チアミン高生産変異微生物
【課題】 真菌を宿主として、チアミンを高生産する変異微生物を得ることを目的とする。
【解決手段】 下記３つの遺伝子を、それぞれチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結後、形質転換により宿主に導入し、宿主内で同時に発現させることにより、目的とするチアミンを多く生産する変異微生物を得た。
(1)チアゾール核合成酵素遺伝子
(2)ピリミジン核合成酵素遺伝子
(3)チアミンピロホスホキナーゼ遺伝子
【解決手段】 下記３つの遺伝子を、それぞれチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結後、形質転換により宿主に導入し、宿主内で同時に発現させることにより、目的とするチアミンを多く生産する変異微生物を得た。
(1)チアゾール核合成酵素遺伝子
(2)ピリミジン核合成酵素遺伝子
(3)チアミンピロホスホキナーゼ遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチアミン生合成可能な真菌から得られたチアミンを多く生産する変異微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内においてチアミンは、遊離チアミン、チアミンモノリン酸およびチアミンピロリン酸として存在している。チアミン生合成可能な真菌においては、前駆体である２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン（ピリミジン核）と４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール（チアゾール核）が生合成された後、これら２つの前駆体が結合してチアミンモノリン酸となり、最後に脱リン酸化を経てチアミンが生合成される。さらにチアミンはチアミンピロホスホキナーゼによって修飾されてチアミンピロリン酸となり、生体内でエネルギー代謝等に関わる酵素の補酵素として利用される。
【０００３】
チアミン生合成可能な真菌のチアミンの生合成に関与する遺伝子は、外部環境に存在するチアミンにより発現が抑制されることが知られている。例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおいて、ピリミジン核合成酵素遺伝子（ｎｍｔＡ）とチアゾール核合成酵素遺伝子（ｔｈｉＡ）は、最終生産物であるチアミンピロリン酸により発現が抑制されることが知られている。つまり真菌のチアミン生産量は複数のチアミン生合成に関与する遺伝子群の発現段階で厳密に制御されており、そのためチアミンを高生産する変異微生物の取得は困難であった。
【０００４】
チアミンはエネルギー生産に欠かせない補酵素（ビタミンＢ１）として知られており、各種栄養補助食品にも利用されている有用物質である。
【０００５】
他にも清酒醸造において、発酵もろみ中にチアミンを添加することで、もろみ中のピルビン酸濃度が減少して、ピルビン酸から酵母により生合成される木香様臭やつわり香といった不快臭の発生を予防できることが知られている。
【０００６】
遺伝子組換えによりチアミンを高生産するようになった微生物として細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓがあるが（非特許文献１参照）、真菌ではこれまでに報告がない。
【０００７】
チアミンの製造方法は、合成法については広く知られている（非特許文献２、３参照）が、微生物による生産については知られていない。また、チアミンピロリン酸の製造方法（特許文献１参照）など、遊離チアミンを出発点としてチアミンの類縁体を製造する方法が報告されているが、これらはすべて原料にチアミンを必要としている。
【０００８】
応用面については、高栄養酵母および酵母製品の製造方法として、酵母の培養条件を検討することでチアミン等を増加させる方法が報告されている（特許文献２参照）。しかし、この方法では、培養条件が制限されるため、汎用性という点で問題がある。また、清酒及び酒類の製造方法として、チアミン輸送能が低下した酵母変異株を用いて酒類の製造を行い、酒中のチアミン残存量を増加させる方法が報告されている（特許文献３参照）。しかし、これは原料由来のチアミンの減少量を抑制する方法であり、チアミンの生産量を増加させる方法ではない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８７， ２３， ８１２７， ２００５
【非特許文献２】化学大辞典 第１版（１９８９） ｐ１３８９ 東京化学同人
【非特許文献３】同志社家政 ｖｏｌ．２６ ｐ１３−１８ Ｄｅｃ． １９９２
【特許文献１】特開Ｈ０８−９９８５号公報
【特許文献２】特開２００６−１４７１９号公報
【特許文献３】特開Ｈ１１−２４３９４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非特許文献１に記載されている方法は、培養時にチアミンの添加が必要であるため、培養条件の汎用性という点で問題があり、実用的なチアミン高生産方法ではない。
【００１１】
また、非特許文献２、３に記載されている方法はチアミンの合成法である。消費者の健康志向の高まりと共に、合成品より天然品を求める傾向が強くなっている。特に大きな市場となった健康食品分野では顕著であり、天然チアミンの工業的製造法が望まれている。
【００１２】
特許文献１に記載されている方法はチアミンを変換する方法であり、生産する方法ではない。
【００１３】
特許文献２に記載されている方法は、培養条件が制限されており、チアミン製造に種々の制約があるため特定の目的にしか応用できず、広い分野への応用は不可能である。
【００１４】
特許文献３に記載されている方法は、原料由来のチアミンの減少量を抑制する方法であり、チアミンの生産量を増加させる方法ではない。
【００１５】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、真菌を宿主とするチアミンを高生産する変異微生物を創製することである。これを用いて通常の培養しやすい条件でチアミンを効率よく大量に生産でき、これによって食品分野や医薬分野など幅広い分野でチアミン含有製品を工業的に製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。すなわち、
＜１＞チアミンを生合成することのできる真菌より得られる、チアミンを高生産する変異微生物を提供することである。
＜２＞チアミンの生合成に関与する２つの遺伝子である２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン合成酵素遺伝子、４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール合成酵素遺伝子、およびチアミンの修飾に関与するチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子の合計３遺伝子を、それぞれ宿主内でチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結して、宿主に同時に導入することで得られた前記＜１＞に記載の変異微生物を提供することである。
＜３＞宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の変異微生物である。
＜４＞宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の変異微生物である。
＜５＞宿主に用いた酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の変異微生物である。
＜６＞前記＜１＞または＜２＞に記載の方法で得られたチアミンを高生産するようになった変異糸状菌株ＴＨ１０９１（寄託微生物受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−２５６）である。
【発明の効果】
【００１７】
本研究者らが鋭意研究の結果、真菌である糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを宿主として取得したチアミンを多く生産する変異微生物は、培養開始時にチアミンを必要とせずに宿主の３〜４倍のチアミンを菌体内に蓄積した。また、チアミンの生合成遺伝子およびチアミンの修飾遺伝子をチアミンによる発現制御のかからない発現プロモーターに連結して宿主に形質転換することを特徴とするため、特別な培地・培養条件を必要とせずチアミンを高生産させられるという利点がある。また、この方法で取得したチアミンを多く生産する変異微生物は、外部からのチアミン取り込み量も減少するため、培養菌体と培地を含む培養系全体からチアミンを回収することで、より多くのチアミンを得ることができる。さらに、チアミンピロリン酸を高生産する変異微生物については過去に報告がなく、新規な特徴である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
宿主に用いる真菌としてはチアミン生合成能を有していれば、その他の制限はないが、例えば糸状菌であればＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、酵母であればＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属が好ましく、糸状菌であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅがより好ましい。これらに対して前述のようにチアミンの生合成遺伝子群およびチアミンの修飾遺伝子をチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結して導入することで、チアミン高生産性を付与して有効に利用することができる。
【００１９】
本発明において、宿主に形質転換する三つの遺伝子としては２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン合成酵素遺伝子、４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール合成酵素遺伝子およびチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子であれば特に制限はないが、好ましくは宿主由来の該遺伝子を用いるのがよい。発現プロモーターとしてはチアミンによる発現抑制を受けない高発現プロモーターであれば特に制限はないが、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター（ＰｐｔｒＡ）またはａｍｙＢ遺伝子のプロモーター（ＰａｍｙＢ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明のチアミンを多く生産する変異微生物はチアミンを生産させるために特別な培地を必要としないが、利用するプロモーターによっては発現の誘導に必要な成分を添加する必要がある。例えば本発明のＴＨ１０９１はチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子の発現プロモーターとしてＰａｍｙＢを使用しているため、培地に炭素源として可溶性デンプン、デキストリンまたはイソマルトースのような多糖類の添加が必要である。
【実施例１】
【００２１】
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（ｔｈｉＡ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡの構築）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｔｈｉＡ遺伝子（配列番号３、翻訳されたアミノ酸配列は配列番号４）は、プロモーター領域の一遺伝子変異（Ａ −６８ Ｇ）によりチアミンによる発現抑制が失われ、さらにこの上記変異は宿主に対しチアミンの代謝アナログであるピリチアミンに対する耐性を付与することが知られている。この変異遺伝子（ｐｔｒＡ遺伝子）を薬剤耐性遺伝子マーカーとして、またｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター領域を遺伝子発現用のプロモーターとして含んだプラスミドｐＰＲｅ１のｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター下流にＫｐｎＩサイトを利用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｎｍｔＡ遺伝子（配列番号１、翻訳されたアミノ酸配列は配列番号２）を挿入した。ｎｍｔＡ遺伝子はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの全ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法により増幅した。ｎｍｔＡ遺伝子の増幅には適当な制限酵素サイトを付加したプライマーを用いた。具体的には、両端にＫｐｎＩサイトを付加した上流プライマー（ａ）（配列表７）、下流プライマー（ｂ）（配列表８）とを使用した。
（ａ）上流プライマー、５’−ＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＧ−３’
（ｂ）下流プライマー、５’−ＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＧＣＧＣＴＡＧＡＧＧＣ−３’
【００２３】
ＰＣＲの反応条件は、（９８℃， １０秒）→（６０℃， ３０秒）→（７２℃， ２分）で３０サイクル行った。ＰＣＲ増幅後の反応液は０．８％アガロース電気泳動により分離後、ｎｍｔＡ遺伝子である１．２ ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡＣＥＬＬ（第一化学薬品株式会社）を用いて精製後、ＴベクターｐＣＲ２．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ株式会社）を用いてサブクローニングした。ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０）を用いてサブクローニングした塩基配列に非特異的な変異が無いことを確認した後、制限酵素ＫｐｎＩによりｎｍｔＡ遺伝子を切り出し、プラスミドｐＰＲｅ１のＫｐｎＩサイトに挿入した。
【００２４】
（ｔｈｉＰ遺伝子発現プラスミドｐＴＡｅｘ３−ｔｈｉＰの構築）
栄養要求性を相補する遺伝子マーカーとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ 由来ａｒｇＢ遺伝子を、チアミンによる発現抑制を受けない遺伝子発現用プロモーターとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｙＢ遺伝子のプロモーターを含むプラスミドｐＴＡｅｘ３（独立行政法人酒類総合研究所）を利用し、ａｍｙＢ遺伝子のプロモーター下流のＥｃｏＲＩサイトを利用してＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｔｈｉＰ遺伝子（配列番号５、翻訳されたアミノ酸配列は配列番号６）を挿入した。ｔｈｉＰ遺伝子はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。ｔｈｉＰ遺伝子の増幅にはｔｈｉＰ全長を増幅できるプライマーを用いた。具体的には、上流プライマー（ｃ）（配列表９）、下流プライマー（ｄ）（配列表１０）とを使用した。
（ｃ）上流プライマー、５’−ＴＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＣＣ−３’
（ｄ）下流プライマー、５’−ＣＴＡＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴ−３’
【００２５】
ＰＣＲの反応条件は、（９８℃， １０秒）→（６０℃， ３０秒）→（７２℃， ２分）で３０サイクル行った。増幅した断片は、ｎｍｔＡ遺伝子と同様に一度ｐＣＲ２．１に連結し、ＤＮＡシークエンスにより非特異的な変異が含まれていないことを確認した後、ｐＣＲ２．１に存在するＥｃｏＲＩサイトを利用して再び切り出してプラスミドｐＴＡｅｘ３のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
【００２６】
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅへの各プラスミドの形質転換）
ａｒｇＢ遺伝子が欠損したアルギニン栄養要求性株であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株（ 独立行政法人酒類総合研究所 ）にプラスミドｐＴＡｅｘ３−ｔｈｉＰを形質転換してチアミンピロリン酸キナーゼ高発現形質転換株を得た。さらに該株にプラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡを形質転換し、最終的にｎｍｔＡ遺伝子、ｔｈｉＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子の三つの遺伝子がチアミンピロリン酸により発現抑制されない三重変異微生物を得た。以下にその手法を示す。
【００２７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株をＤＰＹ培地（０．５ ％ 酵母エキス、１ ％ ポリペプトン、２ ％ デキストリン、０．５ ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５ ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ｐＨ ６．５）で３０℃、１６０ ｒｐｍ、２４時間回転振とう培養後、得られた菌体を３Ｇ−１ブフナー型ガラスフィルターで回収した後、滅菌水で洗浄した。この菌体をＴＦ液（１）（０．６ Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ ｍＭ マレイン酸緩衝液 ｐＨ ５．５、０．５ ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ （タカラバイオ株式会社））に懸濁し、３０℃、２時間、緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化した。得られたプロトプラストを乾熱滅菌した ３Ｇ−３ブフナー型ガラスフィルターでろ過して残存する菌体を除去した後、ＴＦ液（２）（１．２Ｍ ソルビトール、５０ ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ トリスー塩酸緩衝液 ｐＨ ７．５）で２回洗浄し、最後に２×１０８ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＴＦ液（２）に懸濁してコンピテントセルを調製した。
【００２８】
上記コンピテントセル０．２ ｍｌに導入するｔｈｉＰ遺伝子発現プラスミドｐＴＡｅｘ３−ｔｈｉＰを１０ μｇ加え、氷上で３０分間静置後、ＴＦ液（３）（６０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ４０００、５０ ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ ７．５）１．３５ ｍｌ を加えてさらに１５分間室温で静置した。１０ ml の ＴＦ液（２）を加え、１８００ rpm、５ 分間 遠心して、プロトプラストを回収し、再度ＴＦ液（２）０．５ ｍｌ に懸濁した。このプロトプラスト懸濁液を再生用下層最少培地（Ｃｚａｐｅｃ−Ｄｏｘ（ＣＤ）最少培地（０．６ ％ ＮａＮＯ３、０．０５２ ％ ＫＣｌ、０．１５２ ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２１ ％ １ Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ ％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ＊ ｐＨ ６．５ ＊Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ：０．１ ％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８８ ％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ ％ ＣｕＳＯ4・5Ｈ2Ｏ、０．０１５ ％ ＭｎＳＯ4・4Ｈ2Ｏ、０．０１ ％ Ｎａ2ＢＯ7・１０Ｈ2Ｏ、０．００５ ％ （ ＮＨ4 ）６Ｍｏ7Ｏ24・4Ｈ2Ｏ）、１ %Ｇｌｕｃｏｓｅ、１．２ Ｍ ソルビトール、２ % Ａｇａｒ）上にのせ、あらかじめ４５℃に保温しておいた再生用上層最少培地（下層培地組成のＡｇａｒ濃度のみを０．５％ に変えたもの）５ ｍｌを重層してプロトプラストを包埋した。３０℃、１０日間培養後、生育してきた形質転換体を釣菌した。純化のためＣＤ最少培地で ５ 回継代培養した。
【００２９】
次に上記形質転換体から得られた、チアミンピロリン酸キナーゼ高発現株を宿主としてｔｈｉＡ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡを形質転換する際は、プロトプラスト作成用の菌体の培養に５ % Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＣＤ最少培地を用い、さらに形質転換後の再生用上層および下層培地には０．１ ｐｐｍ ピリチアミンをオートクレーブ滅菌後に添加した。上記と同様の操作でｔｈｉＡ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡを用いて形質転換を行ったプロトプラストを、０．１ ｐｐｍピリチアミン添加再生培地で３０℃、１０日間培養後、ピリチアミンに耐性を示して生育してきた形質転換体を釣菌した。純化のため０．１ ｐｐｍ ピリチアミン添加、２ % Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＣＤ最少培地で ５ 回継代培養した。
【００３０】
（ｔｈｉＡ遺伝子、ｎｍｔＡ遺伝子およびｔｈｉＰ遺伝子脱抑制株の選抜方法）
純化した形質転換体から全ＲＮＡを抽出し、ｔｈｉＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子をプローブとしてノザン解析を行い、これら三つの遺伝子のチアミンによる発現抑制が失われている（脱抑制している）ことを確認した。
【００３１】
全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポン・ジーン）を用いて抽出し、変性０．８％アガロース電気泳動により分離してナイロンメンブレン・ハイボンドＮ＋ （アマシャムバイオサイエンス株式会社）にブロットした。プローブとして、それぞれｔｈｉＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子またはｎｍｔＡ遺伝子の全塩基配列を用いた。プローブのラベリングおよびシグナルの検出はＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍs（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いた。宿主であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株はチアミン添加時にｔｈｉＡ遺伝子、ｎｍｔＡ遺伝子およびｔｈｉＰ遺伝子由来のシグナルが消失するが、左記の三つの遺伝子の発現プラスミドが導入された形質転換体では、チアミン添加時もこのシグナルが消失しない。これに基づいて目的の変異微生物を選抜した。
【００３２】
以上の方法を用いて創製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの変異微生物として、ＴＨ１０９１株を挙げることができる。ＴＨ１０９１株のチアミン生産能力以外の菌学的性質はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株に準じる。
【００３３】
本願の発明に係るＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡ遺伝子、ｎｍｔＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子脱抑制変異微生物は、本株ばかりでなく、経代した子孫にも受け継がれ、発明として広い利用形態があるものと認められる。
【００３４】
（培養菌体からのチアミン抽出）
変異微生物を２％デキストリン、ＣＤ最少液体培地で３０℃、１８０ｒｐｍで３６時間回転振とう培養した。培養菌体を３Ｇ−１ブフナー型ガラスフィルターで回収、滅菌水で洗浄し、チアミン抽出用サンプルとした。チアミン抽出はＴｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（ＴＣＡ）抽出法（日本食品科学工学会 新・食品分析法 ｐ３７０（１９９６））に準じて行った。脱水後、菌体を菌体重量の１０倍量の５ ％ ＴＣＡに懸濁し、室温で３０分間２００ ｒｐｍ振とう抽出を行った。抽出液を遠心し（１５,０００ｒｐｍ １０分）上清を回収し、１／１０倍量の中和溶液を加え、０．４５μｍフィルターを通して菌体抽出液とした。
【００３５】
（チアミンの分析）
チアミンの分析は、既報（本江 薫 ビタミン ６８巻 ７号 １９９４）に若干の変更を加えたポストカラムＨＰＬＣ法によって行った。遊離型のチアミンとチアミンモノリン酸、チアミンピロリン酸の標準品を用いて検量線を作成した。移動相としてｓｏｌｖｅｎｔＡ（０．２ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、ｓｏｌｖｅｎｔＢ（０．２ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ2Ｏ、０．０６ Ｍ ＴＣＡ、０．０５ Ｍ ＮａＯＨ、０．０２ Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ）の混合比をｓｏｌｖｅｎｔＡ：ｓｏｌｖｅｎｔＢ＝９２：８の一定とし、流速を １ ｍｌ／分とした。カラム通過後の移動相に、発色液（ ２５０ ｐｐｍ Ｋ３［Ｆｅ(ＣＮ)６］、５ ％ ＮａＯＨ ） を流速 ０．５ ｍｌ／分で混合し、４０℃で６０秒反応させ、反応液の蛍光（励起波長： ３７５ｎｍ、検出波長 ４５０ｎｍ）を測定した。ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓ６００Ｅシステム（Ｗａｔｅｒｓ，ＭＡ．ＵＳＡ）を、分離カラムはＷａｔｅｒｓ ｐｕｒｅｓｉｌＴＭＣ１８（担体直径５ μｍ、カラム内径４．６ ｍｍ、カラム長さ２５０ ｍｍ）を用いた。クロマトグラム波形解析にはＳｍａｒｔＣｈｒｏｍ（株式会社ケーワイエーテクノロジーズ）を用いた。図３にＴＨ１０９１を含む数株の菌体中のチアミン濃度の分析結果を示す。
【００３６】
図３に示したように、三重変異微生物の菌体中のチアミン濃度は、プラスミドｐＴＡｅｘ３のみを組み込んだプラスミドコントロール株と比較して１．７〜４．３ 倍に増大していることがわかる。このうちチアミン濃度が最も増大した（４．３倍）株をＴＨ１０９１株とし、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託した（寄託微生物受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−２５６）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、チアミン（ビタミンB1）を効率的に高生産することが可能となる。従って、ビタミンB1に関する幅広い分野、例えば、健康食品（特定保健食品、栄養機能食品）、栄養補助食品、医薬、飲料、酒類などの分野で、ビタミンB1を含有した製品を、工業的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、プラスミドｐＰＲｅ１の構成を説明する図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＡｅｘ３の構成を説明する図である。
【図３】図３は、三重変異微生物の菌体内チアミン濃度を示す図表である。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号７：フォワードプライマー ｎｍｔＡ
配列番号８：リバースプライマー ｎｍｔＡ
配列番号９：フォワードプライマー ｔｈｉＰ
配列番号１０：リバースプライマー ｔｈｉＰ
【技術分野】
【０００１】
本発明はチアミン生合成可能な真菌から得られたチアミンを多く生産する変異微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内においてチアミンは、遊離チアミン、チアミンモノリン酸およびチアミンピロリン酸として存在している。チアミン生合成可能な真菌においては、前駆体である２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン（ピリミジン核）と４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール（チアゾール核）が生合成された後、これら２つの前駆体が結合してチアミンモノリン酸となり、最後に脱リン酸化を経てチアミンが生合成される。さらにチアミンはチアミンピロホスホキナーゼによって修飾されてチアミンピロリン酸となり、生体内でエネルギー代謝等に関わる酵素の補酵素として利用される。
【０００３】
チアミン生合成可能な真菌のチアミンの生合成に関与する遺伝子は、外部環境に存在するチアミンにより発現が抑制されることが知られている。例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおいて、ピリミジン核合成酵素遺伝子（ｎｍｔＡ）とチアゾール核合成酵素遺伝子（ｔｈｉＡ）は、最終生産物であるチアミンピロリン酸により発現が抑制されることが知られている。つまり真菌のチアミン生産量は複数のチアミン生合成に関与する遺伝子群の発現段階で厳密に制御されており、そのためチアミンを高生産する変異微生物の取得は困難であった。
【０００４】
チアミンはエネルギー生産に欠かせない補酵素（ビタミンＢ１）として知られており、各種栄養補助食品にも利用されている有用物質である。
【０００５】
他にも清酒醸造において、発酵もろみ中にチアミンを添加することで、もろみ中のピルビン酸濃度が減少して、ピルビン酸から酵母により生合成される木香様臭やつわり香といった不快臭の発生を予防できることが知られている。
【０００６】
遺伝子組換えによりチアミンを高生産するようになった微生物として細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓがあるが（非特許文献１参照）、真菌ではこれまでに報告がない。
【０００７】
チアミンの製造方法は、合成法については広く知られている（非特許文献２、３参照）が、微生物による生産については知られていない。また、チアミンピロリン酸の製造方法（特許文献１参照）など、遊離チアミンを出発点としてチアミンの類縁体を製造する方法が報告されているが、これらはすべて原料にチアミンを必要としている。
【０００８】
応用面については、高栄養酵母および酵母製品の製造方法として、酵母の培養条件を検討することでチアミン等を増加させる方法が報告されている（特許文献２参照）。しかし、この方法では、培養条件が制限されるため、汎用性という点で問題がある。また、清酒及び酒類の製造方法として、チアミン輸送能が低下した酵母変異株を用いて酒類の製造を行い、酒中のチアミン残存量を増加させる方法が報告されている（特許文献３参照）。しかし、これは原料由来のチアミンの減少量を抑制する方法であり、チアミンの生産量を増加させる方法ではない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８７， ２３， ８１２７， ２００５
【非特許文献２】化学大辞典 第１版（１９８９） ｐ１３８９ 東京化学同人
【非特許文献３】同志社家政 ｖｏｌ．２６ ｐ１３−１８ Ｄｅｃ． １９９２
【特許文献１】特開Ｈ０８−９９８５号公報
【特許文献２】特開２００６−１４７１９号公報
【特許文献３】特開Ｈ１１−２４３９４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非特許文献１に記載されている方法は、培養時にチアミンの添加が必要であるため、培養条件の汎用性という点で問題があり、実用的なチアミン高生産方法ではない。
【００１１】
また、非特許文献２、３に記載されている方法はチアミンの合成法である。消費者の健康志向の高まりと共に、合成品より天然品を求める傾向が強くなっている。特に大きな市場となった健康食品分野では顕著であり、天然チアミンの工業的製造法が望まれている。
【００１２】
特許文献１に記載されている方法はチアミンを変換する方法であり、生産する方法ではない。
【００１３】
特許文献２に記載されている方法は、培養条件が制限されており、チアミン製造に種々の制約があるため特定の目的にしか応用できず、広い分野への応用は不可能である。
【００１４】
特許文献３に記載されている方法は、原料由来のチアミンの減少量を抑制する方法であり、チアミンの生産量を増加させる方法ではない。
【００１５】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、真菌を宿主とするチアミンを高生産する変異微生物を創製することである。これを用いて通常の培養しやすい条件でチアミンを効率よく大量に生産でき、これによって食品分野や医薬分野など幅広い分野でチアミン含有製品を工業的に製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。すなわち、
＜１＞チアミンを生合成することのできる真菌より得られる、チアミンを高生産する変異微生物を提供することである。
＜２＞チアミンの生合成に関与する２つの遺伝子である２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン合成酵素遺伝子、４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール合成酵素遺伝子、およびチアミンの修飾に関与するチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子の合計３遺伝子を、それぞれ宿主内でチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結して、宿主に同時に導入することで得られた前記＜１＞に記載の変異微生物を提供することである。
＜３＞宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の変異微生物である。
＜４＞宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の変異微生物である。
＜５＞宿主に用いた酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である前記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の変異微生物である。
＜６＞前記＜１＞または＜２＞に記載の方法で得られたチアミンを高生産するようになった変異糸状菌株ＴＨ１０９１（寄託微生物受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−２５６）である。
【発明の効果】
【００１７】
本研究者らが鋭意研究の結果、真菌である糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを宿主として取得したチアミンを多く生産する変異微生物は、培養開始時にチアミンを必要とせずに宿主の３〜４倍のチアミンを菌体内に蓄積した。また、チアミンの生合成遺伝子およびチアミンの修飾遺伝子をチアミンによる発現制御のかからない発現プロモーターに連結して宿主に形質転換することを特徴とするため、特別な培地・培養条件を必要とせずチアミンを高生産させられるという利点がある。また、この方法で取得したチアミンを多く生産する変異微生物は、外部からのチアミン取り込み量も減少するため、培養菌体と培地を含む培養系全体からチアミンを回収することで、より多くのチアミンを得ることができる。さらに、チアミンピロリン酸を高生産する変異微生物については過去に報告がなく、新規な特徴である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
宿主に用いる真菌としてはチアミン生合成能を有していれば、その他の制限はないが、例えば糸状菌であればＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、酵母であればＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属が好ましく、糸状菌であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅがより好ましい。これらに対して前述のようにチアミンの生合成遺伝子群およびチアミンの修飾遺伝子をチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結して導入することで、チアミン高生産性を付与して有効に利用することができる。
【００１９】
本発明において、宿主に形質転換する三つの遺伝子としては２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン合成酵素遺伝子、４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール合成酵素遺伝子およびチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子であれば特に制限はないが、好ましくは宿主由来の該遺伝子を用いるのがよい。発現プロモーターとしてはチアミンによる発現抑制を受けない高発現プロモーターであれば特に制限はないが、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター（ＰｐｔｒＡ）またはａｍｙＢ遺伝子のプロモーター（ＰａｍｙＢ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明のチアミンを多く生産する変異微生物はチアミンを生産させるために特別な培地を必要としないが、利用するプロモーターによっては発現の誘導に必要な成分を添加する必要がある。例えば本発明のＴＨ１０９１はチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子の発現プロモーターとしてＰａｍｙＢを使用しているため、培地に炭素源として可溶性デンプン、デキストリンまたはイソマルトースのような多糖類の添加が必要である。
【実施例１】
【００２１】
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（ｔｈｉＡ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡの構築）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｔｈｉＡ遺伝子（配列番号３、翻訳されたアミノ酸配列は配列番号４）は、プロモーター領域の一遺伝子変異（Ａ −６８ Ｇ）によりチアミンによる発現抑制が失われ、さらにこの上記変異は宿主に対しチアミンの代謝アナログであるピリチアミンに対する耐性を付与することが知られている。この変異遺伝子（ｐｔｒＡ遺伝子）を薬剤耐性遺伝子マーカーとして、またｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター領域を遺伝子発現用のプロモーターとして含んだプラスミドｐＰＲｅ１のｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター下流にＫｐｎＩサイトを利用して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｎｍｔＡ遺伝子（配列番号１、翻訳されたアミノ酸配列は配列番号２）を挿入した。ｎｍｔＡ遺伝子はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの全ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法により増幅した。ｎｍｔＡ遺伝子の増幅には適当な制限酵素サイトを付加したプライマーを用いた。具体的には、両端にＫｐｎＩサイトを付加した上流プライマー（ａ）（配列表７）、下流プライマー（ｂ）（配列表８）とを使用した。
（ａ）上流プライマー、５’−ＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＧ−３’
（ｂ）下流プライマー、５’−ＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＧＣＧＣＴＡＧＡＧＧＣ−３’
【００２３】
ＰＣＲの反応条件は、（９８℃， １０秒）→（６０℃， ３０秒）→（７２℃， ２分）で３０サイクル行った。ＰＣＲ増幅後の反応液は０．８％アガロース電気泳動により分離後、ｎｍｔＡ遺伝子である１．２ ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡＣＥＬＬ（第一化学薬品株式会社）を用いて精製後、ＴベクターｐＣＲ２．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ株式会社）を用いてサブクローニングした。ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０）を用いてサブクローニングした塩基配列に非特異的な変異が無いことを確認した後、制限酵素ＫｐｎＩによりｎｍｔＡ遺伝子を切り出し、プラスミドｐＰＲｅ１のＫｐｎＩサイトに挿入した。
【００２４】
（ｔｈｉＰ遺伝子発現プラスミドｐＴＡｅｘ３−ｔｈｉＰの構築）
栄養要求性を相補する遺伝子マーカーとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ 由来ａｒｇＢ遺伝子を、チアミンによる発現抑制を受けない遺伝子発現用プロモーターとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｙＢ遺伝子のプロモーターを含むプラスミドｐＴＡｅｘ３（独立行政法人酒類総合研究所）を利用し、ａｍｙＢ遺伝子のプロモーター下流のＥｃｏＲＩサイトを利用してＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｔｈｉＰ遺伝子（配列番号５、翻訳されたアミノ酸配列は配列番号６）を挿入した。ｔｈｉＰ遺伝子はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。ｔｈｉＰ遺伝子の増幅にはｔｈｉＰ全長を増幅できるプライマーを用いた。具体的には、上流プライマー（ｃ）（配列表９）、下流プライマー（ｄ）（配列表１０）とを使用した。
（ｃ）上流プライマー、５’−ＴＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＣＣ−３’
（ｄ）下流プライマー、５’−ＣＴＡＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴ−３’
【００２５】
ＰＣＲの反応条件は、（９８℃， １０秒）→（６０℃， ３０秒）→（７２℃， ２分）で３０サイクル行った。増幅した断片は、ｎｍｔＡ遺伝子と同様に一度ｐＣＲ２．１に連結し、ＤＮＡシークエンスにより非特異的な変異が含まれていないことを確認した後、ｐＣＲ２．１に存在するＥｃｏＲＩサイトを利用して再び切り出してプラスミドｐＴＡｅｘ３のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
【００２６】
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅへの各プラスミドの形質転換）
ａｒｇＢ遺伝子が欠損したアルギニン栄養要求性株であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株（ 独立行政法人酒類総合研究所 ）にプラスミドｐＴＡｅｘ３−ｔｈｉＰを形質転換してチアミンピロリン酸キナーゼ高発現形質転換株を得た。さらに該株にプラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡを形質転換し、最終的にｎｍｔＡ遺伝子、ｔｈｉＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子の三つの遺伝子がチアミンピロリン酸により発現抑制されない三重変異微生物を得た。以下にその手法を示す。
【００２７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株をＤＰＹ培地（０．５ ％ 酵母エキス、１ ％ ポリペプトン、２ ％ デキストリン、０．５ ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５ ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ｐＨ ６．５）で３０℃、１６０ ｒｐｍ、２４時間回転振とう培養後、得られた菌体を３Ｇ−１ブフナー型ガラスフィルターで回収した後、滅菌水で洗浄した。この菌体をＴＦ液（１）（０．６ Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ ｍＭ マレイン酸緩衝液 ｐＨ ５．５、０．５ ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ （タカラバイオ株式会社））に懸濁し、３０℃、２時間、緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化した。得られたプロトプラストを乾熱滅菌した ３Ｇ−３ブフナー型ガラスフィルターでろ過して残存する菌体を除去した後、ＴＦ液（２）（１．２Ｍ ソルビトール、５０ ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ トリスー塩酸緩衝液 ｐＨ ７．５）で２回洗浄し、最後に２×１０８ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＴＦ液（２）に懸濁してコンピテントセルを調製した。
【００２８】
上記コンピテントセル０．２ ｍｌに導入するｔｈｉＰ遺伝子発現プラスミドｐＴＡｅｘ３−ｔｈｉＰを１０ μｇ加え、氷上で３０分間静置後、ＴＦ液（３）（６０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ４０００、５０ ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ ７．５）１．３５ ｍｌ を加えてさらに１５分間室温で静置した。１０ ml の ＴＦ液（２）を加え、１８００ rpm、５ 分間 遠心して、プロトプラストを回収し、再度ＴＦ液（２）０．５ ｍｌ に懸濁した。このプロトプラスト懸濁液を再生用下層最少培地（Ｃｚａｐｅｃ−Ｄｏｘ（ＣＤ）最少培地（０．６ ％ ＮａＮＯ３、０．０５２ ％ ＫＣｌ、０．１５２ ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２１ ％ １ Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ ％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ＊ ｐＨ ６．５ ＊Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ：０．１ ％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８８ ％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ ％ ＣｕＳＯ4・5Ｈ2Ｏ、０．０１５ ％ ＭｎＳＯ4・4Ｈ2Ｏ、０．０１ ％ Ｎａ2ＢＯ7・１０Ｈ2Ｏ、０．００５ ％ （ ＮＨ4 ）６Ｍｏ7Ｏ24・4Ｈ2Ｏ）、１ %Ｇｌｕｃｏｓｅ、１．２ Ｍ ソルビトール、２ % Ａｇａｒ）上にのせ、あらかじめ４５℃に保温しておいた再生用上層最少培地（下層培地組成のＡｇａｒ濃度のみを０．５％ に変えたもの）５ ｍｌを重層してプロトプラストを包埋した。３０℃、１０日間培養後、生育してきた形質転換体を釣菌した。純化のためＣＤ最少培地で ５ 回継代培養した。
【００２９】
次に上記形質転換体から得られた、チアミンピロリン酸キナーゼ高発現株を宿主としてｔｈｉＡ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡを形質転換する際は、プロトプラスト作成用の菌体の培養に５ % Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＣＤ最少培地を用い、さらに形質転換後の再生用上層および下層培地には０．１ ｐｐｍ ピリチアミンをオートクレーブ滅菌後に添加した。上記と同様の操作でｔｈｉＡ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＰＲｅ１−ｎｍｔＡを用いて形質転換を行ったプロトプラストを、０．１ ｐｐｍピリチアミン添加再生培地で３０℃、１０日間培養後、ピリチアミンに耐性を示して生育してきた形質転換体を釣菌した。純化のため０．１ ｐｐｍ ピリチアミン添加、２ % Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＣＤ最少培地で ５ 回継代培養した。
【００３０】
（ｔｈｉＡ遺伝子、ｎｍｔＡ遺伝子およびｔｈｉＰ遺伝子脱抑制株の選抜方法）
純化した形質転換体から全ＲＮＡを抽出し、ｔｈｉＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子およびｎｍｔＡ遺伝子をプローブとしてノザン解析を行い、これら三つの遺伝子のチアミンによる発現抑制が失われている（脱抑制している）ことを確認した。
【００３１】
全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポン・ジーン）を用いて抽出し、変性０．８％アガロース電気泳動により分離してナイロンメンブレン・ハイボンドＮ＋ （アマシャムバイオサイエンス株式会社）にブロットした。プローブとして、それぞれｔｈｉＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子またはｎｍｔＡ遺伝子の全塩基配列を用いた。プローブのラベリングおよびシグナルの検出はＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍs（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いた。宿主であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株はチアミン添加時にｔｈｉＡ遺伝子、ｎｍｔＡ遺伝子およびｔｈｉＰ遺伝子由来のシグナルが消失するが、左記の三つの遺伝子の発現プラスミドが導入された形質転換体では、チアミン添加時もこのシグナルが消失しない。これに基づいて目的の変異微生物を選抜した。
【００３２】
以上の方法を用いて創製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの変異微生物として、ＴＨ１０９１株を挙げることができる。ＴＨ１０９１株のチアミン生産能力以外の菌学的性質はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｍ−２−３株に準じる。
【００３３】
本願の発明に係るＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｔｈｉＡ遺伝子、ｎｍｔＡ遺伝子、ｔｈｉＰ遺伝子脱抑制変異微生物は、本株ばかりでなく、経代した子孫にも受け継がれ、発明として広い利用形態があるものと認められる。
【００３４】
（培養菌体からのチアミン抽出）
変異微生物を２％デキストリン、ＣＤ最少液体培地で３０℃、１８０ｒｐｍで３６時間回転振とう培養した。培養菌体を３Ｇ−１ブフナー型ガラスフィルターで回収、滅菌水で洗浄し、チアミン抽出用サンプルとした。チアミン抽出はＴｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ（ＴＣＡ）抽出法（日本食品科学工学会 新・食品分析法 ｐ３７０（１９９６））に準じて行った。脱水後、菌体を菌体重量の１０倍量の５ ％ ＴＣＡに懸濁し、室温で３０分間２００ ｒｐｍ振とう抽出を行った。抽出液を遠心し（１５,０００ｒｐｍ １０分）上清を回収し、１／１０倍量の中和溶液を加え、０．４５μｍフィルターを通して菌体抽出液とした。
【００３５】
（チアミンの分析）
チアミンの分析は、既報（本江 薫 ビタミン ６８巻 ７号 １９９４）に若干の変更を加えたポストカラムＨＰＬＣ法によって行った。遊離型のチアミンとチアミンモノリン酸、チアミンピロリン酸の標準品を用いて検量線を作成した。移動相としてｓｏｌｖｅｎｔＡ（０．２ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、ｓｏｌｖｅｎｔＢ（０．２ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ2Ｏ、０．０６ Ｍ ＴＣＡ、０．０５ Ｍ ＮａＯＨ、０．０２ Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ）の混合比をｓｏｌｖｅｎｔＡ：ｓｏｌｖｅｎｔＢ＝９２：８の一定とし、流速を １ ｍｌ／分とした。カラム通過後の移動相に、発色液（ ２５０ ｐｐｍ Ｋ３［Ｆｅ(ＣＮ)６］、５ ％ ＮａＯＨ ） を流速 ０．５ ｍｌ／分で混合し、４０℃で６０秒反応させ、反応液の蛍光（励起波長： ３７５ｎｍ、検出波長 ４５０ｎｍ）を測定した。ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓ６００Ｅシステム（Ｗａｔｅｒｓ，ＭＡ．ＵＳＡ）を、分離カラムはＷａｔｅｒｓ ｐｕｒｅｓｉｌＴＭＣ１８（担体直径５ μｍ、カラム内径４．６ ｍｍ、カラム長さ２５０ ｍｍ）を用いた。クロマトグラム波形解析にはＳｍａｒｔＣｈｒｏｍ（株式会社ケーワイエーテクノロジーズ）を用いた。図３にＴＨ１０９１を含む数株の菌体中のチアミン濃度の分析結果を示す。
【００３６】
図３に示したように、三重変異微生物の菌体中のチアミン濃度は、プラスミドｐＴＡｅｘ３のみを組み込んだプラスミドコントロール株と比較して１．７〜４．３ 倍に増大していることがわかる。このうちチアミン濃度が最も増大した（４．３倍）株をＴＨ１０９１株とし、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託した（寄託微生物受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−２５６）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、チアミン（ビタミンB1）を効率的に高生産することが可能となる。従って、ビタミンB1に関する幅広い分野、例えば、健康食品（特定保健食品、栄養機能食品）、栄養補助食品、医薬、飲料、酒類などの分野で、ビタミンB1を含有した製品を、工業的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、プラスミドｐＰＲｅ１の構成を説明する図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＡｅｘ３の構成を説明する図である。
【図３】図３は、三重変異微生物の菌体内チアミン濃度を示す図表である。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号７：フォワードプライマー ｎｍｔＡ
配列番号８：リバースプライマー ｎｍｔＡ
配列番号９：フォワードプライマー ｔｈｉＰ
配列番号１０：リバースプライマー ｔｈｉＰ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアミン生合成可能な真菌から得た、チアミンを高生産する変異微生物。
【請求項２】
チアミンの生合成に関与する２つの遺伝子である２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン合成酵素遺伝子、４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール合成酵素遺伝子、およびチアミンの修飾に関与するチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子の合計３遺伝子を、それぞれ宿主内でチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結して、宿主に同時に導入することで得られた請求項１記載の変異微生物。
【請求項３】
宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である請求項１、２記載の変異微生物。
【請求項４】
宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである請求項１、２記載の変異微生物。
【請求項５】
宿主に用いた酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である請求項１、２記載の変異微生物。
【請求項６】
請求項１、２記載の方法で得られたチアミンを高生産するようになった変異糸状菌株ＴＨ１０９１（寄託微生物受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−２５６（受領日２００６年８月１４日））。
【請求項１】
チアミン生合成可能な真菌から得た、チアミンを高生産する変異微生物。
【請求項２】
チアミンの生合成に関与する２つの遺伝子である２−メチル−４−アミノ−５−ヒドロキシメチルピリミジン合成酵素遺伝子、４−メチル−５−ヒドロキシエチルチアゾール合成酵素遺伝子、およびチアミンの修飾に関与するチアミンピロホスホキナーゼ遺伝子の合計３遺伝子を、それぞれ宿主内でチアミンにより発現抑制を受けない発現プロモーターに連結して、宿主に同時に導入することで得られた請求項１記載の変異微生物。
【請求項３】
宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である請求項１、２記載の変異微生物。
【請求項４】
宿主に用いた糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである請求項１、２記載の変異微生物。
【請求項５】
宿主に用いた酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である請求項１、２記載の変異微生物。
【請求項６】
請求項１、２記載の方法で得られたチアミンを高生産するようになった変異糸状菌株ＴＨ１０９１（寄託微生物受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−２５６（受領日２００６年８月１４日））。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−５４５１３（Ｐ２００８−５４５１３Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３２０４０（Ｐ２００６−２３２０４０）
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者名〕社団法人 日本農芸化学会〔刊行物名〕日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会講演要旨集〔発行年月日〕２００６年３月５日〔研究集会名〕日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会〔主催者名〕社団法人日本農芸化学会〔開催日〕平成１８年３月２６日
【出願人】（５９１１１８７７５）白鶴酒造株式会社 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者名〕社団法人 日本農芸化学会〔刊行物名〕日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会講演要旨集〔発行年月日〕２００６年３月５日〔研究集会名〕日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会〔主催者名〕社団法人日本農芸化学会〔開催日〕平成１８年３月２６日
【出願人】（５９１１１８７７５）白鶴酒造株式会社 (16)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]