タンパク質生産の増強のためのｍＲＮＡの一次構造の再操作
本明細書に記載されていることは、翻訳の効率を増加させるために、天然ｍＲＮＡを修飾するか、または合成ｍＲＮＡを操作するための基準である。これらの基準は、１）コード配列におけるＡＵＧまたは非標準開始コドンを介するリボソームダイバージョンを減少させることにより、および／または２）コード配列における１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を除去することによりｍｉＲＮＡ介在の下方制御を回避することにより、タンパク質合成を増強することが意図されるｍＲＮＡコーディングおよび３’ＵＴＲ配列に対する修飾を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願への言及
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に、タイトル“Reengineering mRNA Primary Structure for Enhanced Protein Production”の２００９年２月２４日付け米国仮出願番号６１／１５５，０４９の優先権の利益を主張する。上記出願の内容を、出典明示によりその全体を包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
真核生物における翻訳開始は、５’キャップ構造または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）のいずれかでの４０Ｓリボソームサブユニットおよび翻訳機構の他の成分のｍＲＮＡによる動員に関連する。その動員後、４０Ｓサブユニットは開始コドンへ移動する。翻訳開始の広く受け入れられた考えの１つは、４０Ｓサブユニットが、良いヌクレオチドコンテキスト(context)に属する第１のＡＵＧコドンに遭遇するまで、５’から３’方向において５’リーダーを介する走査により動員の部位から開始コドンへ移動すると主張する（Kozak “The Scanning Model for Translation: An Update” J. Cell Biol. 108:229-241 (1989)）。最近、翻訳開始が走査と関連せず、キャップ構造またはＩＲＥＳのいずれかでのリボソームサブユニットのテザーリング(tethering)、または内部部位でのリボソームサブユニットのクラスタリング(clustering)と関連し得るということが主張されている（Chappellら. “Ribosomal shunting mediated by a translational enhancer element that base pairs to 18S rRNA” PNAS USA 103(25):9488-9493 (2006); Chappellら., “Ribosomal tethering and clustering as mechanisms for translation initiation” PNAS USA 103(48):18077-82 (2006)）。４０Ｓサブユニットは、必ずしもｍＲＮＡにおける第１のＡＵＧコドンではない利用可能なＡＵＧコドンへ移動する。該サブユニットが何らかの機構により開始コドンに到達すると、該サブユニットと関連する開始メチオニン−ｔＲＮＡが開始コドンと塩基対合し、大型（６０Ｓ）リボソームサブユニットが結合し、ペプチド合成が始まる。
【０００３】
翻訳は、一般的に、走査機構により開始すると考えられるため、上流ＡＵＧコドンと称される５’リーダー内に含まれるＡＵＧコドンの翻訳に対する効果が考えられており、５’リーダーにおけるＡＵＧコドンは、遺伝子、ヌクレオチドコンテキストおよび細胞状態に依存して、タンパク質合成に対して正または負の効果のいずれかを有し得る。例えば、上流ＡＵＧコドンは、真の開始コドンからリボソームをそらすことにより、翻訳開始を阻害することができることが知られている。しかしながら、翻訳が走査機構により開始するという考えは、タンパク質合成におけるコード配列中の可能性のある開始コドンの効果を考慮していない。対照的に、翻訳開始のテザーリング／クラスタリング機構は、ＡＵＧコドンおよび非標準コドンの両方を含むコード配列中の推定開始コドンを利用し、結果として、リボソームに対する真の開始コドンと競合することにより、タンパク質合成の速度を低下させ得ることを示唆する。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）介在の下方制御は、また、翻訳の効率に負に影響することができる。ｍｉＲＮＡは、一般的に、２１−２３ヌクレオチド長であり、リボヌクレオタンパク質複合体の成分である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに対する塩基対合によりタンパク質レベルに負に影響し、ｍＲＮＡ安定性、新生ペプチド安定性および翻訳の効率を減少させることが示唆されている（Eulalioら. “Getting to the Root of miRNA-Mediated Gene Silencing” Cell 132:9-14 (1998)）。ｍｉＲＮＡは、一般的に、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列（ＵＴＲ）における結合部位に対する塩基対合によってそれらの効果を介在するが、ｍｉＲＮＡは、コード配列および５’リーダー配列内に含まれる結合部位から同様の抑制作用を有することが示されている。塩基対合は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２−８を含む、いわゆる「シード配列(seed sequence)」を介して起こる。ヒトにおいて１，０００以上の異なるｍｉＲＮＡが存在し得る。
【０００５】
ｍＲＮＡコード配列における推定開始コドンおよびｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合部位の負の影響は、医薬産業への挑戦をもたらす。例えば、タンパク質薬物の産業生産、抗原産生のためのＤＮＡワクチン、一般的な研究目的および遺伝子治療適用は、すべて、タンパク質合成の準最適な速度または配列安定性の影響を受ける。タンパク質収率の改善およびより高いタンパク質濃度は、産業規模の培養物と関連するコストを最小限にし、薬物生産コストを減少させ、タンパク質精製を容易にすることができる。乏しいタンパク質発現は、特定の技術の大規模使用を限定し、例えば、フェーズ３臨床試験を実施するための免疫応答を産生するためのＤＮＡワクチンから十分な抗原を発現することにおいて問題がある。
【発明の概要】
【０００６】
要約
当該分野において、タンパク質翻訳の効率および安定性、ならびに、例えば、タンパク質薬物の産業生産におけるタンパク質収量および濃度の改善の必要性がある。
【０００７】
全長タンパク質発現の効率を改善する方法が開示される。該方法は、タンパク質に対するコード配列、コード配列の上流にある第１の開始コドン、およびコード配列内に位置する１つ以上の第２の開始コドンを有するポリヌクレオチドを提供することを含む。該方法は、また、１つ以上の第２の開始コドンを変異し、第１の開始コドンから離れてリボソームダイバージョンの減少をもたらす１つ以上の第２の開始コドンでのタンパク質合成の開始の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させることを含む。
【０００８】
該方法は、また、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該１つ以上の第２の開始コドンは、コード配列と同じリーディングフレーム内またはコード配列のフレーム外にあり得る。該１つ以上の第２の開始コドンは、リボソーム動員部位から１つ以上のヌクレオチドの上流または下流に位置し得る。該リボソーム動員部位は、キャップまたはＩＲＥＳを含み得る。該１つ以上の第２の開始コドンは、ＡＵＧ、ＡＣＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、およびＡＵＵから選択され得る。該方法は、コード配列内の２つ以上の第２の開始コドンを変異させることを含み得る。該方法は、コード配列内のすべての第２の開始コドンを変異させることを含み得る。フランキング(flanking)ヌクレオチドは、望ましくないヌクレオチドコンテキストへ変異させ得る。１つ以上の第２の開始コドンの変異は、新規開始コドンを導入することを回避し得る。該１つ以上の第２の開始コドンの変異は、ｍｉＲＮＡシード配列を導入することを回避し得る。該１つ以上の第２の開始コドンの変異は、変異コドンの利用バイアス(bias)を改変することを回避し得る。全長をコードされたタンパク質以外の短縮タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの産生は減少され得る。該１つ以上の第２の開始コドンの変異は、ｍｉＲＮＡシード配列、スプライスドナー部位もしくはスプライス受容部位、またはｍＲＮＡ不安定化エレメントを導入することを回避し得る。
【０００９】
また、全長タンパク質発現の効率を改善する方法も開示される。該方法は、タンパク質に対するコード配列およびコード配列内に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を有するポリヌクレオチド配列を提供し、該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を変異することを含む。該変異は、タンパク質翻訳のｍｉＲＮＡ介在の下方制御の減少をもたらす１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位でのｍｉＲＮＡ結合の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる。
【００１０】
該方法は、また、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、ｍｉＲＮＡのシード配列中に１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、開始コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、希少コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、さらなるｍｉＲＮＡシード配列がポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、コード配列内に位置することができる。該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、３’非翻訳領域内に位置することができる。該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、５’リーダー配列内に位置することができる。
【００１１】
本記載の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の以下の部分および特許請求の範囲を参照することにより理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、ＣＡＴ（ダイヤモンド形）またはｍＣＡＴ発現構築物（四角形）で形質転換された大腸菌ＤＨ５α細胞培養物の増殖曲線を示す。
【図２】図２は、ＣＡＴ（Ｃ）またはｍＣＡＴ（ｍＣ）発現構築物で形質転換された大腸菌ＤＨ５α細胞から回収された溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【図３】図３は、野生型ＣＡＴまたは修飾されたＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の抽出物のウエスタンブロット分析を示す。
【図４】図４は、野生型ＣＤ５（ｃｄ５−１）または修飾されたＣＤ５シグナルペプチドα−サイログロブリン軽鎖発現構築物（ｃｄ５−２からｃｄ５−５）で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の上清のウエスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
Ｉ．概観
コードされたタンパク質のレベルを増加させるために、天然ｍＲＮＡを修飾するか、または合成ｍＲＮＡを操作する方法が本明細書に開示される。これらの基準は、１）コード配列におけるＡＵＧまたは非標準開始コドンを介するリボソームダイバージョンを減少させることにより、および／または２）コード配列におけるｍｉＲＮＡ結合部位を除去することによりｍｉＲＮＡ介在の下方制御を回避することにより、タンパク質合成を増強することが意図されるｍＲＮＡコーディングおよび３’ＵＴＲ配列に対する修飾を表す。
【００１４】
真核および細菌細胞において特定のタンパク質の収率を増加させるために使用することができるｍＲＮＡの一次構造の再操作の方法が開示される。本明細書に記載されている該方法は、タンパク質薬物の産業生産、ならびに研究目的、遺伝子治療適用、および抗原産生を増加させるためのＤＮＡワクチンに適用することができる。より良いタンパク質収率は、産業規模の培養物と関連するコストを最小限にし、薬物コストを減少させる。加えて、より高いタンパク質濃度は、タンパク質精製を容易にすることができる。さらに、例えば、フェーズ３臨床試験の実施において、または免疫応答を産生するためのＤＮＡワクチンから十分な抗原を発現することにおいて、乏しいタンパク質発現によって可能でないプロセスは、本明細書に記載されている方法を使用して可能になり得る。
【００１５】
ＩＩ．定義
本明細書は、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは変更してもよい。また、本明細書において使用される用語は、特定の態様を記載するだけの目的のためであり、特許請求の範囲に記載されている本方法の範囲を限定する意図はないことを理解すべきである。
【００１６】
本明細書において使用される単数形「１つ(a、an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに他のものを指示しないかぎり複数の言及を含む。したがって、例えば、「細胞(a cell)」の言及は、複数のこのような細胞を含み、「タンパク質(a protein)」の言及は、１つまたはそれ以上のタンパク質および当業者に知られているその同等語などを含む。
【００１７】
他に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本明細書が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の文献は、当業者に、本明細書において使用される多数の用語の一般的な定義を提供するものである：Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002);およびA Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。本明細書に具体的に適用されるこれらの用語のいくつかのさらなる説明を本明細書において提供する。
【００１８】
「薬剤」なる用語は、あらゆる物質、分子、エレメント、化合物、存在物(entity)またはそれらの組合せを含む。例えば、タンパク質、ポリペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含むがこれらに限定されない。天然産物、合成化合物、もしくは化合物、または２つ以上の物質の組合せであり得る。特記されない限り、「薬剤」、「物質」および「化合物」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００１９】
「シストロン」なる用語は、単一のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡの単位を意味する。「転写単位」なる用語は、ＲＮＡの合成が起こるＤＮＡのセグメントを示す。
【００２０】
「ＤＮＡワクチン」なる用語は、宿主細胞または組織に導入でき、そこで細胞により発現されて、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子を生産し、次に翻訳されて、ＤＮＡによってコードされるワクチン抗原を生産するＤＮＡを示す。
【００２１】
「興味のある遺伝子」なる言葉は、生産が調節されるべきタンパク質産物（興味のあるタンパク質）をコードするシストロン、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはポリヌクレオチド配列を含むことを意図する。興味のある遺伝子の例は、治療タンパク質、栄養タンパク質および産業的に有用なタンパク質をコードする遺伝子を含む。興味のある遺伝子は、また、レポーター遺伝子または選択可能なマーカー遺伝子、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＲｅｎｉｌｌａまたはＰｈｏｔｉｎｕｓ）を含むことができる。
【００２２】
発現は、ポリペプチドがＤＮＡから生産されるプロセスである。該プロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写および後のｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。
【００２３】
本明細書において使用される「内因性」なる用語は、通常、野生型宿主において見出される遺伝子を示し、「外因性」なる用語は、通常、野生型宿主において見出されない遺伝子を示す。
【００２４】
「宿主細胞」は、異種ポリヌクレオチド配列が導入されるか、または導入されている生細胞を示す。生細胞は、培養細胞および生体内の細胞の両方を含む。異種ポリヌクレオチド配列を細胞に導入するための手段は、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、形質転換、ウイルス感染など、よく知られている。しばしば、細胞に導入される異種ポリヌクレオチド配列は、複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターである。いくつかの態様において、宿主細胞は、染色体上またはゲノム中に所望の遺伝子を組み込むように操作することができる。宿主として働く、本願の方法に実施において使用することができる多数の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、当該分野でよく知られている。例えば、Sambrookら., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)、およびBrentら., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)参照。いくつかの態様において、宿主細胞は真核細胞である。
【００２５】
「誘導剤」なる用語は、誘導可能な翻訳調節エレメントから翻訳をもたらす化学的、生物学的または物理学的薬剤を示すために使用される。誘導剤への暴露に対する応答において、エレメントからの翻訳は、一般的に、新たに開始されるか、または発現の基底または構成レベルよりも増加する。誘導剤は、例えば、細胞が暴露されるストレス条件、例えば、熱または低温ショック、毒物、例えば、重金属イオン、または栄養、ホルモン、成長因子の欠乏などであってよく、また細胞の増殖または分化状態に影響する化合物、例えば、ホルモンまたは増殖因子であってよい。
【００２６】
「単離または精製されたポリヌクレオチド」なる句は、生物体の天然ゲノム中の両端の隣接配列から単離されているポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）の断片を含むことを意図する。精製されたポリヌクレオチドは、二本鎖もしくは一本鎖のいずれかであるオリゴヌクレオチド；ベクターに組み込まれたポリヌクレオチドフラグメント；真核または原核生物生物体のゲノムに挿入されたフラグメント；またはプローブとして使用されるフラグメントであり得る。「実質的に純粋」なる句は、ポリヌクレオチドに言及されているとき、一般的に、サンプルの少なくとも８５パーセントまたはそれ以上のパーセントを有するように、分子が他の付随の生物学的成分から分離されていることを意味する。
【００２７】
「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸」または「ポリヌクレオチド配列」なる用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを示し、他に限定のない限り、天然ヌクレオチドと同様の様式で拡散にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。核酸配列は、例えば、原核生物配列、真核ｍＲＮＡ配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ配列、真核ＤＮＡ（例えば、哺乳動物ＤＮＡ）由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得るが、これらに限定されない。
【００２８】
「プロモーター」なる用語は、転写が開始する位置で転写を指向することができる核酸配列を示す。種々のプロモーター配列が当該分野で知られている。例えば、このようなエレメントは、ＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター（例えば、Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３プロモーター）、ＳＰ１部位、および環状ＡＭＰ応答エレメントを含み得るが、これらに限定されない。プロモーターが誘導可能な方であるとき、その活性は誘導剤に応答して増加する。
【００２９】
５’リーダーまたは非翻訳領域（５’リーダー、５’リーダー配列、または５’ＵＴＲ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびそれをコードするＤＮＡの特殊な部分である。それは＋１位（転写が始まる位置）で始まり、コーディング領域の開始コドン（一般的にＡＵＧ）の直前で終わる。細菌において、それは、シャイン−ダルガノ(Shine-Delgarno)配列として知られているリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含み得る。５’リーダー配列は、ヌクレオチドなし（まれにリーダーレスメッセージ(leaderless message)）から＞１，０００−ヌクレオチドまでの長さの範囲である。３’ＵＴＲは、さらに長い傾向がある（最大数キロベース長）。
【００３０】
「作動可能に連結」または「作動可能に結合」なる用語は、通常の機能が行えることが可能である様式下で連結されている遺伝子エレメント間の機能的連結を示す。例えば、転写がプロモーターの制御下にあり、生産された転写産物が通常遺伝子によってコードされるタンパク質に正確に翻訳されるとき、遺伝子はプロモーターに作動可能に連結している。同様に、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を上方調節することを可能にするとき、翻訳エンハンサーエレメントは興味のある遺伝子と作動可能に結合している。
【００３１】
指向性ライゲーションに適応させたヌクレオチドの配列、例えば、ポリリンカーは、ベクターへのポリヌクレオチド配列の指向性ライゲーションのための部位または手段を提供する発現ベクターの領域である。一般的に、指向性ポリリンカーは、２つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列、または制限酵素認識部位を規定するヌクレオチドの配列である。制限開裂時に、２つの部位は、ポリヌクレオチド配列が発現ベクターにライゲートすることができる付着末端を生じる。１つの態様において、２つの制限酵素認識部位は、制限開裂時に、非相補的である付着末端を提供し、それによりポリヌクレオチド配列のカセットへの指向挿入を可能にする。例えば、指向性ライゲーションに適応させたヌクレオチドの配列は、多数の指向性クローニング手段を規定するヌクレオチドの配列を含み得る。指向性ライゲーションに適応させたヌクレオチドの配列が多数の制限酵素認識部位を規定する場合、マルチクローニングサイトと称される。
【００３２】
処置の目的に対する「対象」なる用語は、哺乳動物、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物として分類されるあらゆる動物を示す。非ヒト動物の例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。注記されているときを除き、「患者」または「対象」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。１つの態様において、対象はヒトである。
【００３３】
転写因子は、転写を開始または調節するために必要であるあらゆるポリペプチドを示す。例えば、このような因子は、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ｃＥｔｓ、ＧＡＴＡ、ＧＡＬ４、ＧＡＬ４／Ｖｐ１６、ｃ−Ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、ＮＦ−κＢ、バクテリオファージ−特異的ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｆ−１、およびＴＲＥを含むがこれらに限定されない。このような因子をコードする配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０２２７６（ｃ−Ｍｙｃ）、Ｋ００６５０（ｃ−ｆｏｓ）、ＢＣ００２９８１（ｃ−ｊｕｎ）、Ｍ２７６９１（ＣＲＥＢ）、Ｘ１４７９８（ｃＥｔｓ）、Ｍ７７８１０（ＧＡＴＡ）、Ｋ０１４８６（ＧＡＬ４）、ＡＹ１３６６３２（ＧＡＬ４／Ｖｐ１６）、Ｍ９５５８４（ｃ−Ｍｙｂ）、Ｍ８４９１８（ＭｙｏＤ）、２００６２９３Ａ（ＮＦ−κＢ）、ＮＰ８５３５６８（ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、ＡＡＢ２８１１１（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、ＮＰ５２３３０１（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ）、ＡＦ３６４６０４（ＨＩＦ−１）、およびＸ６３５４７（ＴＲＥ）を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
「実質的に同一」な核酸またはアミノ酸配列は、標準パラメーターを使用して、本明細書に記載されているよく知られているプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）により測定されるとき、参照配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸またはアミノ酸配列を示す。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であり得る。いくつかの態様において、対象配列は参照配列と比較してほぼ同じ長さであり、すなわち、ほぼ同じ数の隣接するアミノ酸残基（ポリペプチド配列に対する）またはヌクレオチド残基（ポリヌクレオチド配列に対する）からなる。
【００３５】
配列同一性は、当該分野で知られている種々の方法で容易に決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）。配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにおいて２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントに対して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がある位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の合計数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００３６】
「処置」または「緩和」なる用語は、化合物または薬剤を対象に投与して、疾患の症状、合併症もしくは生化学的兆候（例えば、心機能障害）の発症を予防または遅延する、症状または疾患を緩和する、状態または障害のさらなる発症を阻止または阻害することを含む。処置を必要とする対象は、疾患または障害にすでに罹患している患者、ならびに障害を有しやすいもの、または障害を予防すべきものを含む。
【００３７】
処置は、予防（疾患の発症を予防または遅延すること、または臨床的もしくは無症状の兆候を予防すること）または疾患の兆候後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。心臓リモデリングおよび／または心不全の処置において、治療剤は、疾患の病状を直接減少させ得るか、疾患を他の治療剤による処置に対してより感受性にさせ得る。
【００３８】
「ベクター」または「構築物」なる用語は、これらのエレメントに作動可能に連結した遺伝子／遺伝子産物の発現が予想通りに制御することができるように明確なパターンの構成に配置されたポリヌクレオチド配列エレメントを示す。一般的に、それらは、外来ＤＮＡのセグメントをスプライスすることによって、外来ＤＮＡを宿主細胞に導入し、複製および／または転写を促進することができる伝播性ポリヌクレオチド配列（例えば、プラスミドまたはウイルス）である。
【００３９】
クローニングベクターは、宿主細胞中で自己複製することができ、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられるＤＮＡ配列（一般的にプラスミドまたはファージ）である。これらの部位に外来ＤＮＡフラグメントがベクターにスプライスされることによって、フラグメントの複製およびクローニングを引き起こし得る。ベクターは、形質転換細胞の同定における使用のために適当な１つ以上のマーカーを含み得る。例えば、マーカーはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供し得る。
【００４０】
発現ベクターはクローニングベクターと同様であるが、宿主への形質転換後に、クローニングされたＤＮＡの発現を誘導することができる。クローニングされたＤＮＡは、通常、特定の調節配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサーの制御下に置かれる（すなわち、作動可能に連結する）。プロモーター配列は、構成的、誘導可能または抑圧可能であり得る。
【００４１】
「開始コドン」または「開始トリプレット」は、タンパク質合成が開始するシストロン内の位置である。それは、一般的に、コード配列の５’末端に位置する。真核ｍＲＮＡにおいて、開始コドンは、一般的に、アミノ酸メチオニン（Ｍｅｔ）をコードする３つのヌクレオチド（アデニン、ウラシルおよびグアニン（ＡＵＧ）ヌクレオチド）からなる。細菌において、開始コドンは、また、一般的にＡＵＧであるが、このコドンは、修飾されたメチオニン（Ｎ−ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ））をコードする。ＡＵＧ以外のヌクレオチドトリプレットは、ときどき、真核生物および細菌の両方において、開始コドンとして使用される。
【００４２】
「下流開始コドン」は、一般的に遺伝子のコーディング領域における真の開始コドンの下流に位置する開始コドンを示す。「上流開始コドン」は、５’リーダー領域における真の開始コドンの上流に位置する開始コドンを示す。
【００４３】
本明細書において使用される、「下流」および「上流」なる言及は、真の開始コドンに対する位置を示す。例えば、ｍＲＮＡ配列上の上流コドンは、配列（例えば、真の開始コドン）内の別の位置と比較してｍＲＮＡ配列の５’末端の方にあるコドンであり、下流コドンは、配列内の別の位置と比較してｍＲＮＡ配列の３’末端の方にあるコドンを示す。
【００４４】
本明細書において使用される「真の開始コドン」または「第１の開始コドン」は、生産が調節されるべき興味のあるコードされたタンパク質のコード配列の第１のアミノ酸をコードするシストロンの開始コドンを示す。「第２の開始コドン」は、興味のあるコードされたタンパク質に対する第１の、もしくは真の開始コドン以外にある開始コドンを示す。第２の開始コドンは、一般的に、コード配列内に位置する第１の、もしくは真の開始コドンの下流である。
【００４５】
本明細書において使用される「タンパク質発現の増加」は、１つ以上の第２の開始コドンが変異されていない野生型ｍＲＮＡから得られたポリペプチド濃度より少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上大きいポリペプチド濃度を産生するように１つ以上の第２の開始コドンが変異された、修飾されたｍＲＮＡの翻訳を示す。タンパク質発現の増加は、また、野生型ｍＲＮＡの１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍またはそれ以上である変異されたｍＲＮＡのタンパク質発現を示し得る。
【００４６】
本明細書において使用される「リボソーム動員部位」は、コードされたタンパク質の翻訳の開始前にリボソームサブユニットが結合するｍＲＮＡ内の部位を示す。リボソーム動員部位は、キャップ構造、ｍＲＮＡの５’末端で見出される修飾されたヌクレオチド（ｍ７Ｇキャップ−構造）、およびｍＲＮＡ内に包含される内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と称される配列を含み得る。他のリボソーム動員部位は、ＧｔｘホメオドメインｍＲＮＡからの９−ヌクレオチド配列を含み得る。リボソーム動員部位は、しばしば、真の開始コドンの上流にあるが、また、真の開始コドンの下流にあることもできる。
【００４７】
本明細書において使用される「利用バイアス」は、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの１つに対して生体が示す特定の好み(preferance)を示す。利用バイアスの改変は、元のコドンよりもより高いまたはより低い好みで同じアミノ酸に対する異なるコドンの使用をもたらす変異を示す。
【００４８】
本明細書において使用される「全長タンパク質」は、本質的にタンパク質をコードする遺伝子によってコードされるあらゆるアミノ酸を包含するタンパク質を示す。当業者は、生細胞におけるいくつかのタンパク質は微妙な修飾が存在するので、タンパク質は実際には、わずかな改変を有する密接に関連したタンパク質の一群であることを知っている。例えば、全てではないがいくつかのタンパク質は、ａ）アミノ末端からアミノ酸が除去されており、および／またはｂ）分子量を増加し得る化学基が付加されている。コードされる大抵の細菌のタンパク質は、タンパク質のアミノ末端でメチオニンおよびアラニン残基を含み、これらの残基の１つまたは両方は、頻繁に、細菌細胞におけるタンパク質の活性型から除去される。修飾のこれらの型は、一般的に、異種であるので、全ての修飾があらゆる分子に起こるわけではない。したがって、天然「全長」分子は、実際には、同じアミノ酸配列から出発するが、修飾され方に小さい差異を有する分子のファミリーである。「全長タンパク質」なる用語は、このような分子のファミリーを包含する。
【００４９】
本明細書において使用される「レスキュー(rescued)」または「修飾」は、コーディング領域から多数からすべての第２の開始コドンを除去するヌクレオチド改変を示す。「部分的に修飾」は、コーディング領域から第２の開始コドンのすべての可能な変異の一部を除去するヌクレオチド改変を示す。
【００５０】
ＩＩＩ．下流開始コドンを介するリボソームダイバージョンの減少
上記のとおり、５’リーダー内に含まれる特徴が翻訳の効率に影響し得ることがよく知られている。例えば、上流ＡＵＧコドンと称される５’リーダーにおけるＡＵＧコドンは、遺伝子、ヌクレオチドコンテキストおよび細胞状態に依存して、タンパク質合成において正または負の効果のいずれかを有し得る。上流ＡＵＧコドンは、真の開始コドンからリボソームをそらすことにより翻訳開始を阻害することができる（Meijerら., “Translational Control of the Xenopus laevis Connexin-41 5’-Untranslated Region by Three Upstream Open Reading Frames” J. Biol. Chem. 275(40):30787-30793 (2000)）。例えば、Ｍｅｉｊｅｒらの図６および８は、５’リーダー配列における上流ＡＵＧコドンのリボソームダイバージョン(ribosomal diversion)効果を示す。
【００５１】
ＡＵＧ／ＡＴＧは、多数の種における通常の翻訳開始コドンであるが、翻訳がときどきインビボでＡＣＧ、ＧＵＧ／ＧＴＧ、ＵＵＧ／ＴＴＧ、ＣＵＧ／ＣＴＧ、ＡＵＡ／ＡＴＡ、ＡＵＣ／ＡＴＣおよびＡＵＵ／ＡＴＴを含む他の上流コドンで開始し得ることも知られている。例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）の開始コドンがＡＣＧに変異されたとき、哺乳動物のリボソームが非ＡＵＧトリプレットで翻訳を開始できることが示されている（Peabody, D.S. (1987) J. Biol. Chem. 262, 11847-11851）。Ｐｅａｂｏｄｙによるさらなる研究は、ｄｈｆｒの変異開始コドンＡＵＧ（ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣおよびＡＵＵ）のすべてが一見したところ正常ｄｈｆｒの合成を指向することできたことを示した（Peabody, D. S. (1989) J. Biol. Chem. 264, 5031-5035）。
【００５２】
翻訳開始のテザーリングおよびクラスタリングモデルは、翻訳が利用可能な開始コドンで開始できることを前提とし、研究は、開始コドンがリボソーム動員部位（ｃａｐまたはＩＲＥＳ）の下流において距離依存性様式で使用されることができることを示した（Ｃｈａｐｐｅｌｌら“Ribosomal tethering and clustering as mechanisms for translation initiation” PNAS USA 103(48):18077-82 2006）。これは、コード配列における推定開始コドンも、利用され得ることを示唆する。下流開始コドンまたは第２の開始部位での翻訳開始は、リボソームについて真の開始コドンまたは第１の開始部位と競合し、コードされたタンパク質の発現を低下させることができる。例えば、第２の開始部位を非開始コドンへ変異することによる、これらの第２の開始部位の有用性の減少は、リボソームに対する第１の開始部位の有用性およびさらに効率的なコードされたタンパク質発現を増加させる。
【００５３】
本方法は、改善され、さらに効率的なタンパク質発現を可能にし、翻訳機構に関する種々の開始コドン間の競合を減少させる。コードされたタンパク質と同じリーディングフレーム内にあるコード配列における下流開始コドンを除去することにより、可能性のある改変された機能を有する短縮タンパク質の産生は除去され得る。加えて、コード配列のフレーム外にある下流開始コドンを除去することにより、いくつかにおいて細胞生理学またはタンパク質生産において負の効果を有し得る種々のペプチドの産生も、また、除去され得る。この利点は、ＤＮＡワクチンまたは遺伝子治療における適用において特に重要であり得る。
【００５４】
コードされたアミノ酸配列が改変されないように下流開始コドンの特異的変異を実施することができる。これは、遺伝子コードが縮重しており、ほとんどのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるため、多数の場合において可能である。例外は、それぞれＡＵＧおよびＵＧＧの１つのコドンによってコードされるメチオニンおよびトリプトファンのみである。また、アミノ酸配列を改変する下流開始コドンの変異もまた、考えることができる。このような場合において、アミノ酸配列を改変する効果を評価し得る。あるいは、アミノ酸配列が改変されないままであるとき、推定開始コドンに隣接するヌクレオチドを、ときどき、開始コドンの効率を減少させるように変異させることができる。ＡＵＧコドンにおいて、これは、優れたコンテキストにおけるＡＵＧが、ＡＵＧが＋１、＋２、＋３と番号付けされるとき、位置−３にプリンおよび＋４にＧを含むことが記載されているＭａｒｉｌｙｎ Ｋｏｚａｋにより確立されたヌクレオチドコンテキスト基準（Kozak, M. (1984) Nature 308, 241-246）にしたがって行うことができる。
【００５５】
非ＡＵＧコドンにおいて、同様の基準が、位置＋５および＋６にヌクレオチド由来のさらなる決定因子で適用できるようである。変異を設計することにおいて、コドン利用バイアスは、多数の場合において、例えば、野生型コドンと同様のコドンバイアスを有する変異コドンを導入することにより、比較的改変されないままであることができる。異なる生物体は異なるコドン利用頻度を有するため、異なる生物体由来の細胞における発現に対する特異的変異は、それに応じて変化し得る。
【００５６】
本明細書に記載されている方法は、真核細胞に限定されず、細菌にも適用すると理解すべきである。細菌の翻訳開始は真核生物と異なると思われるが、リボソーム動員は、依然として、いわゆるシャイン−ダルガノ配列を含むｍＲＮＡにおけるｃｉｓ−エレメントを介して起こる。細菌における非ＡＵＧ開始コドンは、ＡＣＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、およびＡＵＵを含む。
【００５７】
１つの態様において、下流開始コドンを介してリボソームダイバージョンを減少させることにより、タンパク質合成を増強するコード配列への修飾が開示されている。これらのコドンは、ＡＵＧ／ＡＴＧおよび細胞において開始コドンとして機能することが知られている他のヌクレオチドトリプレットコドンを含むことができ、ＡＣＧ、ＧＵＧ／ＧＴＧ、ＵＵＧ／ＴＴＧ、ＣＵＧ／ＣＴＧ、ＡＵＡ／ＡＴＡ、ＡＵＣ／ＡＴＣ、およびＡＵＵ／ＡＴＴを含むが、これらに限定されない。１つの態様において、下流開始コドンを変異する。タンパク質生産を増加させるためのｍＲＮＡコード配列の再操作は、すべての下流開始コドンの変異を含むことができ、または、下流開始コドンの一部のみの変異を含むことができる。別の態様において、フランキングヌクレオチドを望ましくないヌクレオチドコンテキストに変異する。１つの態様において、シグナルペプチドにおけるＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異して、メチオニンからイソロイシンへの置換をもたらすことができる。別の態様において、シグナルペプチドにおけるＣＴＧコドンをＣＴＣに変異することができる。別の態様において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異して、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらすことができ、ＣＴＧコドンをＣＴＣに変異することができる。別の態様において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異することができ、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変異することができ、開始ＡＵＧのコンテキストを開始コドンのコドン３’をＣＣＣからＧＣＴへ変化させて、プロリン（Ｐ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすことにより、改善することができる。他の態様において、１つ以上のＡＵＧおよびＣＵＧコドンを除去することができる修飾をシグナルペプチドに施すことができる。ほとんどの可能性のある開始コドンの除去、シグナルペプチドのＡＴＧおよびＣＴＧの除去、グルタミン酸（Ｅ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸置換またはヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすＡＴＧ、ＣＴＧおよびＡＣＧコドンの除去により修飾されたシグナルペプチドを含む修飾を施すことができる。
【００５８】
分子生物学における標準技術を、変異された核酸配列を産生するために使用することができる。このような技術は、種々の核酸操作技術、核酸転移プロトコール、核酸増幅プロトコールおよび当該分野で知られている他の分子生物学技術を含む。例えば、点変異は、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘発の使用を介して、興味のある遺伝子に導入することができる。修飾された配列は、また、所望の変異と共に合成されたオリゴヌクレオチドを使用することにより合成的に産生することができる。これらのアプローチは、１つの部位またはコーディング領域中に変異を導入するために使用することができる。あるいは、相同組換えを、興味のある標的配列に変異または外因性配列を導入するために使用することができる。核酸転移プロトコールは、塩化カルシウムの形質転換／トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム介在核酸転移、Ｎ−［１−（２，３−ジオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート介在形質転換などを含む。別の変異誘発プロトコールにおいて、特定の遺伝子における点変異を、また、陽性選択圧を使用するために選択することができる。例えば、Current Techniques in Molecular Biology（Ed. Ausubelら）参照。核酸増幅プロトコールは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない。核酸ツール、例えば、プラスミド、ベクター、プロモーターおよび他の制御配列の使用は、多種多様のウイルスまたは細胞生物体に対して当該分野でよく知られている。さらなる多種多様の核酸ツールは、ＡＴＣＣを含む多種多様の供給源、および種々の市販の供給源から利用できる。当業者は、容易に、当該分野の技術常識にしたがってあらゆる特定のウイルスまたは細胞生物体の遺伝子修飾のための適当なツールおよび方法を選択し、選択したものから設計することができる。タンパク質発現は、また、種々の標準方法を使用して測定することができる。これらは、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、代謝標識、および酵素活性測定を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
ＩＶ．ｍｉＲＮＡ介在の下方制御の回避
マイクロＲＮＡは、一般的に負の遺伝子調節因子として機能する小さい非コーディングＲＮＡの豊富なクラスである。１つの態様において、ｍｉＲＮＡ介在の下方制御を回避するように、５’リーダー、コード配列、および３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ配列に対して修飾を施すことができる。このような修飾は、それにより、ｍＲＮＡまたは新生ペプチドの安定性を改変し、タンパク質合成および翻訳の効率を増強することができる。
【００６０】
ｍｉＲＮＡは、一般的に、リボヌクレオタンパク質複合体の成分である２１−２３ヌクレオチドのＲＮＡであり得る。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに対する塩基対合によりｍＲＮＡの安定性またはタンパク質合成に影響を及ぼすことができる。ｍｉＲＮＡは、一般的に、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける結合部位に対する塩基対合によってそれらの効果を介在する。しかしながら、ｍｉＲＮＡは、コード配列および５’リーダー配列内に含まれる結合部位から同様の抑制作用を有することが示されている。塩基対合は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２−８からなる、いわゆる「シード配列」を介して起こる。ヒトにおいて１，０００以上の異なるｍｉＲＮＡが存在し得る。
【００６１】
ｍｉＲＮＡ介在抑制を回避するためのｍＲＮＡの再操作は、ｍＲＮＡ内のすべてのシード配列を変異することを含むことができる。上記の開始コドン変異のとおり、これらの変異は、コードされたアミノ酸配列が改変されないままであることを確実にし、開始コドン、希少コドン、または他のｍｉＲＮＡシード配列を導入しないように作用することができる。
【００６２】
コンピュータープログラムは、興味のある細胞型、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞における発現のための齧歯動物細胞、またはヒト細胞系における発現もしくはＤＮＡワクチンにおける適用のためのヒト細胞にしたがって、ｍＲＮＡ配列を再操作するために使用することができる。このプログラムは、開始コドン以外の、可能性のある開始コドンを除去するようにｍＲＮＡを再コードすることができる。コード配列におけるインフレームのＡＵＧコドンの場合において、これらの下流開始コドンのコンテキストは、可能ならば弱めることができる。変異は、興味のある細胞系に対するコドンバイアスにしたがって実施することができ、例えば、ヒトコドンバイアス情報はヒト細胞系のために使用することができ、出芽酵母コドンバイアス情報は該酵母のために使用することができ、大腸菌コドンバイアス情報は該細菌のために使用することができる。より高等な真核ｍＲＮＡにおいて、次に、再コードされたｍＲＮＡは、興味のある生物体におけるすべての既知のシード配列、例えば、ヒト細胞系に対するヒトシード配列について探索することができる。シード配列を、１）アミノ酸配列を破壊することなく、２）変異コドンの利用バイアスを劇的に改変することなく、３）新規推定開始コドンを導入することなく、変異させることができる。
【００６３】
本明細書は多数の特定の記載を含み、それらの好ましい態様に対する言及が記載されているが、これらは、特許請求される方法または特許請求され得ることの範囲に限定すると解釈すべきでなく、むしろ特定の態様に特異的である特徴の記載と解釈すべきである。形式における種々の変化および詳細は、記載されている対象の意味から逸脱することなく行われ得ることは、当業者により理解される。別々の態様の文脈において本明細書に記載されている特定の特徴は、また、単一の態様における組合せにより実行され得る。逆に、単一の態様の文脈において記載されている種々の特徴は、また、別々に、または任意の適当な副組合せ(sub-combination)において複数の態様により実行され得る。さらに、特徴は特定の組合せにおける作用として上記されており、それ自体、特許請求されているが、特許請求される組合せからの１つまたはそれ以上の特徴は、いくつかの場合において組合せから排除され得、特許請求される組合せは、副組合せまたは副組合せの変異体であり得る。対象の範囲は特許請求の範囲により定義される。
【００６４】
本明細書において引用されている全ての文献、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は、それぞれが、出典明示により包含させるために具体的に、および個々に示されているとき、出典明示により本明細書に包含させる。
【実施例】
【００６５】
実施例
以下の実施例はさらなる説明を提供するが、その範囲に限定されない。他の変異体が当業者には容易に明らかであり、特許請求の範囲に包含される。
【００６６】
実施例１：ｍＲＮＡ転写産物内の多重翻訳開始部位の修飾
ｍＲＮＡ転写産物の５’−ＵＴＲおよびコーディング領域内の多重翻訳開始部位の存在は、例えば、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンからリボソームをそらすことにより、翻訳の効率を減少させる。あるいは、または加えて、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンの下流の多重翻訳開始部位の存在は、全長タンパク質の翻訳の効率を減少させる１つ以上のタンパク質アイソフォームの翻訳の開始を誘導する。商業的に価値のあるヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の翻訳の効率を改善するために、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンの上流および下流のすべてのリーディングフレーム内の可能性のある翻訳開始部位を、これらの部位を除去するように変異させる。この方法の好ましい局面において、ｍＲＮＡ配列を改変するが、コードされる得られるアミノ酸は同じままである。あるいは、同様の物理的特性を有するアミノ酸を置換する保存的変化を誘導する。
【００６７】
標準翻訳開始コドンはＡＵＧ／ＡＴＧである。他の同定された開始コドンは、ＡＣＧ、ＧＵＧ／ＧＴＧ、ＵＵＧ／ＴＴＧ、ＣＵＧ／ＣＴＧ、ＡＵＡ／ＡＴＡ、ＡＵＣ／ＡＴＣおよびＡＵＵ／ＡＴＴを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
細胞内タンパク質：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
クロラムフェニコールは、５０Ｓリボソームサブユニットに結合し、ペプチド結合形成を防止することにより、細菌タンパク質合成を妨げる抗生物質である。耐性遺伝子（ｃａｔ）は、該抗生物質をその２つのヒドロキシル基の１つまたは両方でアセチル化することにより、該薬物をアセチル化し、不活性化させるアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする。ＣＡＴの修飾されていないオープンリーディングフレームは、１１３個の可能性のある開始コドン（真の開始コドンを含む２０個のＡＴＧ、８個のＡＴＣ、８個のＡＣＧ、１２個のＧＴＧ、８個のＴＴＧ、１１個のＣＴＧ、６個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、１６個のＡＴＡおよび１４個のＡＴＴコドン）を含む（配列番号：１２０）。配列番号：１２１は、完全に修飾されたＣＡＴのＯＲＦであり、配列番号：１２２は、可能性のある修飾の一部だけを施した部分的に修飾されたＣＡＴのＯＲＦである。
【００６９】
図１Ａ−１Ｂは、ＣＡＴシストロン（ＣＡＴ）および部分的に修飾されたＣＡＴシストロン（ｍＣＡＴ）を含む細菌発現構築物を産生し、大腸菌細菌株ＤＨ５αにおいて試験したことを示す。ＤＨ５α細胞を、ＣＡＴおよびｍＣＡＴ発現構築物で形質転換し、ＬＢ／アンピシリンプレート上に置いた。培養物を単一のコロニーから得、培養物のＡ６００を測定することにより決定されるとき対数増殖が達成されるまで、ＬＢ／アンピシリン（〜５０μｇ／ｍｌ）中で３７℃で２２０ｒｐｍで振とうしながら培養した。次に、培養物を比較できるＡ６００にＬＢ／アンピシリンで希釈した。ＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞由来の培養物のＡ６００は０．３であったが、ｍＣＡＴ発現構築物で形質転換された細胞由来のものは０．２５であった。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．４ｍＭの最終濃度）の導入により、ＣＡＴおよびｍＣＡＴプラスミド内に含まれるｌａｃオペロンによって誘導した。３ミリリットルのそれぞれの培養物をクロラムフェニコールを含む新しいチューブに移し、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０および２５６０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。培養物を２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートし、それぞれの培養物のＡ６００を１時間間隔で測定した。
【００７０】
図１Ａ−１Ｂは、ＣＡＴ（ダイヤモンド形）およびｍＣＡＴ（四角形）の発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞の培養物の増殖曲線を示す。ＩＰＴＧを加えることによりクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現を誘導し、培養物を含む３ミリリットルのＩＰＴＧ（最終濃度０．４ｍＭ）をクロラムフェニコールを含む新しいチューブに加え、０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０、および２５６０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。培養物を２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートし、それぞれの培養物のＡ６００を経時的に測定した。３２０および６４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下で増殖させた培養物に対する結果を示す。Ｘ軸は時間（時）を示し、Ｙ軸は正規化Ａ６００（開始Ａ６００と比較して）を示す。
【００７１】
結果は、ｍＣＡＴ発現構築物で形質転換された細菌が、すべての濃度において、ＣＡＴ発現構築物で形質転換された細菌よりも良い増殖をしたことを示す。図１Ａ−１Ｂにおいて示されるとおり、クロラムフェニコールの高い濃度（３２０および６４０μｇ／ｍｌ）において、修飾されたＣＡＴを有する細胞はまだ増殖したが、野生型ＣＡＴを有する細胞は増殖しなかった。これらの結果は、より機能的なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素がｍＣＡＴ構築物から発現し、したがって、該発現構築物で形質転換された細菌を該抗生物質の存在下でより良く増殖させることを示す。
【００７２】
ＣＡＴおよびｍＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞から合成されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素の相対量を決定するために、ＩＰＴＧによる誘導の５、３０、６０および９０分後にウエスタンブロット分析を細胞抽出物で実施した。それぞれの時点で５０μｌの培養物を遠心し、細菌ペレットを３０μｌのＴＥバッファーおよび１０μｌの４×ＳＤＳゲルローディングバッファーに懸濁した。サンプルを９５℃で３分加熱し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＳＤＳポリアシルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、抗ＣＡＴ抗体で調査した。図２は、ＩＰＴＧ誘導後種々の時点でＣＡＴ（Ｃ）およびｍＣＡＴ（ｍＣＡＴ）発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞由来の溶解物のウエスタンブロット分析である。結果は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質（１９ｋＤａマーカーより大きい）の量が、全ての試験された時点で、ｍＣＡＴ発現構築物（ｍＣ）で形質転換されたＤＨ５α細胞において実質的に増加していることを示した。
【００７３】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＯＲＦの分析も、哺乳動物細胞において実施した。ＣＡＴのＯＲＦおよび部分的に修飾されたＣＡＴのＯＲＦを、ＣＭＶプロモーターを含む哺乳動物の発現構築物にクローンし、チャイニーズハムスター卵巣（ＤＧ４４）細胞への一過性トランスフェクションにより試験した。簡潔には、０．５μｇのそれぞれの発現構築物をβ−ガラクトシダーゼレポータータンパク質（ｐＣＭＶβ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を発現する２０ｎｇのコトランスフェクション コントロールプラスミドと共に、製造業者の指示のしたがってＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を使用して、１００，０００のＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、２５０μｌの溶解バッファーを使用して細胞を溶解した。サンプル間で同様のトランスフェクション効率であることを確認するため、ＬａｃＺレポーターアッセイを実施した。３０μｌの溶解物を１０μｌの４×ＳＤＳゲルローディングバッファーに加えた。サンプルを７２℃で１０分加熱し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＳＤＳポリアシルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、α−ＣＡＴ抗体で調査した。
【００７４】
図３は、野生型（ＣＡＴ）および修飾されたＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の抽出物のウエスタンブロット分析を示す。細胞抽出物を１×ＭＯＰＳ／ＳＤＳ中の１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分別し、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＣＡＴ抗体で調査した。実験は、トランスフェクション効率が同じである細胞由来の抽出物でトリプリケートで実施した。
【００７５】
野生型（ＣＡＴ）を有する３つのトランスフェクションと修飾されたＣＡＴを有する３つのトランスフェクション間の比較を行った。ＣＡＴタンパク質（１９ｋＤａマーカーより大きい）の量は、修飾された構築物でトランスフェクトされた細胞において実質的に増加する。結果は、ＣＡＴタンパク質（１９ｋＤａマーカーより大きい）の量がｍＣＡＴ構築物でトランスフェクトされたＤＧ４４細胞において実質的に増加することを示した。得られるｍＲＮＡ転写産物内の多重翻訳開始部位を除去することによるＣＡＴのＯＲＦの修飾は、この技術が哺乳動物および細菌細胞だけでなく多数の生物体において実用化され得ることを証明した。
【００７６】
分泌タンパク質
該技術の実用性を、また、分泌タンパク質で研究した。哺乳動物の発現構築物を、ヒトＣＤ５分子（ＣＤ５）ｍＲＮＡ内にコードされるシグナルペプチドに対して産生した。転写をＣＭＶプロモーターにより駆動し、ｃｄ５シグナルペプチドをサイログロブリンタンパク質に対する抗体の軽鎖をコードするＯＲＦの５’末端に置いた哺乳動物の発現構築物を産生した（ｃｄ５−１、配列番号：１２３）。ＣＤ５シグナルペプチド配列は、３つのＡＴＧ、１つのＴＴＧおよび３つのＣＴＧコドンを含む７つの可能性のある開始コドンを含む。一連の発現構築物を産生した。１つの変異体において、ｃｄ５シグナルペプチドにおけるＡＴＧコドンを、ＡＴＣコドンに変化させ、メチオニンからイソロイシン置換をもたらした（ｃｄ５−２、配列番号：１２４）。別の変異体において、ｃｄ５シグナルペプチドにおけるＣＴＧコドンをＣＴＣに変化させた（ｃｄ５−３、配列番号：１２５）。別の変異体において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣに変化させた（ｃｄ５−４、配列番号：１２６）。別の変異体において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変化させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させ、開始ＡＵＧのコンテキストをそれのコドン３’をＣＣＣからＧＣＴに変化させて、プロリン（Ｐ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすことにより改良した（ｃｄ５−５、配列番号：１２７）。
【００７７】
次に、これらの構築物を、チャイニーズハムスター卵巣（ＤＧ４４）細胞への一過性トランスフェクションにより試験した。簡潔には、０．５μｇのそれぞれの発現構築物をβ−ガラクトシダーゼレポータータンパク質（ｐＣＭＶβ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を発現する２０ｎｇのコトランスフェクション コントロールプラスミドと共に、製造業者の指示のしたがってＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を使用して、１００，０００のＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、２５０μｌの溶解バッファーを使用して細胞を溶解した。サンプル間で同様のトランスフェクション効率であることを確認するため、ＬａｃＺレポーターアッセイを実施した。３０μｌの上清を１０μｌの４×ＳＤＳゲルローディングバッファーに加えた。サンプルを７２℃で１０分加熱し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＳＤＳポリアシルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、α−カッパ軽鎖抗体で調査した。
【００７８】
図４は、野生型（ｃｄ５−１）および修飾されたｃｄ５シグナルペプチドのα−サイログロブリン軽鎖発現構築物（ｃｄ５−２からｃｄ５−５）で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の上清のウエスタンブロット分析を示す。細胞抽出物を１×ＭＯＰＳ／ＳＤＳ中の１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分別し、ＰＶＤＦ膜に移し、α−カッパ軽鎖抗体で調査した。実験は、トランスフェクション効率が同じである細胞由来の上清で実施した。結果は、細胞の上清中の分泌された抗体軽鎖産物（２８ｋＤａより大きい）のレベルがシグナルペプチドにおいてＣＴＧコドンを欠いている発現構築物（ｃｄ５−３）について実質的に増加していることを示す。ＣＴＧ、ＡＴＧコドンを欠き、およびシグナルペプチドにおける真の開始コドンの周囲の改善された（完全にレスキューされた）ヌクレオチドコンテキストを有する発現構築物も、また、実質的に増加している上清中のタンパク質産物のレベルを有した。
【００７９】
軽鎖シグナルペプチド１を含むＴｈｙ−１可変軽鎖ＯＲＦ（配列番号：１２８）は、真の開始コドンを含む８個のＡＴＧ、１５個のＡＴＣ、６個のＡＣＧ、１４個のＧＴＧ、４個のＴＴＧ、２６個のＣＴＧ、１６個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、３個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む１０４個の可能性のある開始コドンを含む。修飾によってＡＵＧおよびＣＵＧコドンが除去されたシグナルペプチドを作製した（配列番号：１２９）。軽鎖シグナルペプチド２を含むＴｈｙ−１可変軽鎖ＯＲＦ（配列番号：１３０）は、真の開始コドンを含む７個のＡＴＧ、１６個のＡＴＣ、６個のＡＣＧ、１３個のＧＴＧ、４個のＴＴＧ、２７個のＣＴＧ、１５個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、４個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む１０４個の可能性のある開始コドンを含む。重鎖シグナルペプチド１を含むＴｈｙ−１可変重鎖ＯＲＦは、真の開始コドンを含む１８個のＡＴＧ、１４個のＡＴＣ、１８個のＡＣＧ、４２個のＧＴＧ、７個のＴＴＧ、４３個のＣＴＧ、４３個のＡＧＧ、３３個のＡＡＧ、５個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む２２５個の可能性のある開始コドンを含む（配列番号：１３１）。修飾によってＡＵＧおよびＣＵＧコドンが除去されたシグナルペプチドを作製した（配列番号：１３２）。重鎖シグナルペプチド２を含むＴｈｙ−１可変重鎖ＯＲＦは、真の開始コドンを含む１８個のＡＴＧ、１４個のＡＴＣ、１８個のＡＣＧ、４３個のＧＴＧ、９個のＴＴＧ、４１個のＣＴＧ、４３個のＡＧＧ、３３個のＡＡＧ、５個のＡＴＡおよび３個のＡＴＴコドンを含む２２７個の可能性のある開始コドンを含む（配列番号：１３３）。
【００８０】
シグナルペプチドがＣＤ５シグナルペプチドと置き換えられているＴｈｙ−１可変軽鎖ＯＲＦ（配列番号：１３７）は、真の開始コドンを含む８個のＡＴＧ、１５個のＡＴＣ、６個のＡＣＧ、１３個のＧＴＧ、５個のＴＴＧ、２７個のＣＴＧ、１４個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、３個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む１０４個の可能性のある開始コドンを含む。修飾によってＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変化させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらした（配列番号：１３８）。また、修飾によってＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させた（配列番号：１３９）。別の修飾によってＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させた（配列番号：１４０）。別の修飾によってＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変化させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させ、開始ＡＵＧのコンテキストを、それのコドン３’をＣＣＣからＧＣＴに変化させて、プロリン（Ｐ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすことにより改良した（配列番号：１４１）。
【００８１】
他の生物体由来のシグナルペプチドを同様に変異させた（表１参照）。酵母および哺乳動物細胞において機能するシグナルペプチドに対するＤＮＡ配列を分析し、変異させて、変異型を作製した（配列番号：１４５−１５６）。タンパク質の開裂されるシグナルペプチドにおいて、インフレームでＡＴＧコドンを、例えば、別の疎水性アミノ酸であるイソロイシンをコードするＡＴＴまたはＡＴＣへ、変異させることができると理解すべきである。インフレームでヒトモノクローナル抗体由来の軽鎖と融合させたこれらのシグナル配列を含むようにＤＮＡ構築物を産生することができる。異なる生物体における発現時に（例えば、酵母のメタノール資化酵母および哺乳動物細胞株）、タンパク質ゲルおよびウェスタンアッセイをヒト軽鎖抗体の発現レベルを確認するために使用することができる。
表１：酵母および哺乳動物細胞において機能するシグナルペプチドに対するＤＮＡ配列
【表１】
【００８２】
ＨｃＲｅｄ１
ＨｃＲｅｄ１は、励起および発光最大がそれぞれ５５８ｎｍおよび６１８ｎｍ＋／−４ｎｍで起こる遠赤色蛍光タンパク質をコードする。ＨｃＲｅｄ１は、珊瑚礁シライトイソギンチャク(Heteractis crispa)由来の非蛍光色素タンパク質の変異誘発により産生した。次に、ＨｃＲｅｄ１のコード配列を、哺乳動物細胞においてより高い発現のためにヒトコドンを最適化した。このＯＲＦは、真の開始コドンを含む９個のＡＴＧ、８個のＡＴＣ、１２個のＡＣＧ、１６個のＧＴＧ、２１個のＣＴＧ、１８個のＡＧＧ、および１５個のＡＡＧコドンを含む９９個の可能性のある開始コドンを含む（配列番号：１３４）。ＨｃＲｅｄ１のＯＲＦの完全および部分的修飾を行った（それぞれ配列番号：１３５および１３６）。
【００８３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、重要な治療剤である。本明細書に記載されている方法を使用して、ヒトＥＰＯタンパク質（以下で提供され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７９９として利用できる）をコードするｍＲＮＡ配列を、このｍＲＮＡ転写産物内の多重翻訳開始部位を除去するように最適化する。
【００８４】
典型的なヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）タンパク質は以下のｍＲＮＡ転写産物によってコードされており、ここで、成熟ペプチドをコードする配列は下線が引かれており、全３つのリーディングフレーム内の全ての可能性のある翻訳開始出発部位は太字であり、メチオニンに対応する標準開始コドンは大文字であり、ウラシル（ｕ）はチミジン（ｔ）に置き換えられている（配列番号：１１１）：
【化１】
【００８５】
得られたアミノ酸配列を保存するため、可能であれば、サイレント(silent)または保存的置換を行う。それぞれ１つのコドン（ａｕｇ／ａｔｇ）および（ｕｇｇ／ｔｇｇ）のみによりコードされるメチオニンおよびトリプトファンの場合において、置換はメチオニンまたはトリプトファンをコードする配列を同様の物理的特性のアミノ酸をコードする配列で置き換える。保存的アミノ酸置換が行われるとき重要であると考えられる物理的特性は、側鎖形状、サイズ、および分岐、疎水性、極性、酸性度、芳香族性 対 脂肪族構造、ならびにファンデルワールス体積を含むが、これらに限定されない。例えば、これらのアミノ酸がすべて同様の疎水性、非極性であり、同等のファンデルワールス体積を占めるため、アミノ酸ロイシンまたはイソロイシンはメチオニンに対して置換することができる。したがって、メチオニンに対するロイシンまたはイソロイシンの置換は、タンパク質フォールディングに影響しない。ロイシンは、メチオニン置換のための好ましいアミノ酸である。あるいは、これらのアミノ酸がすべて同様の芳香族性であり、同等のファンデルワールス体積を占めるため、アミノ酸チロシンまたはフェニルアラニンはトリプトファンに対して置換することができる。
【００８６】
以下の配列は、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする修飾されたｍＲＮＡ転写産物の１つの例であり、ここで、証明された開始メチオニン（ヌクレオチド１８２−１８４によってコードされる）の上流の全ての可能性のある翻訳開始出発部位、およびコーディング領域内の証明された開始メチオニンの下流の可能性のある翻訳開始出発部位を変異させる（イタリック体は変異）（配列番号：１１３）。
【化２】
【００８７】
エリスロポエチンに対する修飾されていないオープンリーディングフレームは、８８個の可能性のある開始コドン（真の開始コドンを含む８個のＡＴＧ、５個のＡＴＣ、４個のＡＣＧ、７個のＧＴＧ、３個のＴＴＧ、３２個のＣＴＧ、１４個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、３個のＡＴＡ、および２個のＡＴＴコドン）を含む（配列番号：１１２）。修飾によって、多数の可能性のある開始コドンの除去（配列番号：１１６）、シグナルペプチドのＡＴＧおよびＣＴＧの除去（配列番号：２１１）、グルタミン酸（Ｅ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸置換（配列番号：１１８）またはヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換（配列番号：１１９）をもたらすＡＴＧ、ＣＴＧおよびＡＣＧコドンの除去により修飾されたシグナルペプチドを含むように作製することができる。
【００８８】
実施例２：ｍＲＮＡ転写産物内のｍｉＲＮＡ結合部位の修飾
標的ｍＲＮＡ転写産物に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合は、標的ｍＲＮＡ転写産物の分解を誘導するか、または標的ｍＲＮＡ転写産物の翻訳を防止することのいずれかにより翻訳の効率を減少させる。商業的に価値のあるヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の翻訳の効率を改善するために、標的ｍＲＮＡの５’リーダー配列、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、コード配列、および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列内の全て既知または予測ｍｉＲＮＡ結合部位を第１に同定し、第２にｍｉＲＮＡ結合を阻害するために変異または改変させる。
【００８９】
該方法の好ましい局面において、成熟ｍｉＲＮＡ配列の最初の８個の５’ヌクレオチドを含むシード配列を、特異的に標的とする。シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡ配列の５’ヌクレオチド１−７または２−８のいずれかを含む。したがって、シード配列は、該方法の目的のために、両方の選択肢を包含する。ｍｉＲＮＡシード配列は、ワトソン−クリック塩基対合基準にしたがって結合するｍｉＲＮＡの唯一の部分であるため、ｍｉＲＮＡのシード配列は機能的に有意である。ｍｉＲＮＡのシード配列領域内の結合の絶対的な相補性なしに、ｍｉＲＮＡのその標的ｍＲＮＡへの結合は起こらない。しかしながら、大抵のヌクレオチド対とは異なって、ｍｉＲＮＡのシード配列は、Ｇ：Ｕゆらぎとして知られているグアニンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドと対合するように、標的ｍＲＮＡと対合することができる。
【００９０】
例えば、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、十分な量において製造することが困難であった重要な治療剤である。本方法を使用して、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７９９）を、ｍｉＲＮＡ下方制御を阻害するように最適化する。ＰｉｃＴａｒ Ｗｅｂ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（pictar.mdc_berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgiで公に利用できる）によって、ヒトｍｉＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａがヒトＥＰＯをコードするｍＲＮＡを標的とすることを予測した（これらのｍｉＲＮＡの成熟およびシード配列は、以下の表２に提供されている）。したがって、例えば、ｕｇｇａｇｕｇｕのシード配列を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａの場合において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａがもはや結合しないように１つ以上のヌクレオチドを変異し、別の既知のｍｉＲＮＡのシード配列を創造しない。結合を防止する１つの可能性のある変異ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａシード配列は、「ｕａｇａｇｕｇｕ」である。該配列は、例えば、以下の表２内に示されていないため、該変異シード配列が別の既知のｍｉＲＮＡに属することは起こりそうにない。
【００９１】
同様に、ＰｉｃＴａｒ Ｗｅｂ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅによって、ヒトｍｉＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｆ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｇ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｉ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂが、ヒトインターフェロンベータ２（ＩＬ−６としても既知、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００６００）をコードするｍＲＮＡを標的とすることを予測した（これらのｍｉＲＮＡの成熟およびシード配列は以下の表２に提供されている）。
【００９２】
ＭｉＲＮＡ結合部位は、１０００未満の塩基対のあらゆる配列をＳａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｉＲＮＡ：配列データベース（microna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmlで公に利用できる）に挿入することにより同定することができる。
【００９３】
表２：既知のヒトＭｉＲＮＡ、成熟配列およびシード配列
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
【表５】
【００９７】
【表６】
【００９８】
ｍｉＲ−１８３結合配列（配列番号：５９）を変異させ（配列番号：１４２）、例えば、ＦＬＡＧタグも含むＣＡＴ遺伝子におけるレポーター遺伝子のコード配列に組み込んだ（配列番号：１４３）。ｍｉＲ−１８３結合配列が変異されている抗−ＦＬＡＧタグ抗体（配列番号：１４４）を使用するウエスタンブロット分析により、細胞における発現の評価を可能にする。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願への言及
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に、タイトル“Reengineering mRNA Primary Structure for Enhanced Protein Production”の２００９年２月２４日付け米国仮出願番号６１／１５５，０４９の優先権の利益を主張する。上記出願の内容を、出典明示によりその全体を包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
真核生物における翻訳開始は、５’キャップ構造または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）のいずれかでの４０Ｓリボソームサブユニットおよび翻訳機構の他の成分のｍＲＮＡによる動員に関連する。その動員後、４０Ｓサブユニットは開始コドンへ移動する。翻訳開始の広く受け入れられた考えの１つは、４０Ｓサブユニットが、良いヌクレオチドコンテキスト(context)に属する第１のＡＵＧコドンに遭遇するまで、５’から３’方向において５’リーダーを介する走査により動員の部位から開始コドンへ移動すると主張する（Kozak “The Scanning Model for Translation: An Update” J. Cell Biol. 108:229-241 (1989)）。最近、翻訳開始が走査と関連せず、キャップ構造またはＩＲＥＳのいずれかでのリボソームサブユニットのテザーリング(tethering)、または内部部位でのリボソームサブユニットのクラスタリング(clustering)と関連し得るということが主張されている（Chappellら. “Ribosomal shunting mediated by a translational enhancer element that base pairs to 18S rRNA” PNAS USA 103(25):9488-9493 (2006); Chappellら., “Ribosomal tethering and clustering as mechanisms for translation initiation” PNAS USA 103(48):18077-82 (2006)）。４０Ｓサブユニットは、必ずしもｍＲＮＡにおける第１のＡＵＧコドンではない利用可能なＡＵＧコドンへ移動する。該サブユニットが何らかの機構により開始コドンに到達すると、該サブユニットと関連する開始メチオニン−ｔＲＮＡが開始コドンと塩基対合し、大型（６０Ｓ）リボソームサブユニットが結合し、ペプチド合成が始まる。
【０００３】
翻訳は、一般的に、走査機構により開始すると考えられるため、上流ＡＵＧコドンと称される５’リーダー内に含まれるＡＵＧコドンの翻訳に対する効果が考えられており、５’リーダーにおけるＡＵＧコドンは、遺伝子、ヌクレオチドコンテキストおよび細胞状態に依存して、タンパク質合成に対して正または負の効果のいずれかを有し得る。例えば、上流ＡＵＧコドンは、真の開始コドンからリボソームをそらすことにより、翻訳開始を阻害することができることが知られている。しかしながら、翻訳が走査機構により開始するという考えは、タンパク質合成におけるコード配列中の可能性のある開始コドンの効果を考慮していない。対照的に、翻訳開始のテザーリング／クラスタリング機構は、ＡＵＧコドンおよび非標準コドンの両方を含むコード配列中の推定開始コドンを利用し、結果として、リボソームに対する真の開始コドンと競合することにより、タンパク質合成の速度を低下させ得ることを示唆する。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）介在の下方制御は、また、翻訳の効率に負に影響することができる。ｍｉＲＮＡは、一般的に、２１−２３ヌクレオチド長であり、リボヌクレオタンパク質複合体の成分である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに対する塩基対合によりタンパク質レベルに負に影響し、ｍＲＮＡ安定性、新生ペプチド安定性および翻訳の効率を減少させることが示唆されている（Eulalioら. “Getting to the Root of miRNA-Mediated Gene Silencing” Cell 132:9-14 (1998)）。ｍｉＲＮＡは、一般的に、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列（ＵＴＲ）における結合部位に対する塩基対合によってそれらの効果を介在するが、ｍｉＲＮＡは、コード配列および５’リーダー配列内に含まれる結合部位から同様の抑制作用を有することが示されている。塩基対合は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２−８を含む、いわゆる「シード配列(seed sequence)」を介して起こる。ヒトにおいて１，０００以上の異なるｍｉＲＮＡが存在し得る。
【０００５】
ｍＲＮＡコード配列における推定開始コドンおよびｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合部位の負の影響は、医薬産業への挑戦をもたらす。例えば、タンパク質薬物の産業生産、抗原産生のためのＤＮＡワクチン、一般的な研究目的および遺伝子治療適用は、すべて、タンパク質合成の準最適な速度または配列安定性の影響を受ける。タンパク質収率の改善およびより高いタンパク質濃度は、産業規模の培養物と関連するコストを最小限にし、薬物生産コストを減少させ、タンパク質精製を容易にすることができる。乏しいタンパク質発現は、特定の技術の大規模使用を限定し、例えば、フェーズ３臨床試験を実施するための免疫応答を産生するためのＤＮＡワクチンから十分な抗原を発現することにおいて問題がある。
【発明の概要】
【０００６】
要約
当該分野において、タンパク質翻訳の効率および安定性、ならびに、例えば、タンパク質薬物の産業生産におけるタンパク質収量および濃度の改善の必要性がある。
【０００７】
全長タンパク質発現の効率を改善する方法が開示される。該方法は、タンパク質に対するコード配列、コード配列の上流にある第１の開始コドン、およびコード配列内に位置する１つ以上の第２の開始コドンを有するポリヌクレオチドを提供することを含む。該方法は、また、１つ以上の第２の開始コドンを変異し、第１の開始コドンから離れてリボソームダイバージョンの減少をもたらす１つ以上の第２の開始コドンでのタンパク質合成の開始の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させることを含む。
【０００８】
該方法は、また、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該１つ以上の第２の開始コドンは、コード配列と同じリーディングフレーム内またはコード配列のフレーム外にあり得る。該１つ以上の第２の開始コドンは、リボソーム動員部位から１つ以上のヌクレオチドの上流または下流に位置し得る。該リボソーム動員部位は、キャップまたはＩＲＥＳを含み得る。該１つ以上の第２の開始コドンは、ＡＵＧ、ＡＣＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、およびＡＵＵから選択され得る。該方法は、コード配列内の２つ以上の第２の開始コドンを変異させることを含み得る。該方法は、コード配列内のすべての第２の開始コドンを変異させることを含み得る。フランキング(flanking)ヌクレオチドは、望ましくないヌクレオチドコンテキストへ変異させ得る。１つ以上の第２の開始コドンの変異は、新規開始コドンを導入することを回避し得る。該１つ以上の第２の開始コドンの変異は、ｍｉＲＮＡシード配列を導入することを回避し得る。該１つ以上の第２の開始コドンの変異は、変異コドンの利用バイアス(bias)を改変することを回避し得る。全長をコードされたタンパク質以外の短縮タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの産生は減少され得る。該１つ以上の第２の開始コドンの変異は、ｍｉＲＮＡシード配列、スプライスドナー部位もしくはスプライス受容部位、またはｍＲＮＡ不安定化エレメントを導入することを回避し得る。
【０００９】
また、全長タンパク質発現の効率を改善する方法も開示される。該方法は、タンパク質に対するコード配列およびコード配列内に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を有するポリヌクレオチド配列を提供し、該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を変異することを含む。該変異は、タンパク質翻訳のｍｉＲＮＡ介在の下方制御の減少をもたらす１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位でのｍｉＲＮＡ結合の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる。
【００１０】
該方法は、また、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、ｍｉＲＮＡのシード配列中に１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、開始コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、希少コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該方法は、さらなるｍｉＲＮＡシード配列がポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得る。該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、コード配列内に位置することができる。該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、３’非翻訳領域内に位置することができる。該１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、５’リーダー配列内に位置することができる。
【００１１】
本記載の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の以下の部分および特許請求の範囲を参照することにより理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、ＣＡＴ（ダイヤモンド形）またはｍＣＡＴ発現構築物（四角形）で形質転換された大腸菌ＤＨ５α細胞培養物の増殖曲線を示す。
【図２】図２は、ＣＡＴ（Ｃ）またはｍＣＡＴ（ｍＣ）発現構築物で形質転換された大腸菌ＤＨ５α細胞から回収された溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【図３】図３は、野生型ＣＡＴまたは修飾されたＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の抽出物のウエスタンブロット分析を示す。
【図４】図４は、野生型ＣＤ５（ｃｄ５−１）または修飾されたＣＤ５シグナルペプチドα−サイログロブリン軽鎖発現構築物（ｃｄ５−２からｃｄ５−５）で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の上清のウエスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
Ｉ．概観
コードされたタンパク質のレベルを増加させるために、天然ｍＲＮＡを修飾するか、または合成ｍＲＮＡを操作する方法が本明細書に開示される。これらの基準は、１）コード配列におけるＡＵＧまたは非標準開始コドンを介するリボソームダイバージョンを減少させることにより、および／または２）コード配列におけるｍｉＲＮＡ結合部位を除去することによりｍｉＲＮＡ介在の下方制御を回避することにより、タンパク質合成を増強することが意図されるｍＲＮＡコーディングおよび３’ＵＴＲ配列に対する修飾を表す。
【００１４】
真核および細菌細胞において特定のタンパク質の収率を増加させるために使用することができるｍＲＮＡの一次構造の再操作の方法が開示される。本明細書に記載されている該方法は、タンパク質薬物の産業生産、ならびに研究目的、遺伝子治療適用、および抗原産生を増加させるためのＤＮＡワクチンに適用することができる。より良いタンパク質収率は、産業規模の培養物と関連するコストを最小限にし、薬物コストを減少させる。加えて、より高いタンパク質濃度は、タンパク質精製を容易にすることができる。さらに、例えば、フェーズ３臨床試験の実施において、または免疫応答を産生するためのＤＮＡワクチンから十分な抗原を発現することにおいて、乏しいタンパク質発現によって可能でないプロセスは、本明細書に記載されている方法を使用して可能になり得る。
【００１５】
ＩＩ．定義
本明細書は、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは変更してもよい。また、本明細書において使用される用語は、特定の態様を記載するだけの目的のためであり、特許請求の範囲に記載されている本方法の範囲を限定する意図はないことを理解すべきである。
【００１６】
本明細書において使用される単数形「１つ(a、an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに他のものを指示しないかぎり複数の言及を含む。したがって、例えば、「細胞(a cell)」の言及は、複数のこのような細胞を含み、「タンパク質(a protein)」の言及は、１つまたはそれ以上のタンパク質および当業者に知られているその同等語などを含む。
【００１７】
他に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本明細書が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の文献は、当業者に、本明細書において使用される多数の用語の一般的な定義を提供するものである：Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002);およびA Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。本明細書に具体的に適用されるこれらの用語のいくつかのさらなる説明を本明細書において提供する。
【００１８】
「薬剤」なる用語は、あらゆる物質、分子、エレメント、化合物、存在物(entity)またはそれらの組合せを含む。例えば、タンパク質、ポリペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含むがこれらに限定されない。天然産物、合成化合物、もしくは化合物、または２つ以上の物質の組合せであり得る。特記されない限り、「薬剤」、「物質」および「化合物」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００１９】
「シストロン」なる用語は、単一のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡの単位を意味する。「転写単位」なる用語は、ＲＮＡの合成が起こるＤＮＡのセグメントを示す。
【００２０】
「ＤＮＡワクチン」なる用語は、宿主細胞または組織に導入でき、そこで細胞により発現されて、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子を生産し、次に翻訳されて、ＤＮＡによってコードされるワクチン抗原を生産するＤＮＡを示す。
【００２１】
「興味のある遺伝子」なる言葉は、生産が調節されるべきタンパク質産物（興味のあるタンパク質）をコードするシストロン、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはポリヌクレオチド配列を含むことを意図する。興味のある遺伝子の例は、治療タンパク質、栄養タンパク質および産業的に有用なタンパク質をコードする遺伝子を含む。興味のある遺伝子は、また、レポーター遺伝子または選択可能なマーカー遺伝子、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＲｅｎｉｌｌａまたはＰｈｏｔｉｎｕｓ）を含むことができる。
【００２２】
発現は、ポリペプチドがＤＮＡから生産されるプロセスである。該プロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写および後のｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。
【００２３】
本明細書において使用される「内因性」なる用語は、通常、野生型宿主において見出される遺伝子を示し、「外因性」なる用語は、通常、野生型宿主において見出されない遺伝子を示す。
【００２４】
「宿主細胞」は、異種ポリヌクレオチド配列が導入されるか、または導入されている生細胞を示す。生細胞は、培養細胞および生体内の細胞の両方を含む。異種ポリヌクレオチド配列を細胞に導入するための手段は、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、形質転換、ウイルス感染など、よく知られている。しばしば、細胞に導入される異種ポリヌクレオチド配列は、複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターである。いくつかの態様において、宿主細胞は、染色体上またはゲノム中に所望の遺伝子を組み込むように操作することができる。宿主として働く、本願の方法に実施において使用することができる多数の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、当該分野でよく知られている。例えば、Sambrookら., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)、およびBrentら., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)参照。いくつかの態様において、宿主細胞は真核細胞である。
【００２５】
「誘導剤」なる用語は、誘導可能な翻訳調節エレメントから翻訳をもたらす化学的、生物学的または物理学的薬剤を示すために使用される。誘導剤への暴露に対する応答において、エレメントからの翻訳は、一般的に、新たに開始されるか、または発現の基底または構成レベルよりも増加する。誘導剤は、例えば、細胞が暴露されるストレス条件、例えば、熱または低温ショック、毒物、例えば、重金属イオン、または栄養、ホルモン、成長因子の欠乏などであってよく、また細胞の増殖または分化状態に影響する化合物、例えば、ホルモンまたは増殖因子であってよい。
【００２６】
「単離または精製されたポリヌクレオチド」なる句は、生物体の天然ゲノム中の両端の隣接配列から単離されているポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）の断片を含むことを意図する。精製されたポリヌクレオチドは、二本鎖もしくは一本鎖のいずれかであるオリゴヌクレオチド；ベクターに組み込まれたポリヌクレオチドフラグメント；真核または原核生物生物体のゲノムに挿入されたフラグメント；またはプローブとして使用されるフラグメントであり得る。「実質的に純粋」なる句は、ポリヌクレオチドに言及されているとき、一般的に、サンプルの少なくとも８５パーセントまたはそれ以上のパーセントを有するように、分子が他の付随の生物学的成分から分離されていることを意味する。
【００２７】
「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸」または「ポリヌクレオチド配列」なる用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを示し、他に限定のない限り、天然ヌクレオチドと同様の様式で拡散にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。核酸配列は、例えば、原核生物配列、真核ｍＲＮＡ配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ配列、真核ＤＮＡ（例えば、哺乳動物ＤＮＡ）由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得るが、これらに限定されない。
【００２８】
「プロモーター」なる用語は、転写が開始する位置で転写を指向することができる核酸配列を示す。種々のプロモーター配列が当該分野で知られている。例えば、このようなエレメントは、ＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター（例えば、Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３プロモーター）、ＳＰ１部位、および環状ＡＭＰ応答エレメントを含み得るが、これらに限定されない。プロモーターが誘導可能な方であるとき、その活性は誘導剤に応答して増加する。
【００２９】
５’リーダーまたは非翻訳領域（５’リーダー、５’リーダー配列、または５’ＵＴＲ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびそれをコードするＤＮＡの特殊な部分である。それは＋１位（転写が始まる位置）で始まり、コーディング領域の開始コドン（一般的にＡＵＧ）の直前で終わる。細菌において、それは、シャイン−ダルガノ(Shine-Delgarno)配列として知られているリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含み得る。５’リーダー配列は、ヌクレオチドなし（まれにリーダーレスメッセージ(leaderless message)）から＞１，０００−ヌクレオチドまでの長さの範囲である。３’ＵＴＲは、さらに長い傾向がある（最大数キロベース長）。
【００３０】
「作動可能に連結」または「作動可能に結合」なる用語は、通常の機能が行えることが可能である様式下で連結されている遺伝子エレメント間の機能的連結を示す。例えば、転写がプロモーターの制御下にあり、生産された転写産物が通常遺伝子によってコードされるタンパク質に正確に翻訳されるとき、遺伝子はプロモーターに作動可能に連結している。同様に、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を上方調節することを可能にするとき、翻訳エンハンサーエレメントは興味のある遺伝子と作動可能に結合している。
【００３１】
指向性ライゲーションに適応させたヌクレオチドの配列、例えば、ポリリンカーは、ベクターへのポリヌクレオチド配列の指向性ライゲーションのための部位または手段を提供する発現ベクターの領域である。一般的に、指向性ポリリンカーは、２つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列、または制限酵素認識部位を規定するヌクレオチドの配列である。制限開裂時に、２つの部位は、ポリヌクレオチド配列が発現ベクターにライゲートすることができる付着末端を生じる。１つの態様において、２つの制限酵素認識部位は、制限開裂時に、非相補的である付着末端を提供し、それによりポリヌクレオチド配列のカセットへの指向挿入を可能にする。例えば、指向性ライゲーションに適応させたヌクレオチドの配列は、多数の指向性クローニング手段を規定するヌクレオチドの配列を含み得る。指向性ライゲーションに適応させたヌクレオチドの配列が多数の制限酵素認識部位を規定する場合、マルチクローニングサイトと称される。
【００３２】
処置の目的に対する「対象」なる用語は、哺乳動物、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物として分類されるあらゆる動物を示す。非ヒト動物の例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。注記されているときを除き、「患者」または「対象」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。１つの態様において、対象はヒトである。
【００３３】
転写因子は、転写を開始または調節するために必要であるあらゆるポリペプチドを示す。例えば、このような因子は、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、ｃＥｔｓ、ＧＡＴＡ、ＧＡＬ４、ＧＡＬ４／Ｖｐ１６、ｃ−Ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、ＮＦ−κＢ、バクテリオファージ−特異的ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｆ−１、およびＴＲＥを含むがこれらに限定されない。このような因子をコードする配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０２２７６（ｃ−Ｍｙｃ）、Ｋ００６５０（ｃ−ｆｏｓ）、ＢＣ００２９８１（ｃ−ｊｕｎ）、Ｍ２７６９１（ＣＲＥＢ）、Ｘ１４７９８（ｃＥｔｓ）、Ｍ７７８１０（ＧＡＴＡ）、Ｋ０１４８６（ＧＡＬ４）、ＡＹ１３６６３２（ＧＡＬ４／Ｖｐ１６）、Ｍ９５５８４（ｃ−Ｍｙｂ）、Ｍ８４９１８（ＭｙｏＤ）、２００６２９３Ａ（ＮＦ−κＢ）、ＮＰ８５３５６８（ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、ＡＡＢ２８１１１（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、ＮＰ５２３３０１（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ）、ＡＦ３６４６０４（ＨＩＦ−１）、およびＸ６３５４７（ＴＲＥ）を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
「実質的に同一」な核酸またはアミノ酸配列は、標準パラメーターを使用して、本明細書に記載されているよく知られているプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）により測定されるとき、参照配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸またはアミノ酸配列を示す。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であり得る。いくつかの態様において、対象配列は参照配列と比較してほぼ同じ長さであり、すなわち、ほぼ同じ数の隣接するアミノ酸残基（ポリペプチド配列に対する）またはヌクレオチド残基（ポリヌクレオチド配列に対する）からなる。
【００３５】
配列同一性は、当該分野で知られている種々の方法で容易に決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）。配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにおいて２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントに対して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がある位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の合計数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００３６】
「処置」または「緩和」なる用語は、化合物または薬剤を対象に投与して、疾患の症状、合併症もしくは生化学的兆候（例えば、心機能障害）の発症を予防または遅延する、症状または疾患を緩和する、状態または障害のさらなる発症を阻止または阻害することを含む。処置を必要とする対象は、疾患または障害にすでに罹患している患者、ならびに障害を有しやすいもの、または障害を予防すべきものを含む。
【００３７】
処置は、予防（疾患の発症を予防または遅延すること、または臨床的もしくは無症状の兆候を予防すること）または疾患の兆候後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。心臓リモデリングおよび／または心不全の処置において、治療剤は、疾患の病状を直接減少させ得るか、疾患を他の治療剤による処置に対してより感受性にさせ得る。
【００３８】
「ベクター」または「構築物」なる用語は、これらのエレメントに作動可能に連結した遺伝子／遺伝子産物の発現が予想通りに制御することができるように明確なパターンの構成に配置されたポリヌクレオチド配列エレメントを示す。一般的に、それらは、外来ＤＮＡのセグメントをスプライスすることによって、外来ＤＮＡを宿主細胞に導入し、複製および／または転写を促進することができる伝播性ポリヌクレオチド配列（例えば、プラスミドまたはウイルス）である。
【００３９】
クローニングベクターは、宿主細胞中で自己複製することができ、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられるＤＮＡ配列（一般的にプラスミドまたはファージ）である。これらの部位に外来ＤＮＡフラグメントがベクターにスプライスされることによって、フラグメントの複製およびクローニングを引き起こし得る。ベクターは、形質転換細胞の同定における使用のために適当な１つ以上のマーカーを含み得る。例えば、マーカーはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供し得る。
【００４０】
発現ベクターはクローニングベクターと同様であるが、宿主への形質転換後に、クローニングされたＤＮＡの発現を誘導することができる。クローニングされたＤＮＡは、通常、特定の調節配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサーの制御下に置かれる（すなわち、作動可能に連結する）。プロモーター配列は、構成的、誘導可能または抑圧可能であり得る。
【００４１】
「開始コドン」または「開始トリプレット」は、タンパク質合成が開始するシストロン内の位置である。それは、一般的に、コード配列の５’末端に位置する。真核ｍＲＮＡにおいて、開始コドンは、一般的に、アミノ酸メチオニン（Ｍｅｔ）をコードする３つのヌクレオチド（アデニン、ウラシルおよびグアニン（ＡＵＧ）ヌクレオチド）からなる。細菌において、開始コドンは、また、一般的にＡＵＧであるが、このコドンは、修飾されたメチオニン（Ｎ−ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ））をコードする。ＡＵＧ以外のヌクレオチドトリプレットは、ときどき、真核生物および細菌の両方において、開始コドンとして使用される。
【００４２】
「下流開始コドン」は、一般的に遺伝子のコーディング領域における真の開始コドンの下流に位置する開始コドンを示す。「上流開始コドン」は、５’リーダー領域における真の開始コドンの上流に位置する開始コドンを示す。
【００４３】
本明細書において使用される、「下流」および「上流」なる言及は、真の開始コドンに対する位置を示す。例えば、ｍＲＮＡ配列上の上流コドンは、配列（例えば、真の開始コドン）内の別の位置と比較してｍＲＮＡ配列の５’末端の方にあるコドンであり、下流コドンは、配列内の別の位置と比較してｍＲＮＡ配列の３’末端の方にあるコドンを示す。
【００４４】
本明細書において使用される「真の開始コドン」または「第１の開始コドン」は、生産が調節されるべき興味のあるコードされたタンパク質のコード配列の第１のアミノ酸をコードするシストロンの開始コドンを示す。「第２の開始コドン」は、興味のあるコードされたタンパク質に対する第１の、もしくは真の開始コドン以外にある開始コドンを示す。第２の開始コドンは、一般的に、コード配列内に位置する第１の、もしくは真の開始コドンの下流である。
【００４５】
本明細書において使用される「タンパク質発現の増加」は、１つ以上の第２の開始コドンが変異されていない野生型ｍＲＮＡから得られたポリペプチド濃度より少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上大きいポリペプチド濃度を産生するように１つ以上の第２の開始コドンが変異された、修飾されたｍＲＮＡの翻訳を示す。タンパク質発現の増加は、また、野生型ｍＲＮＡの１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍またはそれ以上である変異されたｍＲＮＡのタンパク質発現を示し得る。
【００４６】
本明細書において使用される「リボソーム動員部位」は、コードされたタンパク質の翻訳の開始前にリボソームサブユニットが結合するｍＲＮＡ内の部位を示す。リボソーム動員部位は、キャップ構造、ｍＲＮＡの５’末端で見出される修飾されたヌクレオチド（ｍ７Ｇキャップ−構造）、およびｍＲＮＡ内に包含される内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と称される配列を含み得る。他のリボソーム動員部位は、ＧｔｘホメオドメインｍＲＮＡからの９−ヌクレオチド配列を含み得る。リボソーム動員部位は、しばしば、真の開始コドンの上流にあるが、また、真の開始コドンの下流にあることもできる。
【００４７】
本明細書において使用される「利用バイアス」は、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの１つに対して生体が示す特定の好み(preferance)を示す。利用バイアスの改変は、元のコドンよりもより高いまたはより低い好みで同じアミノ酸に対する異なるコドンの使用をもたらす変異を示す。
【００４８】
本明細書において使用される「全長タンパク質」は、本質的にタンパク質をコードする遺伝子によってコードされるあらゆるアミノ酸を包含するタンパク質を示す。当業者は、生細胞におけるいくつかのタンパク質は微妙な修飾が存在するので、タンパク質は実際には、わずかな改変を有する密接に関連したタンパク質の一群であることを知っている。例えば、全てではないがいくつかのタンパク質は、ａ）アミノ末端からアミノ酸が除去されており、および／またはｂ）分子量を増加し得る化学基が付加されている。コードされる大抵の細菌のタンパク質は、タンパク質のアミノ末端でメチオニンおよびアラニン残基を含み、これらの残基の１つまたは両方は、頻繁に、細菌細胞におけるタンパク質の活性型から除去される。修飾のこれらの型は、一般的に、異種であるので、全ての修飾があらゆる分子に起こるわけではない。したがって、天然「全長」分子は、実際には、同じアミノ酸配列から出発するが、修飾され方に小さい差異を有する分子のファミリーである。「全長タンパク質」なる用語は、このような分子のファミリーを包含する。
【００４９】
本明細書において使用される「レスキュー(rescued)」または「修飾」は、コーディング領域から多数からすべての第２の開始コドンを除去するヌクレオチド改変を示す。「部分的に修飾」は、コーディング領域から第２の開始コドンのすべての可能な変異の一部を除去するヌクレオチド改変を示す。
【００５０】
ＩＩＩ．下流開始コドンを介するリボソームダイバージョンの減少
上記のとおり、５’リーダー内に含まれる特徴が翻訳の効率に影響し得ることがよく知られている。例えば、上流ＡＵＧコドンと称される５’リーダーにおけるＡＵＧコドンは、遺伝子、ヌクレオチドコンテキストおよび細胞状態に依存して、タンパク質合成において正または負の効果のいずれかを有し得る。上流ＡＵＧコドンは、真の開始コドンからリボソームをそらすことにより翻訳開始を阻害することができる（Meijerら., “Translational Control of the Xenopus laevis Connexin-41 5’-Untranslated Region by Three Upstream Open Reading Frames” J. Biol. Chem. 275(40):30787-30793 (2000)）。例えば、Ｍｅｉｊｅｒらの図６および８は、５’リーダー配列における上流ＡＵＧコドンのリボソームダイバージョン(ribosomal diversion)効果を示す。
【００５１】
ＡＵＧ／ＡＴＧは、多数の種における通常の翻訳開始コドンであるが、翻訳がときどきインビボでＡＣＧ、ＧＵＧ／ＧＴＧ、ＵＵＧ／ＴＴＧ、ＣＵＧ／ＣＴＧ、ＡＵＡ／ＡＴＡ、ＡＵＣ／ＡＴＣおよびＡＵＵ／ＡＴＴを含む他の上流コドンで開始し得ることも知られている。例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）の開始コドンがＡＣＧに変異されたとき、哺乳動物のリボソームが非ＡＵＧトリプレットで翻訳を開始できることが示されている（Peabody, D.S. (1987) J. Biol. Chem. 262, 11847-11851）。Ｐｅａｂｏｄｙによるさらなる研究は、ｄｈｆｒの変異開始コドンＡＵＧ（ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣおよびＡＵＵ）のすべてが一見したところ正常ｄｈｆｒの合成を指向することできたことを示した（Peabody, D. S. (1989) J. Biol. Chem. 264, 5031-5035）。
【００５２】
翻訳開始のテザーリングおよびクラスタリングモデルは、翻訳が利用可能な開始コドンで開始できることを前提とし、研究は、開始コドンがリボソーム動員部位（ｃａｐまたはＩＲＥＳ）の下流において距離依存性様式で使用されることができることを示した（Ｃｈａｐｐｅｌｌら“Ribosomal tethering and clustering as mechanisms for translation initiation” PNAS USA 103(48):18077-82 2006）。これは、コード配列における推定開始コドンも、利用され得ることを示唆する。下流開始コドンまたは第２の開始部位での翻訳開始は、リボソームについて真の開始コドンまたは第１の開始部位と競合し、コードされたタンパク質の発現を低下させることができる。例えば、第２の開始部位を非開始コドンへ変異することによる、これらの第２の開始部位の有用性の減少は、リボソームに対する第１の開始部位の有用性およびさらに効率的なコードされたタンパク質発現を増加させる。
【００５３】
本方法は、改善され、さらに効率的なタンパク質発現を可能にし、翻訳機構に関する種々の開始コドン間の競合を減少させる。コードされたタンパク質と同じリーディングフレーム内にあるコード配列における下流開始コドンを除去することにより、可能性のある改変された機能を有する短縮タンパク質の産生は除去され得る。加えて、コード配列のフレーム外にある下流開始コドンを除去することにより、いくつかにおいて細胞生理学またはタンパク質生産において負の効果を有し得る種々のペプチドの産生も、また、除去され得る。この利点は、ＤＮＡワクチンまたは遺伝子治療における適用において特に重要であり得る。
【００５４】
コードされたアミノ酸配列が改変されないように下流開始コドンの特異的変異を実施することができる。これは、遺伝子コードが縮重しており、ほとんどのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるため、多数の場合において可能である。例外は、それぞれＡＵＧおよびＵＧＧの１つのコドンによってコードされるメチオニンおよびトリプトファンのみである。また、アミノ酸配列を改変する下流開始コドンの変異もまた、考えることができる。このような場合において、アミノ酸配列を改変する効果を評価し得る。あるいは、アミノ酸配列が改変されないままであるとき、推定開始コドンに隣接するヌクレオチドを、ときどき、開始コドンの効率を減少させるように変異させることができる。ＡＵＧコドンにおいて、これは、優れたコンテキストにおけるＡＵＧが、ＡＵＧが＋１、＋２、＋３と番号付けされるとき、位置−３にプリンおよび＋４にＧを含むことが記載されているＭａｒｉｌｙｎ Ｋｏｚａｋにより確立されたヌクレオチドコンテキスト基準（Kozak, M. (1984) Nature 308, 241-246）にしたがって行うことができる。
【００５５】
非ＡＵＧコドンにおいて、同様の基準が、位置＋５および＋６にヌクレオチド由来のさらなる決定因子で適用できるようである。変異を設計することにおいて、コドン利用バイアスは、多数の場合において、例えば、野生型コドンと同様のコドンバイアスを有する変異コドンを導入することにより、比較的改変されないままであることができる。異なる生物体は異なるコドン利用頻度を有するため、異なる生物体由来の細胞における発現に対する特異的変異は、それに応じて変化し得る。
【００５６】
本明細書に記載されている方法は、真核細胞に限定されず、細菌にも適用すると理解すべきである。細菌の翻訳開始は真核生物と異なると思われるが、リボソーム動員は、依然として、いわゆるシャイン−ダルガノ配列を含むｍＲＮＡにおけるｃｉｓ−エレメントを介して起こる。細菌における非ＡＵＧ開始コドンは、ＡＣＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、およびＡＵＵを含む。
【００５７】
１つの態様において、下流開始コドンを介してリボソームダイバージョンを減少させることにより、タンパク質合成を増強するコード配列への修飾が開示されている。これらのコドンは、ＡＵＧ／ＡＴＧおよび細胞において開始コドンとして機能することが知られている他のヌクレオチドトリプレットコドンを含むことができ、ＡＣＧ、ＧＵＧ／ＧＴＧ、ＵＵＧ／ＴＴＧ、ＣＵＧ／ＣＴＧ、ＡＵＡ／ＡＴＡ、ＡＵＣ／ＡＴＣ、およびＡＵＵ／ＡＴＴを含むが、これらに限定されない。１つの態様において、下流開始コドンを変異する。タンパク質生産を増加させるためのｍＲＮＡコード配列の再操作は、すべての下流開始コドンの変異を含むことができ、または、下流開始コドンの一部のみの変異を含むことができる。別の態様において、フランキングヌクレオチドを望ましくないヌクレオチドコンテキストに変異する。１つの態様において、シグナルペプチドにおけるＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異して、メチオニンからイソロイシンへの置換をもたらすことができる。別の態様において、シグナルペプチドにおけるＣＴＧコドンをＣＴＣに変異することができる。別の態様において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異して、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらすことができ、ＣＴＧコドンをＣＴＣに変異することができる。別の態様において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異することができ、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変異することができ、開始ＡＵＧのコンテキストを開始コドンのコドン３’をＣＣＣからＧＣＴへ変化させて、プロリン（Ｐ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすことにより、改善することができる。他の態様において、１つ以上のＡＵＧおよびＣＵＧコドンを除去することができる修飾をシグナルペプチドに施すことができる。ほとんどの可能性のある開始コドンの除去、シグナルペプチドのＡＴＧおよびＣＴＧの除去、グルタミン酸（Ｅ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸置換またはヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすＡＴＧ、ＣＴＧおよびＡＣＧコドンの除去により修飾されたシグナルペプチドを含む修飾を施すことができる。
【００５８】
分子生物学における標準技術を、変異された核酸配列を産生するために使用することができる。このような技術は、種々の核酸操作技術、核酸転移プロトコール、核酸増幅プロトコールおよび当該分野で知られている他の分子生物学技術を含む。例えば、点変異は、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘発の使用を介して、興味のある遺伝子に導入することができる。修飾された配列は、また、所望の変異と共に合成されたオリゴヌクレオチドを使用することにより合成的に産生することができる。これらのアプローチは、１つの部位またはコーディング領域中に変異を導入するために使用することができる。あるいは、相同組換えを、興味のある標的配列に変異または外因性配列を導入するために使用することができる。核酸転移プロトコールは、塩化カルシウムの形質転換／トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム介在核酸転移、Ｎ−［１−（２，３−ジオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート介在形質転換などを含む。別の変異誘発プロトコールにおいて、特定の遺伝子における点変異を、また、陽性選択圧を使用するために選択することができる。例えば、Current Techniques in Molecular Biology（Ed. Ausubelら）参照。核酸増幅プロトコールは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない。核酸ツール、例えば、プラスミド、ベクター、プロモーターおよび他の制御配列の使用は、多種多様のウイルスまたは細胞生物体に対して当該分野でよく知られている。さらなる多種多様の核酸ツールは、ＡＴＣＣを含む多種多様の供給源、および種々の市販の供給源から利用できる。当業者は、容易に、当該分野の技術常識にしたがってあらゆる特定のウイルスまたは細胞生物体の遺伝子修飾のための適当なツールおよび方法を選択し、選択したものから設計することができる。タンパク質発現は、また、種々の標準方法を使用して測定することができる。これらは、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、代謝標識、および酵素活性測定を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
ＩＶ．ｍｉＲＮＡ介在の下方制御の回避
マイクロＲＮＡは、一般的に負の遺伝子調節因子として機能する小さい非コーディングＲＮＡの豊富なクラスである。１つの態様において、ｍｉＲＮＡ介在の下方制御を回避するように、５’リーダー、コード配列、および３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ配列に対して修飾を施すことができる。このような修飾は、それにより、ｍＲＮＡまたは新生ペプチドの安定性を改変し、タンパク質合成および翻訳の効率を増強することができる。
【００６０】
ｍｉＲＮＡは、一般的に、リボヌクレオタンパク質複合体の成分である２１−２３ヌクレオチドのＲＮＡであり得る。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに対する塩基対合によりｍＲＮＡの安定性またはタンパク質合成に影響を及ぼすことができる。ｍｉＲＮＡは、一般的に、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける結合部位に対する塩基対合によってそれらの効果を介在する。しかしながら、ｍｉＲＮＡは、コード配列および５’リーダー配列内に含まれる結合部位から同様の抑制作用を有することが示されている。塩基対合は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２−８からなる、いわゆる「シード配列」を介して起こる。ヒトにおいて１，０００以上の異なるｍｉＲＮＡが存在し得る。
【００６１】
ｍｉＲＮＡ介在抑制を回避するためのｍＲＮＡの再操作は、ｍＲＮＡ内のすべてのシード配列を変異することを含むことができる。上記の開始コドン変異のとおり、これらの変異は、コードされたアミノ酸配列が改変されないままであることを確実にし、開始コドン、希少コドン、または他のｍｉＲＮＡシード配列を導入しないように作用することができる。
【００６２】
コンピュータープログラムは、興味のある細胞型、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞における発現のための齧歯動物細胞、またはヒト細胞系における発現もしくはＤＮＡワクチンにおける適用のためのヒト細胞にしたがって、ｍＲＮＡ配列を再操作するために使用することができる。このプログラムは、開始コドン以外の、可能性のある開始コドンを除去するようにｍＲＮＡを再コードすることができる。コード配列におけるインフレームのＡＵＧコドンの場合において、これらの下流開始コドンのコンテキストは、可能ならば弱めることができる。変異は、興味のある細胞系に対するコドンバイアスにしたがって実施することができ、例えば、ヒトコドンバイアス情報はヒト細胞系のために使用することができ、出芽酵母コドンバイアス情報は該酵母のために使用することができ、大腸菌コドンバイアス情報は該細菌のために使用することができる。より高等な真核ｍＲＮＡにおいて、次に、再コードされたｍＲＮＡは、興味のある生物体におけるすべての既知のシード配列、例えば、ヒト細胞系に対するヒトシード配列について探索することができる。シード配列を、１）アミノ酸配列を破壊することなく、２）変異コドンの利用バイアスを劇的に改変することなく、３）新規推定開始コドンを導入することなく、変異させることができる。
【００６３】
本明細書は多数の特定の記載を含み、それらの好ましい態様に対する言及が記載されているが、これらは、特許請求される方法または特許請求され得ることの範囲に限定すると解釈すべきでなく、むしろ特定の態様に特異的である特徴の記載と解釈すべきである。形式における種々の変化および詳細は、記載されている対象の意味から逸脱することなく行われ得ることは、当業者により理解される。別々の態様の文脈において本明細書に記載されている特定の特徴は、また、単一の態様における組合せにより実行され得る。逆に、単一の態様の文脈において記載されている種々の特徴は、また、別々に、または任意の適当な副組合せ(sub-combination)において複数の態様により実行され得る。さらに、特徴は特定の組合せにおける作用として上記されており、それ自体、特許請求されているが、特許請求される組合せからの１つまたはそれ以上の特徴は、いくつかの場合において組合せから排除され得、特許請求される組合せは、副組合せまたは副組合せの変異体であり得る。対象の範囲は特許請求の範囲により定義される。
【００６４】
本明細書において引用されている全ての文献、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は、それぞれが、出典明示により包含させるために具体的に、および個々に示されているとき、出典明示により本明細書に包含させる。
【実施例】
【００６５】
実施例
以下の実施例はさらなる説明を提供するが、その範囲に限定されない。他の変異体が当業者には容易に明らかであり、特許請求の範囲に包含される。
【００６６】
実施例１：ｍＲＮＡ転写産物内の多重翻訳開始部位の修飾
ｍＲＮＡ転写産物の５’−ＵＴＲおよびコーディング領域内の多重翻訳開始部位の存在は、例えば、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンからリボソームをそらすことにより、翻訳の効率を減少させる。あるいは、または加えて、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンの下流の多重翻訳開始部位の存在は、全長タンパク質の翻訳の効率を減少させる１つ以上のタンパク質アイソフォームの翻訳の開始を誘導する。商業的に価値のあるヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の翻訳の効率を改善するために、真の、もしくは証明された翻訳開始コドンの上流および下流のすべてのリーディングフレーム内の可能性のある翻訳開始部位を、これらの部位を除去するように変異させる。この方法の好ましい局面において、ｍＲＮＡ配列を改変するが、コードされる得られるアミノ酸は同じままである。あるいは、同様の物理的特性を有するアミノ酸を置換する保存的変化を誘導する。
【００６７】
標準翻訳開始コドンはＡＵＧ／ＡＴＧである。他の同定された開始コドンは、ＡＣＧ、ＧＵＧ／ＧＴＧ、ＵＵＧ／ＴＴＧ、ＣＵＧ／ＣＴＧ、ＡＵＡ／ＡＴＡ、ＡＵＣ／ＡＴＣおよびＡＵＵ／ＡＴＴを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
細胞内タンパク質：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
クロラムフェニコールは、５０Ｓリボソームサブユニットに結合し、ペプチド結合形成を防止することにより、細菌タンパク質合成を妨げる抗生物質である。耐性遺伝子（ｃａｔ）は、該抗生物質をその２つのヒドロキシル基の１つまたは両方でアセチル化することにより、該薬物をアセチル化し、不活性化させるアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする。ＣＡＴの修飾されていないオープンリーディングフレームは、１１３個の可能性のある開始コドン（真の開始コドンを含む２０個のＡＴＧ、８個のＡＴＣ、８個のＡＣＧ、１２個のＧＴＧ、８個のＴＴＧ、１１個のＣＴＧ、６個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、１６個のＡＴＡおよび１４個のＡＴＴコドン）を含む（配列番号：１２０）。配列番号：１２１は、完全に修飾されたＣＡＴのＯＲＦであり、配列番号：１２２は、可能性のある修飾の一部だけを施した部分的に修飾されたＣＡＴのＯＲＦである。
【００６９】
図１Ａ−１Ｂは、ＣＡＴシストロン（ＣＡＴ）および部分的に修飾されたＣＡＴシストロン（ｍＣＡＴ）を含む細菌発現構築物を産生し、大腸菌細菌株ＤＨ５αにおいて試験したことを示す。ＤＨ５α細胞を、ＣＡＴおよびｍＣＡＴ発現構築物で形質転換し、ＬＢ／アンピシリンプレート上に置いた。培養物を単一のコロニーから得、培養物のＡ６００を測定することにより決定されるとき対数増殖が達成されるまで、ＬＢ／アンピシリン（〜５０μｇ／ｍｌ）中で３７℃で２２０ｒｐｍで振とうしながら培養した。次に、培養物を比較できるＡ６００にＬＢ／アンピシリンで希釈した。ＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞由来の培養物のＡ６００は０．３であったが、ｍＣＡＴ発現構築物で形質転換された細胞由来のものは０．２５であった。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．４ｍＭの最終濃度）の導入により、ＣＡＴおよびｍＣＡＴプラスミド内に含まれるｌａｃオペロンによって誘導した。３ミリリットルのそれぞれの培養物をクロラムフェニコールを含む新しいチューブに移し、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０および２５６０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。培養物を２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートし、それぞれの培養物のＡ６００を１時間間隔で測定した。
【００７０】
図１Ａ−１Ｂは、ＣＡＴ（ダイヤモンド形）およびｍＣＡＴ（四角形）の発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞の培養物の増殖曲線を示す。ＩＰＴＧを加えることによりクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現を誘導し、培養物を含む３ミリリットルのＩＰＴＧ（最終濃度０．４ｍＭ）をクロラムフェニコールを含む新しいチューブに加え、０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０、および２５６０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。培養物を２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートし、それぞれの培養物のＡ６００を経時的に測定した。３２０および６４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下で増殖させた培養物に対する結果を示す。Ｘ軸は時間（時）を示し、Ｙ軸は正規化Ａ６００（開始Ａ６００と比較して）を示す。
【００７１】
結果は、ｍＣＡＴ発現構築物で形質転換された細菌が、すべての濃度において、ＣＡＴ発現構築物で形質転換された細菌よりも良い増殖をしたことを示す。図１Ａ−１Ｂにおいて示されるとおり、クロラムフェニコールの高い濃度（３２０および６４０μｇ／ｍｌ）において、修飾されたＣＡＴを有する細胞はまだ増殖したが、野生型ＣＡＴを有する細胞は増殖しなかった。これらの結果は、より機能的なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素がｍＣＡＴ構築物から発現し、したがって、該発現構築物で形質転換された細菌を該抗生物質の存在下でより良く増殖させることを示す。
【００７２】
ＣＡＴおよびｍＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞から合成されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素の相対量を決定するために、ＩＰＴＧによる誘導の５、３０、６０および９０分後にウエスタンブロット分析を細胞抽出物で実施した。それぞれの時点で５０μｌの培養物を遠心し、細菌ペレットを３０μｌのＴＥバッファーおよび１０μｌの４×ＳＤＳゲルローディングバッファーに懸濁した。サンプルを９５℃で３分加熱し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＳＤＳポリアシルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、抗ＣＡＴ抗体で調査した。図２は、ＩＰＴＧ誘導後種々の時点でＣＡＴ（Ｃ）およびｍＣＡＴ（ｍＣＡＴ）発現構築物で形質転換されたＤＨ５α細胞由来の溶解物のウエスタンブロット分析である。結果は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質（１９ｋＤａマーカーより大きい）の量が、全ての試験された時点で、ｍＣＡＴ発現構築物（ｍＣ）で形質転換されたＤＨ５α細胞において実質的に増加していることを示した。
【００７３】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＯＲＦの分析も、哺乳動物細胞において実施した。ＣＡＴのＯＲＦおよび部分的に修飾されたＣＡＴのＯＲＦを、ＣＭＶプロモーターを含む哺乳動物の発現構築物にクローンし、チャイニーズハムスター卵巣（ＤＧ４４）細胞への一過性トランスフェクションにより試験した。簡潔には、０．５μｇのそれぞれの発現構築物をβ−ガラクトシダーゼレポータータンパク質（ｐＣＭＶβ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を発現する２０ｎｇのコトランスフェクション コントロールプラスミドと共に、製造業者の指示のしたがってＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を使用して、１００，０００のＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、２５０μｌの溶解バッファーを使用して細胞を溶解した。サンプル間で同様のトランスフェクション効率であることを確認するため、ＬａｃＺレポーターアッセイを実施した。３０μｌの溶解物を１０μｌの４×ＳＤＳゲルローディングバッファーに加えた。サンプルを７２℃で１０分加熱し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＳＤＳポリアシルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、α−ＣＡＴ抗体で調査した。
【００７４】
図３は、野生型（ＣＡＴ）および修飾されたＣＡＴ発現構築物で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の抽出物のウエスタンブロット分析を示す。細胞抽出物を１×ＭＯＰＳ／ＳＤＳ中の１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分別し、ＰＶＤＦ膜に移し、抗ＣＡＴ抗体で調査した。実験は、トランスフェクション効率が同じである細胞由来の抽出物でトリプリケートで実施した。
【００７５】
野生型（ＣＡＴ）を有する３つのトランスフェクションと修飾されたＣＡＴを有する３つのトランスフェクション間の比較を行った。ＣＡＴタンパク質（１９ｋＤａマーカーより大きい）の量は、修飾された構築物でトランスフェクトされた細胞において実質的に増加する。結果は、ＣＡＴタンパク質（１９ｋＤａマーカーより大きい）の量がｍＣＡＴ構築物でトランスフェクトされたＤＧ４４細胞において実質的に増加することを示した。得られるｍＲＮＡ転写産物内の多重翻訳開始部位を除去することによるＣＡＴのＯＲＦの修飾は、この技術が哺乳動物および細菌細胞だけでなく多数の生物体において実用化され得ることを証明した。
【００７６】
分泌タンパク質
該技術の実用性を、また、分泌タンパク質で研究した。哺乳動物の発現構築物を、ヒトＣＤ５分子（ＣＤ５）ｍＲＮＡ内にコードされるシグナルペプチドに対して産生した。転写をＣＭＶプロモーターにより駆動し、ｃｄ５シグナルペプチドをサイログロブリンタンパク質に対する抗体の軽鎖をコードするＯＲＦの５’末端に置いた哺乳動物の発現構築物を産生した（ｃｄ５−１、配列番号：１２３）。ＣＤ５シグナルペプチド配列は、３つのＡＴＧ、１つのＴＴＧおよび３つのＣＴＧコドンを含む７つの可能性のある開始コドンを含む。一連の発現構築物を産生した。１つの変異体において、ｃｄ５シグナルペプチドにおけるＡＴＧコドンを、ＡＴＣコドンに変化させ、メチオニンからイソロイシン置換をもたらした（ｃｄ５−２、配列番号：１２４）。別の変異体において、ｃｄ５シグナルペプチドにおけるＣＴＧコドンをＣＴＣに変化させた（ｃｄ５−３、配列番号：１２５）。別の変異体において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣに変化させた（ｃｄ５−４、配列番号：１２６）。別の変異体において、ＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変化させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させ、開始ＡＵＧのコンテキストをそれのコドン３’をＣＣＣからＧＣＴに変化させて、プロリン（Ｐ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすことにより改良した（ｃｄ５−５、配列番号：１２７）。
【００７７】
次に、これらの構築物を、チャイニーズハムスター卵巣（ＤＧ４４）細胞への一過性トランスフェクションにより試験した。簡潔には、０．５μｇのそれぞれの発現構築物をβ−ガラクトシダーゼレポータータンパク質（ｐＣＭＶβ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を発現する２０ｎｇのコトランスフェクション コントロールプラスミドと共に、製造業者の指示のしたがってＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を使用して、１００，０００のＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、２５０μｌの溶解バッファーを使用して細胞を溶解した。サンプル間で同様のトランスフェクション効率であることを確認するため、ＬａｃＺレポーターアッセイを実施した。３０μｌの上清を１０μｌの４×ＳＤＳゲルローディングバッファーに加えた。サンプルを７２℃で１０分加熱し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＳＤＳポリアシルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、α−カッパ軽鎖抗体で調査した。
【００７８】
図４は、野生型（ｃｄ５−１）および修飾されたｃｄ５シグナルペプチドのα−サイログロブリン軽鎖発現構築物（ｃｄ５−２からｃｄ５−５）で形質転換されたＤＧ４４細胞由来の上清のウエスタンブロット分析を示す。細胞抽出物を１×ＭＯＰＳ／ＳＤＳ中の１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分別し、ＰＶＤＦ膜に移し、α−カッパ軽鎖抗体で調査した。実験は、トランスフェクション効率が同じである細胞由来の上清で実施した。結果は、細胞の上清中の分泌された抗体軽鎖産物（２８ｋＤａより大きい）のレベルがシグナルペプチドにおいてＣＴＧコドンを欠いている発現構築物（ｃｄ５−３）について実質的に増加していることを示す。ＣＴＧ、ＡＴＧコドンを欠き、およびシグナルペプチドにおける真の開始コドンの周囲の改善された（完全にレスキューされた）ヌクレオチドコンテキストを有する発現構築物も、また、実質的に増加している上清中のタンパク質産物のレベルを有した。
【００７９】
軽鎖シグナルペプチド１を含むＴｈｙ−１可変軽鎖ＯＲＦ（配列番号：１２８）は、真の開始コドンを含む８個のＡＴＧ、１５個のＡＴＣ、６個のＡＣＧ、１４個のＧＴＧ、４個のＴＴＧ、２６個のＣＴＧ、１６個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、３個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む１０４個の可能性のある開始コドンを含む。修飾によってＡＵＧおよびＣＵＧコドンが除去されたシグナルペプチドを作製した（配列番号：１２９）。軽鎖シグナルペプチド２を含むＴｈｙ−１可変軽鎖ＯＲＦ（配列番号：１３０）は、真の開始コドンを含む７個のＡＴＧ、１６個のＡＴＣ、６個のＡＣＧ、１３個のＧＴＧ、４個のＴＴＧ、２７個のＣＴＧ、１５個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、４個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む１０４個の可能性のある開始コドンを含む。重鎖シグナルペプチド１を含むＴｈｙ−１可変重鎖ＯＲＦは、真の開始コドンを含む１８個のＡＴＧ、１４個のＡＴＣ、１８個のＡＣＧ、４２個のＧＴＧ、７個のＴＴＧ、４３個のＣＴＧ、４３個のＡＧＧ、３３個のＡＡＧ、５個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む２２５個の可能性のある開始コドンを含む（配列番号：１３１）。修飾によってＡＵＧおよびＣＵＧコドンが除去されたシグナルペプチドを作製した（配列番号：１３２）。重鎖シグナルペプチド２を含むＴｈｙ−１可変重鎖ＯＲＦは、真の開始コドンを含む１８個のＡＴＧ、１４個のＡＴＣ、１８個のＡＣＧ、４３個のＧＴＧ、９個のＴＴＧ、４１個のＣＴＧ、４３個のＡＧＧ、３３個のＡＡＧ、５個のＡＴＡおよび３個のＡＴＴコドンを含む２２７個の可能性のある開始コドンを含む（配列番号：１３３）。
【００８０】
シグナルペプチドがＣＤ５シグナルペプチドと置き換えられているＴｈｙ−１可変軽鎖ＯＲＦ（配列番号：１３７）は、真の開始コドンを含む８個のＡＴＧ、１５個のＡＴＣ、６個のＡＣＧ、１３個のＧＴＧ、５個のＴＴＧ、２７個のＣＴＧ、１４個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、３個のＡＴＡおよび２個のＡＴＴコドンを含む１０４個の可能性のある開始コドンを含む。修飾によってＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変化させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらした（配列番号：１３８）。また、修飾によってＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させた（配列番号：１３９）。別の修飾によってＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変異させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させた（配列番号：１４０）。別の修飾によってＡＴＧコドンをＡＴＣコドンに変化させて、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらし、ＣＴＧコドンをＣＴＣコドンに変化させ、開始ＡＵＧのコンテキストを、それのコドン３’をＣＣＣからＧＣＴに変化させて、プロリン（Ｐ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換をもたらすことにより改良した（配列番号：１４１）。
【００８１】
他の生物体由来のシグナルペプチドを同様に変異させた（表１参照）。酵母および哺乳動物細胞において機能するシグナルペプチドに対するＤＮＡ配列を分析し、変異させて、変異型を作製した（配列番号：１４５−１５６）。タンパク質の開裂されるシグナルペプチドにおいて、インフレームでＡＴＧコドンを、例えば、別の疎水性アミノ酸であるイソロイシンをコードするＡＴＴまたはＡＴＣへ、変異させることができると理解すべきである。インフレームでヒトモノクローナル抗体由来の軽鎖と融合させたこれらのシグナル配列を含むようにＤＮＡ構築物を産生することができる。異なる生物体における発現時に（例えば、酵母のメタノール資化酵母および哺乳動物細胞株）、タンパク質ゲルおよびウェスタンアッセイをヒト軽鎖抗体の発現レベルを確認するために使用することができる。
表１：酵母および哺乳動物細胞において機能するシグナルペプチドに対するＤＮＡ配列
【表１】
【００８２】
ＨｃＲｅｄ１
ＨｃＲｅｄ１は、励起および発光最大がそれぞれ５５８ｎｍおよび６１８ｎｍ＋／−４ｎｍで起こる遠赤色蛍光タンパク質をコードする。ＨｃＲｅｄ１は、珊瑚礁シライトイソギンチャク(Heteractis crispa)由来の非蛍光色素タンパク質の変異誘発により産生した。次に、ＨｃＲｅｄ１のコード配列を、哺乳動物細胞においてより高い発現のためにヒトコドンを最適化した。このＯＲＦは、真の開始コドンを含む９個のＡＴＧ、８個のＡＴＣ、１２個のＡＣＧ、１６個のＧＴＧ、２１個のＣＴＧ、１８個のＡＧＧ、および１５個のＡＡＧコドンを含む９９個の可能性のある開始コドンを含む（配列番号：１３４）。ＨｃＲｅｄ１のＯＲＦの完全および部分的修飾を行った（それぞれ配列番号：１３５および１３６）。
【００８３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、重要な治療剤である。本明細書に記載されている方法を使用して、ヒトＥＰＯタンパク質（以下で提供され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７９９として利用できる）をコードするｍＲＮＡ配列を、このｍＲＮＡ転写産物内の多重翻訳開始部位を除去するように最適化する。
【００８４】
典型的なヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）タンパク質は以下のｍＲＮＡ転写産物によってコードされており、ここで、成熟ペプチドをコードする配列は下線が引かれており、全３つのリーディングフレーム内の全ての可能性のある翻訳開始出発部位は太字であり、メチオニンに対応する標準開始コドンは大文字であり、ウラシル（ｕ）はチミジン（ｔ）に置き換えられている（配列番号：１１１）：
【化１】
【００８５】
得られたアミノ酸配列を保存するため、可能であれば、サイレント(silent)または保存的置換を行う。それぞれ１つのコドン（ａｕｇ／ａｔｇ）および（ｕｇｇ／ｔｇｇ）のみによりコードされるメチオニンおよびトリプトファンの場合において、置換はメチオニンまたはトリプトファンをコードする配列を同様の物理的特性のアミノ酸をコードする配列で置き換える。保存的アミノ酸置換が行われるとき重要であると考えられる物理的特性は、側鎖形状、サイズ、および分岐、疎水性、極性、酸性度、芳香族性 対 脂肪族構造、ならびにファンデルワールス体積を含むが、これらに限定されない。例えば、これらのアミノ酸がすべて同様の疎水性、非極性であり、同等のファンデルワールス体積を占めるため、アミノ酸ロイシンまたはイソロイシンはメチオニンに対して置換することができる。したがって、メチオニンに対するロイシンまたはイソロイシンの置換は、タンパク質フォールディングに影響しない。ロイシンは、メチオニン置換のための好ましいアミノ酸である。あるいは、これらのアミノ酸がすべて同様の芳香族性であり、同等のファンデルワールス体積を占めるため、アミノ酸チロシンまたはフェニルアラニンはトリプトファンに対して置換することができる。
【００８６】
以下の配列は、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする修飾されたｍＲＮＡ転写産物の１つの例であり、ここで、証明された開始メチオニン（ヌクレオチド１８２−１８４によってコードされる）の上流の全ての可能性のある翻訳開始出発部位、およびコーディング領域内の証明された開始メチオニンの下流の可能性のある翻訳開始出発部位を変異させる（イタリック体は変異）（配列番号：１１３）。
【化２】
【００８７】
エリスロポエチンに対する修飾されていないオープンリーディングフレームは、８８個の可能性のある開始コドン（真の開始コドンを含む８個のＡＴＧ、５個のＡＴＣ、４個のＡＣＧ、７個のＧＴＧ、３個のＴＴＧ、３２個のＣＴＧ、１４個のＡＧＧ、１０個のＡＡＧ、３個のＡＴＡ、および２個のＡＴＴコドン）を含む（配列番号：１１２）。修飾によって、多数の可能性のある開始コドンの除去（配列番号：１１６）、シグナルペプチドのＡＴＧおよびＣＴＧの除去（配列番号：２１１）、グルタミン酸（Ｅ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸置換（配列番号：１１８）またはヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）へのアミノ酸置換（配列番号：１１９）をもたらすＡＴＧ、ＣＴＧおよびＡＣＧコドンの除去により修飾されたシグナルペプチドを含むように作製することができる。
【００８８】
実施例２：ｍＲＮＡ転写産物内のｍｉＲＮＡ結合部位の修飾
標的ｍＲＮＡ転写産物に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合は、標的ｍＲＮＡ転写産物の分解を誘導するか、または標的ｍＲＮＡ転写産物の翻訳を防止することのいずれかにより翻訳の効率を減少させる。商業的に価値のあるヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の翻訳の効率を改善するために、標的ｍＲＮＡの５’リーダー配列、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、コード配列、および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列内の全て既知または予測ｍｉＲＮＡ結合部位を第１に同定し、第２にｍｉＲＮＡ結合を阻害するために変異または改変させる。
【００８９】
該方法の好ましい局面において、成熟ｍｉＲＮＡ配列の最初の８個の５’ヌクレオチドを含むシード配列を、特異的に標的とする。シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡ配列の５’ヌクレオチド１−７または２−８のいずれかを含む。したがって、シード配列は、該方法の目的のために、両方の選択肢を包含する。ｍｉＲＮＡシード配列は、ワトソン−クリック塩基対合基準にしたがって結合するｍｉＲＮＡの唯一の部分であるため、ｍｉＲＮＡのシード配列は機能的に有意である。ｍｉＲＮＡのシード配列領域内の結合の絶対的な相補性なしに、ｍｉＲＮＡのその標的ｍＲＮＡへの結合は起こらない。しかしながら、大抵のヌクレオチド対とは異なって、ｍｉＲＮＡのシード配列は、Ｇ：Ｕゆらぎとして知られているグアニンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドと対合するように、標的ｍＲＮＡと対合することができる。
【００９０】
例えば、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、十分な量において製造することが困難であった重要な治療剤である。本方法を使用して、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７９９）を、ｍｉＲＮＡ下方制御を阻害するように最適化する。ＰｉｃＴａｒ Ｗｅｂ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（pictar.mdc_berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgiで公に利用できる）によって、ヒトｍｉＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａがヒトＥＰＯをコードするｍＲＮＡを標的とすることを予測した（これらのｍｉＲＮＡの成熟およびシード配列は、以下の表２に提供されている）。したがって、例えば、ｕｇｇａｇｕｇｕのシード配列を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａの場合において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａがもはや結合しないように１つ以上のヌクレオチドを変異し、別の既知のｍｉＲＮＡのシード配列を創造しない。結合を防止する１つの可能性のある変異ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａシード配列は、「ｕａｇａｇｕｇｕ」である。該配列は、例えば、以下の表２内に示されていないため、該変異シード配列が別の既知のｍｉＲＮＡに属することは起こりそうにない。
【００９１】
同様に、ＰｉｃＴａｒ Ｗｅｂ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅによって、ヒトｍｉＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｆ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｇ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｉ、ｈｓａ−ｌｅｔ７ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂが、ヒトインターフェロンベータ２（ＩＬ−６としても既知、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００６００）をコードするｍＲＮＡを標的とすることを予測した（これらのｍｉＲＮＡの成熟およびシード配列は以下の表２に提供されている）。
【００９２】
ＭｉＲＮＡ結合部位は、１０００未満の塩基対のあらゆる配列をＳａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｉＲＮＡ：配列データベース（microna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmlで公に利用できる）に挿入することにより同定することができる。
【００９３】
表２：既知のヒトＭｉＲＮＡ、成熟配列およびシード配列
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
【表５】
【００９７】
【表６】
【００９８】
ｍｉＲ−１８３結合配列（配列番号：５９）を変異させ（配列番号：１４２）、例えば、ＦＬＡＧタグも含むＣＡＴ遺伝子におけるレポーター遺伝子のコード配列に組み込んだ（配列番号：１４３）。ｍｉＲ−１８３結合配列が変異されている抗−ＦＬＡＧタグ抗体（配列番号：１４４）を使用するウエスタンブロット分析により、細胞における発現の評価を可能にする。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全長タンパク質発現の効率を改善する方法であって、
ａ）ｉ）タンパク質に対するコード配列、
ｉｉ）コード配列の上流にある第１の開始コドン、および
ｉｉｉ）コード配列内に位置する１つ以上の第２の開始コドン
を含むポリヌクレオチドを提供し、
ｂ）１つ以上の第２の開始コドンを変異し、該変異が、第１の開始コドンから離れてリボソームダイバージョンの減少をもたらす１つ以上の第２の開始コドンでのタンパク質合成の開始の減少をもたらし、
それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる
ことを含む方法。
【請求項２】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の第２の開始コドンが、コード配列と同じリーディングフレーム内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の第２の開始コドンが、コード配列のフレーム外にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の第２の開始コドンが、リボソーム動員部位から１つ以上のヌクレオチドの上流または下流に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リボソーム動員部位が、キャップまたはＩＲＥＳを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の第２の開始コドンが、ＡＵＧ、ＡＣＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、およびＡＵＵからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
コード配列内の２つ以上の第２の開始コドンを変異させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コード配列内のすべての第２の開始コドンを変異させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が望ましくないヌクレオチドコンテキストへのフランキングヌクレオチドの変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が、新規開始コドンを導入しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が変異コドンの利用バイアスを改変しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
全長をコードされたタンパク質以外の短縮タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの産生を減少させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が、ｍｉＲＮＡシード配列、スプライスドナー部位、スプライス受容部位、またはｍＲＮＡ不安定化エレメントを導入しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
全長タンパク質発現の効率を改善する方法であって、
ａ）タンパク質に対するコード配列およびコード配列内に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチド配列を提供し、
ｂ）１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を変異し、該変異が、タンパク質翻訳のｍｉＲＮＡ介在の下方制御の減少をもたらす１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位でのｍｉＲＮＡ結合の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる
ことを含む方法。
【請求項１６】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、ｍｉＲＮＡのシード配列中の１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、開始コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、希少コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、さらなるｍｉＲＮＡシード配列がポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位がコード配列内に位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が３’非翻訳領域内に位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が５’リーダー配列内に位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
全長タンパク質発現の効率を改善する方法であって、
ａ）ｉ）タンパク質に対するコード配列、
ｉｉ）コード配列の上流にある第１の開始コドン、および
ｉｉｉ）コード配列内に位置する１つ以上の第２の開始コドン
を含むポリヌクレオチドを提供し、
ｂ）１つ以上の第２の開始コドンを変異し、該変異が、第１の開始コドンから離れてリボソームダイバージョンの減少をもたらす１つ以上の第２の開始コドンでのタンパク質合成の開始の減少をもたらし、
それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる
ことを含む方法。
【請求項２】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の第２の開始コドンが、コード配列と同じリーディングフレーム内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の第２の開始コドンが、コード配列のフレーム外にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の第２の開始コドンが、リボソーム動員部位から１つ以上のヌクレオチドの上流または下流に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リボソーム動員部位が、キャップまたはＩＲＥＳを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の第２の開始コドンが、ＡＵＧ、ＡＣＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＧ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、およびＡＵＵからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
コード配列内の２つ以上の第２の開始コドンを変異させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コード配列内のすべての第２の開始コドンを変異させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が望ましくないヌクレオチドコンテキストへのフランキングヌクレオチドの変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が、新規開始コドンを導入しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が変異コドンの利用バイアスを改変しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
全長をコードされたタンパク質以外の短縮タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの産生を減少させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の第２の開始コドンの変異が、ｍｉＲＮＡシード配列、スプライスドナー部位、スプライス受容部位、またはｍＲＮＡ不安定化エレメントを導入しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
全長タンパク質発現の効率を改善する方法であって、
ａ）タンパク質に対するコード配列およびコード配列内に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチド配列を提供し、
ｂ）１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を変異し、該変異が、タンパク質翻訳のｍｉＲＮＡ介在の下方制御の減少をもたらす１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位でのｍｉＲＮＡ結合の減少をもたらし、それにより、全長タンパク質発現の効率を増加させる
ことを含む方法。
【請求項１６】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、アミノ酸配列が改変されない１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、ｍｉＲＮＡのシード配列中の１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、開始コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、希少コドンがポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の変異が、さらなるｍｉＲＮＡシード配列がポリヌクレオチド配列に導入されないような１つ以上のヌクレオチドの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位がコード配列内に位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が３’非翻訳領域内に位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が５’リーダー配列内に位置する、請求項１５に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５２０１５８（Ｐ２０１３−５２０１５８Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５２０２８（Ｐ２０１１−５５２０２８）
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００５６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９８８６１
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（３９９０３８６２０）ザ スクリプス リサーチ インスティチュート (51)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００５６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９８８６１
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（３９９０３８６２０）ザ スクリプス リサーチ インスティチュート (51)
【Ｆターム（参考）】
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