トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質を認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ
【課題】 ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに係る研究開発において、重要なツールとしての機能を果たし得る、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体を提供するとともに、そのモノクローナル抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを簡便かつ高感度に検出するキット、およびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を簡便かつ高感度に検出する方法を提供する。
【解決手段】 本発明に係るモノクローナル抗体は、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応する。本発明に係るモノクローナル抗体によれば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬをはじめとする酸化ＬＤＬが関与する様々な疾患の解明、治療、診断、評価などを、より効果的かつ簡便に行うことができるとともに、薬効に優れた医薬組成物の開発に寄与し、提供することができる。
【解決手段】 本発明に係るモノクローナル抗体は、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応する。本発明に係るモノクローナル抗体によれば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬをはじめとする酸化ＬＤＬが関与する様々な疾患の解明、治療、診断、評価などを、より効果的かつ簡便に行うことができるとともに、薬効に優れた医薬組成物の開発に寄与し、提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよび被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）は、少なくとも肝疾患患者血清中に出現する低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）である。ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは中性脂肪であるトリアシルグリセロール（トリグリセリド、トリ−Ｏ−アシルグリセリン；ＴＧ，ＴＡＧ）の含有量が高いことを特徴とし、この点で、コレステロールの含有量が高い正常なＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）とは異なるリポタンパク質である。肝疾患の進行に伴いＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの血清中濃度は増加し、肝疾患の末期では血清中に存在するリポタンパク質の大部分を占めるのに対し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の血清中濃度は極端に減少する（非特許文献１）。
【０００３】
また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは培養マクロファージを泡沫化する。そして、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬによるマクロファージ泡沫化率と酸化ＬＤＬの一種であるマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）の血清中濃度とが正比例すること（非特許文献１）、健常者血漿中には過酸化ＴＧがほとんど検出されないのに対し、肝疾患患者血漿中には、過酸化ＴＧの著しい増加が見られること（非特許文献２）などから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは酸化ＬＤＬの一種であるとされている。
【０００４】
すなわち、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、肝疾患のみならず酸化ＬＤＬが関与する種々の疾患に係る重要な物質であると考えられ、基礎医学、臨床医学、創薬などの分野においてさらなる研究が要求されているが、その合成経路、代謝経路などについては未だ不明な点が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｇａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、第１４６巻、第３２９〜３３５頁、２００５年
【非特許文献２】Ｈｕｉ ＳＰ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ、第３８巻、第１２８７〜１２９２頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに係る研究開発において、重要なツールとしての機能を果たし得る、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体を提供するとともに、そのモノクローナル抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを簡便かつ高感度に検出するキット、およびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を簡便かつ高感度に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原としてハイブリドーマを作製し、選択されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が、肝疾患患者血清中に存在するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体と特異的に反応することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体。
【０００９】
（２）自己抗体がヒトの自己抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体。
【００１０】
（３）トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）が肝疾患患者から採取された血清に含まれるトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
【００１１】
（４）自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、（１）から（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【００１２】
（５）受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマにより産生される、（１）から（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【００１３】
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【００１４】
（７）受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５である、（６）に記載のハイブリドーマ。
【００１５】
（８）（１）から（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）検出用キット。
【００１６】
（９）被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
【００１７】
（１０）被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
【００１８】
（１１）自己抗体がヒトの自己抗体である、（９）または（１０）に記載の方法。
【００１９】
（１２）モノクローナル抗体が、肝疾患患者から採取された血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体である、（９）から（１１）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（１３）自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、（９）から（１２）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るモノクローナル抗体、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、モノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法によれば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬをはじめとする酸化ＬＤＬが関与する様々な疾患の解明、治療、診断、評価などを、より効果的かつ簡便に行うことができるとともに、薬効に優れた医薬組成物の開発に寄与し、提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】上下左側の図は、いずれも、血清から超遠心により分離した総リポタンパク質画分について、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った図である。一方、上下右側の図は、いずれも、ゲル濾過クロマトグラフィーを行って得られた各溶出液における各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。図中、ＴＣは総コレステロール、ＰＬはリン脂質、ＦＣは遊離コレステロール、ＴＧは中性脂肪を示す。また、いずれの図も、横軸はフラクションすなわちサイズを示し、横軸のプラス方向（右方向）に位置するほどサイズが小さいことを示す。
【図２】健常者（Ｎ）および肝疾患末期患者（Ｐ）の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図３】Ｇ１１−２抗体および抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体を用いて、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図４】磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体に特異的に反応した抗原について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図５】血清から超遠心により分離した上層画分、中層画分および下層画分について、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図６】検出抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体、抗ヒトＩｇＡ（α）抗体、抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ５μ抗体および抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体を用いて、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図７】凍結融解をそれぞれ０回、１回、２回、３回、４回、５回および６回行った血清サンプルについて、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図８】健常者および肝疾患患者の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図９】健常者、軽中度群および重度群の血清について、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行い測定した吸光度の値を、健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計した結果を示す図である。
【図１０ａ】健常者、脂質異常症患者および肝疾患患者の血清について、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図１０ｂ】各サンプルの吸光度の測定値を、各サンプルの血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度の値で除した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよび被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法について詳細に説明する。本発明に係るモノクローナル抗体は、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応する。
【００２４】
本発明におけるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してＴＧの重量割合が大きいＬＤＬである。また、本発明においてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、酸化ＬＤＬの性質を有しており、マクロファージを泡沫化するＬＤＬである。このようなＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬには、中間比重リポタンパク質｛Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＤＬ（ミッドバンドともいい、分画としてＩＤＬに相当するレムナントリポタンパク質を含む趣旨である）｝の他、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄ−ＬＤＬ、変性ＬＤＬ）といわれる、粒子径が２５．５ｎｍ以下であり、比重で分画した場合に１．０４０〜１．０６３のＬＤＬに相当するリポタンパク質が含まれる。
【００２５】
ここで、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合について測定した結果の典型例を図１および表１に示す。図１の上下左側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分について、２８０ｎｍの吸光度を測定しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果を示す図であり、図１の上下右側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分についてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られた各溶出液について各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。一方、表１は、肝疾患患者４名および健常者７名について上記の方法により各脂質の濃度を測定し、平均値と標準偏差を算出した結果を示している。
【００２６】
【表１】
【００２７】
図１の上下左側の図に示すように、肝疾患患者においてはＶＬＤＬおよびＨＤＬが消失し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズを有するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが高濃度に存在する。その高濃度に存在するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合は、図１右側および表１に示すように、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合と比較して明らかに大きい。しかしながら、表１に示すように、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおける各脂質重量割合の標準偏差の値が大きいことから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合には、ある程度のばらつきがあることがわかる。
【００２８】
また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの粒子サイズは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに近似した結果が得られるが、被験者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
【００２９】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの電荷については、アガロースゲル電気泳動法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに近似した結果またはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してやや負電荷であることを示す結果が得られるが、被験者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
【００３０】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、肝疾患患者の血清から採取されるが、肝疾患のみならず、種々の疾患、特に、酸化ストレスの関与する疾患の患者やその罹患が疑われる者の血清に存在すると考えられている。そのような疾患としては、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝線維症、ＦＩＣ１欠損（良性反復性肝内胆汁うっ滞症、バイラー病）、ＢＳＥＰ欠損（進行性家族性肝内胆汁うっ滞症）などを含む先天性胆汁うっ滞性疾患、脂肪性肝炎などの肝疾患の他、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高トリグリセリド血症などの脂質異常症、脳梗塞、虚血性心疾患、大動脈瘤、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症などの動脈硬化性疾患、糖尿病、高血圧症などを挙げることができる。
【００３１】
自己抗体は一般に、自己の生体内で産生されたタンパク質や細胞、組織などの物質を抗原とする抗体のことをいい、自己免疫疾患の他、種々の癌などの場合に生体内で産生されることが確認されている。
【００３２】
本発明において自己抗体としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類の自己抗体を挙げることができるが、ヒトの自己抗体であることが好ましい。また、自己抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれも挙げることができるが、血清中の濃度が比較的大きいＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭであることが好ましい。
【００３３】
本発明において、「認識する」は、「相互作用する」、「結合する」、「反応する」と交換可能に用いられ、「反応する」もまた、「相互作用する」、「結合する」、「認識する」と交換可能に用いられる。また、本発明において、抗体が、ある特定の抗原（免疫原）に対し「特異的に反応する」とは、前記特定抗原に対して反応性があることが明らかであればよい。前記特定抗原に対し「特異的に反応する」とは、他の抗原に全く反応しない場合も含むが、他の抗原に対し反応する場合も含む。
【００３４】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、Ｆａｂ領域において抗原と特異的に反応する。すなわち、本発明に係るモノクローナル抗体１分子には、抗原と特異的に反応する部位が２箇所存在するため、本発明に係るモノクローナル抗体１分子が特異的に反応する自己抗体は１または２である。よって本発明における自己抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選ばれる１または２であり、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２であることが好ましい。
【００３５】
次に、本発明に係るハイブリドーマは、本発明に係るモノクローナル抗体を産生する。本発明に係るハイブリドーマの作製は、当業者により適宜選択可能な任意の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、第７２頁、１９８３年）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、第７７−９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５年）などの方法の他、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを有する方法を挙げることができる。
【００３６】
（ｉ）まず、免疫原を調製する。免疫原は、どのような方法により調製してもよいが、本発明においては、血清からＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離した後、限外濾過により濃縮し、続いて透析することにより調製することができる。なお、この場合において、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体は血清から分離したＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分に含まれる。
【００３７】
ここで、血清にＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることを確認する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法として、アガロースゲル電気泳動法を挙げることができる。本発明においては、被験者血清および健常者血清をアガロースゲル電気泳動に供することにより、被験者血清においてα位のバンドが検出されないか、あるいは著しく減少し、かつ健常者血清と比較して陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された場合に、その被験者血清にはＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれると判定することができる。
【００３８】
また、血清からＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法としては、例えば、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４−１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従い、密度勾配遠心法を用いて血清から分離した総リポタンパク質画分をゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法を挙げることができる。
【００３９】
（ｉｉ）次に、分離したＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を免疫原として動物を免疫する。免疫は、適宜常法を用いて行うことができる。また、免疫の対象となる動物は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどを挙げることができる。
【００４０】
（ｉｉｉ）続いて、免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などを挙げることができる。さらに、ハイブリドーマを得るため、採取した抗体産生細胞を他の細胞と融合させる。抗体産生細胞を採取する方法および細胞の融合方法は、当業者が適宜選択可能な方法を挙げることができる。また、抗体産生細胞に融合させる細胞としては、増殖能力の強い細胞を用いることが好ましく、例えば、一般に入手可能なミエローマ細胞の細胞株を使用することができる。なお、使用する細胞株は、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
【００４１】
（ｉｖ）次に、作製したハイブリドーマから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法やイムノブロット法などの常法を用いて、当業者が適宜選択可能な手法により行うことができる。ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングする場合は、例えば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡをハイブリドーマの培養上清について行い、適当な標識をした抗（免疫動物）抗体によりＥＬＩＳＡの反応を検出し、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに対して反応が大きいとともにｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに対して反応が小さい培養上清を特定することにより、ハイブリドーマを特定することができる。なお、血清に由来するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにはＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体が付着していると考えられるため、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡをスクリーニングに用いることができる。
【００４２】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを有する方法により得られたハイブリドーマを本発明に係るハイブリドーマとすることができるが、クローニングないしスクリーニングをさらに行うことにより細胞を純化し、本発明に係るハイブリドーマとすることができる。そのようなクローニングないしスクリーニング方法としては、例えば、限界希釈法、トリプシン濾紙法、ペニシリンキャップ法などの方法を挙げることができる。
【００４３】
また、このようにして得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる他、前記方法のステップ（ｉｉｉ）において採取される抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる。ハイブリドーマまたは抗体産生細胞からモノクローナル抗体を抽出する方法としては、例えば、細胞培養法や腹水形成法などの常法を挙げることができる。抽出したモノクローナル抗体は、例えば、硫安塩析法、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択し、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４４】
得られたモノクローナル抗体のクラスの判定は、適宜常法に従って行うことができ、例えば、免疫した動物がマウスの場合は、ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）などを用いて行うことができる。なお、本発明に係るモノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれも用いることができる。
【００４５】
本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質、酵素などにより標識して用いることができる。また、必要に応じて、ポリスチレン製プレート、ポリプロピレン製プレート、シリコン製プレート、ポリスチレン製マイクロビーズ、磁気ビーズ、ラテックス粒子などの担体に固着させて用いることができる。
【００４６】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ヒト免疫グロブリン産生能を有する動物に免疫することにより、ヒト抗体として得ることができる他、遺伝子工学的手法を用いて、免疫動物由来の可変部とヒト由来の定常部とからなるキメラ抗体として得ることもでき、免疫動物由来の超可変部を有し、それ以外の抗体部分はヒト由来であるヒト化抗体として得ることもできる。
【００４７】
なお、本発明に係るモノクローナル抗体として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１０年２月２日付で受領されており、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。同様に、本発明に係るハイブリドーマとして、上記の受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
次に、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットを提供する。本発明に係るモノクローナル抗体はＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対して特異的に反応するため、本発明に係るモノクローナル抗体を用いてこの自己抗体を検出することにより、この自己抗体が認識するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを検出することができることから、本発明に係るキットは、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを検出することを目的として使用することができる。酸化ＬＤＬの一種であるとされているＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、保管中に酸化が進行して壊れるなどの虞がある不安定な物質であるのに対し、免疫グロブリンタンパク質である自己抗体は、長期保存および凍結融解を繰り返しても高感度に検出することができる安定な物質であることから、本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットにより簡便かつ高感度なアッセイが可能となる。
【００４９】
なお、本発明に係るキットは、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質、緩衝液、器具など、その特徴を損なわない限りにおいて、その構成物として含んでもよい。
【００５０】
さらに本発明は、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法を提供する。なお、本発明に係る自己抗体の検出方法には、本発明に係る自己抗体の検出方法を損なわない限り、インキュベート工程や洗浄工程などを含んでいてもよい。
【００５１】
本発明に係る自己抗体を検出する方法は、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法であって、
（ｉ）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（ｉｉ）前記複合体を検出する工程（検出工程）
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００５２】
（ｉ）複合体形成工程において複合体を形成させる方法としては、当業者が適宜選択可能な任意の方法を挙げることができる。そのような方法としては、例えば、モノクローナル抗体を含む溶液と血清とを混合させて複合体を形成させる方法の他、血清成分を担体に固着させてモノクローナル抗体を含む溶液と反応させる方法、モノクローナル抗体を担体に固着させて血清と反応させる方法などを挙げることができる。
【００５３】
（ｉｉ）検出工程において複合体を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、間接抗体法、ラテックス凝集法、比濁法、ＣＬＥＩＡ法などの常法の他、例えば、モノクローナル抗体あるいは血清成分に予め標識をし、この標識を検出する方法を挙げることができる。
【００５４】
次に、本発明に係る自己抗体を検出する方法の異なる態様は、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法であって、
（ｉ）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を担体に固着する工程（固着工程）
（ｉｉ）担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程（固着複合体形成工程）
（ｉｉｉ）前記複合体を検出する工程（固着複合体検出工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する。
【００５５】
（ｉ）固着工程において、モノクローナル抗体を固着する担体は任意のものを用いることができ、そのような担体としては、例えば、上述の、本発明に係るモノクローナル抗体を固着させて用いることができる担体と同様のものを挙げることができる。また、固着する方法は特に限定されず、用いる担体により適宜設定して行うことができる。
【００５６】
（ｉｉ）固着複合体形成工程および（ｉｉｉ）固着複合体検出工程における、固着複合体を形成させる方法および固着複合体を検出する方法としては、上述の（ｉ）複合体形成工程および（ｉｉ）検出工程と同様の方法を挙げることができる。
【００５７】
本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法は、肝疾患のみならず酸化ＬＤＬが関与する種々の疾患の解明、診断、重症度の評価、治療効果の評価の他、リポタンパク質の酸化度の評価などに用いることが可能である。
【００５８】
以下、本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよび被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５９】
＜実施例１＞ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原とするモノクローナル抗体の作製
（１）アガロースゲル電気泳動によるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの確認
肝疾患末期患者１名および健常者１名から採取した血液を室温で１時間静置した後、３５００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行うことにより、肝疾患末期患者血清および健常者血清を得た。得られた血清を１．５μＬずつアガロースゲル（ユニバーサルゲル／８；ヘレナ研究所社）に塗布し、ｐＨ８．６、イオン強度０．０６のバルビタール緩衝液中において、１００Ｖ、１５０Ｗで４５分間電気泳動を行った後、ドライヤーを用いてゲルを乾燥させた。続いて、０．０３％（ｗ／ｖ）のＦａｔ Ｒｅｄ ７Ｂ（ヘレナ研究所社）を含むメタノール２０ｍＬにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２滴加え、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を４ｍＬ加えることにより調製した染色液に、乾燥させたゲルを１０分間浸漬して染色を行った後、７５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液に１０秒間浸漬することにより脱色を行った。
【００６０】
図２に示すように、健常者血清（Ｎ）ではＨＤＬに相当するα位およびＬＤＬに相当するβ位にそれぞれバンドが検出された。一方、肝疾患末期患者血清（Ｐ）ではα位のバンドは検出されなかった。また、健常者血清（Ｎ）のβ位のバンドに比して、肝疾患末期患者血清（Ｐ）では陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された。これらの結果から、この肝疾患末期患者血清にはＨＤＬが含まれず、かつ、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された。
【００６１】
（２）免疫原の調製
［２−１］密度勾配遠心法による総リポタンパク質画分の分離
本実施例（１）でＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された肝疾患末期患者血清について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４−１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従い密度勾配遠心法を行い、総リポタンパク質画分を得た。具体的には、本実施例（１）の肝疾患末期患者血清に５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；和光純薬工業社）および ＥＤＴＡ−２Ｎａ（同仁化学研究所社）をそれぞれ０．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび２．７ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）となるよう加え、さらに適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調製し、サンプル溶液とした。続いて、０．２０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．４）および１ｍｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを含む水溶液（ｄ＝１．００６ｋｇ／Ｌ）に、適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調製し、比重液とした。サンプル溶液１２ｍＬを遠心管（４０ＰＡ；日立工機社）に入れ、比重液を満たし、超遠心機ｈｉｍａｃ ＣＰ６０Ｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（日立工機社）およびローターＲＰＶ−５０Ｔ ｒｏｔｏｒ（日立工機社）を用いて、４００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で１８時間遠心分離を行って、上層（ｄ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）を総リポタンパク質画分として回収した。回収した総リポタンパク画分約８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて添付の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２〜３ｍＬに濃縮した。
【００６２】
［２−２］ゲル濾過クロマトグラフィーによるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の分離
本実施例（２）［２−１］の総リポタンパク質画分について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４〜１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を得た。具体的には、以下の器具、試薬および条件を用いて、２８０ｎｍの吸光度を計測しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行い、溶出液を３ｍＬずつ分取した。
【００６３】
サンプル；本実施例（２）［２−１］の総リポタンパク画分２〜３ｍＬ（カラム負荷量）
カラム ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケア社）
緩衝液 ；０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａ および３ｍｍｏｌ／ＬのＮａＮ３を含む５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ７．４）２００ｍＬ
条件 ；クロマトチャンバー ４℃
流速 ０．１５ｍＬ／分
【００６４】
分取した溶出液のうち、吸光度のピークの前後９ｍＬ（３ｍＬ×３分画）ずつ溶出液を集め、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬ（３ｍＬ×６分画）を得た。
【００６５】
［２−３］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の濃縮および透析
本実施例（２）［２−２］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて添付の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２〜３ｍＬに濃縮した。その後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を透析液として、透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用いて、４℃で一晩透析し、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液２〜３ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。
【００６６】
［２−４］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度測定
本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液について、既報に従い、Ｌｏｗｒｙ変法を用いてタンパク質濃度を測定した（Ｍａｒｋｗｅｌｌ ＭＡ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第８７巻、第２０６〜２１０頁、１９７８年）。具体的には、２％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム、０．４％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、０．１６％（ｗ／ｖ）の酒石酸塩および１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む水溶液を調製し、この水溶液と４％（ｗ／ｖ）の硫酸銅水溶液とを体積比１００：１に混合した溶液を反応溶液として調製した。また、脱イオン水に等量のフェノール試薬（フォーリン・チオカルト試薬；和光純薬社）を混合してフォーリン・チオカルト試薬液を調製した。また、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を標準溶液として調製した。本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液および標準溶液それぞれ１ｍＬに、調製した反応溶液を３ｍＬずつ加えて室温で３０分間インキュベートした。続いて、調製したフォーリン・チオカルト試薬液３００μＬを強く撹拌しながら加えた後、室温で４５分間インキュベートした。その後、６６０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。標準溶液の測定値との比較から、本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を算出した。
【００６７】
［２−５］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度調製
本実施例（２）［２−４］で算出した結果に基づき、本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬに調製した後、４℃で保存した。
【００６８】
（３）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原としたマウスへの免疫およびハイブリドーマの作製
実施例（２）［２−５］の０．５〜１ｍｇ／ｍＬのＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液０．１ｍＬを孔径０．４５ｍｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）に通した後、常法に従って、百日咳菌アジュバントを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔内注射することにより免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、常法に従って、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、コロニーが確認できるまで約１０日間培養した。
【００６９】
（４）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング
［４−１］ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ画分の調製
本実施例（２）［２−１］、［２−２］、［２−３］、［２−４］および［２−５］に記載の方法に従って、健常者血清からｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液を調製した。
【００７０】
［４−２］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
本実施例（２）［２−５］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液および本実施例（４）［４−１］のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液を、ＰＢＳを用いてそれぞれ２０μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて、４℃で一晩インキュベートすることによりＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬをそれぞれプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いて４回洗浄した。続いて、本実施例（３）の、各コロニーの培養上清を、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたウェルおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルに５０μＬ／ウェル入れて、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳで５００倍に希釈したビオチン標識ラット抗マウスｋ鎖（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェルずつ入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ−ＳＡ；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調製したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を１００μＬ／ウェル入れて、室温で３０分間発色反応を行った。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６００ｎｍで吸光度を測定した。ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が大きく、かつｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が小さい培養上清を特定することにより、コロニーの選択を行った。
【００７１】
［４−３］限界希釈法によるクローニングおよびスクリーニング
本実施例（４）［４−２］で選択したコロニーの細胞を、９６穴プレートに１個／ウェルとなるように播き、ペニシリン−ストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、ＴｈｙｍｉｄｉｎｅおよびＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ−ＨＴ−ＨＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０）を用いて培養を行った。これらの培養上清について、本実施例（４）［４−２］に記載の方法に従い、再度ＥＬＩＳＡを行い、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が大きく、かつｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が小さい培養上清を特定することにより、クローンの選択を行った。その結果得られた２つのハイブリドーマを、それぞれＧ１１−２およびＤ１２−５と命名した。
【００７２】
（５）Ｇ１１−２抗体およびＤ１２−５抗体の精製
常法に従って、２，６，１０，１４‐テトラメチル‐２‐ペンタデセン酸（プリステン）を注射したマウスの腹腔内に、本実施例（４）のＧ１１−２およびＤ１２−５をそれぞれ接種して培養し、Ｇ１１−２が産生するモノクローナル抗体（Ｇ１１−２抗体）およびＤ１２−５が産生するモノクローナル抗体（Ｄ１２−５抗体）をそれぞれ含む腹水を得た。
【００７３】
得られた腹水について、常法に従い飽和硫安（飽和硫酸アンモニウム）沈殿法を行って、粗モノクローナル抗体溶液を得た。具体的には、得られた腹水を氷冷しながら、等量の硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下して加えた後、遠心分離を行って上清を除去した。続いて沈殿物に５０％飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて再度遠心して上清を除去することで洗浄を行い、沈殿物をＰＢＳに溶解して粗Ｇ１１−２抗体溶液および粗Ｄ１２−５抗体溶液とした。
【００７４】
続いて、粗Ｇ１１−２抗体溶液および粗Ｄ１２−５抗体溶液それぞれ３００μＬについて、以下の器具・機器、溶離液および条件を用いて常法に従ってＨＰＬＣ法を行い、溶出液を０．５ｍＬずつ分取することにより、１００μｇ／ｍＬ精製Ｇ１１−２抗体溶液を約１０ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ精製Ｄ１２−５抗体溶液を約１５ｍＬ、それぞれ得た。
【００７５】
カラム；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０/３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）
溶離液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＰＢ溶液（ｐＨ７．２）
システムコントローラ；ＣＢＭ−２０Ａ（島津製作所社）
送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社）
オートサンプラー；ＳＩＬ−２０Ａ（島津製作所社）
カラムオーブン；ＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社）
検出器；ＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所社）
条件；流速 ０．５ｍＬ／分
検出波長 ２８０ｎｍ
【００７６】
＜実施例２＞Ｇ１１−２抗体およびＤ１２−５抗体のクラス判定
ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、添付の使用書に従い、イムノクロマトグラフィー法により実施例１（５）のＧ１１−２抗体およびＤ１２−５抗体のクラス判定を行った。その結果、Ｇ１１−２抗体のクラスはＩｇＭであり、Ｄ１２−５抗体のクラスはＩｇＧであることが明らかになった。
【００７７】
＜実施例３＞Ｇ１１−２抗体の抗原解析
（１）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
［１−１］Ｇ１１−２抗体のビオチン標識
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（和光純薬社）に、１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を溶解することによりビオチン標識液を調製した。１００μｇ／ｍＬのＧ１１−２抗体溶液１ｍＬに調製したビオチン標識液を２μＬ添加して、室温で１０分間、振盪しながら反応させた。続いて、ＰＢＳを透析液として透析を行い、未反応のビオチンを除去した。その後、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度が５μｇ／ｍＬとなるよう調製して、ビオチン標識Ｇ１１−２抗体を得た。
【００７８】
［１−２］抗アポリポタンパクＢ抗体のビオチン標識
抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体を含むヤギ抗血清（ＷａｔＰａ；Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ社）について、飽和硫安沈殿法で粗抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液を得た。具体的には、抗血清を氷冷しながら、等量の硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下して加え、遠心分離を行って上清を除去した後、沈殿物に４０％飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて再度遠心して上清を除去することで洗浄を行い、沈殿物をＰＢＳに溶解して粗抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液とした。
【００７９】
続いて、常法に従ってアフィニティカラムクロマトグラフィー法を行った。具体的には、ＰＢＳで１０倍希釈した粗抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液をアフィニティカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケア社）に４℃、一晩ループして通過させ、カラムに抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体を結合させて行った。送液ポンプにはペリスタルティックポンプ（ＳＪ−１２１５；ＡＴＴＯ社）を用い、流速を約０．２ｍＬ／分とし、カラム内の溶液をＰＢＳに置換・洗浄して、流速約０．２ｍＬ／分で０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を流して抗体を溶出させ、その溶出液を０．５ｍＬずつ分取した。
【００８０】
速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を溶出液に加えて中和を行い、各分画において波長２８０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質の存在した分画をプールした後、波長２８０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質濃度を算出し、４．７ｍｇ／ｍＬの精製抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液約３．５ｍＬを得た。その後、ＰＢＳを透析液として透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用いて、４℃で一晩透析し、精製抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液約３．５ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。
【００８１】
続いて、本実施例（１）［１−１］に記載の方法に従って、抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体のビオチン標識を行い、ビオチン標識抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体を得た。ただし、反応時間は１０分間に代えて４時間とした。
【００８２】
（２）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
実施例１（４）［４−２］に記載の方法に従い、ＥＬＩＳＡを行った。ただし、一次抗体として実施例１（３）の各コロニーの培養上清に代えて、本実施例（１）［１−１］のビオチン標識Ｇ１１−２抗体および本実施例（１）［１−２］のビオチン標識抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体をそれぞれ用いた。また、二次抗体は使用せず、発色反応は３０分間に代えて１０分間とし、吸光度測定の際の副波長は６００ｎｍに代えて６２０ｎｍとした。その結果を図３に示す。
【００８３】
図３に示すように、Ｇ１１−２抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．１４４であるのに対し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．０１８であった。一方、抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．６９０であるのに対し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．８２２であった。
【００８４】
以上の結果から、Ｇ１１−２とＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ固相化ウェルとを用いてＥＬＩＳＡを行った場合に強い発色が観察されることが確認された。すなわち、Ｇ１１−２抗体を利用することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを特異的に検出できることが示された。
【００８５】
（２）磁気ビーズによる抗原の回収および抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
［２−１］Ｇ１１−２抗体の磁気ビーズへの固定
実施例１（５）の１００μｇ／ｍＬのＧ１１−２抗体溶液１ｍＬに、２×１０９ｂｅａｄｓ／ｍＬの磁気ビーズ原液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ；Ｖｅｒｉｔａｓ社）１６５μＬを添加し、攪拌しながら４℃で４８時間反応させることにより、磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体溶液を調製した。
【００８６】
［２−２］磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体に特異的に反応した抗原の回収
本実施例（２）［２−１］の磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体溶液を磁石にセットして上清を除去した後、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍＬを用いて、室温で４時間ブロッキングを行った。続いて、磁石にセットして上清を除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて振盪しながら１０分間洗浄を行った。磁石にセットして上清を除去し、ＰＢＳを用いてさらに３回洗浄を行った後、磁石にセットして上清を除した。そこに、ＰＢＳで２０倍希釈した肝疾患患者血清１ｍＬおよびコントロールとしてＰＢＳ１ｍＬをそれぞれ加え、室温にて１時間、インキュベートした。続いて、磁石にセットして上清を除去した後、ＰＢＳを用いて３回洗浄を行い、磁石にセットして上清を除去した後、０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）をそれぞれ加えて１分間ボルテックス処理することにより、磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体と抗原とを解離させた。その後、再度磁石にセットし、上清を回収した後、速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和を行った。
【００８７】
［２−３］ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗原の解析
４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のｇｌｙｃｅｒｏｌおよび０．００５％（ｗ／ｖ）のＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅを含む０．１２６ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を変性用緩衝液として調製した。また、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳおよび３８４ｍｍｏｌ／Ｌのｇｌｙｃｉｎｅを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを泳動用緩衝液として調製した。続いて、本実施例（２）［２−２］で回収した、ＰＢＳを加えた場合の上清をサンプル１、本実施例（２）［２−２］で回収した、肝疾患患者血清を加えた場合の上清をサンプル２、実施例１（５）のＧ１１−２抗体溶液をサンプル３および実施例１（５）のＤ１２−５抗体溶液をサンプル４として、等量の変性用緩衝液をそれぞれのサンプルに加えて混合した後、９０℃で５分間熱処理した。その後、３〜１０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ社）がセットされ、調製した泳動用緩衝液が満たされた泳動槽（ＡＥ−６５００；ＡＴＴＯ社）に、分子量マーカー（ＨｉＭａｒｋ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；インビトロジェン社）５μＬ、サンプル１、サンプル２、サンプル３およびサンプル４をそれぞれ１０μＬ添加して、２０ｍＡ、１５０Ｗで８０分間電気泳動を行った。その後、銀染色試薬（２Ｄ−銀染色試薬・II；コスモ・バイオ社）を用いてゲルを染色した。その結果を図４に示す。
【００８８】
図４に示すように、サンプル１では、約５８ｋＤａの位置にバンドが検出され、サンプル２では、原点、約１７０ｋＤａの位置および約５８ｋＤａの位置にバンドが検出された。サンプル３では、原点の位置にバンドが検出され、サンプル４では、約１７０ｋＤａの位置にバンドが検出された。
【００８９】
約５８ｋＤａの位置のバンドは、サンプル１およびサンプル２で検出されたことから、血清に由来するものではなく、作製した磁気ビーズ由来のバックグラウンドであることが確認された。一方、原点のバンドは、サンプル２およびサンプル３で検出され、実施例２の結果よりＧ１１−２抗体のクラスはＩｇＭであることから、サンプル２にはＩｇＭが含まれることが確認された。また、約１７０ｋＤａの位置のバンドは、サンプル２およびサンプル４で検出され、実施例２の結果よりＤ１２−５抗体のクラスはＩｇＧであることから、サンプル２には、ＩｇＧおよびＩｇＧと同等の分子量を有するＩｇＡが含まれることが確認された。
【００９０】
これらの結果から、肝疾患患者血清に含まれるＧ１１−２抗体の抗原はＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡであることが明らかになった。
【００９１】
（３）Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
［３−１］密度勾配遠心による血清上層画分、中層画分および下層画分の調製
肝疾患患者２名（肝疾患１および肝疾患２とする）および健常者１名から血清を採取した。これらの血清それぞれ２ｍＬについて、実施例１（２）［２−１］に記載の方法に従い、密度勾配遠心法を行った。ただし、超遠心機はｈｉｍａｃ ＣＰ６０Ｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（日立工機社）に代えて、ＯｐｔｉｍａＭＡＸ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用い、ローターはＲＰＶ−５０Ｔ ｒｏｔｏｒ（日立工機社）に代えてＭＬＮ−８０（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いた。また、遠心の際の回転数は５００００ｒｐｍとし、遠心時間は２０時間とした。遠心終了後、総リポタンパク質画分（ｄ ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）として上層画分をそれぞれ２ｍＬを回収し、さらに、中層画分をそれぞれ４ｍＬおよび下層画分をそれぞれ２ｍＬ回収した。
【００９２】
［３−２］Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例１（５）のＧ１１−２抗体について、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度５μｇ／ｍＬに希釈した。これを、９６穴プレートＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて、３７℃で２時間インキュベートすることによりＧ１１−２抗体をプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、本実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分をそれぞれ５０μＬ／ウェル入れて、４℃で一晩反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０μＬ／ウェル入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５００倍に希釈したＡＬＰ−ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調製したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を、１００μＬ／ウェルずつ入れて室温で６０分間発色反応を行った。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ；サーモサイエンティフィックフィッシャー社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図５に示す。
【００９３】
図５に示すように、肝疾患１の上層画分の吸光度は０．１１７、中層画分の吸光度は、０．０４７下層画分の吸光度は１．４７６であり、肝疾患２の上層画分の吸光度は０．０１、中層画分の吸光度は０．０１、下層画分の吸光度は０．９０１であった。一方、健常者の上層画分および中層画分の吸光度は０であり、下層画分の吸光度は０．３４３であった。
【００９４】
これらの結果から、Ｇ１１−２抗体の抗原は、肝疾患患者血清の下層画分に主に存在することが確認された。すなわち、Ｇ１１−２抗体の抗原は、上層画分に存在するリポタンパク質ではなく、下層画分に主に存在する免疫グロブリンタンパク質であることが確認された。また、健常者では上層画分において反応が全く検出されない一方で、肝疾患患者では上層画分において反応が検出されたことから、Ｇ１１−２抗体の抗原となる免疫グロブリンタンパク質は、リポタンパク質に結合することが確認された。
【００９５】
以上より、Ｇ１１−２抗体の抗原は、肝疾患患者血清に含まれるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに結合する免疫グロブリンタンパク質すなわち自己抗体であることが確認された。また、この自己抗体は血清中において、その多くがＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに結合している状態ではなく、遊離の状態で存在することが確認された。
【００９６】
＜実施例４＞Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける検出抗体の検討
実施例３（３）［３−２］に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは本実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて肝疾患患者２名（以下、「肝疾患１」および「肝疾患２」とする）および健常者２名（以下、「健常者１」および「健常者２」とする）からそれぞれ採取した血清をＰＢＳで１００倍に希釈したものを用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＰＢＳで１万倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（α）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＰＢＳで４０万倍に希釈したビオチン標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ５μ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）およびＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。その結果を図６に示す。
【００９７】
図６に示すように、検出抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体を用いた場合、肝疾患１および肝疾患２でいずれも吸光度の測定値は大きい一方で、健常者１および健常者２ではいずれも吸光度の測定値は小さい。検出抗体として抗ヒトＩｇＡ（α）抗体を用いた場合も同様であり、肝疾患患者１および肝疾患患者２でいずれも吸光度の測定値は大きい一方で、健常者１および健常者２ではいずれも吸光度の測定値は小さい。これに対し、検出抗体として抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ５μ抗体を用いた場合は、肝疾患患者１で吸光度の測定値は大きく、肝疾患患者２および健常者１および健常者２ではいずれも同程度に吸光度の測定値は小さい。検出抗体として抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体を用いた場合も同様であり、肝疾患患者１で吸光度の測定値は大きく、肝疾患患者２および健常者１および健常者２ではいずれも同程度に吸光度の測定値は小さい。
【００９８】
これらの結果から、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、検出抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体または抗ヒトＩｇＡ（α）抗体を用いた場合に、肝疾患特異的に反応することが確認された。
【００９９】
＜実施例５＞血清サンプルの凍結融解試験
（１）血清サンプルの調製
肝疾患患者１名から血清を採取して７等分し、患者サンプル０、患者サンプル１、患者サンプル２、・・・患者サンプル６とした。また、健常者１名から血清を採取して同様に７等分し、健常者サンプル０、健常者サンプル１、健常者サンプル２、・・・健常者サンプル６とした。患者サンプル０および健常者サンプル０は４℃で保存し、患者サンプル１および健常者サンプル１は−８０℃で一晩保存することにより凍結後、翌日融解した。患者サンプル２および健常者サンプル２は−８０℃で一晩保存することにより凍結後、翌日融解することを２回繰り返した。同様に、患者サンプル３および健常者サンプル３は前述の凍結融解を３回繰り返し、患者サンプル４および健常者サンプル４は４回、患者サンプル５および健常者サンプル５は５回、患者サンプル６および健常者サンプル６は６回繰り返した。
【０１００】
（２）Ｇ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡ
実施例３（３）［３−２］に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて本実施例（１）の患者サンプル０〜患者サンプル６および健常者サンプル０〜健常者サンプル６の合計１４サンプルをそれぞれ用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。その結果を図７に示す。
【０１０１】
図７に示すように、患者サンプル０〜患者サンプル６の吸光度はいずれも約０．１５であり、健常者サンプル０〜健常者サンプル６の吸光度はいずれも約０．０２５であった。この結果から、血清の凍結融解回数がいずれの場合も、肝疾患患者におけるＥＬＩＳＡの吸光度および健常者のＥＬＩＳＡの吸光度は変化しないことが確認された。すなわち、Ｇ１１−２抗体の抗原である、肝疾患患者血清に含まれるＴＧ−ｒｉｃｈＬＤＬを認識する自己抗体は凍結融解を繰り返しても安定に存在することが確認された。
【０１０２】
＜実施例６＞Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける反応性と肝疾患重症度の相関
（１）アガロースゲル電気泳動による肝疾患重症度の判定
肝疾患患者９名、健常者１４名からそれぞれ血清を採取し、実施例１（１）に記載の方法に従ってアガロースゲル電気泳動を行った。健常者血清および肝疾患患者血清の典型的な泳動結果を図８に示す。
【０１０３】
図８に示すように、肝疾患患者血清のうち、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失したものと欠失していないものがあった。そこでこの結果に基づき、健常者の泳動パターンに比して、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失した肝疾患患者を重度群と判定し、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が欠失していない肝疾患患者を軽中度群と判定したところ、肝疾患患者９名のうち６名が軽中度群であり、３名が重度群であった。
【０１０４】
（２）Ｇ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡ
実施例３（３）［３−２］に記載の方法に従い、ＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて本実施例（１）の健常者群１４名、軽中度群６名および重度群３名の血清合計２３サンプルをＰＢＳで１００倍に希釈したものをそれぞれ用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。吸光度の測定値を健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計し、平均値を算出した。その結果を図９に示す。各群間の比較は、一元配置分散分析およびＳｃｈｅｆｆｅの方法による多重比較検定を行い、 Ｐ＜０．０５である場合に、統計学的に有意であるとした。
【０１０５】
図９に示すように、健常者群の吸光度は０．０６３±０．０５５であったのに対し、軽中度群の吸光度は０．０８３±０．０３４、重度群の吸光度は０．２８１±０．２００であった。多重比較検定の結果、重度群と健常者群との間および重度群と健常者群との間はＰ＜０．０１で、有意差が認められた。一方、健常者群と軽中度群との間には有意差が認められなかった。
【０１０６】
これらの結果から、Ｇ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡは、肝疾患患者において肝疾患の重症度診断に有用であることが確認された。
【０１０７】
＜実施例７＞脂質異常症患者血清に対するＧ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡの反応性
（１）血清脂質項目の測定
健常者２名（健常者１および健常者２とする）、脂質異常症患者７名（脂質異常症１、脂質異常症２、・・・脂質異常症７とする）および肝疾患患者１２名（肝疾患１、肝疾患２、・・・肝疾患１２とする）から血清合計２１サンプルを採取し、以下の試薬および日立自動分析装置７１７０（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて添付のプロトコールに従い血清中脂質濃度を測定した。続いて、測定値を健常者、脂質異常症患者および肝疾患患者の別に集計して、平均値を算出した。その結果を表２に示す。
【０１０８】
総コレステロール（ＴＣ）；コレステストＣＨＯ（積水メディカル社）
中性脂肪（ＴＧ）；エクセライザ ＴＧ（積水メディカル社）
リン脂質（ＰＬ）；ピュアオートＳ ＰＬ（積水メディカル社）
高密度リポタンパク質中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）；コレステストＮ ＨＤＬ（積水メディカル社）
低密度リポタンパク質中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）；コレステスト ＬＤＬ（積水メディカル社）
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
（２）Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例３（３）［３−２］に記載の方法により、ＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて本実施例（１）の健常者２名、脂質異常症患者７名および肝疾患患者１２名の血清合計２１サンプルをそれぞれＰＢＳで１００倍に希釈したものを用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。その結果を図１０ａに示す。また、各サンプルの吸光度の測定値について、以下の式を用いて、本実施例（１）で測定した各サンプルのＬＤＬ−Ｃの血清中濃度で除した。その結果を図１０ｂに示す。
【０１１１】
式；吸光度の測定値×１００００／本実施例（１）で測定した血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度
【０１１２】
図１０ａに示すように、健常者１および健常者２の吸光度の測定値はいずれも小さい一方、脂質異常症１〜脂質異常症７の吸光度の測定値は、概ね健常者の吸光度の測定値と比べて大きい。特に、脂質異常症１の吸光度の測定値は肝疾患患者の吸光度の測定値と同程度に大きい。これに対し、肝疾患１〜肝疾患１２の吸光度は、概ね健常者および脂質異常症患者の吸光度の測定値と比べて大きい。これらの結果から、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、健常者では反応が小さい一方、脂質異常症患者および肝疾患患者では比較的反応が大きいことが確認された。
【０１１３】
また、図１０ｂに示すように、各サンプルの吸光度の測定値を各サンプルの血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度で除したところ、肝疾患患者の測定値と健常者および脂質異常症患者の測定値との差が大きくなり、肝疾患患者の測定値が大きい一方、健常者および脂質異常症患者の測定値が小さくなった。この結果から、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度の測定値を血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度で除することにより、肝疾患特異的に大きな値となることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよび被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）は、少なくとも肝疾患患者血清中に出現する低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）である。ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは中性脂肪であるトリアシルグリセロール（トリグリセリド、トリ−Ｏ−アシルグリセリン；ＴＧ，ＴＡＧ）の含有量が高いことを特徴とし、この点で、コレステロールの含有量が高い正常なＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）とは異なるリポタンパク質である。肝疾患の進行に伴いＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの血清中濃度は増加し、肝疾患の末期では血清中に存在するリポタンパク質の大部分を占めるのに対し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の血清中濃度は極端に減少する（非特許文献１）。
【０００３】
また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは培養マクロファージを泡沫化する。そして、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬによるマクロファージ泡沫化率と酸化ＬＤＬの一種であるマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）の血清中濃度とが正比例すること（非特許文献１）、健常者血漿中には過酸化ＴＧがほとんど検出されないのに対し、肝疾患患者血漿中には、過酸化ＴＧの著しい増加が見られること（非特許文献２）などから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは酸化ＬＤＬの一種であるとされている。
【０００４】
すなわち、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、肝疾患のみならず酸化ＬＤＬが関与する種々の疾患に係る重要な物質であると考えられ、基礎医学、臨床医学、創薬などの分野においてさらなる研究が要求されているが、その合成経路、代謝経路などについては未だ不明な点が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｇａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、第１４６巻、第３２９〜３３５頁、２００５年
【非特許文献２】Ｈｕｉ ＳＰ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ、第３８巻、第１２８７〜１２９２頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに係る研究開発において、重要なツールとしての機能を果たし得る、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体を提供するとともに、そのモノクローナル抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを簡便かつ高感度に検出するキット、およびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を簡便かつ高感度に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原としてハイブリドーマを作製し、選択されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が、肝疾患患者血清中に存在するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体と特異的に反応することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体。
【０００９】
（２）自己抗体がヒトの自己抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体。
【００１０】
（３）トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）が肝疾患患者から採取された血清に含まれるトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
【００１１】
（４）自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、（１）から（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【００１２】
（５）受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマにより産生される、（１）から（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【００１３】
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【００１４】
（７）受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５である、（６）に記載のハイブリドーマ。
【００１５】
（８）（１）から（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）検出用キット。
【００１６】
（９）被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
【００１７】
（１０）被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
【００１８】
（１１）自己抗体がヒトの自己抗体である、（９）または（１０）に記載の方法。
【００１９】
（１２）モノクローナル抗体が、肝疾患患者から採取された血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体である、（９）から（１１）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（１３）自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、（９）から（１２）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るモノクローナル抗体、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、モノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法によれば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬをはじめとする酸化ＬＤＬが関与する様々な疾患の解明、治療、診断、評価などを、より効果的かつ簡便に行うことができるとともに、薬効に優れた医薬組成物の開発に寄与し、提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】上下左側の図は、いずれも、血清から超遠心により分離した総リポタンパク質画分について、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った図である。一方、上下右側の図は、いずれも、ゲル濾過クロマトグラフィーを行って得られた各溶出液における各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。図中、ＴＣは総コレステロール、ＰＬはリン脂質、ＦＣは遊離コレステロール、ＴＧは中性脂肪を示す。また、いずれの図も、横軸はフラクションすなわちサイズを示し、横軸のプラス方向（右方向）に位置するほどサイズが小さいことを示す。
【図２】健常者（Ｎ）および肝疾患末期患者（Ｐ）の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図３】Ｇ１１−２抗体および抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体を用いて、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図４】磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体に特異的に反応した抗原について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図５】血清から超遠心により分離した上層画分、中層画分および下層画分について、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図６】検出抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体、抗ヒトＩｇＡ（α）抗体、抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ５μ抗体および抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体を用いて、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図７】凍結融解をそれぞれ０回、１回、２回、３回、４回、５回および６回行った血清サンプルについて、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図８】健常者および肝疾患患者の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図９】健常者、軽中度群および重度群の血清について、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行い測定した吸光度の値を、健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計した結果を示す図である。
【図１０ａ】健常者、脂質異常症患者および肝疾患患者の血清について、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図１０ｂ】各サンプルの吸光度の測定値を、各サンプルの血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度の値で除した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよび被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法について詳細に説明する。本発明に係るモノクローナル抗体は、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応する。
【００２４】
本発明におけるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してＴＧの重量割合が大きいＬＤＬである。また、本発明においてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、酸化ＬＤＬの性質を有しており、マクロファージを泡沫化するＬＤＬである。このようなＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬには、中間比重リポタンパク質｛Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＤＬ（ミッドバンドともいい、分画としてＩＤＬに相当するレムナントリポタンパク質を含む趣旨である）｝の他、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄ−ＬＤＬ、変性ＬＤＬ）といわれる、粒子径が２５．５ｎｍ以下であり、比重で分画した場合に１．０４０〜１．０６３のＬＤＬに相当するリポタンパク質が含まれる。
【００２５】
ここで、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合について測定した結果の典型例を図１および表１に示す。図１の上下左側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分について、２８０ｎｍの吸光度を測定しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果を示す図であり、図１の上下右側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分についてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られた各溶出液について各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。一方、表１は、肝疾患患者４名および健常者７名について上記の方法により各脂質の濃度を測定し、平均値と標準偏差を算出した結果を示している。
【００２６】
【表１】
【００２７】
図１の上下左側の図に示すように、肝疾患患者においてはＶＬＤＬおよびＨＤＬが消失し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズを有するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが高濃度に存在する。その高濃度に存在するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合は、図１右側および表１に示すように、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合と比較して明らかに大きい。しかしながら、表１に示すように、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおける各脂質重量割合の標準偏差の値が大きいことから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合には、ある程度のばらつきがあることがわかる。
【００２８】
また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの粒子サイズは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに近似した結果が得られるが、被験者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
【００２９】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの電荷については、アガロースゲル電気泳動法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに近似した結果またはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してやや負電荷であることを示す結果が得られるが、被験者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
【００３０】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、肝疾患患者の血清から採取されるが、肝疾患のみならず、種々の疾患、特に、酸化ストレスの関与する疾患の患者やその罹患が疑われる者の血清に存在すると考えられている。そのような疾患としては、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝線維症、ＦＩＣ１欠損（良性反復性肝内胆汁うっ滞症、バイラー病）、ＢＳＥＰ欠損（進行性家族性肝内胆汁うっ滞症）などを含む先天性胆汁うっ滞性疾患、脂肪性肝炎などの肝疾患の他、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高トリグリセリド血症などの脂質異常症、脳梗塞、虚血性心疾患、大動脈瘤、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症などの動脈硬化性疾患、糖尿病、高血圧症などを挙げることができる。
【００３１】
自己抗体は一般に、自己の生体内で産生されたタンパク質や細胞、組織などの物質を抗原とする抗体のことをいい、自己免疫疾患の他、種々の癌などの場合に生体内で産生されることが確認されている。
【００３２】
本発明において自己抗体としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類の自己抗体を挙げることができるが、ヒトの自己抗体であることが好ましい。また、自己抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれも挙げることができるが、血清中の濃度が比較的大きいＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭであることが好ましい。
【００３３】
本発明において、「認識する」は、「相互作用する」、「結合する」、「反応する」と交換可能に用いられ、「反応する」もまた、「相互作用する」、「結合する」、「認識する」と交換可能に用いられる。また、本発明において、抗体が、ある特定の抗原（免疫原）に対し「特異的に反応する」とは、前記特定抗原に対して反応性があることが明らかであればよい。前記特定抗原に対し「特異的に反応する」とは、他の抗原に全く反応しない場合も含むが、他の抗原に対し反応する場合も含む。
【００３４】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、Ｆａｂ領域において抗原と特異的に反応する。すなわち、本発明に係るモノクローナル抗体１分子には、抗原と特異的に反応する部位が２箇所存在するため、本発明に係るモノクローナル抗体１分子が特異的に反応する自己抗体は１または２である。よって本発明における自己抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選ばれる１または２であり、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２であることが好ましい。
【００３５】
次に、本発明に係るハイブリドーマは、本発明に係るモノクローナル抗体を産生する。本発明に係るハイブリドーマの作製は、当業者により適宜選択可能な任意の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、第７２頁、１９８３年）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、第７７−９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５年）などの方法の他、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを有する方法を挙げることができる。
【００３６】
（ｉ）まず、免疫原を調製する。免疫原は、どのような方法により調製してもよいが、本発明においては、血清からＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離した後、限外濾過により濃縮し、続いて透析することにより調製することができる。なお、この場合において、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体は血清から分離したＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分に含まれる。
【００３７】
ここで、血清にＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることを確認する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法として、アガロースゲル電気泳動法を挙げることができる。本発明においては、被験者血清および健常者血清をアガロースゲル電気泳動に供することにより、被験者血清においてα位のバンドが検出されないか、あるいは著しく減少し、かつ健常者血清と比較して陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された場合に、その被験者血清にはＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれると判定することができる。
【００３８】
また、血清からＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法としては、例えば、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４−１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従い、密度勾配遠心法を用いて血清から分離した総リポタンパク質画分をゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法を挙げることができる。
【００３９】
（ｉｉ）次に、分離したＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を免疫原として動物を免疫する。免疫は、適宜常法を用いて行うことができる。また、免疫の対象となる動物は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどを挙げることができる。
【００４０】
（ｉｉｉ）続いて、免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などを挙げることができる。さらに、ハイブリドーマを得るため、採取した抗体産生細胞を他の細胞と融合させる。抗体産生細胞を採取する方法および細胞の融合方法は、当業者が適宜選択可能な方法を挙げることができる。また、抗体産生細胞に融合させる細胞としては、増殖能力の強い細胞を用いることが好ましく、例えば、一般に入手可能なミエローマ細胞の細胞株を使用することができる。なお、使用する細胞株は、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
【００４１】
（ｉｖ）次に、作製したハイブリドーマから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法やイムノブロット法などの常法を用いて、当業者が適宜選択可能な手法により行うことができる。ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングする場合は、例えば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡをハイブリドーマの培養上清について行い、適当な標識をした抗（免疫動物）抗体によりＥＬＩＳＡの反応を検出し、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに対して反応が大きいとともにｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに対して反応が小さい培養上清を特定することにより、ハイブリドーマを特定することができる。なお、血清に由来するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにはＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体が付着していると考えられるため、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡをスクリーニングに用いることができる。
【００４２】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを有する方法により得られたハイブリドーマを本発明に係るハイブリドーマとすることができるが、クローニングないしスクリーニングをさらに行うことにより細胞を純化し、本発明に係るハイブリドーマとすることができる。そのようなクローニングないしスクリーニング方法としては、例えば、限界希釈法、トリプシン濾紙法、ペニシリンキャップ法などの方法を挙げることができる。
【００４３】
また、このようにして得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる他、前記方法のステップ（ｉｉｉ）において採取される抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる。ハイブリドーマまたは抗体産生細胞からモノクローナル抗体を抽出する方法としては、例えば、細胞培養法や腹水形成法などの常法を挙げることができる。抽出したモノクローナル抗体は、例えば、硫安塩析法、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択し、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４４】
得られたモノクローナル抗体のクラスの判定は、適宜常法に従って行うことができ、例えば、免疫した動物がマウスの場合は、ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）などを用いて行うことができる。なお、本発明に係るモノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれも用いることができる。
【００４５】
本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質、酵素などにより標識して用いることができる。また、必要に応じて、ポリスチレン製プレート、ポリプロピレン製プレート、シリコン製プレート、ポリスチレン製マイクロビーズ、磁気ビーズ、ラテックス粒子などの担体に固着させて用いることができる。
【００４６】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ヒト免疫グロブリン産生能を有する動物に免疫することにより、ヒト抗体として得ることができる他、遺伝子工学的手法を用いて、免疫動物由来の可変部とヒト由来の定常部とからなるキメラ抗体として得ることもでき、免疫動物由来の超可変部を有し、それ以外の抗体部分はヒト由来であるヒト化抗体として得ることもできる。
【００４７】
なお、本発明に係るモノクローナル抗体として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１０年２月２日付で受領されており、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。同様に、本発明に係るハイブリドーマとして、上記の受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
次に、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットを提供する。本発明に係るモノクローナル抗体はＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対して特異的に反応するため、本発明に係るモノクローナル抗体を用いてこの自己抗体を検出することにより、この自己抗体が認識するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを検出することができることから、本発明に係るキットは、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを検出することを目的として使用することができる。酸化ＬＤＬの一種であるとされているＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、保管中に酸化が進行して壊れるなどの虞がある不安定な物質であるのに対し、免疫グロブリンタンパク質である自己抗体は、長期保存および凍結融解を繰り返しても高感度に検出することができる安定な物質であることから、本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットにより簡便かつ高感度なアッセイが可能となる。
【００４９】
なお、本発明に係るキットは、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質、緩衝液、器具など、その特徴を損なわない限りにおいて、その構成物として含んでもよい。
【００５０】
さらに本発明は、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法を提供する。なお、本発明に係る自己抗体の検出方法には、本発明に係る自己抗体の検出方法を損なわない限り、インキュベート工程や洗浄工程などを含んでいてもよい。
【００５１】
本発明に係る自己抗体を検出する方法は、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法であって、
（ｉ）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（ｉｉ）前記複合体を検出する工程（検出工程）
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００５２】
（ｉ）複合体形成工程において複合体を形成させる方法としては、当業者が適宜選択可能な任意の方法を挙げることができる。そのような方法としては、例えば、モノクローナル抗体を含む溶液と血清とを混合させて複合体を形成させる方法の他、血清成分を担体に固着させてモノクローナル抗体を含む溶液と反応させる方法、モノクローナル抗体を担体に固着させて血清と反応させる方法などを挙げることができる。
【００５３】
（ｉｉ）検出工程において複合体を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、間接抗体法、ラテックス凝集法、比濁法、ＣＬＥＩＡ法などの常法の他、例えば、モノクローナル抗体あるいは血清成分に予め標識をし、この標識を検出する方法を挙げることができる。
【００５４】
次に、本発明に係る自己抗体を検出する方法の異なる態様は、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法であって、
（ｉ）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を担体に固着する工程（固着工程）
（ｉｉ）担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程（固着複合体形成工程）
（ｉｉｉ）前記複合体を検出する工程（固着複合体検出工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する。
【００５５】
（ｉ）固着工程において、モノクローナル抗体を固着する担体は任意のものを用いることができ、そのような担体としては、例えば、上述の、本発明に係るモノクローナル抗体を固着させて用いることができる担体と同様のものを挙げることができる。また、固着する方法は特に限定されず、用いる担体により適宜設定して行うことができる。
【００５６】
（ｉｉ）固着複合体形成工程および（ｉｉｉ）固着複合体検出工程における、固着複合体を形成させる方法および固着複合体を検出する方法としては、上述の（ｉ）複合体形成工程および（ｉｉ）検出工程と同様の方法を挙げることができる。
【００５７】
本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよびＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法は、肝疾患のみならず酸化ＬＤＬが関与する種々の疾患の解明、診断、重症度の評価、治療効果の評価の他、リポタンパク質の酸化度の評価などに用いることが可能である。
【００５８】
以下、本発明に係るＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのモノクローナル抗体を含んでなるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ検出用キットおよび被験者から採取した血清に含まれ、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを認識する自己抗体を検出する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５９】
＜実施例１＞ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原とするモノクローナル抗体の作製
（１）アガロースゲル電気泳動によるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの確認
肝疾患末期患者１名および健常者１名から採取した血液を室温で１時間静置した後、３５００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行うことにより、肝疾患末期患者血清および健常者血清を得た。得られた血清を１．５μＬずつアガロースゲル（ユニバーサルゲル／８；ヘレナ研究所社）に塗布し、ｐＨ８．６、イオン強度０．０６のバルビタール緩衝液中において、１００Ｖ、１５０Ｗで４５分間電気泳動を行った後、ドライヤーを用いてゲルを乾燥させた。続いて、０．０３％（ｗ／ｖ）のＦａｔ Ｒｅｄ ７Ｂ（ヘレナ研究所社）を含むメタノール２０ｍＬにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２滴加え、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を４ｍＬ加えることにより調製した染色液に、乾燥させたゲルを１０分間浸漬して染色を行った後、７５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液に１０秒間浸漬することにより脱色を行った。
【００６０】
図２に示すように、健常者血清（Ｎ）ではＨＤＬに相当するα位およびＬＤＬに相当するβ位にそれぞれバンドが検出された。一方、肝疾患末期患者血清（Ｐ）ではα位のバンドは検出されなかった。また、健常者血清（Ｎ）のβ位のバンドに比して、肝疾患末期患者血清（Ｐ）では陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された。これらの結果から、この肝疾患末期患者血清にはＨＤＬが含まれず、かつ、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された。
【００６１】
（２）免疫原の調製
［２−１］密度勾配遠心法による総リポタンパク質画分の分離
本実施例（１）でＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された肝疾患末期患者血清について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４−１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従い密度勾配遠心法を行い、総リポタンパク質画分を得た。具体的には、本実施例（１）の肝疾患末期患者血清に５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；和光純薬工業社）および ＥＤＴＡ−２Ｎａ（同仁化学研究所社）をそれぞれ０．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび２．７ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）となるよう加え、さらに適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調製し、サンプル溶液とした。続いて、０．２０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．４）および１ｍｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを含む水溶液（ｄ＝１．００６ｋｇ／Ｌ）に、適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調製し、比重液とした。サンプル溶液１２ｍＬを遠心管（４０ＰＡ；日立工機社）に入れ、比重液を満たし、超遠心機ｈｉｍａｃ ＣＰ６０Ｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（日立工機社）およびローターＲＰＶ−５０Ｔ ｒｏｔｏｒ（日立工機社）を用いて、４００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で１８時間遠心分離を行って、上層（ｄ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）を総リポタンパク質画分として回収した。回収した総リポタンパク画分約８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて添付の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２〜３ｍＬに濃縮した。
【００６２】
［２−２］ゲル濾過クロマトグラフィーによるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の分離
本実施例（２）［２−１］の総リポタンパク質画分について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４〜１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を得た。具体的には、以下の器具、試薬および条件を用いて、２８０ｎｍの吸光度を計測しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行い、溶出液を３ｍＬずつ分取した。
【００６３】
サンプル；本実施例（２）［２−１］の総リポタンパク画分２〜３ｍＬ（カラム負荷量）
カラム ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケア社）
緩衝液 ；０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａ および３ｍｍｏｌ／ＬのＮａＮ３を含む５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ７．４）２００ｍＬ
条件 ；クロマトチャンバー ４℃
流速 ０．１５ｍＬ／分
【００６４】
分取した溶出液のうち、吸光度のピークの前後９ｍＬ（３ｍＬ×３分画）ずつ溶出液を集め、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬ（３ｍＬ×６分画）を得た。
【００６５】
［２−３］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の濃縮および透析
本実施例（２）［２−２］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて添付の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２〜３ｍＬに濃縮した。その後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を透析液として、透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用いて、４℃で一晩透析し、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液２〜３ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。
【００６６】
［２−４］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度測定
本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液について、既報に従い、Ｌｏｗｒｙ変法を用いてタンパク質濃度を測定した（Ｍａｒｋｗｅｌｌ ＭＡ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第８７巻、第２０６〜２１０頁、１９７８年）。具体的には、２％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム、０．４％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、０．１６％（ｗ／ｖ）の酒石酸塩および１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む水溶液を調製し、この水溶液と４％（ｗ／ｖ）の硫酸銅水溶液とを体積比１００：１に混合した溶液を反応溶液として調製した。また、脱イオン水に等量のフェノール試薬（フォーリン・チオカルト試薬；和光純薬社）を混合してフォーリン・チオカルト試薬液を調製した。また、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を標準溶液として調製した。本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液および標準溶液それぞれ１ｍＬに、調製した反応溶液を３ｍＬずつ加えて室温で３０分間インキュベートした。続いて、調製したフォーリン・チオカルト試薬液３００μＬを強く撹拌しながら加えた後、室温で４５分間インキュベートした。その後、６６０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。標準溶液の測定値との比較から、本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を算出した。
【００６７】
［２−５］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度調製
本実施例（２）［２−４］で算出した結果に基づき、本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬに調製した後、４℃で保存した。
【００６８】
（３）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原としたマウスへの免疫およびハイブリドーマの作製
実施例（２）［２−５］の０．５〜１ｍｇ／ｍＬのＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液０．１ｍＬを孔径０．４５ｍｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）に通した後、常法に従って、百日咳菌アジュバントを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔内注射することにより免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、常法に従って、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、コロニーが確認できるまで約１０日間培養した。
【００６９】
（４）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング
［４−１］ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ画分の調製
本実施例（２）［２−１］、［２−２］、［２−３］、［２−４］および［２−５］に記載の方法に従って、健常者血清からｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液を調製した。
【００７０】
［４−２］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
本実施例（２）［２−５］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液および本実施例（４）［４−１］のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液を、ＰＢＳを用いてそれぞれ２０μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて、４℃で一晩インキュベートすることによりＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬをそれぞれプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いて４回洗浄した。続いて、本実施例（３）の、各コロニーの培養上清を、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたウェルおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルに５０μＬ／ウェル入れて、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳで５００倍に希釈したビオチン標識ラット抗マウスｋ鎖（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェルずつ入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ−ＳＡ；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調製したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を１００μＬ／ウェル入れて、室温で３０分間発色反応を行った。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６００ｎｍで吸光度を測定した。ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が大きく、かつｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が小さい培養上清を特定することにより、コロニーの選択を行った。
【００７１】
［４−３］限界希釈法によるクローニングおよびスクリーニング
本実施例（４）［４−２］で選択したコロニーの細胞を、９６穴プレートに１個／ウェルとなるように播き、ペニシリン−ストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、ＴｈｙｍｉｄｉｎｅおよびＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ−ＨＴ−ＨＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０）を用いて培養を行った。これらの培養上清について、本実施例（４）［４−２］に記載の方法に従い、再度ＥＬＩＳＡを行い、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が大きく、かつｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルにおいて吸光度が小さい培養上清を特定することにより、クローンの選択を行った。その結果得られた２つのハイブリドーマを、それぞれＧ１１−２およびＤ１２−５と命名した。
【００７２】
（５）Ｇ１１−２抗体およびＤ１２−５抗体の精製
常法に従って、２，６，１０，１４‐テトラメチル‐２‐ペンタデセン酸（プリステン）を注射したマウスの腹腔内に、本実施例（４）のＧ１１−２およびＤ１２−５をそれぞれ接種して培養し、Ｇ１１−２が産生するモノクローナル抗体（Ｇ１１−２抗体）およびＤ１２−５が産生するモノクローナル抗体（Ｄ１２−５抗体）をそれぞれ含む腹水を得た。
【００７３】
得られた腹水について、常法に従い飽和硫安（飽和硫酸アンモニウム）沈殿法を行って、粗モノクローナル抗体溶液を得た。具体的には、得られた腹水を氷冷しながら、等量の硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下して加えた後、遠心分離を行って上清を除去した。続いて沈殿物に５０％飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて再度遠心して上清を除去することで洗浄を行い、沈殿物をＰＢＳに溶解して粗Ｇ１１−２抗体溶液および粗Ｄ１２−５抗体溶液とした。
【００７４】
続いて、粗Ｇ１１−２抗体溶液および粗Ｄ１２−５抗体溶液それぞれ３００μＬについて、以下の器具・機器、溶離液および条件を用いて常法に従ってＨＰＬＣ法を行い、溶出液を０．５ｍＬずつ分取することにより、１００μｇ／ｍＬ精製Ｇ１１−２抗体溶液を約１０ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ精製Ｄ１２−５抗体溶液を約１５ｍＬ、それぞれ得た。
【００７５】
カラム；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０/３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）
溶離液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＰＢ溶液（ｐＨ７．２）
システムコントローラ；ＣＢＭ−２０Ａ（島津製作所社）
送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社）
オートサンプラー；ＳＩＬ−２０Ａ（島津製作所社）
カラムオーブン；ＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社）
検出器；ＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所社）
条件；流速 ０．５ｍＬ／分
検出波長 ２８０ｎｍ
【００７６】
＜実施例２＞Ｇ１１−２抗体およびＤ１２−５抗体のクラス判定
ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、添付の使用書に従い、イムノクロマトグラフィー法により実施例１（５）のＧ１１−２抗体およびＤ１２−５抗体のクラス判定を行った。その結果、Ｇ１１−２抗体のクラスはＩｇＭであり、Ｄ１２−５抗体のクラスはＩｇＧであることが明らかになった。
【００７７】
＜実施例３＞Ｇ１１−２抗体の抗原解析
（１）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
［１−１］Ｇ１１−２抗体のビオチン標識
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（和光純薬社）に、１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を溶解することによりビオチン標識液を調製した。１００μｇ／ｍＬのＧ１１−２抗体溶液１ｍＬに調製したビオチン標識液を２μＬ添加して、室温で１０分間、振盪しながら反応させた。続いて、ＰＢＳを透析液として透析を行い、未反応のビオチンを除去した。その後、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度が５μｇ／ｍＬとなるよう調製して、ビオチン標識Ｇ１１−２抗体を得た。
【００７８】
［１−２］抗アポリポタンパクＢ抗体のビオチン標識
抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体を含むヤギ抗血清（ＷａｔＰａ；Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ社）について、飽和硫安沈殿法で粗抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液を得た。具体的には、抗血清を氷冷しながら、等量の硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下して加え、遠心分離を行って上清を除去した後、沈殿物に４０％飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて再度遠心して上清を除去することで洗浄を行い、沈殿物をＰＢＳに溶解して粗抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液とした。
【００７９】
続いて、常法に従ってアフィニティカラムクロマトグラフィー法を行った。具体的には、ＰＢＳで１０倍希釈した粗抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液をアフィニティカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケア社）に４℃、一晩ループして通過させ、カラムに抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体を結合させて行った。送液ポンプにはペリスタルティックポンプ（ＳＪ−１２１５；ＡＴＴＯ社）を用い、流速を約０．２ｍＬ／分とし、カラム内の溶液をＰＢＳに置換・洗浄して、流速約０．２ｍＬ／分で０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を流して抗体を溶出させ、その溶出液を０．５ｍＬずつ分取した。
【００８０】
速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を溶出液に加えて中和を行い、各分画において波長２８０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質の存在した分画をプールした後、波長２８０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質濃度を算出し、４．７ｍｇ／ｍＬの精製抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液約３．５ｍＬを得た。その後、ＰＢＳを透析液として透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用いて、４℃で一晩透析し、精製抗アポリポタンパクＢポリクローナル抗体溶液約３．５ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。
【００８１】
続いて、本実施例（１）［１−１］に記載の方法に従って、抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体のビオチン標識を行い、ビオチン標識抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体を得た。ただし、反応時間は１０分間に代えて４時間とした。
【００８２】
（２）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬおよびｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
実施例１（４）［４−２］に記載の方法に従い、ＥＬＩＳＡを行った。ただし、一次抗体として実施例１（３）の各コロニーの培養上清に代えて、本実施例（１）［１−１］のビオチン標識Ｇ１１−２抗体および本実施例（１）［１−２］のビオチン標識抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体をそれぞれ用いた。また、二次抗体は使用せず、発色反応は３０分間に代えて１０分間とし、吸光度測定の際の副波長は６００ｎｍに代えて６２０ｎｍとした。その結果を図３に示す。
【００８３】
図３に示すように、Ｇ１１−２抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．１４４であるのに対し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．０１８であった。一方、抗アポリポタンパクＢ−ＩｇＧ抗体を用いてＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．６９０であるのに対し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡを行った場合、吸光度は０．８２２であった。
【００８４】
以上の結果から、Ｇ１１−２とＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ固相化ウェルとを用いてＥＬＩＳＡを行った場合に強い発色が観察されることが確認された。すなわち、Ｇ１１−２抗体を利用することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを特異的に検出できることが示された。
【００８５】
（２）磁気ビーズによる抗原の回収および抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
［２−１］Ｇ１１−２抗体の磁気ビーズへの固定
実施例１（５）の１００μｇ／ｍＬのＧ１１−２抗体溶液１ｍＬに、２×１０９ｂｅａｄｓ／ｍＬの磁気ビーズ原液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ；Ｖｅｒｉｔａｓ社）１６５μＬを添加し、攪拌しながら４℃で４８時間反応させることにより、磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体溶液を調製した。
【００８６】
［２−２］磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体に特異的に反応した抗原の回収
本実施例（２）［２−１］の磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体溶液を磁石にセットして上清を除去した後、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ１ｍＬを用いて、室温で４時間ブロッキングを行った。続いて、磁石にセットして上清を除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて振盪しながら１０分間洗浄を行った。磁石にセットして上清を除去し、ＰＢＳを用いてさらに３回洗浄を行った後、磁石にセットして上清を除した。そこに、ＰＢＳで２０倍希釈した肝疾患患者血清１ｍＬおよびコントロールとしてＰＢＳ１ｍＬをそれぞれ加え、室温にて１時間、インキュベートした。続いて、磁石にセットして上清を除去した後、ＰＢＳを用いて３回洗浄を行い、磁石にセットして上清を除去した後、０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）をそれぞれ加えて１分間ボルテックス処理することにより、磁気ビーズ固定Ｇ１１−２抗体と抗原とを解離させた。その後、再度磁石にセットし、上清を回収した後、速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和を行った。
【００８７】
［２−３］ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗原の解析
４％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のｇｌｙｃｅｒｏｌおよび０．００５％（ｗ／ｖ）のＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅを含む０．１２６ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を変性用緩衝液として調製した。また、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳおよび３８４ｍｍｏｌ／Ｌのｇｌｙｃｉｎｅを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを泳動用緩衝液として調製した。続いて、本実施例（２）［２−２］で回収した、ＰＢＳを加えた場合の上清をサンプル１、本実施例（２）［２−２］で回収した、肝疾患患者血清を加えた場合の上清をサンプル２、実施例１（５）のＧ１１−２抗体溶液をサンプル３および実施例１（５）のＤ１２−５抗体溶液をサンプル４として、等量の変性用緩衝液をそれぞれのサンプルに加えて混合した後、９０℃で５分間熱処理した。その後、３〜１０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ社）がセットされ、調製した泳動用緩衝液が満たされた泳動槽（ＡＥ−６５００；ＡＴＴＯ社）に、分子量マーカー（ＨｉＭａｒｋ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；インビトロジェン社）５μＬ、サンプル１、サンプル２、サンプル３およびサンプル４をそれぞれ１０μＬ添加して、２０ｍＡ、１５０Ｗで８０分間電気泳動を行った。その後、銀染色試薬（２Ｄ−銀染色試薬・II；コスモ・バイオ社）を用いてゲルを染色した。その結果を図４に示す。
【００８８】
図４に示すように、サンプル１では、約５８ｋＤａの位置にバンドが検出され、サンプル２では、原点、約１７０ｋＤａの位置および約５８ｋＤａの位置にバンドが検出された。サンプル３では、原点の位置にバンドが検出され、サンプル４では、約１７０ｋＤａの位置にバンドが検出された。
【００８９】
約５８ｋＤａの位置のバンドは、サンプル１およびサンプル２で検出されたことから、血清に由来するものではなく、作製した磁気ビーズ由来のバックグラウンドであることが確認された。一方、原点のバンドは、サンプル２およびサンプル３で検出され、実施例２の結果よりＧ１１−２抗体のクラスはＩｇＭであることから、サンプル２にはＩｇＭが含まれることが確認された。また、約１７０ｋＤａの位置のバンドは、サンプル２およびサンプル４で検出され、実施例２の結果よりＤ１２−５抗体のクラスはＩｇＧであることから、サンプル２には、ＩｇＧおよびＩｇＧと同等の分子量を有するＩｇＡが含まれることが確認された。
【００９０】
これらの結果から、肝疾患患者血清に含まれるＧ１１−２抗体の抗原はＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡであることが明らかになった。
【００９１】
（３）Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
［３−１］密度勾配遠心による血清上層画分、中層画分および下層画分の調製
肝疾患患者２名（肝疾患１および肝疾患２とする）および健常者１名から血清を採取した。これらの血清それぞれ２ｍＬについて、実施例１（２）［２−１］に記載の方法に従い、密度勾配遠心法を行った。ただし、超遠心機はｈｉｍａｃ ＣＰ６０Ｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（日立工機社）に代えて、ＯｐｔｉｍａＭＡＸ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用い、ローターはＲＰＶ−５０Ｔ ｒｏｔｏｒ（日立工機社）に代えてＭＬＮ−８０（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）を用いた。また、遠心の際の回転数は５００００ｒｐｍとし、遠心時間は２０時間とした。遠心終了後、総リポタンパク質画分（ｄ ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）として上層画分をそれぞれ２ｍＬを回収し、さらに、中層画分をそれぞれ４ｍＬおよび下層画分をそれぞれ２ｍＬ回収した。
【００９２】
［３−２］Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例１（５）のＧ１１−２抗体について、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度５μｇ／ｍＬに希釈した。これを、９６穴プレートＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて、３７℃で２時間インキュベートすることによりＧ１１−２抗体をプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、本実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分をそれぞれ５０μＬ／ウェル入れて、４℃で一晩反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０μＬ／ウェル入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５００倍に希釈したＡＬＰ−ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調製したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を、１００μＬ／ウェルずつ入れて室温で６０分間発色反応を行った。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ；サーモサイエンティフィックフィッシャー社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図５に示す。
【００９３】
図５に示すように、肝疾患１の上層画分の吸光度は０．１１７、中層画分の吸光度は、０．０４７下層画分の吸光度は１．４７６であり、肝疾患２の上層画分の吸光度は０．０１、中層画分の吸光度は０．０１、下層画分の吸光度は０．９０１であった。一方、健常者の上層画分および中層画分の吸光度は０であり、下層画分の吸光度は０．３４３であった。
【００９４】
これらの結果から、Ｇ１１−２抗体の抗原は、肝疾患患者血清の下層画分に主に存在することが確認された。すなわち、Ｇ１１−２抗体の抗原は、上層画分に存在するリポタンパク質ではなく、下層画分に主に存在する免疫グロブリンタンパク質であることが確認された。また、健常者では上層画分において反応が全く検出されない一方で、肝疾患患者では上層画分において反応が検出されたことから、Ｇ１１−２抗体の抗原となる免疫グロブリンタンパク質は、リポタンパク質に結合することが確認された。
【００９５】
以上より、Ｇ１１−２抗体の抗原は、肝疾患患者血清に含まれるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに結合する免疫グロブリンタンパク質すなわち自己抗体であることが確認された。また、この自己抗体は血清中において、その多くがＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに結合している状態ではなく、遊離の状態で存在することが確認された。
【００９６】
＜実施例４＞Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける検出抗体の検討
実施例３（３）［３−２］に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは本実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて肝疾患患者２名（以下、「肝疾患１」および「肝疾患２」とする）および健常者２名（以下、「健常者１」および「健常者２」とする）からそれぞれ採取した血清をＰＢＳで１００倍に希釈したものを用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＰＢＳで１万倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（α）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＰＢＳで４０万倍に希釈したビオチン標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ５μ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）およびＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。その結果を図６に示す。
【００９７】
図６に示すように、検出抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体を用いた場合、肝疾患１および肝疾患２でいずれも吸光度の測定値は大きい一方で、健常者１および健常者２ではいずれも吸光度の測定値は小さい。検出抗体として抗ヒトＩｇＡ（α）抗体を用いた場合も同様であり、肝疾患患者１および肝疾患患者２でいずれも吸光度の測定値は大きい一方で、健常者１および健常者２ではいずれも吸光度の測定値は小さい。これに対し、検出抗体として抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ５μ抗体を用いた場合は、肝疾患患者１で吸光度の測定値は大きく、肝疾患患者２および健常者１および健常者２ではいずれも同程度に吸光度の測定値は小さい。検出抗体として抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体を用いた場合も同様であり、肝疾患患者１で吸光度の測定値は大きく、肝疾患患者２および健常者１および健常者２ではいずれも同程度に吸光度の測定値は小さい。
【００９８】
これらの結果から、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、検出抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体または抗ヒトＩｇＡ（α）抗体を用いた場合に、肝疾患特異的に反応することが確認された。
【００９９】
＜実施例５＞血清サンプルの凍結融解試験
（１）血清サンプルの調製
肝疾患患者１名から血清を採取して７等分し、患者サンプル０、患者サンプル１、患者サンプル２、・・・患者サンプル６とした。また、健常者１名から血清を採取して同様に７等分し、健常者サンプル０、健常者サンプル１、健常者サンプル２、・・・健常者サンプル６とした。患者サンプル０および健常者サンプル０は４℃で保存し、患者サンプル１および健常者サンプル１は−８０℃で一晩保存することにより凍結後、翌日融解した。患者サンプル２および健常者サンプル２は−８０℃で一晩保存することにより凍結後、翌日融解することを２回繰り返した。同様に、患者サンプル３および健常者サンプル３は前述の凍結融解を３回繰り返し、患者サンプル４および健常者サンプル４は４回、患者サンプル５および健常者サンプル５は５回、患者サンプル６および健常者サンプル６は６回繰り返した。
【０１００】
（２）Ｇ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡ
実施例３（３）［３−２］に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて本実施例（１）の患者サンプル０〜患者サンプル６および健常者サンプル０〜健常者サンプル６の合計１４サンプルをそれぞれ用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。その結果を図７に示す。
【０１０１】
図７に示すように、患者サンプル０〜患者サンプル６の吸光度はいずれも約０．１５であり、健常者サンプル０〜健常者サンプル６の吸光度はいずれも約０．０２５であった。この結果から、血清の凍結融解回数がいずれの場合も、肝疾患患者におけるＥＬＩＳＡの吸光度および健常者のＥＬＩＳＡの吸光度は変化しないことが確認された。すなわち、Ｇ１１−２抗体の抗原である、肝疾患患者血清に含まれるＴＧ−ｒｉｃｈＬＤＬを認識する自己抗体は凍結融解を繰り返しても安定に存在することが確認された。
【０１０２】
＜実施例６＞Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける反応性と肝疾患重症度の相関
（１）アガロースゲル電気泳動による肝疾患重症度の判定
肝疾患患者９名、健常者１４名からそれぞれ血清を採取し、実施例１（１）に記載の方法に従ってアガロースゲル電気泳動を行った。健常者血清および肝疾患患者血清の典型的な泳動結果を図８に示す。
【０１０３】
図８に示すように、肝疾患患者血清のうち、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失したものと欠失していないものがあった。そこでこの結果に基づき、健常者の泳動パターンに比して、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失した肝疾患患者を重度群と判定し、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が欠失していない肝疾患患者を軽中度群と判定したところ、肝疾患患者９名のうち６名が軽中度群であり、３名が重度群であった。
【０１０４】
（２）Ｇ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡ
実施例３（３）［３−２］に記載の方法に従い、ＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて本実施例（１）の健常者群１４名、軽中度群６名および重度群３名の血清合計２３サンプルをＰＢＳで１００倍に希釈したものをそれぞれ用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。吸光度の測定値を健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計し、平均値を算出した。その結果を図９に示す。各群間の比較は、一元配置分散分析およびＳｃｈｅｆｆｅの方法による多重比較検定を行い、 Ｐ＜０．０５である場合に、統計学的に有意であるとした。
【０１０５】
図９に示すように、健常者群の吸光度は０．０６３±０．０５５であったのに対し、軽中度群の吸光度は０．０８３±０．０３４、重度群の吸光度は０．２８１±０．２００であった。多重比較検定の結果、重度群と健常者群との間および重度群と健常者群との間はＰ＜０．０１で、有意差が認められた。一方、健常者群と軽中度群との間には有意差が認められなかった。
【０１０６】
これらの結果から、Ｇ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡは、肝疾患患者において肝疾患の重症度診断に有用であることが確認された。
【０１０７】
＜実施例７＞脂質異常症患者血清に対するＧ１１−２抗体を固相とする（固着させた）ＥＬＩＳＡの反応性
（１）血清脂質項目の測定
健常者２名（健常者１および健常者２とする）、脂質異常症患者７名（脂質異常症１、脂質異常症２、・・・脂質異常症７とする）および肝疾患患者１２名（肝疾患１、肝疾患２、・・・肝疾患１２とする）から血清合計２１サンプルを採取し、以下の試薬および日立自動分析装置７１７０（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて添付のプロトコールに従い血清中脂質濃度を測定した。続いて、測定値を健常者、脂質異常症患者および肝疾患患者の別に集計して、平均値を算出した。その結果を表２に示す。
【０１０８】
総コレステロール（ＴＣ）；コレステストＣＨＯ（積水メディカル社）
中性脂肪（ＴＧ）；エクセライザ ＴＧ（積水メディカル社）
リン脂質（ＰＬ）；ピュアオートＳ ＰＬ（積水メディカル社）
高密度リポタンパク質中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）；コレステストＮ ＨＤＬ（積水メディカル社）
低密度リポタンパク質中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）；コレステスト ＬＤＬ（積水メディカル社）
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
（２）Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例３（３）［３−２］に記載の方法により、ＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例（３）［３−１］の上層画分、中層画分および下層画分に代えて本実施例（１）の健常者２名、脂質異常症患者７名および肝疾患患者１２名の血清合計２１サンプルをそれぞれＰＢＳで１００倍に希釈したものを用いた。また、検出抗体はＰＢＳで５０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に代えて、ＰＢＳで１０万倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。また、発色時間は３０分とした。その結果を図１０ａに示す。また、各サンプルの吸光度の測定値について、以下の式を用いて、本実施例（１）で測定した各サンプルのＬＤＬ−Ｃの血清中濃度で除した。その結果を図１０ｂに示す。
【０１１１】
式；吸光度の測定値×１００００／本実施例（１）で測定した血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度
【０１１２】
図１０ａに示すように、健常者１および健常者２の吸光度の測定値はいずれも小さい一方、脂質異常症１〜脂質異常症７の吸光度の測定値は、概ね健常者の吸光度の測定値と比べて大きい。特に、脂質異常症１の吸光度の測定値は肝疾患患者の吸光度の測定値と同程度に大きい。これに対し、肝疾患１〜肝疾患１２の吸光度は、概ね健常者および脂質異常症患者の吸光度の測定値と比べて大きい。これらの結果から、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、健常者では反応が小さい一方、脂質異常症患者および肝疾患患者では比較的反応が大きいことが確認された。
【０１１３】
また、図１０ｂに示すように、各サンプルの吸光度の測定値を各サンプルの血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度で除したところ、肝疾患患者の測定値と健常者および脂質異常症患者の測定値との差が大きくなり、肝疾患患者の測定値が大きい一方、健常者および脂質異常症患者の測定値が小さくなった。この結果から、Ｇ１１−２抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度の測定値を血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度で除することにより、肝疾患特異的に大きな値となることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
自己抗体がヒトの自己抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）が肝疾患患者から採取された血清に含まれるトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマにより産生される、請求項１から請求項４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５である、請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）検出用キット。
【請求項９】
被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
前記複合体を検出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項１０】
被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、
担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
前記複合体を検出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項１１】
自己抗体がヒトの自己抗体である、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、肝疾患患者から採取された血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体である、請求項９から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、請求項９から請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
自己抗体がヒトの自己抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）が肝疾患患者から採取された血清に含まれるトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５であるハイブリドーマにより産生される、請求項１から請求項４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ−８９５である、請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）検出用キット。
【請求項９】
被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
前記複合体を検出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項１０】
被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体を検出する方法であって、
トリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、
担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被験者から採取した血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
前記複合体を検出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項１１】
自己抗体がヒトの自己抗体である、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、肝疾患患者から採取された血清に含まれ、かつトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を認識する自己抗体に対し特異的に反応するモノクローナル抗体である、請求項９から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
自己抗体がＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群より選ばれる１または２である、請求項９から請求項１２のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【公開番号】特開２０１１−１５７３２４（Ｐ２０１１−１５７３２４Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２０７６（Ｐ２０１０−２２０７６）
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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