胞内ＰＯＩは、シグナル分泌機構を有するが、細胞内に（例えば細胞の細胞質中に）局在化され得る。この点において、細胞内ＰＯＩは、細胞から活発に分泌されないか、またはシグナル配列分泌機構を有していても細胞により分泌されることができないＰＯＩであり得る。あるいは、細胞内ＰＯＩは、細胞からのその分泌を防ぐように操作された、天然に分泌されたＰＯＩであり得る。あるいは、ＰＯＩは、膜結合ドメインを含むキメラタンパク質であり得る。
【００２４】
本発明の方法は、ＡｈｌｓｔｒｏｍおよびＥｄｅｂｏ（（１９９４）ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１９ ７−１２）に記載される方法と対照的であり、これは、テトラデシルベタイナートを用いるＥ．ｃｏｌｉからのペリプラズムβラクタマーゼの放出について報告する。ペリプラズムは、細胞膜と細胞壁との間の細菌細胞中の領域である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のペリプラズムβラクタマーゼは、細胞膜の外側に局在化し、細胞質酵素ではない。対照的に、本発明のＰＯＩは、細胞（単数または複数）内または細胞の内側に見出される細胞内ＰＯＩである。
【００２５】
（膜結合性（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＰＯＩ）
本明細書で使用される場合、用語「膜結合性ＰＯＩ」は、細胞膜または形質膜の近傍に局在化し得るが、実質的に細胞膜または形質膜と結合していなくてもよいＰＯＩを意味する。従って、膜結合性酵素は、実質的に膜結合タンパク質ではなく、膜結合性酵素は、実質的に細胞膜に結合していない。膜結合性ＰＯＩは、細胞ホモジェナイザーを用いる機械的処理により可溶化され得る。
【００２６】
（膜結合（ｂｏｕｎｄ）ＰＯＩ）
本明細書で使用される場合、用語「膜結合ＰＯＩ」は、細胞ホモジェナイザーを茂市イル機械的処理では可溶性にされないタンパク質を意味する。
【００２７】
（特異的放出）
用語「特異的放出」は、ＰＯＩの特異的活性が、ＰＯＩが機械的手段（例えば、ビードミルの使用またはフレンチプレスの原理で操作するセルホモジェナイザーによる）により抽出された場合よりも高いことを意味する。
【００２８】
（形質転換細胞）
用語「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術の使用により形質転換された細胞を含む。形質転換は、代表的には１つ以上のヌクレオチド配列を、形質転換されるべき細胞中に挿入することにより起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に対して天然ではない配列）であり得る。さらに、またあるいは、挿入されたヌクレオチド配列は、相同ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に天然である配列）であり得、その結果、この細胞は、既に細胞中に存在するヌクレオチド配列の１以上の余分のコピーを受容する。
【００２９】
（膜抽出組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「膜抽出組成物」は、細胞膜における成分に影響し得、その結果、膜結合細胞内ＰＯＩおよび／または膜結合性細胞内ＰＯＩが、この膜成分から十分に解離されるかおよび／または放出され、そしてＰＯＩがこの膜抽出組成物から容易に回収されるかおよび／または採取される組成物を意味する。ＰＯＩはまた、可溶性ＰＯＩであり得る。非常に好ましい実施形態において、本発明の膜抽出組成物は、１つ以上の４級アンモニウム化合物またはその組合せを含む。
【００３０】
（四級アンモニウム化合物）
本明細書中で使用する「四級アンモニウム化合物」とは、そのＮＨ４＋イオンの４個の水素原子の全部を有機基（これらは、同一または異なり得る）で置換することにより水酸化アンモニウムまたはアンモニウム塩から誘導できる化合物を意味する。典型的には、これらの有機基の１個は、長鎖（Ｃ８〜Ｃ１８）アルキル基であり、そして他の３個は、短鎖アルキル基または他の基である。
【００３１】
好ましい実施態様では、これらの化合物は、以下の構造を有する：
ＣＨ3−（ＣＨ2）n−Ｎ（ＣＨ3）+3
ここで、ｎは、その鎖内のメチレン基の数であり、ここで、その対イオンは、ハロゲン（例えば、塩素または臭素）イオンであり得る。これらの化合物は、カチオン洗浄剤の特性を有し、強力な抗菌剤である。
【００３２】
これらの四級アンモニウム化合物の例には、ラウロイルトリメチル臭化アンモニウム（ＬＴＡＢ）、ミリスチルトリメチル塩化アンモニウム（ＭＴＡＣ）、セチルトリメチル塩化アンモニウム（ＣＴＡＣ）、セチルトリメチル臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）、セトリミド（またはセトリミダム（Ｃｅｔｒｍｉｄｕｍ）（これは、アルキル臭化アンモニウム（主に、ＣＴＡＢ）の混合物を含有する））、ステアロイルトリメチル塩化アンモニウム（ＳＴＡＣ）、ステアロイルトリメチル臭化アンモニウム（ＳＴＡＢ）、塩化ベンズアルコニウム（塩化アルキルジメチルベンズアルコニウム）、臭化Ｎ−セチルピリジニウム（臭化Ｎ−ヘキサデシルピリジニウム）、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム、およびベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
一例として、これらの化合物の一部の構造は、以下のように図示される。これらの化合物は、メチレン基が多い順に列挙されている：
ＬＴＡＢは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）11−Ｎ（ＣＨ3）3Ｂｒである。
【００３４】
ＭＴＡＣは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）13−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌである。
【００３５】
ＣＴＡＣは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）15−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌである。
【００３６】
ＣＴＡＢは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）15−Ｎ（ＣＨ3）3Ｂｒである。
【００３７】
ＳＴＡＣは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）17−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌである。
【００３８】
ＳＴＡＢは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）17−Ｎ（ＣＨ3）3Ｂｒである。
【００３９】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、Ｃ21Ｈ38ＮＣｌ）である。ＣＰＣの構造は、以下のように図示される：
【００４０】
【化１】
【００４１】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、臭化セチルピリジニウム（ＣＰＢ、Ｃ21Ｈ38ＮＢｒ）である。ＣＰＢの構造は、以下のように図示される：
【００４２】
【化２】
【００４３】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ、Ｃ23Ｈ42ＮＣｌ）である。ＢＤＴＡＣの構造は、以下のように図示される：
【００４４】
【化３】
【００４５】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウム（ＢＤＨＡＣ、Ｃ25Ｈ46ＮＣｌ）である。ＢＤＨＡＣの構造は、以下のように図示される：
【００４６】
【化４】
【００４７】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化ベンズアルコニウム（塩化アルキルジメチルベンズアルコニウム）である。
【００４８】
塩化ベンズアルコニウムの構造は、以下のように図示される：
Ｃ12Ｈ25Ｎ（ＣＨ3）2Ｃ7Ｈ7Ｃｌ
ＣＴＡＢと塩化ベンズアルコニウム（これはまた、塩化アルキルジメチルベンズアルコニウムとしても知られている−本明細書中では、Ｒｏｄａｌｏｎの登録商標権名で呼ぶ）の構造の比較は、以下のように図示される：
【００４９】
【化５】
【００５０】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ラウロイルテトラメチル臭化アンモニウム（ＬＴＡＢ）である。
【００５１】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、セチルトリメチル塩化アンモニウム（ＣＴＡＣ）である。
【００５２】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、セチルトリメチル臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）である。
【００５３】
カチオン洗浄剤ＣＴＡＢは、おそらく、膜間細孔を形成することにより、イースト菌の浸透性を変えることができることが明らかとなっており、これは、他の２種の非イオン性洗浄剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）について提案された機構と類似している（Ｋｉｎｇら、１９９１）。ＣＴＡＢのような洗浄剤を使用する細胞浸透性の変化は、全細胞での細胞内酵素活性の測定を容易にした（Ｓｅｋｈａｒら、１９９９）。さらに、ＣＴＡＢ浸透化細胞の開発は、例えば、イースト菌株（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｏｗｄａら、１９９１）およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｊｏｓｈｉら、１９８７））に由来の細胞での細胞内酵素触媒作用に有用であることが判明している。これらの研究では、洗浄剤ＣＴＡＢは、細胞内酵素および他のＰＯＩ類を細胞内で未変化のままにしつつ、イースト細胞を低分子量分子（例えば、基質、生成物、補助因子）に対して浸透性にしたことを述べておくことは重要である。本発明とは対照区別して、上記研究のいずれも、ホスト細胞からの溶解性または膜結合した細胞内ＰＯＩの放出を助けるのに、洗浄剤ＣＴＡＢ（または関連した四級アンモニウム化合物（例えば、ＬＴＡＢまたはＣＴＡＣ））が使用され得ることを開示または示唆していない。
【００５４】
カチオン性洗浄剤ＣＴＡＢはまた、通例、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を単離する方法で、使用されている。一例として、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ−ＣＴＡＢ沈殿物が形成され容易に回収されるように、高温（約６５℃）および低塩濃度（０．６Ｍ未満のＮａＣｌ）で細胞をＣＴＡＢで処理することにより、単離され得る。ＣＴＡＢ洗浄剤はまた、エタノールまたはイソプロパノールのいずれかによる中性多糖類の共沈が重大な問題を引き起こし得る場合、植物から核酸を抽出するのに頻繁に使用される。ＣＴＡＢはまた、繊維状ファージで感染したＥ．Ｃｏｌｉ培養物の上澄み液からのＤＮＡの直接的な溶解および沈殿で使用されている（Ｉｓｈａｑら、１９９０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（ｌ）：１９〜２０，２２，２４；Ｋａｍｂｏｕｒｉｓら、１９９９：ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２５（３）：２５５〜６４；Ｋｕｉｐｅｒｓら、１９９９
Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５８（２）：１０３〜８；Ｖｅｌｅｇｒａｋｉら、１９９９ Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ ３７（ｌ） ６９〜７３；Ｗｈｉｔｅら、１９９８ Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ ３６（５）：２９９〜３０３；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、１９９８ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９（３）：２４３−６；Ｍｉｔｏ ａｎｄ Ｄｅｔｓｃｈａｒｔ １９９８ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｒｅｓ ８４（７） ５９６〜７；Ｚｈａｎｇら、１９１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１（ｌ） ４５〜５０；Ｒｅｉｎｅｋｅら、（１９９８） Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７（ｌ） ９５−９を参照）。ＤＮＡ分子を単離するこれらのＣＴＡＢベース方法の全ては、残りのタンパク質および中性多糖類を溶液中で維持しつつ、ＣＴＡＢが核酸および酸多糖類を沈殿する特性を活用することに頼っている。驚くべきことに、また、予想外に、本発明の方法は、この沈殿を促進するだけでなく、細胞内ＤＮＡの保持を促進する。結果的に、本発明の方法は、細胞内ＰＯＬの選択的な放出を促進する。
【００５５】
（放出）
本発明の方法によれば、この溶解性または膜結合した細胞内ＰＯＩは、細胞内ＰＯＩの放出に十分な条件下にてホスト細胞を膜抽出組成物と接触させることにより、この細胞から放出される。
【００５６】
（ＰＯＩを放出するのに十分な好ましい条件）
（Ｉ）四級アンモニウム化合物の％
好ましくは、この膜抽出組成物は、約０．０５重量％〜約０．６重量％の四級アンモニウム化合物、好ましくは、約０．１重量％〜約０．５重量％の四級アンモニウム化合物、好ましくは、約０．２重量％〜約０．４５重量％の四級アンモニウム化合物、さらに好ましくは、約０．４重量％の四級アンモニウム化合物を含有する。
【００５７】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＬＴＡＢである。
【００５８】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＣＴＡＣである。
【００５９】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＣＴＡＢである。
【００６０】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化ベンズアルコニウム（Ｃ１２Ｈ２５Ｎ（ＣＨ２）３Ｃ７Ｈ７Ｃｌ）である。
【００６１】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、Ｃ２１Ｈ３８ＮＣｌ）である。
【００６２】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、臭化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、Ｃ２１Ｈ３８ＮＢｒ）である。
【００６３】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ：Ｃ２３Ｈ４２ＮＣｌ）である。
【００６４】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ：Ｃ２５Ｈ４６ＮＣｌ）である。
（ＩＩ）温度
好ましくは、このホスト細胞は、約４℃〜約４０℃の温度で、この膜抽出組成物と接触される。
【００６５】
好ましくは、このホスト細胞は、約２０℃〜約３０℃の温度で、この膜抽出組成物と接触される。
【００６６】
好ましくは、このホスト細胞は、約２５℃の温度で、この膜抽出組成物と接触される。
【００６７】
好ましくは、上記温度は、もしＰＯＩが熱安定性ＰＯＬであるなら、さらに高くなる。
（ＩＩＩ）ｐＨ
好ましくは、このホスト細胞は、約２．０〜約１１．０のｐＨで、この膜抽出組成物と接触される。
【００６８】
好ましくは、このホスト細胞は、約５．０〜約７．０のｐＨで、この膜抽出組成物と接触される。
【００６９】
好ましくは、このホスト細胞は、約６．３のｐＨで、この膜抽出組成物と接触される。
【００７０】
本発明の方法に先立つ発酵操作がこのホスト細胞に適当な任意のｐＨで行うことができるは、非常に有利である。分泌されたＰＯＩがその細胞外成長培地のｐＨで影響され得ることは、当該技術分野で周知である。今まで、ホスト有機体成長培地のｐＨを適当な中性ｐＨで維持する必要があった。その理由は、このようなｐＨでの発酵は、通常、細菌汚染の危険を高めたとしても、分泌されたＰＯＩの安定性を維持するのに必要であると思われたからである。本発明の方法を使うと、このＰＯＩは、分泌されない。それゆえ、このホスト有機体成長培地のｐＨは、細胞外ｐＨが培地ｐＨとは無関係に一定のままであるので、無関係である。従って、本発明は、生物量またはＰＯＩ生成のいずれかに影響を与えることにく、細菌汚染の危険を減らす低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）で、ホスト有機体（例えば、イースト菌）の成長を可能にする。
【００７１】
本発明のさらに他の利点は、細胞内ＰＯＩが細胞外成長培地と接触するのを防止するのに使用できることにある。このことは、もし、このＰＯＩが、例えば、プロテアーゼ感受性があるために、この細胞外培地で不安定であるなら、有利である。このタンパク質を細胞内で発現させることに次いで、本発明の方法で抽出することにより、この細胞外培地との接触は、回避される。
【００７２】
（ＰＯＩ回収）
本発明の方法に従って抽出された細胞内ＰＯＩは、そのＰＯＬをさらに濃縮し精製するために、当業者に公知の方法を使用することによりさらに処理される。それゆえ、抽出した細胞内ＰＯＩは、例えば、限外濾過、逆相樹脂への通過に続いて、最小容量の溶媒での溶出、沈殿、限外濾過および凍結乾燥により、濃縮され得る。このＰＯＬをさらに精製するのに利用できる技術には、サイズ排除樹脂を使用するサイズ分別、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換および疎水性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
（ＰＯＩ）
本明細書中で使用する「ＰＯＩ」との用語には、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（これらには、構造タンパク質が挙げられるが、これに限定されない）、酵素、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよび／またはインターロイキン）、インターロイキンレセプタアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ）、抗生物質、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその有効部分（例えば、Ｆｖ断片（この抗体またはその一部は、天然、合成またはヒト化され得る））、ペプチドホルモン、抗原（例えば、細菌／ウイルス／原生動物／寄生抗原）、腫瘍抗原、レセプタ、配位子、制御因子、情報伝達分子、神経伝達物質、凝固因子、または任意の他のタンパク質（これらには、膜結合タンパク質および／または膜結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の方法では、このＰＯＩは、細胞内で発現され、すなわち、それは、細胞内ＰＯＩである。
【００７５】
このＰＯＩは、関心ヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を使用して、組換えＤＮＡ技術により、産生され得る。
【００７６】
（ＮＯＩ）
本明細書中で使用する「ＮＯＩ」との用語は、合成起源および天然起源の両方のＤＮＡおよびＲＮＡを包含するように規定され、これらのＤＮＡまたはＲＮＡは、変性または未変性のデオキシ−またはジデオキシ−ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似物を含有し得る。この核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ共重合体として存在し得、ここで、「共重合体」との用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有する単一の核酸鎖を意味する。このＮＯＩは、発現をさらに高めるために最適化されたコドンでさえあり得る。
【００７７】
（合成）
本明細書中で使用する「合成」との用語は、インビトロ化学合成または酵素合成により生成したものとして規定される。それには、ホスト有機体（例えば、メチロトローフイースト菌であるＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）に最適なコドン用法で製造したＮＯＩ類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
（構築物）
このＮＯＩは、目的の宿主細胞において活性である、転写および翻訳の調節エレメントに対して作動可能に連結され得る。このＮＯＩはまた、たとえば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ由来のグルコアミラーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子接合型遺伝子、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＴＡＫＡ−アミラーゼに由来するもののような、シグナル配列を含む融合タンパク質をコードし得る。あるいは、このＮＯＩは、膜結合ドメインを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００７９】
（発現ベクター）
このＮＯＩは、発現ベクターを用いて宿主生物において所望のレベルで発現され得る。
【００８０】
本発明に従うＮＯＩを含む発現ベクターは、選択された宿主生物におけるＮＯＩをコードする遺伝子を発現し得る任意のベクターであり得、そしてベクターの選択は、それが導入されるべき宿主細胞に依存する。従って、そのベクターは、自律複製ベクター、すなわち、エピソーム存在物として存在するベクター（このベクターの複製は、染色体複製とは独立しており、たとえば、プラスミド、バクテリオファージまたはエピソームエレメント、ミニ染色体または人工染色体など）であり得る。あるいは、本発明に従うベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして染色体とともに複製されるものである。
【００８１】
（発現ベクターの成分）
発現ベクターは代表的に、クローニングベクターの成分（たとえば、選択された宿主生物においてベクターの自律複製を許容するエレメントおよび選択目的で１つ以上の表現型で検出可能なマーカーを含む。発現ベクターは、通常、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび必要に応じてリプレッサー遺伝子または１つ以上のアクチベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。さらに、この発現ベクターは、ＰＯＩを宿主細胞オルガネラ（たとえば、ペルオキシソーム）または特定の宿主細胞区画へと標的かし得るアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。そのような標的化配列としては、配列ＳＫＬが挙げられるがそれに限定されない。本発明の状況において、用語「発現シグナル」とは、上記制御配列、リプレッサー配列またはアクチベーター配列のいずれかを包含する。制御配列の指示のもとでの発現のために、ＰＯＩをコードするＮＯＩは、発現に関して適切な様式で制御配列と作動可能に連結される。
【００８２】
（プロモーター）
ベクターにおいて、ＰＯＩをコードするＮＯＩは、適切なプロモータ配列と作動可能にあわせられる。このプロモーターは、選択した宿主細胞における転写活性を有する任意のＤＮＡ配列であり得、そしてその宿主生物と同種または異種である遺伝子に由来し得る。
【００８３】
（細菌プロモーター）
細菌宿主における本発明の改変されたヌクレオチド配列の転写を指向するための適切なプロモーターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢの遺伝子のプロモーター、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のプロモーターに由来するプロモーター（ｐ１７０プロモーターを含む）が挙げられる。本発明のＰＯＩをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌種において発現され、適切なプロモーターは、たとえば、Ｔ７プロモーターおよびファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択され得る。
【００８４】
（真菌プロモーター）
真菌種における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性αアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼに由来するプロモーターである。
【００８５】
（酵母プロモーター）
酵母種における発現のために適切なプロモーターの例は、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＧａｌ １プロモーターおよびＧａｌ １０プロモーターならびにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーター。
【００８６】
（宿主生物）
（Ｉ：細菌宿主生物）
適切な細菌宿主生物の例は、グラム陽性細菌種（たとえば、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ），乳酸細菌種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（たとえば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉを含む）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ））である。あるいは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅに属するグラム陰性細菌種は、宿主生物として選択され得る。
【００８７】
（ＩＩ：酵母宿主生物）
適切な酵母宿主生物は、以下のような酵母種などであるがそれらに限定されない生物工学的に関連する酵母から選択され得る：Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ種またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む）またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅに属する種（たとえば、Ｓ．Ｐｏｍｂｅ種など）。
【００８８】
好ましくは、メチル栄養性酵母種であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの株が宿主生物として使用される。
【００８９】
好ましくは、宿主生物は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種である。
【００９０】
グリコシル化が起こる前に、本発明の方法を使用することは、酵母のような真核生物宿主細胞から細胞内ＰＯＩを回収するために非常に有利である。分泌されたタンパク質のオリゴグリコシル化は、酵母のような真核生物宿主生物において特に周知の問題である。酵母発現系に関連するこの欠点は、酵母発現ベクターが、大量のバイオマスの高レベルの発現を行い、そしてさらに、酵母は、食品における使用が承認されているにもかかわらず、生産系として酵母を使用することをためらわせている。本発明の方法を用いてＰＯＩを細胞内で発現させ、そしてそのＰＯＩを抽出することによって、そのＰＯＩは、グリコシル化されない。なぜなら、ＰＯＩは、グリコシル化部位が行われる分泌経路を通らないからである。
【００９１】
（ＩＩＩ．真菌宿主生物）
糸状真菌のなかで適切な宿主生物としては、以下のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種が挙げられる：たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ。あるいは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種の株（たとえば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種の株（たとえば、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）は、宿主生物として使用され得る。他の適切な株としては、ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓおよびＭｕｃｏｒ種が挙げられる。
【００９２】
（大規模適用）
本発明の好ましい実施形態において、ＰＯＩは、大規模適用のために使用される。
【００９３】
好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、１ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。
【００９４】
好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、１００ｍｇ／Ｌから約９００ｍｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。
【００９５】
好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、２５０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。
【００９６】
（食品適用）
１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、飲料のような食品の製造において使用するためにＰＯＩを放出するために用いられる。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、界面活性剤の調製において使用するためにＰＯＩを放出するために用いられる。
【００９８】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、製パンにおいて使用するために使用するために適切なＰＯＩを放出するために用いられる。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、生地改善剤において使用するために適切なＰＯＩを放出するために用いられる。
【０１００】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、粉生地、粉生地改善組成物および改善された食品の特性を改善するためにＰＯＩを放出するために用いられる（以下を参照のこと：ＷＯ ９６／３９８５１およびＥＰ−Ｂ−０ ８３３ ５６３）。
【０１０１】
好ましい実施形態において、放出されたＰＯＩは、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2オキシドレダクターゼ、 ＥＣ １．１．３．５）である。
【０１０２】
（ＨＯＸ酵素）
ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）（これはまた、ＨＯＸとも称する）は、Ｄ−グルコースおよび他のいくつかの還元糖（マルトース、ラクトースおよびセロビオースを含む）を、それらの対応するラクトンへと酸化し得、その後、これを加水分解してそれぞれのアルドービオン酸（ａｌｄｏｂｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）へと変換し得る。従って、ＨＯＸは、別のオキシドレダクターゼであるグルコースオキシダーゼ（これは、Ｄ−グルコースのみを変換し得る）とは、その酵素がより広い範囲の糖基質を利用し得るという点において異なる。ＨＯＸによって触媒される酸化は、以下に例示され得る：
Ｄ−グルコース＋Ｏ2−−−−−＞γ−Ｄ−グルクノラクトン＋Ｈ2Ｏ2、または
Ｄ−ガラクトース＋Ｏ2−−−−＞γ−Ｄ−ガラクトノラクトン＋Ｈ2Ｏ2。
【０１０３】
ＨＯＸは、いくつかの海草種により天然で生産される。そのような種は、とりわけ、Ｇｉｇａｒｔｉｎａｃｅａｅ科において見出される。本命最初において使用される用語「ＨＯＸ」とは、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、マルトース、ラクトースおよびセロビオースからなる群より選択される基質を酸化し得る酵素をいう。
【０１０４】
（ＨＯＸ産生）
ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子は、海草Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓからクローニングされた（Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ １９９６，Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｏｕｇａａｒｄ，１９９７）。メチル栄養性酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（異種タンパク質のための発現系としてＲｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ／Ｇｅｒｍａｎｙで開発）もまた、ＨＯＸ酵素（天然のタンパク質は、海草から精製された（Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｈｓｔｒｕｐ，１９９８））を生産するために用いられてきた。ＷＯ ９６／４０９３５およびＷＯ ９８／１３４７８もっまた、ＨＯＸ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組み換え宿主生物におけるクローニングおよび発現を開示する。
【０１０５】
１つの好ましい実施形態において、ＨＯＸ酵素は、配列番号２２において示される配列を含む。
【０１０６】
１つの好ましい実施形態において、ＨＯＸ酵素は、配列番号２２において示される配列、またはその改変体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを包含する。
【０１０７】
（改変体／ホモログ／誘導体（アミノ酸配列））
本発明の好ましいアミノ酸配列は、配列番号２２に示される。か、または本発明のＨＯＸ酵素から入手可能な配列であるが、任意の供給源（例えば、関連するウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチドならびにそれらの改変体または誘導体）から得られたホモログ配列を包含する。
【０１０８】
従って、本発明は、本命最初において提示されるアミノ酸配列の改変体、ホモログまたは誘導体、ならびにそれらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の改変体、ホモログまたは誘導体を包含する。
【０１０９】
本発明の文脈において、ホモログ配列は、少なくとも、例えば、本明細書において列挙される配列の配列番号２２において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５、８５、９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を包含すると解釈される。特に、相同性は、代表的に、必須ではない隣接する配列ではなく、酵素活性について必須であることが知られる配列のそれらの領域に関して考慮されるべきである。これらの領域としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＳＧＧＨ79Ｃ、ＬＧＧＨ146ｌおよびＬＧＧＨ320ＡのようなＨＯＸにおけるＦＡＤ推定結合ドメイン。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学特性／官能基を有するアミノ酸残基）に関して考慮され得るが、本発明の文脈において、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１１０】
相同性比較は、目またはより通常には、利用可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間の相同性％を算出し得る。
【０１１１】
％相同性は、連続配列にわたって算出され得る（すなわち、１つの配列は、他の配列と整列され、そして一方の配列におけるのおののアミノ酸は、他の配列における対応するアミノ酸と、１回に１残基ごと直接比較される）。これは、「ギャップされた」配列と呼ばれる。代表的には、そのようなギャップのない整列は、比較的短い数の残基にわたってのみ行われる。
【０１１２】
このことは、非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一の対の配列において、１つの挿入または欠失が、次のアミノ酸残基が整列から追い出され、従って、全体の整列が行われるとき、相同性％における大きな減少を潜在的に生じ得ることを考慮していない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、相同性全体のスコアを不当にペナルティ付与せずに、可能な挿入および欠失を考慮する最適な整列を生成するように設計される。このことは、局所的相同性を最大限にするように試みる配列整列において「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１１３】
しかし、これらのより複雑な方法は、整列において生じるおのおののギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当て、その結果、同じ数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを伴う配列整列（すなわち、比較される２つの配列の間の最大限の関連性を反映する）は、多くのギャップを用いて１を超える高いスコアを達成する。「アフィンギャップコスト」が代表的に使用される。これは、ギャップの存在について比較的高いコストを、およびギャップにおけるおのおのの次の残基についてのより少ないペナルティーを付与する。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然、より少ないギャップを伴う、最適化された整列を生じる。ほとんどの整列プログラムは、そのギャップペナルティーが改変されることを可能にする。しかし、配列比較のためのそのようなソフトウェアを使用するときは、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（以下を参照）を用いるとき、アミノ酸配列のためのそのデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについて−１２であり、そして各々の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）について−４である。
【０１１４】
従って、最大％相同性の算出は、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最適の整列の生成を必要とする。そのような整列を行うための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を行い得る他のソフトウェアの例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＢＬＡＳＴ ｐａｃｋａｇｅ（以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツールスイート。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインおよびオンラインの検索について利用可能である（以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 同上，７−５８〜７−６０頁）。しかし、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【０１１５】
最終的な％相同性は、同一性の観点で測定され得るが、その整列プロセス自体は、代表的には、オールオアナッシングの対比較に基づかない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいて各々対での比較に対してスコアを割り当てる、スケール調節した類似性スコア行列が一般的に使用される。一般的に使用されるそのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートについてのデフォルト行列）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的に、公のデフォルト値または供給される場合カスタムのシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージのための公のデフォルト値あるいは、他のソフトウェアの場合、デフォルト行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用することが好ましい。
【０１１６】
一旦ソフトウェアが最適整列を生成すると、％相同性、好ましくは＄配列同一性を算出することが可能である。このソフトウェアは、代表的には、その配列比較の部分としてこのことを行い、数的な結果を生成する。
【０１１７】
本発明のアミノ酸配列に関して、用語「改変体」または「誘導体」は、得られるアミノ酸配列が、酵素活性を有し、好ましくは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくともひとつの同じ酵素活性を有する限り、その配列からまたはそれに対して、１（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失、または付加を包含する。
【０１１８】
配列番号２２は、本発明における使用のために改変され得る。代表的には、配列の酵素活性を維持する改変が行われる。アミノ酸置換は、改変された配列が要求される酵素活性を保持する限り、例えば、１、２または３〜１０または２０の置換がなされ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を包含し得る。
【０１１９】
本発明の配列番号２２はまた、サイレントな変化を生成し、そして機能的に等価な酵素を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。故意のアミノ酸置換は、ＨＯＸ酵素の酵素活性が保持される限り、その残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の特性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；および荷電されておらず、極性基を有志、類似の親水性値を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０１２０】
保存的な置換は、例えば、以下の表に従って作成され得る。第二列における同じブロックにおけるアミノ酸、および好ましくは第三列における同じ線上のアミノ酸は、互いに置換され得る。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
（改変体／ホモログ／誘導体（ヌクレオチド配列））
当業者は、遺伝コードの縮重性の結果、多数の異なるヌクレオチド配列が同じＨＯＸ酵素をコードし得ることを理解する。さらに、当業者は、慣用技術を用いて、本発明のＨＯＸ酵素が発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映させるように、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるＨＯＸ酵素に影響させずにぬくれ土地度配列を行い得ることが理解されるべきである。
【０１２３】
本発明の配列番号２２において示されるヌクレオチド配列に関して用語「改変体」、「ホモログ」または「誘導体」には、酵素活性を有し、好ましくは配列表の配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と同じ活性を少なくとも有する、ＨＯＸ酵素をコードする得られたヌクレオチド配列を提供する配列からまたはそれに対して、任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失または付加を包含する。
【０１２４】
配列相同性に関して上記のように、本明細書における配列表に示される配列に対して、好ましくは、少なくとも７５％の、より好ましくは８５％の、より好ましくは９０％の、相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％の、より好ましくは９８％の、相同性が存在する。ヌクレオチド相同性比較は、上記に記載されるように行われ得る。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。 デフォルトスコアリングマトリクスは、各々の同一ヌクレオチドについて１０のマッチ値を有志、ミスマッチについて−９を有する。デフォルトギャップ作成ペナルティーは、−５０であり、そしてそのデフォルトギャップ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティーは、各々のヌクレオチドについて−３である。
【０１２５】
本発明はまた、本明細書に置いて提示される配列に選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の改変対、フラグメントもしくは誘導体、あるいは上記のいずれかに対する相補体を包含する。ヌクレオチド配列は好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長である。
【０１２６】
（ハイブリダイゼーション）
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対合を通じて相補鎖と結合するプロセス、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われるような増幅プロセスを包含する。
【０１２７】
本発明のヌクレオチド配列は、本明細書ににおいて提示されるヌクレオチド配列またはその相補体に対して選択的にハイブリダイズし得、本明細書において提示された対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５もしくは３０、例えば、少なくとも４０、６０もしくは１００またはそれを超える連続するヌクレオチドにわたって、一般的に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５もしくは９０％、および依り好ましくは少なくとも９５％もしくは９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列に対して相同な領域を含み、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列に対して、好ましくは８０または９０％相同であり、そして依り好ましくは少なくとも９５％相同である。
【０１２８】
用語「選択的にハイブリダイズ可能」とは、プローブとして使用されるヌクレオチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドを超えて有意なレベルでプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が存在する（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーがスクリーニングされる場合）。この事象において、バックグラウンドは、プローブとそのライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成されるシグナルのレベルを意味する。このレベルは、標的ＤＮＡで観察された特異的相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の強度である。相互作用の強度は、例えば、32Ｐを用いて、プローブを例えば放射標識することによって、測定され得る。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、そして以下に説明するような規定された「ストリンジェンシー」を与える。
【０１３０】
最大のストリンジェンシーは代表的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じ；高度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約５℃から１０℃下で商事；中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約１０℃〜２０度下で生じ；そして低ストリンジェンシーは、Ｔｍの約２０℃〜２５℃で生じる。
【０１３１】
当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得るが、中程度（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いられ得る。
【０１３２】
好ましい局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５ Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）である。本発明のヌクレオチド配列が、二本鎖である場合、その二重鎖の両方の鎖は、個々または組み合わせてかのいずれかで、本発明により包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖のとき、そのヌクレオチド配列の相補鎖もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解されるべきである。
【０１３３】
本発明の配列に対して１００％相同ではないが、本発明の範囲内に入るヌクレオチド配列は、多数の方法で入手することができる。本明細書において記載される他の改変体は、ある範囲の供給源から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブ検査することによって例えば得られ得る。さらに、他のウイルス／細菌、または細胞ホモログ（特に、哺乳動物細胞（たとえば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）から見出された細胞ホモログ）が得られ得、そしてそのようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、本明細書におけるは入れうｔ表に示される配列に選択的にハイブリダイズし得る。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはそれからのゲノムＤＮＡライブラリーをプローブ検査すること、およびそのようなライブラリーを、配列番号２２に示すヌクレオチド配列のすべてまたは部分を含むプローブで、中程度から高度のストリンジェンシーの条件下でプローブ検査することによって得られ得る。類似の考慮条件は、本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチドの配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。改変体および株／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の標的配列に対して設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得られ得る。
【０１３４】
保存された配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログからのアミノ酸配列を整列することによって予測され得る。配列整列は、当該分野において耕地のコンピュータソフトウェアを用いて行われ得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムは、広汎に使用されている。縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして公知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用されるものよりも低いストリンジェント条件下で使用される。
【０１３５】
あるいは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴付けられた配列（例えば、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列）の部位特異的変異誘発によって得られ得る。このことは、そのヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞にとってコドン優先度を最適化するための配列にとって必要である。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされるＨＯＸ酵素の酵素活性を変更するために所望され得る。
【０１３６】
本発明のヌクレオチド配列は、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射標識または非放射方式を用いて従来の手段により表示標識によって標識されている）を生成するために用いられ得、あるいはそのヌクレオチド配列は、ベクター中にクローニングされ得る。そのようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０のヌクレオチド長であり、そしてまた、本明細書において使用される本発明の用語ヌクレオチド配列によって包含される。
【０１３７】
本発明に従ったヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）およびプローブは、組み換え的に、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段で生成され得る。これらはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。
【０１３８】
一般に、プライマーは、合成的手段によって生成され得、これには、一度に１ヌクレオチドという所望の核酸配列の段階的製造が包含される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当該分野において容易に利用可能である。
【０１３９】
より長いヌクレオチド配列は、一般的に、組み換え手段（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術）を用いて生産される。これは、クローニングすることが所望される標的配列の領域に隣接する、一対のプライマー（例えば、１５〜３０ヌクレオチド長）を作製する工程、そのプライマーを、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに接触させる工程、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を所望の領域の増幅をもたらす条件下で行う工程、増幅したフラグメントを例えば、アガロースゲルにおいて反応混合物を精製することによる）およびその増幅したＤＮＡを回収する工程を包含する。このプライマーは、増幅したＤＮＡが適切なクローニングベクター中にクローニングされ得るように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
【０１４０】
遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用してＨＯＸ酵素をクローニングおよび発現し得る。当業者に明らかなように、天然に存在しないコドンを含むＨＯＸ酵素コードヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。特定の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７−５０８）が選択され得、例えば、これにより、ＨＯＸ酵素発現率を増加させ得、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生産される転写物より長い半減期）を有する組み換えＤＮＡ転写物を生産し得る。
【０１４１】
（スクリーニング）
本発明の方法は、変異した宿主細胞生物における細胞内ＰＯＩのレベル上昇についてスクリーニングするために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて使用される細胞は、固体支持体または固体基材に固定され得る（例えば、プラスチックピンまたは他のいくらかの表面）。その細胞は、本発明の膜抽出組成物に接触され得、そして放出されたＰＯＩレベルは、当該分野において公知の方法を用いて測定され得る。
【０１４２】
（高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ））
本発明の方法は、高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）系において使用され得る。ここで、標的細胞は、マイクロタイタープレート（１００００変異体／日）でロボットにより増殖およびスクリーニングされる。例示の目的で、新たな組み換え生産株を作製する場合、生産性を増加するために伝統的な変異誘発を１回または数回行うことが通常必要である。これは、変異された細胞のＨＴＳを用いて最も効率的に行われる。
【０１４３】
本発明の方法は、非常に有利である。なぜなら、これは、細胞内ＰＯＩのレベルの増加を高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）に可能とするからである。これまでは、これらの系は、分泌されたＰＯＩのより高いレベルについてスクリーニングのみを行うことができた。
【０１４４】
（実施例節および図面への導入）
わずかにより詳細には、
図１は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉａにおけるＨＯＸ産生のための発現ベクターの物理的マップを提供する。任意のシグナル配列に融合された合成ＨＯＸ遺伝子のコード領域を有する、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ平滑フラグメントを、標準的なＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクターの多重クローニング部位中にクローニングした。この発現ベクターは、蟻酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）遺伝子のプロモーターおよびメタノールオキシダーゼ遺伝子のターミネーター（ＭＯＸ−Ｔ）を、フラグメント部位についての複数クローニング部位によって分離されて、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増殖および選択のためのｏｒｉおよびｂｌａ（ａｍｐＲ）、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける複製のためのＡＲＳ（ＨＡＲＳ）配列、選択のためのＵＲＡ３遺伝子を包含する。
【０１４５】
図２Ａは、１．４ｋｂの純正のＦＭＤ遺伝子（上スキーム）およびクローニングされた異種ＤＮＡを有するＦＭＤプロモーター（下スキーム）の図を示す。制限部位は、Ａｓｐ７１８、ＮｃｏＩである。
【０１４６】
図２Ｂは、組み込まれた遺伝子の遺伝子コピーを示す。レーン１−１２は、異なる組み換え単離体およびその対応するＤＮＡ希釈を示す。レーン１３は、形質転換されていない宿主株を示し、そしてレーン１４は、サイズマーカー（Ｍ）を示す。
【０１４７】
図３Ａおよび３Ｂは、ＨＯＸ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。図３Ａは、変異誘発した株ＤＫ８−２７ＫａｎＩＩ３−ｍｕｔ２５のグリセロール醗酵からの培養物濾液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。レーン１は、マーカータンパク質を示す。レーン２は、ＨＯＸ標準（０．０３Ｕ／ｍｌ；１８μｌ）を示す。レーン３は、プローブ３（１８μｌ）からの上清を示す。レーン４は、プローブ４（１８μｌ）からの上清を示す。レーン５は、プローブ５（１８μｌ）からの上清を示す。レーン６は、プローブ６（１８μｌ）からの上清を示す。レーン７は、プローブ７（１８μｌ）からの上清を示す。レーン８は、プローブ８（１８μｌ）からの上清を示す。レーン９は、プローブ９（１８μｌ）からの上清を示す。レーン１０は、プローブ１０（１８μｌ）からの上清を示す。レーン７は、プローブ７（１８μｌ）からの上清を示す。
【０１４８】
図３Ｂは、ＨＯＸを発現する組み換え株のウェスタンブロット分析を提供する。レーンに適用されたサンプルは、図３Ａについてと同様である。膜は、ポリクローナルＨＯＸ抗体でプローブ検査した。
【０１４９】
図４は、分泌株ＤＫ８−２７ＫａｎＩＩ３−ｍｕｔ２５の１０リットルの醗酵培養物の増殖および生産性を示す。この醗酵は、２５℃およびｐＨ５．０で、グリセロールおよびｐＯ2制御のもとで行った。
【０１５０】
図５は、コドン最適化を伴うＨＯＸ遺伝子を合成するために使用される個々のオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５１】
図６は、合成ＨＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を提供する。
【０１５２】
図７Ａ−７Ｄは、免疫蛍光により決定されるようなＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおけるＨＯＸ酵素の局在化を示す。ＨＯＸ酵素（緑色シグナル）の局在化の、核局在（青色シグナル）との重ね合わせを示す。以下を参照：Ａ）ＨＯＸ遺伝子なしのＲＢ １１ 株、Ｂ）ＤＫ８−２７、Ｃ）ＤＫ８−２７ ｍｕｔ２５、Ｄ）ＤＫ２ＩＩ−Ｉ。
【０１５３】
図８は、細胞ホモジナイザーを通じたサイクルの数の関数としてのＨＯＸ活性を示すグラフを提供する。
【０１５４】
図９は、ＣＴＡＢおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の異なる濃度で抽出されたＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞を示すグラフを提供する。
【０１５５】
図１０Ａは、ＣＴＡＢ処理後の細胞上清（レーン７−１０）およびペレット（レーン２−５）におけるにおけるＨＯＸ酵素レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＨＯＸ酵素は、機械的抽出によりペレットから放出された。そのサンプルは、ＭＥＳ，Ｎｏｖｅｘからの４−１２％ＮｕＰＡＧＥゲルの上で分析し、そして１０μｌのサンプルを以下の順で各々のレーンにロードした：レーン２−５：細胞ペレットにおける残りのＨＯＸ；レーン７−１０：上清における放出されたＨＯＸ；レーン１および６：Ｎｏｖｅｘ Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ標準物；レーン２：コントロール；レーン３：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン４：０．２％ＣＴＡＢ；レーン５：０．４％ＣＴＡＢ；レーン７：コントロール；レーン８：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン９：０．２％ ＣＴＡＢおよびレーン１０：０．４％ ＣＴＡＢ。
【０１５６】
図１０Ｂは、細胞上清（レーン７−１０）およびペレット（レーン２−５）におけるＨＯＸ酵素レベルのウェスタンブロット分析を示す。ＨＯＸ酵素は、機械的抽出によりペレットから放出された。このサンプルを、ＭＥＳ，Ｎｏｖｅｘからの４−１２％ ＮｕＰＡＧＥゲルにおいて分析し、そして５μｌのサンプルを各々のレーンに以下の順序でロードした：レーン１ および６：Ｎｏｖｅｘ Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ 標準物，レーン２：コントロール，レーン３：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン４：０．２％ ＣＴＡＢ；レーン５：０．４％ ＣＴＡＢ；レーン７：コントロール，レーン８：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン９：０．２％ ＣＴＡＢおよびレーン１０：０．４％ ＣＴＡＢ。
【０１５７】
図１１Ａは、ＣＴＡＢ抽出されたＨＯＸについての溶出プロファイルを示す。
【０１５８】
図１１Ｂは、機械的に抽出されたＨＯＸについての溶出プロファイルを示す。
【０１５９】
（実施例）
（材料および方法）
（化学物質）
使用したすべての化学物質は、分析試薬等級のものであった。レシチン（３−ｓｎ−ホスファチジルコリン）は、Ｓｔｅｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からＳｔｅｒｎｐｕｒ ＰＭとして市販されている。プロナーゼＥ（エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼの混合物についての専用名称であって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ から得られ、実質的に任意のタンパク質を加水分解してほとんど完全にアミノ酸を遊離させ得るもの）。リゾレシチン（リゾホスファチジルコリン）、Ｄ−グルコース、ｏ−ジアニシジン、ペルオキシダーゼ（Ｐ−８１２５）、カプロン酸（デカン酸）、サポニン（植物において広く分布するグリコシドの大群のいずれかのメンバーであって、強力な界面活性剤である）およびＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドとしても知られる）（Ｈ−５８８２）はすべて、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡから購入した。メタノール（ＨＰＬＣ）は、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ Ｌｔｄからであった。過酸化水素およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエトキシル化オクチルフェノールについての専用名称）は、Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。Ｐａｌｓｇａａｒｄ ４４４５としても市販される乳化剤ＹＮは、Ｐａｌｓｇａａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。四級アンモニウム化合物（例えば、ＬＴＡＢ（ラウロイルトリメチルアンモニウムブロミド）、Ｃｅｔｒｉｍｉｄｅ−４０（ｃｅｔｒｉｍｉｄｕｍとしても知られる）（これは、アルキルアンモニウムブロミド、主にＣＴＡＢからなる界面活性剤殺菌剤である）、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＳＴＡＢ（ステアロイルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＭＴＡＣ（ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド）、ＣＴＡＣ（セチルトリメチルアンモニウムクロリド），ＳＴＡＣ（ステアロイルトリメチルアンモニウムクロリド）は、すべて、ＦｅＦ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。Ｒｏｄａｌｏｎは、約９．５％（９５ｇ／ｌ）のアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド（Ｃl2Ｈ25Ｎ（ＣＨ3）2Ｃ7Ｈ7Ｃｌ）を含み、これは、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，２９５０ Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋから得た。アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドはまた、塩化ベンザルコニウムとしても知られる。乳化剤ラウロイルラクチレートナトリウム（ＳＬＬ）は、Ｄａｎｉｓｃｏ Ｃｕｌｔｏｒ，Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。
【０１６０】
（酵母醗酵）
酵母の培養は、１０ＬスケールについてのＲｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ醗酵マニュアルに従って６Ｌまたは１００Ｌの醗酵槽において行った。
【０１６１】
（実施例１）
（合成の、コドン最適化ＨＯＸ遺伝子のアセンブリ）
（遺伝子設計）
ネイティブのＨＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、合成遺伝子を生成した。この合成ＨＯＸ遺伝子（図６）は、コドン使用法を、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ、Ｓ．Ｐｏｍｂｅのような生物工学的に関係ある酵母の既知のコドン優先度と正確に一致するように、これら生物における高レベル生産を容易にするため設計した。遺伝子は、３つの別個のアセンブルおよび／またはクローン化されたフラグメントに分割した。５’基部半分と称したサブアセンブリは、相補的なペアとして図５に提示されるような以下のオリゴヌクレオチドから構成された：ＨＯＸ１ａ／ＨＯＸ２ｂ、ＨＯＸ３ａ／ＨＯＸ４ｂ、ＨＯＸ５ａ／ＨＯＸ６ｂ、ＨＯＸ７ａ／ＨＯＸ８ｂ、ＨＯＸ９ａ／ＨＯＸ１０ｂ；プライマー１−６を用いる３’遠位部半分およびプライマー６−１０を用いる３’遠位部半分。
【０１６２】
（５’基部合成ＨＯＸ遺伝子）
合成ＨＯＸ遺伝子の５’基部半分は、１０のオリゴヌクレオチドＨＯＸ１Ａ〜ＨＯＸ１０Ｂを用いて合成した。１００μＬのホットスタートＰＣＲ反応（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いる）において、１００−１２０塩基対の範囲の長さを有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた（濃度＝各々０．１μＭ）。ホットスタートは、ｄＮＴＰ（２５０μＭ）およびＰｗｏポリメラーゼ（２．５単位）を添加する前に、オリゴヌクレオチド、緩衝液、ＭｇＳＯ4の混合物を、９０℃まで加熱することにより実施した。４０サイクルのＰＣＲは、９４℃３０秒、５７℃１分および７２℃１分のＰＣＲプロフィールを用いた。７２℃における１０分の伸長ステップを、４０サイクルの終わりに含めた。アガロースゲル電気泳動におけるこのＰＣＲからの産物の分析は、サイズが１００〜８５０塩基対の範囲のＤＮＡバンドのスメアを示した。最初のＰＣＲを、上記反応からの２μｌをテンプレートとして、および隣接プライマーＨＯＸ１ＡおよびＨＯＸ１Ｂ（各々１μＭ）用いて再増幅した。この反応は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および２単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を含んだ。ＰＣＲ条件は：９４℃２分間、次いで９４℃３０秒間、６０℃１分間および７２℃４５秒間のプロフィールをもつＰＣＲの３０サイクルであった。７２℃における１０分の伸長ステップを、４０サイクルの終わりに含めた。アガロースゲル電気泳動による第２のＰＣＲ産物の分析は、次いでゲルから精製され、そしてベクターｐＣＲ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化された、８５０ｂｐのＤＮＡバンドの存在を示した。
【０１６３】
（３’遠位部合成ＨＯＸ遺伝子）
ＨＯＸ遺伝子の遠位部分を合成するために、９０−１２６塩基対の範囲の長さのプライマーを設計した。これらプライマーは、約６０℃の計算された融解温度をもつ１６−２１塩基対の重複（相補的）領域を含んだ。このＨＯＸ遺伝子の遠位部分は、各々が５３０塩基対のサイズをもつ２つのフラグメント（ＡおよびＢ）として合成された。２つのＰＣＲ反応を、６つのプライマーを用いて一度に実施した。ＰＣＲ反応１はプライマー１−６を含み、そしてＰＣＲ反応２はプライマー５−１０を含んだ。ＰＣＲ増幅反応は、１００μｌの反応容量中、０．１μＭの各々のプライマー、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＳＯ4および２．５単位のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いる２つのＰＣＲ反応のサイクリングパラメーターは、９５℃における１分の変性、次いで：９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間のＰＣＲの３０サイクルを含めた。次いで、７２℃における３分の伸長反応を行った。アガロースゲル電気泳動による２つのＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の分析は、両方の場合で、長さが約５３０ｂｐの正確なサイズの１つの特異的ＤＮＡバンドの合成を示した。これらＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。クローン化された部分的合成ＨＯＸ遺伝子を、複数クローニング部位に隣接するプライマー（Ｍ１３逆プライマーおよびＴ７プロモータープライマー）を用いて配列決定した。配列決定結果は、合成された部分遺伝子が正確な配列を含んでいたことを確証した。
【０１６４】
（最終のコドン最適化ＨＯＸ遺伝子のアセンブリ）
合成ＨＯＸ遺伝子の３つの部分を、Ｎｃｏ１／ＰｖｕＩＩ ５’基部ＨＯＸ、３’遠位ＰｖｕＩＩ／ＳｐｅＩ ＨＯＸフラグメントＡおよびＳｐｅＩ／ＮｏｔＩで切断されたフラグメントＢからなる、ゲル精製されたＤＮＡフラグメントの連結により結合した。完全なコドン最適化された合成ＨＯＸ遺伝子（図６）を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａから外来タンパク質の発現および分泌を媒介するために開発されたＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクター中にアセンブルした。この発現ベクターは、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＦＭＤ）、ＭＯＸターミネーター、酵母分泌シグナルありまたはなしに基づく。
【０１６５】
（結果１）
（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける組換えＨＯＸの発現）
表１は、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ発現／組み込みベクターの複数クローニング部位中に、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ平滑フラグメントとして挿入された種々のＨＯＸ／分泌融合構築物を示す。異なるシグナル配列は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子接合型遺伝子およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡアミラーゼ由来であった。シグナル配列なしのＮｏｃＩ／ＮｏｔＩ ＨＯＸ構築物もまたベクター中にクローン化した。
【０１６６】
【表２】
【０１６７】
用語、変異体合成は、推定のＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位Ｒ331−Ｋ332〜Ｒ331−Ｐ332に関する。
【０１６８】
（実施例２）
（形質転換および継代）
異なるＨＯＸ発現プラスミドを用いて、ウラシル栄養要求性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｐｈａ株ＲＢ１１を、ウリジン原栄養に形質転換した。異なる発現プラスミドを保持するＨＯＸ形質転換体を、選択的条件下で３０世代の間培養し、プラスミドＤＮＡを増幅し、そしてゲノム中へ組み込ませた。これら形質転換体を、完全非選択培地上で２０世代の間増殖させた。選択に加え、ＰＣＲおよびサザン分析を用いて形質転換体を特徴付けた。
【０１６９】
（組み込まれた異質ＤＮＡのコピー数の決定）
非形質転換宿主株および特定のＨＯＸ構築物の種々の組換え単離株のゲノムＤＮＡを制限酵素Ａｓｐ７１８／ＮｃｏＩで消化した。制限酵素消化ＤＮＡを、０．８％アガロースゲル上で分離し、メンブレン（ニトロセルロース）に移し、そしてクローン化ＦＭＤプロモーターの32Ｐ標識フラグメントにハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションパターンは２つのシグナルを示し、１つは真の単一コピー１．４ｋｂＦＭＤ遺伝子であり、そしてもう１つはわずかにより小さな異種融合に由来する。一連の希釈は、固有の単一コピーのコントロールと比較して組み込まれたＤＮＡの単一強度の推定を可能にした。
【０１７０】
（結果２）
（ＨＯＸ発現のスクリーニング）
形質転換体を、３ｍＬのチューブ培養中で生育させ、そして１％グリセロールを培地に補填することによる脱抑制条件の下で培養した。ＨＯＸ発現を、グリセロール発酵からの培養のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。ポリクローナルＨＯＸ抗体を用いるウェスタンブロット分析を用いてＨＯＸタンパク質の存在を検出した。
【０１７１】
【表３】
【０１７２】
（実施例３）
（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける組換えＨＯＸの局在化）
組換えＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの免疫蛍光顕微鏡法には、細胞を、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）＋グルコース中で、１０8細胞／ｍｌの密度まで前培養した。発現を誘導するために、３×１０8細胞を、ＹＮＢ＋１％グリセロールで補填した１００ｍＬの振盪フラスコ培養にシフトした。脱抑制条件下の１、２または３日の増殖の後、５×１０8細胞を、組合わせたパラ−ホルムアルデヒド（４％）およびグルタルアルデヒド（０．２％）処置（ＨａｇｅｎおよびＨｙａｍ、１９８８）により固定した。１ｍＬのＰＥＭ（１００ｍＭ
Ｐｉｐｅｓ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、ｐＨ６．９）で３回洗浄した後、細胞壁を、０．５ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔを補填したＰＥＭＳ（ＰＥＭ＋１Ｍソルビトール）中で部分的に除去した。消化の約６０分後、細胞を、ＰＥＭＳ＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００にシフトし、３０秒インキュベートし、そして０．５ｍＬのＰＥＭで３回洗浄した。未反応グルタルアルデヒド細胞をクエンチするために、細胞をＰＥＭ＋１ｍｇ／ｍＬホウ化水素ナトリウム中に再懸濁した。この直後、細胞を、ＰＥＭ中で２回洗浄し、ＰＥＭＢＡＬ（ＰＥＭ＋１％ＢＳＡ（グロブリンフリー）、１ｍＭ リジン塩酸塩、０．１％ＮａＮ3）中に再懸濁し、そして回転ホイール上でインキュベートした。１０8細胞に等しい、細胞懸濁物の２５％を、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製したポリクローナル抗−ＨＯＸ抗体で補填し、そして室温で一晩インキュベートした。０．５ｍＬのＰＥＭＢＡＬ中で３回洗浄した後、細胞を、ＰＥＭＢＡＬ中に懸濁し、そして０．５％のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに暗中で５−２０時間インキュベートした。ＰＥＭＢＡＬ中の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ中で１回、ＰＢＳ＋０．２μｇ／ｍＬジアミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）中で１回洗浄し、そして最後にＰＢＳ＋０．１％ＮａＮ3中に再懸濁した。顕微鏡観察には、細胞懸濁物の小サンプルを、ポリＬリジンでコートされたカバースリップ上に乾燥し、そして１ｍｇ／ｍＬパラ−フェニレンジアミンを含む１００％グリセロールの液滴中に転置した。細胞を、間接免疫蛍光装置を備えたＺｅｉｓｓ顕微鏡で検査し（１．０００×）、そしてイメージを、ＣＣＤカメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ Ｋｏｄａｋ）によりキャプチャーし、そしてＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いてプロセッシングした。
【０１７３】
（結果３）
ＤＫ８−２７形質転換体の免疫蛍光顕微鏡検査は、組換えＨＯＸタンパク質が、凝集体として、主に細胞の周縁に局在化していることを示した（図７ｂ）。生化学的データと組合わせ、これらの結果は、ある程度までのＨＯＸが、（実質的な膜結合タンパク質に対し）膜結合タンパク質であり得ることを示す。ＨＯＸは、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の原形質膜に局在化する可能性が最も高い。また、ＤＫ８−２７由来のＤＫ８−２７ｍｕｔ２５株では、ＨＯＸは、原形質膜と結合している（図７ｃ）。しかし、このタンパク質は、凝集体で蓄積せず、より均一に分布している。種々のリーダーペプチドに融合するとき、ＨＯＸは、巨大な細胞内凝集体で蓄積する（図７ｄ）。
【０１７４】
（実施例４）
（異なる界面活性剤およびプロテアーゼによる組換えＨａｎｓｅｎｕｌａからのＨＯＸの抽出）
実験は、１５ｍＬの遠心分離チューブ中の５．０ｍＬの細胞懸濁物（細胞＋上清）を用いることにより実施した（ＨＯＸ９９２６−７、３１７ｇ細胞／Ｌ湿潤重量、０．３Ｕ／ｍＬ細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間の遠心分離により分離した。透過性実験には、次いで、上清を、ＣＴＡＢ、ＣＴＡＴ＋プロナーゼＥ、プロナーゼＥ、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの商標名）およびＴｗｅｅｎ８０（ソルビタンモノラウレートの商標名）のいずれかで補填した。次いで、細胞を、４．０ｍＬの上清中に再懸濁し、そして２５℃で２３時間インキュベートした（５００ｒｐｍ）。ＣＴＡＢとの時間の効果を調べるために、チューブの１つの中の細胞を、４ｍＬの０．４％ＣＴＡＢ中２５℃で７分間のインキュベートのみをした。次いで、細胞を、遠心分離により分離した。次いで、細胞を、添加されるＣＴＡＢのない元の上清中に再懸濁し、次いで、上記のように２３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞フリー抽出物中の細胞外ＨＯＸを、ＨＯＸアッセイにより測定した。
【０１７５】
（ＨＯＸ活性の測定のためのアッセイ方法（ＨＯＸアッセイ））
ＨＯＸ活性は、ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＩｋａｗａ（１９７３）のアッセイにより推定した。このアッセイを、マイクロタイタープレート中で行うためにスケールダウンした。
【０１７６】
（原理）
ＨＯＸアッセイは、グルコースの酸化で発生する過酸化水素の測定に基づく。この過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下でｏ−ジアニシジンを酸化し、色素を形成する。
【０１７７】
ＨＯＸ
β−Ｄ−グルコース＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2 → Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン＋Ｈ2Ｏ2
ＰＯＤ
Ｈ2Ｏ2＋ｏ−ジアニシジンred → ２Ｈ2Ｏ＋ｏ−ジアニシジンox
（試薬）
１．１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３
２．１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中の１００ｍＭ Ｄ−グルコース
３．ｏ−ジアニシジン、３．０ｍｇ／ｍｌ蒸留水中
４．ペルオキシダーゼ、０．１０ｍｇ／ｌｍＬ １００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中
（アッセイ）
１２０μｌ 試薬１
１５０μｌ 試薬２
１０μｌ 試薬３
１０μｌ 試薬４
および １０μｌ 酵素溶液（適正な希釈中）
このアッセイは、マイクロタイタープレート中で実施される。反応は、酵素溶液の添加により開始される。この混合物は、振盪しながら２５℃で１０分間インキュベートされる。ブランクの反応は、酵素溶液に代わる水とすべての成分を含む。色素の形成は、４０５ｎｍにおけるマイクロタイタープレートリーダー中で測定される。反応の直線性は、マイクロリーダー上の動力学的プログラムを用いることによりチェックされる。
【０１７８】
（過酸化水素標準曲線）
過酸化水素標準曲線は、変化する濃度の新鮮Ｈ2Ｏ2を用いることにより構築する。１単位の酵素活性を、２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＨ2Ｏ2を生成する酵素量と規定する。
【０１７９】
（結果４）
表３に提示されたデータは、ＣＴＡＢがＨＯＸを抽出することで非常に効率的であることを示す。ＣＴＡＢはまた、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ８０よりかなり効率的である。プロテアーゼを添加することの有意な利点はない。非常に興味深いことに、ＣＴＡＢは、ほんの７分のプレインキュベーションでもちいるときでさえ、そのポジティブな影響を奏し、これは、ＣＴＡＢが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞壁に非常に迅速に結合し、かつ透過処理することを示す。これは、ＣＴＡＢに対する細胞フリー上清の分析により支持されており（以下を参照のこと）、これは、添加された４０００ｐｐｍのＣＴＡＢのうちほんの５０−１００ｐｐｍが細胞フリー上清中に存在することを示す。
【０１８０】
各試験薬剤についての遠心分離チューブ中の沈殿物の比較はまた、ＣＴＡＢ処置細胞のパックされた細胞容積が、ＣＴＡＢ以外の界面活性剤で処理されたコントロール細胞（単数または複数）の容積より小さいことを示す。細胞のこの収縮は、細胞が実際に透過処理され、そしてそれらの可溶性内容物のあるものが空にされたことを示す。
【０１８１】
【表４】
【０１８２】
（実施例５）
（ＣＴＡＢおよびベンズアルコニウムクロライド（ＢＡＣ）を用いるＨＯＸの抽出）
この実験は、１５ｍＬ遠心分離チューブ中の５．０ｍＬの細胞懸濁物（細胞＋上清）（ＨＯＸ９９５９、Ｍｕｔ４５）を用いることにより実施した。次いで、細胞懸濁物を、ＣＴＡＢ（１０％ＣＴＡＢストック溶液から）またはベンズアルコニウムクロライド（Ｒｏｄａｌｏｎ、９．５％ベンズアルコニウムクロライド）いずれかで補填し、そして２５℃で２２時間インキュベートした（２００ｒｐｍ）。インキュベーション後、細胞外ＨＯＸ（細胞を４０００ｇで１０分間の遠心分離により除去した）をＨＯＸアッセイにより測定した。
【０１８３】
（結果５）
表４に提示したデータは、ベンズアルコニウムクロライド（ＢＡＣ）が細胞からＨＯＸ酵素を放出することで非常に効果的であることを示す。
【０１８４】
【表５】
【０１８５】
（実施例６）
（塩と組み合わせたＣＴＡＢによる、かつ異なる温度におけるＨＯＸの抽出）
ＣＴＡＢ効果の機構を試験するために、ＣＴＡＢをカオトロピック塩および非カオトロピック塩と組み合わせた。５ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を１５ｍＬ遠心管に加えた（ＨＯＸ９９２６−７、３１７ｇ細胞／リットル湿重量、０．３Ｕ／ｍＬ細胞内ＨＯＸ活性）。細胞を４０００ｇで１０分間遠心分離によって分離した。次いで、上清をＣＴＡＢ、ＣＴＡＢ＋ＮａＣｌ、ＣＴＡＢ＋尿素、ＣＴＡＢ＋硫酸アンモニウムまたは非イオン性洗浄剤であるオクチル−グリコシドのいずれかで補充した。次いで、細胞を４．０ｍＬの上清中に再懸濁させ、そして２５℃で２６時間インキュベートした（５００ｒｐｍ）。この実験において、振盪および温度の効果もまた、試験した。インキュベーション後、細胞を含まない抽出物を使用して、実施例４に概説されるようなＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性を試験した。
【０１８６】
（結果６）
結果を表５に示す。振盪が、ＣＴＡＢの存在下でＨＯＸの抽出をするために必ずしも必要でないことが明白である。明らかな温度効果があり、これは、４℃での抽出は、２５℃で抽出された活性の半分だけ生じることを意味する。塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムの添加は両方とも、ＣＴＡＢ処理の効果を減少させ、これは、ＣＴＡＢ］のイオン性が重要であることを示し得る。尿素の添加は、あまり強烈でない効果を有するが、依然として抽出されたＨＯＸの量を０．４％のＣＴＡＢで抽出された量の約半分まで減少させる。尿素は、非イオン性であるが、疎水性の相互作用によって妨害され得る。尿素は、親油性のタンパク質の抽出のためにＰｉｃｈｉａ細胞を透過させる手法として、先行技術において報告された（Ｃｒａｉｇ １９８７）。非イオン洗浄剤であるオクチルグルコシドは、有意な抽出効果を有さない。
表５
細胞内ＨＯＸの抽出に対する洗浄剤、塩と組み合わせた洗浄剤、振盪、および温度の効果
【０１８７】
【表６】
【０１８８】
（実施例７）
（ＨＯＸを含む細胞抽出物におけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるＣＴＡＢおよびＬＴＡＢの決定）
実施例５からの抽出されたＨＯＸのサンプルを、以下のユニットからなるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣ−ＭＳシステムにおけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの手法によって、それらのＣＴＡＢの含量について分析した：
ａ）二成分勾配ポンプ、ＨＰ１１００
ｂ）自動サンプラー、ＨＰ１１００、
ｃ）サーモスタットのカラム成分、ＨＰ１１００
ｄ）質量選択検出器、ＨＰ１１００
ｅ）クロマトグラフィーデータシステム、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０１。
【０１８９】
このシステムに、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＸＤＢ−Ｃ８、５μＭ、１５０×４．６ｍＭ ｉｄ．（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを備えた。カラム温度は２５℃であった。
【０１９０】
クロマトグラフィー条件は、２つの溶媒からなる移動相であった。溶媒Ａ：１ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ／水、溶媒Ｂ：１ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ／メタノール。カラムを、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件によって（すなわち、クロマトグラフィーの期間の間、溶出液の組成が一定に保持される条件を用いて）実行した：５％Ａ＋９５％Ｂ、０．８０ｍＬ／分の溶媒流速および１０μＬの注入量で。サンプルを直接注入した。
【０１９１】
質量分析条件は、以下の噴霧室設定であった：
イオン化モード：ポジティブモードにおけるエレクトロスプレー
乾燥ガス（Ｎ2）温度：３５０℃
乾燥ガス流速：６．０ｌ／分
噴霧器圧：６０ｐｓｉ
毛細管電圧：−４０００ボルト
フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧：１００ボルト。
【０１９２】
検出器の設定は以下であった：ＳＩＭパラメータ：ｍ／ｚ ２８４．１（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン）。５００μｇのＣＴＡＢ／ｍＬ水（中心集中度 １０００）を含むストック溶液を、水で希釈し、以下の中心集中度を有する標準溶液を得た：３００−１００−３０−１０。サンプルに、０．４％のＣＴＡＢを添加し、これによって、抽出物に全ＣＴＡＢが存在する場合、４０００μｇ／ｍＬを得た。
【０１９３】
四級アンモニウム化合物のための分析方法を、異なるカラムを用いることによって、そして異なる移動相を用いることによって最適化した。２つの９０Ｌスケールの発酵（３１４ｇ／Ｌウエットセルのバイオマス濃度のＶｅｓｔ０００２ｂおよび３３２ｇ／Ｌウエットセルのバイオマス濃度のＶｅｓｔ０００３ｂ）を、０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度までＬＴＡＢに添加し、そしてＨＯＸを２４時間抽出した。各発酵からのサンプルを１００００ｇで１０分間遠心分離し、そして得られた上清をＬＴＡＢ分析のために除去した。以下の方法を用いて、以下のユニットからなるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣ−ＭＳシステムにおけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの手法によって、上清中のＬＴＡＢ含量を定量した：
ａ）二成分勾配ポンプ、ＨＰ１１００
ｂ）自動サンプラー、ＨＰ１１００
ｃ）サーモスタットのカラム成分、ＨＰ１１００
ｄ）質量選択検出器、ＨＰ１１００
ｅ）クロマトグラフィーデータシステム、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０１。
【０１９４】
このシステムに、ＰＬＲＰ−Ｓ、１００Å、５μｍ、２５０×４．６ｍＭ ｉｄ．（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムを備えた。カラム温度は２５℃であった。
【０１９５】
クロマトグラフィー条件は、メタノール中の０．１％のヘプタフルオロ酪酸からなる移動相であった。カラムを１．００ｍＬ／分の溶媒流速および５μＬの注入量で実行した。サンプルをメタノールで２５倍に希釈し、そして注入前に、Ｇｅｌｍａｎ ＧＨＰ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍＭ Ｍｉｎｉｓｐｉｋｅ ０．４５μＭを介して濾過した。
【０１９６】
質量分析条件は、以下の噴霧室設定であった：
イオン化モード：ポジティブモードにおけるエレクトロスプレー
乾燥ガス（Ｎ2）温度：３５０℃
乾燥ガス流速：１３．０Ｌ／分
噴霧器圧：６０ｐｓｉ
毛細管電圧：−４０００ボルト
フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧：１５０ボルト。
【０１９７】
検出器の設定は以下であった：ＳＩＭパラメータ：ｍ／ｚ ２２８．１（ラウオリルトリメチルアンモニウムカチオン）。２５０μｇのＬＴＡＢ／ｍＬメタノール（中心集中度 １０００）を含むストック溶液を、メタノールで希釈し、以下の中心集中度を有する標準溶液を得た：４００−２００−１２０−８０−３６−１０．８−５．４−２．１６−０．８６４。
【０１９８】
（結果７）
表６から、ＨＯＸ酵素を含む細胞抽出物におけるＣＴＡＢのレベルは、細胞に添加された量よりずっとより低いことが明白である。これは、酵母細胞壁へのＣＴＡＢの結合およびそれ故の固定化によって説明される。これは、得られたＨＯＸ酵素のみが、非常に低いレベルのＣＴＡＢを含むことを意味する。
表６
実施例６からの抽出されたＨＯＸ上清中のＣＴＡＢの含量
【０１９９】
【表７】
【０２００】
上清中のＬＴＡＢについて得られた結果（表６ａ参照）は、添加されたＬＴＡＢの約２７％のみが、細胞を含まない画分において見出されることを示す。この結果は、表６のＣＴＡＢでの結果と同じ傾向を示す。
表６ａ
実施例６からの発酵Ｖｅｓｔ０００２ｂおよびＶｅｓｔ０００３ｂから抽出された上清中のＬＴＡＢ含量
【０２０１】
【表８】
【０２０２】
（実施例８）
（ＣＴＡＢによるＨＯＸの抽出の時間および効率に対する温度の効果）
ＣＴＡＢによるＨＯＸの抽出の時間および効率に対する温度の効果を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａサンプル上で試験した：Ｍｕｔ４５、ＨＯＸ９９４９、２８４ｇ／Ｌ、２．６Ｕ／ｍＬ。
【０２０３】
遠心管中の発酵物（細胞＋上清）５ｍＬに、（１０％のＣＴＡＢ溶液からの）０．２％か０．４％のいずれかのＣＴＡＢを添加した。この管を、それぞれ、２５、３０、３５および４０℃でインキュベートした（２００ｒｐｍ）。指示された時間に、サンプルを取り、そして１０００ｇで５分間遠心分離した後、上清をＨＯＸ活性についてアッセイした。結果を表７に示す。
表７
異なる温度でのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸ抽出の時間経過
【０２０４】
【表９】
【０２０５】
（結果８）
ＣＴＡＢ抽出は、温度に依存すること、およびより高い温度を用いることによってより速い抽出が達成され得ることが明白である。しかし、これは、抽出されたタンパク質の安定性によってバランスされるべきパラメータである。この実験において、０．２％または０．４％のＣＴＡＢを用いることの間に、有意差は存在しないようである。しかし、これは、特定の実験における細胞濃度に依存する。
【０２０６】
（実施例９）
（異なる４級アンモニウム化合物によるＨＯＸ抽出）
いくつかの異なる４級アンモニウム化合物を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来の細胞内ＨＯＸ酵素の抽出に関して試験した。発酵培養液のサンプルを、６Ｌスケールの発酵（ここでは、バイオマス濃度が１Ｌ当たり約３４０ｇ湿重量である）から除去した。表８に列挙される４級アンモニウム化合物の各々の４％（ｗ／ｖ）溶液１ｍＬを、プラスチック管に発酵培養液９ｍＬまで添加した。２５℃で２００ＲＰＭでの２４時間のインキュベーション後に、管を２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、前記のように、ＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析した。
【０２０７】
ＨＯＸ抽出の時間経過をＣＴＡＢ、ＬＴＡＢおよびＣＴＡＣを用いて研究した。１Ｌ当たり２８０ｇの湿重量のＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを含む発酵サンプルを発酵層から除去した。ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢおよびＣＴＡＣの４％（ｗ／ｖ）溶液を、発酵培養液９ｍＬを含むプラスチック管に最終濃度０．２または０．４（ｗ／ｖ）まで添加した。２５℃で２００ＲＰＭでの４８時間のインキュベーションの０、７、１７、２４、および４８時間後に、管を２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、前記のようにＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析した。
【０２０８】
ＬＴＡＢの抽出効果を、細胞内でＨＯＸを産生するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株番号３４９において試験した。発酵培養液のサンプルを６Ｌスケールの発酵（ここで、バイオマス濃度は、１Ｌ当たり約２３２ｇ湿重量であった）から除去した。発酵培養液９ｍＬを、ＬＴＡＢの１０％（ｗ／ｖ）溶液 ０μＬ（コントロール）または１８０μＬと共にプラスチック管に添加した。３０℃で２０ＲＰＭでの２４時間のインキュベーション後に、管を９０００ｇで５分間遠心分離した。上清を前記のようにＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析した。
【０２０９】
（結果９）
ＨＯＸは、０．４％（ｗ／ｖ）の終濃度で発酵サンプルに添加した場合の全ての試験した四級アンモニウム化合物で抽出することができた（表８を参照のこと）。２５℃での２４時間のインキュベーション後、ＬＴＡＢは、ＨＯＸの抽出に関して、他の試験した化合物より優れていた。抽出されたＨＯＸの量は、四級アンモニウム化合物の鎖の長さが増加するにつれ減少するようであった。
【０２１０】
ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢまたはＣＴＡＣを用いたＨＯＸ抽出の時間経過を、表９に示す。インキュベーション時間および抽出試薬濃度の両方が抽出されるＨＯＸ活性の量に影響を与えることが、明らかである。ＬＴＡＢは、分析した全インキュベーション時間において最良の抽出試薬であることが見出され、これは、表８に示す結果と一致する。ＬＴＡＢを用いたＨＯＸの抽出は、０．４％（ｗ／ｖ）の濃度のＬＴＡＢよりも、０．２％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢの濃度においてよりゆっくりとした速度で進行するようである。ＨＯＸ酵素の抽出に関して、０．２％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢの使用と０．４％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢの使用との間にほとんど差異はないようである。
【０２１１】
（表８）
（種々の四級アンモニウム化合物を用いたＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの抽出）
【０２１２】
【表１０】
【０２１３】
抽出試薬の添加前の発酵培地における細胞外ＨＯＸレベルは、２４時間後にＬＴＡＢで抽出したＨＯＸ活性の約９％であった。
a化合物は、全て構造：ＣＨ3−（ＣＨ2）n−Ｎ（ＣＨ3）+3（塩化物または臭化物を対イオンとして有する）である。
b全ての実験を２連で実行した。
cＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの結果を、いずれのＬＴＡＢの添加も伴わないコントロールチューブでの抽出ＨＯＸに対して標準化した。抽出開始前の発酵中の細胞外ＨＯＸレベルは、コントロール（すなわち、いずれのＬＴＡＢの添加も伴わないプラスチックチューブ）中の抽出レベルの約２４％であった。
【０２１４】
（表９）
（ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢ、およびＣＴＡＣを用いたＨＯＸ酵素の抽出の時間経過）
【０２１５】
【表１１】
【０２１６】
抽出試薬の添加前の発酵培地における細胞外ＨＯＸレベルは、４８時間後に０．４％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢで抽出したＨＯＸ活性の約４％であった。値を、±１標準偏差で提供する。ｎ：実験数。
【０２１７】
全ての値を、４８時間後に０．４％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢを用いた抽出レベルに対して標準化する。
【０２１８】
（実験１０）
（ＨＯＸ抽出に関するＣＴＡＢと他の乳化剤との間の比較）
リゾレシチン（リゾホスファチジルクロライド）は、高分子の選択的な放出を伴って少なくとも哺乳動物細胞を透過可能であり得る。リゾレシチンおよび多数の他の乳化剤および短い鎖の脂肪酸の効果を試験するために、ＨＯＸを抽出するこれらの能力を試験してＣＴＡＢと比較した。
【０２１９】
５ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を、１５ｍＬの遠心分離チューブに添加した（ＨＯＸ９９１０Ｂ、３０５ｇ細胞／Ｌ 湿重量、１．６Ｕ／ｍｌ 細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間、遠心分離によって分離した。次いで、細胞を、ＣＴＡＢ、乳化剤ＳＬＬ、ＹＮ、カプリン酸、リゾレシチン、またはレシチンのいずれかを補充した４．０ｍＬ ２５ｍＭクエン酸（ｐＨ６．３）中に再懸濁した。次いで細胞を、２０時間２５℃（５００ｒｐｍ）でインキュベートした。
【０２２０】
（結果１０）
インキュベーション後、無細胞抽出物中のＨＯＸ活性のレベルを、ＨＯＸアッセイによって測定した。表１０に示すデータは、ＣＴＡＢ以外の試験した乳化剤が、非常に低いレベルの活性酵素を放出し得るのみであることを示す。この結果はまた、ＣＴＡＢが、上清中の潜在的な酵素を活性化し得ること（おそらく、膜結合フラグメントから酵素を放出することによる）を示す。
【０２２１】
（表１０）
（ＨＯＸ抽出に対する界面活性剤、乳化剤、およびリン脂質の効果）
【０２２２】
【表１２】
【０２２３】
（実施例１１）
（ＨＯＸの抽出に関するＣＴＡＢとサポニンとの間の比較）
サポニンがジギトニンのように作用するか否かを確認するために、ＨａｎｓｅｎｕｌａからのＨＯＸ酵素の抽出に対するサポニンの効果を試験した。
【０２２４】
実験を、５．０ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を用いて１５ｍＬ遠心分離チューブ中で実行した（ＨＯＸ１９０７９９、３４０ｇ細胞／Ｌ 湿重量、０．５Ｕ／ｍＬ 細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間、遠心分離することによって分離した。次いで、細胞を、ＣＴＡＢもしくははサポニンのいずれかを補充した４．０ｍＬの上清中に再懸濁するか、またはＣＴＡＢもしくはサポニンのいずれかを補充した２５ｍＭ クエン酸（ｐＨ６．３）中に再懸濁した。
【０２２５】
無細胞抽出液（ＣＴＡＢを用いた処理後）中の測定されたＨＯＸ活性が実際に抽出の結果であり、単に上清中のＨＯＸ活性化の結果ではないこと（これは、ＨＯＸは上清中に既に存在するが不活性であることであり得る）を確認するために、無細胞抽出液（ＣＴＡＢまたはサポニンでの補充後）をまた、インキュベートし、そしてＨＯＸ活性について分析した。このチューブを、１９時間２５℃（５００ｒｐｍ）でインキュベートした。インキュベーション後、無細胞抽出物中の細胞外ＨＯＸを、ＨＯＸアッセイによって測定した。
【０２２６】
（結果１１）
表１１の結果は、サポニンがＨＯＸを細胞から抽出するごくわずかな能力を有することを示す。さらに、サポニンによるＨＯＸ活性化の指標も、ＣＴＡＢによるＨＯＸ活性化の指標も、いずれもなかった。
【０２２７】
（表１１）
異なる透過剤を使用することによる比較ＨＯＸ抽出／活性化
試験 ＨＯＸ活性％
コントロール ０（細胞＋上清） １００
０．２％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） １２００
０．４％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ３１００
０．２％ サポニン（細胞＋上清） １５０
０．４％ サポニン（細胞＋上清） １４０
０．８％ サポニン（細胞＋上清） １４０
コントロール １（細胞＋緩衝液） １００
０．２％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ３１００
０．４％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ７７００
０．２％ サポニン（細胞＋上清） ２３０
０．４％ サポニン（細胞＋上清） ２３０
０．８％ サポニン（細胞＋上清） ２３０
上清＋０．２％ ＣＴＡＢ ８０
上清＋０．４％ ＣＴＡＢ ８０
上清＋０．２％ サポニン ８０
上清＋０．４％ サポニン ８０
上清＋０．８％ サポニン ８０
（実施例１２）
（１００Ｌ発酵槽におけるＨＯＸのＣＴＡＢ抽出）
１２０時間の発酵（ＦｅｒｍＩＤ Ｖｅｓｔ９９１０ｂ）の後、ＣＴＡＢ溶液（４０℃の水３．６Ｌに溶解した３６０ｇのＣＴＡＢ）を１００Ｌ発酵槽の入口ポートを介してブロスに直接添加した。活性な発酵物容量が約９０Ｌであったため、発酵ブロス中のＣＴＡＢの最終濃度は、約４ｇ／Ｌであった。
【０２２８】
同時に、撹拌、通気、ｐＨ制御、および栄養物添加をとめた。温度を２５℃に制御し、そして２２時間のＣＴＡＢ処理の後、ブロスのＨＯＸ含量は、１．６Ｕ／ｍＬから３０Ｕ／ｍＬに増加した。
【０２２９】
（実施例１３）
（実験室スケールにおけるＨＯＸ産生Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの均質化）
ＣＴＡＢ処理の結果としてＨＯＸ抽出の効率を試験するために、２つの異なる発酵試験からの細胞を、細胞分裂装置「Ｚ Ｐｌｕｓ」２．２ｋＷ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用することによって分裂させた。細胞（５ｍＬ）をワンショットポンプヘッドを使用して様々な圧力で分裂させた。開始後、この細胞片を遠心分離（１０，０００ｇで５分）によって上清から分離し、そして細胞を含まない上清中の細胞内ＨＯＸレベルを、上記のようなＨＯＸアッセイを使用して測定した。同じ細胞をまた、０．２％ ＣＴＡＢで処理し（２５℃、５００ｒｐｍ、２０時間）、そして細胞を含まない抽出物を比較物質として使用した。
【０２３０】
（結果１３）
表１２に示すデータは、細胞内ＨＯＸの総量が０．２％ ＣＴＡＢでの処理によって抽出されることを示す。
【０２３１】
（表１２）
ＣＴＡＢ処理の有効性
【０２３２】
【表１４】
【０２３３】
*細胞は２５℃で４８時間インキュベートした。
【０２３４】
（実施例１４）
（大スケールにおけるＨＯＸ産生Ｈｏｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの均質化）
ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ高圧ホモジナイザーモデル３０ＣＤで、１０Ｌの発酵ブロス（ＦｅｒｍＩＤ Ｖｅｓｔ９９０７ｂ）をホモジナイズした。ホモジナイザーを最大流速（１００Ｌ／分）で、１０００ｂａｒの圧力によって作動させた。均質化手順の間、このブロスを氷水で冷却し、そして産物の温度は決して２０℃を越えなかった。ＨＯＸ活性の迅速な増加は、初めの３サイクルの間に観察され、続いて５〜７サイクル後にほとんど定常レベルが観察された。
【０２３５】
（結果１４）
この結果を、表１３および図８に示す。
【０２３６】
（表１３）
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの機械抽出）
【０２３７】
【表１５】
【０２３８】
（実施例１５）
（Ｈｏｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの抽出に対するＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の効果）
ＣＴＡＢまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、遠心分離管の５ｍＬの発酵物（サンプル ＨＯＸ９９５４、Ｍｕｔ ４５、１８．１０．９９，ＨＶＰ）に添加した。水をコントロールに添加した。サンプルを、２５℃、２００ｒｐｍで２２時間インキュベートした。インキュベーションの後、これらのサンプルを遠心分離し、そして上清を、上記のようにＨＯＸ活性について分析した。
【０２３９】
（結果１５）
結果を表１４および図９に示す。非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して、酵母細胞を透過化処理し（Ｎａｇｌａｋら、１９９０および米国特許第第５１２４２５６号を参照のこと）たが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００はＣＴＡＢ（これは、当該分野において、細胞内酵素（例えば、ＨＯＸ酵素）を抽出し得ることが記載されていないが、細胞の透過性化を与えることが記載されている）とは逆に抽出効果を有さないことは明らかである。
【０２４０】
（表１４）
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と比較したＣＴＡＢでのＨＯＸ抽出）
【０２４１】
【表１６】
【０２４２】
（実施例１６）
（ウェスタンブロッティング）
ウェスタンブロッティングを用いて、残余（ペレット）のＨＯＸ酵素および放出された（上清の）ＨＯＸ酵素の量を分析することによりＨＯＸ分泌の効力を試験した。細胞を、それぞれ、０％、０．１％、０．２％、および０．４％ＣＴＡＢを用いて処置した。インキュベーションの後、細胞を、４０００ｇで１０分間遠心分離により分離した。得られた上清のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（４−１２％ Ｍｅｓ Ｎｕ−Ｐａｇｅ）は、図１０Ａのレーン７−１０に示される。ペレットを緩衝液を用いて２回洗浄し、次いで、緩衝液中に再懸濁したＦａｓｔＰｒｅｐ細胞崩壊剤において崩壊させた。ペレット抽出物をまた、製造業者の指示書（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）に従って、プレキャストＮｏｖｅｘゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ａ中のレーン２−５を参照のこと）にアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、製造業者の指示書（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）に従って、ニトロセルロース膜にブロットした。このブロットを、ＨＯＸ酵素に対して惹起された抗体（ウサギ抗血清＃４３６４ ＢＩ／ＯＣＨ １９０７９７）（この調製を以下に記載する）と共にインキュベートした。
【０２４３】
（ＨＯＸ特異的抗体の調製）
組換えＨＯＸ酵素をＷＯ９６／４０９３５に記載されるように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、発現プラスミドＰＵＰＯ１８１から産生させた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現組換えＨＯＸの粗抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＨＯＸに対応する６２ｋＤの相対分子量（Ｍｒ）でのプロミネントタンパク質のバンドを、ＷＯ９６／４０９３５に記載されるように、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写させ、そしてＮ−末端アミノ酸配列分析に供した。同定したアミノ酸配列は：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−（配列番号１）であった。この配列は、ＨＯＸについて開示された配列（ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｒｄ，１９９７）中のアミノ酸番号２〜１１に対応した。従って、発現した６２ｋＤタンパク質は、Ｎ−末端アミノ酸のメチオニン（Ｍｅｔ1）を欠く組換えＨＯＸであった。
【０２４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された６２ｋＤのＨＯＸのバンドを、プレパラティブＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製し、そしてＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１９８３）により記載されるようにゲルから電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）した。電気溶出した６２ｋＤのＨＯＸバンドの純度を、上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、そしてアミノ酸配列分析により分析した。精製したＨＯＸを、ウサギにおける抗体産生のために用いた。約５０μｇを、等量の不完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントと混合し、そして免疫に用いた。
【０２４５】
ウサギにおいて産生したＨＯＸ特異的モノクローナル抗体を、ウェスタンブロット分析における本研究を通じて用いた。ウェスタンブロット分析により分析されるタンパク質を、上記のように、電気泳動し、そして標準的手順に従って、ニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を、３％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間ブロックした。１．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００で希釈したＨＯＸ特異的抗体を添加し、そして一晩ブロットした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した後、１．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ中に１：１０００で希釈した二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、ＤＡＫＯ，カタログ番号Ｄ４８７）と共にインキュベーション（１〜２時間）した。このブロットを、引き続いて、ＴＢＳ−Ｔ（２ｘ２０分）およびＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１×５分）中で洗浄した後、標準的な手順に従って、ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）緩衝液中で発色させた。
【０２４６】
抗体の特異性を、それぞれ、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の抽出物を含むＨＯＸを用いる一連のウェスタンブロットにおいて調査した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの抽出物を含むＨＯＸのウェスタンブロット分析は、Ｍｒ６２ｋＤの強力なＨＯＸ特異的バンド、およびより低い分子量の２つまたは３つの弱いバンドを示した。
【０２４７】
（結果１６）
ウェスタンブロットの結果を、図１０Ｂに示す。このウェスタンブロットは、実質的に、ＨＯＸが０．４％ＣＴＡＢを用いる処置の後の細胞に残らないことを確認した。
【０２４８】
（実施例１７）
（細胞内酵素の増加したレベルに対するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）についての記載）
細胞内ＨＯＸ酵素を発現するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株を、２５４ｎｍの波長のＵＶ光を用いて変異させた。変異した菌株を、寒天プレート（Ｇｉｂｃｏからの１．４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ／Ｌグリセロールおよび２％（ｗ／ｖ）寒天）上にプレートし、そしてコロニーが形成されるまで３０℃でインキュベートした。コロニーを、ロボテックコロニーピッカー（ｒｏｂｏｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｃｋｅｒ）（Ｑ−Ｐｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ Ｄｏｒｓｅｔｔ，ＵＫ）を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。各マイクロタイターウェルは、２００μＬ ＹＮＢ培地（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．１、１．４ｇ／Ｌ ＹＮＢ（Ｇｉｂｃｏから）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4および１０ｇ／Ｌグリセロール）を含んだ。マイクロタイタープレートを、ＩＯＣ４００．ＸＸ２．Ｃ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＳＡＮＹＯ Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ ＢＶ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、７日間振盪させて２５℃でインキュベートした。ＨＯＸ活性を、１０５μＬの試薬を含むように改変されたＨＯＸアッセイを用いて１０μＬ発酵ブロスで測定し、そして１５μＬ ０．４％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを、アッセイに加えた。反応時間は、３０℃で６０分であった。ＨＯＸアッセイをＰｌａｔｏ ７ ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ ｒｏｂｏｔ（Ｒｏｓｙｓ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行し、吸収度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＫ）で測定した。それぞれの個々のマイクロタイターウェルにおける増殖を、１０μＬの発酵ブロスを新しいマイクロタイタープレートに移し、１００μＬの１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３を加え、そして６００ｎｍにおける吸収度を測定した。ＨＯＸ測定を、乏しい増殖を考慮に入れるために、６００ｎｍでの吸収度に関して規格化した。
【０２４９】
（結果１７）
この結果は、上昇したレベルの細胞内ＨＯＸ酵素を産生するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの変異についてスクリーニングすることが可能であることを示す。
【０２５０】
（実施例１８）
ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸ（例えば、表１２を参照のこと）および「機械抽出」ＨＯＸ酵素（例えば、表１３および図８を参照のこと）からの比活性の比較。
【０２５１】
（結果１８）
この結果は、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸからの比活性が、「機械抽出」ＨＯＸの比活性よりも高いことを示す。これらの結果は、ＣＴＡＢが、細胞小器官に局在化する細胞内タンパク質のすべてを抽出するわけではないが、主に細胞質ゾルタンパク質を抽出することを示す。
【０２５２】
（実施例１９）
アニオン交換クロマトグラフィーによるＣＴＡＢ抽出ＨＯＸおよび機械抽出ＨＯＸの特徴付け）
ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸの純度を分析するために、これを細胞破壊を使用することによって抽出されたＨＯＸと比較した。比活性を測定し、比較して、そして抽出物の核酸含有量を比較した。さらに、純度をアニオン交換クロマトグラフィーによって調べた。
【０２５３】
７ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を、１５ｍＬの遠心分離チューブ（ＨＯＸ９９５７，Ｍｕｔ ４５）に加えた。０．４％ＣＴＡＢの添加時に、細胞懸濁液を２３時間、３０℃で（２００ｒｐｍ）インキュベートした。細胞を遠心分離（１００００ｇおよび１０分）で除去し、細胞を含まない上清をＣＴＡＢ抽出ＨＯＸの供給源として使用した。別の７ｍＬの同じ細胞懸濁液（ＣＴＡＢを添加しない）を、ワンショットポンプヘッド（Ｚ Ｐｌｕｓ，２．２ｋＷ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）を２×２４００ｂａｒで使用することによって破壊した。次いで、細胞の破片を遠心分離（１００００ｇおよび１０分）によって分離し、そして上清を機械抽出ＨＯＸの供給源として使用した。
【０２５４】
両方のサンプルを２０ｍＭ ＴＥＡ（トリエタノールアミン、Ｍｅｒｃｋ）緩衝液、ｐＨ７．３で、ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）で脱塩した。サンプルをＨＯＸ活性およびタンパク質濃度について分析した（タンパク質アッセイは、Ｓｃｈｌｅｉｆ ａｎｄ Ｗｅｎｓｉｎｋ，１９８１によって記載されるアッセイ方法に基づく）。核酸の含有量は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの測定によって決定した（Ｂｏｌｌａｇ ａｎｄ Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，１９９１）。
【０２５５】
イオン交換クロマトグラフィーを、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）システムを使用することによって行った。５００μｌの脱塩化サンプルを、ＴＥＡ緩衝液（緩衝液Ａ、２０ｍＭ、ｐＨ７．３）で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ Ｑ １５ ｃｏｌｕｍｎ（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）に適用した。ＨＯＸを、１．５ｍＬ／分の流速で、緩衝液Ａ中０−０．５Ｍ ＮａＣｌの２０ｍＬの直線勾配で溶出し、この間、１．５ｍＬの画分が、収集され、そしてＨＯＸ活性についてアッセイされた。
【０２５６】
（結果１９）
比活性の決定は、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸが、機械抽出ＨＯＸと比較してずっとより純粋であることを示す（表１５）。また、この核酸の含有量は、機械抽出ＨＯＸにおけるよりも、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸにおいてずっと低い（表１５）。
【０２５７】
【表１７】
【０２５８】
ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸおよび機械抽出ＨＯＸについてのＳｏｕｒｃｅ Ｑ分析のクロマトグラムを示す図１１Ａおよび１１Ｂにおけるアニオン交換クロマトグラフィー分析はまた、この結果を強く確認する。
【０２５９】
（ＣＴＡＢを用いた実験）
（実施例２０）
（１．振とうフラスコ実験）
２種の異なる培地を、ＣＴＡＢとの実験のために選択した：
・ＹＰ／１％のグリセロール
・ＹＮＢ／１％のグリセロール＋０．１ＭのＮａＰｉ ｐＨ６．０。
【０２６０】
（（ａ）ＹＰ／１％のグリセロール中での培養）
５０ｍＬの培地を、２．５ｍＬのＹＰＤプレ培地を用いてインキュベートし、そして３７℃、１６０ｒｐｍで培養した。培養の２８時間後に、１％（ｖ／ｖ）のメタノールを添加し、そして３７℃、１６ｒｐｍで１８時間さらにインキュベートした。このＯＤ600nmを測定して、必要であるＣＴＡＢの量を計算した。上清（ＳＮ）のアリコートおよび１．５ｍＬの培地の細胞ペレットを取り出した。細胞を機械で破壊した後、可溶なフラクション（ＣＸ）を単離した。
→ これらの状態のＳＮを、Ａと命名した。
【０２６１】
これらの状態のＣＸを、Ｄと命名した。
【０２６２】
これらの培養物の同一の体積（２０ｍＬ）を、２個の振とうフラスコにアリコートした。２０ｍＬの培地に、０．００５ｇのＣＴＡＢを補充した。（ＣＴＡＢ−ストック溶液：０．０２ｇ／ｍＬ；ＤＡＮＩＳＣＯ：０．４％（発酵槽培地中）（ＯＤ600nm〜３００）→振とうフラスコ実験ＯＤ600nm〜２０→０．０２７ｇのＣＴＡＢ／１００ｍＬの培地）培地のインキュベーション：２４時間、４℃（振とう無し）。
→ これらの状態のＳＮを、Ｃと命名した。
【０２６３】
これらの状態のＣＸを、Ｆと命名した。
【０２６４】
ＣＴＡＢを含まない第２の振とうフラスコを、ＣＴＡＢ−フラスコとして同一の条件下でインキュベートし、そして参照培地として利用した。
→ これらの状態のＳＮを、Ｂと命名した。
【０２６５】
これらの状態のＣＸを、Ｅと命名した。
【０２６６】
５種の異なるＩＬ−１ｒａ構築物を有する菌株を培養した。この菌株４−１７、ＡＬ９／２およびＩＩ３−１は、単一の配列を有さない、３種の異なる構築物を含んだが、この菌株ＭＦα２およびＭＦαＡＬ７／１は、ＭＦαプレ−プロ配列を有する、２種の異なる構築物を示した。
【０２６７】
菌株ＦＰＭＴ８を、組換え菌株と同一の条件下で培養した。この菌株をエンプティーＨａｎｓｅｎｕｌａベクターｐＦＰＭＴ１２１のほぼ３０個のコピーに必須のＲＢ１１であり、ネガティブコントロールとして役立つ。
【０２６８】
ＣＴＡＢでの処理後に、４０倍（２０倍）から１１０倍のＩＬ−１ｒａ濃度の増加が、単一配列を有さない構築物を含む、菌株の上清において検出された。ＣＴＡＢで処置したＭＦα−菌株に関して、ＩＬ−１ｒａ濃度のより低い増加（２倍〜５倍）が測定された。
【０２６９】
（結果２０）
これらの結果を、表１６に要約した。
【０２７０】
【表１８】
【０２７１】
表１６：ＹＰ／グリセロール／メタノール中でのＣＴＡＢとの実験
Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中での４６時間の培養後の上清
Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の上清
Ｃ：ＹＰ／グリコール／メタノール中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の滅菌濾過した上清。
＊注釈
菌株ＡＬ９／２の上清中のこのＩＬ−１ｒａ濃度は、通常低かった。第４の実施形態において、０．６と０．７μｇ／ｍＬとの間の濃度が検出された。低い収率の理由は、公知ではない。
【０２７２】
（実施例２１）
（（ｂ）ＹＮＢ／１％のグリセロール＋０．１ＭのＮａＰｉ ｐＨ６．０中での培養）
ＣＴＡＢでのさらなる実験にために、シグナル配列を有さない３種の異なる構築物を含む３種の菌株を、選択した（菌株４−１７；ＡＬ９／２；ＩＩ３−１）。
【０２７３】
４５ｍＬの培地を、５ｍＬのＹＰＤプレ培養で播種し、そして３７℃、１６０ｒｐｍで培養した。２８時間培養した後、１％（ｖ／ｖ）のメタノールを添加し、そして３７℃、１６０ｒｐｍで１８時間さらにインキュベートした。
【０２７４】
このＯＤ600nmを測定して、必要であるＣＴＡＢの量を計算した。上清（ＳＮ）のアリコートおよび３ｍＬの培地の細胞ペレットを取り出した。細胞を機械的に破壊した後、可溶なフラクション（ＣＸ）を単離した。
→ これらの状態のＳＮを、Ａと命名した。
【０２７５】
これらの状態のＣＸを、Ｄと命名した。
【０２７６】
これらの培養物の同一の体積（２０ｍＬ）を、２個の振とうフラスコにアリコートした。２０ｍＬの培地に、０．００３ｇのＣＴＡＢを補充した。培地のインキュベーション：２４時間、４℃（振とう無し）。
→ これらの状態のＳＮを、Ｃと命名した。
【０２７７】
これらの状態のＣＸを、Ｆと命名した。
【０２７８】
ＣＴＡＢを含まない第２の振とうフラスコを、ＣＴＡＢ−フラスコとして同一の条件下でインキュベートし、そして参照培地として利用した。
→ これらの状態のＳＮを、Ｂと命名した。
【０２７９】
これらの状態のＣＸを、Ｅと命名した。
【０２８０】
全ての場合において、ＣＴＡＢでのインキュベーションは、上清のＩＬ−１ｒａ濃度の有意な増加（１００〜１３０倍）に導いた。
【０２８１】
（結果２１）
２種の培地において培養した後の、ＣＴＡＢ実験のＥＬＩＳＡ結果を、以下の表１７において比較する。
【０２８２】
【表１９】
【０２８３】
表１７：ＹＰ／グリセロール／メタノールおよびＹＮＢ／グリコール／メタノール中でのＣＴＡＢでの比較
Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノール）中での４６時間の培養後の上清
Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノール）中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の上清
Ｃ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノール）中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の滅菌濾過した上清。
【０２８４】
（実施例２２）
（異なるインキュベーション条件の試験）
ＹＰ／グリセロール／メタノール中で培養した菌株ＩＩ ３／１（１．ａを参照のこと）について、ＣＴＡＢの添加後に異なるインキュベーション条件を試験した。
条件：
＞２４時間 ＣＴＡＢ；４℃ 振盪なし（「標準的」条件）
＞２４時間 ＣＴＡＢ；４℃ 緩やかに振盪
＞２４時間 ＣＴＡＢ；３７℃ 振盪なし
＞２４時間 ＣＴＡＢ；３７℃ 緩やかに振盪
（結果２２）
上清中のＩＬ−１ｒａの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、表１８に要約する。
【０２８５】
【表２０】
【０２８６】
Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養後の上清
Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養し、次いでＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の上清
Ｃ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養し、次いでＣＴＡＢと共に２４時間インキュベートした後の滅菌濾過上清。
【０２８７】
上清におけるＩＬ−１ｒａの最も高い増加は、振盪なしで３７℃でＣＴＡＢインキュベーション後（７６倍）、および振盪なしで４℃でＣＴＡＢインキュベーション後（４９倍）で測定された。
【０２８８】
最も高いＩＬ−１ｒａの濃度は、３７℃で検出されたが、ＣＴＡＢなしでインキュベートした参照サンプルにおける濃度もまた、増加した（１６倍）。参照サンプルにおける高い濃度は、細胞の溶解によって引き起こされ得る。
＝＞最良の条件：４℃（細胞の溶解を回避するため）振盪なし。
【０２８９】
（実施例２３）
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよびクマシー染色）
振盪フラスコ実験から単離された粗抽出物の上清および可溶性画分を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ゲル：１６％Ｎｏｖｅｘ−ｇｅｌ ＴＧ １ｍｍ；還元条件
コロイド状クマシー染色（ＢＩＯ−ＳＡＦＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏｒａｄ）
サンプル：Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養後の上清
Ｂ：ＣＴＡＢを含まない参照上清
Ｄ：粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈
Ｅ：参照培養物の粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈
Ｆ：ＣＴＡＢ処理後の粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈。
【０２９０】
（結果２３）
（＊ＷＢ３３およびＣｏｏ２）
菌株： ４〜１７ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ １ｒａＩ
Ａｌ ９／２ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ １ｒａＩ＋Ａｌ
ＣＴＡＢ：２４時間インキュベーション；４℃、振盪なし。
【０２９１】
ウエスタンブロット（ＷＢ３３）の結果を、図１２Ａに示す。試験サンプルおよび添加した量を、図１２Ａについての以下の説明文において示す。
【０２９２】
【表２１】
【０２９３】
この結果は、両方の菌株について、ＳＮにおけるＩＬ−１ｒａの増加（レーン４、レーン９）およびＣＸにおける減少（レーン５、レーン１０）が、ＣＴＡＢでの処理後に検出されたことを実証する。
【０２９４】
コロイド状のクマシー（Ｃｏｏ２）ブルー染色を、図１２Ｂに示す。この試験サンプルおよび添加量を、図１２Ｂについての以下の説明文において示す。
【０２９５】
【表２２】
【０２９６】
（＊ＷＢ３４およびＣｏｏ３）
菌株： ＭＦα２ ｐＦＰＭＴ ＭＦα ＩＬ−１ｒａＩ
ＭＦαＡＬ ７／１ｐＦＰＭＴ ＭＦα ＩＬ−１ｒａＩ＋Ａｌ
ＣＴＡＢ：２４時間インキュベーション；４℃、振盪なし。
【０２９７】
ウエスタンブロット（ＷＢ３４）の結果を、図１３Ａに示す。試験サンプルおよび添加した量を、図１３Ａについての以下の説明文において示す。
【０２９８】
【表２３】
【０２９９】
この結果は、ＣＴＡＢでの処理後に、細胞内および分泌されたＩＬ−１ｒａの混合物が、レーン４および９において上清Ｃにおいて検出されたことを示す。
ＭＦα２：細胞内ＩＬ−１ｒａ由来の〜２０ｋＤａおよび３４ｋＤａのさらなるバンド。
【０３００】
ＭＦα７／１： 細胞内ＩＬ−１ｒａ由来の１７ｋＤａ未満のさらなるバンド
増加した１８ｋＤａシグナルの強度
コロイド状クマシー（Ｃｏｏ３）結果を図１３Ｂに示す。
【０３０１】
添加された試験サンプルおよび量を、図１３Ｂに対する以下の説明文に示す。
【０３０２】
【表２４】
【０３０３】
（ＷＢ３５およびＣｏｏ４）
株：ＩＩ３／１ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ−１ｒａ ＩＩ型
ＣＴＡＢの添加後の異なったインキュベーション条件：
２４時間ＣＴＡＢ、４℃、浸透せず（「標準条件」）
２４時間ＣＴＡＢ、３７℃、浸透せず
ウエスタンブロット（ＷＢ３５）結果を図１４Ａに示す。
【０３０４】
添加された試験サンプルおよび量を図１４Ａに対する以下の説明文に示す。
【０３０５】
【表２５】
【０３０６】
コロイド状クマシー（Ｃｏｏ４）結果を図１４Ｂに示す。
【０３０７】
添加された試験サンプルおよび量を、図１４Ｂに対する以下の説明文に示す。
【０３０８】
【表２６】
【０３０９】
４℃および３７℃におけるＣＴＡＢのインキュベーション後、ＳＮにおけるＩＬ−１ｒａの増加（ＷＢ３５：レーン４、レーン８）の増加およびＣＸにおける減少（ＷＢ３５：レーン５、レーン９）が検出されたことを、この結果は実証する。
【０３１０】
ＳＮ ＣＴＡＢ ３７℃（レーン８）において、最も多い量のＩＬ−１ｒａＩＩを得た。この結果は、ＥＬＩＳＡ結果と一致している（表３を参照のこと）。
【０３１１】
この上清において、より多くのＩＬ−１ｒａＩＩだけでなく、より多くの他のタンパク質（３５ｋＤａを超える）が染色された（Ｃｏｏ４：レーン８）。この観察は、４℃と比較して３７℃で有意な細胞溶解が発生するという仮定を確かめた。
【０３１２】
（考察）
Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ ＨＯＸ遺伝子のコドン用法（ＳｔｏｕｇａａｒｄおよびＨａｎｓｅｎ １９９６、ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｄ，１９９７）は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ宿主生物体のより頻繁に使用されたコドンのコドン用法と、低使用コドンとの置換によって改変された。ＨＯＸの発現のためのコドン至適化されたＨＯＸ ＤＮＡフラグメントを含む酵母、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、発現系（Ｒｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｌｄｏｒｆ／ドイツで開発された）の形質転換体を調製した。
【０３１３】
ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子のコドン至適化は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ酵母宿主生物体におけるＨＯＸ酵素の高レベルの発現（高レベルの酵素活性の点から）を生じた。シグナル配列が存在しない場合、ＨＯＸ酵素は、細胞内に局在化される。しかし、多数の異なったシグナル配列が異なった構築物において使用される場合でさえ、少しのＨＯＸ活性が細胞外培地において測定され得たか、または全く活性が測定され得なった。これらの結果は、ＨＯＸ酵素が、シグナル配列を含むＨＯＸ酵素を発現する宿主株からでさえ分泌され得ないことを示す。ウエスタンブロットはまた、シグナル配列が存在する場合でさえ、ＨＯＸ酵素が膜結合画分中に局在化し得ることを確認し、ＨＯＸ遺伝子の転写および翻訳が存在するが、ＨＯＸ酵素は分泌されずそして分泌経路にとどまっているようであることを示す。
【０３１４】
本発明の方法を使用する細胞内酵素学的に活性なＨＯＸ酵素は、他のイオン性／非イオン性界面活性剤および乳化剤を使用して、伝統的な細胞破壊方法および抽出方法と比較された。プロテアーゼおよび塩と界面活性剤との組み合わせがまた、調べられた。
【０３１５】
（要約）
本発明の１つの広範な局面において、目的の可溶性かまたは膜結合細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を放出する方法が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性かまたは膜結合細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；膜抽出組成物と細胞を接触させる工程；およびＰＯＩの放出に十分な条件下でおよび可溶性形態で、ＰＯＩを細胞から放出させる工程を包含する。
【０３１６】
本発明の別の広範な局面において、目的の可溶性かまたは膜結合細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を特異的に放出する工程が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性かまたは膜結合細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；膜抽出組成物と細胞を接触させる工程；およびＰＯＩの放出について十分な条件下で細胞から放出されるが、他の混入したタンパク質の放出に不十分である工程を包含する。
【０３１７】
上記の明細書中で述べられた全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載された方法および系の種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、要求されるような本発明が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。確かに、分子生物学または関連した分野における当業者に明らかである本発明を実施するために記載されたモデルの種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【０３１８】
（参考文献）
【０３１９】
【表２７】
【０３２０】
【０３２１】
本発明は、以下の図面を参照して、例示の目的でのみ説明される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）の放出を補助する膜抽出組成物を使用して、可溶性かまたは膜に結合したＰＯＩを放出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞内ＰＯＩ（例えば、酵素）を回収するための伝統的な方法は、ビーズミルまたはフレンチプレス原理で作動する細胞ホモジナイザーのような、機械的破壊方法（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）を使用することであった。しかし、これらの機械的破壊方法は、これらが低い能力でエネルギーを消費する方法であるという欠点、および機械的破壊のために必要とされる細胞ホモジナイザーまたは類似の設備が、購入に高価であるという欠点に、悩まされている。さらに、機械的方法は、細胞、および従って抽出されたＰＯＩを、非常に厳しい条件に曝露する。特に、大部分のタンパク質は、機械的デバイスおよび／またはホモジネートが効率的に冷却されない限り発生する熱によって、変性するからである。さらに、酵母細胞（例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来の細胞）のようないくつかの細胞は、機械的に破壊することが困難であり、そして細胞ホモジナイザーに１回より多く通過させることを必要とする。細胞ホモジネートはまた、細胞壁フラグメントおよびＤＮＡを含み得、これは、高い粘度を生じる。このことは、ＰＯＩからの細胞の破片の分離が、困難な操作を示し得ることを意味する。さらに、得られる無細胞ホモジネートは、細胞内ＰＯＩのみでなく、一般的な細胞代謝に関連する多数（時々数千）の異なる細胞内タンパク質および酵素をもまた含み得る。このことは、得られる無細胞ホモジネートが、限外濾過によって濃縮することが困難であり得るのみでなく、所定のＰＯＩの正しい市販の濃度を得ることに関する問題を提供し得ることをもまた意味する。
【０００４】
いくつかの機械的破壊方法の潜在的な有害な効果を最小にするために、酵母細胞を透過性にするための、例えば界面活性剤を使用する、化学的方法が開発された。例示として、非イオン性界面活性剤であるポリエトキシ化オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００として市販されている）が、単独でかまたは凍結解凍サイクルとの組み合わせかのいずれかで使用された（Ｎａｇｌａｋら、１９９０で参照される）。さらに、米国特許第５１２４２５６号（Ｃｒａｈａｙら、１９９２）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母を水性培地中で、中性の水溶性無機塩および非イオン性水溶性ポリエトキシ化アルキルフェノール界面活性剤（８と１５との間の親水性親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）（ＨＬＢ）を有する）で処理することによる、この酵母からタンパク質が抽出された方法を開示する。しかし、これらの非イオン性水溶性ポリエトキシ化アルキルフェノール界面活性剤（これには、ポリエトキシ化オクチルフェノール、ノニルフェノールおよびトリブチルフェノール（特に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０およびＳａｐｏｇｅｎａｔ Ｔ−０８０の商品名で市販されているもの）が挙げられる）は、以下の欠点に悩まされる：（ｉ）これらは、単独で使用される場合に有意な抽出効果を有さないかもしれない；および（ｉｉ）これらの界面活性剤は、引き続くＰＯＩの酵素活性の測定を妨害し得る。
【０００５】
いくつかの有機溶媒もまた、インサイチュ酵素アッセイにおいて酵素細胞を透過性にするためと、酵素細胞からタンパク質を除去するためとの両方に、使用されてきた。このような溶媒の例としては、トルエン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、およびグリセロールと混合されたベンゼンが挙げられるが、これらに限定されない（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）。しかし、これらの溶媒は、２００ｍ3までの醗酵槽容量が必要とされる場合に、産業規模での製造における使用に対して魅力的ではない。
【０００６】
ジギトニンおよび天然に存在する他のサポニンもまた、多数の真核生物細胞を透過性にすることが示された（Ｊｏｓｈｉら、１９８９を参照のこと）。ジギトニン透過性化の正確な機構は未知であるが、ジギトニンが、細胞膜に存在するコレステロールと複合体を形成し、そしてその膜を漏出性にすると考えられる。酵母細胞のジギトニン透過性化もまた、酵母膜のエルゴステロールの複合体化に起因し得る。Ｊｏｓｉら（１９８９）は、ジギトニン（０．１％）を使用して、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓを透過性化し、これは、ラクトースのグルコースおよびガラクトースへの細胞内触媒を容易にした。非イオン性界面活性剤であるサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｂａｒｋから）は、別のコレステロール複合体化剤であり、これは、少なくとも哺乳動物細胞を透過性化することが公知である（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）。再度、上で概説したような非イオン性界面活性剤と同様に、ジギトニンおよび天然に存在する他のサポニンの使用は、単独で使用される場合に有意な抽出効果を有さないかもしれないという欠点に悩まされ得る。
【０００７】
カオトロピック剤もまた、細胞内酵素の抽出を容易にするために、使用されてきた。例示として、米国特許第３８０１４６１号（ＭｉｙａｋｅおよびＳｈｉｏｓａｋａ、１９７４）は、尿素溶液のようなカオトロピック溶液を使用して、真菌または細菌の菌糸体または細胞において産生される細胞内酵素を抽出するための、プロセスを開示する。米国特許第４６８３２９３号（Ｃｒａｉｇ、１９８７）はまた、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、臭化リチウム、グアニジン塩酸塩および尿素のような、カオトロピック塩の存在下での細胞溶解による、Ｐｉｃｈｉａ属の形質転換された細胞からの親油性タンパク質の選択的な抽出のための方法を、開示する。しかし、カオトロピック剤は、尿素のようなカオトロピック剤へのＰＯＩの曝露が、ＰＯＩの変性を介して酵素活性の実際の損失を生じ得るという欠点に悩まされる。
【０００８】
上記で引用した欠点に加えて、上記で引用した従来技術は、宿主細胞の低分子量分子への透過性化のみに関連し、一方でＰＯＩは、細胞内で変化しないままである。特に、上記で引用した従来技術のいずれも、ＰＯＩの性質および／または活性に影響を与えない条件下での、膜結合細胞内ＰＯＩの抽出に関連しない。さらに具体的には、上記で引用される従来技術のいずれも、トラップされて宿主細胞から分泌され得ない、膜結合細胞内ＰＯＩの放出を補助するための方法に関しない。
【０００９】
従って、本発明は、従来技術の抽出方法に関連する問題を克服することを追求する。
【００１０】
従って、本発明は、可溶性かまたは膜に結合した、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を、宿主生物から放出するための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、トラップされそして／または宿主細胞から分泌され得ない、可溶性かまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩの放出において、補助するための方法に関する。本発明の方法を使用する、細胞内ＰＯＩの抽出を、従来の細胞破壊方法、ならびに他のイオン性／非イオン性の界面活性剤および乳化剤を使用する抽出手順と、比較した。プロテアーゼおよび塩との界面活性剤の組み合わせもまた、調査した。本発明の結果は、本発明の方法を使用する、可溶性かまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩの抽出が、以下の理由により有利であることを示す：
（ｉ）伝統的な細胞破壊技術が回避され得る；
（ｉｉ）細胞内ＰＯＩがＤＮＡおよび細胞壁フラグメントを含まずに回収され得る；
（ｉｉｉ）細胞内ＰＯＩが、グリコシル化が起こる前に、酵母のような真核生物宿主生物から回収され得る。分泌タンパク質の過剰のグリコシル化は、酵母のような真核生物宿主生物において特に、周知の問題である。酵母発現系に関するこの欠点は、酵母発現ベクターが、多量のバイオマスで高い発現レベルでタンパク質を産生し得、そしてさらに、酵母が食物において認可された用途を有するとしても、酵母を産生系として使用することの嫌悪をもたらした。ＰＯＩを細胞内で発現させ、次いでこのＰＯＩを本発明の方法で抽出することによって、このＰＯＩはグリコシル化されない。なぜなら、このＰＯＩは、グリコシル化が起こる分泌経路を通らなかったからである；
（ｉｖ）本発明の方法を進行させる醗酵手順が、宿主細胞のために適切な任意のｐＨにおいて実施され得る。分泌ＰＯＩがその細胞外培養培地のｐＨによって影響を受け得ることは、当該分野において周知である。現在まで、宿主生物増殖培地のｐＨを、おおよそ中性のｐＨに維持することがしばしば必要であった。なぜなら、このようなｐＨが細菌夾雑の危険性を通常増加させるとしても、このようなｐＨにおける醗酵が、分泌ＰＯＩの安定性を維持するために必要であると考えられたからである。本発明の方法を用いると、ＰＯＩは分泌されない。従って、宿主生物増殖培地のｐＨは、無関係である。なぜなら、培地ｐＨにかかわらず、細胞内ｐＨが一定に保たれるからである。従って、本発明は、より低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）における宿主生物（例えば、酵母）の増殖を可能にし、このことは、バイオマスにもＰＯＩ産生のいずれにも影響を与えることなく、細菌夾雑の危険を低下させる；
（ｖ）本発明の方法を使用して、細胞内ＰＯＩの、細胞外増殖培地との接触を防止し得る。このことは、ＰＯＩが、例えばプロテアーゼ感受性に起因して細胞外培地中において不安定である場合に、有利である。このタンパク質を細胞内で発現させ、次いで本発明の方法を用いて抽出することによって、細胞外培地との接触が回避される。
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
１つの広い局面において、本発明は、細胞から目的のタンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：可溶性であるかまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；この細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにこのＰＯＩを、ＰＯＩの放出に十分な条件下で、かつ可溶性形態で、細胞から放出させる工程。ここで、ＰＯＩは、目的の細胞内タンパク質であり得、そして／またはＰＯＩは、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）であり得る。
【００１３】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１） 細胞から可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法であって、以下の工程：
可溶性または膜結合性の細胞内のＰＯＩを含む細胞を提供する工程；
該細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および
該ＰＯＩの特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＰＯＩを該細胞から放出させる工程、
を包含する、方法。
(項目２） 項目１に記載の方法であって、前記細胞が形質転換された細胞である、方法。
(項目３） 形質転換細胞からＰＯＩを放出させるための項目１または項目２に記載の方法であって、該ＰＯＩがＨＯＸ酵素であり、該方法は、以下の工程：
ＨＯＸ酵素を含む形質転換細胞を提供する工程；
該形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および
該ＨＯＸ酵素の特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＨＯＸ酵素を該形質転換細胞から放出させる工程、
を包含する、方法。
(項目４） 形質転換細胞からＰＯＩを放出させるための方法であって、該ＰＯＩがインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）であり、該方法は、以下の工程：
ＩＬ−１ｒａを含む形質転換細胞を提供する工程；
該形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および
該ＩＬ−１ｒａの特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＩＬ−１ｒａが該形質転換細胞から放出させる工程、
を包含する、方法。
(項目５） 項目１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、酵母細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群より選択され、好ましくは酵母細胞および真菌細胞から選択される、方法。
(項目６） 項目１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞内ＰＯＩが、組換えＤＮＡ技術によって産生される、方法。
(項目７） 項目１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記膜抽出組成物が、四級アンモニウム化合物を含む、方法。
(項目８） 項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記四級アンモニウム化合物が、ラウロイルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＭＴＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、セトリミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ステアロイルトリメチルアンモニウムクロリド（ＳＴＡＣ）、ステアロイルトリメチルアンモニウムブロミド（ＳＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウム（アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）、Ｎ−セチルピリジニウムブロミド（Ｎ−ヘキサデシルピリジニウムブロミド）、Ｎ−セチルピリジニウムクロリド（Ｎ−ヘキサデシルピリジニウムクロリド）、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリドおよびこれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、方法。
(項目９） 項目１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記膜抽出組成物が、約０．０５重量％〜約０．６重量％の前記四級アンモニウム化合物を含み、好ましくは約０．１重量％〜約０．５重量％の前記四級アンモニウム化合物を含み、好ましくは約０．２重量％〜約０．４５重量％の前記四級アンモニウム化合物を含み、より好ましくは約０．４重量％の前記四級アンモニウム化合物を含む、方法。
(項目１０） 項目１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、温度約４℃〜４０℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃、より好ましくは約２５℃で、前記膜抽出組成物と接触される、方法。
(項目１１） 項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、ｐＨ約２．０〜約１１．０（より特には約５．０〜約７．０、より特には約６．３）で、前記膜抽出組成物と接触される、方法。
(項目１２） 上昇したレベルの可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを産生する変異細胞または形質転換細胞についてスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）該変異細胞を３０℃で増殖させる工程；
（ｂ）該変異細胞または形質転換細胞を、項目７または項目８に規定されるような膜抽出組成物とともにインキュベートする工程；
（ｃ）前記細胞フリー培地を回収する工程；
（ｄ）上昇したレベルの該細胞内ＰＯＩについて該細胞フリー培地をスクリーニングする工程；
を包含し、該細胞フリー培地中の該細胞内ＰＯＩの存在が、該細胞内ＰＯＩが放出されたことを示す、方法。
(項目１３） 可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを特異的に放出するために適切な、膜抽出組成物であって、該組成物は、以下の条件：
（ａ）四級アンモニウム化合物の重量パーセンテージ約０．０５％〜約０．６％（より特には約０．１％〜約０．５％、より特には約０．２％〜約０．４５％、より特には約０．４％）；
（ｂ）最適ｐＨ約２．０〜約１１．０（より特には約５．０〜約７．０、より特には約６．３）；
（ｃ）最適温度約４℃〜４０℃（より特には約２０℃〜約３０℃、より特には約２５℃）；
の下で、細胞と接触させられ、混入タンパク質を実質的に含まない細胞内ＰＯＩが得られる、組成物。
(項目１４） 可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを選択的に放出するための、四級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物の使用。
(項目１５） 項目１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＰＯＩがＨＯＸ酵素である、方法。
(項目１６） 項目１５に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントを含む、方法。
(項目１７） 項目１５または項目１６に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントによりコードされる、方法。
(項目１８） 項目１５または項目１６または項目１７に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってか、あるいは該ハイブリダイズし得る配列と相補的な配列によってコードされる、方法。
(項目１９） 項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって生成可能なＨＯＸ酵素であって、該ＨＯＸ酵素は、項目１６〜１８のうちのいずれか１項にて規定されるようなヌクレオチド配列によりコードされ、そして該ヌクレオチド配列は、配列番号２〜２２に示されるようなオリゴヌクレオチドによって合成される、ＨＯＸ酵素。
(項目２０） 項目１またはそれに従属する任意の項目にて規定されるようなＰＯＩであって、該ＰＯＩが、真核生物宿主生物から実質的に非グリコシル化形態で放出される、ＰＯＩ。
(項目２１） 真核生物宿主生物から放出された、実質的に非グリコシル化されたＰＯＩ。
(項目２２） 項目２１に記載の実質的に非グリコシル化されたＰＯＩであって、該ＰＯＩは、項目１〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法によって放出される、ＰＯＩ。
(項目２３） 実質的には、本明細書中および添付の図面を参照して記載されるような、方法および組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、遺伝子構築物を提供する。
【図２Ａ】図２Ａは、遺伝子構築物を提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、写真図を提供する。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、写真図提供する。
【図４】図４は、グラフを提供する。
【図５−１】図５は、配列表を提供する。
【図５−２】図５は、配列表を提供する。
【図６−１】図６は、配列表を提供する。
【図６−２】図６は、配列表を提供する。
【図７】図７Ａ−Ｄは、写真図を提供する。
【図８】図８は、グラフを提供する。
【図９】図９は、グラフを提供する。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１１】図１１Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１２】図１２Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、写真図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な局面）
本発明の１つの局面に従って、可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）を、形質転換細胞から放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性または膜結合性細胞内ＰＯＩを含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；およびＰＯＩの特異的放出およびＰＯＩの可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＰＯＩを放出させる工程、を包含する。
【００１６】
本発明の別の局面に従って、形質転換細胞からＨＯＸ酵素を放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：ＨＯＸ酵素を含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにＨＯＸ酵素の特異的放出およびＨＯＸ酵素の可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＨＯＸ酵素を放出させる工程、を包含する。
【００１７】
本発明の別の局面に従って、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を形質転換細胞から放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：ＩＬ−１ｒａを含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにＩＬ−１ｒａの特異的放出およびＩＬ−１ｒａの可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＩＬ−１ｒａを放出させる工程、を包含する。
【００１８】
本発明の別の局面に従って、上昇したレベルの、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを産生する変異体についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、以下の工程：変異した細胞を３０℃で成長させる工程；この変異した細胞を膜抽出組成物と共にインキュベートする工程；無細胞培地を回収する工程；この無細胞培地を上昇したレベルの細胞内ＰＯＩについてスクリーニングする工程；を包含し、その結果、無細胞培地内の細胞内ＰＯＩの存在が、細胞内ＰＯＩが放出されたことを示す。
【００１９】
本発明の別の局面に従って、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを放出するために適切な膜抽出組成物が提供され、ここでこの組成物は、以下の条件下で細胞と接触される：約０．０５％〜約０．６％（より特に約０．１％〜約０．５％、より特に約０．２％〜約０．４５％、より特に約０．４％）の重量％の４級アンモニウム化合物；および約２．０〜約１１．０（より特に約５．０〜約７．０、より特に約６．３）の最適ｐＨ；約４℃〜約４０℃、（より特に約２０℃〜約３０℃、より特に約２５℃）の最適温度。
【００２０】
本発明の別の局面に従って、可溶性または膜結合性細胞内ＰＯＩの放出に適切な４級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物が提供される。
【００２１】
本発明の別の局面に従って、真核生物宿主生物から放出される実質的にグリコシル化されていないＰＯＩが提供される。
【００２２】
本発明の１つの局面および利点は、添付の特許請求の範囲ならびに以下の説明および議論に提示される。これらの局面は、別々の節の見出しの下に提示される。しかし、各説の見出しの下の教示は、特定の節の見出しに限定される必要はない。
（発明の詳細な説明）
本発明は、４級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物を使用して、伝統的細胞破壊技術の使用にたよらずに、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩの高速、特異的かつ経済的に効率の良い抽出が得られ得るという、非常に驚くべき発見を実証する。有利に、かつ予期されず、得られた細胞抽出物は、非常に少ない混入細胞内ＤＮＡを含有し、そして細胞壁断片を比較的含まず、それにより、ＰＯＩがかけられ得る任意のさらなる精製工程を単純化する。これは、従来技術の機械的抽出方法と対比される。
【００２３】
（細胞内タンパク質）
本明細書中で使用される場合、用語「細胞内」ＰＯＩは、細胞（単数または複数）内または細胞の内側で見出されるＰＯＩを意味する。細胞内ＰＯＩは、シグナル分泌機構を有するが、細胞内に（例えば細胞の細胞質中に）局在化され得る。この点において、細胞内ＰＯＩは、細胞から活発に分泌されないか、またはシグナル配列分泌機構を有していても細胞により分泌されることができないＰＯＩであり得る。あるいは、細胞内ＰＯＩは、細胞からのその分泌を防ぐように操作された、天然に分泌されたＰＯＩであり得る。あるいは、ＰＯＩは、膜結合ドメインを含むキメラタンパク質であり得る。
【００２４】
本発明の方法は、ＡｈｌｓｔｒｏｍおよびＥｄｅｂｏ（（１９９４）ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１９ ７−１２）に記載される方法と対照的であり、これは、テトラデシルベタイナートを用いるＥ．ｃｏｌｉからのペリプラズムβラクタマーゼの放出について報告する。ペリプラズムは、細胞膜と細胞壁との間の細菌細胞中の領域である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のペリプラズムβラクタマーゼは、細胞膜の外側に局在化し、細胞質酵素ではない。対照的に、本発明のＰＯＩは、細胞（単数または複数）内または細胞の内側に見出される細胞内ＰＯＩである。
【００２５】
（膜結合性（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＰＯＩ）
本明細書で使用される場合、用語「膜結合性ＰＯＩ」は、細胞膜または形質膜の近傍に局在化し得るが、実質的に細胞膜または形質膜と結合していなくてもよいＰＯＩを意味する。従って、膜結合性酵素は、実質的に膜結合タンパク質ではなく、膜結合性酵素は、実質的に細胞膜に結合していない。膜結合性ＰＯＩは、細胞ホモジェナイザーを用いる機械的処理により可溶化され得る。
【００２６】
（膜結合（ｂｏｕｎｄ）ＰＯＩ）
本明細書で使用される場合、用語「膜結合ＰＯＩ」は、細胞ホモジェナイザーを茂市イル機械的処理では可溶性にされないタンパク質を意味する。
【００２７】
（特異的放出）
用語「特異的放出」は、ＰＯＩの特異的活性が、ＰＯＩが機械的手段（例えば、ビードミルの使用またはフレンチプレスの原理で操作するセルホモジェナイザーによる）により抽出された場合よりも高いことを意味する。
【００２８】
（形質転換細胞）
用語「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術の使用により形質転換された細胞を含む。形質転換は、代表的には１つ以上のヌクレオチド配列を、形質転換されるべき細胞中に挿入することにより起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に対して天然ではない配列）であり得る。さらに、またあるいは、挿入されたヌクレオチド配列は、相同ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に天然である配列）であり得、その結果、この細胞は、既に細胞中に存在するヌクレオチド配列の１以上の余分のコピーを受容する。
【００２９】
（膜抽出組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「膜抽出組成物」は、細胞膜における成分に影響し得、その結果、膜結合細胞内ＰＯＩおよび／または膜結合性細胞内ＰＯＩが、この膜成分から十分に解離されるかおよび／または放出され、そしてＰＯＩがこの膜抽出組成物から容易に回収されるかおよび／または採取される組成物を意味する。ＰＯＩはまた、可溶性ＰＯＩであり得る。非常に好ましい実施形態において、本発明の膜抽出組成物は、１つ以上の４級アンモニウム化合物またはその組合せを含む。
【００３０】
（四級アンモニウム化合物）
本明細書中で使用する「四級アンモニウム化合物」とは、そのＮＨ４＋イオンの４個の水素原子の全部を有機基（これらは、同一または異なり得る）で置換することにより水酸化アンモニウムまたはアンモニウム塩から誘導できる化合物を意味する。典型的には、これらの有機基の１個は、長鎖（Ｃ８〜Ｃ１８）アルキル基であり、そして他の３個は、短鎖アルキル基または他の基である。
【００３１】
好ましい実施態様では、これらの化合物は、以下の構造を有する：
ＣＨ3−（ＣＨ2）n−Ｎ（ＣＨ3）+3
ここで、ｎは、その鎖内のメチレン基の数であり、ここで、その対イオンは、ハロゲン（例えば、塩素または臭素）イオンであり得る。これらの化合物は、カチオン洗浄剤の特性を有し、強力な抗菌剤である。
【００３２】
これらの四級アンモニウム化合物の例には、ラウロイルトリメチル臭化アンモニウム（ＬＴＡＢ）、ミリスチルトリメチル塩化アンモニウム（ＭＴＡＣ）、セチルトリメチル塩化アンモニウム（ＣＴＡＣ）、セチルトリメチル臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）、セトリミド（またはセトリミダム（Ｃｅｔｒｍｉｄｕｍ）（これは、アルキル臭化アンモニウム（主に、ＣＴＡＢ）の混合物を含有する））、ステアロイルトリメチル塩化アンモニウム（ＳＴＡＣ）、ステアロイルトリメチル臭化アンモニウム（ＳＴＡＢ）、塩化ベンズアルコニウム（塩化アルキルジメチルベンズアルコニウム）、臭化Ｎ−セチルピリジニウム（臭化Ｎ−ヘキサデシルピリジニウム）、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム、およびベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
一例として、これらの化合物の一部の構造は、以下のように図示される。これらの化合物は、メチレン基が多い順に列挙されている：
ＬＴＡＢは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）11−Ｎ（ＣＨ3）3Ｂｒである。
【００３４】
ＭＴＡＣは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）13−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌである。
【００３５】
ＣＴＡＣは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）15−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌである。
【００３６】
ＣＴＡＢは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）15−Ｎ（ＣＨ3）3Ｂｒである。
【００３７】
ＳＴＡＣは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）17−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌである。
【００３８】
ＳＴＡＢは、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＣＨ2）17−Ｎ（ＣＨ3）3Ｂｒである。
【００３９】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、Ｃ21Ｈ38ＮＣｌ）である。ＣＰＣの構造は、以下のように図示される：
【００４０】
【化１】
【００４１】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、臭化セチルピリジニウム（ＣＰＢ、Ｃ21Ｈ38ＮＢｒ）である。ＣＰＢの構造は、以下のように図示される：
【００４２】
【化２】
【００４３】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ、Ｃ23Ｈ42ＮＣｌ）である。ＢＤＴＡＣの構造は、以下のように図示される：
【００４４】
【化３】
【００４５】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウム（ＢＤＨＡＣ、Ｃ25Ｈ46ＮＣｌ）である。ＢＤＨＡＣの構造は、以下のように図示される：
【００４６】
【化４】
【００４７】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化ベンズアルコニウム（塩化アルキルジメチルベンズアルコニウム）である。
【００４８】
塩化ベンズアルコニウムの構造は、以下のように図示される：
Ｃ12Ｈ25Ｎ（ＣＨ3）2Ｃ7Ｈ7Ｃｌ
ＣＴＡＢと塩化ベンズアルコニウム（これはまた、塩化アルキルジメチルベンズアルコニウムとしても知られている−本明細書中では、Ｒｏｄａｌｏｎの登録商標権名で呼ぶ）の構造の比較は、以下のように図示される：
【００４９】
【化５】
【００５０】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ラウロイルテトラメチル臭化アンモニウム（ＬＴＡＢ）である。
【００５１】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、セチルトリメチル塩化アンモニウム（ＣＴＡＣ）である。
【００５２】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、セチルトリメチル臭化アンモニウム（ＣＴＡＢ）である。
【００５３】
カチオン洗浄剤ＣＴＡＢは、おそらく、膜間細孔を形成することにより、イースト菌の浸透性を変えることができることが明らかとなっており、これは、他の２種の非イオン性洗浄剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）について提案された機構と類似している（Ｋｉｎｇら、１９９１）。ＣＴＡＢのような洗浄剤を使用する細胞浸透性の変化は、全細胞での細胞内酵素活性の測定を容易にした（Ｓｅｋｈａｒら、１９９９）。さらに、ＣＴＡＢ浸透化細胞の開発は、例えば、イースト菌株（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｏｗｄａら、１９９１）およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｊｏｓｈｉら、１９８７））に由来の細胞での細胞内酵素触媒作用に有用であることが判明している。これらの研究では、洗浄剤ＣＴＡＢは、細胞内酵素および他のＰＯＩ類を細胞内で未変化のままにしつつ、イースト細胞を低分子量分子（例えば、基質、生成物、補助因子）に対して浸透性にしたことを述べておくことは重要である。本発明とは対照区別して、上記研究のいずれも、ホスト細胞からの溶解性または膜結合した細胞内ＰＯＩの放出を助けるのに、洗浄剤ＣＴＡＢ（または関連した四級アンモニウム化合物（例えば、ＬＴＡＢまたはＣＴＡＣ））が使用され得ることを開示または示唆していない。
【００５４】
カチオン性洗浄剤ＣＴＡＢはまた、通例、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を単離する方法で、使用されている。一例として、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ−ＣＴＡＢ沈殿物が形成され容易に回収されるように、高温（約６５℃）および低塩濃度（０．６Ｍ未満のＮａＣｌ）で細胞をＣＴＡＢで処理することにより、単離され得る。ＣＴＡＢ洗浄剤はまた、エタノールまたはイソプロパノールのいずれかによる中性多糖類の共沈が重大な問題を引き起こし得る場合、植物から核酸を抽出するのに頻繁に使用される。ＣＴＡＢはまた、繊維状ファージで感染したＥ．Ｃｏｌｉ培養物の上澄み液からのＤＮＡの直接的な溶解および沈殿で使用されている（Ｉｓｈａｑら、１９９０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（ｌ）：１９〜２０，２２，２４；Ｋａｍｂｏｕｒｉｓら、１９９９：ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２５（３）：２５５〜６４；Ｋｕｉｐｅｒｓら、１９９９
Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５８（２）：１０３〜８；Ｖｅｌｅｇｒａｋｉら、１９９９ Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ ３７（ｌ） ６９〜７３；Ｗｈｉｔｅら、１９９８ Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ ３６（５）：２９９〜３０３；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、１９９８ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９（３）：２４３−６；Ｍｉｔｏ ａｎｄ Ｄｅｔｓｃｈａｒｔ １９９８ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｒｅｓ ８４（７） ５９６〜７；Ｚｈａｎｇら、１９１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１（ｌ） ４５〜５０；Ｒｅｉｎｅｋｅら、（１９９８） Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７（ｌ） ９５−９を参照）。ＤＮＡ分子を単離するこれらのＣＴＡＢベース方法の全ては、残りのタンパク質および中性多糖類を溶液中で維持しつつ、ＣＴＡＢが核酸および酸多糖類を沈殿する特性を活用することに頼っている。驚くべきことに、また、予想外に、本発明の方法は、この沈殿を促進するだけでなく、細胞内ＤＮＡの保持を促進する。結果的に、本発明の方法は、細胞内ＰＯＬの選択的な放出を促進する。
【００５５】
（放出）
本発明の方法によれば、この溶解性または膜結合した細胞内ＰＯＩは、細胞内ＰＯＩの放出に十分な条件下にてホスト細胞を膜抽出組成物と接触させることにより、この細胞から放出される。
【００５６】
（ＰＯＩを放出するのに十分な好ましい条件）
（Ｉ）四級アンモニウム化合物の％
好ましくは、この膜抽出組成物は、約０．０５重量％〜約０．６重量％の四級アンモニウム化合物、好ましくは、約０．１重量％〜約０．５重量％の四級アンモニウム化合物、好ましくは、約０．２重量％〜約０．４５重量％の四級アンモニウム化合物、さらに好ましくは、約０．４重量％の四級アンモニウム化合物を含有する。
【００５７】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＬＴＡＢである。
【００５８】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＣＴＡＣである。
【００５９】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＣＴＡＢである。
【００６０】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化ベンズアルコニウム（Ｃ１２Ｈ２５Ｎ（ＣＨ２）３Ｃ７Ｈ７Ｃｌ）である。
【００６１】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、Ｃ２１Ｈ３８ＮＣｌ）である。
【００６２】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、臭化セチルピリジニウム（ＣＰＣ、Ｃ２１Ｈ３８ＮＢｒ）である。
【００６３】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ：Ｃ２３Ｈ４２ＮＣｌ）である。
【００６４】
好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ：Ｃ２５Ｈ４６ＮＣｌ）である。
（ＩＩ）温度
好ましくは、このホスト細胞は、約４℃〜約４０℃の温度で、この膜抽出組成物と接触される。
【００６５】
好ましくは、このホスト細胞は、約２０℃〜約３０℃の温度で、この膜抽出組成物と接触される。
【００６６】
好ましくは、このホスト細胞は、約２５℃の温度で、この膜抽出組成物と接触される。
【００６７】
好ましくは、上記温度は、もしＰＯＩが熱安定性ＰＯＬであるなら、さらに高くなる。
（ＩＩＩ）ｐＨ
好ましくは、このホスト細胞は、約２．０〜約１１．０のｐＨで、この膜抽出組成物と接触される。
【００６８】
好ましくは、このホスト細胞は、約５．０〜約７．０のｐＨで、この膜抽出組成物と接触される。
【００６９】
好ましくは、このホスト細胞は、約６．３のｐＨで、この膜抽出組成物と接触される。
【００７０】
本発明の方法に先立つ発酵操作がこのホスト細胞に適当な任意のｐＨで行うことができるは、非常に有利である。分泌されたＰＯＩがその細胞外成長培地のｐＨで影響され得ることは、当該技術分野で周知である。今まで、ホスト有機体成長培地のｐＨを適当な中性ｐＨで維持する必要があった。その理由は、このようなｐＨでの発酵は、通常、細菌汚染の危険を高めたとしても、分泌されたＰＯＩの安定性を維持するのに必要であると思われたからである。本発明の方法を使うと、このＰＯＩは、分泌されない。それゆえ、このホスト有機体成長培地のｐＨは、細胞外ｐＨが培地ｐＨとは無関係に一定のままであるので、無関係である。従って、本発明は、生物量またはＰＯＩ生成のいずれかに影響を与えることにく、細菌汚染の危険を減らす低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）で、ホスト有機体（例えば、イースト菌）の成長を可能にする。
【００７１】
本発明のさらに他の利点は、細胞内ＰＯＩが細胞外成長培地と接触するのを防止するのに使用できることにある。このことは、もし、このＰＯＩが、例えば、プロテアーゼ感受性があるために、この細胞外培地で不安定であるなら、有利である。このタンパク質を細胞内で発現させることに次いで、本発明の方法で抽出することにより、この細胞外培地との接触は、回避される。
【００７２】
（ＰＯＩ回収）
本発明の方法に従って抽出された細胞内ＰＯＩは、そのＰＯＬをさらに濃縮し精製するために、当業者に公知の方法を使用することによりさらに処理される。それゆえ、抽出した細胞内ＰＯＩは、例えば、限外濾過、逆相樹脂への通過に続いて、最小容量の溶媒での溶出、沈殿、限外濾過および凍結乾燥により、濃縮され得る。このＰＯＬをさらに精製するのに利用できる技術には、サイズ排除樹脂を使用するサイズ分別、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換および疎水性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
（ＰＯＩ）
本明細書中で使用する「ＰＯＩ」との用語には、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（これらには、構造タンパク質が挙げられるが、これに限定されない）、酵素、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよび／またはインターロイキン）、インターロイキンレセプタアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ）、抗生物質、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその有効部分（例えば、Ｆｖ断片（この抗体またはその一部は、天然、合成またはヒト化され得る））、ペプチドホルモン、抗原（例えば、細菌／ウイルス／原生動物／寄生抗原）、腫瘍抗原、レセプタ、配位子、制御因子、情報伝達分子、神経伝達物質、凝固因子、または任意の他のタンパク質（これらには、膜結合タンパク質および／または膜結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の方法では、このＰＯＩは、細胞内で発現され、すなわち、それは、細胞内ＰＯＩである。
【００７５】
このＰＯＩは、関心ヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を使用して、組換えＤＮＡ技術により、産生され得る。
【００７６】
（ＮＯＩ）
本明細書中で使用する「ＮＯＩ」との用語は、合成起源および天然起源の両方のＤＮＡおよびＲＮＡを包含するように規定され、これらのＤＮＡまたはＲＮＡは、変性または未変性のデオキシ−またはジデオキシ−ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似物を含有し得る。この核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ共重合体として存在し得、ここで、「共重合体」との用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有する単一の核酸鎖を意味する。このＮＯＩは、発現をさらに高めるために最適化されたコドンでさえあり得る。
【００７７】
（合成）
本明細書中で使用する「合成」との用語は、インビトロ化学合成または酵素合成により生成したものとして規定される。それには、ホスト有機体（例えば、メチロトローフイースト菌であるＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）に最適なコドン用法で製造したＮＯＩ類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
（構築物）
このＮＯＩは、目的の宿主細胞において活性である、転写および翻訳の調節エレメントに対して作動可能に連結され得る。このＮＯＩはまた、たとえば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ由来のグルコアミラーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子接合型遺伝子、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＴＡＫＡ−アミラーゼに由来するもののような、シグナル配列を含む融合タンパク質をコードし得る。あるいは、このＮＯＩは、膜結合ドメインを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００７９】
（発現ベクター）
このＮＯＩは、発現ベクターを用いて宿主生物において所望のレベルで発現され得る。
【００８０】
本発明に従うＮＯＩを含む発現ベクターは、選択された宿主生物におけるＮＯＩをコードする遺伝子を発現し得る任意のベクターであり得、そしてベクターの選択は、それが導入されるべき宿主細胞に依存する。従って、そのベクターは、自律複製ベクター、すなわち、エピソーム存在物として存在するベクター（このベクターの複製は、染色体複製とは独立しており、たとえば、プラスミド、バクテリオファージまたはエピソームエレメント、ミニ染色体または人工染色体など）であり得る。あるいは、本発明に従うベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして染色体とともに複製されるものである。
【００８１】
（発現ベクターの成分）
発現ベクターは代表的に、クローニングベクターの成分（たとえば、選択された宿主生物においてベクターの自律複製を許容するエレメントおよび選択目的で１つ以上の表現型で検出可能なマーカーを含む。発現ベクターは、通常、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび必要に応じてリプレッサー遺伝子または１つ以上のアクチベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。さらに、この発現ベクターは、ＰＯＩを宿主細胞オルガネラ（たとえば、ペルオキシソーム）または特定の宿主細胞区画へと標的かし得るアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。そのような標的化配列としては、配列ＳＫＬが挙げられるがそれに限定されない。本発明の状況において、用語「発現シグナル」とは、上記制御配列、リプレッサー配列またはアクチベーター配列のいずれかを包含する。制御配列の指示のもとでの発現のために、ＰＯＩをコードするＮＯＩは、発現に関して適切な様式で制御配列と作動可能に連結される。
【００８２】
（プロモーター）
ベクターにおいて、ＰＯＩをコードするＮＯＩは、適切なプロモータ配列と作動可能にあわせられる。このプロモーターは、選択した宿主細胞における転写活性を有する任意のＤＮＡ配列であり得、そしてその宿主生物と同種または異種である遺伝子に由来し得る。
【００８３】
（細菌プロモーター）
細菌宿主における本発明の改変されたヌクレオチド配列の転写を指向するための適切なプロモーターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢの遺伝子のプロモーター、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のプロモーターに由来するプロモーター（ｐ１７０プロモーターを含む）が挙げられる。本発明のＰＯＩをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌種において発現され、適切なプロモーターは、たとえば、Ｔ７プロモーターおよびファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択され得る。
【００８４】
（真菌プロモーター）
真菌種における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性αアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼに由来するプロモーターである。
【００８５】
（酵母プロモーター）
酵母種における発現のために適切なプロモーターの例は、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＧａｌ １プロモーターおよびＧａｌ １０プロモーターならびにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーター。
【００８６】
（宿主生物）
（Ｉ：細菌宿主生物）
適切な細菌宿主生物の例は、グラム陽性細菌種（たとえば、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ），乳酸細菌種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（たとえば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉを含む）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ））である。あるいは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅに属するグラム陰性細菌種は、宿主生物として選択され得る。
【００８７】
（ＩＩ：酵母宿主生物）
適切な酵母宿主生物は、以下のような酵母種などであるがそれらに限定されない生物工学的に関連する酵母から選択され得る：Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ種またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む）またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅに属する種（たとえば、Ｓ．Ｐｏｍｂｅ種など）。
【００８８】
好ましくは、メチル栄養性酵母種であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの株が宿主生物として使用される。
【００８９】
好ましくは、宿主生物は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種である。
【００９０】
グリコシル化が起こる前に、本発明の方法を使用することは、酵母のような真核生物宿主細胞から細胞内ＰＯＩを回収するために非常に有利である。分泌されたタンパク質のオリゴグリコシル化は、酵母のような真核生物宿主生物において特に周知の問題である。酵母発現系に関連するこの欠点は、酵母発現ベクターが、大量のバイオマスの高レベルの発現を行い、そしてさらに、酵母は、食品における使用が承認されているにもかかわらず、生産系として酵母を使用することをためらわせている。本発明の方法を用いてＰＯＩを細胞内で発現させ、そしてそのＰＯＩを抽出することによって、そのＰＯＩは、グリコシル化されない。なぜなら、ＰＯＩは、グリコシル化部位が行われる分泌経路を通らないからである。
【００９１】
（ＩＩＩ．真菌宿主生物）
糸状真菌のなかで適切な宿主生物としては、以下のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種が挙げられる：たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ。あるいは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種の株（たとえば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種の株（たとえば、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）は、宿主生物として使用され得る。他の適切な株としては、ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓおよびＭｕｃｏｒ種が挙げられる。
【００９２】
（大規模適用）
本発明の好ましい実施形態において、ＰＯＩは、大規模適用のために使用される。
【００９３】
好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、１ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。
【００９４】
好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、１００ｍｇ／Ｌから約９００ｍｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。
【００９５】
好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、２５０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。
【００９６】
（食品適用）
１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、飲料のような食品の製造において使用するためにＰＯＩを放出するために用いられる。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、界面活性剤の調製において使用するためにＰＯＩを放出するために用いられる。
【００９８】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、製パンにおいて使用するために使用するために適切なＰＯＩを放出するために用いられる。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、生地改善剤において使用するために適切なＰＯＩを放出するために用いられる。
【０１００】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、粉生地、粉生地改善組成物および改善された食品の特性を改善するためにＰＯＩを放出するために用いられる（以下を参照のこと：ＷＯ ９６／３９８５１およびＥＰ−Ｂ−０ ８３３ ５６３）。
【０１０１】
好ましい実施形態において、放出されたＰＯＩは、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2オキシドレダクターゼ、 ＥＣ １．１．３．５）である。
【０１０２】
（ＨＯＸ酵素）
ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）（これはまた、ＨＯＸとも称する）は、Ｄ−グルコースおよび他のいくつかの還元糖（マルトース、ラクトースおよびセロビオースを含む）を、それらの対応するラクトンへと酸化し得、その後、これを加水分解してそれぞれのアルドービオン酸（ａｌｄｏｂｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）へと変換し得る。従って、ＨＯＸは、別のオキシドレダクターゼであるグルコースオキシダーゼ（これは、Ｄ−グルコースのみを変換し得る）とは、その酵素がより広い範囲の糖基質を利用し得るという点において異なる。ＨＯＸによって触媒される酸化は、以下に例示され得る：
Ｄ−グルコース＋Ｏ2−−−−−＞γ−Ｄ−グルクノラクトン＋Ｈ2Ｏ2、または
Ｄ−ガラクトース＋Ｏ2−−−−＞γ−Ｄ−ガラクトノラクトン＋Ｈ2Ｏ2。
【０１０３】
ＨＯＸは、いくつかの海草種により天然で生産される。そのような種は、とりわけ、Ｇｉｇａｒｔｉｎａｃｅａｅ科において見出される。本命最初において使用される用語「ＨＯＸ」とは、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、マルトース、ラクトースおよびセロビオースからなる群より選択される基質を酸化し得る酵素をいう。
【０１０４】
（ＨＯＸ産生）
ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子は、海草Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓからクローニングされた（Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ １９９６，Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｏｕｇａａｒｄ，１９９７）。メチル栄養性酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（異種タンパク質のための発現系としてＲｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ／Ｇｅｒｍａｎｙで開発）もまた、ＨＯＸ酵素（天然のタンパク質は、海草から精製された（Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｈｓｔｒｕｐ，１９９８））を生産するために用いられてきた。ＷＯ ９６／４０９３５およびＷＯ ９８／１３４７８もっまた、ＨＯＸ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組み換え宿主生物におけるクローニングおよび発現を開示する。
【０１０５】
１つの好ましい実施形態において、ＨＯＸ酵素は、配列番号２２において示される配列を含む。
【０１０６】
１つの好ましい実施形態において、ＨＯＸ酵素は、配列番号２２において示される配列、またはその改変体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを包含する。
【０１０７】
（改変体／ホモログ／誘導体（アミノ酸配列））
本発明の好ましいアミノ酸配列は、配列番号２２に示される。か、または本発明のＨＯＸ酵素から入手可能な配列であるが、任意の供給源（例えば、関連するウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチドならびにそれらの改変体または誘導体）から得られたホモログ配列を包含する。
【０１０８】
従って、本発明は、本命最初において提示されるアミノ酸配列の改変体、ホモログまたは誘導体、ならびにそれらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の改変体、ホモログまたは誘導体を包含する。
【０１０９】
本発明の文脈において、ホモログ配列は、少なくとも、例えば、本明細書において列挙される配列の配列番号２２において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５、８５、９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を包含すると解釈される。特に、相同性は、代表的に、必須ではない隣接する配列ではなく、酵素活性について必須であることが知られる配列のそれらの領域に関して考慮されるべきである。これらの領域としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＳＧＧＨ79Ｃ、ＬＧＧＨ146ｌおよびＬＧＧＨ320ＡのようなＨＯＸにおけるＦＡＤ推定結合ドメイン。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学特性／官能基を有するアミノ酸残基）に関して考慮され得るが、本発明の文脈において、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１１０】
相同性比較は、目またはより通常には、利用可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間の相同性％を算出し得る。
【０１１１】
％相同性は、連続配列にわたって算出され得る（すなわち、１つの配列は、他の配列と整列され、そして一方の配列におけるのおののアミノ酸は、他の配列における対応するアミノ酸と、１回に１残基ごと直接比較される）。これは、「ギャップされた」配列と呼ばれる。代表的には、そのようなギャップのない整列は、比較的短い数の残基にわたってのみ行われる。
【０１１２】
このことは、非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一の対の配列において、１つの挿入または欠失が、次のアミノ酸残基が整列から追い出され、従って、全体の整列が行われるとき、相同性％における大きな減少を潜在的に生じ得ることを考慮していない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、相同性全体のスコアを不当にペナルティ付与せずに、可能な挿入および欠失を考慮する最適な整列を生成するように設計される。このことは、局所的相同性を最大限にするように試みる配列整列において「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１１３】
しかし、これらのより複雑な方法は、整列において生じるおのおののギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当て、その結果、同じ数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを伴う配列整列（すなわち、比較される２つの配列の間の最大限の関連性を反映する）は、多くのギャップを用いて１を超える高いスコアを達成する。「アフィンギャップコスト」が代表的に使用される。これは、ギャップの存在について比較的高いコストを、およびギャップにおけるおのおのの次の残基についてのより少ないペナルティーを付与する。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然、より少ないギャップを伴う、最適化された整列を生じる。ほとんどの整列プログラムは、そのギャップペナルティーが改変されることを可能にする。しかし、配列比較のためのそのようなソフトウェアを使用するときは、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（以下を参照）を用いるとき、アミノ酸配列のためのそのデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについて−１２であり、そして各々の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）について−４である。
【０１１４】
従って、最大％相同性の算出は、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最適の整列の生成を必要とする。そのような整列を行うための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を行い得る他のソフトウェアの例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＢＬＡＳＴ ｐａｃｋａｇｅ（以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツールスイート。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインおよびオンラインの検索について利用可能である（以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 同上，７−５８〜７−６０頁）。しかし、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【０１１５】
最終的な％相同性は、同一性の観点で測定され得るが、その整列プロセス自体は、代表的には、オールオアナッシングの対比較に基づかない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいて各々対での比較に対してスコアを割り当てる、スケール調節した類似性スコア行列が一般的に使用される。一般的に使用されるそのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートについてのデフォルト行列）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的に、公のデフォルト値または供給される場合カスタムのシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージのための公のデフォルト値あるいは、他のソフトウェアの場合、デフォルト行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用することが好ましい。
【０１１６】
一旦ソフトウェアが最適整列を生成すると、％相同性、好ましくは＄配列同一性を算出することが可能である。このソフトウェアは、代表的には、その配列比較の部分としてこのことを行い、数的な結果を生成する。
【０１１７】
本発明のアミノ酸配列に関して、用語「改変体」または「誘導体」は、得られるアミノ酸配列が、酵素活性を有し、好ましくは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくともひとつの同じ酵素活性を有する限り、その配列からまたはそれに対して、１（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失、または付加を包含する。
【０１１８】
配列番号２２は、本発明における使用のために改変され得る。代表的には、配列の酵素活性を維持する改変が行われる。アミノ酸置換は、改変された配列が要求される酵素活性を保持する限り、例えば、１、２または３〜１０または２０の置換がなされ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を包含し得る。
【０１１９】
本発明の配列番号２２はまた、サイレントな変化を生成し、そして機能的に等価な酵素を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。故意のアミノ酸置換は、ＨＯＸ酵素の酵素活性が保持される限り、その残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の特性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；および荷電されておらず、極性基を有志、類似の親水性値を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０１２０】
保存的な置換は、例えば、以下の表に従って作成され得る。第二列における同じブロックにおけるアミノ酸、および好ましくは第三列における同じ線上のアミノ酸は、互いに置換され得る。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
（改変体／ホモログ／誘導体（ヌクレオチド配列））
当業者は、遺伝コードの縮重性の結果、多数の異なるヌクレオチド配列が同じＨＯＸ酵素をコードし得ることを理解する。さらに、当業者は、慣用技術を用いて、本発明のＨＯＸ酵素が発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映させるように、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるＨＯＸ酵素に影響させずにぬくれ土地度配列を行い得ることが理解されるべきである。
【０１２３】
本発明の配列番号２２において示されるヌクレオチド配列に関して用語「改変体」、「ホモログ」または「誘導体」には、酵素活性を有し、好ましくは配列表の配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と同じ活性を少なくとも有する、ＨＯＸ酵素をコードする得られたヌクレオチド配列を提供する配列からまたはそれに対して、任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失または付加を包含する。
【０１２４】
配列相同性に関して上記のように、本明細書における配列表に示される配列に対して、好ましくは、少なくとも７５％の、より好ましくは８５％の、より好ましくは９０％の、相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％の、より好ましくは９８％の、相同性が存在する。ヌクレオチド相同性比較は、上記に記載されるように行われ得る。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。 デフォルトスコアリングマトリクスは、各々の同一ヌクレオチドについて１０のマッチ値を有志、ミスマッチについて−９を有する。デフォルトギャップ作成ペナルティーは、−５０であり、そしてそのデフォルトギャップ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティーは、各々のヌクレオチドについて−３である。
【０１２５】
本発明はまた、本明細書に置いて提示される配列に選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の改変対、フラグメントもしくは誘導体、あるいは上記のいずれかに対する相補体を包含する。ヌクレオチド配列は好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長である。
【０１２６】
（ハイブリダイゼーション）
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対合を通じて相補鎖と結合するプロセス、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われるような増幅プロセスを包含する。
【０１２７】
本発明のヌクレオチド配列は、本明細書ににおいて提示されるヌクレオチド配列またはその相補体に対して選択的にハイブリダイズし得、本明細書において提示された対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５もしくは３０、例えば、少なくとも４０、６０もしくは１００またはそれを超える連続するヌクレオチドにわたって、一般的に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５もしくは９０％、および依り好ましくは少なくとも９５％もしくは９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列に対して相同な領域を含み、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列に対して、好ましくは８０または９０％相同であり、そして依り好ましくは少なくとも９５％相同である。
【０１２８】
用語「選択的にハイブリダイズ可能」とは、プローブとして使用されるヌクレオチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドを超えて有意なレベルでプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が存在する（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーがスクリーニングされる場合）。この事象において、バックグラウンドは、プローブとそのライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成されるシグナルのレベルを意味する。このレベルは、標的ＤＮＡで観察された特異的相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の強度である。相互作用の強度は、例えば、32Ｐを用いて、プローブを例えば放射標識することによって、測定され得る。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、そして以下に説明するような規定された「ストリンジェンシー」を与える。
【０１３０】
最大のストリンジェンシーは代表的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じ；高度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約５℃から１０℃下で商事；中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約１０℃〜２０度下で生じ；そして低ストリンジェンシーは、Ｔｍの約２０℃〜２５℃で生じる。
【０１３１】
当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得るが、中程度（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いられ得る。
【０１３２】
好ましい局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５ Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）である。本発明のヌクレオチド配列が、二本鎖である場合、その二重鎖の両方の鎖は、個々または組み合わせてかのいずれかで、本発明により包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖のとき、そのヌクレオチド配列の相補鎖もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解されるべきである。
【０１３３】
本発明の配列に対して１００％相同ではないが、本発明の範囲内に入るヌクレオチド配列は、多数の方法で入手することができる。本明細書において記載される他の改変体は、ある範囲の供給源から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブ検査することによって例えば得られ得る。さらに、他のウイルス／細菌、または細胞ホモログ（特に、哺乳動物細胞（たとえば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）から見出された細胞ホモログ）が得られ得、そしてそのようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、本明細書におけるは入れうｔ表に示される配列に選択的にハイブリダイズし得る。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはそれからのゲノムＤＮＡライブラリーをプローブ検査すること、およびそのようなライブラリーを、配列番号２２に示すヌクレオチド配列のすべてまたは部分を含むプローブで、中程度から高度のストリンジェンシーの条件下でプローブ検査することによって得られ得る。類似の考慮条件は、本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチドの配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。改変体および株／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の標的配列に対して設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得られ得る。
【０１３４】
保存された配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログからのアミノ酸配列を整列することによって予測され得る。配列整列は、当該分野において耕地のコンピュータソフトウェアを用いて行われ得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムは、広汎に使用されている。縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして公知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用されるものよりも低いストリンジェント条件下で使用される。
【０１３５】
あるいは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴付けられた配列（例えば、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列）の部位特異的変異誘発によって得られ得る。このことは、そのヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞にとってコドン優先度を最適化するための配列にとって必要である。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされるＨＯＸ酵素の酵素活性を変更するために所望され得る。
【０１３６】
本発明のヌクレオチド配列は、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射標識または非放射方式を用いて従来の手段により表示標識によって標識されている）を生成するために用いられ得、あるいはそのヌクレオチド配列は、ベクター中にクローニングされ得る。そのようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０のヌクレオチド長であり、そしてまた、本明細書において使用される本発明の用語ヌクレオチド配列によって包含される。
【０１３７】
本発明に従ったヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）およびプローブは、組み換え的に、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段で生成され得る。これらはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。
【０１３８】
一般に、プライマーは、合成的手段によって生成され得、これには、一度に１ヌクレオチドという所望の核酸配列の段階的製造が包含される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当該分野において容易に利用可能である。
【０１３９】
より長いヌクレオチド配列は、一般的に、組み換え手段（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術）を用いて生産される。これは、クローニングすることが所望される標的配列の領域に隣接する、一対のプライマー（例えば、１５〜３０ヌクレオチド長）を作製する工程、そのプライマーを、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに接触させる工程、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を所望の領域の増幅をもたらす条件下で行う工程、増幅したフラグメントを例えば、アガロースゲルにおいて反応混合物を精製することによる）およびその増幅したＤＮＡを回収する工程を包含する。このプライマーは、増幅したＤＮＡが適切なクローニングベクター中にクローニングされ得るように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
【０１４０】
遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用してＨＯＸ酵素をクローニングおよび発現し得る。当業者に明らかなように、天然に存在しないコドンを含むＨＯＸ酵素コードヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。特定の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７−５０８）が選択され得、例えば、これにより、ＨＯＸ酵素発現率を増加させ得、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生産される転写物より長い半減期）を有する組み換えＤＮＡ転写物を生産し得る。
【０１４１】
（スクリーニング）
本発明の方法は、変異した宿主細胞生物における細胞内ＰＯＩのレベル上昇についてスクリーニングするために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて使用される細胞は、固体支持体または固体基材に固定され得る（例えば、プラスチックピンまたは他のいくらかの表面）。その細胞は、本発明の膜抽出組成物に接触され得、そして放出されたＰＯＩレベルは、当該分野において公知の方法を用いて測定され得る。
【０１４２】
（高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ））
本発明の方法は、高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）系において使用され得る。ここで、標的細胞は、マイクロタイタープレート（１００００変異体／日）でロボットにより増殖およびスクリーニングされる。例示の目的で、新たな組み換え生産株を作製する場合、生産性を増加するために伝統的な変異誘発を１回または数回行うことが通常必要である。これは、変異された細胞のＨＴＳを用いて最も効率的に行われる。
【０１４３】
本発明の方法は、非常に有利である。なぜなら、これは、細胞内ＰＯＩのレベルの増加を高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）に可能とするからである。これまでは、これらの系は、分泌されたＰＯＩのより高いレベルについてスクリーニングのみを行うことができた。
【０１４４】
（実施例節および図面への導入）
わずかにより詳細には、
図１は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉａにおけるＨＯＸ産生のための発現ベクターの物理的マップを提供する。任意のシグナル配列に融合された合成ＨＯＸ遺伝子のコード領域を有する、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ平滑フラグメントを、標準的なＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクターの多重クローニング部位中にクローニングした。この発現ベクターは、蟻酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）遺伝子のプロモーターおよびメタノールオキシダーゼ遺伝子のターミネーター（ＭＯＸ−Ｔ）を、フラグメント部位についての複数クローニング部位によって分離されて、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増殖および選択のためのｏｒｉおよびｂｌａ（ａｍｐＲ）、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける複製のためのＡＲＳ（ＨＡＲＳ）配列、選択のためのＵＲＡ３遺伝子を包含する。
【０１４５】
図２Ａは、１．４ｋｂの純正のＦＭＤ遺伝子（上スキーム）およびクローニングされた異種ＤＮＡを有するＦＭＤプロモーター（下スキーム）の図を示す。制限部位は、Ａｓｐ７１８、ＮｃｏＩである。
【０１４６】
図２Ｂは、組み込まれた遺伝子の遺伝子コピーを示す。レーン１−１２は、異なる組み換え単離体およびその対応するＤＮＡ希釈を示す。レーン１３は、形質転換されていない宿主株を示し、そしてレーン１４は、サイズマーカー（Ｍ）を示す。
【０１４７】
図３Ａおよび３Ｂは、ＨＯＸ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。図３Ａは、変異誘発した株ＤＫ８−２７ＫａｎＩＩ３−ｍｕｔ２５のグリセロール醗酵からの培養物濾液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。レーン１は、マーカータンパク質を示す。レーン２は、ＨＯＸ標準（０．０３Ｕ／ｍｌ；１８μｌ）を示す。レーン３は、プローブ３（１８μｌ）からの上清を示す。レーン４は、プローブ４（１８μｌ）からの上清を示す。レーン５は、プローブ５（１８μｌ）からの上清を示す。レーン６は、プローブ６（１８μｌ）からの上清を示す。レーン７は、プローブ７（１８μｌ）からの上清を示す。レーン８は、プローブ８（１８μｌ）からの上清を示す。レーン９は、プローブ９（１８μｌ）からの上清を示す。レーン１０は、プローブ１０（１８μｌ）からの上清を示す。レーン７は、プローブ７（１８μｌ）からの上清を示す。
【０１４８】
図３Ｂは、ＨＯＸを発現する組み換え株のウェスタンブロット分析を提供する。レーンに適用されたサンプルは、図３Ａについてと同様である。膜は、ポリクローナルＨＯＸ抗体でプローブ検査した。
【０１４９】
図４は、分泌株ＤＫ８−２７ＫａｎＩＩ３−ｍｕｔ２５の１０リットルの醗酵培養物の増殖および生産性を示す。この醗酵は、２５℃およびｐＨ５．０で、グリセロールおよびｐＯ2制御のもとで行った。
【０１５０】
図５は、コドン最適化を伴うＨＯＸ遺伝子を合成するために使用される個々のオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５１】
図６は、合成ＨＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を提供する。
【０１５２】
図７Ａ−７Ｄは、免疫蛍光により決定されるようなＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおけるＨＯＸ酵素の局在化を示す。ＨＯＸ酵素（緑色シグナル）の局在化の、核局在（青色シグナル）との重ね合わせを示す。以下を参照：Ａ）ＨＯＸ遺伝子なしのＲＢ １１ 株、Ｂ）ＤＫ８−２７、Ｃ）ＤＫ８−２７ ｍｕｔ２５、Ｄ）ＤＫ２ＩＩ−Ｉ。
【０１５３】
図８は、細胞ホモジナイザーを通じたサイクルの数の関数としてのＨＯＸ活性を示すグラフを提供する。
【０１５４】
図９は、ＣＴＡＢおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の異なる濃度で抽出されたＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞を示すグラフを提供する。
【０１５５】
図１０Ａは、ＣＴＡＢ処理後の細胞上清（レーン７−１０）およびペレット（レーン２−５）におけるにおけるＨＯＸ酵素レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＨＯＸ酵素は、機械的抽出によりペレットから放出された。そのサンプルは、ＭＥＳ，Ｎｏｖｅｘからの４−１２％ＮｕＰＡＧＥゲルの上で分析し、そして１０μｌのサンプルを以下の順で各々のレーンにロードした：レーン２−５：細胞ペレットにおける残りのＨＯＸ；レーン７−１０：上清における放出されたＨＯＸ；レーン１および６：Ｎｏｖｅｘ Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ標準物；レーン２：コントロール；レーン３：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン４：０．２％ＣＴＡＢ；レーン５：０．４％ＣＴＡＢ；レーン７：コントロール；レーン８：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン９：０．２％ ＣＴＡＢおよびレーン１０：０．４％ ＣＴＡＢ。
【０１５６】
図１０Ｂは、細胞上清（レーン７−１０）およびペレット（レーン２−５）におけるＨＯＸ酵素レベルのウェスタンブロット分析を示す。ＨＯＸ酵素は、機械的抽出によりペレットから放出された。このサンプルを、ＭＥＳ，Ｎｏｖｅｘからの４−１２％ ＮｕＰＡＧＥゲルにおいて分析し、そして５μｌのサンプルを各々のレーンに以下の順序でロードした：レーン１ および６：Ｎｏｖｅｘ Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ 標準物，レーン２：コントロール，レーン３：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン４：０．２％ ＣＴＡＢ；レーン５：０．４％ ＣＴＡＢ；レーン７：コントロール，レーン８：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン９：０．２％ ＣＴＡＢおよびレーン１０：０．４％ ＣＴＡＢ。
【０１５７】
図１１Ａは、ＣＴＡＢ抽出されたＨＯＸについての溶出プロファイルを示す。
【０１５８】
図１１Ｂは、機械的に抽出されたＨＯＸについての溶出プロファイルを示す。
【０１５９】
（実施例）
（材料および方法）
（化学物質）
使用したすべての化学物質は、分析試薬等級のものであった。レシチン（３−ｓｎ−ホスファチジルコリン）は、Ｓｔｅｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からＳｔｅｒｎｐｕｒ ＰＭとして市販されている。プロナーゼＥ（エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼの混合物についての専用名称であって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ から得られ、実質的に任意のタンパク質を加水分解してほとんど完全にアミノ酸を遊離させ得るもの）。リゾレシチン（リゾホスファチジルコリン）、Ｄ−グルコース、ｏ−ジアニシジン、ペルオキシダーゼ（Ｐ−８１２５）、カプロン酸（デカン酸）、サポニン（植物において広く分布するグリコシドの大群のいずれかのメンバーであって、強力な界面活性剤である）およびＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドとしても知られる）（Ｈ−５８８２）はすべて、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡから購入した。メタノール（ＨＰＬＣ）は、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ Ｌｔｄからであった。過酸化水素およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエトキシル化オクチルフェノールについての専用名称）は、Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。Ｐａｌｓｇａａｒｄ ４４４５としても市販される乳化剤ＹＮは、Ｐａｌｓｇａａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。四級アンモニウム化合物（例えば、ＬＴＡＢ（ラウロイルトリメチルアンモニウムブロミド）、Ｃｅｔｒｉｍｉｄｅ−４０（ｃｅｔｒｉｍｉｄｕｍとしても知られる）（これは、アルキルアンモニウムブロミド、主にＣＴＡＢからなる界面活性剤殺菌剤である）、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＳＴＡＢ（ステアロイルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＭＴＡＣ（ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド）、ＣＴＡＣ（セチルトリメチルアンモニウムクロリド），ＳＴＡＣ（ステアロイルトリメチルアンモニウムクロリド）は、すべて、ＦｅＦ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。Ｒｏｄａｌｏｎは、約９．５％（９５ｇ／ｌ）のアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド（Ｃl2Ｈ25Ｎ（ＣＨ3）2Ｃ7Ｈ7Ｃｌ）を含み、これは、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，２９５０ Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋから得た。アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリドはまた、塩化ベンザルコニウムとしても知られる。乳化剤ラウロイルラクチレートナトリウム（ＳＬＬ）は、Ｄａｎｉｓｃｏ Ｃｕｌｔｏｒ，Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。
【０１６０】
（酵母醗酵）
酵母の培養は、１０ＬスケールについてのＲｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ醗酵マニュアルに従って６Ｌまたは１００Ｌの醗酵槽において行った。
【０１６１】
（実施例１）
（合成の、コドン最適化ＨＯＸ遺伝子のアセンブリ）
（遺伝子設計）
ネイティブのＨＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、合成遺伝子を生成した。この合成ＨＯＸ遺伝子（図６）は、コドン使用法を、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ、Ｓ．Ｐｏｍｂｅのような生物工学的に関係ある酵母の既知のコドン優先度と正確に一致するように、これら生物における高レベル生産を容易にするため設計した。遺伝子は、３つの別個のアセンブルおよび／またはクローン化されたフラグメントに分割した。５’基部半分と称したサブアセンブリは、相補的なペアとして図５に提示されるような以下のオリゴヌクレオチドから構成された：ＨＯＸ１ａ／ＨＯＸ２ｂ、ＨＯＸ３ａ／ＨＯＸ４ｂ、ＨＯＸ５ａ／ＨＯＸ６ｂ、ＨＯＸ７ａ／ＨＯＸ８ｂ、ＨＯＸ９ａ／ＨＯＸ１０ｂ；プライマー１−６を用いる３’遠位部半分およびプライマー６−１０を用いる３’遠位部半分。
【０１６２】
（５’基部合成ＨＯＸ遺伝子）
合成ＨＯＸ遺伝子の５’基部半分は、１０のオリゴヌクレオチドＨＯＸ１Ａ〜ＨＯＸ１０Ｂを用いて合成した。１００μＬのホットスタートＰＣＲ反応（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いる）において、１００−１２０塩基対の範囲の長さを有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた（濃度＝各々０．１μＭ）。ホットスタートは、ｄＮＴＰ（２５０μＭ）およびＰｗｏポリメラーゼ（２．５単位）を添加する前に、オリゴヌクレオチド、緩衝液、ＭｇＳＯ4の混合物を、９０℃まで加熱することにより実施した。４０サイクルのＰＣＲは、９４℃３０秒、５７℃１分および７２℃１分のＰＣＲプロフィールを用いた。７２℃における１０分の伸長ステップを、４０サイクルの終わりに含めた。アガロースゲル電気泳動におけるこのＰＣＲからの産物の分析は、サイズが１００〜８５０塩基対の範囲のＤＮＡバンドのスメアを示した。最初のＰＣＲを、上記反応からの２μｌをテンプレートとして、および隣接プライマーＨＯＸ１ＡおよびＨＯＸ１Ｂ（各々１μＭ）用いて再増幅した。この反応は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および２単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を含んだ。ＰＣＲ条件は：９４℃２分間、次いで９４℃３０秒間、６０℃１分間および７２℃４５秒間のプロフィールをもつＰＣＲの３０サイクルであった。７２℃における１０分の伸長ステップを、４０サイクルの終わりに含めた。アガロースゲル電気泳動による第２のＰＣＲ産物の分析は、次いでゲルから精製され、そしてベクターｐＣＲ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化された、８５０ｂｐのＤＮＡバンドの存在を示した。
【０１６３】
（３’遠位部合成ＨＯＸ遺伝子）
ＨＯＸ遺伝子の遠位部分を合成するために、９０−１２６塩基対の範囲の長さのプライマーを設計した。これらプライマーは、約６０℃の計算された融解温度をもつ１６−２１塩基対の重複（相補的）領域を含んだ。このＨＯＸ遺伝子の遠位部分は、各々が５３０塩基対のサイズをもつ２つのフラグメント（ＡおよびＢ）として合成された。２つのＰＣＲ反応を、６つのプライマーを用いて一度に実施した。ＰＣＲ反応１はプライマー１−６を含み、そしてＰＣＲ反応２はプライマー５−１０を含んだ。ＰＣＲ増幅反応は、１００μｌの反応容量中、０．１μＭの各々のプライマー、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＳＯ4および２．５単位のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いる２つのＰＣＲ反応のサイクリングパラメーターは、９５℃における１分の変性、次いで：９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間のＰＣＲの３０サイクルを含めた。次いで、７２℃における３分の伸長反応を行った。アガロースゲル電気泳動による２つのＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の分析は、両方の場合で、長さが約５３０ｂｐの正確なサイズの１つの特異的ＤＮＡバンドの合成を示した。これらＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。クローン化された部分的合成ＨＯＸ遺伝子を、複数クローニング部位に隣接するプライマー（Ｍ１３逆プライマーおよびＴ７プロモータープライマー）を用いて配列決定した。配列決定結果は、合成された部分遺伝子が正確な配列を含んでいたことを確証した。
【０１６４】
（最終のコドン最適化ＨＯＸ遺伝子のアセンブリ）
合成ＨＯＸ遺伝子の３つの部分を、Ｎｃｏ１／ＰｖｕＩＩ ５’基部ＨＯＸ、３’遠位ＰｖｕＩＩ／ＳｐｅＩ ＨＯＸフラグメントＡおよびＳｐｅＩ／ＮｏｔＩで切断されたフラグメントＢからなる、ゲル精製されたＤＮＡフラグメントの連結により結合した。完全なコドン最適化された合成ＨＯＸ遺伝子（図６）を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａから外来タンパク質の発現および分泌を媒介するために開発されたＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクター中にアセンブルした。この発現ベクターは、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＦＭＤ）、ＭＯＸターミネーター、酵母分泌シグナルありまたはなしに基づく。
【０１６５】
（結果１）
（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける組換えＨＯＸの発現）
表１は、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ発現／組み込みベクターの複数クローニング部位中に、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ平滑フラグメントとして挿入された種々のＨＯＸ／分泌融合構築物を示す。異なるシグナル配列は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子接合型遺伝子およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡアミラーゼ由来であった。シグナル配列なしのＮｏｃＩ／ＮｏｔＩ ＨＯＸ構築物もまたベクター中にクローン化した。
【０１６６】
【表２】
【０１６７】
用語、変異体合成は、推定のＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位Ｒ331−Ｋ332〜Ｒ331−Ｐ332に関する。
【０１６８】
（実施例２）
（形質転換および継代）
異なるＨＯＸ発現プラスミドを用いて、ウラシル栄養要求性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｐｈａ株ＲＢ１１を、ウリジン原栄養に形質転換した。異なる発現プラスミドを保持するＨＯＸ形質転換体を、選択的条件下で３０世代の間培養し、プラスミドＤＮＡを増幅し、そしてゲノム中へ組み込ませた。これら形質転換体を、完全非選択培地上で２０世代の間増殖させた。選択に加え、ＰＣＲおよびサザン分析を用いて形質転換体を特徴付けた。
【０１６９】
（組み込まれた異質ＤＮＡのコピー数の決定）
非形質転換宿主株および特定のＨＯＸ構築物の種々の組換え単離株のゲノムＤＮＡを制限酵素Ａｓｐ７１８／ＮｃｏＩで消化した。制限酵素消化ＤＮＡを、０．８％アガロースゲル上で分離し、メンブレン（ニトロセルロース）に移し、そしてクローン化ＦＭＤプロモーターの32Ｐ標識フラグメントにハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションパターンは２つのシグナルを示し、１つは真の単一コピー１．４ｋｂＦＭＤ遺伝子であり、そしてもう１つはわずかにより小さな異種融合に由来する。一連の希釈は、固有の単一コピーのコントロールと比較して組み込まれたＤＮＡの単一強度の推定を可能にした。
【０１７０】
（結果２）
（ＨＯＸ発現のスクリーニング）
形質転換体を、３ｍＬのチューブ培養中で生育させ、そして１％グリセロールを培地に補填することによる脱抑制条件の下で培養した。ＨＯＸ発現を、グリセロール発酵からの培養のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。ポリクローナルＨＯＸ抗体を用いるウェスタンブロット分析を用いてＨＯＸタンパク質の存在を検出した。
【０１７１】
【表３】
【０１７２】
（実施例３）
（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける組換えＨＯＸの局在化）
組換えＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの免疫蛍光顕微鏡法には、細胞を、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）＋グルコース中で、１０8細胞／ｍｌの密度まで前培養した。発現を誘導するために、３×１０8細胞を、ＹＮＢ＋１％グリセロールで補填した１００ｍＬの振盪フラスコ培養にシフトした。脱抑制条件下の１、２または３日の増殖の後、５×１０8細胞を、組合わせたパラ−ホルムアルデヒド（４％）およびグルタルアルデヒド（０．２％）処置（ＨａｇｅｎおよびＨｙａｍ、１９８８）により固定した。１ｍＬのＰＥＭ（１００ｍＭ
Ｐｉｐｅｓ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、ｐＨ６．９）で３回洗浄した後、細胞壁を、０．５ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔを補填したＰＥＭＳ（ＰＥＭ＋１Ｍソルビトール）中で部分的に除去した。消化の約６０分後、細胞を、ＰＥＭＳ＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００にシフトし、３０秒インキュベートし、そして０．５ｍＬのＰＥＭで３回洗浄した。未反応グルタルアルデヒド細胞をクエンチするために、細胞をＰＥＭ＋１ｍｇ／ｍＬホウ化水素ナトリウム中に再懸濁した。この直後、細胞を、ＰＥＭ中で２回洗浄し、ＰＥＭＢＡＬ（ＰＥＭ＋１％ＢＳＡ（グロブリンフリー）、１ｍＭ リジン塩酸塩、０．１％ＮａＮ3）中に再懸濁し、そして回転ホイール上でインキュベートした。１０8細胞に等しい、細胞懸濁物の２５％を、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製したポリクローナル抗−ＨＯＸ抗体で補填し、そして室温で一晩インキュベートした。０．５ｍＬのＰＥＭＢＡＬ中で３回洗浄した後、細胞を、ＰＥＭＢＡＬ中に懸濁し、そして０．５％のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに暗中で５−２０時間インキュベートした。ＰＥＭＢＡＬ中の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ中で１回、ＰＢＳ＋０．２μｇ／ｍＬジアミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）中で１回洗浄し、そして最後にＰＢＳ＋０．１％ＮａＮ3中に再懸濁した。顕微鏡観察には、細胞懸濁物の小サンプルを、ポリＬリジンでコートされたカバースリップ上に乾燥し、そして１ｍｇ／ｍＬパラ−フェニレンジアミンを含む１００％グリセロールの液滴中に転置した。細胞を、間接免疫蛍光装置を備えたＺｅｉｓｓ顕微鏡で検査し（１．０００×）、そしてイメージを、ＣＣＤカメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ Ｋｏｄａｋ）によりキャプチャーし、そしてＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いてプロセッシングした。
【０１７３】
（結果３）
ＤＫ８−２７形質転換体の免疫蛍光顕微鏡検査は、組換えＨＯＸタンパク質が、凝集体として、主に細胞の周縁に局在化していることを示した（図７ｂ）。生化学的データと組合わせ、これらの結果は、ある程度までのＨＯＸが、（実質的な膜結合タンパク質に対し）膜結合タンパク質であり得ることを示す。ＨＯＸは、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の原形質膜に局在化する可能性が最も高い。また、ＤＫ８−２７由来のＤＫ８−２７ｍｕｔ２５株では、ＨＯＸは、原形質膜と結合している（図７ｃ）。しかし、このタンパク質は、凝集体で蓄積せず、より均一に分布している。種々のリーダーペプチドに融合するとき、ＨＯＸは、巨大な細胞内凝集体で蓄積する（図７ｄ）。
【０１７４】
（実施例４）
（異なる界面活性剤およびプロテアーゼによる組換えＨａｎｓｅｎｕｌａからのＨＯＸの抽出）
実験は、１５ｍＬの遠心分離チューブ中の５．０ｍＬの細胞懸濁物（細胞＋上清）を用いることにより実施した（ＨＯＸ９９２６−７、３１７ｇ細胞／Ｌ湿潤重量、０．３Ｕ／ｍＬ細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間の遠心分離により分離した。透過性実験には、次いで、上清を、ＣＴＡＢ、ＣＴＡＴ＋プロナーゼＥ、プロナーゼＥ、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの商標名）およびＴｗｅｅｎ８０（ソルビタンモノラウレートの商標名）のいずれかで補填した。次いで、細胞を、４．０ｍＬの上清中に再懸濁し、そして２５℃で２３時間インキュベートした（５００ｒｐｍ）。ＣＴＡＢとの時間の効果を調べるために、チューブの１つの中の細胞を、４ｍＬの０．４％ＣＴＡＢ中２５℃で７分間のインキュベートのみをした。次いで、細胞を、遠心分離により分離した。次いで、細胞を、添加されるＣＴＡＢのない元の上清中に再懸濁し、次いで、上記のように２３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞フリー抽出物中の細胞外ＨＯＸを、ＨＯＸアッセイにより測定した。
【０１７５】
（ＨＯＸ活性の測定のためのアッセイ方法（ＨＯＸアッセイ））
ＨＯＸ活性は、ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＩｋａｗａ（１９７３）のアッセイにより推定した。このアッセイを、マイクロタイタープレート中で行うためにスケールダウンした。
【０１７６】
（原理）
ＨＯＸアッセイは、グルコースの酸化で発生する過酸化水素の測定に基づく。この過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下でｏ−ジアニシジンを酸化し、色素を形成する。
【０１７７】
ＨＯＸ
β−Ｄ−グルコース＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2 → Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン＋Ｈ2Ｏ2
ＰＯＤ
Ｈ2Ｏ2＋ｏ−ジアニシジンred → ２Ｈ2Ｏ＋ｏ−ジアニシジンox
（試薬）
１．１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３
２．１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中の１００ｍＭ Ｄ−グルコース
３．ｏ−ジアニシジン、３．０ｍｇ／ｍｌ蒸留水中
４．ペルオキシダーゼ、０．１０ｍｇ／ｌｍＬ １００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中
（アッセイ）
１２０μｌ 試薬１
１５０μｌ 試薬２
１０μｌ 試薬３
１０μｌ 試薬４
および １０μｌ 酵素溶液（適正な希釈中）
このアッセイは、マイクロタイタープレート中で実施される。反応は、酵素溶液の添加により開始される。この混合物は、振盪しながら２５℃で１０分間インキュベートされる。ブランクの反応は、酵素溶液に代わる水とすべての成分を含む。色素の形成は、４０５ｎｍにおけるマイクロタイタープレートリーダー中で測定される。反応の直線性は、マイクロリーダー上の動力学的プログラムを用いることによりチェックされる。
【０１７８】
（過酸化水素標準曲線）
過酸化水素標準曲線は、変化する濃度の新鮮Ｈ2Ｏ2を用いることにより構築する。１単位の酵素活性を、２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＨ2Ｏ2を生成する酵素量と規定する。
【０１７９】
（結果４）
表３に提示されたデータは、ＣＴＡＢがＨＯＸを抽出することで非常に効率的であることを示す。ＣＴＡＢはまた、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ８０よりかなり効率的である。プロテアーゼを添加することの有意な利点はない。非常に興味深いことに、ＣＴＡＢは、ほんの７分のプレインキュベーションでもちいるときでさえ、そのポジティブな影響を奏し、これは、ＣＴＡＢが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞壁に非常に迅速に結合し、かつ透過処理することを示す。これは、ＣＴＡＢに対する細胞フリー上清の分析により支持されており（以下を参照のこと）、これは、添加された４０００ｐｐｍのＣＴＡＢのうちほんの５０−１００ｐｐｍが細胞フリー上清中に存在することを示す。
【０１８０】
各試験薬剤についての遠心分離チューブ中の沈殿物の比較はまた、ＣＴＡＢ処置細胞のパックされた細胞容積が、ＣＴＡＢ以外の界面活性剤で処理されたコントロール細胞（単数または複数）の容積より小さいことを示す。細胞のこの収縮は、細胞が実際に透過処理され、そしてそれらの可溶性内容物のあるものが空にされたことを示す。
【０１８１】
【表４】
【０１８２】
（実施例５）
（ＣＴＡＢおよびベンズアルコニウムクロライド（ＢＡＣ）を用いるＨＯＸの抽出）
この実験は、１５ｍＬ遠心分離チューブ中の５．０ｍＬの細胞懸濁物（細胞＋上清）（ＨＯＸ９９５９、Ｍｕｔ４５）を用いることにより実施した。次いで、細胞懸濁物を、ＣＴＡＢ（１０％ＣＴＡＢストック溶液から）またはベンズアルコニウムクロライド（Ｒｏｄａｌｏｎ、９．５％ベンズアルコニウムクロライド）いずれかで補填し、そして２５℃で２２時間インキュベートした（２００ｒｐｍ）。インキュベーション後、細胞外ＨＯＸ（細胞を４０００ｇで１０分間の遠心分離により除去した）をＨＯＸアッセイにより測定した。
【０１８３】
（結果５）
表４に提示したデータは、ベンズアルコニウムクロライド（ＢＡＣ）が細胞からＨＯＸ酵素を放出することで非常に効果的であることを示す。
【０１８４】
【表５】
【０１８５】
（実施例６）
（塩と組み合わせたＣＴＡＢによる、かつ異なる温度におけるＨＯＸの抽出）
ＣＴＡＢ効果の機構を試験するために、ＣＴＡＢをカオトロピック塩および非カオトロピック塩と組み合わせた。５ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を１５ｍＬ遠心管に加えた（ＨＯＸ９９２６−７、３１７ｇ細胞／リットル湿重量、０．３Ｕ／ｍＬ細胞内ＨＯＸ活性）。細胞を４０００ｇで１０分間遠心分離によって分離した。次いで、上清をＣＴＡＢ、ＣＴＡＢ＋ＮａＣｌ、ＣＴＡＢ＋尿素、ＣＴＡＢ＋硫酸アンモニウムまたは非イオン性洗浄剤であるオクチル−グリコシドのいずれかで補充した。次いで、細胞を４．０ｍＬの上清中に再懸濁させ、そして２５℃で２６時間インキュベートした（５００ｒｐｍ）。この実験において、振盪および温度の効果もまた、試験した。インキュベーション後、細胞を含まない抽出物を使用して、実施例４に概説されるようなＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性を試験した。
【０１８６】
（結果６）
結果を表５に示す。振盪が、ＣＴＡＢの存在下でＨＯＸの抽出をするために必ずしも必要でないことが明白である。明らかな温度効果があり、これは、４℃での抽出は、２５℃で抽出された活性の半分だけ生じることを意味する。塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムの添加は両方とも、ＣＴＡＢ処理の効果を減少させ、これは、ＣＴＡＢ］のイオン性が重要であることを示し得る。尿素の添加は、あまり強烈でない効果を有するが、依然として抽出されたＨＯＸの量を０．４％のＣＴＡＢで抽出された量の約半分まで減少させる。尿素は、非イオン性であるが、疎水性の相互作用によって妨害され得る。尿素は、親油性のタンパク質の抽出のためにＰｉｃｈｉａ細胞を透過させる手法として、先行技術において報告された（Ｃｒａｉｇ １９８７）。非イオン洗浄剤であるオクチルグルコシドは、有意な抽出効果を有さない。
表５
細胞内ＨＯＸの抽出に対する洗浄剤、塩と組み合わせた洗浄剤、振盪、および温度の効果
【０１８７】
【表６】
【０１８８】
（実施例７）
（ＨＯＸを含む細胞抽出物におけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるＣＴＡＢおよびＬＴＡＢの決定）
実施例５からの抽出されたＨＯＸのサンプルを、以下のユニットからなるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣ−ＭＳシステムにおけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの手法によって、それらのＣＴＡＢの含量について分析した：
ａ）二成分勾配ポンプ、ＨＰ１１００
ｂ）自動サンプラー、ＨＰ１１００、
ｃ）サーモスタットのカラム成分、ＨＰ１１００
ｄ）質量選択検出器、ＨＰ１１００
ｅ）クロマトグラフィーデータシステム、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０１。
【０１８９】
このシステムに、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＸＤＢ−Ｃ８、５μＭ、１５０×４．６ｍＭ ｉｄ．（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを備えた。カラム温度は２５℃であった。
【０１９０】
クロマトグラフィー条件は、２つの溶媒からなる移動相であった。溶媒Ａ：１ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ／水、溶媒Ｂ：１ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ／メタノール。カラムを、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件によって（すなわち、クロマトグラフィーの期間の間、溶出液の組成が一定に保持される条件を用いて）実行した：５％Ａ＋９５％Ｂ、０．８０ｍＬ／分の溶媒流速および１０μＬの注入量で。サンプルを直接注入した。
【０１９１】
質量分析条件は、以下の噴霧室設定であった：
イオン化モード：ポジティブモードにおけるエレクトロスプレー
乾燥ガス（Ｎ2）温度：３５０℃
乾燥ガス流速：６．０ｌ／分
噴霧器圧：６０ｐｓｉ
毛細管電圧：−４０００ボルト
フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧：１００ボルト。
【０１９２】
検出器の設定は以下であった：ＳＩＭパラメータ：ｍ／ｚ ２８４．１（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムカチオン）。５００μｇのＣＴＡＢ／ｍＬ水（中心集中度 １０００）を含むストック溶液を、水で希釈し、以下の中心集中度を有する標準溶液を得た：３００−１００−３０−１０。サンプルに、０．４％のＣＴＡＢを添加し、これによって、抽出物に全ＣＴＡＢが存在する場合、４０００μｇ／ｍＬを得た。
【０１９３】
四級アンモニウム化合物のための分析方法を、異なるカラムを用いることによって、そして異なる移動相を用いることによって最適化した。２つの９０Ｌスケールの発酵（３１４ｇ／Ｌウエットセルのバイオマス濃度のＶｅｓｔ０００２ｂおよび３３２ｇ／Ｌウエットセルのバイオマス濃度のＶｅｓｔ０００３ｂ）を、０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度までＬＴＡＢに添加し、そしてＨＯＸを２４時間抽出した。各発酵からのサンプルを１００００ｇで１０分間遠心分離し、そして得られた上清をＬＴＡＢ分析のために除去した。以下の方法を用いて、以下のユニットからなるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣ−ＭＳシステムにおけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの手法によって、上清中のＬＴＡＢ含量を定量した：
ａ）二成分勾配ポンプ、ＨＰ１１００
ｂ）自動サンプラー、ＨＰ１１００
ｃ）サーモスタットのカラム成分、ＨＰ１１００
ｄ）質量選択検出器、ＨＰ１１００
ｅ）クロマトグラフィーデータシステム、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０１。
【０１９４】
このシステムに、ＰＬＲＰ−Ｓ、１００Å、５μｍ、２５０×４．６ｍＭ ｉｄ．（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムを備えた。カラム温度は２５℃であった。
【０１９５】
クロマトグラフィー条件は、メタノール中の０．１％のヘプタフルオロ酪酸からなる移動相であった。カラムを１．００ｍＬ／分の溶媒流速および５μＬの注入量で実行した。サンプルをメタノールで２５倍に希釈し、そして注入前に、Ｇｅｌｍａｎ ＧＨＰ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍＭ Ｍｉｎｉｓｐｉｋｅ ０．４５μＭを介して濾過した。
【０１９６】
質量分析条件は、以下の噴霧室設定であった：
イオン化モード：ポジティブモードにおけるエレクトロスプレー
乾燥ガス（Ｎ2）温度：３５０℃
乾燥ガス流速：１３．０Ｌ／分
噴霧器圧：６０ｐｓｉ
毛細管電圧：−４０００ボルト
フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧：１５０ボルト。
【０１９７】
検出器の設定は以下であった：ＳＩＭパラメータ：ｍ／ｚ ２２８．１（ラウオリルトリメチルアンモニウムカチオン）。２５０μｇのＬＴＡＢ／ｍＬメタノール（中心集中度 １０００）を含むストック溶液を、メタノールで希釈し、以下の中心集中度を有する標準溶液を得た：４００−２００−１２０−８０−３６−１０．８−５．４−２．１６−０．８６４。
【０１９８】
（結果７）
表６から、ＨＯＸ酵素を含む細胞抽出物におけるＣＴＡＢのレベルは、細胞に添加された量よりずっとより低いことが明白である。これは、酵母細胞壁へのＣＴＡＢの結合およびそれ故の固定化によって説明される。これは、得られたＨＯＸ酵素のみが、非常に低いレベルのＣＴＡＢを含むことを意味する。
表６
実施例６からの抽出されたＨＯＸ上清中のＣＴＡＢの含量
【０１９９】
【表７】
【０２００】
上清中のＬＴＡＢについて得られた結果（表６ａ参照）は、添加されたＬＴＡＢの約２７％のみが、細胞を含まない画分において見出されることを示す。この結果は、表６のＣＴＡＢでの結果と同じ傾向を示す。
表６ａ
実施例６からの発酵Ｖｅｓｔ０００２ｂおよびＶｅｓｔ０００３ｂから抽出された上清中のＬＴＡＢ含量
【０２０１】
【表８】
【０２０２】
（実施例８）
（ＣＴＡＢによるＨＯＸの抽出の時間および効率に対する温度の効果）
ＣＴＡＢによるＨＯＸの抽出の時間および効率に対する温度の効果を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａサンプル上で試験した：Ｍｕｔ４５、ＨＯＸ９９４９、２８４ｇ／Ｌ、２．６Ｕ／ｍＬ。
【０２０３】
遠心管中の発酵物（細胞＋上清）５ｍＬに、（１０％のＣＴＡＢ溶液からの）０．２％か０．４％のいずれかのＣＴＡＢを添加した。この管を、それぞれ、２５、３０、３５および４０℃でインキュベートした（２００ｒｐｍ）。指示された時間に、サンプルを取り、そして１０００ｇで５分間遠心分離した後、上清をＨＯＸ活性についてアッセイした。結果を表７に示す。
表７
異なる温度でのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸ抽出の時間経過
【０２０４】
【表９】
【０２０５】
（結果８）
ＣＴＡＢ抽出は、温度に依存すること、およびより高い温度を用いることによってより速い抽出が達成され得ることが明白である。しかし、これは、抽出されたタンパク質の安定性によってバランスされるべきパラメータである。この実験において、０．２％または０．４％のＣＴＡＢを用いることの間に、有意差は存在しないようである。しかし、これは、特定の実験における細胞濃度に依存する。
【０２０６】
（実施例９）
（異なる４級アンモニウム化合物によるＨＯＸ抽出）
いくつかの異なる４級アンモニウム化合物を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来の細胞内ＨＯＸ酵素の抽出に関して試験した。発酵培養液のサンプルを、６Ｌスケールの発酵（ここでは、バイオマス濃度が１Ｌ当たり約３４０ｇ湿重量である）から除去した。表８に列挙される４級アンモニウム化合物の各々の４％（ｗ／ｖ）溶液１ｍＬを、プラスチック管に発酵培養液９ｍＬまで添加した。２５℃で２００ＲＰＭでの２４時間のインキュベーション後に、管を２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、前記のように、ＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析した。
【０２０７】
ＨＯＸ抽出の時間経過をＣＴＡＢ、ＬＴＡＢおよびＣＴＡＣを用いて研究した。１Ｌ当たり２８０ｇの湿重量のＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを含む発酵サンプルを発酵層から除去した。ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢおよびＣＴＡＣの４％（ｗ／ｖ）溶液を、発酵培養液９ｍＬを含むプラスチック管に最終濃度０．２または０．４（ｗ／ｖ）まで添加した。２５℃で２００ＲＰＭでの４８時間のインキュベーションの０、７、１７、２４、および４８時間後に、管を２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、前記のようにＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析した。
【０２０８】
ＬＴＡＢの抽出効果を、細胞内でＨＯＸを産生するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株番号３４９において試験した。発酵培養液のサンプルを６Ｌスケールの発酵（ここで、バイオマス濃度は、１Ｌ当たり約２３２ｇ湿重量であった）から除去した。発酵培養液９ｍＬを、ＬＴＡＢの１０％（ｗ／ｖ）溶液 ０μＬ（コントロール）または１８０μＬと共にプラスチック管に添加した。３０℃で２０ＲＰＭでの２４時間のインキュベーション後に、管を９０００ｇで５分間遠心分離した。上清を前記のようにＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析した。
【０２０９】
（結果９）
ＨＯＸは、０．４％（ｗ／ｖ）の終濃度で発酵サンプルに添加した場合の全ての試験した四級アンモニウム化合物で抽出することができた（表８を参照のこと）。２５℃での２４時間のインキュベーション後、ＬＴＡＢは、ＨＯＸの抽出に関して、他の試験した化合物より優れていた。抽出されたＨＯＸの量は、四級アンモニウム化合物の鎖の長さが増加するにつれ減少するようであった。
【０２１０】
ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢまたはＣＴＡＣを用いたＨＯＸ抽出の時間経過を、表９に示す。インキュベーション時間および抽出試薬濃度の両方が抽出されるＨＯＸ活性の量に影響を与えることが、明らかである。ＬＴＡＢは、分析した全インキュベーション時間において最良の抽出試薬であることが見出され、これは、表８に示す結果と一致する。ＬＴＡＢを用いたＨＯＸの抽出は、０．４％（ｗ／ｖ）の濃度のＬＴＡＢよりも、０．２％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢの濃度においてよりゆっくりとした速度で進行するようである。ＨＯＸ酵素の抽出に関して、０．２％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢの使用と０．４％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢの使用との間にほとんど差異はないようである。
【０２１１】
（表８）
（種々の四級アンモニウム化合物を用いたＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの抽出）
【０２１２】
【表１０】
【０２１３】
抽出試薬の添加前の発酵培地における細胞外ＨＯＸレベルは、２４時間後にＬＴＡＢで抽出したＨＯＸ活性の約９％であった。
a化合物は、全て構造：ＣＨ3−（ＣＨ2）n−Ｎ（ＣＨ3）+3（塩化物または臭化物を対イオンとして有する）である。
b全ての実験を２連で実行した。
cＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの結果を、いずれのＬＴＡＢの添加も伴わないコントロールチューブでの抽出ＨＯＸに対して標準化した。抽出開始前の発酵中の細胞外ＨＯＸレベルは、コントロール（すなわち、いずれのＬＴＡＢの添加も伴わないプラスチックチューブ）中の抽出レベルの約２４％であった。
【０２１４】
（表９）
（ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢ、およびＣＴＡＣを用いたＨＯＸ酵素の抽出の時間経過）
【０２１５】
【表１１】
【０２１６】
抽出試薬の添加前の発酵培地における細胞外ＨＯＸレベルは、４８時間後に０．４％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢで抽出したＨＯＸ活性の約４％であった。値を、±１標準偏差で提供する。ｎ：実験数。
【０２１７】
全ての値を、４８時間後に０．４％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢを用いた抽出レベルに対して標準化する。
【０２１８】
（実験１０）
（ＨＯＸ抽出に関するＣＴＡＢと他の乳化剤との間の比較）
リゾレシチン（リゾホスファチジルクロライド）は、高分子の選択的な放出を伴って少なくとも哺乳動物細胞を透過可能であり得る。リゾレシチンおよび多数の他の乳化剤および短い鎖の脂肪酸の効果を試験するために、ＨＯＸを抽出するこれらの能力を試験してＣＴＡＢと比較した。
【０２１９】
５ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を、１５ｍＬの遠心分離チューブに添加した（ＨＯＸ９９１０Ｂ、３０５ｇ細胞／Ｌ 湿重量、１．６Ｕ／ｍｌ 細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間、遠心分離によって分離した。次いで、細胞を、ＣＴＡＢ、乳化剤ＳＬＬ、ＹＮ、カプリン酸、リゾレシチン、またはレシチンのいずれかを補充した４．０ｍＬ ２５ｍＭクエン酸（ｐＨ６．３）中に再懸濁した。次いで細胞を、２０時間２５℃（５００ｒｐｍ）でインキュベートした。
【０２２０】
（結果１０）
インキュベーション後、無細胞抽出物中のＨＯＸ活性のレベルを、ＨＯＸアッセイによって測定した。表１０に示すデータは、ＣＴＡＢ以外の試験した乳化剤が、非常に低いレベルの活性酵素を放出し得るのみであることを示す。この結果はまた、ＣＴＡＢが、上清中の潜在的な酵素を活性化し得ること（おそらく、膜結合フラグメントから酵素を放出することによる）を示す。
【０２２１】
（表１０）
（ＨＯＸ抽出に対する界面活性剤、乳化剤、およびリン脂質の効果）
【０２２２】
【表１２】
【０２２３】
（実施例１１）
（ＨＯＸの抽出に関するＣＴＡＢとサポニンとの間の比較）
サポニンがジギトニンのように作用するか否かを確認するために、ＨａｎｓｅｎｕｌａからのＨＯＸ酵素の抽出に対するサポニンの効果を試験した。
【０２２４】
実験を、５．０ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を用いて１５ｍＬ遠心分離チューブ中で実行した（ＨＯＸ１９０７９９、３４０ｇ細胞／Ｌ 湿重量、０．５Ｕ／ｍＬ 細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間、遠心分離することによって分離した。次いで、細胞を、ＣＴＡＢもしくははサポニンのいずれかを補充した４．０ｍＬの上清中に再懸濁するか、またはＣＴＡＢもしくはサポニンのいずれかを補充した２５ｍＭ クエン酸（ｐＨ６．３）中に再懸濁した。
【０２２５】
無細胞抽出液（ＣＴＡＢを用いた処理後）中の測定されたＨＯＸ活性が実際に抽出の結果であり、単に上清中のＨＯＸ活性化の結果ではないこと（これは、ＨＯＸは上清中に既に存在するが不活性であることであり得る）を確認するために、無細胞抽出液（ＣＴＡＢまたはサポニンでの補充後）をまた、インキュベートし、そしてＨＯＸ活性について分析した。このチューブを、１９時間２５℃（５００ｒｐｍ）でインキュベートした。インキュベーション後、無細胞抽出物中の細胞外ＨＯＸを、ＨＯＸアッセイによって測定した。
【０２２６】
（結果１１）
表１１の結果は、サポニンがＨＯＸを細胞から抽出するごくわずかな能力を有することを示す。さらに、サポニンによるＨＯＸ活性化の指標も、ＣＴＡＢによるＨＯＸ活性化の指標も、いずれもなかった。
【０２２７】
（表１１）
異なる透過剤を使用することによる比較ＨＯＸ抽出／活性化
試験 ＨＯＸ活性％
コントロール ０（細胞＋上清） １００
０．２％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） １２００
０．４％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ３１００
０．２％ サポニン（細胞＋上清） １５０
０．４％ サポニン（細胞＋上清） １４０
０．８％ サポニン（細胞＋上清） １４０
コントロール １（細胞＋緩衝液） １００
０．２％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ３１００
０．４％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ７７００
０．２％ サポニン（細胞＋上清） ２３０
０．４％ サポニン（細胞＋上清） ２３０
０．８％ サポニン（細胞＋上清） ２３０
上清＋０．２％ ＣＴＡＢ ８０
上清＋０．４％ ＣＴＡＢ ８０
上清＋０．２％ サポニン ８０
上清＋０．４％ サポニン ８０
上清＋０．８％ サポニン ８０
（実施例１２）
（１００Ｌ発酵槽におけるＨＯＸのＣＴＡＢ抽出）
１２０時間の発酵（ＦｅｒｍＩＤ Ｖｅｓｔ９９１０ｂ）の後、ＣＴＡＢ溶液（４０℃の水３．６Ｌに溶解した３６０ｇのＣＴＡＢ）を１００Ｌ発酵槽の入口ポートを介してブロスに直接添加した。活性な発酵物容量が約９０Ｌであったため、発酵ブロス中のＣＴＡＢの最終濃度は、約４ｇ／Ｌであった。
【０２２８】
同時に、撹拌、通気、ｐＨ制御、および栄養物添加をとめた。温度を２５℃に制御し、そして２２時間のＣＴＡＢ処理の後、ブロスのＨＯＸ含量は、１．６Ｕ／ｍＬから３０Ｕ／ｍＬに増加した。
【０２２９】
（実施例１３）
（実験室スケールにおけるＨＯＸ産生Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの均質化）
ＣＴＡＢ処理の結果としてＨＯＸ抽出の効率を試験するために、２つの異なる発酵試験からの細胞を、細胞分裂装置「Ｚ Ｐｌｕｓ」２．２ｋＷ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用することによって分裂させた。細胞（５ｍＬ）をワンショットポンプヘッドを使用して様々な圧力で分裂させた。開始後、この細胞片を遠心分離（１０，０００ｇで５分）によって上清から分離し、そして細胞を含まない上清中の細胞内ＨＯＸレベルを、上記のようなＨＯＸアッセイを使用して測定した。同じ細胞をまた、０．２％ ＣＴＡＢで処理し（２５℃、５００ｒｐｍ、２０時間）、そして細胞を含まない抽出物を比較物質として使用した。
【０２３０】
（結果１３）
表１２に示すデータは、細胞内ＨＯＸの総量が０．２％ ＣＴＡＢでの処理によって抽出されることを示す。
【０２３１】
（表１２）
ＣＴＡＢ処理の有効性
【０２３２】
【表１４】
【０２３３】
*細胞は２５℃で４８時間インキュベートした。
【０２３４】
（実施例１４）
（大スケールにおけるＨＯＸ産生Ｈｏｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの均質化）
ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ高圧ホモジナイザーモデル３０ＣＤで、１０Ｌの発酵ブロス（ＦｅｒｍＩＤ Ｖｅｓｔ９９０７ｂ）をホモジナイズした。ホモジナイザーを最大流速（１００Ｌ／分）で、１０００ｂａｒの圧力によって作動させた。均質化手順の間、このブロスを氷水で冷却し、そして産物の温度は決して２０℃を越えなかった。ＨＯＸ活性の迅速な増加は、初めの３サイクルの間に観察され、続いて５〜７サイクル後にほとんど定常レベルが観察された。
【０２３５】
（結果１４）
この結果を、表１３および図８に示す。
【０２３６】
（表１３）
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの機械抽出）
【０２３７】
【表１５】
【０２３８】
（実施例１５）
（Ｈｏｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの抽出に対するＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の効果）
ＣＴＡＢまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、遠心分離管の５ｍＬの発酵物（サンプル ＨＯＸ９９５４、Ｍｕｔ ４５、１８．１０．９９，ＨＶＰ）に添加した。水をコントロールに添加した。サンプルを、２５℃、２００ｒｐｍで２２時間インキュベートした。インキュベーションの後、これらのサンプルを遠心分離し、そして上清を、上記のようにＨＯＸ活性について分析した。
【０２３９】
（結果１５）
結果を表１４および図９に示す。非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して、酵母細胞を透過化処理し（Ｎａｇｌａｋら、１９９０および米国特許第第５１２４２５６号を参照のこと）たが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００はＣＴＡＢ（これは、当該分野において、細胞内酵素（例えば、ＨＯＸ酵素）を抽出し得ることが記載されていないが、細胞の透過性化を与えることが記載されている）とは逆に抽出効果を有さないことは明らかである。
【０２４０】
（表１４）
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と比較したＣＴＡＢでのＨＯＸ抽出）
【０２４１】
【表１６】
【０２４２】
（実施例１６）
（ウェスタンブロッティング）
ウェスタンブロッティングを用いて、残余（ペレット）のＨＯＸ酵素および放出された（上清の）ＨＯＸ酵素の量を分析することによりＨＯＸ分泌の効力を試験した。細胞を、それぞれ、０％、０．１％、０．２％、および０．４％ＣＴＡＢを用いて処置した。インキュベーションの後、細胞を、４０００ｇで１０分間遠心分離により分離した。得られた上清のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（４−１２％ Ｍｅｓ Ｎｕ−Ｐａｇｅ）は、図１０Ａのレーン７−１０に示される。ペレットを緩衝液を用いて２回洗浄し、次いで、緩衝液中に再懸濁したＦａｓｔＰｒｅｐ細胞崩壊剤において崩壊させた。ペレット抽出物をまた、製造業者の指示書（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）に従って、プレキャストＮｏｖｅｘゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ａ中のレーン２−５を参照のこと）にアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、製造業者の指示書（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）に従って、ニトロセルロース膜にブロットした。このブロットを、ＨＯＸ酵素に対して惹起された抗体（ウサギ抗血清＃４３６４ ＢＩ／ＯＣＨ １９０７９７）（この調製を以下に記載する）と共にインキュベートした。
【０２４３】
（ＨＯＸ特異的抗体の調製）
組換えＨＯＸ酵素をＷＯ９６／４０９３５に記載されるように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、発現プラスミドＰＵＰＯ１８１から産生させた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現組換えＨＯＸの粗抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＨＯＸに対応する６２ｋＤの相対分子量（Ｍｒ）でのプロミネントタンパク質のバンドを、ＷＯ９６／４０９３５に記載されるように、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写させ、そしてＮ−末端アミノ酸配列分析に供した。同定したアミノ酸配列は：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−（配列番号１）であった。この配列は、ＨＯＸについて開示された配列（ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｒｄ，１９９７）中のアミノ酸番号２〜１１に対応した。従って、発現した６２ｋＤタンパク質は、Ｎ−末端アミノ酸のメチオニン（Ｍｅｔ1）を欠く組換えＨＯＸであった。
【０２４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された６２ｋＤのＨＯＸのバンドを、プレパラティブＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製し、そしてＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１９８３）により記載されるようにゲルから電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）した。電気溶出した６２ｋＤのＨＯＸバンドの純度を、上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、そしてアミノ酸配列分析により分析した。精製したＨＯＸを、ウサギにおける抗体産生のために用いた。約５０μｇを、等量の不完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントと混合し、そして免疫に用いた。
【０２４５】
ウサギにおいて産生したＨＯＸ特異的モノクローナル抗体を、ウェスタンブロット分析における本研究を通じて用いた。ウェスタンブロット分析により分析されるタンパク質を、上記のように、電気泳動し、そして標準的手順に従って、ニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を、３％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間ブロックした。１．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００で希釈したＨＯＸ特異的抗体を添加し、そして一晩ブロットした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した後、１．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ中に１：１０００で希釈した二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、ＤＡＫＯ，カタログ番号Ｄ４８７）と共にインキュベーション（１〜２時間）した。このブロットを、引き続いて、ＴＢＳ−Ｔ（２ｘ２０分）およびＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１×５分）中で洗浄した後、標準的な手順に従って、ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）緩衝液中で発色させた。
【０２４６】
抗体の特異性を、それぞれ、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の抽出物を含むＨＯＸを用いる一連のウェスタンブロットにおいて調査した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの抽出物を含むＨＯＸのウェスタンブロット分析は、Ｍｒ６２ｋＤの強力なＨＯＸ特異的バンド、およびより低い分子量の２つまたは３つの弱いバンドを示した。
【０２４７】
（結果１６）
ウェスタンブロットの結果を、図１０Ｂに示す。このウェスタンブロットは、実質的に、ＨＯＸが０．４％ＣＴＡＢを用いる処置の後の細胞に残らないことを確認した。
【０２４８】
（実施例１７）
（細胞内酵素の増加したレベルに対するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）についての記載）
細胞内ＨＯＸ酵素を発現するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株を、２５４ｎｍの波長のＵＶ光を用いて変異させた。変異した菌株を、寒天プレート（Ｇｉｂｃｏからの１．４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ／Ｌグリセロールおよび２％（ｗ／ｖ）寒天）上にプレートし、そしてコロニーが形成されるまで３０℃でインキュベートした。コロニーを、ロボテックコロニーピッカー（ｒｏｂｏｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｃｋｅｒ）（Ｑ−Ｐｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ Ｄｏｒｓｅｔｔ，ＵＫ）を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。各マイクロタイターウェルは、２００μＬ ＹＮＢ培地（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．１、１．４ｇ／Ｌ ＹＮＢ（Ｇｉｂｃｏから）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4および１０ｇ／Ｌグリセロール）を含んだ。マイクロタイタープレートを、ＩＯＣ４００．ＸＸ２．Ｃ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＳＡＮＹＯ Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ ＢＶ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、７日間振盪させて２５℃でインキュベートした。ＨＯＸ活性を、１０５μＬの試薬を含むように改変されたＨＯＸアッセイを用いて１０μＬ発酵ブロスで測定し、そして１５μＬ ０．４％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを、アッセイに加えた。反応時間は、３０℃で６０分であった。ＨＯＸアッセイをＰｌａｔｏ ７ ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ ｒｏｂｏｔ（Ｒｏｓｙｓ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行し、吸収度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＫ）で測定した。それぞれの個々のマイクロタイターウェルにおける増殖を、１０μＬの発酵ブロスを新しいマイクロタイタープレートに移し、１００μＬの１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３を加え、そして６００ｎｍにおける吸収度を測定した。ＨＯＸ測定を、乏しい増殖を考慮に入れるために、６００ｎｍでの吸収度に関して規格化した。
【０２４９】
（結果１７）
この結果は、上昇したレベルの細胞内ＨＯＸ酵素を産生するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの変異についてスクリーニングすることが可能であることを示す。
【０２５０】
（実施例１８）
ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸ（例えば、表１２を参照のこと）および「機械抽出」ＨＯＸ酵素（例えば、表１３および図８を参照のこと）からの比活性の比較。
【０２５１】
（結果１８）
この結果は、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸからの比活性が、「機械抽出」ＨＯＸの比活性よりも高いことを示す。これらの結果は、ＣＴＡＢが、細胞小器官に局在化する細胞内タンパク質のすべてを抽出するわけではないが、主に細胞質ゾルタンパク質を抽出することを示す。
【０２５２】
（実施例１９）
アニオン交換クロマトグラフィーによるＣＴＡＢ抽出ＨＯＸおよび機械抽出ＨＯＸの特徴付け）
ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸの純度を分析するために、これを細胞破壊を使用することによって抽出されたＨＯＸと比較した。比活性を測定し、比較して、そして抽出物の核酸含有量を比較した。さらに、純度をアニオン交換クロマトグラフィーによって調べた。
【０２５３】
７ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を、１５ｍＬの遠心分離チューブ（ＨＯＸ９９５７，Ｍｕｔ ４５）に加えた。０．４％ＣＴＡＢの添加時に、細胞懸濁液を２３時間、３０℃で（２００ｒｐｍ）インキュベートした。細胞を遠心分離（１００００ｇおよび１０分）で除去し、細胞を含まない上清をＣＴＡＢ抽出ＨＯＸの供給源として使用した。別の７ｍＬの同じ細胞懸濁液（ＣＴＡＢを添加しない）を、ワンショットポンプヘッド（Ｚ Ｐｌｕｓ，２．２ｋＷ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）を２×２４００ｂａｒで使用することによって破壊した。次いで、細胞の破片を遠心分離（１００００ｇおよび１０分）によって分離し、そして上清を機械抽出ＨＯＸの供給源として使用した。
【０２５４】
両方のサンプルを２０ｍＭ ＴＥＡ（トリエタノールアミン、Ｍｅｒｃｋ）緩衝液、ｐＨ７．３で、ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）で脱塩した。サンプルをＨＯＸ活性およびタンパク質濃度について分析した（タンパク質アッセイは、Ｓｃｈｌｅｉｆ ａｎｄ Ｗｅｎｓｉｎｋ，１９８１によって記載されるアッセイ方法に基づく）。核酸の含有量は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの測定によって決定した（Ｂｏｌｌａｇ ａｎｄ Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，１９９１）。
【０２５５】
イオン交換クロマトグラフィーを、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）システムを使用することによって行った。５００μｌの脱塩化サンプルを、ＴＥＡ緩衝液（緩衝液Ａ、２０ｍＭ、ｐＨ７．３）で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ Ｑ １５ ｃｏｌｕｍｎ（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）に適用した。ＨＯＸを、１．５ｍＬ／分の流速で、緩衝液Ａ中０−０．５Ｍ ＮａＣｌの２０ｍＬの直線勾配で溶出し、この間、１．５ｍＬの画分が、収集され、そしてＨＯＸ活性についてアッセイされた。
【０２５６】
（結果１９）
比活性の決定は、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸが、機械抽出ＨＯＸと比較してずっとより純粋であることを示す（表１５）。また、この核酸の含有量は、機械抽出ＨＯＸにおけるよりも、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸにおいてずっと低い（表１５）。
【０２５７】
【表１７】
【０２５８】
ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸおよび機械抽出ＨＯＸについてのＳｏｕｒｃｅ Ｑ分析のクロマトグラムを示す図１１Ａおよび１１Ｂにおけるアニオン交換クロマトグラフィー分析はまた、この結果を強く確認する。
【０２５９】
（ＣＴＡＢを用いた実験）
（実施例２０）
（１．振とうフラスコ実験）
２種の異なる培地を、ＣＴＡＢとの実験のために選択した：
・ＹＰ／１％のグリセロール
・ＹＮＢ／１％のグリセロール＋０．１ＭのＮａＰｉ ｐＨ６．０。
【０２６０】
（（ａ）ＹＰ／１％のグリセロール中での培養）
５０ｍＬの培地を、２．５ｍＬのＹＰＤプレ培地を用いてインキュベートし、そして３７℃、１６０ｒｐｍで培養した。培養の２８時間後に、１％（ｖ／ｖ）のメタノールを添加し、そして３７℃、１６ｒｐｍで１８時間さらにインキュベートした。このＯＤ600nmを測定して、必要であるＣＴＡＢの量を計算した。上清（ＳＮ）のアリコートおよび１．５ｍＬの培地の細胞ペレットを取り出した。細胞を機械で破壊した後、可溶なフラクション（ＣＸ）を単離した。
→ これらの状態のＳＮを、Ａと命名した。
【０２６１】
これらの状態のＣＸを、Ｄと命名した。
【０２６２】
これらの培養物の同一の体積（２０ｍＬ）を、２個の振とうフラスコにアリコートした。２０ｍＬの培地に、０．００５ｇのＣＴＡＢを補充した。（ＣＴＡＢ−ストック溶液：０．０２ｇ／ｍＬ；ＤＡＮＩＳＣＯ：０．４％（発酵槽培地中）（ＯＤ600nm〜３００）→振とうフラスコ実験ＯＤ600nm〜２０→０．０２７ｇのＣＴＡＢ／１００ｍＬの培地）培地のインキュベーション：２４時間、４℃（振とう無し）。
→ これらの状態のＳＮを、Ｃと命名した。
【０２６３】
これらの状態のＣＸを、Ｆと命名した。
【０２６４】
ＣＴＡＢを含まない第２の振とうフラスコを、ＣＴＡＢ−フラスコとして同一の条件下でインキュベートし、そして参照培地として利用した。
→ これらの状態のＳＮを、Ｂと命名した。
【０２６５】
これらの状態のＣＸを、Ｅと命名した。
【０２６６】
５種の異なるＩＬ−１ｒａ構築物を有する菌株を培養した。この菌株４−１７、ＡＬ９／２およびＩＩ３−１は、単一の配列を有さない、３種の異なる構築物を含んだが、この菌株ＭＦα２およびＭＦαＡＬ７／１は、ＭＦαプレ−プロ配列を有する、２種の異なる構築物を示した。
【０２６７】
菌株ＦＰＭＴ８を、組換え菌株と同一の条件下で培養した。この菌株をエンプティーＨａｎｓｅｎｕｌａベクターｐＦＰＭＴ１２１のほぼ３０個のコピーに必須のＲＢ１１であり、ネガティブコントロールとして役立つ。
【０２６８】
ＣＴＡＢでの処理後に、４０倍（２０倍）から１１０倍のＩＬ−１ｒａ濃度の増加が、単一配列を有さない構築物を含む、菌株の上清において検出された。ＣＴＡＢで処置したＭＦα−菌株に関して、ＩＬ−１ｒａ濃度のより低い増加（２倍〜５倍）が測定された。
【０２６９】
（結果２０）
これらの結果を、表１６に要約した。
【０２７０】
【表１８】
【０２７１】
表１６：ＹＰ／グリセロール／メタノール中でのＣＴＡＢとの実験
Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中での４６時間の培養後の上清
Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の上清
Ｃ：ＹＰ／グリコール／メタノール中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の滅菌濾過した上清。
＊注釈
菌株ＡＬ９／２の上清中のこのＩＬ−１ｒａ濃度は、通常低かった。第４の実施形態において、０．６と０．７μｇ／ｍＬとの間の濃度が検出された。低い収率の理由は、公知ではない。
【０２７２】
（実施例２１）
（（ｂ）ＹＮＢ／１％のグリセロール＋０．１ＭのＮａＰｉ ｐＨ６．０中での培養）
ＣＴＡＢでのさらなる実験にために、シグナル配列を有さない３種の異なる構築物を含む３種の菌株を、選択した（菌株４−１７；ＡＬ９／２；ＩＩ３−１）。
【０２７３】
４５ｍＬの培地を、５ｍＬのＹＰＤプレ培養で播種し、そして３７℃、１６０ｒｐｍで培養した。２８時間培養した後、１％（ｖ／ｖ）のメタノールを添加し、そして３７℃、１６０ｒｐｍで１８時間さらにインキュベートした。
【０２７４】
このＯＤ600nmを測定して、必要であるＣＴＡＢの量を計算した。上清（ＳＮ）のアリコートおよび３ｍＬの培地の細胞ペレットを取り出した。細胞を機械的に破壊した後、可溶なフラクション（ＣＸ）を単離した。
→ これらの状態のＳＮを、Ａと命名した。
【０２７５】
これらの状態のＣＸを、Ｄと命名した。
【０２７６】
これらの培養物の同一の体積（２０ｍＬ）を、２個の振とうフラスコにアリコートした。２０ｍＬの培地に、０．００３ｇのＣＴＡＢを補充した。培地のインキュベーション：２４時間、４℃（振とう無し）。
→ これらの状態のＳＮを、Ｃと命名した。
【０２７７】
これらの状態のＣＸを、Ｆと命名した。
【０２７８】
ＣＴＡＢを含まない第２の振とうフラスコを、ＣＴＡＢ−フラスコとして同一の条件下でインキュベートし、そして参照培地として利用した。
→ これらの状態のＳＮを、Ｂと命名した。
【０２７９】
これらの状態のＣＸを、Ｅと命名した。
【０２８０】
全ての場合において、ＣＴＡＢでのインキュベーションは、上清のＩＬ−１ｒａ濃度の有意な増加（１００〜１３０倍）に導いた。
【０２８１】
（結果２１）
２種の培地において培養した後の、ＣＴＡＢ実験のＥＬＩＳＡ結果を、以下の表１７において比較する。
【０２８２】
【表１９】
【０２８３】
表１７：ＹＰ／グリセロール／メタノールおよびＹＮＢ／グリコール／メタノール中でのＣＴＡＢでの比較
Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノール）中での４６時間の培養後の上清
Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノール）中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の上清
Ｃ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノール）中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の滅菌濾過した上清。
【０２８４】
（実施例２２）
（異なるインキュベーション条件の試験）
ＹＰ／グリセロール／メタノール中で培養した菌株ＩＩ ３／１（１．ａを参照のこと）について、ＣＴＡＢの添加後に異なるインキュベーション条件を試験した。
条件：
＞２４時間 ＣＴＡＢ；４℃ 振盪なし（「標準的」条件）
＞２４時間 ＣＴＡＢ；４℃ 緩やかに振盪
＞２４時間 ＣＴＡＢ；３７℃ 振盪なし
＞２４時間 ＣＴＡＢ；３７℃ 緩やかに振盪
（結果２２）
上清中のＩＬ−１ｒａの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、表１８に要約する。
【０２８５】
【表２０】
【０２８６】
Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養後の上清
Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養し、次いでＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートした後の上清
Ｃ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養し、次いでＣＴＡＢと共に２４時間インキュベートした後の滅菌濾過上清。
【０２８７】
上清におけるＩＬ−１ｒａの最も高い増加は、振盪なしで３７℃でＣＴＡＢインキュベーション後（７６倍）、および振盪なしで４℃でＣＴＡＢインキュベーション後（４９倍）で測定された。
【０２８８】
最も高いＩＬ−１ｒａの濃度は、３７℃で検出されたが、ＣＴＡＢなしでインキュベートした参照サンプルにおける濃度もまた、増加した（１６倍）。参照サンプルにおける高い濃度は、細胞の溶解によって引き起こされ得る。
＝＞最良の条件：４℃（細胞の溶解を回避するため）振盪なし。
【０２８９】
（実施例２３）
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよびクマシー染色）
振盪フラスコ実験から単離された粗抽出物の上清および可溶性画分を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ゲル：１６％Ｎｏｖｅｘ−ｇｅｌ ＴＧ １ｍｍ；還元条件
コロイド状クマシー染色（ＢＩＯ−ＳＡＦＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏｒａｄ）
サンプル：Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養後の上清
Ｂ：ＣＴＡＢを含まない参照上清
Ｄ：粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈
Ｅ：参照培養物の粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈
Ｆ：ＣＴＡＢ処理後の粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈。
【０２９０】
（結果２３）
（＊ＷＢ３３およびＣｏｏ２）
菌株： ４〜１７ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ １ｒａＩ
Ａｌ ９／２ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ １ｒａＩ＋Ａｌ
ＣＴＡＢ：２４時間インキュベーション；４℃、振盪なし。
【０２９１】
ウエスタンブロット（ＷＢ３３）の結果を、図１２Ａに示す。試験サンプルおよび添加した量を、図１２Ａについての以下の説明文において示す。
【０２９２】
【表２１】
【０２９３】
この結果は、両方の菌株について、ＳＮにおけるＩＬ−１ｒａの増加（レーン４、レーン９）およびＣＸにおける減少（レーン５、レーン１０）が、ＣＴＡＢでの処理後に検出されたことを実証する。
【０２９４】
コロイド状のクマシー（Ｃｏｏ２）ブルー染色を、図１２Ｂに示す。この試験サンプルおよび添加量を、図１２Ｂについての以下の説明文において示す。
【０２９５】
【表２２】
【０２９６】
（＊ＷＢ３４およびＣｏｏ３）
菌株： ＭＦα２ ｐＦＰＭＴ ＭＦα ＩＬ−１ｒａＩ
ＭＦαＡＬ ７／１ｐＦＰＭＴ ＭＦα ＩＬ−１ｒａＩ＋Ａｌ
ＣＴＡＢ：２４時間インキュベーション；４℃、振盪なし。
【０２９７】
ウエスタンブロット（ＷＢ３４）の結果を、図１３Ａに示す。試験サンプルおよび添加した量を、図１３Ａについての以下の説明文において示す。
【０２９８】
【表２３】
【０２９９】
この結果は、ＣＴＡＢでの処理後に、細胞内および分泌されたＩＬ−１ｒａの混合物が、レーン４および９において上清Ｃにおいて検出されたことを示す。
ＭＦα２：細胞内ＩＬ−１ｒａ由来の〜２０ｋＤａおよび３４ｋＤａのさらなるバンド。
【０３００】
ＭＦα７／１： 細胞内ＩＬ−１ｒａ由来の１７ｋＤａ未満のさらなるバンド
増加した１８ｋＤａシグナルの強度
コロイド状クマシー（Ｃｏｏ３）結果を図１３Ｂに示す。
【０３０１】
添加された試験サンプルおよび量を、図１３Ｂに対する以下の説明文に示す。
【０３０２】
【表２４】
【０３０３】
（ＷＢ３５およびＣｏｏ４）
株：ＩＩ３／１ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ−１ｒａ ＩＩ型
ＣＴＡＢの添加後の異なったインキュベーション条件：
２４時間ＣＴＡＢ、４℃、浸透せず（「標準条件」）
２４時間ＣＴＡＢ、３７℃、浸透せず
ウエスタンブロット（ＷＢ３５）結果を図１４Ａに示す。
【０３０４】
添加された試験サンプルおよび量を図１４Ａに対する以下の説明文に示す。
【０３０５】
【表２５】
【０３０６】
コロイド状クマシー（Ｃｏｏ４）結果を図１４Ｂに示す。
【０３０７】
添加された試験サンプルおよび量を、図１４Ｂに対する以下の説明文に示す。
【０３０８】
【表２６】
【０３０９】
４℃および３７℃におけるＣＴＡＢのインキュベーション後、ＳＮにおけるＩＬ−１ｒａの増加（ＷＢ３５：レーン４、レーン８）の増加およびＣＸにおける減少（ＷＢ３５：レーン５、レーン９）が検出されたことを、この結果は実証する。
【０３１０】
ＳＮ ＣＴＡＢ ３７℃（レーン８）において、最も多い量のＩＬ−１ｒａＩＩを得た。この結果は、ＥＬＩＳＡ結果と一致している（表３を参照のこと）。
【０３１１】
この上清において、より多くのＩＬ−１ｒａＩＩだけでなく、より多くの他のタンパク質（３５ｋＤａを超える）が染色された（Ｃｏｏ４：レーン８）。この観察は、４℃と比較して３７℃で有意な細胞溶解が発生するという仮定を確かめた。
【０３１２】
（考察）
Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ ＨＯＸ遺伝子のコドン用法（ＳｔｏｕｇａａｒｄおよびＨａｎｓｅｎ １９９６、ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｄ，１９９７）は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ宿主生物体のより頻繁に使用されたコドンのコドン用法と、低使用コドンとの置換によって改変された。ＨＯＸの発現のためのコドン至適化されたＨＯＸ ＤＮＡフラグメントを含む酵母、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、発現系（Ｒｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｌｄｏｒｆ／ドイツで開発された）の形質転換体を調製した。
【０３１３】
ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子のコドン至適化は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ酵母宿主生物体におけるＨＯＸ酵素の高レベルの発現（高レベルの酵素活性の点から）を生じた。シグナル配列が存在しない場合、ＨＯＸ酵素は、細胞内に局在化される。しかし、多数の異なったシグナル配列が異なった構築物において使用される場合でさえ、少しのＨＯＸ活性が細胞外培地において測定され得たか、または全く活性が測定され得なった。これらの結果は、ＨＯＸ酵素が、シグナル配列を含むＨＯＸ酵素を発現する宿主株からでさえ分泌され得ないことを示す。ウエスタンブロットはまた、シグナル配列が存在する場合でさえ、ＨＯＸ酵素が膜結合画分中に局在化し得ることを確認し、ＨＯＸ遺伝子の転写および翻訳が存在するが、ＨＯＸ酵素は分泌されずそして分泌経路にとどまっているようであることを示す。
【０３１４】
本発明の方法を使用する細胞内酵素学的に活性なＨＯＸ酵素は、他のイオン性／非イオン性界面活性剤および乳化剤を使用して、伝統的な細胞破壊方法および抽出方法と比較された。プロテアーゼおよび塩と界面活性剤との組み合わせがまた、調べられた。
【０３１５】
（要約）
本発明の１つの広範な局面において、目的の可溶性かまたは膜結合細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を放出する方法が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性かまたは膜結合細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；膜抽出組成物と細胞を接触させる工程；およびＰＯＩの放出に十分な条件下でおよび可溶性形態で、ＰＯＩを細胞から放出させる工程を包含する。
【０３１６】
本発明の別の広範な局面において、目的の可溶性かまたは膜結合細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を特異的に放出する工程が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性かまたは膜結合細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；膜抽出組成物と細胞を接触させる工程；およびＰＯＩの放出について十分な条件下で細胞から放出されるが、他の混入したタンパク質の放出に不十分である工程を包含する。
【０３１７】
上記の明細書中で述べられた全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載された方法および系の種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、要求されるような本発明が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。確かに、分子生物学または関連した分野における当業者に明らかである本発明を実施するために記載されたモデルの種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【０３１８】
（参考文献）
【０３１９】
【表２７】
【０３２０】
【０３２１】
本発明は、以下の図面を参照して、例示の目的でのみ説明される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１５３１５２（Ｐ２０１１−１５３１５２Ａ）
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−７６６８９（Ｐ２０１１−７６６８９）
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【分割の表示】特願２００１−５３９８８６（Ｐ２００１−５３９８８６）の分割
【原出願日】平成１２年１１月２４日（２０００．１１．２４）
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７６６８９（Ｐ２０１１−７６６８９）
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【分割の表示】特願２００１−５３９８８６（Ｐ２００１−５３９８８６）の分割
【原出願日】平成１２年１１月２４日（２０００．１１．２４）
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
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