タンパク質マトリックスワクチンおよびそのようなワクチンの製造方法および投与方法
本発明は、担体タンパク質と目的の抗原が複合体に捕捉されているワクチン組成物、そのようなワクチンの製造方法、およびワクチン投与法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年８月７日出願の米国仮出願出願番号第６０／８３５，９４４号、および２００７年６月８日出願の米国仮出願出願番号第６０／９３３，７６４号の特典を請求し、それらの明細書をこれにより参照により組み込む。
【０００２】
連邦出資研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された授与番号第Ｕ５４ＡＩ０５７１５９号の政府援助によって行なわれた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ワクチン組成物、ワクチンの製造方法、およびワクチン投与法に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの抗原、特に病原体の莢膜層に付随する抗原は、免疫応答をほとんど、またはまったく刺激せず、それらの抗原に対する有効なワクチン創出への努力を困難なものにしている。莢膜は、典型的には、炭水化物、アミノ酸、またはアルコールなどの有機化合物のポリマーから構成される、微生物表面成分である。莢膜は、化学的に非常に多様である。莢膜（例えば炭水化物）を構成する単量体単位は、様々な分子配置で連結することができ、さらにリン酸、窒素、硫酸、および他の化学的修飾物で置換することができる。これらの化学的変形によって、莢膜は、多数の抗原標的を微生物表面上に提示できるようになり、それによって、これらの標的に向けられた宿主免疫系から逃れることができる。莢膜はまた、微生物が、宿主マクロファージおよび多形核（polymorphoneuclear）白血球によって貪食され、死滅するのを防止する病原性因子でもありうる。莢膜に対する抗体は、微生物表面に補体を固定することによって、莢膜を有する微生物から強力に防御するが、その固定によって食作用性宿主免疫細胞がそれらを溶解し、またはそれらをオプソニン化し、取込み、死滅させられる。莢膜に対する最も強力な抗体は、ＩｇＧ抗体である。顕著なレベルのＩｇＧを誘発できない莢膜は、Ｔ非依存性抗原と呼ばれる。タンパク質と莢膜は共有結合することによって、「Ｔ依存性」になり、そのような抗原はＩｇＧ応答を誘発することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
強力な免疫応答またはＩｇＧ抗体を誘起しない莢膜および他のＴ非依存性抗原を対象とする、安全で合成可能な費用効率の高いワクチンが必要とされている。様々な感染症、例えば、炭疽、肺炎球菌、インフルエンザＢ型、髄膜炎菌、および連鎖球菌による感染から防御するためには、そのようなワクチンが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、目的の抗原が担体タンパク質によって複合体中に捕捉されているワクチン組成物、そのようなワクチンの製造方法、およびワクチン投与法に関する。
【０００７】
従って、第１態様では、本発明は、目的の抗原と担体タンパク質を含むワクチン組成物であって、（ｉ）目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋し、かつ（ｉｉ）該抗原が該担体タンパク質に捕捉されて複合体を形成するワクチン組成物を特徴とする。
【０００８】
本発明の第１態様の望ましい実施形態では、その複合体の直径は１０ｎｍ〜１００μｍである。本発明の第１態様のより望ましい実施形態では、その複合体の直径は約１００ｎｍ〜１００μｍである。本発明の第１態様のよりさらに望ましい実施形態では、その複合体の直径は約１００ｎｍ〜１０μｍである。
【０００９】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、その複合体を哺乳動物に投与すると、該哺乳動物でＴ細胞依存性免疫応答が誘発される。
【００１０】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、抗原：担体タンパク質のモル比は、１：１０〜１０：１である。望ましくは、担体タンパク質は多量体であり、例えば、少なくとも５個のサブユニットを含む多量体である。別の望ましい実施形態では、多量体はホモ多量体である。
【００１１】
本発明の第１態様のさらに望ましい実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも一個の別の担体タンパク質と共有結合している。望ましくは、共有結合には、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合が含まれる。別の望ましい実施形態では、共有結合に、式
【化１】
【００１２】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物が含まれる。別の望ましい実施形態では、共有結合に、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。さらに別の望ましい実施形態では、共有結合に二官能基架橋剤が含まれる。望ましくは、二官能基架橋剤は、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである。
【００１３】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は非共有結合している。望ましい実施形態では、非共有結合には、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合が含まれる。
【００１４】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン（例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae）フラゲリンタンパク質）、ニューモリシン、髄膜炎菌（Neisseria menningitidis）の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌（Escherichia coli）熱不安定性エンテロトキシン、志賀様（shiga−like）毒素（例えば、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質）、ヒトＬＴＢタンパク質、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（または関連タンパク質）、細菌細胞全体（例えば、緑膿菌または連鎖球菌細胞）からのタンパク質抽出物、炭疽菌（Bacillus anthracis）防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである。特に望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、ジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素、または破傷風トキソイドである。
【００１５】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である。望ましくは、多糖は少なくとも１８残基を含む。別の望ましい実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）多糖、チフス菌（Salmonella typhi）多糖、サルモネラ種多糖、赤痢菌多糖、または髄膜炎菌多糖である。特に望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、莢膜型１〜４８、例えば、３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６のどれか一つである。別の特に望ましい実施形態では、野兎病菌多糖はＯ抗原である。
【００１６】
本発明の第１態様のさらに望ましい実施形態では、目的の抗原は微生物の莢膜ポリマーである。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である。
【００１７】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、それらの原子のそれぞれは、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸から独立して選択されている。望ましくは、その有機ポリマーは微生物に由来する。別の望ましい実施形態では、有機ポリマーは自然発生のものではない。
【００１８】
別の望ましい実施形態では、ワクチン組成物は第２の目的の抗原をさらに含む。望ましくは、そのワクチン組成物は第３の目的の抗原をさらに含む。
【００１９】
第２態様では、本発明は、ワクチン組成物の作製方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合して、該抗原と該担体タンパク質の混合物を形成するステップ、および（ｉｉ）該目的の抗原を該担体タンパク質で捕捉するステップを含み、その際、該ワクチン組成物中、目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する。
【００２０】
本発明の第２態様の望ましい実施形態では、ワクチン組成物は製薬上許容される賦形剤をさらに含む。
【００２１】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、捕捉ステップは、混合物から抗原と担体タンパク質を沈殿させるステップを含む。望ましくは、沈殿ステップは、混合物のｐＨを変化させるステップ、混合物に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または硫酸アンモニウムを加えるステップ、混合物の無機塩濃度を上昇させ、または低下させることにより、混合物のイオン強度を変化させるステップ、混合物を加熱して、担体タンパク質および／または抗原を凝固させるステップ、または混合物に十分な線束の電離放射線を照射して架橋させるステップを含む。
【００２２】
本発明の第２態様の望ましい実施形態では、ワクチン組成物中、抗原：担体タンパク質のモル比は１：１０〜９：１０である。
【００２３】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は多量体である。望ましくは、多量体は、少なくとも５個のサブユニットを含む。別の望ましい実施形態では、多量体はホモ多量体である。
【００２４】
本発明の第２態様のさらに望ましい実施形態では、担体タンパク質は非共有結合している。望ましくは、非共有結合に、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合が含まれる。
【００２５】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン（例えば、コレラ菌フラゲリンタンパク質）、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素（赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質）、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体（例えば、緑膿菌または連鎖球菌細胞）からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである。特に望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、ジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素、または破傷風トキソイドである。
【００２６】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である。望ましくは、多糖は、少なくとも１８残基を含む。別の望ましい実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である。特に望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、莢膜型１〜４８、例えば、３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６のどれか一つである。別の特に望ましい実施形態では、野兎病菌多糖はＯ抗原である。
【００２７】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は微生物の莢膜ポリマーである。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である。
【００２８】
本発明の第１態様のさらに別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、それらの原子のそれぞれは、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸から独立して選択されている。望ましくは、その有機ポリマーは微生物に由来する。別の望ましい実施形態では、有機ポリマーは自然発生のものではない。
【００２９】
本発明の第２態様のさらに望ましい実施形態では、ステップ（ｉ）の混合ステップは、第２の目的の抗原、または第３の目的の抗原さえも含む。
【００３０】
第３態様では、本発明は、別のワクチン組成物の作製方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合するステップ、および（ｉｉ）該担体タンパク質と架橋するリンカーを加えるステップを含み、その際、該ワクチン組成物中、目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する。
【００３１】
本発明の第３態様の望ましい実施形態では、ワクチン組成物は製薬上許容される賦形剤をさらに含む。本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、ワクチン組成物中、抗原：担体タンパク質のモル比は１：１０〜１０：１である。本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は多量体である。望ましくは、多量体は少なくとも５個のサブユニットを含む。別の望ましい実施形態では、多量体はホモ多量体である。
【００３２】
本発明の第３態様のさらに望ましい実施形態では、本方法は、担体タンパク質中のシッフ塩基を還元するステップを含む。本発明の第３態様のよりさらに望ましい実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも一個の別の担体タンパク質と共有結合している。望ましくは、共有結合に、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合が含まれる。別の望ましい実施形態では、共有結合に二官能基架橋剤が含まれる。望ましくは、二官能基架橋剤は、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである。
【００３３】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、リンカーは、式
【化２】
【００３４】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物である。
【００３５】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、リンカーは、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンである。
【００３６】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン（コレラ菌フラゲリンタンパク質）、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素（赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質）、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体（緑膿菌または連鎖球菌細胞）からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである。
【００３７】
本発明の第３態様のさらに望ましい実施形態では、目的の抗原は、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である。望ましくは、多糖は、少なくとも１８残基を含む。別の望ましい実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である。特に望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、莢膜型１〜４８、例えば、３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６のどれか一つである。別の特に望ましい実施形態では、野兎病菌多糖はＯ抗原である。
【００３８】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、微生物の莢膜ポリマーである。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である。
【００３９】
本発明の第３態様のさらに別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、それらの原子のそれぞれは、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸から独立して選択されている。望ましくは、その有機ポリマーは微生物に由来する。別の望ましい実施形態では、有機ポリマーは自然発生のものではない。
【００４０】
本発明の第３態様のさらに望ましい実施形態では、ステップ（ｉ）の混合ステップは、第２の目的の抗原、または第３の目的の抗原さえも含む。
【００４１】
第４態様では、本発明は、被験体に感染病原体に対するワクチンを接種する方法を特徴とする。この方法は、被験体で抗体の産生を誘発するのに十分な量の本発明の第１態様のワクチン組成物を該被験体に投与するステップを含む。本発明の第４態様の望ましい実施形態では、方法は、被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の本発明の第１態様のワクチン組成物を該被験体に投与する２回目の投与ステップを含む。望ましくは、本発明の第４態様では、抗体の産生がＴ細胞に依存する。本発明の第４態様の別の望ましい実施形態では、被験体が感染病原体に感染するのを防止または低減するのに、抗体の産生が十分である。感染病原体は、肺炎球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌Ｂ型、緑膿菌、野兎病菌、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、または大腸菌が望ましい。
【００４２】
本発明の第４態様の別の望ましい実施形態では、方法は、被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の、目的の抗原を含む第２のワクチン組成物を該被験体に提供する２回目の投与ステップを含む。望ましくは、被験体が第２の感染病原体に感染するのを防止または低減するのに、抗体の産生が十分である。
【００４３】
本発明の第４態様の望ましい実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。本発明の第４態様のさらに望ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００４４】
本発明の態様のいずれか一つの望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、Kongら,(J. Med. Microbiol. 54:35−356, 2005)に記載されている莢膜型の一つである。例えば、望ましくは、肺炎連鎖球菌多糖莢膜型は、１（例えば、１−ｇまたは１−ｑ）、２（例えば、２−ｇ、２−ｑ、または２−４１Ａ）、３（例えば、３−ｇ、３−ｑ、３−ｃ、または３−ｎｚ）、４、５（例えば、５−ｑ、５−ｃ、５−ｑａｐ、または５−ｇ）、６Ａ（例えば、６Ａ−ｇ、６Ａ−ｃ１、６Ａ−ｃ２、６Ａ−ｎ、６Ａ−ｑａｐ、６Ａ−６Ｂ−ｇ、６Ａ−６Ｂ−ｑ、または６Ａ−６Ｂ−ｓ）、６Ｂ（例えば、６Ｂ−ｃ、６Ａ−６Ｂ−ｇ、６Ａ−６Ｂ−ｑ、または６Ａ−６Ｂ−ｓ）、７Ｆ（例えば、７Ｆ−７Ａ）、７Ａ（例えば、７Ａ−ｃｎまたは７Ｆ−７Ａ）、７Ｂ（例えば、７Ｂ−４０）、７Ｃ（例えば、７Ｃ−１９Ｃ−２４Ｂ）、８（例えば、８−ｇまたは８−ｓ）、９Ａ（例えば、９Ａ−９Ｖ）、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ（例えば、９Ａ−９Ｖ）、９Ｖおよび１４、１０Ｆ（例えば、１０Ｆ−ｑ、１０Ｆ−ｃａ、または１０Ｆ−１０Ｃ）、１０Ａ（例えば、１０Ａ−１７Ａまたは１０Ａ−２３Ｆ）、１０Ｂ（例えば、１０Ｂ−１０Ｃ）、１１Ｆ、１１Ａ（例えば、１１Ａ−ｎｚまたは１１Ａ−１１Ｄ−１８Ｆ）、１１Ｂ（例えば、１１Ｂ−１１Ｃ）、１１Ｃ（例えば、１１Ｂ−１１Ｃまたは１１Ｃ−ｃｎ）、１１Ｄ（例えば、１１Ａ−１１Ｄ−１８Ｆ）、１２Ｆ（例えば、１２Ｆ−ｑまたは１２Ｆ−１２Ａ−１２Ｂ）、１２Ａ（例えば、１２Ａ−ｃｎ、１２Ａ−４６、または１２Ｆ−１２Ａ−１２Ｂ）、１２Ｂ（例えば、１２Ｆ−１２Ａ−１２Ｂ）、１３（例えば、１３−２０）、１４（例えば、１４−ｇ、１４−ｑ、１４−ｖ、または１４−ｃ）、１５Ｆ（例えば、１５Ｆ−ｃｎ１または１５Ｆ−ｃｎ２）、１５Ａ（例えば、１５Ａ−ｃａ１、１５Ａ−ｃａ２、または１５Ａ−ｃｈｗ）、１５Ｂ（例えば、１５Ｂ−ｃ、１５Ｂ−１５Ｃ、１５Ｂ−１５Ｃ−２２Ｆ−２２Ａ）、１５Ｃ（例えば、１５Ｃ−ｃａ、１５Ｃ−ｑ１、１５Ｃ−ｑ２、１５Ｃ−ｑ３、１５Ｃ−ｓ、１５Ｂ−１５Ｃ、または１５Ｂ−１５Ｃ−２２Ｆ−２２Ａ）、１６Ｆ（例えば、１６Ｆ−ｑまたは１６Ｆ−ｎｚ）、１６Ａ、１７Ｆ（例えば、１７Ｆ−ｎおよび１７Ｆ−３５Ｂ−３５Ｃ−４２）、１７Ａ（例えば、１７Ａ−ｃａまたは１０Ａ−１７Ａ）、１８Ｆ（例えば、１８Ｆ−ｃａ、１８Ｆ−ｗ、または１１Ａ−１１Ｄ−１８Ｆ）、１８Ａ（例えば、１８Ａ−ｎｚまたは１８Ａ−ｑ）、１８Ｂ（例えば、１８Ｂ−１８Ｃ）、１８Ｃ（例えば、１８Ｂ−１８Ｃ）、１９Ｆ（例えば、１９Ｆ−ｇ１、１９Ｆ−ｇ２、１９Ｆ−ｇ３、１９Ｆ−ｑ、１９Ｆ−ｎ、または１９Ｆ−ｃ）、１９Ａ（例えば、１９Ａ−ｇ、１９Ａ−、または１９Ａ−ｃａ）、１９Ｂ、１９Ｃ（例えば、１９Ｃ−ｃｎ１、１９Ｃ−ｃｎ２、または７Ｃ−１９Ｃ−２４Ｂ）、２０（例えば、１３−２０）、２１（例えば、２１−ｃａまたは２１−ｃｎ）、２２Ｆ（例えば、１５Ｂ−１５Ｃ−２２Ｆ−２２Ａ）、２３Ｆ（例えば、２３Ｆ−ｃ、１０Ａ−２３Ｆ、または２３Ｆ−２３Ａ）、２３Ｂ（例えば、２３Ｂ−ｃまたは２３Ｂ−ｑ）、２４Ｆ（例えば、２４Ｆ−ｃｎ１、２４Ｆ−ｃｎ２、または２４Ｆ−ｃｎ３）、２４Ａ、２４Ｂ（例えば、７Ｃ−１９Ｃ−２４Ｂ）、２５Ｆ（例えば、２５Ｆ−３８）、２５Ａ、２７、２８Ｆ（例えば、２８Ｆ−２８Ａまたは２８Ｆ−ｃｎ）、２８Ａ（例えば、２８Ｆ−２８Ａ）、２９（例えば、２９−ｃａまたは２９−ｑ）、３１、３２Ｆ（例えば、３２Ｆ−３２Ａ）、３２Ａ（例えば、３２Ａ−ｃｎまたは３２Ｆ−３２Ａ）、３３Ｆ（例えば、３３Ｆ−ｇ、３３Ｆ−ｑ、３３Ｆ−ｃｈｗ、３３Ｆ−３３Ｂ、または３３Ｆ−３３Ａ−３５Ａ）、３３Ａ（例えば、３３Ｆ−３３Ａ−３５Ａ）、３３Ｂ（例えば、３３Ｂ−ｑ、３３Ｂ−ｓ、または３３Ｆ−３３Ｂ）、３３Ｄ、３４（例えば、３４−ｃａまたは３４ｓ）、３５Ｆ（例えば、３５Ｆ−４７Ｆ）、３５Ａ（例えば、３３Ｆ−３３Ａ−３５Ａ）、３５Ｂ（例えば、１７Ｆ−３５Ｂ−３５Ｃ−４２）、３６、３７（例えば、３７−ｇまたは３７−ｃａ）、３８（例えば、２５Ｆ−３８）、３９（例えば、３９−ｃｎ１または３９−ｃｎ２）、４０（例えば、７Ｂ−４０）、４１Ｆ（例えば、４１Ｆ−ｃｎまたは４１Ｆ−ｓ）、４１Ａ（例えば、２−４１Ａ）、４２（例えば、１７Ｂ−３５Ｂ−３５Ｃ−４２）、４３、４４、４５、４６（例えば、４６−ｓまたは１２Ａ−４６）、４７Ｆ（例えば、３５Ｆ−４７Ｆ）、４７Ａ、４８（例えば、４８−ｃｎ１または４８−ｃｎ２）、またはGenBank受託番号ＡＦ５３２７１４もしくはＡＦ５３２７１５である。
【００４５】
定義
ワクチンと関連して本明細書で使用する「投与すること」は、被験体で免疫応答を誘発するのに十分な用量で、被験体にワクチンを提供することを意味し、その際、免疫応答によって、ワクチンに含まれている抗原と特異的に結合する抗体が産生される。望ましくは、投与には、筋肉内注射、皮内注射、または経皮注射が含まれ、望ましくは好適な免疫アジュバントの投与が含まれる。投与には、１回ワクチン投与または複数回用量でのワクチン投与を含めてよい。望ましくは、２回目の投与は、感染病原体による感染を防止するように、被験体で抗体の産生をブーストするように設計する。ワクチン投薬の頻度および量は、そのワクチンの比活性に依存し、常法の実験によって容易に決定することができる。
【００４６】
「架橋」は、「長さゼロ」のリンカーを使用したときは直接的に、または化学的リンカーである第３分子を使用することによって、２分子間、巨大分子間、または分子の組合せ間、例えば担体タンパク質間に共有結合を形成することを意味し、その化学的リンカーは２個の官能基を有し、それぞれの官能基は、２個の別個の分子の一個と共有結合を形成し、または同じ分子中の２個の別個の基の間に共有結合を形成することができる（すなわち、これらは、ポリマー周囲を取り巻くこともできる「ループ」を形成するであろう）。例示的なリンカーには、２個の担体タンパク質を架橋することができる二官能性リンカーが含まれる。架橋は、抗原と担体タンパク質間にも生じうる。
【００４７】
本明細書で使用する「抗原」は、抗体または抗体フラグメントが特異的に結合する、任意の分子または分子の組合せを意味する。
【００４８】
本明細書で使用する「二官能性リンカー」は、２個の官能基を有する化合物を意味し、それらの官能基は、それぞれ別々に、２個の別個の分子、原子、または分子集合体と共有結合を形成することができる。例示的な二官能性リンカーについては、例えば、G. T. Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996)およびDick and Beurret (Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal 10:48−114, 1989)が記載している。二官能性リンカーは、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルが望ましい。
【００４９】
本明細書で使用する「リンカー」は、２個以上の分子を共有結合する、化合物または化学結合を意味する。望ましくは、リンカーは、グルタルアルデヒドまたは式
【化３】
【００５０】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物である。結合は、結合分子を使用せず、直接的であってよい。例えば、タンパク質のカルボキシル基は、カルボジイミド化学を使用して直接的に、またはこの種類の架橋を触媒するトランスグルタミナーゼを使用し、酵素的に、そのアミノ基と直接結合することができる。
【００５１】
「抗体の産生をブーストする」とは、「ブースター応答」と称する、２回目の抗原への曝露中に生じる記憶Ｂ細胞の活性化を意味し、結果として抗体の産生を持続させる持続性「二次的」記憶免疫応答をさす。
【００５２】
「担体タンパク質」は、そのタンパク質自体および／または担体タンパク質と複合体を形成する抗原に対して免疫応答を引き出す、ワクチンに使用されるタンパク質を意味する。望ましくは、担体タンパク質によって複合体中に捕捉されることによって、抗原は担体タンパク質と非共有結合する。それにもかかわらず、抗原と担体タンパク質が互いに共有結合することも可能である。望ましくは、担体タンパク質は、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを含む。同様に「担体タンパク質」の定義に包含されるものは、分枝鎖ペプチドの多抗原ペプチド（ＭＡＰ）である。ＭＡＰにはリジンを含めるのが望ましい。例示的な望ましい担体タンパク質には、（化学的または遺伝子的）、毒素および変異体でありうるトキソイドが含まれる。望ましくは、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（および関連分子）、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼ、またはリンカーにより架橋できる別の任意のタンパク質である。
【００５３】
「ＤＮＩ」は、Bensonら,(Biochemistry 37:3941−3948, 1998)が記載したように、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の変異形であるドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）タンパク質を意味する。
【００５４】
抗原に関して本明細書で使用する「捕捉される」は、生理学的状態下で担体タンパク質と共に複合体に留まっている抗原を意味する。望ましくは、抗原と担体タンパク質間にさほど共有結合が存在しない状況で、抗原は担体タンパク質によって複合体中に捕捉される。本明細書で使用する、さほど共有結合が存在しないということは、その抗原の５０％以下が担体タンパク質と共有結合していることをさす。望ましくは、その抗原の４０％以下、３０％以下、１０％以下、または５％以下が担体タンパク質と共有結合している。
【００５５】
「感染」は、微生物、例えば細菌、菌類、寄生虫、またはウイルスが、被験体に侵襲することを意味する。感染は、例えば、被験体身体中もしくは被験体身体上に通常存在する過剰な微生物の増殖、または被験体中もしくは被験体上に通常存在しない微生物の増殖を含む。過剰量の微生物集団が、被験体の身体中または身体上に存在するとき、あるいは微生物集団の存在が、被験体の細胞を損傷し、または被験体の組織に病理学的症状をもたらすとき、被験体は微生物に感染している。
【００５６】
「感染病原体」は、感染をもたらす微生物を意味する。
【００５７】
「免疫原性物」は、被験体で免疫応答を誘発する化合物を意味する。望ましくは、免疫応答は、ＩｇＧ抗体の産生を含むＴ細胞依存性免疫応答である。
【００５８】
「微生物」は、被験体で感染を引き起こすことが可能な細菌、菌類、寄生虫、またはウイルスを意味する。
【００５９】
「微生物の莢膜ポリマー」は、微生物の莢膜被膜中または被膜上に存在するポリマーを意味する。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、有機ポリマー、例えば、多糖、ホスホ多糖；アミノ糖がＮアセチル置換されている多糖；スルファニル化糖、別の硫酸修飾糖、またはリン酸修飾糖を含む多糖；ポリアルコール、ポリアミノ酸、タイコ酸、およびリポ多糖のＯ側鎖である。
【００６０】
「モノマー」は、モノマーなどと２個以上の結合を形成することができる分子構造を意味し、「ポリマー」部分である場合、繰り返しモノマー下部構造の鎖または一連の分枝連結鎖をもたらすことが多い。
【００６１】
「有機ポリマー」は、共有結合したモノマーであって、それぞれが以下の原子：炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸の３個以上を有するモノマーから構成されたポリマーを意味する。有機ポリマーは、多糖、ホスホ多糖；アミノ糖がＮアセチル置換されている多糖；スルファニル化糖、別の硫酸修飾糖、またはリン酸修飾糖を含む多糖；糖、ポリアルコール、ポリアミノ酸、タイコ酸、およびリポ多糖のＯ側鎖が望ましい。
【００６２】
「ポリアルコール」は、カルボニル基が、一級または二級ヒドロキシル基に還元されている炭水化物の水素化形を意味する。例示的なポリアルコールは、ポリ酸化アルキレン（ＰＡＯ）、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）；ポリ−ビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物；ポリスチレン−ｃｏ−リンゴ酸無水物；カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース；キトサン加水分解物；ヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプンなどのデンプン；グリコーゲン；アガロースおよびその誘導体；グアールガム；プルラン；イヌリン；キサンタンガム；カラギナン；ペクチン；アルギン酸加水分解物；ソルビトール；グルコース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、グロース、キシロース、トレオース、ソルボース、フルクトース、グリセロール、マルトース、セロビオース、スクロース、アミロース、アミロペクチンのアルコール；またはモノプロピレングリコール（ＭＰＧ）である。
【００６３】
「ポリアミノ酸」は、ペプチド結合によって連結した少なくとも２個のアミノ酸を意味する。望ましくは、ポリアミノ酸は、反復性アミノ酸配列または同じアミノ酸の鎖を含むペプチド（すなわちホモポリマー）である。
【００６４】
「シッフ塩基を還元する」とは、シッフ塩基の二重結合を水素原子で飽和させる還元剤に、アゾメチンまたは式Ｒ１Ｒ２Ｃ＝Ｎ−Ｒ３（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、典型的には炭素原子を含む化学的下部構造である）の化合物を曝露することを意味する。還元方法は、当業者には公知である。
【００６５】
抗体もしくはそのフラグメントに関して本明細書で使用する「特異的に結合する」とは、等量の別の任意のタンパク質に比べて、特定のタンパク質、例えば抗原に対して、抗体もしくは抗体フラグメントの親和性が高いことを意味する。望ましくは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的方法を使用し定量した場合、抗体もしくは抗体フラグメントは、関連抗原を含む別の任意の抗原の等量に対する親和性よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、３０倍、または１００倍高い親和性をその抗原に対して有する。
【００６６】
「被験体」は、微生物が感染する可能性がある動物を意味する。望ましくは、被験体は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマである。望ましい実施形態では、被験体は、ヒト、例えばヒト児童である。望ましくは、被験体は、ヒト小児、乳児、または思春期前の児童である。
【００６７】
「Ｔ細胞非依存性抗原」は、Ｔリンパ球の協力なしに抗体を生じる抗原を意味する。望ましくは、Ｔ細胞非依存性抗原は、Ｔリンパ球の協力なしに直接Ｂリンパ球を刺激する。例示的な望ましいＴ細胞非依存性抗原には、莢膜抗原のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、アルギン酸（algenate）、デキストラン、多糖（ＰＳ）、ポリアミノ酸、ポリアルコール、および核酸が含まれる。
【００６８】
利点
既存のワクチン技術と比較して、本発明のワクチンは、製造が簡単であり、化学的問題を起こしにくく、免疫学的問題も起こしにくく、それほど高価ではなく、異なる目的の抗原と担体タンパク質に対して、抱合体技術よりも適応性が高く、多価ワクチン（複数の抗原に対して防御的なワクチン）の創出に、より柔軟性がある。
【００６９】
本発明のワクチンは、担体タンパク質と、免疫応答を誘起させるための抗原との間に共有結合を必要とせず、従って抱合型ワクチン技術と比較して、その作製方法は簡単になり、その調製コストは低下する。発展途上国では、多糖（ＰＳ）−タンパク質抱合型ワクチンを製造販売するのは法外に高価であり、それぞれのワクチンに要求される高度に専門化された化学、およびＰＳと担体タンパク質の製造精製コストのために、従来の抱合型ワクチンを安価に製造するのは難しい。
【００７０】
本発明のワクチンはまた、かつては難治性であった抗原に対して、免疫を安全に誘発することができるワクチンの必要性にも対処するものである。そのようなワクチンは、一価（一免疫応答を誘発する単一抗原を有する）であっても、または多価（複数の免疫応答を誘発する複数の抗原を有する）であってもよい。ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンドを含むワクチンは、難治性抗原にせよそうでないにせよ、免疫応答を誘起することは分かっているが、安全性が低い傾向がある。なぜなら、ＴＬＲリガンドは、しばしば、炎症誘発性であり、小用量であっても有毒で、反応誘発性（reactogenic）もあり、本発明のワクチンと比較して有害な症状をもたらす可能性が高いからである。
【００７１】
以下、発明を実施するための最良の形態、図面、および特許請求の範囲から、本発明の他の特徴および利点を明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＰＳと担体タンパク質破傷風トキソイド間に産生された抱合体に対して、抱合型ワクチンにより抗ＰＳ ＩｇＧ免疫応答を誘発する、非限定的に提案される経路の概略図である。このモデルでは、ＰＳを認識する抗体受容体を提示するＢ細胞のみがＰＳ−タンパク質抱合体に結合する。従って、担体タンパク質は、正確なＰＳ結合特異性を提示するＢ細胞の表面と結合する。
【図２】架橋について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および抗ＰＡ抗血清によるウェスタンブロッティングにより、ＰＣＭＶおよび対照調製物をモニターしたウエスタンブロット分析の画像である。ＤＮＩタンパク質は、グルタルアルデヒド架橋前に８４ｋＤａで泳動する。ＰＣＶＭ１〜ＰＣＭＶ３（レーン１〜３）は、２２０ｋＤａを超える分子量でのバンド泳動により実証されるように、ＤＮＩタンパク質の広範な架橋を示す。ＰＧＡ非存在下で架橋させたＤＮＩタンパク質のみでも、同じ高分子量種が見られる（レーン５）。それに反して、ＰＧＡと混合したが、グルタルアルデヒドで処理しなかったＤＮＩでは、ＤＮＩと共泳動するバンドまたは低分子量種（レーン４）が見られる。
【図３】３種のＰＣＭＶ調製物（ＰＣＭＶ１〜ＰＣＭＶ３；調製物１〜３）および２種の抗原対照調製物４および５で免疫化したマウスで、ＩｇＭおよびＩｇＧ特異的抗ＤＮＩ免疫応答を測定するために使用した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。ＤＮＩタンパク質は、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔ）で架橋しなかった対照調製物４を除き、全ての調製物で高度に免疫原性であった。しかし、これらのＤＮＩ特異的免疫応答は排他的にＩｇＧを基礎とした。免疫化７日目でさえも抗ＤＮＩ ＩｇＭは検出されなかったが、顕著な抗ＤＮＩ ＩｇＧの応答が、１７日目までにＰＣＭＶ調製物で免疫化したマウス、および架橋ＤＮＩのみ（調製物５）で免疫化したマウスで検出することができた。調製物４を含む全ての調製物について、３０日目にＤＮＩに対して強力なブースター応答が認められた。
【図４】３種のＰＣＭＶ調製物（ＰＣＭＶ１〜ＰＣＭＶ３；調製物１〜３）および２種の抗原対照調製物４および５で免疫化したマウスで、ＩｇＭ特異的抗ＰＧＡ免疫応答を測定するために使用した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答は、莢膜ポリマーに典型的なパターンを示した。対照調製物４では、７日目に検出可能な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が生じたが、この応答は１７日目または３０日目にブーストされなかった。全てのＰＣＭＶ調製物で、７日目に抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が誘発され、次いで１７日目および３０日目にさらに強力な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が排他的に発生した。予想通り、対照調製物５（架橋ＤＮＩのみ）では、ＩｇＭまたはＩｇＧのどちらを基礎とする抗ＰＧＡ応答も生じなかった。
【図５】３種のＰＣＭＶ調製物（ＰＣＭＶ１〜ＰＣＭＶ３；調製物１〜３）および２種の抗原対照調製物４および５で免疫化したマウスで、ＩｇＧ特異的抗ＰＧＡ免疫応答を測定するために使用した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。ＰＣＭＶ１〜３では、１７日目に顕著になった、強力なＩｇＧを基礎とした抗ＰＧＡ応答が生じ、次いで３０日目にはっきりとブーストされた。
【図６】免疫化前、およびＤＮＩとアルギン酸を含むＰＣＭＶ（ＤＮＩ−ＡＬＧ Ｃ、ＤＮＩ ＡＬＧ Ａ）、ならびにアルギン酸（algenate）（ＡＬＧ）、デキストラン（ＤＥＸ）、およびＰＧＡと複合体を形成したＤＮＩを含む、「ワンポット」三価ＰＣＭＶ調製物で免疫化後、３０日目のプールした血清のＩｇＭ抗体力価を示すグラフである。
【図７】ＤＮＩとアルギン酸を含むＰＣＭＶ（ＤＮＩ−ＡＬＧ Ｃ、ＤＮＩ ＡＬＧ Ａ）、ならびにアルギン酸（algenate）（ＡＬＧ）、デキストラン（ＤＥＸ）、およびＰＧＡと複合体を形成したＤＮＩを含む、「ワンポット」三価ＰＣＭＶ調製物で免疫化後、６０日目の抗原特異的血清ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである。
【図８】ＤＮＩとアルギン酸を含むＰＣＭＶ（ＤＮＩ−ＡＬＧ Ｃ、ＤＮＩ ＡＬＧ Ａ）、ならびにアルギン酸（algenate）（ＡＬＧ）、デキストラン（ＤＥＸ）、およびＰＧＡと複合体を形成したＤＮＩを含む、「ワンポット」三価ＰＣＭＶ調製物で免疫化後、１２８日目の抗ＰＳ ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである。
【図９】AおよびBは、米国菌培養収集所より入手し、Merck社が製造した、またはSerum Institute of India（ＳＩＩ）社より入手した肺炎連鎖球菌多糖（ｐｓｓ）を使用したＩＬ−６アッセイを示すグラフである。
【図１０】ＳＩＩより入手したｐｓｓ ６Ｂ中の混入物質は、処理２（１Ｍ ＮａＯＨ中８０℃で１時間インキュベーション）を使用し除去できることを示すグラフである。処理１は、多糖からタンパク質を除去するための一連の５種のフェノール抽出物である。
【図１１】ｐｓｓ ６Ｂを含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）よりも有効であることを示すグラフである。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、ＤＴ＝ジフテリア毒素、ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、およびＴＴｘ＝破傷風トキソイド。
【図１２】ｐｓｓ ６Ｂを含むＰＣＭＶが、ＩｇＭの産生誘発では、Prevnar（登録商標）と同程度に有効であることを示すグラフである。
【図１３】ｐｓｓ ６Ｂを含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）よりも有効であることを示すグラフである。
【図１４】ｐｓｓ １４を含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）とほぼ同等であることを示すグラフである（ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、ＴＴｘ＝破傷風トキソイド）。
【図１５】ｐｓｓ １４を含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）とほぼ同等であることを示すグラフである（ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、ＴＴｘ＝破傷風トキソイド）。
【図１６】ｐｓｓ １４を含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）とほぼ同等であることを示すグラフである（ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、ＴＴｘ＝破傷風トキソイド）。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、Ｔ細胞非依存性抗原、または通常、弱い免疫応答を引き出す抗原、例えば、多糖（ＰＳ）、ポリアルコール、ポリアミノ酸、および他の有機ポリマーなどに対して、免疫を提供するためのワクチン組成物、およびそのような組成物を製造し投与する方法を特徴とする。本発明のワクチンは、典型的なＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンの強力な免疫学的特性を有しているが、望ましくは、目的の抗原、例えばＰＳもしくは莢膜有機ポリマーと、担体タンパク質との結合に顕著な共有結合性原子結合は必要とされないという点で抱合型ワクチンと異なる。むしろ、目的の抗原、例えばＰＳもしくは莢膜有機ポリマーは、担体タンパク質によって捕捉されている。例えば、タンパク質マトリックスは、ＰＳもしくは莢膜有機ポリマーなどの溶解性抗原の存在下、担体タンパク質分子同士を共有結合的に架橋することにより形成されうる。これらのワクチンを、タンパク質マトリックスワクチンと称する。互いに高度に架橋している担体タンパク質は、抗原の捕獲、その抗原の取込み、および免疫細胞中での抗体産生の刺激を促進できるマトリックスを形成することができる。担体タンパク質マトリックスは、抗原を封入した「メッシュ」、または抗原が「糸」であり、タンパク質もしくは架橋したタンパク質複合体が、この例では「ビーズ」である、一連の「糸に通したビーズ」の形であってよい。担体タンパク質が、抗原を取り囲んで抗原の周囲に環を形成している場合、または抗原がその中に絡み取られている三次元メッシュを形成している場合、抗原は担体タンパク質に捕捉されている。また、担体および抗原は、例えば、担体タンパク質と抗原鎖中の内鎖（intra−chain）との架橋によって架橋していてもよい。望ましい実施形態では、抗原と担体タンパク質は非共有結合している。そのような非共有結合には、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合が含まれうる。非共有結合には、抗原とタンパク質複合体を非共有結合させる物理的幾何的配置（上記に類似する「糸に通したビーズ」を参照）を含めることができる。
【００７４】
抗原を捕捉するのに、担体タンパク質は、担体タンパク質自体と架橋しなくてもよい。抗原は、例えば、担体タンパク質と抗原を水溶液に混合し、担体タンパク質を沈殿させ、それによって抗原とタンパク質とを共沈殿させることによって捕捉することもできる。抗原はまた、抗原と担体タンパク質の混合物から、化合物（例えば、ミョウバン、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ポリホスファゼン、または疎水性もしくはイオン性相互作用によって操縦される親和性をタンパク質に対して有する他のポリマー）を沈殿させることによって、担体タンパク質により捕捉することもできる。タンパク質を沈殿させる方法は、当技術分野で標準的であり、中でも、例えば（１）混合物のｐＨを変化させる方法、（２）混合物の無機塩濃度を上昇させ、または低下させる方法により、溶液のイオン強度を変化させる方法、（３）または混合物に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または硫酸アンモニウムを加える方法、（４）混合物を加熱して、タンパク質を凝固させる（すなわち、沈殿物またはゲルが形成される）方法、（５）混合物中のタンパク質を不溶性にする方式で、そのタンパク質を化学的に修飾する方法、および（６）タンパク質の架橋および／または沈殿を引き起こすために、タンパク質溶液に、十分な線束の電離放射線（紫外線、γ線、またはβ線）を照射する方法が含まれる。
【００７５】
病原体の莢膜型タンパク質を使用する場合、そのようなワクチンは、タンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）と称する。実施例に記載するように、Ｔ非依存性莢膜抗原モデルをベースとするＰＣＭＶ、ポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）をベースとするＰＣＭＶ、およびアルギン酸（algenate）およびデキストランをベースとするＰＣＭＶ、および例示的な担体タンパク質であるＤＮＩをベースとするＰＣＭＶを含むＰＣＭＶを生成した。ＰＧＡ ＰＣＭＶは、大量生産が簡単であり、ＰＧＡ−タンパク質抱合型ワクチンに典型的な免疫応答を誘発することが判明した。本発明のワクチンは、任意の目的の抗原の存在下、多くの可能な担体タンパク質のいずれかと架橋させるための、多くの可能なリンカーのいずれかを使用し調製してよい。例示的であり好ましいリンカー、担体タンパク質、および目的の抗原を本明細書に記載する。
【００７６】
多糖（ＰＳ）は、サッカライド（糖）のポリマーである。莢膜由来のＰＳは、莢膜を有する細菌病原体、例えば、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、チフス菌、およびインフルエンザ菌Ｂ型に対する防御免疫に関わる一次抗原成分である。微生物のＰＳをベースとするワクチンで、青年期の人および成人を免疫化することは、疾患の負担の軽減で成功しているが、小児および幼児（すなわち２４ヵ月齢未満の児童）に防御免疫を提供するには、あまり有効ではないことが証明されている。児童は、成熟適応免疫レパートリーがまだ発達しておらず、そのような若年のワクチン接種者では、莢膜ＰＳなどのＴ細胞非依存性抗原も免疫原性が低く、長期防御免疫応答（すなわち免疫学的記憶応答）はもたらされない。
【００７７】
ＰＳなどのＴ細胞非依存性抗原は、ＰＳとタンパク質とを化学的に結合させることによって、Ｔ細胞依存性抗原に転換することができ、この過程を「抱合」と呼び、ＰＳ構造中の原子と、「担体」タンパク質中に存在するアミノ酸の側鎖原子との間の共有結合の形成が含まれる。そのような「抱合型ワクチン」は、Ｂ細胞の成熟およびアイソタイプスイッチの誘発をより効率よく促進し、正確な抗ＰＳ防御プロフィールを備えた極めて高いレベルの抗体がもたらされる。防御抗体は、それらのＰＳ抗原に対して親和性が高く、典型的には、補体固定およびオプソニンエフェクター活性を備えた長期持続型抗体である、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスのものがある。
【００７８】
ＰＳと担体タンパク質破傷風トキソイド間に生成された抱合体により、抗ＰＳ ＩｇＧ免疫応答が誘発される例示的で非限定的な経路を図１に示す。このモデルでは、ＰＳを認識する抗体受容体を提示するＢ細胞のみが、ＰＳ−タンパク質抱合体と結合する。従って、担体タンパク質は、正確なＰＳ結合特異性を提示するＢ細胞の表面と結合する。タンパク質−ＰＳ複合体は、これらのＢ細胞によって細胞内液胞区画に取り込まれ、そこで担体はタンパク質分解によって処理される。担体タンパク質由来ペプチドは、輸送され、ＭＨＣ−クラスＩＩ受容体（ＭＨＣ-ＩＩ）提示溝に装填される。このＭＨＣ-ＩＩ−担体ペプチド複合体は、Ｂ細胞表面に提示される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＭＨＣ-ＩＩ−ペプチド複合体を認識すると、Ｔ細胞は活性化しサイトカインを分泌するが、このサイトカインは、Ｂ細胞分化を誘発するための「補助」を提供する。Ｂ細胞は、数が増大し、次いで抗体を分泌する「形質細胞」に分化する。初期には、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）は、形質細胞によって産生されるが、最終的にはＴ細胞は、その形質細胞がクラス替えし、ＩｇＧなど、他のアイソタイプクラスの抗体を産生するのを助ける。この過程は形質細胞で継続し、変異を変化させ、ＰＳ−タンパク質抱合体に、よりさらに高い親和性を有する抗体受容体を生成させる。抗原は一掃されるので、高親和性形質細胞のみが、循環中に残存する残留ＰＳ−タンパク質抱合体によって活性化される。形質細胞のＴ細胞依存性成熟の過程は継続し、ＩｇＧクラスの高親和性抗体を産生する血漿細胞集団が増殖する。免疫化した被験体、例えばヒトの血清中の抗ＰＳ ＩｇＧ抗体レベルを測定することによって、その増殖は容易にモニターすることができる。
【００７９】
最終的に、成熟およびスイッチ過程によって、持続性であり、ＰＳに特異的な記憶Ｂ細胞が産生される。記憶Ｂ細胞は、ＰＳに曝露されると、直ちに活性化が可能であるという特有の性質を有する。活性化すると、記憶Ｂ細胞は増幅し、直ちに抗ＰＳ ＩｇＧを産生する。二回目のＰＳ抗原への曝露中に生じる記憶Ｂ細胞の活性化は、「ブースター応答」と称し、持続性の「二次的」記憶免疫応答を示すものである。一回目の免疫化によって、ＩｇＭ抗体と、いくらかのＩｇＧ抗体が産生の刺激を受けうる。二回目の免疫化、すなわち「ブースター」ショットによって、一回目の免疫化によって既にプログラムされた記憶細胞が、多量のＩｇＧを産生するように刺激される。記憶免疫応答である。
【００８０】
一般的に、Ｔ細胞非依存性抗原は、持続性の免疫、すなわちＩｇＧ抗体の産生は刺激せず、ＩｇＭ抗体の産生は刺激しうるが、余り強力ではなく時間も短い。そのようなものとして、通常、ＰＳ抗原単独ではＩｇＧのブースター応答は生じない。しかし、ＰＳ−タンパク質抱合体によって一回目の免疫化が実施されると、ＰＳによってまさにブースター応答がもたらされる。なぜなら、抱合体によって誘発された記憶細胞は、ＩｇＧを産生するように既にプログラムされているからである。実際、ワクチン接種動物もしくはヒトでのブースター応答は、ＰＳを提示する微生物への曝露のために防御応答が模倣されたと考えられる。抱合型ワクチンによる免疫化後何年も、ワクチンが、免疫化された被験体の保護に役立つためには、この長期記憶が重要な意味を持つ。従って、ＰＳ−タンパク質抱合体は、（１）ＰＳ抗原に対して高レベルのＩｇＧを誘発する能力、および（２）ＰＳ抗原に対して記憶免疫応答を誘発する能力に対して評価される。典型的には、ＰＳ抗原はこれらの特性を示さず、従って劣る抗原である。抱合型ワクチンの合成の難しさおよびその生産コストによって、ＰＳに対する免疫応答が防御的であるうる多くの細菌性疾患に向けた抱合型ワクチンの開発が遅れている。
【００８１】
他のＴ細胞非依存性抗原には、アミノ酸ホモポリマー、例えば、ポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）およびポリアルコールが含まれる。実際、ほとんどの生物学的ポリマーはＴ細胞非依存性抗原である。ポリマーは、その化学構造（および従ってエピトープ）の反復的性質のために、それらを認識するＢ細胞上の免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体と架橋することができる。従って、ポリマーは、多糖がするのと同じ方式で、抗ポリマーＩｇＭを産生するようにＢ細胞を活性化することができる。例えば、アミノ酸ホモポリマーである炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は、免疫原性が低く、同様にＴ細胞非依存性抗原である莢膜ポリマーである。タンパク質担体と抱合したＰＧＡから構成されるワクチンは、免疫原性が高く、抗ＰＧＡ ＩｇＧを誘発し、およびＰＧＡに対して免疫学的記憶を誘発することができる。従って、ほとんどのポリマーは、その免疫原性の点でＰＳのように応答する。なぜなら、それらのポリマーは、ＭＨＣ-ＩＩと関連して処理することも、提示することも不可能で、それによってＴ細胞補助を召集することができないからである。一例外は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と称する、別の受容体クラスと相互作用する数種の自然発生ポリマーに見出される。一度活性化されると、ＴＬＲは、宿主細胞によるサイトカインの産生を誘発し、適応免疫応答を変化させることができる。いくつかのＰＳは、ＴＬＲリガンドと共有結合し、またはそのようなリガンドが混入している。例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）は、免疫原性が高く、ＩｇＧおよび記憶応答を誘発するＰＳであり、ＬＰＳの脂質Ａ部分は、ＴＬＲリガンドであり免疫学的特性を担いうる。
【００８２】
別の実施例では、数種の肺炎球菌ＰＳは、たとえタンパク質担体に結合していなくても、ＩｇＧへのアイソタイプスイッチを誘発するという点で、抱合型ワクチンの免疫学的特性のいくつかを示すことが判明している。近年、肺炎連鎖球菌の様々な株由来の個々のＰＳと同様に、市販の多糖ワクチンPneumovax−23にも、ＴＬＲリガンドが混入していることが判明した（Senら, J. Immunol. 175:3084−3091, 2005）。この知見から、これらのＰＳ調製物が、タンパク質抱合体の非存在下で、ＩｇＧへのアイソタイプスイッチを誘発できる理由が説明されよう。これらの肺炎球菌ＰＳは、マクロファージによるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌を誘発した。しかし、フェノール抽出によりＰＳをさらに精製すると、マクロファージからのサイトカインの分泌が阻害された。免疫化の研究では、フェノール抽出したＰＳは、免疫原性が低く、もはや抗ＰＳ ＩｇＧを誘発しなかった。従って、このＰＳ調製物のこれらの異常な免疫原性特性の原因である混入分子は、フェノール抽出によって除去する。混入分子は、マクロファージでＴＬＲ依存性サイトカイン応答を活性化する能力が付与されたＴＬＲリガンドであると思われる。フェノール抽出によりさらにＰＳを精製すると、混入するＴＬＲリガンドが除去され、ＰＳは完全にＴ細胞非依存性になった。
【００８３】
上の例は、タンパク質と炭水化物との共有結合なしに、ＰＳ抗原が、抱合体ＰＳ−タンパク質抗原のように働きうることを例示している。遺憾ながら、ＴＬＲリガンドは、通常炎症誘発性である。例えば、ＬＰＳは、小用量であっても有毒である。従って、ＴＬＲリガンドとＰＳとを混合すると、ＰＳに対する免疫応答は広がるかもしれないが、この手法は、反応誘発性であるワクチンを産生する可能性も高く、ワクチン接種者に有害な症状を引き起こす可能性も高い。抱合型ワクチン技術には、所望の範囲の免疫原性と安全性を備えたＰＳワクチンの生産に向けた選択方法が残されている。
【００８４】
ＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンの開発によって、浸潤性細菌病原体によって生じる小児期疾患の負担は著しく軽減された。先進世界では、インフルエンザ菌Ｂ型およびある種の髄膜炎菌株や連鎖球菌株に対するワクチンを含め、一握りのそのようなワクチンが市販されている。開発途上世界では、これらのＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンを製造販売するには法外に高価である。例えば、市販の七価肺炎球菌抱合型ワクチンは、一用量当たり約５８ドル（２００６年、米ドル）かかり、４用量治療計画が必要となる。費用だけでも、このワクチンは、疾患の負担を抱えている発展途上国の人々の手に届かないものになっている。
【００８５】
従来の抱合型ワクチンは、関与する化学、およびＰＳと担体タンパク質の製造精製費用のせいで安価に生産するのは困難である。通常、ＰＳと担体タンパク質のどちらも、妥当な結合効率で抱合化学を実施できるようになる前に、非常で純粋でなければならない。通常、様々なＰＳに対して結合化学を実施する必要があり、それは選択したＰＳおよび担体タンパク質の化学に特有なものである。この結合化学によってＰＳ中に官能基が導入され、次いで典型的にはリジン残基のイプシロンアミノ側鎖を通じて、その官能基を担体タンパク質に連結することができる。そのような結合基が導入されるようにＰＳを化学的に修飾することによって、ＰＳ上のエピトープを破壊し、（例えば、リンカーまたは修飾糖基と結合された）新規なエピトープを導入でき、その重要性は、注意深く免疫学的分析を実施することによってのみ、評価することができる。さらに、従来のＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンについては、ＰＳのサイズ、１タンパク質担体分子当たりに結合しているＰＳ分子数、選択した担体の性質、および連鎖化学の種類が全て、抱合型ワクチンの免疫原性に作用する可能性がある。そのようなものとして、例えば、９０＋の既知の血清型のそれぞれが、異なるＰＳ構造を有する肺炎球菌疾患の場合には（Bentleyら, PLOS Genetics 2(3):e31 262−269, 2006）、全ての血清型に対して、ただ一つの抱合方法では適切ではないであろう。再現性免疫学的特性を有する抱合型ワクチンを再現可能に合成するには、ＰＳのサイズ、１タンパク質担体分子当たりに結合しているＰＳ分子数、選択した担体の性質、および連鎖化学の種類を注意深く制御する必要があり、翻って、これにより、抱合型ワクチンの製造費用が劇的に増大している。
【００８６】
抗生物質耐性の出現は、安全かつ有効なワクチンの開発の緊急性に光を当てるものである。特に発展途上国の人々にとって広く入手できるワクチンを製造するためには、ワクチン製造は費用効率も高くなければならない。小児期免疫化治療計画に、１種もしくは複数の菌種の異なる血清由来の多くの多糖抗原に対する混合抱合型ワクチンを取り入れることは、その高危険性集団でのワクチン投与を簡略化するはずである。しかし、現在の抱合型ワクチン技術は、費用効率が余り高くなく、従って混合抱合型ワクチンを開発途上世界まで届けるのは実質的に不可能である。実際、強力な確立された市場を有する先進世界においてさえ、近年のWyeth七価抱合体肺炎球菌ワクチンの供給不足は、複合体抱合型ワクチン合成技術を必要とするワクチンを産生し備蓄するのがいかに困難であるかを例示している。
【００８７】
望ましい実施形態では、本発明のワクチンは、１種または複数の細菌の莢膜成分を多価担体タンパク質マトリックスに捕捉している多価莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）である。出発物質としては、ほんの中程度に純粋な目的の抗原、例えば莢膜が必要とされるので、ＰＣＭＶは、容易に生産することができる。例えば、Vedanポリγ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は純粋ではない（ＤＮＩ上で活性なプロテアーゼを担持する）が、本明細書に記載したように、Ｔ細胞非依存性抗原に対して予想通り厳密に作働した（実施例１）。ＰＣＭＶ中へのＰＧＡの取り込みは、そのタンパク質対ＰＧＡの割合が７倍の範囲にわたって異なる全３種のＰＣＭＶ調製物で成功した。
【００８８】
本発明のワクチンの作製方法は、目的の抗原、例えば莢膜多糖の化学のいかなる知識も必要としないので、本方法は、目的の抗原および担体タンパク質の化学に適合する架橋化学を開発する必要性に捕らわれない。いくつかの抗原が、それにもかかわらずリンカーと相互作用しうるという恐れもあるが、これによってワクチンの効力が下がってはならない。目的の抗原と担体タンパク質の意図しない架橋は、ともかく免疫原性特性を有することが予期されるからである。本発明のワクチンでは、目的の抗原と担体タンパク質の架橋は、ワクチンが有効であるための要件ではない。これは、従来の抱合型ワクチンと際立って対照的であるが、抱合型ワクチンは、そのために製造および開発が阻止されている。望ましくは、本発明のワクチンは、担体タンパク質の少なくとも、例えば１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらには１００％が架橋し、目的の抗原の、例えば１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、または９０％以下を担体タンパク質と架橋させる。望ましくは、抗原の１０％以下を担体タンパク質と架橋させ、担体タンパク質の少なくとも５０％を架橋させる。
【００８９】
本明細書に記載したワクチンの製造方法は、目的の抗原、例えば莢膜ポリマーを甚だしく変化させることはない。一般的に、抗原は、還元糖をポリマー鎖の末端にそのような基を有するＰＳ莢膜用に還元するなど、可能な修飾を有して同じ状態で残存する。そのようなマイナーな修飾は、ほとんどの莢膜ＰＳの免疫原性に影響しないと思われる。なぜなら、末端糖は、ポリマーの内部残基の１／１００〜１／１０００と少ないからである。それに反して、従来の抱合型ワクチンでは、通常、莢膜ポリマーなどの抗原に、リンカー基を導入しなければならず、それは、担体タンパク質の共有結合の接着点として役立つ。莢膜ポリマーなど、多くの抗原は、その構造の一部としてカルボキシル基またはアミノ基などの反応基を有していないので、リンカーを使用する必要がある。例えば、リンカー化学をＰＳに導入すると、莢膜のエピトープが破壊され、新規なエピトープを開発することができるが、その新規なエピトープは、宿主自己エピトープとの未知の免疫学的交差反応性のために、ワクチン生成物では望ましくないであろう。
【００９０】
本明細書に記載したワクチンの製造方法は、その化学が、担体タンパク質（例えば、ＤＮＩ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素フラグメントＣ、または大腸菌β−ガラクトシダーゼ）の架橋化学のみに依存するので、抱合型ワクチン技術よりも複雑ではない。例えば、莢膜ポリマーは、ＤＮＩと混合すると架橋率が影響するが、架橋のパターンもしくは程度には影響されず、それらは、使用したタンパク質、その濃度、および添加した架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）濃度に、より大きく支配される。これらのパラメーターは、容易に調整することができ、それによってワクチンの製造に必要な時間および努力が低減し、かつ費用が節約される。
【００９１】
本明細書に記載したＰＣＭＶワクチンの製造方法は、任意の抗原、例えばあってもごくわずかのアミノ基を有する、任意の莢膜ポリマーもしくは任意のポリマー；および架橋すること可能な任意の担体タンパク質、例えば、水素化ホウ素還元によって破壊されうる重要なエピトープを有しない担体タンパク質と共に使用することができる。本明細書記載の方法で使用してよい担体タンパク質は、望ましくは少なくとも２個のリジン残基、または阻害されていない残基および化学的修飾によって架橋可能な他の残基を有する。破傷風トキソイドは可能な一担体タンパク質である。この毒素は、タンパク質のアミノ基と反応する試薬であるホルムアルデヒドで処理することによって解毒する。他の望ましい担体タンパク質には、コレラ毒素Ｂサブユニット（SBL Vaccin ABより入手可能）、ジフテリア毒素、破傷風毒素フラグメントＣ（Sigma Aldrichより入手可能）、ＤＮＩ、または大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（Sigma Aldrichより入手可能）が含まれる。
【００９２】
現在の多価抱合型ワクチンは、まず個々の抱合型ワクチンを合成し、続いてそれらを混合して「カクテル」抱合型ワクチンを生成することによって作製される（例えば、Wyeth七価肺炎球菌ワクチン、Prevnar（登録商標））。多価ワクチンを製造するために、本発明のワクチンの製造方法は、担体タンパク質を架橋する前に、莢膜有機ポリマーなどの化学的に異なる抗原と、例えばグルタルアルデヒドとを一緒に混合すること、または別々に合成した本発明の特定のワクチンを混合することによって使用できる。この柔軟性は、現在の多価ワクチン製造法に著しく勝る。
【００９３】
実施例に記載した本発明の例示的なワクチンであるＰＣＭＶワクチン＃１〜３は、ＰＧＡ分子およびＤＮＩタンパク質を構成する原子間に、いかなる共有結合も発生しないと予想される方法によって、これらのワクチンを合成したという事実にもかかわらず、抱合型ワクチンのように作働した。グルタルアルデヒドは、リジン残基のイプシロンアミノ基に代表される、タンパク質のアミノ側鎖と排他的に反応する。ＰＧＡポリマーは、遊離アミノ基を含まず、グルタルアルデヒドと反応しないカルボキシル側鎖のみを有する。従って、ＰＣＭＶによって生じた抱合体様免疫応答は、長鎖ＰＧＡ分子が、ＤＮＩタンパク質分子の架橋されたマトリックス中に分子的に捕捉されたことを示す。
【００９４】
非限定的モデルによれば、捕捉は、ＤＮＩタンパク質とＰＧＡをＢ細胞中に運搬する働きをし、そのＢ細胞は、ＰＧＡを免疫学的に認識するＩｇ受容体によって、それらのマトリックスを結合する。一度これらのＢ細胞の内側に取り込まれると、従来の抱合型ワクチンに類似する方式でマトリックスは分解され、これによって、対応するＢ細胞のＭＨＣ-ＩＩ分子上に提示されるＤＮＩ由来ペプチドがもたらされる。次いで、これが、Ｔ細胞補助を召集し、それによってそのようなＢ細胞が増殖し成熟して、ＩｇＧ産生血漿およびＰＧＡ特異的記憶細胞になる。従って、非限定的モデルによれば、ＰＣＭＶは、免疫学的にタンパク質−抱合体莢膜ワクチンのように働くが、ＰＣＭＶは、担体タンパク質と莢膜ポリマー間に顕著な共有結合を有しないために異なる。
【００９５】
ＰＣＭＶを含む本発明のワクチンは、例えば小児用ワクチンで組み合わせて使用してよい。さらに、本発明のワクチンは、例えば、肺炎球菌感染、連鎖球菌（Ａ群およびＢ群）感染、インフルエンザ菌Ｂ型（「ＨｉＢ」）感染、髄膜炎菌［例えばナイセリアメニンギチデス（Neisseria meningitides）］感染に対してワクチン接種するために使用してよく、グラム陰性菌［例えば、緑膿菌、野兎病菌（Thirumalapuraら, J. Med. Microbiol. 54:693−695, 2005；Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res. 339:1643−1648, 2004；Vinogradovら, Carbohydr. Res. 214:289−297, 1991）、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、および大腸菌］のＯ抗原ワクチンとして使用してよい。
【００９６】
本発明のワクチンは、１種もしくは複数の目的の抗原、例えば本明細書に記載した目的の抗原などの存在下で、任意の担体タンパク質、例えば本明細書に記載した担体タンパク質などを架橋するために、任意のリンカー、例えば本明細書に記載したリンカーを使用し作製することができる。１種の目的の抗原を使用する場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンは１価であると言う。複数の目的の抗原を使用する場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンは、多価であると言う。微生物の莢膜ポリマーが目的の抗原である場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンは、タンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）であると言う。
【００９７】
リンカー
架橋担体タンパク質は、当技術分野で周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。
【００９８】
ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーを使用し、直接担体タンパク質を架橋するための一般的方法および部分（moiety）は、例えば、G. T. Hermanson による Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996およびDickおよびBeurretによる Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal 10:48−114, 1989に記載されている。例えば、ｎ個のリジン部分を有する担体タンパク質を用いると、例示的な架橋剤のカルボキシル基との反応に利用できる一級アミン（末端アミンを含む）は理論上ｎ＋１個ある。従って、この直接的抱合手順を使用し、生成物はｎ＋１個のアミド結合の形成に限定される。
【００９９】
本発明の望ましい実施形態で使用されるリンカーは、最も簡単なものでは、２個の担体タンパク質を連結する結合である。リンカーは、直線的、環状、または分枝した分子骨格であってよく、２個の担体タンパク質（Ａ）および（Ｂ）に共有結合で結合するペンダント基を有する。その中に抗原を封入しうる、相互に連結した担体タンパク質マトリックスが創出されるように、任意の所与の担体タンパク質と、複数の担体タンパク質とを連結することができる。
【０１００】
結合基（linkage group）という用語は、リンカー（Ｌ）の反応性部分と、（Ａ）もしくは（Ｂ）の官能基との組合せの結果もたらされる共有結合をさす。結合基の例には、それだけには限らないが、エステル、カルバメート、チオエステル、イミン、ジスルフィド、アミド、エーテル、チオエーテル、スルホンアミド、イソ尿素、イソチオ尿素、イミドエステル、アミジン、ホスホロアミデート、リン酸ジエステル、チオエーテル、およびヒドラゾンが含まれる。
【０１０１】
（Ａ）と（Ｂ）の連結は、（Ａ）および（Ｂ）上に位置する１個もしくは複数の官能基による結合（結合基）の形成を含む、共有結合的手段によって達成される。本目的に使用してよい化学的反応性官能基の例には、それだけには限らないが、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、チオエーテル、グアニジニル、イミダゾリル、およびフェノール基が含まれ、それらの全てが、多くの担体タンパク質中の自然発生アミノ酸中に存在する。
【０１０２】
従って、（Ａ）と（Ｂ）の共有結合は、（Ａ）および（Ｂ）中に存在するそのような官能基と反応することが可能な反応性部分を含むリンカー（Ｌ）を使用し実施しうる。この反応生成物は、（Ｌ）と（Ａ）および（Ｌ）と（Ｂ）を結合する新たに形成された結合を含む結合基である。例えば、（Ａ）のヒドロキシル基は、（Ｌ）のカルボン酸基、またはその活性化した誘導体（下記参照）と反応することができ、結果としてエステル結合基が形成される。
【０１０３】
スルフヒドリル基と反応することが可能な部分の例には、ＸＣＨ２ＣＯ−型（式中、Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）のα−ハロアセチル化合物が含まれ、この化合物は、スルフヒドリル基に特定の反応性を示すが、例えば、Gurd, Methods Enzymol. 11:532, 1967に記載されているように、イミダゾリル、チオエーテル、フェノール、およびアミノ基を修飾するために使用することもできる。Ｎ−マレイミド誘導体も、スルフヒドリル基選択的と考えられるが、一定の条件下では、さらにアミノ基への結合に有用でありうる。アミノ基の転換を通じてチオール基を導入する２−イミノチオラン（Trautら, Biochemistry 12:3266, 1973）などの試薬は、ジスルフィド架橋の形成を通じて連結が生じるならば、スルフヒドリル剤と考えてよい。
【０１０４】
アミノ基と反応すること可能な反応性部分の例には、例えば、アルキル化剤およびアシル化剤が含まれる。代表的アルキル化剤には、以下のもの含まれる。
【０１０５】
（ｉ）α−ハロアセチル化合物。これは、反応性チオール基の非存在下でアミノ基に対して特異性を示し、例えば、Wong (Biochemistry 24:5337, 1979)に記載されているように、ＸＣＨ２ＣＯ−型（式中、Ｘ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）である。
【０１０６】
（ｉｉ）Ｎ−マレイミド誘導体。これは、Michael型反応を通じて、または例えばSmythら,(J. Am. Chem. Soc. 82:4600, 1960 および Biochem. J. 91:589, 1964)に記載されているように、環状カルボニル基への付加によるアシル化を通じてアミノ基と反応させることができる。
【０１０７】
（ｉｉｉ）アリールハロゲン化物。例えば、反応性ニトロハロ芳香族化合物。
【０１０８】
（ｉｖ）ハロゲン化アルキル。例えば、McKenzieら,(J. Protein Chem. 7:581, 1988)に記載されているもの。
【０１０９】
（ｖ）アミノ基とシッフ塩基を形成することができるアルデヒドおよびケトン。形成された付加体は、通常、還元されて安定したアミンがもたらされることにより安定化している。
【０１１０】
（ｖｉ）エピクロロヒドリンおよびビスオキシランなどのエポキシド誘導体。これは、アミノ、スルフヒドリル、またはフェノール性水酸基と反応しうる。
【０１１１】
（ｖｉｉ）ｓ−トリアジンの塩素含有誘導体。これは、アミノ、スフヒドリル（sufhydryl）、およびヒドロキシル基などの求核剤に対して非常に反応性に富む。
【０１１２】
（ｖｉｉｉ）例えば、Ross (J. Adv. Cancer Res. 2:1, 1954)に記載されているような、先に詳述したｓ−トリアジン化合物に基づくアジリジン。これは、開環によりアミノ基などの求核剤と反応する。
【０１１３】
（ｉｘ）例えば、Tietze (Chem. Ber. 124:1215, 1991)に記載されているような四角酸ジエチルエステル。および
（ｘ）α−ハロアルキルエーテル。例えば、Bennecheら,(Eur. J. Med. Chem. 28:463, 1993)に記載されているように、これは、エーテル酸素原子によって生じる活性化のために、通常のハロゲン化アルキルよりも反応性に富むアルキル化剤である。
【０１１４】
代表的なアミノ反応性アシル化剤には、以下のものが含まれる。
【０１１５】
（ｉ）イソシアン酸およびイソチオシアン酸、特に芳香族誘導体。これらから、それぞれ安定した尿素およびチオ尿素誘導体が形成される。
【０１１６】
（ｉｉ）塩化スルホニル。これは、例えば、Herzigら,(Biopolymers 2:349, 1964)に記載されている。
【０１１７】
（ｉｉｉ）酸ハロゲン化物。
【０１１８】
（ｉｖ）ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの活性エステル。
【０１１９】
（ｖ）混合型、対称性、またはＮ−カルボキシ無水物などの酸無水物
（ｖｉ）アミド結合を形成する他の有用な試薬。例えば、M. Bodansky (Principles of Peptide Synthesis, Springer−Verlag, 1984)に記載されているような試薬。
【０１２０】
（ｖｉｉ）アシルアジド。例えば、Wetzら,(Anal. Biochem. 58:347, 1974)に記載されているような、例えばアジド基が、亜硝酸ナトリウムを使用し、プリフォームしたヒドラジド誘導体から生成されているアシルアジド。および
（ｖｉｉｉ）イミドエステル。これは、例えば、Hunter and Ludwig (J. Am. Chem. Soc. 84:3491, 1962)に記載されているような、アミノ基と反応すると安定したアミジンを形成する。
【０１２１】
例えば、グルタルアルデヒドなどのアルデヒドおよびケトンは、アミンと反応させてシッフ塩基を形成でき、このシッフ塩基は還元的アミノ化を通じて有利に安定化させることができる。例えば、Webbら,(Bioconjugate Chem. 1:96, 1990)に記載されているように、アルコキシルアミノ部分は、ケトンおよびアルデヒドと容易に反応して、安定したアルコキサミン（alkoxamines）を生成する。
【０１２２】
カルボキシル基と反応することが可能な反応性部分の例には、ジアゾ酢酸エステルおよびジアゾアセトアミドなどのジアゾ化合物が含まれ、これらは、例えば、Herriot (Adv. Protein Chem. 3:169, 1947)に記載されているように、高い特異性で反応してエステル基を発生する。Ｏ−アシル尿素形成を通じて反応し、続いてアミド結合を形成する、カルボジイミドなどのカルボン酸修飾試薬も使用してよい。
【０１２３】
必要に応じて、（Ａ）および／または（Ｂ）の官能基は、例えば、追加の反応性または選択性を授けるために、反応前に別の官能基に転換してよい。この目的に有用な方法の例には、ジカルボン酸無水物などの試薬を使用し、アミンをカルボン酸に転換する方法；Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸、２−イミノチオラン、またはチオール含有スクシンイミジル誘導体などの試薬を使用し、アミンをチオールに転換する方法；α−ハロ酢酸などの試薬を使用し、チオールをカルボン酸に転換する方法；エチレンイミンまたは２−ブロモエチルアミンなどの試薬を使用し、チオールをアミンに転換する方法；カルボジイミド、続いてジアミンなどの試薬を使用し、カルボン酸をアミンに転換する方法；およびトシル塩化物などの試薬を使用してアルコールをチオールに転換し、続いてチオ酢酸によりエステル交換し、そして酢酸ナトリウムによりチオールへ加水分解する方法が含まれる。
【０１２４】
追加の連結物質を導入しない、（Ａ）の反応性化学基と（Ｂ）の反応性化学基の直接共有結合を含む、いわゆるゼロ長リンカーを必要に応じて本発明に従って使用してよい。例としては、結合基がエステルもしくはチオエステルであるように、（Ｌ）が、（Ａ）の酸素原子と（Ｂ）中に存在するカルボニル部分もしくはチオカルボニル部分とを連結する化学結合を表す化合物が含まれる。例えば、カルボジイミド化学を使用することによって、アミノ基（Ａ）とカルボキシル基（Ｂ）を結合し、Ａ−Ｌ−Ｂ（式中、Ｌはアミド結合である。）またはＮ−Ｒと連結したＲ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒは、同じまたは異なる２個のタンパク質分子のアミノ酸側鎖に由来する炭素鎖である。）を得ることができる。
【０１２５】
しかし、最も一般的には上記のように、リンカーは、スペーサー成分によって結合された２個以上の反応性部分を含む。スペーサーの存在によって、二官能性リンカーが、（Ａ）および（Ｂ）中の特異的官能基と反応できるようになり、結果としてこれらの２個の化合物間に共有結合がもたらされる。リンカー（Ｌ）の反応性部分は、同じであっても（ホモ二官能性リンカー）、または異なっても（ヘテロ二官能性リンカー、または数個の異なる反応性部分が存在するヘテロ多官能性リンカー）よく、（Ａ）と（Ｂ）の間に共有結合をもたらすことができる様々の潜在的試薬が提供される。
【０１２６】
典型的には、スペーサー成分は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは１〜４である）によって、（Ａ）と（Ｂ）を効率的に分離する鎖からなる。
【０１２７】
結合剤によって導入された外因性物質の性質は、究極のワクチン生成物の薬物動態および／または活性と関連しかねない。従って、生分解性であり、または化学的に感受性なスペーサーアーム、あるいは酵素切断部位を組み込むスペーサーアームを含む、切断可能リンカーを導入するのが望ましいことも有りうる。
【０１２８】
これらの切断可能リンカー、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９２／１７４３６（これにより参照により組み込む）に記載されているようなリンカーはインビボで容易に生物分解される。ある場合には、結合基はエステル分解酵素の存在下で切断されるが、そのような酵素の非存在下では安定している。従って、（Ａ）および（Ｂ）は、疾患部位近傍で活性な酵素によって徐々に放出されるように有利に連結する。
【０１２９】
リンカーは、式Ｉの生分解性ジエステル、ジアミド、またはジカルバミン酸基と結合基を形成しうる。
【０１３０】
−−（Ｚ１）ｏ−（Ｙ１）ｕ−（Ｚ２）ｓ−（Ｒ１１）−（Ｚ３）ｔ−（Ｙ２）ｖ−（Ｚ４）ｐ−
［式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４のそれぞれは、独立してＯ、Ｓ、およびＮＲ１２（式中、Ｒ１２は水素またはアルキル基である）から選択され、Ｙ１およびＹ２のそれぞれは、独立してカルボニル、チオカルボニル、スルホニル、ホスホリル、または類似の酸形成基から選択され、ｏ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、およびｖは、それぞれ独立して０または１であり、およびＲ１１は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または−（Ｚ１）ｏ−（Ｙ１）ｕ−（Ｚ２）ｓ−と−（Ｚ３）ｔ−（Ｙ２）ｖ−（Ｚ４）ｐ−を連結する化学結合である］。
【０１３１】
本発明で使用する例示的な望ましいリンカー（Ｌ）は、式ＩＩ〜ＩＩＩのいずれかによって記載され得る。
【化４】
【０１３２】
［式中、リンカーは、両（Ａ）の酸素原子と（Ｂ）の酸素原子に共有結合する。］従って、式ＩＩ〜ＩＩＩのリンカー（Ｌ）は、ジピラン（dipyran）、エステル、またはカルバミン酸結合基を介して、担体タンパク質（Ａ）および（Ｂ）に結合する。これらの実施形態では、Ｒ１３は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは１〜４、または２個の窒素または２個のカルボニルを連結する化学結合を表す）である。
【０１３３】
ヒドラゾン連鎖を形成するように設計されたリンカーは、化学式ＩＶで示される。
【化５】
【０１３４】
［式中、Ｚ５はＯ、Ｓ、またはＮＲ１６から選択され、Ｒ１６は水素またはアルキル基であり、Ｒ１５は水素、アルキル、またはヘテロアルキルから選択され、Ｙ３はカルボニル、チオカルボニル、スルホニル、ホスホリル、または（Ａ）の酸素原子と共有結合している類似の酸形成基から選択され、ｗは０または１であり、Ｒ１４は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは１〜４である）もしくは−（Ｙ３）−（Ｚ５）ｗ−と
【化６】
【０１３５】
を連結する化学結合であり、かつＸ４は、ヒドラジド基を含む（Ｂ）とリンカーＩＩ前駆体との縮合反応から得られたヒドラゾン（その際、Ｘ４はケトン基もしくはアルデヒド基の酸素原子である）である］。
【０１３６】
担体タンパク質
一般に、生理学的条件下で抗原によって捕捉できる任意の担体タンパク質を本発明で使用してよい。望ましくは、抗原は、抗原と担体タンパク質間にさほど共有結合が存在しない状況で、担体タンパク質によって複合体中に捕捉される。さほど共有結合が存在しないとは、その抗原の５０％以下が、担体タンパク質と共有結合していることをさす。望ましい実施形態では、その抗原の４０％以下、３０％以下、１０％以下、または５％以下が、担体タンパク質と共有結合している。抗原／担体タンパク質複合体は、ミョウバンなど、別の化合物を含んでよく、望ましい実施形態では、この別の化合物は、抗原および担体タンパク質を捕捉することができる。
【０１３７】
望ましくは、本発明のワクチンに使用される担体タンパク質は、単独で、または抗原と組み合わさって、被験体で免疫応答を引き出すタンパク質である。望ましくは、担体タンパク質は、Ｔ細胞によって認識される少なくとも一個のエピトープを含む。望ましくは、そのエピトープは、被験体でＴ細胞応答を誘発することができ、Ｂ細胞を誘発して目的の抗原全体に対する抗体を産生する。本発明の説明に使用されるエピトープには、抗体分子もしくはそのフラグメントとの特異的な相互作用を担う抗原上のあらゆる決定基が含まれる。エピトープの決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面群、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、特定の電荷特性と同様に、特定の三次元構造特性を有する。免疫原性特性を有するために、一般的に、タンパク質またはポリペプチドはＴ細胞を刺激することができる。しかし、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを欠く担体タンパク質もまた、免疫原性であり得る。
【０１３８】
強力な免疫原性応答を誘発することが知られている担体タンパク質を選択することによって、本明細書に記載したＰＣＭＶで、多様な被験体集団を処置することができる。担体タンパク質は、本ワクチンに対して強力な免疫応答を誘発するように、十分に外来性であるのが望ましい。典型的には、使用される担体タンパク質は、目的の抗原に対して免疫原性を付与できる分子である。望ましい実施形態では、担体タンパク質は、本質的に免疫原性が高いものである。従って、免疫原性が高く、それと複合体を形成した抗原に対して、抗体産生を最大にできる担体タンパク質が望ましい。
【０１３９】
本発明の様々な担体タンパク質には、例えば、変異体であっても、またはそうでなくてもよい（化学的または遺伝子的）毒素およびトキソイド、例えば、炭疽毒素、ＰＡおよびＤＮＩ（PharmAthene, Inc.）、ジフテリアトキソイド（Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India, Ltd.）もしくはＣＲＭ１９７、破傷風毒素、破傷風トキソイド（Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India, Ltd.）、破傷風毒素フラグメントＺ、緑膿菌外毒素Ａもしくは外毒素Ａ変異体、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌の外膜タンパク質［ＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関、バージニア州Manassas）より入手できる株］、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、およびリンカーにより架橋できる別の任意のタンパク質が含まれる。担体タンパク質は、コレラ毒素Ｂサブユニット（SBL Vaccin ABより入手可能）、ジフテリア毒素（Connaught, Inc.）、破傷風毒素フラグメントＣ（Sigma Aldrichより入手可能）、ＤＮＩ、または大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（Sigma Aldrichより入手可能）が望ましい。他の望ましい担体タンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐ４０、およびニワトリリボフラビンが含まれる。（別段の指示が無い限り、例示的な担体タンパク質はSigma Aldrichより購入することができる）。他の例示的な担体タンパク質は、分枝ペプチドであるＭＡＰ（多抗原ペプチド）である。ＭＡＰの使用によって、架橋密度は、複数の分枝アミノ酸残基のために最大になる。限定しないが、ＭＡＰを形成するために使用できる例示的なアミノ酸はリジンである。
【０１４０】
ＢＳＡとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、動物実験の際に、ワクチン開発で一般に担体として使用されてきた。治療用ワクチンの調製で使用されてきた担体タンパク質には、それだけには限らないが、いくつかの病原性細菌の毒素およびそれらのトキソイドが含まれる。例としては、ジフテリアや破傷風毒素、およびそれらの医学的に許容される対応するトキソイドが含まれる。他の候補は、交差反応性物質（ＣＲＭ）と称する、細菌性毒素に抗原的に類似するタンパク質である。本発明の担体タンパク質には、ヒトに由来せず、かついかなるヒト食物物質にも存在しない、あらゆるタンパク質を含めてもよい。
【０１４１】
本発明の望ましい実施形態では、ＰＣＭＶの生成に、環様構造を形成するタンパク質を使用する。そのようなタンパク質には、緑膿菌のＨｃｐ１タンパク質、コレラ毒素の無害な「Ｂサブユニット」、大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシン、および志賀様毒素が含まれる。そのような環様タンパク質複合体は、直鎖ＰＳ鎖が、これらの環形タンパク質複合体の中心通路を貫通する「糸に通したビーズ」を形成することができる。タンパク質の架橋後、そのような複合体は、特に安定すると予想される。タンパク質の構造データは、これらの中心通路が十分広く、ＰＳ鎖がたやすく進入できることを示唆している。例えば、Ｈｃｐ１六量体環の中心通路は、十分な広く、数個の幅５.５オングストロームの多糖鎖を容易に収容できる４２オングストローム（Angstoms）である（Mougousら, Science 312(5779):1526−1530, 2006）。あるいは、（例えば、特定の物理化学的条件下で、自然に環を組み立てる単量体担体タンパク質のサブユニットから）ＰＳ周囲にタンパク質環を組み立ててもよい。環を組み立てることができるそのような単量体タンパク質は、当技術分野で公知であり、例えば、ニューモリシン（Walkerら, Infect. Immun. 55(5):1184−1189, 1987；Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol. 25(2):222−225, 1987）、リステリオリシンＯ（Kayal and Charbit, FEMS Microbiol. Rev. 30:514−529, 2006；Mengaudら, Infect. Immun. 55(12):3225−3227, 1987）、ＤＮＩ、炭疽ＰＡ、Ｈｃｐ１、コレラ毒素Ｂサブユニット、志賀毒素Ｂサブユニット、フラゲリンが含まれ、多数の関連分子が当技術分野で公知であり、様々な微生物から製造されている。
【０１４２】
別の望ましい実施形態では、担体タンパク質としてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが使用される。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化は、適応免疫応答を形作るのに重要であり、抗体応答、アイソタイプスイッチ、および免疫学的記憶の親和性成熟において一役割を担い得る。コレラ菌のフラゲリン（ＦＬＡ）は、ＴＬＲアゴニストである。２０ｍｇを超えるＦＬＡタンパク質が、組換え大腸菌から精製され、本明細書に記載したＩＬ−６マクロファージ誘発アッセイで強力なＴＬＲアクチベーターであることが示されている。さらに、「ニューモリシン」と称する首尾よく保存された肺炎連鎖球菌タンパク質が、ＴＬＲ４を活性化することも示されており、加えて防御抗原でもある。従って、このタンパク質もＰＣＭＶ担体タンパク質として使用することができる。
【０１４３】
さらに、Merck社製ＨＩＢ抱合型ワクチンに、担体タンパク質として外膜タンパク質（ＯＭＰ）混合物（例えば髄膜炎菌のＯＭＰ）が使用され、全連鎖球菌性肺炎細菌細胞からのタンパク質抽出物は、動物感染モデルにおいて少なくとも部分的に防御的であることが示されている。本発明の望ましい実施形態では、これらのタンパク質混合物が、ＰＣＭＶ担体タンパク質源である。
【０１４４】
望ましい実施形態では、例えば、少なくとも２個のリジン残基、または阻害されておらず、化学的修飾によって架橋することができる別の残基を有する担体タンパク質を用いて、ＰＣＭＶ法を使用する。別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は多量体である（例えば、少なくとも５個のサブユニットを含むもの）。望ましくは、多量体はホモ多量体である。
【０１４５】
別の実施形態では、ＤＮＩを担体タンパク質として使用する。ＤＮＩは無害であり、使用前にタンパク質を解毒する必要性を残さないからである。さらに、ＤＮＩは、目的の抗原に対する防御免疫応答に加えて、炭疽菌に対しても防御免疫応答を誘発しうるので、ＤＮＩの使用が望ましい。また、ＤＮＩも内部ジスルフィド結合を持たない。タンパク質を変性させ、結果的に、炭疽毒素中和化抗体を誘発するエピトープを消失させる恐れがある水素化ホウ素還元に対して、そのような結合は感受性が高い。
【０１４６】
目的の抗原
本発明のワクチン組成物、ならびにそのようなワクチンの製造方法および投与方法は、任意の目的の抗原、例えば多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸に使用することができる。望ましくは、目的の抗原は、水素化ホウ素還元により抗原のジスルフィド結合が破壊されることによって生じる抗原変性など、ワクチン製造法に使用される化学反応によって破壊されうる一級基を持たない。例示的な目的の抗原には、有機ポリマー、例えば、多糖（例えば、少なくとも１８残基を有する多糖）、ホスホ多糖；アミノ糖がＮアセチル置換されている多糖；スルファニル化糖、別の硫酸修飾糖、またはリン酸修飾糖を含む多糖；ポリアルコール、ポリアミノ酸、タイコ酸、リポ多糖のＯ側鎖が含まれる。例示的な目的の抗原にはまた、標準的方法を使用し、微生物、例えば、細菌、菌類、寄生虫、およびウイルスにより合成され、次いでそのような生物源から精製されたものを含む莢膜有機ポリマーも含まれる。例示的な目的の抗原には、細菌性生物、例えば、（炭疽菌を含む）桿菌種（Wang and Lucas, Infect. Immun. 72(9):5460−5463, 2004）、肺炎連鎖球菌（Bentleyら, PLoS Genet. 2(3):e31, Epub 2006；Kolkmanら, J. Biochemistry 123:937−945, 1998；およびKongら, J. Med. Micorbiol. 54:351−356, 2005）、赤痢菌（Zhaoら, Carbohydr. Res. 342(9):1275−1279, Epub 2007）、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌、化膿レンサ球菌、大腸菌（Zhaoら, Carbohydr. Res. 342(9):1275−1279, Epub 2007）、および緑膿菌、ならびに菌類生物、例えば、クリプトコックスおよびカンジダ、同様に他の多くの微生物（例えばOvodov, Biochemistry (Mosc.) 71(9):937−954, 2006；Leeら, Adv. Exp. Med. Biol. 491:453−471, 2001；およびLee, Mol. Immunol. 24(10):1005−1019, 1987を参照）から精製されたものを含む微生物の莢膜有機ポリマーが含まれる。例示的な目的の抗原には、自然に存在せず、従って非生物学的起源のポリマーも含まれる。
【０１４７】
ワクチン組成物
ＰＣＭＶを含む本発明のワクチン、例えば小児用ワクチンに組み合わせて使用してよい。さらに、本発明のワクチンは、例えば、肺炎球菌感染、インフルエンザ菌Ｂ型（「ＨｉＢ」）感染、連鎖球菌（Ａ群およびＢ群）感染、髄膜炎菌（例えばネイッセリアメニンギチデス（Neisseria meningitides））感染に対するワクチン接種に使用してよく、かつグラム陰性菌（例えば、緑膿菌、野兎病菌、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、および大腸菌）由来のＯ抗原ワクチンとして使用してよい。
【０１４８】
望ましくは、ワクチン製剤は、少なくとも一種の担体タンパク質、一種もしくは複数の目的の抗原、および製薬上許容される担体もしくは賦形剤（例えば、リン酸アルミニウム、塩化ナトリウム、および滅菌水）を含む。ワクチン組成物には、製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系、例えば、当技術分野で公知の水中油系および他の系、または他の製薬上許容される賦形剤を含めてもよい。生理学的条件下で不溶性である担体／抗原複合体は、被験体に投与後、抗原を徐々に放出するのが望ましい。そのような複合体は、製薬上許容される賦形剤を含む懸濁液で送達するのが望ましい。しかし、担体／抗原複合体は、生理学的条件下で可溶性であってもよい。
【０１４９】
典型的には、ワクチンは、皮下注射には約０.５ｍL、皮内注射には０.１ｍＬ、または経皮的投与には０.００２〜０.０２ｍＬの容量である。０.５ｍｌ用量のワクチンには、約２〜５００μｇの担体タンパク質によって捕捉された約２〜５００μｇの抗原を含むことができる。望ましい実施形態では、０.５ｍｌ用量中、約１０μｇの抗原が約１０μｇの担体タンパク質によって捕捉される。抗原：担体タンパク質のモル比は、１：１０（例えば、１部の抗原：２部の担体または１部の抗原：３部の担体）〜１０：１（例えば、３部の抗原：１部の担体または２部の抗原：１部の担体）が望ましい。望ましい実施形態では、抗原：担体のモル比は１：１である。あるいは、抗原：担体タンパク質の乾物重量比は、１：１０〜１０：１（乾物重量で１：１など）が望ましい。
【０１５０】
ペプチドまたは抱合体は、おそらく胃内で分解されるので、ワクチンは、（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または皮内注射により）非経口投与するのが望ましい。物理的に真皮層を通り抜ける手段（例えば針、空気銃、または擦過）による送達が望ましいが、本発明のワクチンは、経皮吸収により投与することもできる。
【０１５１】
特に、本発明のワクチンは、例えば、好適な免疫アジュバントを用いて、筋肉内注射、皮内注射、または経皮的免疫化により被験体に投与してもよい。本発明のワクチンは、１回または数回に分けて投与してもよく、感染病原体の感染を防止するために、被験体で抗体の産生をブーストするように設計した２回目の投与を含むことが多い。ワクチン投薬の頻度および量は、そのワクチンの比活性に依存し、常法の実験によって容易に定量することができる。
【０１５２】
例えば、小児には、ワクチンスケジュールは、（２ヵ月齢で開始して）約４〜８週間空けてそれぞれ０.５ｍｌを３回投与し、続いて約１２〜１５ヵ月齢で４回目の０.５ｍｌを投与してよい。数種のワクチンでは、５回目の投与は４〜６歳の間が望ましいであろう。
【０１５３】
一般的に、１回目の投薬がなされる年齢は２ヵ月であるが、６週齡ほどの幼い小児にワクチンを投与してもよい。定型の小児ワクチン接種スケジュールの年齢を超えている児童には、以下の例示的なスケジュールに従って、本発明のワクチンを投与してもよい。
【０１５４】
【０１５５】
成人には、長期的保護に、一般的に２〜８週の間を空けて０.５ｍｌ用量を２回以上投与すれば十分である。既に免疫化した成人および１１歳を超える小児には、１０年ごとに、ブースター用量を投与するのが望ましい。
【０１５６】
製剤は、１回用量または多数回用量容器で、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供してよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵してよい。本発明のワクチンは、薬理学的に許容されるビヒクル、例えば、ミョウバン水酸化ゲル、アジュバント調製物、または生理食塩水で製剤化し、次いで例えば好適な免疫アジュバントを用いて筋肉内注射、皮内注射、または経皮的免疫化により投与することができる。
【０１５７】
本発明には、本明細書に記載したワクチン（例えばＰＣＭＶ）を含むキットも含まれる。本発明のキットには、本明細書に記載したワクチン接種方法のキットを使用するための使用説明書を含めてよい。
【０１５８】
免疫化スケジュールの効力は、被験体で抗体力価を測定する標準的方法の使用によって定量しうる。一般に、約１μｇ／ｍｌという平均抗体力価（望ましくはＩｇＧ力価）は、長期的保護を示していると考えられる。
【０１５９】
本明細書に記載したワクチン組成物で使用するための抗原／担体タンパク質複合体は、直径が１０ｎｍ〜１００μｍであることが望ましい。ウイルスは、直径が１００ｎｍであろうし免疫原性である。細菌全体の直径は１〜１０μｍであり、同様に免疫原性である。細菌凝集塊の直径は約１００μｍであろう。特定の実施形態では、ワクチン組成物中の抗原／担体タンパク質複合体の直径は１００ｎｍ〜１０μｍが望ましい。この複合体は、溶解性であっても、または不溶性であってもよい。
【０１６０】
本明細書以下に、具体的実施例、実施形態、および図を参照しながら本発明について記載するが、その目的は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を説明することである。以下の実施例は限定するものとは解釈されない。
【０１６１】
（実施例）
【実施例１】
【０１６２】
ワクチンおよび対照調製物
莢膜のポリγ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）をVedan社（台湾）から購入し、またはRhieら,(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925−10930, 2003)の方法によって精製した。ドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）は、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の変異形であり、Benson,ら,(Biochemistry 37:3941−3948, 1998)の方法により大腸菌から生成した。ＰＧＡおよびＤＮＩタンパク質は、使用前に、０.０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.４）（ＳＰ７.４）に対して徹底的に透析した。ＤＮＩ原液濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。ＰＧＡ原液濃度は１３４ｍｇ／ｍｌであった。２５％原液として、リンカーグルタルアルデヒドをPierce社から購入した。表１に従って、反応によりタンパク質莢膜のマトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）および対照を組み立てた。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
グルタルアルデヒド不含の５個の反応を室温で（２２℃）で組み立てた。Ｔ＝０で、０.１ｍｌの２５％グルタルアルデヒド（Ｇ２５）を表示する反応に加えた。それから各々３０秒後に、さらに０.１ｍｌのＧ２５を加え、それぞれ示した反応に合計で０.８ｍｌのＧ２５が加えられるまで、これを繰り返した。二官能性グルタルアルデヒド分子によるＤＮＩ分子の架橋は、様々な程度の濁度と、以下の順序での不溶性「ゲル」様粒子の発生により巨視的に観察することができた。ほとんどの濁度およびゲル形成は反応１＞２＞３＞４であり、反応５は全体として透明かつ可溶性のままであった。１時間後、１Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを含む０.５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.３）（ＳＢＨ）２ｍｌを全６反応に加えて、ＤＮＩ分子のアミノ側鎖と二官能性グルタルアルデヒド分子との間に形成されたシッフ塩基を還元した。シリコーン抗起泡剤（０.０１ｍｌ）を各反応に加えて、この反応中の起泡を制御した。反応物を４℃で７２時間貯蔵した。次いで、全ての反応をＳＰ７.４に対して４８時間徹底的に透析した。最終生成物を遠心分離することによって不溶性物質を除去し、使用時まで４℃で貯蔵した。
【０１６５】
以下のように、水溶性カルボジイミド、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用し、ＢＳＡのアミノ基と、ＰＧＡのカルボキシル基とを結合することによって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とＰＧＡ間の従来の抱合体を合成した。３０ｍｇ／ｍｌ ＢＳA水溶液５ｍｌを１ｍｌの１３４ｍｇ／ｍｌ ＰＧＡ含有ＮＰ７.５と混合した。５０ｍｇのＥＤＡＣを加え、反応を室温で３時間放置進行させた。活性化された基をブロックするために、１ｍＭグリシンを含むＳＰ７.４に対して、反応物を４℃で１８時間透析し、次いでＳＰ７.４のみに対して４℃で２４時間透析した。最終生成物をＰＧＡ−ＢＳＡ抱合体と呼ぶ。
【０１６６】
ＰＣＭＶおよび対照調製物の合成および透析後、ＤＮＩタンパク質の分子状態を検査して、グルタルアルデヒドが、様々な量のＰＧＡの存在または非存在下で、実際分子的にタンパク質を架橋したかを確認した。そのような架橋について、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリアミド（polyacryamide）ゲル電気泳動および抗ＰＡ抗血清によるウェスタンブロッティングにより、ＰＣＭＶおよび対照調製物をモニターした。図２に示すように、ＤＮＩタンパク質は、グルタルアルデヒドで架橋する前は８４ｋＤａで泳動する。ＰＣＶＭ１〜ＰＣＭＶ３（レーン１〜３）は、２２０ｋＤａより大きい分子量のバンドの泳動によって実証された通り、ＤＮＩタンパク質の広範な架橋を示している。ＰＧＡの非存在下で架橋されたＤＮＩタンパク質単独も、同じ高分子量種（レーン５）を示している。それに反して、ＰＧＡと混合したがグルタルアルデヒドで処理していないＤＮＩは、ＤＮＩまたは低分子量種（レーン４）と共泳動するバンドを示している。従って、Vedan（台湾）社製ＰＧＡ調製物は、ＤＮＩに対して活性なプロテアーゼが混入しているように見えた。Vedan社のＰＧＡ試料は、レーン６で泳動したが、高抗ＰＡ抗血清と反応する混入タンパク質が高レベルではないことを示し、観察されたバンドが様々な反応のＤＮＩ由来生成物であることを示唆した。
【０１６７】
さらに、ＰＧＡと、抗原として肺炎球菌ＰＳの一種または複数を使用して、ＦＬＡ（コレラ菌のフラゲリン）が、ＰＣＭＶと関連してＤＮＩよりも優れた担体タンパク質であるかどうかを調査した。ＰＧＡに対するＩｇＧのレベル、これらの様々なＰＣＭＶによる免疫化によって得られたＰＳ、およびタンパク質基準の重量でのそれらの作用強度を測定することによって、担体タンパク質の効果を評価する。
【０１６８】
二官能基架橋剤を使用せずに、アミノ基とカルボキシ基を直接架橋する手順によっても、ＰＣＭＶ作製することができる。特に、ＰＣＭＶは、カルボジイミド化学を使用し、担体タンパク質の、アミノ基とカルボキシル基を架橋することによって作製できる。この化学により、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸およびグルタミン酸側鎖のカルボキシル基との間にペプチド結合が形成される。アミノ基は、ホルマリン処理トキソイドで大部分ブロックされるが、ホルマリンは、カルボキシル基とは一切反応しない。従って、ＰＣＭＶの製造に、グルタルアルデヒド架橋に抵抗するホルマリントキソイドを使用し、カルボジイミド化学を使用することができる。架橋は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって容易に検出される。グルタルアルデヒドなどの架橋剤の添加に依存する、高分子量タンパク質の「スメア」の存在は、架橋を示すものである。
【表２】
【０１６９】
表２に示す実験では、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）で２００μｌの反応を行い、周囲温度で２時間インキュベートした。反応を１２０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウムで急冷した。グルタルアルデヒドを加えて６４ｍＭにし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１５ｍｇ／ｍｌで使用し、ジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドを約５ｍｇ／ｍｌで使用し、ＰＧＡを１３.４ｍｇ／ｍｌで加え、ニューモ（pneumo）ＰＳ６Ｂ型および２３Ｆ型を４ｍｇ／ｍｌで加えた。
【０１７０】
表２に示す通り、いくつかのホルマリン処理タンパク質（例えばジフテリアトキソイド）は、グルタルアルデヒドとはあまり架橋せず、従ってＰＣＭＶの調製に使用するためには他の架橋化学が必要となる。破傷風トキソイドなど、他のものはグルタルアルデヒドで架橋することができるが、ジフテリア毒素およびウシ血清アルブミンなどの未修飾タンパク質と同程度ではない。
【実施例２】
【０１７１】
免疫化、ならびに抗ＤＮＩおよび抗ＰＧＡ免疫応答の分析
表１に記載した５反応の可溶性生成物は、それらの２８０ｎｍでの吸光度に基づき、同じタンパク質濃度になるように調整した。図２に記載した全ての免疫化研究では、Charles River社の約５〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。０日目に腹腔内注射により、ＤＮＩタンパク質２０μｇの用量で、ＰＣＭＶワクチン１〜３および抗原調製物対照４および５によりマウスを免疫化した。全てのマウスを７日目に採血し、次いで１０日目に同じサイズ用量の抗原調製物でブーストした。１７日目に再度マウスを採血し、次いで２０日目に再度ブーストした。３０日目に再度マウスを採血し、その日にマウスを屠殺した。凝固発生後、血液試料から血清を採取し−２０℃で貯蔵した。抗ＰＧＡおよび抗ＤＮＩ血清抗体のレベルについてアッセイするのに、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。手短に言えば、１００μｌ／ウェル容量のImmulon 2HB ELISA（ＶＷＲ）マイクロタイター皿を、０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.６）に含まれたＢＳＡ−ＰＧＡまたはＤＮＩ ０.５μｇ／ウェルで被膜した。４℃で終夜インキュベーション後、３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ−０.１％ Tween（ＴＢＳＴ）で、室温で１時間または終夜４℃でインキュベーションすることによって、抗原被膜プレートをブロックした。ブースト後の各時点から、４頭のマウス群よりプールした血清試料をＴＢＳＴで連続希釈し、抗原被膜プレートに添加し、少なくとも１時間インキュベートした。ウサギ抗血清を使用し、アルカリホスファターゼ（Zymed）と抱合したマウスＩｇＧまたはＩｇＭに対する、抗ＤＮＩおよび抗ＰＧＡ抗体応答を測定した。基質のｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を各ウェルに加え、分光光度計で各反応の４０５ｎｍでの吸光度を測定した。負の対照の吸光度を上回る２点の標準偏差値であるＯＤ４０５読取り値を得るための最大希釈率として定義される逆数端点力価としてデータを報告する。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、３種のＰＣＭＶ調製物１〜３および２種の抗原対照調製物４および５（図３〜５）により免疫化したマウスでの、ＩｇＭおよびＩｇＧ特異的抗ＤＮＩおよび抗ＰＧＡ免疫応答を測定した。図３に示すように、グルタルアルデヒドで架橋しなかった（グルタルアルデヒド不含）対照調製物４を除く全ての調製物において、ＤＮＩタンパク質の免疫原性は高かった。しかし、これらのＤＮＩ特異的免疫応答は、排他的にＩｇＧに基づいた。免疫化７日目でさえも抗ＤＮＩ ＩｇＭは検出されなかったが、１７日目までにＰＣＭＶ調製物で免疫化したマウス、および架橋ＤＮＩのみ（調製物５）で免疫化したマウスで、顕著な抗ＤＮＩ ＩｇＧ応答を検出することができた。３０日目に調製物４を含む全ての調製物で、ＤＮＩに対する強力なブースター応答が認められた。
【０１７３】
抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答は、莢膜ポリマーに典型的なパターンを示した（図４）。対照調製物４では、７日目に検出可能な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が生じたが、この応答は１７日目または３０日目にブーストされなかった。全てのＰＣＭＶ調製物で、７日目に抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が誘発され、次いで１７日目および３０日目にさらに強力な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が排他的に生じた。予想通り、対照調製物５（架橋ＤＮＩのみ）では、ＩｇＭまたはＩｇＧベースの抗ＰＧＡ応答のいずれも発生しなかった。極めて対照的に、ＰＣＭＶ１〜３（調製物１〜３）では、ＩｇＧベースの強力な抗ＰＧＡ応答が発生したが、この応答は１７日目に明瞭になり、次いで３０日目に明らかにブーストされた（図５）。ＰＣＭＶ１〜３に見られたＩｇＧベースの抗ＰＧＡ応答は、Aulingerら,(Infect. Immun. 73:3408−3414, 2005)が報告した従来のＰＧＡ−ＤＮＩ抱合型ワクチンで観察されたＰＧＡに対して、およびRhieら,(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925−10930, 2003)が記載したＰＡ−ＰＧＡ抱合型ワクチンに対して報告されている応答に明瞭に類似した。従って、公知の炭疽菌のＴ非依存性防御抗原である莢膜ＰＧＡに対するＩｇＧ応答を誘発することによって、従来の抱合体ＰＧＡワクチンと同様に、ＰＣＭＶワクチン＃１、＃２および＃３は全て作働した（Wangら, Infect. Immun. 72:5460−5463, 2004）。ＰＧＡと混合してＤＮＩ（非架橋）を含む対照調製物５は、ＰＧＡに対して検出可能なＩｇＧを誘発せず、ＤＮＩは、ＰＣＭＶ調製物１〜３ではＩｇＧ抗ＰＧＡ応答を刺激する際にＴＬＲリガンドとして作用しないことが示唆された。この結果はまた、ＰＧＡは、共有結合を通じてタンパク質に結合しなければ、低免疫原性のＴ細胞非依存性免疫原である、という文献中の観察を確認するものである（Rhieら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925−10930, 2003）。ＰＣＭＶ法では、直接ＰＧＡ分子とＤＮＩタンパク質とは架橋されないという事実にもかかわらず、ＰＣＭＶ法は、明らかにＰＧＡをＴ細胞依存性免疫原に転換する。
【０１７４】
これらのデータは、ＰＣＭＶ法が、従来の抱合型ワクチンに類似する特性を備えた免疫原を産生できることを支持するものである。ＰＧＡ ＰＣＭＶは、本明細書記載の方法を使用して容易に作製され、ＰＧＡ−タンパク質抱合型ワクチンに典型的な免疫応答を誘発することが判明した。図３に概略する投薬スキームに基づき１０００匹のマウスを免疫化するのに十分なＰＣＭＶが、表１に詳述した小規模反応によって生成された。本発明のデータは、炭疽菌によって生じた炭疽に対して防御するために、ＰＧＡとＤＮＩから作製されたＰＣＭＶをワクチンとして使用できることを支持するものである。
【実施例３】
【０１７５】
追加のＰＣＭＶの生成および特徴付け
様々な構造およびイオン電荷莢膜抗原に対して、ＰＣＭＶ技術を適用することができる。肺炎連鎖球菌ＰＳ型のうち２３種の型を米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）から購入し、そしてMerck社により製造する。これらのＰＳは、その分子構造が大きく異なり、電荷が強くアニオン性、部分的にカチオン性、中性である構造、リン酸化されている構造、直鎖である構造、枝分れ構造、および様々な他の方式で修飾されたＰＳ分子構造を含む。予備実験では、マウスマクロファージによりＩＬ−６産生が誘発される能力について、Wyeth社製Prevnarの７個の莢膜型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）に対応して、これらのＰＳサブセットをアッセイした。４型ＰＳは、このアッセイで活性であり、リポ多糖（ＬＰＳ）はＴＬＲアゴニストの対照であった。ＰＧＡ−ＤＮＩおよび非架橋対照から作製したＰＣＭＶワクチンと同様に、他のＰＳ（例えば３型）、ＰＧＡ、および野兎病Ｏ抗原ＰＳもアッセイした。この実験によって、３型肺炎球菌ＰＳ、およびそれより少ない程度でＰＧＡで、ＴＬＲアゴニストが混入していることも示された。野兎病由来ＰＳおよびＰＣＭＶは、アッセイで比較的に汚染が少なかった。フェノール抽出およびエタノール沈殿による２回の連続的処理の後、肺炎連鎖球菌ＰＳ３型を「純粋化（clean up）」（未知の残留ＴＬＲアゴニストを除去）することができた。従って、６種の肺炎連鎖球菌ＰＳおよび野兎病Ｏ抗原ＰＳは、ＩＬ６産生を純粋化することが判明しており、これらは本明細書に記載した実験で調査されている。
【０１７６】
ＩＬ６産生のために純粋化することが判明している７種のＰＳに向けたＰＣＭＶが、実施例１に記載した方法と類似の方法により、担体タンパク質としてＤＮＩを使用し合成された。予備的免疫原性アッセイでは、全７種のＰＣＭＶが様々な程度で免疫原性であることが示唆されている。肺炎連鎖球菌ＰＳ１４に対する、ＤＮＩベースの「１価」ＰＣＭＶ（１４−ＰＣＭＶ）は、３回目の免疫化後著しくブーストされた抗ＰＰＳ１４ ＩｇＧの高力価を誘発することが判明した。注目すべきことに、１４−ＰＣＭＶとその他の６ＰＣＭＶと混合して「カクテル」免疫原を作製したとき同じ免疫応答が見られた。Prevnar（登録商標）は、ミョウバンに吸収させた「アジュバント型」ワクチンなので、ミョウバンアジュバントに六価ＰＣＭＶカクテルを吸収させることができるかどうかを判定した。ＰＣＭＶに、またはＤＮＩタンパク質と混合したが、グルタルアルデヒドで架橋していない同じＰＳの対照混合物に曝露後、ミョウバンに吸収された肺炎連鎖球菌ＰＳの量を定性的に計測する免疫アッセイの結果では、対照（非架橋ＰＳ＋ＤＮＩタンパク質）よりもＰＣＭＶに関連して、より多くのＰＳがミョウバン吸収されたことが示された（このイムノアッセイでＰＣＭＶを希釈するほど、免疫活性レベルが高いことによって示された通りである）。
【０１７７】
マウスの免疫化を使用して、ミョウバンアジュバントへの吸収の有り無しで七価ＰＣＭＶの免疫原性を評価した。ミョウバンアジュバントは、ＰＳ１４に対する免疫応答の動態論を改善し、このＰＳに対するＩｇＧの誘発を非アジュバント型ワクチンよりも７日早めた。しかし、ミョウバンの存在下での対照の非架橋型ＰＳ＋ＤＮＩ組合せよりも、ミョウバンの非存在下での七価ＰＣＭＶの方が免疫原性が高かった。この結果は、ＰＣＭＶ手順が、マウスに対するＰＳの免疫原性をより高めることを確認するものであり、ＰＣＭＶ手順が、抱合型ワクチンカクテルのように免疫学的に作働する抗原カクテルを作製するために使用できることを支持するものである。
【０１７８】
追加の実験では、フェノール抽出およびエタノール沈殿を使用して、２３種の肺炎球菌多糖市販調製物から、混入するＴＬＲアゴニストを除去する。混入物質の除去は、標準的方法により、腹腔マクロファージによるＩＬ−６の誘発について、処理したＰＳを試験することによって確認する。ＰＣＭＶの生成に、ＩＬ−６誘発活性を欠くＰＳを使用する。ＰＣＭＶに使用した他の多糖には、野兎病から精製したＯ抗原ＰＳ、および炭疽菌由来のＰＧＡ莢膜が含まれる。合計２５個の莢膜型を検査する（肺炎球菌型２３個、および野兎病型および炭疽病型を各１個）。基本的に実施例１に記載した方法により、２５個の莢膜型のそれぞれを使用して、ＤＮＩタンパク質を使用するＰＣＭＶを作製する。これらの初期ＰＣＭＶ調製物には、ＰＳ：タンパク質を１：１の割合で使用する（乾物重量で約１：１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、予備実験で様々なＰＣＭＶ調製物の免疫原性と完全に相関したタンパク質の架橋の形跡について、各調製物を特徴付ける。数種の莢膜型（例えば、６Ｂおよび２３Ｆ）については、別の担体タンパク質を使用してＰＣＭＶを作製する。これらの数種の莢膜型（例えば、６Ｂおよび２３Ｆ）については、代替の架橋化学を使用することができる。（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥで）タンパク質の架橋の形跡を示す全てのＰＣＭＶ調製物をその免疫原性について試験する。
【０１７９】
例えば、以下のように、異なる５種のマトリックスタンパク質と異なる２種の抗原を使用し、異なる１０種のＰＣＭＶを作製する。５種のマトリッックスタンパク質の選択は、ＦＤＡの認可を受けたワクチンでのそれらの現在の使用、またはＰＣＭＶ調製物の安定性を測定するトレーサーとしてそれらが役立つようにするその他の特性に基づく。以下のマトリックスタンパク質を使用する（１）コレラ毒素Ｂサブユニット（SBL Vaccin ABより入手可能）、（２）ジフテリア毒素、（３）破傷風毒素フラグメントＣ、「Ｆｒａｇ Ｃ」（Sigma Aldrichより入手可能）、（４）ＤＮＩ、および（５）大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（Sigma Aldrichより入手可能）。莢膜抗原として、炭疽菌から得たポリ−Ｄ−グルタミン酸および肺炎連鎖球菌莢膜１４型（Suarezら, Appl. Environ. Micobiol. 67:969−971, 2001）を使用する。対応するＰＣＭＶでマトリックスタンパク質としてＤＮＩと共に使用したとき、これらの莢膜抗原のどちらも免疫原性が高い。各莢膜抗原と、５種の選択したマトリックスタンパク質のそれぞれを組み合わせて、１０種の別個のＰＣＭＶを生成する。
【０１８０】
従来の抱合型ワクチンで観察されたように、マウスでアイソタイプ抗体がＩｇＧにスイッチされるように誘発する能力について、ＰＣＭＶを試験することができる。全ての抗原をミョウバンに吸収させることができ、次いで一ＰＣＭＶ調製物につき通常５頭のマウス群を使用する。マウスは、予め採血して、試験抗原に対する基線免疫応答を得る。次いで、標準的ＩＰ注射プロトコルにより、マウスを３回（０、７、１４日目）免疫化し、一回目の免疫化から１０、２０、３０、および６０日後に血液を採取する。使用したＰＳおよび担体タンパク質に対するＩｇＧについて、標準的ＥＬＩＳＡアッセイによりマウス血清を分析する。これらの実験では、低または非免疫原性であろう非抱合型ＰＳと比較して、抗ＰＳ ＩｇＧを誘発する様々なＰＣＭＶ調製物の能力を評価するためにＰＳのみで免疫化したマウス対照群が含まれる。有望なＰＣＭＶ（すなわちＰＳに対して高レベルのＩｇＧを誘発するＰＣＭＶ）について、より注意深い免疫学的分析を実施するが、その分析はマウスでのＰＣＭＶに対する免疫応答の動態論および用量応答態様を確立するために調査するものである。
【０１８１】
あるいは、有望なＰＣＭＶおよび対応するそれらの対照は、ウサギ抗血清を製造する販売業者に送付することができる。類似の免疫アッセイを実施して、ウサギで免疫原性、誘発された抗体クラス、および免疫応答動態論を評価する。これらの実験では、対照は市販品のPrevnar（登録商標）であり、これは、ジフテリア毒素に関して無害な変異体タンパク質であるＣＲＭ１９７に結合させた７種の異なる従来の抱合体ＰＳワクチンの混合物をミョウバンに吸収させたものである。
【０１８２】
ＰＣＭＶによって誘発された抗体応答の官能性を評価することができる。例えば、抗ＰＳ抗体が、莢膜を有する肺炎連鎖球菌をオプソニン化し、マクロファージによる貪食後、細菌を死滅させる能力を測定することによって、官能性を評価することができる。肺炎連鎖球菌による致死的攻撃から動物を保護することは、ＰＣＭＶ免疫化した動物でワクチンの効力を実証する別のやり方である。
【実施例４】
【０１８３】
ＰＣＭＶとPrevnar（登録商標）の比較
Merck社を介してＡＴＣＣから、または直接Serum Institute of India（ＳＩＩ）から得た肺炎連鎖球菌多糖（ｐｐｓ）６Ｂ、１４、および２３Ｆの相対的純粋度（cleanliness）を定量した。ｐｐｓの純粋度の指標としてＩＬ−６の発現を使用し、正の「不純（dirty）」対照としてＬＰＳを使用した。図９Ａに示すように、Merck社のｐｐｓ ６Ｂ、１４、および２３Ｆは純粋であるが、図９Ｂに示すように、ＳＩＩ社製ｐｐｓ ６Ｂは「不純」である。図１０に示すように、処理２（１Ｍ ＮａＯＨ中、８０℃での１時間インキュベーション）により、ＳＩＩ ｐｐｓ ６Ｂは純粋になる。抱合体とＰＣＭＶの免疫学的特性の比較に、純粋ｐｐｓ ６Ｂを使用する。表３に示す通り、混入物質はＬＰＳではなかった。
【表３】
【０１８４】
図１１および１３は、Prevnar（登録商標）［ミョウバンに賦活（adjuvated）されている］が、ｐｐｓ ６Ｂに対してＩｇＧ抗体を誘発すること、およびミョウバン賦活型ＰＣＭＶ（ＢＳＡとｐｐｓ ６Ｂ；ジフテリア毒素とｐｐｓ ６Ｂ；ジフテリアトキソイドとｐｐｓ ６Ｂ；および破傷風トキソイドとｐｐｓ ６Ｂ）由来ＩｇＧ応答は、Prevnar（登録商標）で観察されたものよりも高いことを示している。同様に、図１２に示されるように、ミョウバン賦活型ＰＣＭＶに対するＩｇＭ応答は、Prevnar（登録商標）に見られるものと類似している。
【０１８５】
さらに、ｐｐｓ １４（Prevnar（登録商標）で最も免疫原性であったｐｐｓ）に関して、図１４〜１６に示す通り、ジフテリアトキソイドとｐｐｓ １４、または破傷風トキソイドとｐｐｓ １４を含むミョウバン賦活型ＰＣＭＶは、ＩｇＧ応答の誘発においてPrevnar（登録商標）とほぼ等しい。
【実施例５】
【０１８６】
多価ＰＣＭＶ
ＤＮＩ担体タンパク質をグルタルアルデヒドで架橋する前に、化学的に異なる莢膜有機ポリマーを一緒に混合することによるＰＣＭＶ法（「ワンポット合成反応」）を使用し、多価免疫原を生成した。担体としてＤＮＩを使用し、この種の三価免疫原を３種の有機ポリマー−ＰＧＡ、アルギン酸、およびデキストラン−から作製した。これらの三価ワクチンは、免疫原性であり、３種の莢膜有機ポリマーに対して免疫応答を生じたが、免疫化前および３０日後に分析したプールした血清のＩｇＭ（図６）、免疫化６０日後の抗原特異的血清ＩｇＧ抗体力価（図７）、および免疫化１２８日後の抗ＰＳ血清抗体力価（図８）によって示される通りである。同様に図６〜８に示すように、一価アルギン酸ＰＣＭＶ調製物は、マウスでも免疫応答を生じた。別々に合成した特異的ＰＣＭＶを混合し、次いで最後に一緒に混合して「カクテル」ワクチンを生成することによって、多価ＰＣＭＶ免疫原を製剤化することもできる。
【０１８７】
参照により組み込むために、独立した各特許、特許出願、特許出願公開または刊行物を具体的にかつ別個に指摘するのと同程度に、本明細書において、引用または参照した全ての特許、特許出願、特許出願公開、および他の刊行物を参照により本明細書に組み込む。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年８月７日出願の米国仮出願出願番号第６０／８３５，９４４号、および２００７年６月８日出願の米国仮出願出願番号第６０／９３３，７６４号の特典を請求し、それらの明細書をこれにより参照により組み込む。
【０００２】
連邦出資研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された授与番号第Ｕ５４ＡＩ０５７１５９号の政府援助によって行なわれた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ワクチン組成物、ワクチンの製造方法、およびワクチン投与法に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの抗原、特に病原体の莢膜層に付随する抗原は、免疫応答をほとんど、またはまったく刺激せず、それらの抗原に対する有効なワクチン創出への努力を困難なものにしている。莢膜は、典型的には、炭水化物、アミノ酸、またはアルコールなどの有機化合物のポリマーから構成される、微生物表面成分である。莢膜は、化学的に非常に多様である。莢膜（例えば炭水化物）を構成する単量体単位は、様々な分子配置で連結することができ、さらにリン酸、窒素、硫酸、および他の化学的修飾物で置換することができる。これらの化学的変形によって、莢膜は、多数の抗原標的を微生物表面上に提示できるようになり、それによって、これらの標的に向けられた宿主免疫系から逃れることができる。莢膜はまた、微生物が、宿主マクロファージおよび多形核（polymorphoneuclear）白血球によって貪食され、死滅するのを防止する病原性因子でもありうる。莢膜に対する抗体は、微生物表面に補体を固定することによって、莢膜を有する微生物から強力に防御するが、その固定によって食作用性宿主免疫細胞がそれらを溶解し、またはそれらをオプソニン化し、取込み、死滅させられる。莢膜に対する最も強力な抗体は、ＩｇＧ抗体である。顕著なレベルのＩｇＧを誘発できない莢膜は、Ｔ非依存性抗原と呼ばれる。タンパク質と莢膜は共有結合することによって、「Ｔ依存性」になり、そのような抗原はＩｇＧ応答を誘発することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
強力な免疫応答またはＩｇＧ抗体を誘起しない莢膜および他のＴ非依存性抗原を対象とする、安全で合成可能な費用効率の高いワクチンが必要とされている。様々な感染症、例えば、炭疽、肺炎球菌、インフルエンザＢ型、髄膜炎菌、および連鎖球菌による感染から防御するためには、そのようなワクチンが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、目的の抗原が担体タンパク質によって複合体中に捕捉されているワクチン組成物、そのようなワクチンの製造方法、およびワクチン投与法に関する。
【０００７】
従って、第１態様では、本発明は、目的の抗原と担体タンパク質を含むワクチン組成物であって、（ｉ）目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋し、かつ（ｉｉ）該抗原が該担体タンパク質に捕捉されて複合体を形成するワクチン組成物を特徴とする。
【０００８】
本発明の第１態様の望ましい実施形態では、その複合体の直径は１０ｎｍ〜１００μｍである。本発明の第１態様のより望ましい実施形態では、その複合体の直径は約１００ｎｍ〜１００μｍである。本発明の第１態様のよりさらに望ましい実施形態では、その複合体の直径は約１００ｎｍ〜１０μｍである。
【０００９】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、その複合体を哺乳動物に投与すると、該哺乳動物でＴ細胞依存性免疫応答が誘発される。
【００１０】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、抗原：担体タンパク質のモル比は、１：１０〜１０：１である。望ましくは、担体タンパク質は多量体であり、例えば、少なくとも５個のサブユニットを含む多量体である。別の望ましい実施形態では、多量体はホモ多量体である。
【００１１】
本発明の第１態様のさらに望ましい実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも一個の別の担体タンパク質と共有結合している。望ましくは、共有結合には、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合が含まれる。別の望ましい実施形態では、共有結合に、式
【化１】
【００１２】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物が含まれる。別の望ましい実施形態では、共有結合に、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。さらに別の望ましい実施形態では、共有結合に二官能基架橋剤が含まれる。望ましくは、二官能基架橋剤は、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである。
【００１３】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は非共有結合している。望ましい実施形態では、非共有結合には、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合が含まれる。
【００１４】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン（例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae）フラゲリンタンパク質）、ニューモリシン、髄膜炎菌（Neisseria menningitidis）の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌（Escherichia coli）熱不安定性エンテロトキシン、志賀様（shiga−like）毒素（例えば、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質）、ヒトＬＴＢタンパク質、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（または関連タンパク質）、細菌細胞全体（例えば、緑膿菌または連鎖球菌細胞）からのタンパク質抽出物、炭疽菌（Bacillus anthracis）防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである。特に望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、ジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素、または破傷風トキソイドである。
【００１５】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である。望ましくは、多糖は少なくとも１８残基を含む。別の望ましい実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）多糖、チフス菌（Salmonella typhi）多糖、サルモネラ種多糖、赤痢菌多糖、または髄膜炎菌多糖である。特に望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、莢膜型１〜４８、例えば、３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６のどれか一つである。別の特に望ましい実施形態では、野兎病菌多糖はＯ抗原である。
【００１６】
本発明の第１態様のさらに望ましい実施形態では、目的の抗原は微生物の莢膜ポリマーである。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である。
【００１７】
本発明の第１態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、それらの原子のそれぞれは、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸から独立して選択されている。望ましくは、その有機ポリマーは微生物に由来する。別の望ましい実施形態では、有機ポリマーは自然発生のものではない。
【００１８】
別の望ましい実施形態では、ワクチン組成物は第２の目的の抗原をさらに含む。望ましくは、そのワクチン組成物は第３の目的の抗原をさらに含む。
【００１９】
第２態様では、本発明は、ワクチン組成物の作製方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合して、該抗原と該担体タンパク質の混合物を形成するステップ、および（ｉｉ）該目的の抗原を該担体タンパク質で捕捉するステップを含み、その際、該ワクチン組成物中、目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する。
【００２０】
本発明の第２態様の望ましい実施形態では、ワクチン組成物は製薬上許容される賦形剤をさらに含む。
【００２１】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、捕捉ステップは、混合物から抗原と担体タンパク質を沈殿させるステップを含む。望ましくは、沈殿ステップは、混合物のｐＨを変化させるステップ、混合物に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または硫酸アンモニウムを加えるステップ、混合物の無機塩濃度を上昇させ、または低下させることにより、混合物のイオン強度を変化させるステップ、混合物を加熱して、担体タンパク質および／または抗原を凝固させるステップ、または混合物に十分な線束の電離放射線を照射して架橋させるステップを含む。
【００２２】
本発明の第２態様の望ましい実施形態では、ワクチン組成物中、抗原：担体タンパク質のモル比は１：１０〜９：１０である。
【００２３】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は多量体である。望ましくは、多量体は、少なくとも５個のサブユニットを含む。別の望ましい実施形態では、多量体はホモ多量体である。
【００２４】
本発明の第２態様のさらに望ましい実施形態では、担体タンパク質は非共有結合している。望ましくは、非共有結合に、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合が含まれる。
【００２５】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン（例えば、コレラ菌フラゲリンタンパク質）、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素（赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質）、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体（例えば、緑膿菌または連鎖球菌細胞）からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである。特に望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、ジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素、または破傷風トキソイドである。
【００２６】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である。望ましくは、多糖は、少なくとも１８残基を含む。別の望ましい実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である。特に望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、莢膜型１〜４８、例えば、３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６のどれか一つである。別の特に望ましい実施形態では、野兎病菌多糖はＯ抗原である。
【００２７】
本発明の第２態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は微生物の莢膜ポリマーである。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である。
【００２８】
本発明の第１態様のさらに別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、それらの原子のそれぞれは、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸から独立して選択されている。望ましくは、その有機ポリマーは微生物に由来する。別の望ましい実施形態では、有機ポリマーは自然発生のものではない。
【００２９】
本発明の第２態様のさらに望ましい実施形態では、ステップ（ｉ）の混合ステップは、第２の目的の抗原、または第３の目的の抗原さえも含む。
【００３０】
第３態様では、本発明は、別のワクチン組成物の作製方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合するステップ、および（ｉｉ）該担体タンパク質と架橋するリンカーを加えるステップを含み、その際、該ワクチン組成物中、目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する。
【００３１】
本発明の第３態様の望ましい実施形態では、ワクチン組成物は製薬上許容される賦形剤をさらに含む。本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、ワクチン組成物中、抗原：担体タンパク質のモル比は１：１０〜１０：１である。本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は多量体である。望ましくは、多量体は少なくとも５個のサブユニットを含む。別の望ましい実施形態では、多量体はホモ多量体である。
【００３２】
本発明の第３態様のさらに望ましい実施形態では、本方法は、担体タンパク質中のシッフ塩基を還元するステップを含む。本発明の第３態様のよりさらに望ましい実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも一個の別の担体タンパク質と共有結合している。望ましくは、共有結合に、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合が含まれる。別の望ましい実施形態では、共有結合に二官能基架橋剤が含まれる。望ましくは、二官能基架橋剤は、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである。
【００３３】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、リンカーは、式
【化２】
【００３４】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物である。
【００３５】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、リンカーは、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンである。
【００３６】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン（コレラ菌フラゲリンタンパク質）、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素（赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質）、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体（緑膿菌または連鎖球菌細胞）からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである。
【００３７】
本発明の第３態様のさらに望ましい実施形態では、目的の抗原は、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である。望ましくは、多糖は、少なくとも１８残基を含む。別の望ましい実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である。特に望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、莢膜型１〜４８、例えば、３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６のどれか一つである。別の特に望ましい実施形態では、野兎病菌多糖はＯ抗原である。
【００３８】
本発明の第３態様の別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、微生物の莢膜ポリマーである。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である。
【００３９】
本発明の第３態様のさらに別の望ましい実施形態では、目的の抗原は、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、それらの原子のそれぞれは、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸から独立して選択されている。望ましくは、その有機ポリマーは微生物に由来する。別の望ましい実施形態では、有機ポリマーは自然発生のものではない。
【００４０】
本発明の第３態様のさらに望ましい実施形態では、ステップ（ｉ）の混合ステップは、第２の目的の抗原、または第３の目的の抗原さえも含む。
【００４１】
第４態様では、本発明は、被験体に感染病原体に対するワクチンを接種する方法を特徴とする。この方法は、被験体で抗体の産生を誘発するのに十分な量の本発明の第１態様のワクチン組成物を該被験体に投与するステップを含む。本発明の第４態様の望ましい実施形態では、方法は、被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の本発明の第１態様のワクチン組成物を該被験体に投与する２回目の投与ステップを含む。望ましくは、本発明の第４態様では、抗体の産生がＴ細胞に依存する。本発明の第４態様の別の望ましい実施形態では、被験体が感染病原体に感染するのを防止または低減するのに、抗体の産生が十分である。感染病原体は、肺炎球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌Ｂ型、緑膿菌、野兎病菌、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、または大腸菌が望ましい。
【００４２】
本発明の第４態様の別の望ましい実施形態では、方法は、被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の、目的の抗原を含む第２のワクチン組成物を該被験体に提供する２回目の投与ステップを含む。望ましくは、被験体が第２の感染病原体に感染するのを防止または低減するのに、抗体の産生が十分である。
【００４３】
本発明の第４態様の望ましい実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。本発明の第４態様のさらに望ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００４４】
本発明の態様のいずれか一つの望ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖は、Kongら,(J. Med. Microbiol. 54:35−356, 2005)に記載されている莢膜型の一つである。例えば、望ましくは、肺炎連鎖球菌多糖莢膜型は、１（例えば、１−ｇまたは１−ｑ）、２（例えば、２−ｇ、２−ｑ、または２−４１Ａ）、３（例えば、３−ｇ、３−ｑ、３−ｃ、または３−ｎｚ）、４、５（例えば、５−ｑ、５−ｃ、５−ｑａｐ、または５−ｇ）、６Ａ（例えば、６Ａ−ｇ、６Ａ−ｃ１、６Ａ−ｃ２、６Ａ−ｎ、６Ａ−ｑａｐ、６Ａ−６Ｂ−ｇ、６Ａ−６Ｂ−ｑ、または６Ａ−６Ｂ−ｓ）、６Ｂ（例えば、６Ｂ−ｃ、６Ａ−６Ｂ−ｇ、６Ａ−６Ｂ−ｑ、または６Ａ−６Ｂ−ｓ）、７Ｆ（例えば、７Ｆ−７Ａ）、７Ａ（例えば、７Ａ−ｃｎまたは７Ｆ−７Ａ）、７Ｂ（例えば、７Ｂ−４０）、７Ｃ（例えば、７Ｃ−１９Ｃ−２４Ｂ）、８（例えば、８−ｇまたは８−ｓ）、９Ａ（例えば、９Ａ−９Ｖ）、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ（例えば、９Ａ−９Ｖ）、９Ｖおよび１４、１０Ｆ（例えば、１０Ｆ−ｑ、１０Ｆ−ｃａ、または１０Ｆ−１０Ｃ）、１０Ａ（例えば、１０Ａ−１７Ａまたは１０Ａ−２３Ｆ）、１０Ｂ（例えば、１０Ｂ−１０Ｃ）、１１Ｆ、１１Ａ（例えば、１１Ａ−ｎｚまたは１１Ａ−１１Ｄ−１８Ｆ）、１１Ｂ（例えば、１１Ｂ−１１Ｃ）、１１Ｃ（例えば、１１Ｂ−１１Ｃまたは１１Ｃ−ｃｎ）、１１Ｄ（例えば、１１Ａ−１１Ｄ−１８Ｆ）、１２Ｆ（例えば、１２Ｆ−ｑまたは１２Ｆ−１２Ａ−１２Ｂ）、１２Ａ（例えば、１２Ａ−ｃｎ、１２Ａ−４６、または１２Ｆ−１２Ａ−１２Ｂ）、１２Ｂ（例えば、１２Ｆ−１２Ａ−１２Ｂ）、１３（例えば、１３−２０）、１４（例えば、１４−ｇ、１４−ｑ、１４−ｖ、または１４−ｃ）、１５Ｆ（例えば、１５Ｆ−ｃｎ１または１５Ｆ−ｃｎ２）、１５Ａ（例えば、１５Ａ−ｃａ１、１５Ａ−ｃａ２、または１５Ａ−ｃｈｗ）、１５Ｂ（例えば、１５Ｂ−ｃ、１５Ｂ−１５Ｃ、１５Ｂ−１５Ｃ−２２Ｆ−２２Ａ）、１５Ｃ（例えば、１５Ｃ−ｃａ、１５Ｃ−ｑ１、１５Ｃ−ｑ２、１５Ｃ−ｑ３、１５Ｃ−ｓ、１５Ｂ−１５Ｃ、または１５Ｂ−１５Ｃ−２２Ｆ−２２Ａ）、１６Ｆ（例えば、１６Ｆ−ｑまたは１６Ｆ−ｎｚ）、１６Ａ、１７Ｆ（例えば、１７Ｆ−ｎおよび１７Ｆ−３５Ｂ−３５Ｃ−４２）、１７Ａ（例えば、１７Ａ−ｃａまたは１０Ａ−１７Ａ）、１８Ｆ（例えば、１８Ｆ−ｃａ、１８Ｆ−ｗ、または１１Ａ−１１Ｄ−１８Ｆ）、１８Ａ（例えば、１８Ａ−ｎｚまたは１８Ａ−ｑ）、１８Ｂ（例えば、１８Ｂ−１８Ｃ）、１８Ｃ（例えば、１８Ｂ−１８Ｃ）、１９Ｆ（例えば、１９Ｆ−ｇ１、１９Ｆ−ｇ２、１９Ｆ−ｇ３、１９Ｆ−ｑ、１９Ｆ−ｎ、または１９Ｆ−ｃ）、１９Ａ（例えば、１９Ａ−ｇ、１９Ａ−、または１９Ａ−ｃａ）、１９Ｂ、１９Ｃ（例えば、１９Ｃ−ｃｎ１、１９Ｃ−ｃｎ２、または７Ｃ−１９Ｃ−２４Ｂ）、２０（例えば、１３−２０）、２１（例えば、２１−ｃａまたは２１−ｃｎ）、２２Ｆ（例えば、１５Ｂ−１５Ｃ−２２Ｆ−２２Ａ）、２３Ｆ（例えば、２３Ｆ−ｃ、１０Ａ−２３Ｆ、または２３Ｆ−２３Ａ）、２３Ｂ（例えば、２３Ｂ−ｃまたは２３Ｂ−ｑ）、２４Ｆ（例えば、２４Ｆ−ｃｎ１、２４Ｆ−ｃｎ２、または２４Ｆ−ｃｎ３）、２４Ａ、２４Ｂ（例えば、７Ｃ−１９Ｃ−２４Ｂ）、２５Ｆ（例えば、２５Ｆ−３８）、２５Ａ、２７、２８Ｆ（例えば、２８Ｆ−２８Ａまたは２８Ｆ−ｃｎ）、２８Ａ（例えば、２８Ｆ−２８Ａ）、２９（例えば、２９−ｃａまたは２９−ｑ）、３１、３２Ｆ（例えば、３２Ｆ−３２Ａ）、３２Ａ（例えば、３２Ａ−ｃｎまたは３２Ｆ−３２Ａ）、３３Ｆ（例えば、３３Ｆ−ｇ、３３Ｆ−ｑ、３３Ｆ−ｃｈｗ、３３Ｆ−３３Ｂ、または３３Ｆ−３３Ａ−３５Ａ）、３３Ａ（例えば、３３Ｆ−３３Ａ−３５Ａ）、３３Ｂ（例えば、３３Ｂ−ｑ、３３Ｂ−ｓ、または３３Ｆ−３３Ｂ）、３３Ｄ、３４（例えば、３４−ｃａまたは３４ｓ）、３５Ｆ（例えば、３５Ｆ−４７Ｆ）、３５Ａ（例えば、３３Ｆ−３３Ａ−３５Ａ）、３５Ｂ（例えば、１７Ｆ−３５Ｂ−３５Ｃ−４２）、３６、３７（例えば、３７−ｇまたは３７−ｃａ）、３８（例えば、２５Ｆ−３８）、３９（例えば、３９−ｃｎ１または３９−ｃｎ２）、４０（例えば、７Ｂ−４０）、４１Ｆ（例えば、４１Ｆ−ｃｎまたは４１Ｆ−ｓ）、４１Ａ（例えば、２−４１Ａ）、４２（例えば、１７Ｂ−３５Ｂ−３５Ｃ−４２）、４３、４４、４５、４６（例えば、４６−ｓまたは１２Ａ−４６）、４７Ｆ（例えば、３５Ｆ−４７Ｆ）、４７Ａ、４８（例えば、４８−ｃｎ１または４８−ｃｎ２）、またはGenBank受託番号ＡＦ５３２７１４もしくはＡＦ５３２７１５である。
【００４５】
定義
ワクチンと関連して本明細書で使用する「投与すること」は、被験体で免疫応答を誘発するのに十分な用量で、被験体にワクチンを提供することを意味し、その際、免疫応答によって、ワクチンに含まれている抗原と特異的に結合する抗体が産生される。望ましくは、投与には、筋肉内注射、皮内注射、または経皮注射が含まれ、望ましくは好適な免疫アジュバントの投与が含まれる。投与には、１回ワクチン投与または複数回用量でのワクチン投与を含めてよい。望ましくは、２回目の投与は、感染病原体による感染を防止するように、被験体で抗体の産生をブーストするように設計する。ワクチン投薬の頻度および量は、そのワクチンの比活性に依存し、常法の実験によって容易に決定することができる。
【００４６】
「架橋」は、「長さゼロ」のリンカーを使用したときは直接的に、または化学的リンカーである第３分子を使用することによって、２分子間、巨大分子間、または分子の組合せ間、例えば担体タンパク質間に共有結合を形成することを意味し、その化学的リンカーは２個の官能基を有し、それぞれの官能基は、２個の別個の分子の一個と共有結合を形成し、または同じ分子中の２個の別個の基の間に共有結合を形成することができる（すなわち、これらは、ポリマー周囲を取り巻くこともできる「ループ」を形成するであろう）。例示的なリンカーには、２個の担体タンパク質を架橋することができる二官能性リンカーが含まれる。架橋は、抗原と担体タンパク質間にも生じうる。
【００４７】
本明細書で使用する「抗原」は、抗体または抗体フラグメントが特異的に結合する、任意の分子または分子の組合せを意味する。
【００４８】
本明細書で使用する「二官能性リンカー」は、２個の官能基を有する化合物を意味し、それらの官能基は、それぞれ別々に、２個の別個の分子、原子、または分子集合体と共有結合を形成することができる。例示的な二官能性リンカーについては、例えば、G. T. Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996)およびDick and Beurret (Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal 10:48−114, 1989)が記載している。二官能性リンカーは、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルが望ましい。
【００４９】
本明細書で使用する「リンカー」は、２個以上の分子を共有結合する、化合物または化学結合を意味する。望ましくは、リンカーは、グルタルアルデヒドまたは式
【化３】
【００５０】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物である。結合は、結合分子を使用せず、直接的であってよい。例えば、タンパク質のカルボキシル基は、カルボジイミド化学を使用して直接的に、またはこの種類の架橋を触媒するトランスグルタミナーゼを使用し、酵素的に、そのアミノ基と直接結合することができる。
【００５１】
「抗体の産生をブーストする」とは、「ブースター応答」と称する、２回目の抗原への曝露中に生じる記憶Ｂ細胞の活性化を意味し、結果として抗体の産生を持続させる持続性「二次的」記憶免疫応答をさす。
【００５２】
「担体タンパク質」は、そのタンパク質自体および／または担体タンパク質と複合体を形成する抗原に対して免疫応答を引き出す、ワクチンに使用されるタンパク質を意味する。望ましくは、担体タンパク質によって複合体中に捕捉されることによって、抗原は担体タンパク質と非共有結合する。それにもかかわらず、抗原と担体タンパク質が互いに共有結合することも可能である。望ましくは、担体タンパク質は、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを含む。同様に「担体タンパク質」の定義に包含されるものは、分枝鎖ペプチドの多抗原ペプチド（ＭＡＰ）である。ＭＡＰにはリジンを含めるのが望ましい。例示的な望ましい担体タンパク質には、（化学的または遺伝子的）、毒素および変異体でありうるトキソイドが含まれる。望ましくは、担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（および関連分子）、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼ、またはリンカーにより架橋できる別の任意のタンパク質である。
【００５３】
「ＤＮＩ」は、Bensonら,(Biochemistry 37:3941−3948, 1998)が記載したように、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の変異形であるドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）タンパク質を意味する。
【００５４】
抗原に関して本明細書で使用する「捕捉される」は、生理学的状態下で担体タンパク質と共に複合体に留まっている抗原を意味する。望ましくは、抗原と担体タンパク質間にさほど共有結合が存在しない状況で、抗原は担体タンパク質によって複合体中に捕捉される。本明細書で使用する、さほど共有結合が存在しないということは、その抗原の５０％以下が担体タンパク質と共有結合していることをさす。望ましくは、その抗原の４０％以下、３０％以下、１０％以下、または５％以下が担体タンパク質と共有結合している。
【００５５】
「感染」は、微生物、例えば細菌、菌類、寄生虫、またはウイルスが、被験体に侵襲することを意味する。感染は、例えば、被験体身体中もしくは被験体身体上に通常存在する過剰な微生物の増殖、または被験体中もしくは被験体上に通常存在しない微生物の増殖を含む。過剰量の微生物集団が、被験体の身体中または身体上に存在するとき、あるいは微生物集団の存在が、被験体の細胞を損傷し、または被験体の組織に病理学的症状をもたらすとき、被験体は微生物に感染している。
【００５６】
「感染病原体」は、感染をもたらす微生物を意味する。
【００５７】
「免疫原性物」は、被験体で免疫応答を誘発する化合物を意味する。望ましくは、免疫応答は、ＩｇＧ抗体の産生を含むＴ細胞依存性免疫応答である。
【００５８】
「微生物」は、被験体で感染を引き起こすことが可能な細菌、菌類、寄生虫、またはウイルスを意味する。
【００５９】
「微生物の莢膜ポリマー」は、微生物の莢膜被膜中または被膜上に存在するポリマーを意味する。望ましくは、微生物の莢膜ポリマーは、有機ポリマー、例えば、多糖、ホスホ多糖；アミノ糖がＮアセチル置換されている多糖；スルファニル化糖、別の硫酸修飾糖、またはリン酸修飾糖を含む多糖；ポリアルコール、ポリアミノ酸、タイコ酸、およびリポ多糖のＯ側鎖である。
【００６０】
「モノマー」は、モノマーなどと２個以上の結合を形成することができる分子構造を意味し、「ポリマー」部分である場合、繰り返しモノマー下部構造の鎖または一連の分枝連結鎖をもたらすことが多い。
【００６１】
「有機ポリマー」は、共有結合したモノマーであって、それぞれが以下の原子：炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸の３個以上を有するモノマーから構成されたポリマーを意味する。有機ポリマーは、多糖、ホスホ多糖；アミノ糖がＮアセチル置換されている多糖；スルファニル化糖、別の硫酸修飾糖、またはリン酸修飾糖を含む多糖；糖、ポリアルコール、ポリアミノ酸、タイコ酸、およびリポ多糖のＯ側鎖が望ましい。
【００６２】
「ポリアルコール」は、カルボニル基が、一級または二級ヒドロキシル基に還元されている炭水化物の水素化形を意味する。例示的なポリアルコールは、ポリ酸化アルキレン（ＰＡＯ）、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）；ポリ−ビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物；ポリスチレン−ｃｏ−リンゴ酸無水物；カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース；キトサン加水分解物；ヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプンなどのデンプン；グリコーゲン；アガロースおよびその誘導体；グアールガム；プルラン；イヌリン；キサンタンガム；カラギナン；ペクチン；アルギン酸加水分解物；ソルビトール；グルコース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、グロース、キシロース、トレオース、ソルボース、フルクトース、グリセロール、マルトース、セロビオース、スクロース、アミロース、アミロペクチンのアルコール；またはモノプロピレングリコール（ＭＰＧ）である。
【００６３】
「ポリアミノ酸」は、ペプチド結合によって連結した少なくとも２個のアミノ酸を意味する。望ましくは、ポリアミノ酸は、反復性アミノ酸配列または同じアミノ酸の鎖を含むペプチド（すなわちホモポリマー）である。
【００６４】
「シッフ塩基を還元する」とは、シッフ塩基の二重結合を水素原子で飽和させる還元剤に、アゾメチンまたは式Ｒ１Ｒ２Ｃ＝Ｎ−Ｒ３（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、典型的には炭素原子を含む化学的下部構造である）の化合物を曝露することを意味する。還元方法は、当業者には公知である。
【００６５】
抗体もしくはそのフラグメントに関して本明細書で使用する「特異的に結合する」とは、等量の別の任意のタンパク質に比べて、特定のタンパク質、例えば抗原に対して、抗体もしくは抗体フラグメントの親和性が高いことを意味する。望ましくは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的方法を使用し定量した場合、抗体もしくは抗体フラグメントは、関連抗原を含む別の任意の抗原の等量に対する親和性よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、３０倍、または１００倍高い親和性をその抗原に対して有する。
【００６６】
「被験体」は、微生物が感染する可能性がある動物を意味する。望ましくは、被験体は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマである。望ましい実施形態では、被験体は、ヒト、例えばヒト児童である。望ましくは、被験体は、ヒト小児、乳児、または思春期前の児童である。
【００６７】
「Ｔ細胞非依存性抗原」は、Ｔリンパ球の協力なしに抗体を生じる抗原を意味する。望ましくは、Ｔ細胞非依存性抗原は、Ｔリンパ球の協力なしに直接Ｂリンパ球を刺激する。例示的な望ましいＴ細胞非依存性抗原には、莢膜抗原のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、アルギン酸（algenate）、デキストラン、多糖（ＰＳ）、ポリアミノ酸、ポリアルコール、および核酸が含まれる。
【００６８】
利点
既存のワクチン技術と比較して、本発明のワクチンは、製造が簡単であり、化学的問題を起こしにくく、免疫学的問題も起こしにくく、それほど高価ではなく、異なる目的の抗原と担体タンパク質に対して、抱合体技術よりも適応性が高く、多価ワクチン（複数の抗原に対して防御的なワクチン）の創出に、より柔軟性がある。
【００６９】
本発明のワクチンは、担体タンパク質と、免疫応答を誘起させるための抗原との間に共有結合を必要とせず、従って抱合型ワクチン技術と比較して、その作製方法は簡単になり、その調製コストは低下する。発展途上国では、多糖（ＰＳ）−タンパク質抱合型ワクチンを製造販売するのは法外に高価であり、それぞれのワクチンに要求される高度に専門化された化学、およびＰＳと担体タンパク質の製造精製コストのために、従来の抱合型ワクチンを安価に製造するのは難しい。
【００７０】
本発明のワクチンはまた、かつては難治性であった抗原に対して、免疫を安全に誘発することができるワクチンの必要性にも対処するものである。そのようなワクチンは、一価（一免疫応答を誘発する単一抗原を有する）であっても、または多価（複数の免疫応答を誘発する複数の抗原を有する）であってもよい。ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンドを含むワクチンは、難治性抗原にせよそうでないにせよ、免疫応答を誘起することは分かっているが、安全性が低い傾向がある。なぜなら、ＴＬＲリガンドは、しばしば、炎症誘発性であり、小用量であっても有毒で、反応誘発性（reactogenic）もあり、本発明のワクチンと比較して有害な症状をもたらす可能性が高いからである。
【００７１】
以下、発明を実施するための最良の形態、図面、および特許請求の範囲から、本発明の他の特徴および利点を明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＰＳと担体タンパク質破傷風トキソイド間に産生された抱合体に対して、抱合型ワクチンにより抗ＰＳ ＩｇＧ免疫応答を誘発する、非限定的に提案される経路の概略図である。このモデルでは、ＰＳを認識する抗体受容体を提示するＢ細胞のみがＰＳ−タンパク質抱合体に結合する。従って、担体タンパク質は、正確なＰＳ結合特異性を提示するＢ細胞の表面と結合する。
【図２】架橋について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および抗ＰＡ抗血清によるウェスタンブロッティングにより、ＰＣＭＶおよび対照調製物をモニターしたウエスタンブロット分析の画像である。ＤＮＩタンパク質は、グルタルアルデヒド架橋前に８４ｋＤａで泳動する。ＰＣＶＭ１〜ＰＣＭＶ３（レーン１〜３）は、２２０ｋＤａを超える分子量でのバンド泳動により実証されるように、ＤＮＩタンパク質の広範な架橋を示す。ＰＧＡ非存在下で架橋させたＤＮＩタンパク質のみでも、同じ高分子量種が見られる（レーン５）。それに反して、ＰＧＡと混合したが、グルタルアルデヒドで処理しなかったＤＮＩでは、ＤＮＩと共泳動するバンドまたは低分子量種（レーン４）が見られる。
【図３】３種のＰＣＭＶ調製物（ＰＣＭＶ１〜ＰＣＭＶ３；調製物１〜３）および２種の抗原対照調製物４および５で免疫化したマウスで、ＩｇＭおよびＩｇＧ特異的抗ＤＮＩ免疫応答を測定するために使用した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。ＤＮＩタンパク質は、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔ）で架橋しなかった対照調製物４を除き、全ての調製物で高度に免疫原性であった。しかし、これらのＤＮＩ特異的免疫応答は排他的にＩｇＧを基礎とした。免疫化７日目でさえも抗ＤＮＩ ＩｇＭは検出されなかったが、顕著な抗ＤＮＩ ＩｇＧの応答が、１７日目までにＰＣＭＶ調製物で免疫化したマウス、および架橋ＤＮＩのみ（調製物５）で免疫化したマウスで検出することができた。調製物４を含む全ての調製物について、３０日目にＤＮＩに対して強力なブースター応答が認められた。
【図４】３種のＰＣＭＶ調製物（ＰＣＭＶ１〜ＰＣＭＶ３；調製物１〜３）および２種の抗原対照調製物４および５で免疫化したマウスで、ＩｇＭ特異的抗ＰＧＡ免疫応答を測定するために使用した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答は、莢膜ポリマーに典型的なパターンを示した。対照調製物４では、７日目に検出可能な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が生じたが、この応答は１７日目または３０日目にブーストされなかった。全てのＰＣＭＶ調製物で、７日目に抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が誘発され、次いで１７日目および３０日目にさらに強力な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が排他的に発生した。予想通り、対照調製物５（架橋ＤＮＩのみ）では、ＩｇＭまたはＩｇＧのどちらを基礎とする抗ＰＧＡ応答も生じなかった。
【図５】３種のＰＣＭＶ調製物（ＰＣＭＶ１〜ＰＣＭＶ３；調製物１〜３）および２種の抗原対照調製物４および５で免疫化したマウスで、ＩｇＧ特異的抗ＰＧＡ免疫応答を測定するために使用した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。ＰＣＭＶ１〜３では、１７日目に顕著になった、強力なＩｇＧを基礎とした抗ＰＧＡ応答が生じ、次いで３０日目にはっきりとブーストされた。
【図６】免疫化前、およびＤＮＩとアルギン酸を含むＰＣＭＶ（ＤＮＩ−ＡＬＧ Ｃ、ＤＮＩ ＡＬＧ Ａ）、ならびにアルギン酸（algenate）（ＡＬＧ）、デキストラン（ＤＥＸ）、およびＰＧＡと複合体を形成したＤＮＩを含む、「ワンポット」三価ＰＣＭＶ調製物で免疫化後、３０日目のプールした血清のＩｇＭ抗体力価を示すグラフである。
【図７】ＤＮＩとアルギン酸を含むＰＣＭＶ（ＤＮＩ−ＡＬＧ Ｃ、ＤＮＩ ＡＬＧ Ａ）、ならびにアルギン酸（algenate）（ＡＬＧ）、デキストラン（ＤＥＸ）、およびＰＧＡと複合体を形成したＤＮＩを含む、「ワンポット」三価ＰＣＭＶ調製物で免疫化後、６０日目の抗原特異的血清ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである。
【図８】ＤＮＩとアルギン酸を含むＰＣＭＶ（ＤＮＩ−ＡＬＧ Ｃ、ＤＮＩ ＡＬＧ Ａ）、ならびにアルギン酸（algenate）（ＡＬＧ）、デキストラン（ＤＥＸ）、およびＰＧＡと複合体を形成したＤＮＩを含む、「ワンポット」三価ＰＣＭＶ調製物で免疫化後、１２８日目の抗ＰＳ ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである。
【図９】AおよびBは、米国菌培養収集所より入手し、Merck社が製造した、またはSerum Institute of India（ＳＩＩ）社より入手した肺炎連鎖球菌多糖（ｐｓｓ）を使用したＩＬ−６アッセイを示すグラフである。
【図１０】ＳＩＩより入手したｐｓｓ ６Ｂ中の混入物質は、処理２（１Ｍ ＮａＯＨ中８０℃で１時間インキュベーション）を使用し除去できることを示すグラフである。処理１は、多糖からタンパク質を除去するための一連の５種のフェノール抽出物である。
【図１１】ｐｓｓ ６Ｂを含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）よりも有効であることを示すグラフである。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、ＤＴ＝ジフテリア毒素、ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、およびＴＴｘ＝破傷風トキソイド。
【図１２】ｐｓｓ ６Ｂを含むＰＣＭＶが、ＩｇＭの産生誘発では、Prevnar（登録商標）と同程度に有効であることを示すグラフである。
【図１３】ｐｓｓ ６Ｂを含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）よりも有効であることを示すグラフである。
【図１４】ｐｓｓ １４を含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）とほぼ同等であることを示すグラフである（ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、ＴＴｘ＝破傷風トキソイド）。
【図１５】ｐｓｓ １４を含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）とほぼ同等であることを示すグラフである（ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、ＴＴｘ＝破傷風トキソイド）。
【図１６】ｐｓｓ １４を含むＰＣＭＶが、ＩｇＧの産生誘発では、Prevnar（登録商標）とほぼ同等であることを示すグラフである（ＤＴｘ＝ジフテリアトキソイド、ＴＴｘ＝破傷風トキソイド）。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、Ｔ細胞非依存性抗原、または通常、弱い免疫応答を引き出す抗原、例えば、多糖（ＰＳ）、ポリアルコール、ポリアミノ酸、および他の有機ポリマーなどに対して、免疫を提供するためのワクチン組成物、およびそのような組成物を製造し投与する方法を特徴とする。本発明のワクチンは、典型的なＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンの強力な免疫学的特性を有しているが、望ましくは、目的の抗原、例えばＰＳもしくは莢膜有機ポリマーと、担体タンパク質との結合に顕著な共有結合性原子結合は必要とされないという点で抱合型ワクチンと異なる。むしろ、目的の抗原、例えばＰＳもしくは莢膜有機ポリマーは、担体タンパク質によって捕捉されている。例えば、タンパク質マトリックスは、ＰＳもしくは莢膜有機ポリマーなどの溶解性抗原の存在下、担体タンパク質分子同士を共有結合的に架橋することにより形成されうる。これらのワクチンを、タンパク質マトリックスワクチンと称する。互いに高度に架橋している担体タンパク質は、抗原の捕獲、その抗原の取込み、および免疫細胞中での抗体産生の刺激を促進できるマトリックスを形成することができる。担体タンパク質マトリックスは、抗原を封入した「メッシュ」、または抗原が「糸」であり、タンパク質もしくは架橋したタンパク質複合体が、この例では「ビーズ」である、一連の「糸に通したビーズ」の形であってよい。担体タンパク質が、抗原を取り囲んで抗原の周囲に環を形成している場合、または抗原がその中に絡み取られている三次元メッシュを形成している場合、抗原は担体タンパク質に捕捉されている。また、担体および抗原は、例えば、担体タンパク質と抗原鎖中の内鎖（intra−chain）との架橋によって架橋していてもよい。望ましい実施形態では、抗原と担体タンパク質は非共有結合している。そのような非共有結合には、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合が含まれうる。非共有結合には、抗原とタンパク質複合体を非共有結合させる物理的幾何的配置（上記に類似する「糸に通したビーズ」を参照）を含めることができる。
【００７４】
抗原を捕捉するのに、担体タンパク質は、担体タンパク質自体と架橋しなくてもよい。抗原は、例えば、担体タンパク質と抗原を水溶液に混合し、担体タンパク質を沈殿させ、それによって抗原とタンパク質とを共沈殿させることによって捕捉することもできる。抗原はまた、抗原と担体タンパク質の混合物から、化合物（例えば、ミョウバン、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ポリホスファゼン、または疎水性もしくはイオン性相互作用によって操縦される親和性をタンパク質に対して有する他のポリマー）を沈殿させることによって、担体タンパク質により捕捉することもできる。タンパク質を沈殿させる方法は、当技術分野で標準的であり、中でも、例えば（１）混合物のｐＨを変化させる方法、（２）混合物の無機塩濃度を上昇させ、または低下させる方法により、溶液のイオン強度を変化させる方法、（３）または混合物に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または硫酸アンモニウムを加える方法、（４）混合物を加熱して、タンパク質を凝固させる（すなわち、沈殿物またはゲルが形成される）方法、（５）混合物中のタンパク質を不溶性にする方式で、そのタンパク質を化学的に修飾する方法、および（６）タンパク質の架橋および／または沈殿を引き起こすために、タンパク質溶液に、十分な線束の電離放射線（紫外線、γ線、またはβ線）を照射する方法が含まれる。
【００７５】
病原体の莢膜型タンパク質を使用する場合、そのようなワクチンは、タンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）と称する。実施例に記載するように、Ｔ非依存性莢膜抗原モデルをベースとするＰＣＭＶ、ポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）をベースとするＰＣＭＶ、およびアルギン酸（algenate）およびデキストランをベースとするＰＣＭＶ、および例示的な担体タンパク質であるＤＮＩをベースとするＰＣＭＶを含むＰＣＭＶを生成した。ＰＧＡ ＰＣＭＶは、大量生産が簡単であり、ＰＧＡ−タンパク質抱合型ワクチンに典型的な免疫応答を誘発することが判明した。本発明のワクチンは、任意の目的の抗原の存在下、多くの可能な担体タンパク質のいずれかと架橋させるための、多くの可能なリンカーのいずれかを使用し調製してよい。例示的であり好ましいリンカー、担体タンパク質、および目的の抗原を本明細書に記載する。
【００７６】
多糖（ＰＳ）は、サッカライド（糖）のポリマーである。莢膜由来のＰＳは、莢膜を有する細菌病原体、例えば、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、チフス菌、およびインフルエンザ菌Ｂ型に対する防御免疫に関わる一次抗原成分である。微生物のＰＳをベースとするワクチンで、青年期の人および成人を免疫化することは、疾患の負担の軽減で成功しているが、小児および幼児（すなわち２４ヵ月齢未満の児童）に防御免疫を提供するには、あまり有効ではないことが証明されている。児童は、成熟適応免疫レパートリーがまだ発達しておらず、そのような若年のワクチン接種者では、莢膜ＰＳなどのＴ細胞非依存性抗原も免疫原性が低く、長期防御免疫応答（すなわち免疫学的記憶応答）はもたらされない。
【００７７】
ＰＳなどのＴ細胞非依存性抗原は、ＰＳとタンパク質とを化学的に結合させることによって、Ｔ細胞依存性抗原に転換することができ、この過程を「抱合」と呼び、ＰＳ構造中の原子と、「担体」タンパク質中に存在するアミノ酸の側鎖原子との間の共有結合の形成が含まれる。そのような「抱合型ワクチン」は、Ｂ細胞の成熟およびアイソタイプスイッチの誘発をより効率よく促進し、正確な抗ＰＳ防御プロフィールを備えた極めて高いレベルの抗体がもたらされる。防御抗体は、それらのＰＳ抗原に対して親和性が高く、典型的には、補体固定およびオプソニンエフェクター活性を備えた長期持続型抗体である、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスのものがある。
【００７８】
ＰＳと担体タンパク質破傷風トキソイド間に生成された抱合体により、抗ＰＳ ＩｇＧ免疫応答が誘発される例示的で非限定的な経路を図１に示す。このモデルでは、ＰＳを認識する抗体受容体を提示するＢ細胞のみが、ＰＳ−タンパク質抱合体と結合する。従って、担体タンパク質は、正確なＰＳ結合特異性を提示するＢ細胞の表面と結合する。タンパク質−ＰＳ複合体は、これらのＢ細胞によって細胞内液胞区画に取り込まれ、そこで担体はタンパク質分解によって処理される。担体タンパク質由来ペプチドは、輸送され、ＭＨＣ−クラスＩＩ受容体（ＭＨＣ-ＩＩ）提示溝に装填される。このＭＨＣ-ＩＩ−担体ペプチド複合体は、Ｂ細胞表面に提示される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＭＨＣ-ＩＩ−ペプチド複合体を認識すると、Ｔ細胞は活性化しサイトカインを分泌するが、このサイトカインは、Ｂ細胞分化を誘発するための「補助」を提供する。Ｂ細胞は、数が増大し、次いで抗体を分泌する「形質細胞」に分化する。初期には、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）は、形質細胞によって産生されるが、最終的にはＴ細胞は、その形質細胞がクラス替えし、ＩｇＧなど、他のアイソタイプクラスの抗体を産生するのを助ける。この過程は形質細胞で継続し、変異を変化させ、ＰＳ−タンパク質抱合体に、よりさらに高い親和性を有する抗体受容体を生成させる。抗原は一掃されるので、高親和性形質細胞のみが、循環中に残存する残留ＰＳ−タンパク質抱合体によって活性化される。形質細胞のＴ細胞依存性成熟の過程は継続し、ＩｇＧクラスの高親和性抗体を産生する血漿細胞集団が増殖する。免疫化した被験体、例えばヒトの血清中の抗ＰＳ ＩｇＧ抗体レベルを測定することによって、その増殖は容易にモニターすることができる。
【００７９】
最終的に、成熟およびスイッチ過程によって、持続性であり、ＰＳに特異的な記憶Ｂ細胞が産生される。記憶Ｂ細胞は、ＰＳに曝露されると、直ちに活性化が可能であるという特有の性質を有する。活性化すると、記憶Ｂ細胞は増幅し、直ちに抗ＰＳ ＩｇＧを産生する。二回目のＰＳ抗原への曝露中に生じる記憶Ｂ細胞の活性化は、「ブースター応答」と称し、持続性の「二次的」記憶免疫応答を示すものである。一回目の免疫化によって、ＩｇＭ抗体と、いくらかのＩｇＧ抗体が産生の刺激を受けうる。二回目の免疫化、すなわち「ブースター」ショットによって、一回目の免疫化によって既にプログラムされた記憶細胞が、多量のＩｇＧを産生するように刺激される。記憶免疫応答である。
【００８０】
一般的に、Ｔ細胞非依存性抗原は、持続性の免疫、すなわちＩｇＧ抗体の産生は刺激せず、ＩｇＭ抗体の産生は刺激しうるが、余り強力ではなく時間も短い。そのようなものとして、通常、ＰＳ抗原単独ではＩｇＧのブースター応答は生じない。しかし、ＰＳ−タンパク質抱合体によって一回目の免疫化が実施されると、ＰＳによってまさにブースター応答がもたらされる。なぜなら、抱合体によって誘発された記憶細胞は、ＩｇＧを産生するように既にプログラムされているからである。実際、ワクチン接種動物もしくはヒトでのブースター応答は、ＰＳを提示する微生物への曝露のために防御応答が模倣されたと考えられる。抱合型ワクチンによる免疫化後何年も、ワクチンが、免疫化された被験体の保護に役立つためには、この長期記憶が重要な意味を持つ。従って、ＰＳ−タンパク質抱合体は、（１）ＰＳ抗原に対して高レベルのＩｇＧを誘発する能力、および（２）ＰＳ抗原に対して記憶免疫応答を誘発する能力に対して評価される。典型的には、ＰＳ抗原はこれらの特性を示さず、従って劣る抗原である。抱合型ワクチンの合成の難しさおよびその生産コストによって、ＰＳに対する免疫応答が防御的であるうる多くの細菌性疾患に向けた抱合型ワクチンの開発が遅れている。
【００８１】
他のＴ細胞非依存性抗原には、アミノ酸ホモポリマー、例えば、ポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）およびポリアルコールが含まれる。実際、ほとんどの生物学的ポリマーはＴ細胞非依存性抗原である。ポリマーは、その化学構造（および従ってエピトープ）の反復的性質のために、それらを認識するＢ細胞上の免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体と架橋することができる。従って、ポリマーは、多糖がするのと同じ方式で、抗ポリマーＩｇＭを産生するようにＢ細胞を活性化することができる。例えば、アミノ酸ホモポリマーである炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は、免疫原性が低く、同様にＴ細胞非依存性抗原である莢膜ポリマーである。タンパク質担体と抱合したＰＧＡから構成されるワクチンは、免疫原性が高く、抗ＰＧＡ ＩｇＧを誘発し、およびＰＧＡに対して免疫学的記憶を誘発することができる。従って、ほとんどのポリマーは、その免疫原性の点でＰＳのように応答する。なぜなら、それらのポリマーは、ＭＨＣ-ＩＩと関連して処理することも、提示することも不可能で、それによってＴ細胞補助を召集することができないからである。一例外は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と称する、別の受容体クラスと相互作用する数種の自然発生ポリマーに見出される。一度活性化されると、ＴＬＲは、宿主細胞によるサイトカインの産生を誘発し、適応免疫応答を変化させることができる。いくつかのＰＳは、ＴＬＲリガンドと共有結合し、またはそのようなリガンドが混入している。例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）は、免疫原性が高く、ＩｇＧおよび記憶応答を誘発するＰＳであり、ＬＰＳの脂質Ａ部分は、ＴＬＲリガンドであり免疫学的特性を担いうる。
【００８２】
別の実施例では、数種の肺炎球菌ＰＳは、たとえタンパク質担体に結合していなくても、ＩｇＧへのアイソタイプスイッチを誘発するという点で、抱合型ワクチンの免疫学的特性のいくつかを示すことが判明している。近年、肺炎連鎖球菌の様々な株由来の個々のＰＳと同様に、市販の多糖ワクチンPneumovax−23にも、ＴＬＲリガンドが混入していることが判明した（Senら, J. Immunol. 175:3084−3091, 2005）。この知見から、これらのＰＳ調製物が、タンパク質抱合体の非存在下で、ＩｇＧへのアイソタイプスイッチを誘発できる理由が説明されよう。これらの肺炎球菌ＰＳは、マクロファージによるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌を誘発した。しかし、フェノール抽出によりＰＳをさらに精製すると、マクロファージからのサイトカインの分泌が阻害された。免疫化の研究では、フェノール抽出したＰＳは、免疫原性が低く、もはや抗ＰＳ ＩｇＧを誘発しなかった。従って、このＰＳ調製物のこれらの異常な免疫原性特性の原因である混入分子は、フェノール抽出によって除去する。混入分子は、マクロファージでＴＬＲ依存性サイトカイン応答を活性化する能力が付与されたＴＬＲリガンドであると思われる。フェノール抽出によりさらにＰＳを精製すると、混入するＴＬＲリガンドが除去され、ＰＳは完全にＴ細胞非依存性になった。
【００８３】
上の例は、タンパク質と炭水化物との共有結合なしに、ＰＳ抗原が、抱合体ＰＳ−タンパク質抗原のように働きうることを例示している。遺憾ながら、ＴＬＲリガンドは、通常炎症誘発性である。例えば、ＬＰＳは、小用量であっても有毒である。従って、ＴＬＲリガンドとＰＳとを混合すると、ＰＳに対する免疫応答は広がるかもしれないが、この手法は、反応誘発性であるワクチンを産生する可能性も高く、ワクチン接種者に有害な症状を引き起こす可能性も高い。抱合型ワクチン技術には、所望の範囲の免疫原性と安全性を備えたＰＳワクチンの生産に向けた選択方法が残されている。
【００８４】
ＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンの開発によって、浸潤性細菌病原体によって生じる小児期疾患の負担は著しく軽減された。先進世界では、インフルエンザ菌Ｂ型およびある種の髄膜炎菌株や連鎖球菌株に対するワクチンを含め、一握りのそのようなワクチンが市販されている。開発途上世界では、これらのＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンを製造販売するには法外に高価である。例えば、市販の七価肺炎球菌抱合型ワクチンは、一用量当たり約５８ドル（２００６年、米ドル）かかり、４用量治療計画が必要となる。費用だけでも、このワクチンは、疾患の負担を抱えている発展途上国の人々の手に届かないものになっている。
【００８５】
従来の抱合型ワクチンは、関与する化学、およびＰＳと担体タンパク質の製造精製費用のせいで安価に生産するのは困難である。通常、ＰＳと担体タンパク質のどちらも、妥当な結合効率で抱合化学を実施できるようになる前に、非常で純粋でなければならない。通常、様々なＰＳに対して結合化学を実施する必要があり、それは選択したＰＳおよび担体タンパク質の化学に特有なものである。この結合化学によってＰＳ中に官能基が導入され、次いで典型的にはリジン残基のイプシロンアミノ側鎖を通じて、その官能基を担体タンパク質に連結することができる。そのような結合基が導入されるようにＰＳを化学的に修飾することによって、ＰＳ上のエピトープを破壊し、（例えば、リンカーまたは修飾糖基と結合された）新規なエピトープを導入でき、その重要性は、注意深く免疫学的分析を実施することによってのみ、評価することができる。さらに、従来のＰＳ−タンパク質抱合型ワクチンについては、ＰＳのサイズ、１タンパク質担体分子当たりに結合しているＰＳ分子数、選択した担体の性質、および連鎖化学の種類が全て、抱合型ワクチンの免疫原性に作用する可能性がある。そのようなものとして、例えば、９０＋の既知の血清型のそれぞれが、異なるＰＳ構造を有する肺炎球菌疾患の場合には（Bentleyら, PLOS Genetics 2(3):e31 262−269, 2006）、全ての血清型に対して、ただ一つの抱合方法では適切ではないであろう。再現性免疫学的特性を有する抱合型ワクチンを再現可能に合成するには、ＰＳのサイズ、１タンパク質担体分子当たりに結合しているＰＳ分子数、選択した担体の性質、および連鎖化学の種類を注意深く制御する必要があり、翻って、これにより、抱合型ワクチンの製造費用が劇的に増大している。
【００８６】
抗生物質耐性の出現は、安全かつ有効なワクチンの開発の緊急性に光を当てるものである。特に発展途上国の人々にとって広く入手できるワクチンを製造するためには、ワクチン製造は費用効率も高くなければならない。小児期免疫化治療計画に、１種もしくは複数の菌種の異なる血清由来の多くの多糖抗原に対する混合抱合型ワクチンを取り入れることは、その高危険性集団でのワクチン投与を簡略化するはずである。しかし、現在の抱合型ワクチン技術は、費用効率が余り高くなく、従って混合抱合型ワクチンを開発途上世界まで届けるのは実質的に不可能である。実際、強力な確立された市場を有する先進世界においてさえ、近年のWyeth七価抱合体肺炎球菌ワクチンの供給不足は、複合体抱合型ワクチン合成技術を必要とするワクチンを産生し備蓄するのがいかに困難であるかを例示している。
【００８７】
望ましい実施形態では、本発明のワクチンは、１種または複数の細菌の莢膜成分を多価担体タンパク質マトリックスに捕捉している多価莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）である。出発物質としては、ほんの中程度に純粋な目的の抗原、例えば莢膜が必要とされるので、ＰＣＭＶは、容易に生産することができる。例えば、Vedanポリγ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は純粋ではない（ＤＮＩ上で活性なプロテアーゼを担持する）が、本明細書に記載したように、Ｔ細胞非依存性抗原に対して予想通り厳密に作働した（実施例１）。ＰＣＭＶ中へのＰＧＡの取り込みは、そのタンパク質対ＰＧＡの割合が７倍の範囲にわたって異なる全３種のＰＣＭＶ調製物で成功した。
【００８８】
本発明のワクチンの作製方法は、目的の抗原、例えば莢膜多糖の化学のいかなる知識も必要としないので、本方法は、目的の抗原および担体タンパク質の化学に適合する架橋化学を開発する必要性に捕らわれない。いくつかの抗原が、それにもかかわらずリンカーと相互作用しうるという恐れもあるが、これによってワクチンの効力が下がってはならない。目的の抗原と担体タンパク質の意図しない架橋は、ともかく免疫原性特性を有することが予期されるからである。本発明のワクチンでは、目的の抗原と担体タンパク質の架橋は、ワクチンが有効であるための要件ではない。これは、従来の抱合型ワクチンと際立って対照的であるが、抱合型ワクチンは、そのために製造および開発が阻止されている。望ましくは、本発明のワクチンは、担体タンパク質の少なくとも、例えば１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらには１００％が架橋し、目的の抗原の、例えば１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、または９０％以下を担体タンパク質と架橋させる。望ましくは、抗原の１０％以下を担体タンパク質と架橋させ、担体タンパク質の少なくとも５０％を架橋させる。
【００８９】
本明細書に記載したワクチンの製造方法は、目的の抗原、例えば莢膜ポリマーを甚だしく変化させることはない。一般的に、抗原は、還元糖をポリマー鎖の末端にそのような基を有するＰＳ莢膜用に還元するなど、可能な修飾を有して同じ状態で残存する。そのようなマイナーな修飾は、ほとんどの莢膜ＰＳの免疫原性に影響しないと思われる。なぜなら、末端糖は、ポリマーの内部残基の１／１００〜１／１０００と少ないからである。それに反して、従来の抱合型ワクチンでは、通常、莢膜ポリマーなどの抗原に、リンカー基を導入しなければならず、それは、担体タンパク質の共有結合の接着点として役立つ。莢膜ポリマーなど、多くの抗原は、その構造の一部としてカルボキシル基またはアミノ基などの反応基を有していないので、リンカーを使用する必要がある。例えば、リンカー化学をＰＳに導入すると、莢膜のエピトープが破壊され、新規なエピトープを開発することができるが、その新規なエピトープは、宿主自己エピトープとの未知の免疫学的交差反応性のために、ワクチン生成物では望ましくないであろう。
【００９０】
本明細書に記載したワクチンの製造方法は、その化学が、担体タンパク質（例えば、ＤＮＩ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素フラグメントＣ、または大腸菌β−ガラクトシダーゼ）の架橋化学のみに依存するので、抱合型ワクチン技術よりも複雑ではない。例えば、莢膜ポリマーは、ＤＮＩと混合すると架橋率が影響するが、架橋のパターンもしくは程度には影響されず、それらは、使用したタンパク質、その濃度、および添加した架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）濃度に、より大きく支配される。これらのパラメーターは、容易に調整することができ、それによってワクチンの製造に必要な時間および努力が低減し、かつ費用が節約される。
【００９１】
本明細書に記載したＰＣＭＶワクチンの製造方法は、任意の抗原、例えばあってもごくわずかのアミノ基を有する、任意の莢膜ポリマーもしくは任意のポリマー；および架橋すること可能な任意の担体タンパク質、例えば、水素化ホウ素還元によって破壊されうる重要なエピトープを有しない担体タンパク質と共に使用することができる。本明細書記載の方法で使用してよい担体タンパク質は、望ましくは少なくとも２個のリジン残基、または阻害されていない残基および化学的修飾によって架橋可能な他の残基を有する。破傷風トキソイドは可能な一担体タンパク質である。この毒素は、タンパク質のアミノ基と反応する試薬であるホルムアルデヒドで処理することによって解毒する。他の望ましい担体タンパク質には、コレラ毒素Ｂサブユニット（SBL Vaccin ABより入手可能）、ジフテリア毒素、破傷風毒素フラグメントＣ（Sigma Aldrichより入手可能）、ＤＮＩ、または大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（Sigma Aldrichより入手可能）が含まれる。
【００９２】
現在の多価抱合型ワクチンは、まず個々の抱合型ワクチンを合成し、続いてそれらを混合して「カクテル」抱合型ワクチンを生成することによって作製される（例えば、Wyeth七価肺炎球菌ワクチン、Prevnar（登録商標））。多価ワクチンを製造するために、本発明のワクチンの製造方法は、担体タンパク質を架橋する前に、莢膜有機ポリマーなどの化学的に異なる抗原と、例えばグルタルアルデヒドとを一緒に混合すること、または別々に合成した本発明の特定のワクチンを混合することによって使用できる。この柔軟性は、現在の多価ワクチン製造法に著しく勝る。
【００９３】
実施例に記載した本発明の例示的なワクチンであるＰＣＭＶワクチン＃１〜３は、ＰＧＡ分子およびＤＮＩタンパク質を構成する原子間に、いかなる共有結合も発生しないと予想される方法によって、これらのワクチンを合成したという事実にもかかわらず、抱合型ワクチンのように作働した。グルタルアルデヒドは、リジン残基のイプシロンアミノ基に代表される、タンパク質のアミノ側鎖と排他的に反応する。ＰＧＡポリマーは、遊離アミノ基を含まず、グルタルアルデヒドと反応しないカルボキシル側鎖のみを有する。従って、ＰＣＭＶによって生じた抱合体様免疫応答は、長鎖ＰＧＡ分子が、ＤＮＩタンパク質分子の架橋されたマトリックス中に分子的に捕捉されたことを示す。
【００９４】
非限定的モデルによれば、捕捉は、ＤＮＩタンパク質とＰＧＡをＢ細胞中に運搬する働きをし、そのＢ細胞は、ＰＧＡを免疫学的に認識するＩｇ受容体によって、それらのマトリックスを結合する。一度これらのＢ細胞の内側に取り込まれると、従来の抱合型ワクチンに類似する方式でマトリックスは分解され、これによって、対応するＢ細胞のＭＨＣ-ＩＩ分子上に提示されるＤＮＩ由来ペプチドがもたらされる。次いで、これが、Ｔ細胞補助を召集し、それによってそのようなＢ細胞が増殖し成熟して、ＩｇＧ産生血漿およびＰＧＡ特異的記憶細胞になる。従って、非限定的モデルによれば、ＰＣＭＶは、免疫学的にタンパク質−抱合体莢膜ワクチンのように働くが、ＰＣＭＶは、担体タンパク質と莢膜ポリマー間に顕著な共有結合を有しないために異なる。
【００９５】
ＰＣＭＶを含む本発明のワクチンは、例えば小児用ワクチンで組み合わせて使用してよい。さらに、本発明のワクチンは、例えば、肺炎球菌感染、連鎖球菌（Ａ群およびＢ群）感染、インフルエンザ菌Ｂ型（「ＨｉＢ」）感染、髄膜炎菌［例えばナイセリアメニンギチデス（Neisseria meningitides）］感染に対してワクチン接種するために使用してよく、グラム陰性菌［例えば、緑膿菌、野兎病菌（Thirumalapuraら, J. Med. Microbiol. 54:693−695, 2005；Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res. 339:1643−1648, 2004；Vinogradovら, Carbohydr. Res. 214:289−297, 1991）、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、および大腸菌］のＯ抗原ワクチンとして使用してよい。
【００９６】
本発明のワクチンは、１種もしくは複数の目的の抗原、例えば本明細書に記載した目的の抗原などの存在下で、任意の担体タンパク質、例えば本明細書に記載した担体タンパク質などを架橋するために、任意のリンカー、例えば本明細書に記載したリンカーを使用し作製することができる。１種の目的の抗原を使用する場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンは１価であると言う。複数の目的の抗原を使用する場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンは、多価であると言う。微生物の莢膜ポリマーが目的の抗原である場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンは、タンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）であると言う。
【００９７】
リンカー
架橋担体タンパク質は、当技術分野で周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。
【００９８】
ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーを使用し、直接担体タンパク質を架橋するための一般的方法および部分（moiety）は、例えば、G. T. Hermanson による Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996およびDickおよびBeurretによる Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal 10:48−114, 1989に記載されている。例えば、ｎ個のリジン部分を有する担体タンパク質を用いると、例示的な架橋剤のカルボキシル基との反応に利用できる一級アミン（末端アミンを含む）は理論上ｎ＋１個ある。従って、この直接的抱合手順を使用し、生成物はｎ＋１個のアミド結合の形成に限定される。
【００９９】
本発明の望ましい実施形態で使用されるリンカーは、最も簡単なものでは、２個の担体タンパク質を連結する結合である。リンカーは、直線的、環状、または分枝した分子骨格であってよく、２個の担体タンパク質（Ａ）および（Ｂ）に共有結合で結合するペンダント基を有する。その中に抗原を封入しうる、相互に連結した担体タンパク質マトリックスが創出されるように、任意の所与の担体タンパク質と、複数の担体タンパク質とを連結することができる。
【０１００】
結合基（linkage group）という用語は、リンカー（Ｌ）の反応性部分と、（Ａ）もしくは（Ｂ）の官能基との組合せの結果もたらされる共有結合をさす。結合基の例には、それだけには限らないが、エステル、カルバメート、チオエステル、イミン、ジスルフィド、アミド、エーテル、チオエーテル、スルホンアミド、イソ尿素、イソチオ尿素、イミドエステル、アミジン、ホスホロアミデート、リン酸ジエステル、チオエーテル、およびヒドラゾンが含まれる。
【０１０１】
（Ａ）と（Ｂ）の連結は、（Ａ）および（Ｂ）上に位置する１個もしくは複数の官能基による結合（結合基）の形成を含む、共有結合的手段によって達成される。本目的に使用してよい化学的反応性官能基の例には、それだけには限らないが、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、チオエーテル、グアニジニル、イミダゾリル、およびフェノール基が含まれ、それらの全てが、多くの担体タンパク質中の自然発生アミノ酸中に存在する。
【０１０２】
従って、（Ａ）と（Ｂ）の共有結合は、（Ａ）および（Ｂ）中に存在するそのような官能基と反応することが可能な反応性部分を含むリンカー（Ｌ）を使用し実施しうる。この反応生成物は、（Ｌ）と（Ａ）および（Ｌ）と（Ｂ）を結合する新たに形成された結合を含む結合基である。例えば、（Ａ）のヒドロキシル基は、（Ｌ）のカルボン酸基、またはその活性化した誘導体（下記参照）と反応することができ、結果としてエステル結合基が形成される。
【０１０３】
スルフヒドリル基と反応することが可能な部分の例には、ＸＣＨ２ＣＯ−型（式中、Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）のα−ハロアセチル化合物が含まれ、この化合物は、スルフヒドリル基に特定の反応性を示すが、例えば、Gurd, Methods Enzymol. 11:532, 1967に記載されているように、イミダゾリル、チオエーテル、フェノール、およびアミノ基を修飾するために使用することもできる。Ｎ−マレイミド誘導体も、スルフヒドリル基選択的と考えられるが、一定の条件下では、さらにアミノ基への結合に有用でありうる。アミノ基の転換を通じてチオール基を導入する２−イミノチオラン（Trautら, Biochemistry 12:3266, 1973）などの試薬は、ジスルフィド架橋の形成を通じて連結が生じるならば、スルフヒドリル剤と考えてよい。
【０１０４】
アミノ基と反応すること可能な反応性部分の例には、例えば、アルキル化剤およびアシル化剤が含まれる。代表的アルキル化剤には、以下のもの含まれる。
【０１０５】
（ｉ）α−ハロアセチル化合物。これは、反応性チオール基の非存在下でアミノ基に対して特異性を示し、例えば、Wong (Biochemistry 24:5337, 1979)に記載されているように、ＸＣＨ２ＣＯ−型（式中、Ｘ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）である。
【０１０６】
（ｉｉ）Ｎ−マレイミド誘導体。これは、Michael型反応を通じて、または例えばSmythら,(J. Am. Chem. Soc. 82:4600, 1960 および Biochem. J. 91:589, 1964)に記載されているように、環状カルボニル基への付加によるアシル化を通じてアミノ基と反応させることができる。
【０１０７】
（ｉｉｉ）アリールハロゲン化物。例えば、反応性ニトロハロ芳香族化合物。
【０１０８】
（ｉｖ）ハロゲン化アルキル。例えば、McKenzieら,(J. Protein Chem. 7:581, 1988)に記載されているもの。
【０１０９】
（ｖ）アミノ基とシッフ塩基を形成することができるアルデヒドおよびケトン。形成された付加体は、通常、還元されて安定したアミンがもたらされることにより安定化している。
【０１１０】
（ｖｉ）エピクロロヒドリンおよびビスオキシランなどのエポキシド誘導体。これは、アミノ、スルフヒドリル、またはフェノール性水酸基と反応しうる。
【０１１１】
（ｖｉｉ）ｓ−トリアジンの塩素含有誘導体。これは、アミノ、スフヒドリル（sufhydryl）、およびヒドロキシル基などの求核剤に対して非常に反応性に富む。
【０１１２】
（ｖｉｉｉ）例えば、Ross (J. Adv. Cancer Res. 2:1, 1954)に記載されているような、先に詳述したｓ−トリアジン化合物に基づくアジリジン。これは、開環によりアミノ基などの求核剤と反応する。
【０１１３】
（ｉｘ）例えば、Tietze (Chem. Ber. 124:1215, 1991)に記載されているような四角酸ジエチルエステル。および
（ｘ）α−ハロアルキルエーテル。例えば、Bennecheら,(Eur. J. Med. Chem. 28:463, 1993)に記載されているように、これは、エーテル酸素原子によって生じる活性化のために、通常のハロゲン化アルキルよりも反応性に富むアルキル化剤である。
【０１１４】
代表的なアミノ反応性アシル化剤には、以下のものが含まれる。
【０１１５】
（ｉ）イソシアン酸およびイソチオシアン酸、特に芳香族誘導体。これらから、それぞれ安定した尿素およびチオ尿素誘導体が形成される。
【０１１６】
（ｉｉ）塩化スルホニル。これは、例えば、Herzigら,(Biopolymers 2:349, 1964)に記載されている。
【０１１７】
（ｉｉｉ）酸ハロゲン化物。
【０１１８】
（ｉｖ）ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの活性エステル。
【０１１９】
（ｖ）混合型、対称性、またはＮ−カルボキシ無水物などの酸無水物
（ｖｉ）アミド結合を形成する他の有用な試薬。例えば、M. Bodansky (Principles of Peptide Synthesis, Springer−Verlag, 1984)に記載されているような試薬。
【０１２０】
（ｖｉｉ）アシルアジド。例えば、Wetzら,(Anal. Biochem. 58:347, 1974)に記載されているような、例えばアジド基が、亜硝酸ナトリウムを使用し、プリフォームしたヒドラジド誘導体から生成されているアシルアジド。および
（ｖｉｉｉ）イミドエステル。これは、例えば、Hunter and Ludwig (J. Am. Chem. Soc. 84:3491, 1962)に記載されているような、アミノ基と反応すると安定したアミジンを形成する。
【０１２１】
例えば、グルタルアルデヒドなどのアルデヒドおよびケトンは、アミンと反応させてシッフ塩基を形成でき、このシッフ塩基は還元的アミノ化を通じて有利に安定化させることができる。例えば、Webbら,(Bioconjugate Chem. 1:96, 1990)に記載されているように、アルコキシルアミノ部分は、ケトンおよびアルデヒドと容易に反応して、安定したアルコキサミン（alkoxamines）を生成する。
【０１２２】
カルボキシル基と反応することが可能な反応性部分の例には、ジアゾ酢酸エステルおよびジアゾアセトアミドなどのジアゾ化合物が含まれ、これらは、例えば、Herriot (Adv. Protein Chem. 3:169, 1947)に記載されているように、高い特異性で反応してエステル基を発生する。Ｏ−アシル尿素形成を通じて反応し、続いてアミド結合を形成する、カルボジイミドなどのカルボン酸修飾試薬も使用してよい。
【０１２３】
必要に応じて、（Ａ）および／または（Ｂ）の官能基は、例えば、追加の反応性または選択性を授けるために、反応前に別の官能基に転換してよい。この目的に有用な方法の例には、ジカルボン酸無水物などの試薬を使用し、アミンをカルボン酸に転換する方法；Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸、２−イミノチオラン、またはチオール含有スクシンイミジル誘導体などの試薬を使用し、アミンをチオールに転換する方法；α−ハロ酢酸などの試薬を使用し、チオールをカルボン酸に転換する方法；エチレンイミンまたは２−ブロモエチルアミンなどの試薬を使用し、チオールをアミンに転換する方法；カルボジイミド、続いてジアミンなどの試薬を使用し、カルボン酸をアミンに転換する方法；およびトシル塩化物などの試薬を使用してアルコールをチオールに転換し、続いてチオ酢酸によりエステル交換し、そして酢酸ナトリウムによりチオールへ加水分解する方法が含まれる。
【０１２４】
追加の連結物質を導入しない、（Ａ）の反応性化学基と（Ｂ）の反応性化学基の直接共有結合を含む、いわゆるゼロ長リンカーを必要に応じて本発明に従って使用してよい。例としては、結合基がエステルもしくはチオエステルであるように、（Ｌ）が、（Ａ）の酸素原子と（Ｂ）中に存在するカルボニル部分もしくはチオカルボニル部分とを連結する化学結合を表す化合物が含まれる。例えば、カルボジイミド化学を使用することによって、アミノ基（Ａ）とカルボキシル基（Ｂ）を結合し、Ａ−Ｌ−Ｂ（式中、Ｌはアミド結合である。）またはＮ−Ｒと連結したＲ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒは、同じまたは異なる２個のタンパク質分子のアミノ酸側鎖に由来する炭素鎖である。）を得ることができる。
【０１２５】
しかし、最も一般的には上記のように、リンカーは、スペーサー成分によって結合された２個以上の反応性部分を含む。スペーサーの存在によって、二官能性リンカーが、（Ａ）および（Ｂ）中の特異的官能基と反応できるようになり、結果としてこれらの２個の化合物間に共有結合がもたらされる。リンカー（Ｌ）の反応性部分は、同じであっても（ホモ二官能性リンカー）、または異なっても（ヘテロ二官能性リンカー、または数個の異なる反応性部分が存在するヘテロ多官能性リンカー）よく、（Ａ）と（Ｂ）の間に共有結合をもたらすことができる様々の潜在的試薬が提供される。
【０１２６】
典型的には、スペーサー成分は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは１〜４である）によって、（Ａ）と（Ｂ）を効率的に分離する鎖からなる。
【０１２７】
結合剤によって導入された外因性物質の性質は、究極のワクチン生成物の薬物動態および／または活性と関連しかねない。従って、生分解性であり、または化学的に感受性なスペーサーアーム、あるいは酵素切断部位を組み込むスペーサーアームを含む、切断可能リンカーを導入するのが望ましいことも有りうる。
【０１２８】
これらの切断可能リンカー、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９２／１７４３６（これにより参照により組み込む）に記載されているようなリンカーはインビボで容易に生物分解される。ある場合には、結合基はエステル分解酵素の存在下で切断されるが、そのような酵素の非存在下では安定している。従って、（Ａ）および（Ｂ）は、疾患部位近傍で活性な酵素によって徐々に放出されるように有利に連結する。
【０１２９】
リンカーは、式Ｉの生分解性ジエステル、ジアミド、またはジカルバミン酸基と結合基を形成しうる。
【０１３０】
−−（Ｚ１）ｏ−（Ｙ１）ｕ−（Ｚ２）ｓ−（Ｒ１１）−（Ｚ３）ｔ−（Ｙ２）ｖ−（Ｚ４）ｐ−
［式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４のそれぞれは、独立してＯ、Ｓ、およびＮＲ１２（式中、Ｒ１２は水素またはアルキル基である）から選択され、Ｙ１およびＹ２のそれぞれは、独立してカルボニル、チオカルボニル、スルホニル、ホスホリル、または類似の酸形成基から選択され、ｏ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、およびｖは、それぞれ独立して０または１であり、およびＲ１１は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または−（Ｚ１）ｏ−（Ｙ１）ｕ−（Ｚ２）ｓ−と−（Ｚ３）ｔ−（Ｙ２）ｖ−（Ｚ４）ｐ−を連結する化学結合である］。
【０１３１】
本発明で使用する例示的な望ましいリンカー（Ｌ）は、式ＩＩ〜ＩＩＩのいずれかによって記載され得る。
【化４】
【０１３２】
［式中、リンカーは、両（Ａ）の酸素原子と（Ｂ）の酸素原子に共有結合する。］従って、式ＩＩ〜ＩＩＩのリンカー（Ｌ）は、ジピラン（dipyran）、エステル、またはカルバミン酸結合基を介して、担体タンパク質（Ａ）および（Ｂ）に結合する。これらの実施形態では、Ｒ１３は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは１〜４、または２個の窒素または２個のカルボニルを連結する化学結合を表す）である。
【０１３３】
ヒドラゾン連鎖を形成するように設計されたリンカーは、化学式ＩＶで示される。
【化５】
【０１３４】
［式中、Ｚ５はＯ、Ｓ、またはＮＲ１６から選択され、Ｒ１６は水素またはアルキル基であり、Ｒ１５は水素、アルキル、またはヘテロアルキルから選択され、Ｙ３はカルボニル、チオカルボニル、スルホニル、ホスホリル、または（Ａ）の酸素原子と共有結合している類似の酸形成基から選択され、ｗは０または１であり、Ｒ１４は、１〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１０原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１０炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｎは１〜４である）もしくは−（Ｙ３）−（Ｚ５）ｗ−と
【化６】
【０１３５】
を連結する化学結合であり、かつＸ４は、ヒドラジド基を含む（Ｂ）とリンカーＩＩ前駆体との縮合反応から得られたヒドラゾン（その際、Ｘ４はケトン基もしくはアルデヒド基の酸素原子である）である］。
【０１３６】
担体タンパク質
一般に、生理学的条件下で抗原によって捕捉できる任意の担体タンパク質を本発明で使用してよい。望ましくは、抗原は、抗原と担体タンパク質間にさほど共有結合が存在しない状況で、担体タンパク質によって複合体中に捕捉される。さほど共有結合が存在しないとは、その抗原の５０％以下が、担体タンパク質と共有結合していることをさす。望ましい実施形態では、その抗原の４０％以下、３０％以下、１０％以下、または５％以下が、担体タンパク質と共有結合している。抗原／担体タンパク質複合体は、ミョウバンなど、別の化合物を含んでよく、望ましい実施形態では、この別の化合物は、抗原および担体タンパク質を捕捉することができる。
【０１３７】
望ましくは、本発明のワクチンに使用される担体タンパク質は、単独で、または抗原と組み合わさって、被験体で免疫応答を引き出すタンパク質である。望ましくは、担体タンパク質は、Ｔ細胞によって認識される少なくとも一個のエピトープを含む。望ましくは、そのエピトープは、被験体でＴ細胞応答を誘発することができ、Ｂ細胞を誘発して目的の抗原全体に対する抗体を産生する。本発明の説明に使用されるエピトープには、抗体分子もしくはそのフラグメントとの特異的な相互作用を担う抗原上のあらゆる決定基が含まれる。エピトープの決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面群、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、特定の電荷特性と同様に、特定の三次元構造特性を有する。免疫原性特性を有するために、一般的に、タンパク質またはポリペプチドはＴ細胞を刺激することができる。しかし、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを欠く担体タンパク質もまた、免疫原性であり得る。
【０１３８】
強力な免疫原性応答を誘発することが知られている担体タンパク質を選択することによって、本明細書に記載したＰＣＭＶで、多様な被験体集団を処置することができる。担体タンパク質は、本ワクチンに対して強力な免疫応答を誘発するように、十分に外来性であるのが望ましい。典型的には、使用される担体タンパク質は、目的の抗原に対して免疫原性を付与できる分子である。望ましい実施形態では、担体タンパク質は、本質的に免疫原性が高いものである。従って、免疫原性が高く、それと複合体を形成した抗原に対して、抗体産生を最大にできる担体タンパク質が望ましい。
【０１３９】
本発明の様々な担体タンパク質には、例えば、変異体であっても、またはそうでなくてもよい（化学的または遺伝子的）毒素およびトキソイド、例えば、炭疽毒素、ＰＡおよびＤＮＩ（PharmAthene, Inc.）、ジフテリアトキソイド（Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India, Ltd.）もしくはＣＲＭ１９７、破傷風毒素、破傷風トキソイド（Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India, Ltd.）、破傷風毒素フラグメントＺ、緑膿菌外毒素Ａもしくは外毒素Ａ変異体、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌の外膜タンパク質［ＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関、バージニア州Manassas）より入手できる株］、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、およびリンカーにより架橋できる別の任意のタンパク質が含まれる。担体タンパク質は、コレラ毒素Ｂサブユニット（SBL Vaccin ABより入手可能）、ジフテリア毒素（Connaught, Inc.）、破傷風毒素フラグメントＣ（Sigma Aldrichより入手可能）、ＤＮＩ、または大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（Sigma Aldrichより入手可能）が望ましい。他の望ましい担体タンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐ４０、およびニワトリリボフラビンが含まれる。（別段の指示が無い限り、例示的な担体タンパク質はSigma Aldrichより購入することができる）。他の例示的な担体タンパク質は、分枝ペプチドであるＭＡＰ（多抗原ペプチド）である。ＭＡＰの使用によって、架橋密度は、複数の分枝アミノ酸残基のために最大になる。限定しないが、ＭＡＰを形成するために使用できる例示的なアミノ酸はリジンである。
【０１４０】
ＢＳＡとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、動物実験の際に、ワクチン開発で一般に担体として使用されてきた。治療用ワクチンの調製で使用されてきた担体タンパク質には、それだけには限らないが、いくつかの病原性細菌の毒素およびそれらのトキソイドが含まれる。例としては、ジフテリアや破傷風毒素、およびそれらの医学的に許容される対応するトキソイドが含まれる。他の候補は、交差反応性物質（ＣＲＭ）と称する、細菌性毒素に抗原的に類似するタンパク質である。本発明の担体タンパク質には、ヒトに由来せず、かついかなるヒト食物物質にも存在しない、あらゆるタンパク質を含めてもよい。
【０１４１】
本発明の望ましい実施形態では、ＰＣＭＶの生成に、環様構造を形成するタンパク質を使用する。そのようなタンパク質には、緑膿菌のＨｃｐ１タンパク質、コレラ毒素の無害な「Ｂサブユニット」、大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシン、および志賀様毒素が含まれる。そのような環様タンパク質複合体は、直鎖ＰＳ鎖が、これらの環形タンパク質複合体の中心通路を貫通する「糸に通したビーズ」を形成することができる。タンパク質の架橋後、そのような複合体は、特に安定すると予想される。タンパク質の構造データは、これらの中心通路が十分広く、ＰＳ鎖がたやすく進入できることを示唆している。例えば、Ｈｃｐ１六量体環の中心通路は、十分な広く、数個の幅５.５オングストロームの多糖鎖を容易に収容できる４２オングストローム（Angstoms）である（Mougousら, Science 312(5779):1526−1530, 2006）。あるいは、（例えば、特定の物理化学的条件下で、自然に環を組み立てる単量体担体タンパク質のサブユニットから）ＰＳ周囲にタンパク質環を組み立ててもよい。環を組み立てることができるそのような単量体タンパク質は、当技術分野で公知であり、例えば、ニューモリシン（Walkerら, Infect. Immun. 55(5):1184−1189, 1987；Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol. 25(2):222−225, 1987）、リステリオリシンＯ（Kayal and Charbit, FEMS Microbiol. Rev. 30:514−529, 2006；Mengaudら, Infect. Immun. 55(12):3225−3227, 1987）、ＤＮＩ、炭疽ＰＡ、Ｈｃｐ１、コレラ毒素Ｂサブユニット、志賀毒素Ｂサブユニット、フラゲリンが含まれ、多数の関連分子が当技術分野で公知であり、様々な微生物から製造されている。
【０１４２】
別の望ましい実施形態では、担体タンパク質としてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが使用される。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化は、適応免疫応答を形作るのに重要であり、抗体応答、アイソタイプスイッチ、および免疫学的記憶の親和性成熟において一役割を担い得る。コレラ菌のフラゲリン（ＦＬＡ）は、ＴＬＲアゴニストである。２０ｍｇを超えるＦＬＡタンパク質が、組換え大腸菌から精製され、本明細書に記載したＩＬ−６マクロファージ誘発アッセイで強力なＴＬＲアクチベーターであることが示されている。さらに、「ニューモリシン」と称する首尾よく保存された肺炎連鎖球菌タンパク質が、ＴＬＲ４を活性化することも示されており、加えて防御抗原でもある。従って、このタンパク質もＰＣＭＶ担体タンパク質として使用することができる。
【０１４３】
さらに、Merck社製ＨＩＢ抱合型ワクチンに、担体タンパク質として外膜タンパク質（ＯＭＰ）混合物（例えば髄膜炎菌のＯＭＰ）が使用され、全連鎖球菌性肺炎細菌細胞からのタンパク質抽出物は、動物感染モデルにおいて少なくとも部分的に防御的であることが示されている。本発明の望ましい実施形態では、これらのタンパク質混合物が、ＰＣＭＶ担体タンパク質源である。
【０１４４】
望ましい実施形態では、例えば、少なくとも２個のリジン残基、または阻害されておらず、化学的修飾によって架橋することができる別の残基を有する担体タンパク質を用いて、ＰＣＭＶ法を使用する。別の望ましい実施形態では、担体タンパク質は多量体である（例えば、少なくとも５個のサブユニットを含むもの）。望ましくは、多量体はホモ多量体である。
【０１４５】
別の実施形態では、ＤＮＩを担体タンパク質として使用する。ＤＮＩは無害であり、使用前にタンパク質を解毒する必要性を残さないからである。さらに、ＤＮＩは、目的の抗原に対する防御免疫応答に加えて、炭疽菌に対しても防御免疫応答を誘発しうるので、ＤＮＩの使用が望ましい。また、ＤＮＩも内部ジスルフィド結合を持たない。タンパク質を変性させ、結果的に、炭疽毒素中和化抗体を誘発するエピトープを消失させる恐れがある水素化ホウ素還元に対して、そのような結合は感受性が高い。
【０１４６】
目的の抗原
本発明のワクチン組成物、ならびにそのようなワクチンの製造方法および投与方法は、任意の目的の抗原、例えば多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸に使用することができる。望ましくは、目的の抗原は、水素化ホウ素還元により抗原のジスルフィド結合が破壊されることによって生じる抗原変性など、ワクチン製造法に使用される化学反応によって破壊されうる一級基を持たない。例示的な目的の抗原には、有機ポリマー、例えば、多糖（例えば、少なくとも１８残基を有する多糖）、ホスホ多糖；アミノ糖がＮアセチル置換されている多糖；スルファニル化糖、別の硫酸修飾糖、またはリン酸修飾糖を含む多糖；ポリアルコール、ポリアミノ酸、タイコ酸、リポ多糖のＯ側鎖が含まれる。例示的な目的の抗原にはまた、標準的方法を使用し、微生物、例えば、細菌、菌類、寄生虫、およびウイルスにより合成され、次いでそのような生物源から精製されたものを含む莢膜有機ポリマーも含まれる。例示的な目的の抗原には、細菌性生物、例えば、（炭疽菌を含む）桿菌種（Wang and Lucas, Infect. Immun. 72(9):5460−5463, 2004）、肺炎連鎖球菌（Bentleyら, PLoS Genet. 2(3):e31, Epub 2006；Kolkmanら, J. Biochemistry 123:937−945, 1998；およびKongら, J. Med. Micorbiol. 54:351−356, 2005）、赤痢菌（Zhaoら, Carbohydr. Res. 342(9):1275−1279, Epub 2007）、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌、化膿レンサ球菌、大腸菌（Zhaoら, Carbohydr. Res. 342(9):1275−1279, Epub 2007）、および緑膿菌、ならびに菌類生物、例えば、クリプトコックスおよびカンジダ、同様に他の多くの微生物（例えばOvodov, Biochemistry (Mosc.) 71(9):937−954, 2006；Leeら, Adv. Exp. Med. Biol. 491:453−471, 2001；およびLee, Mol. Immunol. 24(10):1005−1019, 1987を参照）から精製されたものを含む微生物の莢膜有機ポリマーが含まれる。例示的な目的の抗原には、自然に存在せず、従って非生物学的起源のポリマーも含まれる。
【０１４７】
ワクチン組成物
ＰＣＭＶを含む本発明のワクチン、例えば小児用ワクチンに組み合わせて使用してよい。さらに、本発明のワクチンは、例えば、肺炎球菌感染、インフルエンザ菌Ｂ型（「ＨｉＢ」）感染、連鎖球菌（Ａ群およびＢ群）感染、髄膜炎菌（例えばネイッセリアメニンギチデス（Neisseria meningitides））感染に対するワクチン接種に使用してよく、かつグラム陰性菌（例えば、緑膿菌、野兎病菌、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、および大腸菌）由来のＯ抗原ワクチンとして使用してよい。
【０１４８】
望ましくは、ワクチン製剤は、少なくとも一種の担体タンパク質、一種もしくは複数の目的の抗原、および製薬上許容される担体もしくは賦形剤（例えば、リン酸アルミニウム、塩化ナトリウム、および滅菌水）を含む。ワクチン組成物には、製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系、例えば、当技術分野で公知の水中油系および他の系、または他の製薬上許容される賦形剤を含めてもよい。生理学的条件下で不溶性である担体／抗原複合体は、被験体に投与後、抗原を徐々に放出するのが望ましい。そのような複合体は、製薬上許容される賦形剤を含む懸濁液で送達するのが望ましい。しかし、担体／抗原複合体は、生理学的条件下で可溶性であってもよい。
【０１４９】
典型的には、ワクチンは、皮下注射には約０.５ｍL、皮内注射には０.１ｍＬ、または経皮的投与には０.００２〜０.０２ｍＬの容量である。０.５ｍｌ用量のワクチンには、約２〜５００μｇの担体タンパク質によって捕捉された約２〜５００μｇの抗原を含むことができる。望ましい実施形態では、０.５ｍｌ用量中、約１０μｇの抗原が約１０μｇの担体タンパク質によって捕捉される。抗原：担体タンパク質のモル比は、１：１０（例えば、１部の抗原：２部の担体または１部の抗原：３部の担体）〜１０：１（例えば、３部の抗原：１部の担体または２部の抗原：１部の担体）が望ましい。望ましい実施形態では、抗原：担体のモル比は１：１である。あるいは、抗原：担体タンパク質の乾物重量比は、１：１０〜１０：１（乾物重量で１：１など）が望ましい。
【０１５０】
ペプチドまたは抱合体は、おそらく胃内で分解されるので、ワクチンは、（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または皮内注射により）非経口投与するのが望ましい。物理的に真皮層を通り抜ける手段（例えば針、空気銃、または擦過）による送達が望ましいが、本発明のワクチンは、経皮吸収により投与することもできる。
【０１５１】
特に、本発明のワクチンは、例えば、好適な免疫アジュバントを用いて、筋肉内注射、皮内注射、または経皮的免疫化により被験体に投与してもよい。本発明のワクチンは、１回または数回に分けて投与してもよく、感染病原体の感染を防止するために、被験体で抗体の産生をブーストするように設計した２回目の投与を含むことが多い。ワクチン投薬の頻度および量は、そのワクチンの比活性に依存し、常法の実験によって容易に定量することができる。
【０１５２】
例えば、小児には、ワクチンスケジュールは、（２ヵ月齢で開始して）約４〜８週間空けてそれぞれ０.５ｍｌを３回投与し、続いて約１２〜１５ヵ月齢で４回目の０.５ｍｌを投与してよい。数種のワクチンでは、５回目の投与は４〜６歳の間が望ましいであろう。
【０１５３】
一般的に、１回目の投薬がなされる年齢は２ヵ月であるが、６週齡ほどの幼い小児にワクチンを投与してもよい。定型の小児ワクチン接種スケジュールの年齢を超えている児童には、以下の例示的なスケジュールに従って、本発明のワクチンを投与してもよい。
【０１５４】
【０１５５】
成人には、長期的保護に、一般的に２〜８週の間を空けて０.５ｍｌ用量を２回以上投与すれば十分である。既に免疫化した成人および１１歳を超える小児には、１０年ごとに、ブースター用量を投与するのが望ましい。
【０１５６】
製剤は、１回用量または多数回用量容器で、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供してよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵してよい。本発明のワクチンは、薬理学的に許容されるビヒクル、例えば、ミョウバン水酸化ゲル、アジュバント調製物、または生理食塩水で製剤化し、次いで例えば好適な免疫アジュバントを用いて筋肉内注射、皮内注射、または経皮的免疫化により投与することができる。
【０１５７】
本発明には、本明細書に記載したワクチン（例えばＰＣＭＶ）を含むキットも含まれる。本発明のキットには、本明細書に記載したワクチン接種方法のキットを使用するための使用説明書を含めてよい。
【０１５８】
免疫化スケジュールの効力は、被験体で抗体力価を測定する標準的方法の使用によって定量しうる。一般に、約１μｇ／ｍｌという平均抗体力価（望ましくはＩｇＧ力価）は、長期的保護を示していると考えられる。
【０１５９】
本明細書に記載したワクチン組成物で使用するための抗原／担体タンパク質複合体は、直径が１０ｎｍ〜１００μｍであることが望ましい。ウイルスは、直径が１００ｎｍであろうし免疫原性である。細菌全体の直径は１〜１０μｍであり、同様に免疫原性である。細菌凝集塊の直径は約１００μｍであろう。特定の実施形態では、ワクチン組成物中の抗原／担体タンパク質複合体の直径は１００ｎｍ〜１０μｍが望ましい。この複合体は、溶解性であっても、または不溶性であってもよい。
【０１６０】
本明細書以下に、具体的実施例、実施形態、および図を参照しながら本発明について記載するが、その目的は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を説明することである。以下の実施例は限定するものとは解釈されない。
【０１６１】
（実施例）
【実施例１】
【０１６２】
ワクチンおよび対照調製物
莢膜のポリγ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）をVedan社（台湾）から購入し、またはRhieら,(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925−10930, 2003)の方法によって精製した。ドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）は、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の変異形であり、Benson,ら,(Biochemistry 37:3941−3948, 1998)の方法により大腸菌から生成した。ＰＧＡおよびＤＮＩタンパク質は、使用前に、０.０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.４）（ＳＰ７.４）に対して徹底的に透析した。ＤＮＩ原液濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。ＰＧＡ原液濃度は１３４ｍｇ／ｍｌであった。２５％原液として、リンカーグルタルアルデヒドをPierce社から購入した。表１に従って、反応によりタンパク質莢膜のマトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）および対照を組み立てた。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
グルタルアルデヒド不含の５個の反応を室温で（２２℃）で組み立てた。Ｔ＝０で、０.１ｍｌの２５％グルタルアルデヒド（Ｇ２５）を表示する反応に加えた。それから各々３０秒後に、さらに０.１ｍｌのＧ２５を加え、それぞれ示した反応に合計で０.８ｍｌのＧ２５が加えられるまで、これを繰り返した。二官能性グルタルアルデヒド分子によるＤＮＩ分子の架橋は、様々な程度の濁度と、以下の順序での不溶性「ゲル」様粒子の発生により巨視的に観察することができた。ほとんどの濁度およびゲル形成は反応１＞２＞３＞４であり、反応５は全体として透明かつ可溶性のままであった。１時間後、１Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを含む０.５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.３）（ＳＢＨ）２ｍｌを全６反応に加えて、ＤＮＩ分子のアミノ側鎖と二官能性グルタルアルデヒド分子との間に形成されたシッフ塩基を還元した。シリコーン抗起泡剤（０.０１ｍｌ）を各反応に加えて、この反応中の起泡を制御した。反応物を４℃で７２時間貯蔵した。次いで、全ての反応をＳＰ７.４に対して４８時間徹底的に透析した。最終生成物を遠心分離することによって不溶性物質を除去し、使用時まで４℃で貯蔵した。
【０１６５】
以下のように、水溶性カルボジイミド、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用し、ＢＳＡのアミノ基と、ＰＧＡのカルボキシル基とを結合することによって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とＰＧＡ間の従来の抱合体を合成した。３０ｍｇ／ｍｌ ＢＳA水溶液５ｍｌを１ｍｌの１３４ｍｇ／ｍｌ ＰＧＡ含有ＮＰ７.５と混合した。５０ｍｇのＥＤＡＣを加え、反応を室温で３時間放置進行させた。活性化された基をブロックするために、１ｍＭグリシンを含むＳＰ７.４に対して、反応物を４℃で１８時間透析し、次いでＳＰ７.４のみに対して４℃で２４時間透析した。最終生成物をＰＧＡ−ＢＳＡ抱合体と呼ぶ。
【０１６６】
ＰＣＭＶおよび対照調製物の合成および透析後、ＤＮＩタンパク質の分子状態を検査して、グルタルアルデヒドが、様々な量のＰＧＡの存在または非存在下で、実際分子的にタンパク質を架橋したかを確認した。そのような架橋について、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリアミド（polyacryamide）ゲル電気泳動および抗ＰＡ抗血清によるウェスタンブロッティングにより、ＰＣＭＶおよび対照調製物をモニターした。図２に示すように、ＤＮＩタンパク質は、グルタルアルデヒドで架橋する前は８４ｋＤａで泳動する。ＰＣＶＭ１〜ＰＣＭＶ３（レーン１〜３）は、２２０ｋＤａより大きい分子量のバンドの泳動によって実証された通り、ＤＮＩタンパク質の広範な架橋を示している。ＰＧＡの非存在下で架橋されたＤＮＩタンパク質単独も、同じ高分子量種（レーン５）を示している。それに反して、ＰＧＡと混合したがグルタルアルデヒドで処理していないＤＮＩは、ＤＮＩまたは低分子量種（レーン４）と共泳動するバンドを示している。従って、Vedan（台湾）社製ＰＧＡ調製物は、ＤＮＩに対して活性なプロテアーゼが混入しているように見えた。Vedan社のＰＧＡ試料は、レーン６で泳動したが、高抗ＰＡ抗血清と反応する混入タンパク質が高レベルではないことを示し、観察されたバンドが様々な反応のＤＮＩ由来生成物であることを示唆した。
【０１６７】
さらに、ＰＧＡと、抗原として肺炎球菌ＰＳの一種または複数を使用して、ＦＬＡ（コレラ菌のフラゲリン）が、ＰＣＭＶと関連してＤＮＩよりも優れた担体タンパク質であるかどうかを調査した。ＰＧＡに対するＩｇＧのレベル、これらの様々なＰＣＭＶによる免疫化によって得られたＰＳ、およびタンパク質基準の重量でのそれらの作用強度を測定することによって、担体タンパク質の効果を評価する。
【０１６８】
二官能基架橋剤を使用せずに、アミノ基とカルボキシ基を直接架橋する手順によっても、ＰＣＭＶ作製することができる。特に、ＰＣＭＶは、カルボジイミド化学を使用し、担体タンパク質の、アミノ基とカルボキシル基を架橋することによって作製できる。この化学により、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸およびグルタミン酸側鎖のカルボキシル基との間にペプチド結合が形成される。アミノ基は、ホルマリン処理トキソイドで大部分ブロックされるが、ホルマリンは、カルボキシル基とは一切反応しない。従って、ＰＣＭＶの製造に、グルタルアルデヒド架橋に抵抗するホルマリントキソイドを使用し、カルボジイミド化学を使用することができる。架橋は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって容易に検出される。グルタルアルデヒドなどの架橋剤の添加に依存する、高分子量タンパク質の「スメア」の存在は、架橋を示すものである。
【表２】
【０１６９】
表２に示す実験では、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）で２００μｌの反応を行い、周囲温度で２時間インキュベートした。反応を１２０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウムで急冷した。グルタルアルデヒドを加えて６４ｍＭにし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１５ｍｇ／ｍｌで使用し、ジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドを約５ｍｇ／ｍｌで使用し、ＰＧＡを１３.４ｍｇ／ｍｌで加え、ニューモ（pneumo）ＰＳ６Ｂ型および２３Ｆ型を４ｍｇ／ｍｌで加えた。
【０１７０】
表２に示す通り、いくつかのホルマリン処理タンパク質（例えばジフテリアトキソイド）は、グルタルアルデヒドとはあまり架橋せず、従ってＰＣＭＶの調製に使用するためには他の架橋化学が必要となる。破傷風トキソイドなど、他のものはグルタルアルデヒドで架橋することができるが、ジフテリア毒素およびウシ血清アルブミンなどの未修飾タンパク質と同程度ではない。
【実施例２】
【０１７１】
免疫化、ならびに抗ＤＮＩおよび抗ＰＧＡ免疫応答の分析
表１に記載した５反応の可溶性生成物は、それらの２８０ｎｍでの吸光度に基づき、同じタンパク質濃度になるように調整した。図２に記載した全ての免疫化研究では、Charles River社の約５〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。０日目に腹腔内注射により、ＤＮＩタンパク質２０μｇの用量で、ＰＣＭＶワクチン１〜３および抗原調製物対照４および５によりマウスを免疫化した。全てのマウスを７日目に採血し、次いで１０日目に同じサイズ用量の抗原調製物でブーストした。１７日目に再度マウスを採血し、次いで２０日目に再度ブーストした。３０日目に再度マウスを採血し、その日にマウスを屠殺した。凝固発生後、血液試料から血清を採取し−２０℃で貯蔵した。抗ＰＧＡおよび抗ＤＮＩ血清抗体のレベルについてアッセイするのに、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。手短に言えば、１００μｌ／ウェル容量のImmulon 2HB ELISA（ＶＷＲ）マイクロタイター皿を、０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.６）に含まれたＢＳＡ−ＰＧＡまたはＤＮＩ ０.５μｇ／ウェルで被膜した。４℃で終夜インキュベーション後、３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ−０.１％ Tween（ＴＢＳＴ）で、室温で１時間または終夜４℃でインキュベーションすることによって、抗原被膜プレートをブロックした。ブースト後の各時点から、４頭のマウス群よりプールした血清試料をＴＢＳＴで連続希釈し、抗原被膜プレートに添加し、少なくとも１時間インキュベートした。ウサギ抗血清を使用し、アルカリホスファターゼ（Zymed）と抱合したマウスＩｇＧまたはＩｇＭに対する、抗ＤＮＩおよび抗ＰＧＡ抗体応答を測定した。基質のｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を各ウェルに加え、分光光度計で各反応の４０５ｎｍでの吸光度を測定した。負の対照の吸光度を上回る２点の標準偏差値であるＯＤ４０５読取り値を得るための最大希釈率として定義される逆数端点力価としてデータを報告する。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、３種のＰＣＭＶ調製物１〜３および２種の抗原対照調製物４および５（図３〜５）により免疫化したマウスでの、ＩｇＭおよびＩｇＧ特異的抗ＤＮＩおよび抗ＰＧＡ免疫応答を測定した。図３に示すように、グルタルアルデヒドで架橋しなかった（グルタルアルデヒド不含）対照調製物４を除く全ての調製物において、ＤＮＩタンパク質の免疫原性は高かった。しかし、これらのＤＮＩ特異的免疫応答は、排他的にＩｇＧに基づいた。免疫化７日目でさえも抗ＤＮＩ ＩｇＭは検出されなかったが、１７日目までにＰＣＭＶ調製物で免疫化したマウス、および架橋ＤＮＩのみ（調製物５）で免疫化したマウスで、顕著な抗ＤＮＩ ＩｇＧ応答を検出することができた。３０日目に調製物４を含む全ての調製物で、ＤＮＩに対する強力なブースター応答が認められた。
【０１７３】
抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答は、莢膜ポリマーに典型的なパターンを示した（図４）。対照調製物４では、７日目に検出可能な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が生じたが、この応答は１７日目または３０日目にブーストされなかった。全てのＰＣＭＶ調製物で、７日目に抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が誘発され、次いで１７日目および３０日目にさらに強力な抗ＰＧＡ ＩｇＭ応答が排他的に生じた。予想通り、対照調製物５（架橋ＤＮＩのみ）では、ＩｇＭまたはＩｇＧベースの抗ＰＧＡ応答のいずれも発生しなかった。極めて対照的に、ＰＣＭＶ１〜３（調製物１〜３）では、ＩｇＧベースの強力な抗ＰＧＡ応答が発生したが、この応答は１７日目に明瞭になり、次いで３０日目に明らかにブーストされた（図５）。ＰＣＭＶ１〜３に見られたＩｇＧベースの抗ＰＧＡ応答は、Aulingerら,(Infect. Immun. 73:3408−3414, 2005)が報告した従来のＰＧＡ−ＤＮＩ抱合型ワクチンで観察されたＰＧＡに対して、およびRhieら,(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925−10930, 2003)が記載したＰＡ−ＰＧＡ抱合型ワクチンに対して報告されている応答に明瞭に類似した。従って、公知の炭疽菌のＴ非依存性防御抗原である莢膜ＰＧＡに対するＩｇＧ応答を誘発することによって、従来の抱合体ＰＧＡワクチンと同様に、ＰＣＭＶワクチン＃１、＃２および＃３は全て作働した（Wangら, Infect. Immun. 72:5460−5463, 2004）。ＰＧＡと混合してＤＮＩ（非架橋）を含む対照調製物５は、ＰＧＡに対して検出可能なＩｇＧを誘発せず、ＤＮＩは、ＰＣＭＶ調製物１〜３ではＩｇＧ抗ＰＧＡ応答を刺激する際にＴＬＲリガンドとして作用しないことが示唆された。この結果はまた、ＰＧＡは、共有結合を通じてタンパク質に結合しなければ、低免疫原性のＴ細胞非依存性免疫原である、という文献中の観察を確認するものである（Rhieら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925−10930, 2003）。ＰＣＭＶ法では、直接ＰＧＡ分子とＤＮＩタンパク質とは架橋されないという事実にもかかわらず、ＰＣＭＶ法は、明らかにＰＧＡをＴ細胞依存性免疫原に転換する。
【０１７４】
これらのデータは、ＰＣＭＶ法が、従来の抱合型ワクチンに類似する特性を備えた免疫原を産生できることを支持するものである。ＰＧＡ ＰＣＭＶは、本明細書記載の方法を使用して容易に作製され、ＰＧＡ−タンパク質抱合型ワクチンに典型的な免疫応答を誘発することが判明した。図３に概略する投薬スキームに基づき１０００匹のマウスを免疫化するのに十分なＰＣＭＶが、表１に詳述した小規模反応によって生成された。本発明のデータは、炭疽菌によって生じた炭疽に対して防御するために、ＰＧＡとＤＮＩから作製されたＰＣＭＶをワクチンとして使用できることを支持するものである。
【実施例３】
【０１７５】
追加のＰＣＭＶの生成および特徴付け
様々な構造およびイオン電荷莢膜抗原に対して、ＰＣＭＶ技術を適用することができる。肺炎連鎖球菌ＰＳ型のうち２３種の型を米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）から購入し、そしてMerck社により製造する。これらのＰＳは、その分子構造が大きく異なり、電荷が強くアニオン性、部分的にカチオン性、中性である構造、リン酸化されている構造、直鎖である構造、枝分れ構造、および様々な他の方式で修飾されたＰＳ分子構造を含む。予備実験では、マウスマクロファージによりＩＬ−６産生が誘発される能力について、Wyeth社製Prevnarの７個の莢膜型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）に対応して、これらのＰＳサブセットをアッセイした。４型ＰＳは、このアッセイで活性であり、リポ多糖（ＬＰＳ）はＴＬＲアゴニストの対照であった。ＰＧＡ−ＤＮＩおよび非架橋対照から作製したＰＣＭＶワクチンと同様に、他のＰＳ（例えば３型）、ＰＧＡ、および野兎病Ｏ抗原ＰＳもアッセイした。この実験によって、３型肺炎球菌ＰＳ、およびそれより少ない程度でＰＧＡで、ＴＬＲアゴニストが混入していることも示された。野兎病由来ＰＳおよびＰＣＭＶは、アッセイで比較的に汚染が少なかった。フェノール抽出およびエタノール沈殿による２回の連続的処理の後、肺炎連鎖球菌ＰＳ３型を「純粋化（clean up）」（未知の残留ＴＬＲアゴニストを除去）することができた。従って、６種の肺炎連鎖球菌ＰＳおよび野兎病Ｏ抗原ＰＳは、ＩＬ６産生を純粋化することが判明しており、これらは本明細書に記載した実験で調査されている。
【０１７６】
ＩＬ６産生のために純粋化することが判明している７種のＰＳに向けたＰＣＭＶが、実施例１に記載した方法と類似の方法により、担体タンパク質としてＤＮＩを使用し合成された。予備的免疫原性アッセイでは、全７種のＰＣＭＶが様々な程度で免疫原性であることが示唆されている。肺炎連鎖球菌ＰＳ１４に対する、ＤＮＩベースの「１価」ＰＣＭＶ（１４−ＰＣＭＶ）は、３回目の免疫化後著しくブーストされた抗ＰＰＳ１４ ＩｇＧの高力価を誘発することが判明した。注目すべきことに、１４−ＰＣＭＶとその他の６ＰＣＭＶと混合して「カクテル」免疫原を作製したとき同じ免疫応答が見られた。Prevnar（登録商標）は、ミョウバンに吸収させた「アジュバント型」ワクチンなので、ミョウバンアジュバントに六価ＰＣＭＶカクテルを吸収させることができるかどうかを判定した。ＰＣＭＶに、またはＤＮＩタンパク質と混合したが、グルタルアルデヒドで架橋していない同じＰＳの対照混合物に曝露後、ミョウバンに吸収された肺炎連鎖球菌ＰＳの量を定性的に計測する免疫アッセイの結果では、対照（非架橋ＰＳ＋ＤＮＩタンパク質）よりもＰＣＭＶに関連して、より多くのＰＳがミョウバン吸収されたことが示された（このイムノアッセイでＰＣＭＶを希釈するほど、免疫活性レベルが高いことによって示された通りである）。
【０１７７】
マウスの免疫化を使用して、ミョウバンアジュバントへの吸収の有り無しで七価ＰＣＭＶの免疫原性を評価した。ミョウバンアジュバントは、ＰＳ１４に対する免疫応答の動態論を改善し、このＰＳに対するＩｇＧの誘発を非アジュバント型ワクチンよりも７日早めた。しかし、ミョウバンの存在下での対照の非架橋型ＰＳ＋ＤＮＩ組合せよりも、ミョウバンの非存在下での七価ＰＣＭＶの方が免疫原性が高かった。この結果は、ＰＣＭＶ手順が、マウスに対するＰＳの免疫原性をより高めることを確認するものであり、ＰＣＭＶ手順が、抱合型ワクチンカクテルのように免疫学的に作働する抗原カクテルを作製するために使用できることを支持するものである。
【０１７８】
追加の実験では、フェノール抽出およびエタノール沈殿を使用して、２３種の肺炎球菌多糖市販調製物から、混入するＴＬＲアゴニストを除去する。混入物質の除去は、標準的方法により、腹腔マクロファージによるＩＬ−６の誘発について、処理したＰＳを試験することによって確認する。ＰＣＭＶの生成に、ＩＬ−６誘発活性を欠くＰＳを使用する。ＰＣＭＶに使用した他の多糖には、野兎病から精製したＯ抗原ＰＳ、および炭疽菌由来のＰＧＡ莢膜が含まれる。合計２５個の莢膜型を検査する（肺炎球菌型２３個、および野兎病型および炭疽病型を各１個）。基本的に実施例１に記載した方法により、２５個の莢膜型のそれぞれを使用して、ＤＮＩタンパク質を使用するＰＣＭＶを作製する。これらの初期ＰＣＭＶ調製物には、ＰＳ：タンパク質を１：１の割合で使用する（乾物重量で約１：１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、予備実験で様々なＰＣＭＶ調製物の免疫原性と完全に相関したタンパク質の架橋の形跡について、各調製物を特徴付ける。数種の莢膜型（例えば、６Ｂおよび２３Ｆ）については、別の担体タンパク質を使用してＰＣＭＶを作製する。これらの数種の莢膜型（例えば、６Ｂおよび２３Ｆ）については、代替の架橋化学を使用することができる。（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥで）タンパク質の架橋の形跡を示す全てのＰＣＭＶ調製物をその免疫原性について試験する。
【０１７９】
例えば、以下のように、異なる５種のマトリックスタンパク質と異なる２種の抗原を使用し、異なる１０種のＰＣＭＶを作製する。５種のマトリッックスタンパク質の選択は、ＦＤＡの認可を受けたワクチンでのそれらの現在の使用、またはＰＣＭＶ調製物の安定性を測定するトレーサーとしてそれらが役立つようにするその他の特性に基づく。以下のマトリックスタンパク質を使用する（１）コレラ毒素Ｂサブユニット（SBL Vaccin ABより入手可能）、（２）ジフテリア毒素、（３）破傷風毒素フラグメントＣ、「Ｆｒａｇ Ｃ」（Sigma Aldrichより入手可能）、（４）ＤＮＩ、および（５）大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（Sigma Aldrichより入手可能）。莢膜抗原として、炭疽菌から得たポリ−Ｄ−グルタミン酸および肺炎連鎖球菌莢膜１４型（Suarezら, Appl. Environ. Micobiol. 67:969−971, 2001）を使用する。対応するＰＣＭＶでマトリックスタンパク質としてＤＮＩと共に使用したとき、これらの莢膜抗原のどちらも免疫原性が高い。各莢膜抗原と、５種の選択したマトリックスタンパク質のそれぞれを組み合わせて、１０種の別個のＰＣＭＶを生成する。
【０１８０】
従来の抱合型ワクチンで観察されたように、マウスでアイソタイプ抗体がＩｇＧにスイッチされるように誘発する能力について、ＰＣＭＶを試験することができる。全ての抗原をミョウバンに吸収させることができ、次いで一ＰＣＭＶ調製物につき通常５頭のマウス群を使用する。マウスは、予め採血して、試験抗原に対する基線免疫応答を得る。次いで、標準的ＩＰ注射プロトコルにより、マウスを３回（０、７、１４日目）免疫化し、一回目の免疫化から１０、２０、３０、および６０日後に血液を採取する。使用したＰＳおよび担体タンパク質に対するＩｇＧについて、標準的ＥＬＩＳＡアッセイによりマウス血清を分析する。これらの実験では、低または非免疫原性であろう非抱合型ＰＳと比較して、抗ＰＳ ＩｇＧを誘発する様々なＰＣＭＶ調製物の能力を評価するためにＰＳのみで免疫化したマウス対照群が含まれる。有望なＰＣＭＶ（すなわちＰＳに対して高レベルのＩｇＧを誘発するＰＣＭＶ）について、より注意深い免疫学的分析を実施するが、その分析はマウスでのＰＣＭＶに対する免疫応答の動態論および用量応答態様を確立するために調査するものである。
【０１８１】
あるいは、有望なＰＣＭＶおよび対応するそれらの対照は、ウサギ抗血清を製造する販売業者に送付することができる。類似の免疫アッセイを実施して、ウサギで免疫原性、誘発された抗体クラス、および免疫応答動態論を評価する。これらの実験では、対照は市販品のPrevnar（登録商標）であり、これは、ジフテリア毒素に関して無害な変異体タンパク質であるＣＲＭ１９７に結合させた７種の異なる従来の抱合体ＰＳワクチンの混合物をミョウバンに吸収させたものである。
【０１８２】
ＰＣＭＶによって誘発された抗体応答の官能性を評価することができる。例えば、抗ＰＳ抗体が、莢膜を有する肺炎連鎖球菌をオプソニン化し、マクロファージによる貪食後、細菌を死滅させる能力を測定することによって、官能性を評価することができる。肺炎連鎖球菌による致死的攻撃から動物を保護することは、ＰＣＭＶ免疫化した動物でワクチンの効力を実証する別のやり方である。
【実施例４】
【０１８３】
ＰＣＭＶとPrevnar（登録商標）の比較
Merck社を介してＡＴＣＣから、または直接Serum Institute of India（ＳＩＩ）から得た肺炎連鎖球菌多糖（ｐｐｓ）６Ｂ、１４、および２３Ｆの相対的純粋度（cleanliness）を定量した。ｐｐｓの純粋度の指標としてＩＬ−６の発現を使用し、正の「不純（dirty）」対照としてＬＰＳを使用した。図９Ａに示すように、Merck社のｐｐｓ ６Ｂ、１４、および２３Ｆは純粋であるが、図９Ｂに示すように、ＳＩＩ社製ｐｐｓ ６Ｂは「不純」である。図１０に示すように、処理２（１Ｍ ＮａＯＨ中、８０℃での１時間インキュベーション）により、ＳＩＩ ｐｐｓ ６Ｂは純粋になる。抱合体とＰＣＭＶの免疫学的特性の比較に、純粋ｐｐｓ ６Ｂを使用する。表３に示す通り、混入物質はＬＰＳではなかった。
【表３】
【０１８４】
図１１および１３は、Prevnar（登録商標）［ミョウバンに賦活（adjuvated）されている］が、ｐｐｓ ６Ｂに対してＩｇＧ抗体を誘発すること、およびミョウバン賦活型ＰＣＭＶ（ＢＳＡとｐｐｓ ６Ｂ；ジフテリア毒素とｐｐｓ ６Ｂ；ジフテリアトキソイドとｐｐｓ ６Ｂ；および破傷風トキソイドとｐｐｓ ６Ｂ）由来ＩｇＧ応答は、Prevnar（登録商標）で観察されたものよりも高いことを示している。同様に、図１２に示されるように、ミョウバン賦活型ＰＣＭＶに対するＩｇＭ応答は、Prevnar（登録商標）に見られるものと類似している。
【０１８５】
さらに、ｐｐｓ １４（Prevnar（登録商標）で最も免疫原性であったｐｐｓ）に関して、図１４〜１６に示す通り、ジフテリアトキソイドとｐｐｓ １４、または破傷風トキソイドとｐｐｓ １４を含むミョウバン賦活型ＰＣＭＶは、ＩｇＧ応答の誘発においてPrevnar（登録商標）とほぼ等しい。
【実施例５】
【０１８６】
多価ＰＣＭＶ
ＤＮＩ担体タンパク質をグルタルアルデヒドで架橋する前に、化学的に異なる莢膜有機ポリマーを一緒に混合することによるＰＣＭＶ法（「ワンポット合成反応」）を使用し、多価免疫原を生成した。担体としてＤＮＩを使用し、この種の三価免疫原を３種の有機ポリマー−ＰＧＡ、アルギン酸、およびデキストラン−から作製した。これらの三価ワクチンは、免疫原性であり、３種の莢膜有機ポリマーに対して免疫応答を生じたが、免疫化前および３０日後に分析したプールした血清のＩｇＭ（図６）、免疫化６０日後の抗原特異的血清ＩｇＧ抗体力価（図７）、および免疫化１２８日後の抗ＰＳ血清抗体力価（図８）によって示される通りである。同様に図６〜８に示すように、一価アルギン酸ＰＣＭＶ調製物は、マウスでも免疫応答を生じた。別々に合成した特異的ＰＣＭＶを混合し、次いで最後に一緒に混合して「カクテル」ワクチンを生成することによって、多価ＰＣＭＶ免疫原を製剤化することもできる。
【０１８７】
参照により組み込むために、独立した各特許、特許出願、特許出願公開または刊行物を具体的にかつ別個に指摘するのと同程度に、本明細書において、引用または参照した全ての特許、特許出願、特許出願公開、および他の刊行物を参照により本明細書に組み込む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の抗原と担体タンパク質を含むワクチン組成物であって、（ｉ）目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋し、かつ（ｉｉ）該抗原が該担体タンパク質に捕捉されて複合体を形成する、前記ワクチン組成物。
【請求項２】
前記複合体の直径が１０ｎｍ〜１００μｍである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記複合体の直径が約１００ｎｍ〜１００μｍである、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記複合体の直径が約１００ｎｍ〜１０μｍである、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記複合体を哺乳動物に投与すると、該哺乳動物でＴ細胞依存性免疫応答が誘発される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記抗原：前記担体タンパク質のモル比が、１：１０〜１０：１である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記担体タンパク質が多量体である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記多量体が、少なくとも５個のサブユニットを含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記多量体がホモ多量体である、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記担体タンパク質が、少なくとも１個の別の担体タンパク質と共有結合している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記共有結合が、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合を含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記共有結合が、式
【化１】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物を含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記共有結合が、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンを含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記共有結合が、二官能基架橋剤を含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記二官能基架橋剤が、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記担体タンパク質が非共有結合している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記非共有結合が、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合を含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記担体タンパク質が、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（または関連タンパク質）、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記細菌細胞全体が、緑膿菌または連鎖球菌細胞である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記細菌性フラゲリンが、コレラ菌フラゲリンタンパク質である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記志賀様毒素が、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記担体タンパク質がニューモリシンである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記担体タンパク質がリステリオリシンＯである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記担体タンパク質がジフテリア毒素である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記担体タンパク質がジフテリアトキソイドである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
前記担体タンパク質が破傷風毒素である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
前記担体タンパク質が破傷風トキソイドである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
前記目的の抗原が、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
前記多糖が、少なくとも１８残基を含む、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌（多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、サルモネラ種多糖、赤痢菌多糖、または髄膜炎菌多糖である、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
前記肺炎連鎖球菌多糖が、莢膜型３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６である、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
前記野兎病菌多糖がＯ抗原である、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
前記目的の抗原が、微生物の莢膜ポリマーである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
前記微生物の莢膜ポリマーが、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
前記目的の抗原が、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、該原子の各々が、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸からなる群から独立して選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
前記有機ポリマーが微生物に由来する、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
前記有機ポリマーが自然発生のものではない、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
前記ワクチン組成物が、第２の目的の抗原をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記ワクチン組成物が、第３の目的の抗原をさらに含む、請求項３８に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合して、該抗原と該担体タンパク質の混合物を形成するステップ、および（ｉｉ）該目的の抗原を該担体タンパク質で捕捉するステップを含むワクチン組成物の作製方法であって、該ワクチン組成物中、該目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する、前記作製方法。
【請求項４１】
前記ワクチン組成物が、製薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記捕捉ステップが、前記混合物から前記抗原と前記担体タンパク質を沈殿させるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記沈殿ステップが、前記混合物のｐＨを変化させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記沈殿ステップが、前記混合物に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または硫酸アンモニウムを加えるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記沈殿ステップが、前記混合物の無機塩濃度を上昇させ、または低下させることにより、該混合物のイオン強度を変化させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記沈殿ステップが、前記混合物を加熱して、前記担体タンパク質および／または前記抗原を凝固させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記沈殿ステップが、前記混合物に十分な線束の電離放射線を照射して架橋させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記ワクチン組成物中、前記抗原：前記担体タンパク質のモル比が、１：１０〜９：１０である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記担体タンパク質が多量体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記多量体が、少なくとも５個のサブユニットを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記多量体がホモ多量体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記担体タンパク質が非共有結合している、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記非共有結合が、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記担体タンパク質が、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌細胞全体が、緑膿菌または連鎖球菌細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌性フラゲリンが、コレラ菌フラゲリンタンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記志賀様毒素が、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記担体タンパク質がニューモリシンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記担体タンパク質がリステリオリシンＯである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記担体タンパク質がジフテリア毒素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記担体タンパク質がジフテリアトキソイドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記担体タンパク質が破傷風毒素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記担体タンパク質が破傷風トキソイドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
前記目的の抗原が、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項６５】
前記多糖が、少なくとも１８残基を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記肺炎連鎖球菌多糖が、莢膜型３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記野兎病菌多糖がＯ抗原である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記目的の抗原が、微生物の莢膜ポリマーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項７０】
前記微生物の莢膜ポリマーが、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記目的の抗原が、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、該原子の各々が、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸からなる群から独立して選択されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項７２】
前記有機ポリマーが微生物に由来する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記有機ポリマーが自然発生のものではない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
第２の目的の抗原をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項７５】
第３の目的の抗原をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合するステップ、および（ｉｉ）該担体タンパク質と架橋するリンカーを加えるステップを含むワクチン組成物の作製方法であって、該ワクチン組成物中、該目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する、前記作製方法。
【請求項７７】
前記ワクチン組成物が、製薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ワクチン組成物中、前記抗原：前記担体タンパク質のモル比が、１：１０〜１０：１である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記担体タンパク質が多量体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記多量体が、少なくとも５個のサブユニットを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記多量体がホモ多量体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記方法が、前記担体タンパク質中のシッフ塩基を還元するステップを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記担体タンパク質が、少なくとも１個の別の担体タンパク質と共有結合している、請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
前記共有結合が、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記共有結合が、二官能基架橋剤を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記二官能基架橋剤が、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記リンカーが、式
【化２】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８８】
前記リンカーが、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８９】
前記担体タンパク質が、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである、請求項７６に記載の方法。
【請求項９０】
前記細菌細胞全体が、緑膿菌または連鎖球菌細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記細菌性フラゲリンが、コレラ菌フラゲリンタンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記志賀様毒素が、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記目的の抗原が、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である、請求項７６に記載の方法。
【請求項９４】
前記多糖が、少なくとも１８残基を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記肺炎連鎖球菌多糖が、莢膜型３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記野兎病菌多糖がＯ抗原である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記目的の抗原が、微生物の莢膜ポリマーである、請求項７６に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物の莢膜ポリマーが、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記目的の抗原が、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、該原子の各々が、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸からなる群から独立して選択されている、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記有機ポリマーが微生物に由来する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記有機ポリマーが自然発生のものではない、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
第２の目的の抗原をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０４】
第３の目的の抗原をさらに含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
被験体で抗体の産生を誘発するのに十分な量の請求項１に記載のワクチン組成物を該被験体に投与するステップを含む、被験体に感染病原体に対するワクチンを接種する方法。
【請求項１０６】
前記方法が、前記被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の請求項１に記載の前記ワクチン組成物を該被験体に投与する、２回目の投与ステップを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗体の産生がＴ細胞に依存する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記抗体の産生が、前記被験体が感染病原体に感染するのを防止または低減するのに十分である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記感染病原体が、肺炎球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌Ｂ型、緑膿菌、野兎病菌、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、および大腸菌である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記方法が、前記被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の、目的の抗原を含む第２のワクチン組成物を該被験体に提供する、２回目の投与ステップを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体の産生が、前記被験体が第２の感染病原体に感染するのを防止または低減するのに十分である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１０５または１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記被験体がヒトである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１】
目的の抗原と担体タンパク質を含むワクチン組成物であって、（ｉ）目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋し、かつ（ｉｉ）該抗原が該担体タンパク質に捕捉されて複合体を形成する、前記ワクチン組成物。
【請求項２】
前記複合体の直径が１０ｎｍ〜１００μｍである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記複合体の直径が約１００ｎｍ〜１００μｍである、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記複合体の直径が約１００ｎｍ〜１０μｍである、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記複合体を哺乳動物に投与すると、該哺乳動物でＴ細胞依存性免疫応答が誘発される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記抗原：前記担体タンパク質のモル比が、１：１０〜１０：１である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記担体タンパク質が多量体である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記多量体が、少なくとも５個のサブユニットを含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記多量体がホモ多量体である、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記担体タンパク質が、少なくとも１個の別の担体タンパク質と共有結合している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記共有結合が、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合を含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記共有結合が、式
【化１】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物を含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記共有結合が、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンを含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記共有結合が、二官能基架橋剤を含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記二官能基架橋剤が、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記担体タンパク質が非共有結合している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記非共有結合が、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合を含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記担体タンパク質が、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（または関連タンパク質）、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記細菌細胞全体が、緑膿菌または連鎖球菌細胞である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記細菌性フラゲリンが、コレラ菌フラゲリンタンパク質である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記志賀様毒素が、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記担体タンパク質がニューモリシンである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記担体タンパク質がリステリオリシンＯである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記担体タンパク質がジフテリア毒素である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記担体タンパク質がジフテリアトキソイドである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
前記担体タンパク質が破傷風毒素である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
前記担体タンパク質が破傷風トキソイドである、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
前記目的の抗原が、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
前記多糖が、少なくとも１８残基を含む、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌（多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、サルモネラ種多糖、赤痢菌多糖、または髄膜炎菌多糖である、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
前記肺炎連鎖球菌多糖が、莢膜型３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６である、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
前記野兎病菌多糖がＯ抗原である、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
前記目的の抗原が、微生物の莢膜ポリマーである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
前記微生物の莢膜ポリマーが、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
前記目的の抗原が、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、該原子の各々が、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸からなる群から独立して選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
前記有機ポリマーが微生物に由来する、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
前記有機ポリマーが自然発生のものではない、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
前記ワクチン組成物が、第２の目的の抗原をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記ワクチン組成物が、第３の目的の抗原をさらに含む、請求項３８に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合して、該抗原と該担体タンパク質の混合物を形成するステップ、および（ｉｉ）該目的の抗原を該担体タンパク質で捕捉するステップを含むワクチン組成物の作製方法であって、該ワクチン組成物中、該目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する、前記作製方法。
【請求項４１】
前記ワクチン組成物が、製薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記捕捉ステップが、前記混合物から前記抗原と前記担体タンパク質を沈殿させるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記沈殿ステップが、前記混合物のｐＨを変化させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記沈殿ステップが、前記混合物に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または硫酸アンモニウムを加えるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記沈殿ステップが、前記混合物の無機塩濃度を上昇させ、または低下させることにより、該混合物のイオン強度を変化させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記沈殿ステップが、前記混合物を加熱して、前記担体タンパク質および／または前記抗原を凝固させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記沈殿ステップが、前記混合物に十分な線束の電離放射線を照射して架橋させるステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記ワクチン組成物中、前記抗原：前記担体タンパク質のモル比が、１：１０〜９：１０である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記担体タンパク質が多量体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記多量体が、少なくとも５個のサブユニットを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記多量体がホモ多量体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記担体タンパク質が非共有結合している、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記非共有結合が、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記担体タンパク質が、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌細胞全体が、緑膿菌または連鎖球菌細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌性フラゲリンが、コレラ菌フラゲリンタンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記志賀様毒素が、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記担体タンパク質がニューモリシンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記担体タンパク質がリステリオリシンＯである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記担体タンパク質がジフテリア毒素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記担体タンパク質がジフテリアトキソイドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記担体タンパク質が破傷風毒素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記担体タンパク質が破傷風トキソイドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
前記目的の抗原が、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項６５】
前記多糖が、少なくとも１８残基を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記肺炎連鎖球菌多糖が、莢膜型３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記野兎病菌多糖がＯ抗原である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記目的の抗原が、微生物の莢膜ポリマーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項７０】
前記微生物の莢膜ポリマーが、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記目的の抗原が、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、該原子の各々が、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸からなる群から独立して選択されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項７２】
前記有機ポリマーが微生物に由来する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記有機ポリマーが自然発生のものではない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
第２の目的の抗原をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項７５】
第３の目的の抗原をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
（ｉ）目的の抗原と担体タンパク質とを混合するステップ、および（ｉｉ）該担体タンパク質と架橋するリンカーを加えるステップを含むワクチン組成物の作製方法であって、該ワクチン組成物中、該目的の抗原の５０％以下が該担体タンパク質と架橋する、前記作製方法。
【請求項７７】
前記ワクチン組成物が、製薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ワクチン組成物中、前記抗原：前記担体タンパク質のモル比が、１：１０〜１０：１である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記担体タンパク質が多量体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記多量体が、少なくとも５個のサブユニットを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記多量体がホモ多量体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記方法が、前記担体タンパク質中のシッフ塩基を還元するステップを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記担体タンパク質が、少なくとも１個の別の担体タンパク質と共有結合している、請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
前記共有結合が、リジン側鎖の一級アミノ基と、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖のカルボキシ基との間のペプチド結合を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記共有結合が、二官能基架橋剤を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記二官能基架橋剤が、グルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチルである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記リンカーが、式
【化２】
［式中、Ｒｎは、１〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、１〜１２原子の直鎖もしくは分枝鎖ヘテロアルキル、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルケン、２〜１２炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖アルキン、５〜１０炭素原子の芳香族残基、３〜１０原子の環系、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｑは１〜４である）、または２個のアルデヒド基を結合する化学結合である。］の化合物である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８８】
前記リンカーが、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、またはビス−ビアゾ化ベンジジンである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８９】
前記担体タンパク質が、ジフテリア毒素もしくはその変異体、ジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその変異体、破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、志賀様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌細胞全体からのタンパク質抽出物、炭疽菌防御抗原のドミナントネガティブ変異体（ＤＮＩ）、または大腸菌β−ガラクトシダーゼである、請求項７６に記載の方法。
【請求項９０】
前記細菌細胞全体が、緑膿菌または連鎖球菌細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記細菌性フラゲリンが、コレラ菌フラゲリンタンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記志賀様毒素が、赤痢菌ＳｌｔＢ２タンパク質である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記目的の抗原が、多糖、ポリアルコール、またはポリアミノ酸である、請求項７６に記載の方法。
【請求項９４】
前記多糖が、少なくとも１８残基を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記多糖が、肺炎連鎖球菌多糖、野兎病菌多糖、炭疽菌多糖、インフルエンザ菌多糖、チフス菌多糖、赤痢菌種多糖、サルモネラ種多糖、または髄膜炎菌多糖である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記肺炎連鎖球菌多糖が、莢膜型３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記野兎病菌多糖がＯ抗原である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記目的の抗原が、微生物の莢膜ポリマーである、請求項７６に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物の莢膜ポリマーが、炭疽菌のポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記目的の抗原が、少なくとも３原子を有するモノマーからなる有機ポリマーであり、該原子の各々が、炭素、酸素、水素、リン酸、窒素、および硫酸からなる群から独立して選択されている、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記有機ポリマーが微生物に由来する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記有機ポリマーが自然発生のものではない、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
第２の目的の抗原をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０４】
第３の目的の抗原をさらに含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
被験体で抗体の産生を誘発するのに十分な量の請求項１に記載のワクチン組成物を該被験体に投与するステップを含む、被験体に感染病原体に対するワクチンを接種する方法。
【請求項１０６】
前記方法が、前記被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の請求項１に記載の前記ワクチン組成物を該被験体に投与する、２回目の投与ステップを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗体の産生がＴ細胞に依存する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記抗体の産生が、前記被験体が感染病原体に感染するのを防止または低減するのに十分である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記感染病原体が、肺炎球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌Ｂ型、緑膿菌、野兎病菌、赤痢菌種、サルモネラ種、アシネトバクター種、ブルクホルデリア種、および大腸菌である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記方法が、前記被験体で抗体の産生をブーストするのに十分な量の、目的の抗原を含む第２のワクチン組成物を該被験体に提供する、２回目の投与ステップを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体の産生が、前記被験体が第２の感染病原体に感染するのを防止または低減するのに十分である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１０５または１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記被験体がヒトである、請求項１０５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５００３５４（Ｐ２０１０−５００３５４Ａ）
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２３８１８（Ｐ２００９−５２３８１８）
【出願日】平成１９年８月７日（２００７．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７５２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２１０７６
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月７日（２００７．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１７５２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２１０７６
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
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