タンパク質骨格およびその使用
特異的な単量体ドメインを提供し、ならびにそれらの単量体ドメインを含む多量体が提供される。キットおよび集積システムとともに、1つまたは複数のライブラリーメンバーを発現する方法、組成物、ライブラリーおよび細胞も本発明に含まれる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的分子に結合する単量体ドメインを同定する方法：
a) 単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択される、非天然の単量体ドメインのライブラリーを提供する段階であって、
ここでCa-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、段階;
b) 第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに
c) 少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する段階。
【請求項２】
少なくとも1つの単量体ドメインが、非天然の単量体ドメインと少なくとも90%同一である天然の単量体ドメインによって結合されない標的分子に特異的に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成し；ならびに
DSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中αがw、y、f、およびlからなる群より選択され；βがv、I、l、a、m、およびfからなる群より選択され；χがg、a、s、およびtからなる群より選択され；δがk、r、e、q、およびdからなる群より選択され；εがv、a、s、およびtからなる群より選択され；ならびにφがd、e、およびnからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつインテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含む：
請求項1記載の方法。
【請求項６】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
同定された単量体ドメインを第2の単量体ドメインに連結させて、各々が少なくとも2つの単量体ドメインを含む多量体のライブラリーを形成する段階;
第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；および
第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階。
【請求項７】
選択された多量体の各単量体ドメインが同じ標的分子に結合する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
選択された多量体が3つの単量体ドメインを含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
選択された多量体が4つの単量体ドメインを含む、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも1つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異した単量体ドメインを含むライブラリーを提供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
突然変異させる段階が、ポリペプチドドメインをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの、複数のポリヌクレオチド断片を組換える段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階;
第2の標的分子に結合する単量体ドメインを同定する段階;
第1の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインを、第2の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインと連結させ、それによって第1および第2の標的分子に対する親和性を有する多量体を形成する段階。
【請求項１３】
単量体ドメインのライブラリーがファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは細胞表面ディスプレイとして発現される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
単量体ドメインのライブラリーがマイクロアレイ上に提示される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
標的分子が、非天然の単量体ドメインと少なくとも90%同一である天然の単量体ドメインによって結合されず、
非天然の単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択される、
標的分子に特異的に結合する単量体ドメインを含む、非天然のタンパク質。
【請求項１６】
単量体ドメインが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１７】
単量体ドメインが少なくとも3つのジスルフィド結合を含む、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１８】
単量体ドメインがイオンを結合する、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１９】
イオンがカルシウムである、請求項18記載のタンパク質。
【請求項２０】
単量体ドメインが30〜100アミノ酸長である、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２１】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２２】
Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成し；ならびに
DSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成する、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２３】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
および式中αがw、y、f、およびlからなる群より選択され；βがv、I、l、a、m、およびfからなる群より選択され；χがg、a、s、およびtからなる群より選択され；δがk、r、e、q、およびdからなる群より選択され；εがv、a、s、およびtからなる群より選択され；ならびにφがd、e、およびnからなる群より選択される、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２４】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつインテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含む：
請求項23記載のタンパク質。
【請求項２５】
単量体ドメインが異種アミノ酸配列に融合される、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２６】
異種アミノ酸が、異種リンカーによって第1の単量体ドメインに連結された第2の単量体ドメインである、請求項25記載のタンパク質。
【請求項２７】
第1の単量体ドメインが第1の標的分子を結合し、第2の単量体ドメインが第2の標的分子を結合する、請求項26記載のタンパク質。
【請求項２８】
第1の単量体ドメインが第1の部位で標的分子を結合し、第2の単量体ドメインが異なる部位に標的分子を結合する、請求項26記載のタンパク質。
【請求項２９】
単量体ドメイン単独の結合活性と比較して標的分子に対する改善された結合活性を有する、請求項26記載のタンパク質。
【請求項３０】
単量体ドメインがポリペプチドリンカーによって連結される、請求項26記載のタンパク質。
【請求項３１】
請求項15記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項31記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項３３】
単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択され、
ここでCa-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、非天然の単量体ドメインを含むタンパク質のライブラリー。
【請求項３４】
多量体の各単量体ドメインが非天然の単量体ドメインである、請求項33記載のライブラリー。
【請求項３５】
ライブラリーが、リンカーによって連結された少なくとも2つの単量体ドメインを含む複数の多量体を含む、請求項33記載のライブラリー。
【請求項３６】
ライブラリーが、異なる単量体ドメインを含む少なくとも100種の異なるタンパク質を含む、請求項33記載のライブラリー。
【請求項３７】
請求項33記載のタンパク質のライブラリーをコードするポリヌクレオチドのライブラリー。
【請求項１】
以下の段階を含む、標的分子に結合する単量体ドメインを同定する方法：
a) 単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択される、非天然の単量体ドメインのライブラリーを提供する段階であって、
ここでCa-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、段階;
b) 第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに
c) 少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する段階。
【請求項２】
少なくとも1つの単量体ドメインが、非天然の単量体ドメインと少なくとも90%同一である天然の単量体ドメインによって結合されない標的分子に特異的に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成し；ならびに
DSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中αがw、y、f、およびlからなる群より選択され；βがv、I、l、a、m、およびfからなる群より選択され；χがg、a、s、およびtからなる群より選択され；δがk、r、e、q、およびdからなる群より選択され；εがv、a、s、およびtからなる群より選択され；ならびにφがd、e、およびnからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつインテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含む：
請求項1記載の方法。
【請求項６】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
同定された単量体ドメインを第2の単量体ドメインに連結させて、各々が少なくとも2つの単量体ドメインを含む多量体のライブラリーを形成する段階;
第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；および
第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階。
【請求項７】
選択された多量体の各単量体ドメインが同じ標的分子に結合する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
選択された多量体が3つの単量体ドメインを含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
選択された多量体が4つの単量体ドメインを含む、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも1つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異した単量体ドメインを含むライブラリーを提供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
突然変異させる段階が、ポリペプチドドメインをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの、複数のポリヌクレオチド断片を組換える段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階;
第2の標的分子に結合する単量体ドメインを同定する段階;
第1の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインを、第2の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインと連結させ、それによって第1および第2の標的分子に対する親和性を有する多量体を形成する段階。
【請求項１３】
単量体ドメインのライブラリーがファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは細胞表面ディスプレイとして発現される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
単量体ドメインのライブラリーがマイクロアレイ上に提示される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
標的分子が、非天然の単量体ドメインと少なくとも90%同一である天然の単量体ドメインによって結合されず、
非天然の単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択される、
標的分子に特異的に結合する単量体ドメインを含む、非天然のタンパク質。
【請求項１６】
単量体ドメインが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１７】
単量体ドメインが少なくとも3つのジスルフィド結合を含む、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１８】
単量体ドメインがイオンを結合する、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１９】
イオンがカルシウムである、請求項18記載のタンパク質。
【請求項２０】
単量体ドメインが30〜100アミノ酸長である、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２１】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２２】
Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成し；ならびに
DSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成する、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２３】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
および式中αがw、y、f、およびlからなる群より選択され；βがv、I、l、a、m、およびfからなる群より選択され；χがg、a、s、およびtからなる群より選択され；δがk、r、e、q、およびdからなる群より選択され；εがv、a、s、およびtからなる群より選択され；ならびにφがd、e、およびnからなる群より選択される、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２４】
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつインテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含む：
請求項23記載のタンパク質。
【請求項２５】
単量体ドメインが異種アミノ酸配列に融合される、請求項15記載のタンパク質。
【請求項２６】
異種アミノ酸が、異種リンカーによって第1の単量体ドメインに連結された第2の単量体ドメインである、請求項25記載のタンパク質。
【請求項２７】
第1の単量体ドメインが第1の標的分子を結合し、第2の単量体ドメインが第2の標的分子を結合する、請求項26記載のタンパク質。
【請求項２８】
第1の単量体ドメインが第1の部位で標的分子を結合し、第2の単量体ドメインが異なる部位に標的分子を結合する、請求項26記載のタンパク質。
【請求項２９】
単量体ドメイン単独の結合活性と比較して標的分子に対する改善された結合活性を有する、請求項26記載のタンパク質。
【請求項３０】
単量体ドメインがポリペプチドリンカーによって連結される、請求項26記載のタンパク質。
【請求項３１】
請求項15記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項31記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項３３】
単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択され、
ここでCa-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、非天然の単量体ドメインを含むタンパク質のライブラリー。
【請求項３４】
多量体の各単量体ドメインが非天然の単量体ドメインである、請求項33記載のライブラリー。
【請求項３５】
ライブラリーが、リンカーによって連結された少なくとも2つの単量体ドメインを含む複数の多量体を含む、請求項33記載のライブラリー。
【請求項３６】
ライブラリーが、異なる単量体ドメインを含む少なくとも100種の異なるタンパク質を含む、請求項33記載のライブラリー。
【請求項３７】
請求項33記載のタンパク質のライブラリーをコードするポリヌクレオチドのライブラリー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５２０２０７（Ｐ２００８−５２０２０７Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４１４８２（Ｐ２００７−５４１４８２）
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１６３６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５５６８９
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５０７１５７９８６）アヴィディア リサーチ インスティテュート (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１６３６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５５６８９
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５０７１５７９８６）アヴィディア リサーチ インスティテュート (2)
【Ｆターム（参考）】
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