ナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析
本発明は試料のナノワイヤ支援質量分析方法に関する。さらに詳しくは、試料を固定し、照射される試料にレーザーエネルギーを効果的に伝達しながら試料の脱離／イオン化を行うことができるナノワイヤを用いることにより、それによって、マトリクス溶液なしで試料の質量分析を行うことを可能にする。本発明は、上記のナノワイヤを使用して効果的に試料の脱離／イオン化を行うことにより、低分子量の試料と同様に、試料の定性的、定量的、及び微量分析を効果的に行うことを可能にする。さらに、本発明はＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ ＭＳで用いられる典型的な質量分析計にも可能である。特に、本発明は、１０００Ｄａより小さい分子量の試料の質量分析を行うことができ、所定の領域に試料を固定すて定量的に分析を行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料のナノワイヤ（ｎａｎｏｗｉｒｅ）支援質量分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ナノワイヤを用いることにより、試料を固定し、照射される試料にレーザーエネルギーを効果的に伝達しながら試料の脱離／イオン化を行うことができ、それによって、マトリクス溶液なしで試料の質量分析を行う。
【背景技術】
【０００２】
質量分析計は化合物の質量を測定する分析機器である。それは、一般的に、荷電させて化合物をイオン化することにより、質量対電荷（mass-to-charge；m／z）の値を測定することによって化合物の分子量を決定する。電子ビームを用いた電子イオン化、高速の原子の衝突、レーザーを用いた方法、及び試料を電場の中にスプレーする方法など、化合物をイオン化するためのたくさんの方法がある。
【０００３】
タンパク質や核酸などの極めて大きな質量を有する生物化学的物質に対して、レーザーを用いるＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析（マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析；以降ＭＡＬＤＩとする）が使用され、最近この種の様々な分析機器が開発され、現時点で購入することができきる。これらの機器は、分析しようとする物質へのエネルギーの伝達を支援するだけでなく、物質のイオン化を促進するマトリクスを用いることにより、分子量３００ｋＤａ以上のポリマーの分子量を測定できる。さらに、それらの相対的に高い感度に起因して、フェムトモルレベルでの試料の分析が可能であり、イオン化工程における化合物の破損を大きく減少して混合物の分析を可能にするための助けともなる。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ支援質量分析のために、試料は下記のように準備される。
【０００５】
（１）少量のマトリクス溶液を金属プレートからなるターゲット板上に加え、乾燥させ、それから、分析しようとする試料溶液をさらにその上に加えて乾燥させる。あるいは、
マトリクス物質を試料溶液に混合した後、ターゲットプレートに置き、結晶化させる。
【０００６】
（２）マトリクスと結晶化した試料の領域にレーザーを照射し、マトリクスに支援されて試料が離脱／イオン化する。
【０００７】
典型的な質量分析計は、イオン化した試料が電位の差異によりセンサー側に移動するように、試料が位置したターゲットプレートと質量分析用センサーの間に電場を印加する構造を有する。試料の電荷量が既知である場合、試料がセンサーに到着するのに要した時間などの変数を基にして試料の質量を分析することができる。
【０００８】
上記のＭＡＬＤＩ法は質量分析に大変有用であるが、試料の性質によってイオン化に適合したマトリクス物質を選択することがまた必要である。マトリクス物質の例は、ニコチン酸、桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸などである。これらのマトリクス物質は照射するエネルギーを吸収することでプロトンを発生させ、それを試料に結合させ、それによって試料のイオン化を促進することが知られている。しかし、正確なイオン化メカニズムはまだ解明されておらず、従って与えられた試料に適合したマトリクス物質を選定することは手腕を問われるところである。
【０００９】
さらに、ＭＡＬＤＩは、レーザーにより活性化されたマトリクスにより試料がイオン化される過程で、低分子量マトリクスとマトリクス分解性生物が質量分析スペクトル上に示されるため、その使用は１０００Ｄａより大きな分子量を有する物質に大きく制限されるという不利益を有する。
【００１０】
また、マトリクスの選定によって分解生成物のイオン化が決定されるため、より適切なマトリクス物質の選定が必要となり、混合物の中の未知物質の分析を行うのは困難である（非特許文献１）。
【００１１】
また、ＭＡＬＤＩ法は、試料の準備工程で得られた結晶化した試料の空間的分布が均一ではなく、従って、照射位置によってレーザーにより励起される試料の量が変化するという不利益を有する。従って、適切な定量分析のために、様々な位置を照射して得られた様々な結果が統計的に解釈される。ＭＡＬＤＩ法での定量分析に対して広く知られた方法は、分析しようとする化合物とほとんど同一構造を有する化合物に放射性同位元素でラベルした内部標準物質を一定の比率で混合してスペクトルを測定する方法が知られている（非特許文献２）。しかし、上記の方法でもＭＡＬＤＩ法では試料の正確な定量分析を行うことは困難である。
【００１２】
マトリクスを使用せずに試料の脱離／イオン化のエネルギー源としてレーザーを使用する質量分析法として、ＤＩＯＳ ＭＳ（Desorption Ionization on Silicon Mass Spectroscopy；以下ＤＩＯＳとする）が知られている。一般的に、ＤＩＯＳはマトリクスなしに多孔質シリコンをターゲットとして用いる試料の質量分析方法である。多孔質シリコンは電気エッチングにより形成され、多孔性と酸化の程度の調節によりＤＩＯＳが可能となる。ＤＩＯＳに使用される多孔質シリコンは、マトリクスと同様にレーザーエネルギーを吸収することで試料のイオン化を供すると考えられているが、試料の離脱／イオン化のための正確なエネルギー伝達経路はまだ知られていない。
【００１３】
ＤＩＯＳはマトリクスを使用しなくても、相対的に低い分子量の化合物と同様に、タンパク質、核酸などの高い分子量の物質の定量分析を行うことを可能にすると知られている（特許文献１、非特許文献３、非特許文献４）。
【特許文献１】米国特許第６，２８８，３９０号Ｂ１
【非特許文献１】G. Suizdak, 1. Ion sources and sample introduction, In: Mass spectroscopy for biotechnology, Acedemic press, 1996, p13
【非特許文献２】M.J. Kang, E. Heinzle, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 15(2001) 1327-1333
【非特許文献３】J. Wel, J. M. Burlak, G. Suizdak, Nature, 399(1999) 243-246
【非特許文献４】W.G. Lewis, Z. Shen, M.G. Finn, G. Suizdak, International Journal of Mass spectrometry, 226(2003) 107-116
【非特許文献５】1.J. Johnson, Heon-Jin Choi, K.P. Knutsen, R.D. Schaller, P. Yang, R.J. Saykally, “Single Gallium Nitride Nanowire Laser,” Nature Materials, 1, 2, 106-110 (2002)
【非特許文献６】J.M. Bermond, N, Lenoir, J.P. Prulhiere, M. Drechsler, Sur. Sci. 42, 306 (1974)
【非特許文献７】V.E. Frankevich, J. Zhang, S.D. Friess, M. Dashtiev, R. Zenobi, Anal. Chem. 2003, 75, 6063
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
一方、ＤＩＯＳの場合、多孔質シリコン基板に試料溶液を注入する過程で、試料溶液が多孔質構造に浸透して結晶化し、このように、結晶のサイズを制限することを困難にしており、また、レーザー照射点に試料の結晶の中心を一致させることも難しい。このような理由により、１〜２回の試料測定を通した定量分析はほとんど不可能である。また、シリコンのみ適用可能であるため、様々な種類の試料に適合したエネルギー伝達媒体を選択することができない。また、レーザーエネルギーが２次元的にのみ伝達されるため、効果的な脱離／イオン化が困難となる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、上述の問題を解決するために、本発明は、従来の多孔質シリコンに代わって用いられるナノワイヤが、試料を固定でき、効果的にレーザーエネルギーを照射される試料に伝達して、マトリクス溶液を用いることなく試料の質量分析を行うことを可能にする、ナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
以下、本説明を詳しく説明する。
【００１７】
本発明の実施形態において、レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法が提供され、
（ａ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に多数の微細なナノワイヤを成長させることによりナノワイヤスポットを形成する工程と、
（ｂ）分析しようとする物質を含む試料をナノワイヤスポットに配置し、乾燥により結晶化させる工程と、
（ｃ）基板に電圧を印加した状態で、減圧下で試料がナノワイヤに吸着及び結晶化したナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、ナノワイヤを通してエネルギーを試料に伝達して、イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有する。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法が提供され、
（ａ）多数の微細なナノワイヤを含有するナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布されたナノワイヤ懸濁液を乾燥させてナノワイヤアイレット（islet）を形成する工程と、
（ｃ）分析しようとする物質を含む前記試料をナノワイヤスポットに配置し、それの乾燥により結晶化させる工程と、
（ｄ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で試料がナノワイヤに吸着及び結晶化した前ノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、ナノワイヤを通してエネルギーを前記試料に伝達して、イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有する。
【００１９】
本発明のさらに他の実施形態において、レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法が提供され、
（ａ）多数の微細なナノワイヤと分析しようとする物質を含有する試料溶液を混合してナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布されたナノワイヤ懸濁液を乾燥させて、ナノワイヤと前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した試料を有するナノワイヤアイレット（islet）を形成する工程と、
（ｃ）基板に電圧を印加した状態で、減圧下でナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを試料に伝達して、イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有する。
【００２０】
添付の図面を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
【００２１】
本発明は、従来の多孔質シリコンの代わりに用いられるナノワイヤが、試料を固定し、照射される試料にレーザーエネルギーを効果的に伝達して、マトリクス溶液を用いずに試料の質量分析を行うことを可能にする、試料のナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＮＡＤＩ ＭＳ：Nanowire-Assisted Laser Desorption／Ionization Mass Spectrometric Analysis；以下ＮＡＤＩとする）の方法に関する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態を以下に記載する。
【００２３】
まず、基板上の選択された領域に多数の微細なナノワイヤを成長させ、それらは典型的なＭＡＬＤＩ工程に用いられることができ、それらからナノワイヤスポットを形成する。ここで用いられる基板は電圧を印加することができる導電体または半導体の基板である。ナノワイヤは直径が５００ｎｍ以下でアスペクト比が１０以上であることが好ましい。直径が５００ｎｍを超えてナノワイヤが成長すると、照射されるレーザーエネルギーを増幅することや、あるいは試料内で分布を均一化させることが困難となり、一方、アスペクト比が１０より小さくナノワイヤが成長すると、照射されるレーザーエネルギーを増幅させながらエネルギーを効率的に伝達することが難しくなる。
【００２４】
ナノワイヤは、シリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される。また、定量的観点から、ナノワイヤスポットの面積が試料の脱離／イオン化のために照射される面積と等しく、または、小さくなるように形成することが好ましい。
【００２５】
それから、ナノワイヤに吸着し、乾燥により結晶化できるように、分析しようとする物質を含む試料が、ＭＡＬＤＩ工程における方法を用いてナノワイヤが成長した領域に配置される。試料は塩と分析しようとする物質を有し、塩の濃度は１０ｍＭより大きく、一方で分析しようとする物質の濃度は試料中に１フェムトモルより小さく含まれる。
【００２６】
それから、ＭＡＬＤＩ工程で使用される機器と同様な真空状態で、ナノワイヤと結晶化した試料が吸着した基板がナノワイヤスポット上にレーザー照射され、一方、その間同時に、基板に電圧が印加された状態で、イオン化された試料が質量分析にかけられる。ここで、脱離／イオン化した試料は、質量分析を行うため、基板と分析用センサー間に印加された電場によりセンサーに移動される。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態を以下に記載する。
【００２８】
まず、所定の基板に多数の微細なナノワイヤを成長させ、このナノワイヤを基板から分離し、ナノワイヤ物質の種類に従って蒸留水、水溶液またはアルコールなどの揮発性溶液と混合してナノワイヤ懸濁液を形成する。例えば、ナノワイヤを成長させた基板（以下、ナノワイヤチップとする）を揮発性溶液の中に入れ、超音波を印加してナノワイヤを基板から分離することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製することができる。または、ナノワイヤを成長させた基板からナノワイヤをスクラッチング（scratching）により分離し、基板にスプレーするための揮発性溶液と混合することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製することができる。ここで、第１の好ましい実施形態のように、各ナノワイヤは直径が５００ｎｍ以下でアスペクト比が１０以上であることが好ましい。さらに、ナノワイヤは、シリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される。
【００２９】
それから、典型的なＭＡＬＤＩ工程において使用できる基板の選択された領域上に上記のナノワイヤ懸濁液をスプレーし、乾燥して、ナノワイヤアイレットを形成する。用いられる基板は、電圧を印加することができる導電体または半導体の基板である。さらに、ナノワイヤ懸濁液を基板上の選択された領域にスプレーすることによってナノワイヤアイレットを形成することができる。また、ナノワイヤアイレットの面積を、試料の脱離／イオン化のためのレーザーで照射される面積と等しく、または、小さくすることが好ましい。
【００３０】
それから、質量分析のための物質を含む試料溶液を上述のナノワイヤアイレット上に塗布し、乾燥させ、結晶化させる。ここで、スプレー領域内で試料を保持するケージ（ｃａｇｅ）として働くナノワイヤに試料が吸着されるようになって、結晶化された試料とナノワイヤとの混合物が適切に位置付けられる。試料は塩および分析しようとする物質とで構成される。好ましくは、塩の濃度は１０ｍＭより大きく、一方で分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含有される。
【００３１】
それから、ＭＡＬＤＩ工程で使用される機器と同様な真空状態で、ナノワイヤと試料が脱離／結晶化した基板がナノワイヤアイレット上にレーザー照射され、一方、その間同時に、基板に電圧が印加された状態で、イオン化された試料が質量分析にかけられる。ここで、脱離／イオン化した試料は、質量分析を行うため、基板と分析用センサー間に印加された電場によりセンサーに移動される。
【００３２】
本発明のまた別の好ましい実施形態を下記に記載する。
【００３３】
まず、所定の基板に多数の微細なナノワイヤを成長させ、このナノワイヤを基板から分離し、分析しようとする物質を含む試料溶液と混合して、最終的にナノワイヤ懸濁液を調製する。例えば、ナノワイヤを成長させた基板（即ち、ナノワイヤチップ）を揮発性溶液に入れ、超音波を印加してナノワイヤを基板から分離させ、試料溶液が添加されることにより、ナノワイヤと試料を含むナノワイヤ懸濁液を調製することができる。または、ナノワイヤを成長させた基板からナノワイヤをスクラッチングにより分離して、基板へのスプレーを可能にする揮発性溶液と混合することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製することができる。ここで、第１の好ましい実施形態のように、各ナノワイヤは直径が５００ｎｍ以下でアスペクト比が１０以上であることが好ましい。さらに、ナノワイヤは、シリコンを含む単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される。上記の試料は塩および分析しようとする物質とで構成される。好ましくは、塩の濃度は１０ｍＭより大きく、一方で分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含有される。
【００３４】
それから、典型的なＭＡＬＤＩ工程で使用できる基板の選択された領域に上記のナノワイヤ懸濁液をスプレーして乾燥させてナノワイヤアイレットを形成し、試料を結晶化させる。使用される基板は電圧を印加することができる導電体または半導体の基板である。さらに、ナノワイヤ懸濁液を基板上の選択された領域にスプレーすることによってナノワイヤアイレットを形成することが可能である。さらに、ナノワイヤアイレットの面積を、試料の脱離／イオン化のためのレーザーで照射される面積と等しく、または、小さくすることが好ましい。
【００３５】
上記の好ましい実施形態に記載のように、ナノワイヤの種類によってナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有するレーザーを用いて照射が施され、また、真空圧、即ち雰囲気圧力は１０−１６ｔｏｒｒより低く設定される。
【００３６】
さらに、基板上に電圧を印加する際、約５，０００Ｖ〜３０，０００Ｖが印加され、分析しようとするイオン化物質を質量分析する過程でイオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する。
【００３７】
上述のＮＡＤＩ工程において、マトリクスなしにナノワイヤにより提供される効率的な試料の脱離およびイオン化の基本的原理を詳しく下記に説明する。
【００３８】
ナノワイヤは、レーザー照射に曝されると、エネルギーを吸収して光子（photon）を生成することができ、ここで、ナノワイヤ自身は光子を増幅させることができるキャビティ（cavity）構造を有する（非特許文献５）。従って、ナノワイヤは外部から伝達されたレーザーエネルギーを自然に増幅でき、誘導放出の形態で増幅したエネルギーを試料に再び伝達することができる。従って、どんな形態の他のエネルギー伝達媒体よりも最も効率的にエネルギーを試料に伝達することができ、それによって比較的容易な試料の脱離／イオン化を促進できる。
【００３９】
本発明で用いられるナノワイヤは、数（few）ナノメートルの直径と比較的大きなアスペクト比を有する針状の形状である。従って、ナノワイヤの両端は原子のレベルで非常に鋭い先端である。これらの幾何学的な構造は、質量分析用の装置で基板とセンサーの間に電場をかけると、ナノワイヤの前方の先端（front tip）に極めて高い電場を生成でき、ナノワイヤの前方の先端の高い電場は電界脱離（field desorption）を引き起こし、それによって試料の脱離／イオン化を可能にする。さらに、レーザー照射されると、それらはレーザに誘起されてナノワイヤの前方の先端に比較的高い電場を生成できる（非特許文献６）。極めて高い局在の電場の生成は、ナノワイヤの前方の先端における脱離／イオン放出の放出を加速することができ、それによって試料の脱離／イオン化を容易にする。
【００４０】
さらに、ナノワイヤの前方の先端の幾何学的な形状は、電場が印加されたときに電子の放出を可能にし、この電子放出が試料のイオン化を容易にする（非特許文献７）。
【００４１】
従来の多孔性シリコンを用いるＤＩＯＳの場合、多孔性構造に試料溶液を注入して乾燥するため、試料への二次元的なレーザー照射のみが可能である。しかし、本発明においては、多孔性シリコンとは異なって、ナノワイヤ上に形成された結晶化された試料はレーザーに３次元的に曝され、このように試料にレーザーエネルギーをより効果的に伝達でき、これによってより効果的な脱離／イオン化が行われる。
【００４２】
上述のように、ナノワイヤの使用は効果的な試料へのエネルギー伝達を可能にし、容易な脱離／イオン化を促進し、従ってマトリクスなしでの質量分析を可能とする。
【００４３】
また、本発明によるＮＡＤＩ工程において、結晶化された試料内の試料分布は、より正確なデータを保証する。即ち、ナノワイヤの使用は、基板上の触媒のパターンにより成長位置を正確に制御することができる。例えば、本発明における基板上にナノワイヤを成長させる工程で、特に（ナノワイヤスポットの形成における）シリコンのナノワイヤを成長させるとき、スパッタリング気相成長によりマスクを用いて触媒として働く金属であるＡｕを円形形状の所定の厚み及び直径を持つようにシリコン基板の表面に成長させた後、化学気相成長（ＣＶＤ）によりシリコン基板上に５００℃でＳｉＣｌ４を供給することによりシリコンナノワイヤを成長させることができる。
【００４４】
または、ＩｎＮナノワイヤを成長させる場合、スパッタリング気相成長によりマスクを用いて触媒として働く金属であるＡｕを円形形状の所定の厚み及び直径を持つようにシリコン基板の表面に成長させた後、化学気相成長によりシリコン基板上に５００℃でＩｎＣｌ３及びＮＨ３を供給することによりＩｎＮナノワイヤを成長させることができる。
【００４５】
さらに、ナノワイヤが成長したところに試料を位置させるとき、ナノワイヤが、試料が結晶化されるまで液体試料を保持する３次元的なケージの役割を果たし、それによってナノワイヤが位置するところに試料の結晶中心を形成する。試料の結晶中心のサイズが照射されるレーザーの直径と等しいサイズに調節されると、１〜２回のみのレーザー照射が試料の脱離／イオン化を十分に促進し、それが分子量の測定を可能にして、このようにして定量的な分析が可能となる。
【００４６】
あるいは、ナノワイヤ溶液を用いる場合、広げられたナノワイヤが乾燥過程で試料を固定するケージの役割を果たし、これによって、レーザーの直径サイズ内で試料を固定することが可能となる。従って、１〜２回のみのレーザー照射が試料のイオン化を十分に促進し、それが分子量の測定を可能にして、このようにして定量的な分析が可能となる。
【００４７】
典型的な多孔性シリコンは工程のために適切な物質の選択に制限があり、従ってレーザーエネルギーを効果的に利用するのにも制限がある。反対に、本発明によるナノワイヤを用いた脱離／イオン化法の場合、試料に伝達されるレーザーエネルギーは、様々なエネルギーギャップを有するナノワイヤを使用して望まれるエネルギーレベルの範囲内で適切に調製可能である。
【００４８】
典型的な多孔性シリコンを利用したＤＩＯＳの場合、多孔性構造が制限された領域のみで使用されるという不利益がある。即ち、試料溶液の注入及び乾燥の過程で試料溶液が多孔性構造に浸透して結晶化し、このために、試料の結晶のサイズは制限されない。反対に、本発明によるＮＡＤＩの場合、試料はナノワイヤケージを用いて結晶化し、これによって試料の結晶サイズを制限することができる。
【００４９】
また、ナノワイヤを用いる本発明のＮＡＤＩでは、使用済みターゲットのリサイクルが難しい典型的な多孔性シリコンを用いるＤＩＯＳの場合と異なり、ターゲットとして従来の金属プレート（plate）を用いることにより適切な洗浄後に使用済みターゲットをリサイクルすることができる。
【００５０】
ＤＩＯＳの場合、ＤＩＯＳの効率は酸化により悪化すると報告がなされており、従って密閉された状態で保管されなければならない。しかし、ナノワイヤを使用したターゲットプレートは酸化した生成物の使用が可能で、従って簡易な包装が可能となり、また、大気中での長期保管が可能となる。
【００５１】
ＮＡＤＩ法を使用してマトリクスがなくても質量分析が可能であることを示すため、ＺｎＯナノワイヤチップおよびペプチドを使用して実験を行った。シリコン基板の表面にスパッタリング気相成長法により触媒の役割をするＡｕを２ｎｍの厚さで所定の領域に蒸着させ、化学気相成長法により５００℃でジエチル亜鉛（diethylzinc）と酸素を供給し、それによってＺｎＯナノワイヤの選択した領域への成長をａｌｌｏｗすることにより、ＺｎＯナノワイヤチップを形成した。このように形成されたナノワイヤを有する基板が質量分析計の試料検査プレートに挿入されたターゲットプレートを図１に示すように形成した。
【００５２】
図１において、参照番号１は検査プレート、参照番号２はターゲットプレート、参照番号３は基板、参照番号４はナノワイヤスポットを示す。また、図１（ａ）は、ＺｎＯナノワイヤスポットが形成された基板と、この基板が質量分析計の試料検査プレートに挿入されたターゲットプレートの写真を示す。図１（ｂ）と（ｃ）は、走査電子顕微鏡で撮影された成長したナノワイヤの拡大した写真を示す。ナノワイヤスポット（４）上に成長したに対するＺｎＯの成長条件を、平均直径１００ｎｍ、平均長さ３μｍ、平均密度約１×１０6ナノワイヤ（ＮＷｓ）／ｍｍ2に制限した。ナノワイヤスポット（４）の直径を０．２ｍｍに制限し、試料の結晶は試料のイオン化のためにレーザーの円形スポット（直径０．２ｍｍ）により照射された。上述のように、試料結晶の大部分がレーザーに曝され、従って、試料の結晶表面を通してイオン化した試料の量が試料の濃度と定量的な関係を持つようにした。
【００５３】
質量分析には、Bruker Daltonics社（ドイツ）のリフレックス３を使用した。
【００５４】
試料としては、ペプチドであるアンギオテンシン（ＭＷ１０１４、Sigma Chemical社、米国）とロイシンエンケファリン（ＭＷ５８８、Sigma Chemical社、米国）を各々使用した。
【００５５】
図２は、ＺｎＯナノワイヤ上に試料なしにレーザーを照射した後の分子量ピークを示したグラフである。図２に示すように、ＺｎＯナノワイヤは試料のピークと混乱させうる分子量ピークを生成しない。
【００５６】
図３は、ロイシンエンケファリンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．１３、０．２５、０．５０、及び１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ加えた後、質量分析を行った結果を示す。上記の結果から、ＺｎＯナノワイヤチップを用いて質量分析が可能であることが分かった。また、ＺｎＯナノワイヤチップの各々の濃度に対する質量比較の結果は、ロイシンエンケファリンの分子量に対するピークの高さと上記の濃度が定量関係を有することを示す。
【００５７】
図４は、アンギオテンシンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．２５、０．５０、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ加えた後、質量分析を行った結果を示す。ロイシンエンケファリンの場合のように、質量比較の結果はアンギオテンシンの分子量に対するピークの高さと上記の濃度が定量関係を有することを示す。
【００５８】
上述のように、本発明によるナノワイヤチップのターゲットプレートを用いるとき、マトリクスなしに質量分析を行うことが可能であり、また、定量分析が可能であることも示す。比較のために同一試料と典型的な金属ターゲットプレートを用いて質量分析を行ったところ、胆管癌（ＣＣＡ）をマトリクスとして使用した場合にはＣＣＡ自体のピークとペプチドのピークがともに得られたが、マトリクスを使用しなかった場合は高濃度の試料でも分子量ピークが得られなかった。即ち、典型的な金属ターゲットプレートをマトリクスなしで用いる場合、試料の質量分析は不可能であった。
【００５９】
一方、典型的なマトリクスを使用せずに質量分析が行える多孔性シリコンを用いたＤＩＯＳ法において、シリコンを除いて他の物質を使用することができないため、用いるエネルギー伝達のための物質に制限がある。反対に、本発明のＭＡＬＤＩターゲットを用いると、多様なエネルギーギャップを有するナノワイヤ物質を選択することが可能であり、従って試料に応じて望まれる範囲内でレーザーエネルギーが伝達されるのを制御することができる。下記の表１に、種々のナノワイヤ物質に応じたバンドギャップに基づくＤＩＯＳとペプチドを使用したＤＩＯＳ実験の実施を示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
本発明において、ナノワイヤスポットの代わりに、定量分析のための典型的なＭＡＬＤＩにおいて用いられる金属ターゲットプレートによるナノワイヤ懸濁液を用いる方法を提供する。この方法は、金属ターゲットプレートを変性せずに用いることにより、ナノワイヤスポットを用いずに、マトリクスのピークの干渉なしに、１０００ダルトンの分子量の範囲で質量分析を行うことを可能にする。
【００６２】
上述のナノワイヤチップを使用した定量実験で説明したように、試料の結晶中心がレーザー照射に対応できるように、金属ターゲットプレートの１つのスポットに焦点を決めてナノワイヤアイレットを形成し、また、この目的のために、アンカー（ankers）が配列されたターゲットプレート（ＭＴＰプレート、Bruker社、ドイツ）を使用した。
【００６３】
水溶液の試料の場合、ターゲットプレートのアンカー点は、試料の溶媒が乾燥して結晶を形成する位置である。本発明において、水溶液中で調製されたナノワイヤ懸濁液の溶媒が乾燥してくる一方で、ナノワイヤアイレットがこのようなアンカー点に多量に形成されるようにした。即ち、ナノワイヤ懸濁液を揮発性イソプロンパノールと混合し、それを金属ターゲットプレートに分注することによりナノワイヤアイレットを形成した。さらに、ナノワイヤアイレットに少量の試料を分注し、その後に乾燥させることで試料の結晶を形成した。図５において、ＺｎＯ、ＳｉＣ、ＳｎＯ２、ＧａＮのナノワイヤ懸濁液を使用した。ここで、シリコン基板に約５０００ＮＷｓ／ｍｍ２の密度で成長させたナノワイヤチップ（ナノワイヤを成長させた基板）を蒸留水に入れ、超音波を印加してナノワイヤを分離し、それによって上記の材料のナノワイヤおよび蒸留水のナノワイヤ懸濁液を形成した。
【００６４】
図５は、上記の４つの異なる種類のナノワイヤを用いて得られたペプチドの分子量ピークを示す。上述のアンカーが配列されたターゲットプレート上にナノワイヤアイレットを形成した後、ペプチドであるロイシンエンケファリン（分子量１０１４、Sigma Chemical社、米国）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、それから各ナノワイヤアイレットに１０μＬずつ加え、室内で乾燥させた。質量分析のために、Bruker Daltonics社（ドイツ）のリフレックス３を使用した。
【００６５】
多孔性シリコンは、酸化によりＤＩＯＳの効率が著しく落ちるという報告がなされており、従って商品化された多孔性シリコンからなるＤＩＯＳ用ターゲットプレートは使い捨てとしてアルゴンを使用して個別に包装されている。上記の表１に示すように、ナノワイヤを用いたターゲットプレートは酸化した生成物の使用が可能であり、このために相対的な簡易な包装を提供でき、また、大気中で長期保管することも可能である。また、典型的金属プレートにおいてナノワイヤが用いられている本発明のターゲットプレートにおいて、適切な洗浄の後で再使用が可能である。反対に、多孔性シリコンを用いたＤＩＯＳ用ターゲットプレートにおいては、多孔質シリコンの構造上の問題から使用済みのターゲットプレートにおいて試料結晶を洗浄することはできない。従って、多孔性シリコンの使用のためのＤＩＯＳターゲットプレートは一度使用したら廃棄される。反対に、ナノワイヤを用いたターゲットプレートにおいては、ターゲットプレートは、蒸留水、イソプロピル・アルコール、アセトンなどで順番に洗浄した後、再使用が可能であり、それは金属ターゲットプレートと同様である。
【００６６】
図６は、ＺｎＯナノワイヤチップを１０回洗浄したリサイクルの後での、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のロイシンエンケファリン（分子量１０１４、Sigma Chemical社、米国）の質量分析の結果を示す。結果は、洗浄後にナノワイヤチップを再使用することが可能であることを明確に示す。
【００６７】
また、典型的な金属ターゲットを用い、ナノワイヤと試料を混合して形成された懸濁液を、ＭＡＬＤＩターゲット基板にスプレーするとき、得られる試料は均一に分布して、結晶がレーザーエネルギーを効果的に吸収することができる。従って、これを考慮すると、再使用が可能な典型的なＭＡＬＤＩターゲットの独特な特徴を保持しながら、優れた質量分析の効果を達成することができる。
【００６８】
本発明の上記及び他の目的及び特徴が、添付の図面に関連付けして、本発明の下記の記載から明らかになるだろう。
【００６９】
以下、本発明の脱離／イオン化によるナノワイヤを用いた質量分析方法が、下記の実施例を基に以下に記載されるが、それらは本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００７０】
（実施例）
（実施例１） ナノワイヤを用いた質量分析
シリコン基板の表面にスパッタリング気相成長法によりＡｕを２ｎｍの厚さで堆積させ、ここで、堆積の領域はマスクを用いて直径２００μｍの円形に形成した。それから、化学気相成長法（ＣＶＤ）により、基板にＳｉＣｌ４を５００℃で供給し、それによってシリコンナノワイヤが成長し、図１は基板上に成長したシリコンナノワイヤを示す。用いたシリコンナノワイヤは、長さが５μｍ、直径が１００ｎｍ、密度が約１．８×１０６ＮＷｓ／ｍｍ２に制限した。このようにナノワイヤを成長させた基板を質量分析計の試料検査プレートに挿入した。質量分析は、Bruker Daltonics社（ドイツ）のリフレックス（Reflex）３を使用して行った。用いた試料は２種類のペプチド、アンギオテンシンとロイシンエンケファリンであった。ナノワイヤスポットの直径を０．２ｍｍに制限し、試料のイオン化のために、レーザーの円形スポット（直径０．２ｍｍ）で試料の結晶を照射した。上記のように、試料の結晶の大部分がレーザーに曝され、このように、イオン化した試料の量は試料の量と定量的な関係を有するようにした。検査で、マトリクスなしでナノワイヤ試料プレートを用いたＭＡＬＤＩによるペプチドの質量分析が見出された。結果の比較のために質量分析計の試料検査プレートを使用したとき、ペプチドの質量分析を行うことはできなかった。また、実験結果から上記の方法で試料の定量が可能であることが見出された。
【００７１】
（実施例２） ナノワイヤ懸濁液を利用した質量分析
シリコン基板の表面にスパッタリング気相成長法によりＡｕを２ｎｍの厚さで堆積させ、ここで、化学気相成長法（ＣＶＤ）によりＩｎＣｌ３およびＮＨ３を５００℃で供給することによって、ＩｎＮナノワイヤを成長させた。上記のシリコン基板をイソプロピルアルコールに入れて１０秒間超音波を印加して、基板からナノワイヤを分離することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製した。典型的なマトリクスの代りにBruker Daltonics社（ドイツ）のＭＡＬＤＩターゲットを用いることにより、ナノワイヤ懸濁液を用いてＭＡＬＤＩ測定を行った。試料の結晶中心がアンカーに集中するというＭＡＬＤＩターゲットの特別な特徴を利用して、少量のナノワイヤ懸濁液を処理してアンカーの周辺にナノワイヤアイレットを形成した。それから、上記のナノワイヤアイレットに試料のペプチドを滴下し、試料の結晶を形成させた。検査で、ナノワイヤ懸濁液はマトリクスに置き換えることができ、結果として定量的な結果が得られたことが見出された。
【００７２】
（実施例３） ナノワイヤを用いた結合反応の検出
実施例１のようにナノワイヤが成長したナノワイヤターゲットにＢ型肝炎の抗原溶液を加え、ナノワイヤ上にＢ型肝炎の抗原が固定されるように１時間水分で飽和された３７℃の恒温槽で培養した。それから、固定されなかったＢ型肝炎の抗原を分離するために、ナノワイヤターゲットを洗浄液に浸漬した。抗体−抗原反応を誘起するため、Ｂ型肝炎の抗原を含有する試料溶液をナノワイヤに加え、それから抗体−抗原反応の後で残された試料を除去するためにナノワイヤターゲットを洗浄溶液に入れた。それから、ＭＡＬＤＩは、ナノワイヤと結合された抗原−抗体結合物の定性分析と同様に定量分析を行うことが可能であることが確認された。同じように、ナノワイヤＭＡＬＤＩターゲットを用いて、ＤＮＡ間、ＤＮＡとＲＮＡ間、あるいはタンパク質間の結合体を定量的に検出することが可能である。さらに、有機物と無機物などのリガンド（ligand）およびレセプタ（receptor）間の結合体を定量的に検出することも可能である。
【００７３】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に説明された。しかし、開示の考察から、当業者が本発明の範囲及び趣旨内で修正及び改善を行えることが認識されるだろう。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
上述のように、ナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析によれば、試料を固定し、試料に照射されるレーザーエネルギーを効果的に伝達して試料の脱離／イオン化を行うことができるナノワイヤを用いることにより、マトリクスなしで試料の質量分析が可能である。
【００７５】
即ち、本発明は、上記のナノワイヤを使用することにより、上述のナノワイヤを用いて効果的に試料を脱離／イオン化させることを可能にし、それによって低分子量の試料と同様に、試料の定性的、定量的、及び微量分析を効果的に行うことができる。さらに、本発明はＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ ＭＳで用いられる典型的な質量分析計にも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１（ａ）はＺｎＯナノワイヤスポットを形成させた基板およびこれを質量分析計の試料検査プレートに挿入したターゲットプレートを示す写真であり、図１（ｂ）と（ｃ）は走査電子顕微鏡で撮影した成長したナノワイヤの拡大写真を示す。ここで、参照番号１は検査プレートを示し、参照番号２はターゲットプレートを示し、参照番号３は基板を示し、参照番号４はナノワイヤしポットを示す。
【図２】図２はＺｎＯナノワイヤ上に試料なしでレーザーを照射した後の分子量のピークを示すグラフである。
【図３】図３はロイシンエンケファリンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．１３、０．２５、０．５０、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた後の質量分析の結果を示す。
【図４】図４はアンギオテンシンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．２５、０．５０、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた後の質量分析の結果を示す。
【図５】図５はＺｎＯ、ＳｉＣ、ＳｎＯ２、ＧａＮの４つの異なる種類のナノワイヤ懸濁液を用いて得られたペプチドの分子量のピークを示す。
【図６】図６はＺｎＯナノワイヤチップの１０回の洗浄でリサイクルした後の０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でロイシンエンケファリンの質量分析の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料のナノワイヤ（ｎａｎｏｗｉｒｅ）支援質量分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ナノワイヤを用いることにより、試料を固定し、照射される試料にレーザーエネルギーを効果的に伝達しながら試料の脱離／イオン化を行うことができ、それによって、マトリクス溶液なしで試料の質量分析を行う。
【背景技術】
【０００２】
質量分析計は化合物の質量を測定する分析機器である。それは、一般的に、荷電させて化合物をイオン化することにより、質量対電荷（mass-to-charge；m／z）の値を測定することによって化合物の分子量を決定する。電子ビームを用いた電子イオン化、高速の原子の衝突、レーザーを用いた方法、及び試料を電場の中にスプレーする方法など、化合物をイオン化するためのたくさんの方法がある。
【０００３】
タンパク質や核酸などの極めて大きな質量を有する生物化学的物質に対して、レーザーを用いるＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析（マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析；以降ＭＡＬＤＩとする）が使用され、最近この種の様々な分析機器が開発され、現時点で購入することができきる。これらの機器は、分析しようとする物質へのエネルギーの伝達を支援するだけでなく、物質のイオン化を促進するマトリクスを用いることにより、分子量３００ｋＤａ以上のポリマーの分子量を測定できる。さらに、それらの相対的に高い感度に起因して、フェムトモルレベルでの試料の分析が可能であり、イオン化工程における化合物の破損を大きく減少して混合物の分析を可能にするための助けともなる。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ支援質量分析のために、試料は下記のように準備される。
【０００５】
（１）少量のマトリクス溶液を金属プレートからなるターゲット板上に加え、乾燥させ、それから、分析しようとする試料溶液をさらにその上に加えて乾燥させる。あるいは、
マトリクス物質を試料溶液に混合した後、ターゲットプレートに置き、結晶化させる。
【０００６】
（２）マトリクスと結晶化した試料の領域にレーザーを照射し、マトリクスに支援されて試料が離脱／イオン化する。
【０００７】
典型的な質量分析計は、イオン化した試料が電位の差異によりセンサー側に移動するように、試料が位置したターゲットプレートと質量分析用センサーの間に電場を印加する構造を有する。試料の電荷量が既知である場合、試料がセンサーに到着するのに要した時間などの変数を基にして試料の質量を分析することができる。
【０００８】
上記のＭＡＬＤＩ法は質量分析に大変有用であるが、試料の性質によってイオン化に適合したマトリクス物質を選択することがまた必要である。マトリクス物質の例は、ニコチン酸、桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸などである。これらのマトリクス物質は照射するエネルギーを吸収することでプロトンを発生させ、それを試料に結合させ、それによって試料のイオン化を促進することが知られている。しかし、正確なイオン化メカニズムはまだ解明されておらず、従って与えられた試料に適合したマトリクス物質を選定することは手腕を問われるところである。
【０００９】
さらに、ＭＡＬＤＩは、レーザーにより活性化されたマトリクスにより試料がイオン化される過程で、低分子量マトリクスとマトリクス分解性生物が質量分析スペクトル上に示されるため、その使用は１０００Ｄａより大きな分子量を有する物質に大きく制限されるという不利益を有する。
【００１０】
また、マトリクスの選定によって分解生成物のイオン化が決定されるため、より適切なマトリクス物質の選定が必要となり、混合物の中の未知物質の分析を行うのは困難である（非特許文献１）。
【００１１】
また、ＭＡＬＤＩ法は、試料の準備工程で得られた結晶化した試料の空間的分布が均一ではなく、従って、照射位置によってレーザーにより励起される試料の量が変化するという不利益を有する。従って、適切な定量分析のために、様々な位置を照射して得られた様々な結果が統計的に解釈される。ＭＡＬＤＩ法での定量分析に対して広く知られた方法は、分析しようとする化合物とほとんど同一構造を有する化合物に放射性同位元素でラベルした内部標準物質を一定の比率で混合してスペクトルを測定する方法が知られている（非特許文献２）。しかし、上記の方法でもＭＡＬＤＩ法では試料の正確な定量分析を行うことは困難である。
【００１２】
マトリクスを使用せずに試料の脱離／イオン化のエネルギー源としてレーザーを使用する質量分析法として、ＤＩＯＳ ＭＳ（Desorption Ionization on Silicon Mass Spectroscopy；以下ＤＩＯＳとする）が知られている。一般的に、ＤＩＯＳはマトリクスなしに多孔質シリコンをターゲットとして用いる試料の質量分析方法である。多孔質シリコンは電気エッチングにより形成され、多孔性と酸化の程度の調節によりＤＩＯＳが可能となる。ＤＩＯＳに使用される多孔質シリコンは、マトリクスと同様にレーザーエネルギーを吸収することで試料のイオン化を供すると考えられているが、試料の離脱／イオン化のための正確なエネルギー伝達経路はまだ知られていない。
【００１３】
ＤＩＯＳはマトリクスを使用しなくても、相対的に低い分子量の化合物と同様に、タンパク質、核酸などの高い分子量の物質の定量分析を行うことを可能にすると知られている（特許文献１、非特許文献３、非特許文献４）。
【特許文献１】米国特許第６，２８８，３９０号Ｂ１
【非特許文献１】G. Suizdak, 1. Ion sources and sample introduction, In: Mass spectroscopy for biotechnology, Acedemic press, 1996, p13
【非特許文献２】M.J. Kang, E. Heinzle, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 15(2001) 1327-1333
【非特許文献３】J. Wel, J. M. Burlak, G. Suizdak, Nature, 399(1999) 243-246
【非特許文献４】W.G. Lewis, Z. Shen, M.G. Finn, G. Suizdak, International Journal of Mass spectrometry, 226(2003) 107-116
【非特許文献５】1.J. Johnson, Heon-Jin Choi, K.P. Knutsen, R.D. Schaller, P. Yang, R.J. Saykally, “Single Gallium Nitride Nanowire Laser,” Nature Materials, 1, 2, 106-110 (2002)
【非特許文献６】J.M. Bermond, N, Lenoir, J.P. Prulhiere, M. Drechsler, Sur. Sci. 42, 306 (1974)
【非特許文献７】V.E. Frankevich, J. Zhang, S.D. Friess, M. Dashtiev, R. Zenobi, Anal. Chem. 2003, 75, 6063
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
一方、ＤＩＯＳの場合、多孔質シリコン基板に試料溶液を注入する過程で、試料溶液が多孔質構造に浸透して結晶化し、このように、結晶のサイズを制限することを困難にしており、また、レーザー照射点に試料の結晶の中心を一致させることも難しい。このような理由により、１〜２回の試料測定を通した定量分析はほとんど不可能である。また、シリコンのみ適用可能であるため、様々な種類の試料に適合したエネルギー伝達媒体を選択することができない。また、レーザーエネルギーが２次元的にのみ伝達されるため、効果的な脱離／イオン化が困難となる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、上述の問題を解決するために、本発明は、従来の多孔質シリコンに代わって用いられるナノワイヤが、試料を固定でき、効果的にレーザーエネルギーを照射される試料に伝達して、マトリクス溶液を用いることなく試料の質量分析を行うことを可能にする、ナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
以下、本説明を詳しく説明する。
【００１７】
本発明の実施形態において、レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法が提供され、
（ａ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に多数の微細なナノワイヤを成長させることによりナノワイヤスポットを形成する工程と、
（ｂ）分析しようとする物質を含む試料をナノワイヤスポットに配置し、乾燥により結晶化させる工程と、
（ｃ）基板に電圧を印加した状態で、減圧下で試料がナノワイヤに吸着及び結晶化したナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、ナノワイヤを通してエネルギーを試料に伝達して、イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有する。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法が提供され、
（ａ）多数の微細なナノワイヤを含有するナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布されたナノワイヤ懸濁液を乾燥させてナノワイヤアイレット（islet）を形成する工程と、
（ｃ）分析しようとする物質を含む前記試料をナノワイヤスポットに配置し、それの乾燥により結晶化させる工程と、
（ｄ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で試料がナノワイヤに吸着及び結晶化した前ノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、ナノワイヤを通してエネルギーを前記試料に伝達して、イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有する。
【００１９】
本発明のさらに他の実施形態において、レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法が提供され、
（ａ）多数の微細なナノワイヤと分析しようとする物質を含有する試料溶液を混合してナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布されたナノワイヤ懸濁液を乾燥させて、ナノワイヤと前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した試料を有するナノワイヤアイレット（islet）を形成する工程と、
（ｃ）基板に電圧を印加した状態で、減圧下でナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを試料に伝達して、イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有する。
【００２０】
添付の図面を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
【００２１】
本発明は、従来の多孔質シリコンの代わりに用いられるナノワイヤが、試料を固定し、照射される試料にレーザーエネルギーを効果的に伝達して、マトリクス溶液を用いずに試料の質量分析を行うことを可能にする、試料のナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＮＡＤＩ ＭＳ：Nanowire-Assisted Laser Desorption／Ionization Mass Spectrometric Analysis；以下ＮＡＤＩとする）の方法に関する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態を以下に記載する。
【００２３】
まず、基板上の選択された領域に多数の微細なナノワイヤを成長させ、それらは典型的なＭＡＬＤＩ工程に用いられることができ、それらからナノワイヤスポットを形成する。ここで用いられる基板は電圧を印加することができる導電体または半導体の基板である。ナノワイヤは直径が５００ｎｍ以下でアスペクト比が１０以上であることが好ましい。直径が５００ｎｍを超えてナノワイヤが成長すると、照射されるレーザーエネルギーを増幅することや、あるいは試料内で分布を均一化させることが困難となり、一方、アスペクト比が１０より小さくナノワイヤが成長すると、照射されるレーザーエネルギーを増幅させながらエネルギーを効率的に伝達することが難しくなる。
【００２４】
ナノワイヤは、シリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される。また、定量的観点から、ナノワイヤスポットの面積が試料の脱離／イオン化のために照射される面積と等しく、または、小さくなるように形成することが好ましい。
【００２５】
それから、ナノワイヤに吸着し、乾燥により結晶化できるように、分析しようとする物質を含む試料が、ＭＡＬＤＩ工程における方法を用いてナノワイヤが成長した領域に配置される。試料は塩と分析しようとする物質を有し、塩の濃度は１０ｍＭより大きく、一方で分析しようとする物質の濃度は試料中に１フェムトモルより小さく含まれる。
【００２６】
それから、ＭＡＬＤＩ工程で使用される機器と同様な真空状態で、ナノワイヤと結晶化した試料が吸着した基板がナノワイヤスポット上にレーザー照射され、一方、その間同時に、基板に電圧が印加された状態で、イオン化された試料が質量分析にかけられる。ここで、脱離／イオン化した試料は、質量分析を行うため、基板と分析用センサー間に印加された電場によりセンサーに移動される。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態を以下に記載する。
【００２８】
まず、所定の基板に多数の微細なナノワイヤを成長させ、このナノワイヤを基板から分離し、ナノワイヤ物質の種類に従って蒸留水、水溶液またはアルコールなどの揮発性溶液と混合してナノワイヤ懸濁液を形成する。例えば、ナノワイヤを成長させた基板（以下、ナノワイヤチップとする）を揮発性溶液の中に入れ、超音波を印加してナノワイヤを基板から分離することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製することができる。または、ナノワイヤを成長させた基板からナノワイヤをスクラッチング（scratching）により分離し、基板にスプレーするための揮発性溶液と混合することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製することができる。ここで、第１の好ましい実施形態のように、各ナノワイヤは直径が５００ｎｍ以下でアスペクト比が１０以上であることが好ましい。さらに、ナノワイヤは、シリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される。
【００２９】
それから、典型的なＭＡＬＤＩ工程において使用できる基板の選択された領域上に上記のナノワイヤ懸濁液をスプレーし、乾燥して、ナノワイヤアイレットを形成する。用いられる基板は、電圧を印加することができる導電体または半導体の基板である。さらに、ナノワイヤ懸濁液を基板上の選択された領域にスプレーすることによってナノワイヤアイレットを形成することができる。また、ナノワイヤアイレットの面積を、試料の脱離／イオン化のためのレーザーで照射される面積と等しく、または、小さくすることが好ましい。
【００３０】
それから、質量分析のための物質を含む試料溶液を上述のナノワイヤアイレット上に塗布し、乾燥させ、結晶化させる。ここで、スプレー領域内で試料を保持するケージ（ｃａｇｅ）として働くナノワイヤに試料が吸着されるようになって、結晶化された試料とナノワイヤとの混合物が適切に位置付けられる。試料は塩および分析しようとする物質とで構成される。好ましくは、塩の濃度は１０ｍＭより大きく、一方で分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含有される。
【００３１】
それから、ＭＡＬＤＩ工程で使用される機器と同様な真空状態で、ナノワイヤと試料が脱離／結晶化した基板がナノワイヤアイレット上にレーザー照射され、一方、その間同時に、基板に電圧が印加された状態で、イオン化された試料が質量分析にかけられる。ここで、脱離／イオン化した試料は、質量分析を行うため、基板と分析用センサー間に印加された電場によりセンサーに移動される。
【００３２】
本発明のまた別の好ましい実施形態を下記に記載する。
【００３３】
まず、所定の基板に多数の微細なナノワイヤを成長させ、このナノワイヤを基板から分離し、分析しようとする物質を含む試料溶液と混合して、最終的にナノワイヤ懸濁液を調製する。例えば、ナノワイヤを成長させた基板（即ち、ナノワイヤチップ）を揮発性溶液に入れ、超音波を印加してナノワイヤを基板から分離させ、試料溶液が添加されることにより、ナノワイヤと試料を含むナノワイヤ懸濁液を調製することができる。または、ナノワイヤを成長させた基板からナノワイヤをスクラッチングにより分離して、基板へのスプレーを可能にする揮発性溶液と混合することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製することができる。ここで、第１の好ましい実施形態のように、各ナノワイヤは直径が５００ｎｍ以下でアスペクト比が１０以上であることが好ましい。さらに、ナノワイヤは、シリコンを含む単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される。上記の試料は塩および分析しようとする物質とで構成される。好ましくは、塩の濃度は１０ｍＭより大きく、一方で分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含有される。
【００３４】
それから、典型的なＭＡＬＤＩ工程で使用できる基板の選択された領域に上記のナノワイヤ懸濁液をスプレーして乾燥させてナノワイヤアイレットを形成し、試料を結晶化させる。使用される基板は電圧を印加することができる導電体または半導体の基板である。さらに、ナノワイヤ懸濁液を基板上の選択された領域にスプレーすることによってナノワイヤアイレットを形成することが可能である。さらに、ナノワイヤアイレットの面積を、試料の脱離／イオン化のためのレーザーで照射される面積と等しく、または、小さくすることが好ましい。
【００３５】
上記の好ましい実施形態に記載のように、ナノワイヤの種類によってナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有するレーザーを用いて照射が施され、また、真空圧、即ち雰囲気圧力は１０−１６ｔｏｒｒより低く設定される。
【００３６】
さらに、基板上に電圧を印加する際、約５，０００Ｖ〜３０，０００Ｖが印加され、分析しようとするイオン化物質を質量分析する過程でイオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する。
【００３７】
上述のＮＡＤＩ工程において、マトリクスなしにナノワイヤにより提供される効率的な試料の脱離およびイオン化の基本的原理を詳しく下記に説明する。
【００３８】
ナノワイヤは、レーザー照射に曝されると、エネルギーを吸収して光子（photon）を生成することができ、ここで、ナノワイヤ自身は光子を増幅させることができるキャビティ（cavity）構造を有する（非特許文献５）。従って、ナノワイヤは外部から伝達されたレーザーエネルギーを自然に増幅でき、誘導放出の形態で増幅したエネルギーを試料に再び伝達することができる。従って、どんな形態の他のエネルギー伝達媒体よりも最も効率的にエネルギーを試料に伝達することができ、それによって比較的容易な試料の脱離／イオン化を促進できる。
【００３９】
本発明で用いられるナノワイヤは、数（few）ナノメートルの直径と比較的大きなアスペクト比を有する針状の形状である。従って、ナノワイヤの両端は原子のレベルで非常に鋭い先端である。これらの幾何学的な構造は、質量分析用の装置で基板とセンサーの間に電場をかけると、ナノワイヤの前方の先端（front tip）に極めて高い電場を生成でき、ナノワイヤの前方の先端の高い電場は電界脱離（field desorption）を引き起こし、それによって試料の脱離／イオン化を可能にする。さらに、レーザー照射されると、それらはレーザに誘起されてナノワイヤの前方の先端に比較的高い電場を生成できる（非特許文献６）。極めて高い局在の電場の生成は、ナノワイヤの前方の先端における脱離／イオン放出の放出を加速することができ、それによって試料の脱離／イオン化を容易にする。
【００４０】
さらに、ナノワイヤの前方の先端の幾何学的な形状は、電場が印加されたときに電子の放出を可能にし、この電子放出が試料のイオン化を容易にする（非特許文献７）。
【００４１】
従来の多孔性シリコンを用いるＤＩＯＳの場合、多孔性構造に試料溶液を注入して乾燥するため、試料への二次元的なレーザー照射のみが可能である。しかし、本発明においては、多孔性シリコンとは異なって、ナノワイヤ上に形成された結晶化された試料はレーザーに３次元的に曝され、このように試料にレーザーエネルギーをより効果的に伝達でき、これによってより効果的な脱離／イオン化が行われる。
【００４２】
上述のように、ナノワイヤの使用は効果的な試料へのエネルギー伝達を可能にし、容易な脱離／イオン化を促進し、従ってマトリクスなしでの質量分析を可能とする。
【００４３】
また、本発明によるＮＡＤＩ工程において、結晶化された試料内の試料分布は、より正確なデータを保証する。即ち、ナノワイヤの使用は、基板上の触媒のパターンにより成長位置を正確に制御することができる。例えば、本発明における基板上にナノワイヤを成長させる工程で、特に（ナノワイヤスポットの形成における）シリコンのナノワイヤを成長させるとき、スパッタリング気相成長によりマスクを用いて触媒として働く金属であるＡｕを円形形状の所定の厚み及び直径を持つようにシリコン基板の表面に成長させた後、化学気相成長（ＣＶＤ）によりシリコン基板上に５００℃でＳｉＣｌ４を供給することによりシリコンナノワイヤを成長させることができる。
【００４４】
または、ＩｎＮナノワイヤを成長させる場合、スパッタリング気相成長によりマスクを用いて触媒として働く金属であるＡｕを円形形状の所定の厚み及び直径を持つようにシリコン基板の表面に成長させた後、化学気相成長によりシリコン基板上に５００℃でＩｎＣｌ３及びＮＨ３を供給することによりＩｎＮナノワイヤを成長させることができる。
【００４５】
さらに、ナノワイヤが成長したところに試料を位置させるとき、ナノワイヤが、試料が結晶化されるまで液体試料を保持する３次元的なケージの役割を果たし、それによってナノワイヤが位置するところに試料の結晶中心を形成する。試料の結晶中心のサイズが照射されるレーザーの直径と等しいサイズに調節されると、１〜２回のみのレーザー照射が試料の脱離／イオン化を十分に促進し、それが分子量の測定を可能にして、このようにして定量的な分析が可能となる。
【００４６】
あるいは、ナノワイヤ溶液を用いる場合、広げられたナノワイヤが乾燥過程で試料を固定するケージの役割を果たし、これによって、レーザーの直径サイズ内で試料を固定することが可能となる。従って、１〜２回のみのレーザー照射が試料のイオン化を十分に促進し、それが分子量の測定を可能にして、このようにして定量的な分析が可能となる。
【００４７】
典型的な多孔性シリコンは工程のために適切な物質の選択に制限があり、従ってレーザーエネルギーを効果的に利用するのにも制限がある。反対に、本発明によるナノワイヤを用いた脱離／イオン化法の場合、試料に伝達されるレーザーエネルギーは、様々なエネルギーギャップを有するナノワイヤを使用して望まれるエネルギーレベルの範囲内で適切に調製可能である。
【００４８】
典型的な多孔性シリコンを利用したＤＩＯＳの場合、多孔性構造が制限された領域のみで使用されるという不利益がある。即ち、試料溶液の注入及び乾燥の過程で試料溶液が多孔性構造に浸透して結晶化し、このために、試料の結晶のサイズは制限されない。反対に、本発明によるＮＡＤＩの場合、試料はナノワイヤケージを用いて結晶化し、これによって試料の結晶サイズを制限することができる。
【００４９】
また、ナノワイヤを用いる本発明のＮＡＤＩでは、使用済みターゲットのリサイクルが難しい典型的な多孔性シリコンを用いるＤＩＯＳの場合と異なり、ターゲットとして従来の金属プレート（plate）を用いることにより適切な洗浄後に使用済みターゲットをリサイクルすることができる。
【００５０】
ＤＩＯＳの場合、ＤＩＯＳの効率は酸化により悪化すると報告がなされており、従って密閉された状態で保管されなければならない。しかし、ナノワイヤを使用したターゲットプレートは酸化した生成物の使用が可能で、従って簡易な包装が可能となり、また、大気中での長期保管が可能となる。
【００５１】
ＮＡＤＩ法を使用してマトリクスがなくても質量分析が可能であることを示すため、ＺｎＯナノワイヤチップおよびペプチドを使用して実験を行った。シリコン基板の表面にスパッタリング気相成長法により触媒の役割をするＡｕを２ｎｍの厚さで所定の領域に蒸着させ、化学気相成長法により５００℃でジエチル亜鉛（diethylzinc）と酸素を供給し、それによってＺｎＯナノワイヤの選択した領域への成長をａｌｌｏｗすることにより、ＺｎＯナノワイヤチップを形成した。このように形成されたナノワイヤを有する基板が質量分析計の試料検査プレートに挿入されたターゲットプレートを図１に示すように形成した。
【００５２】
図１において、参照番号１は検査プレート、参照番号２はターゲットプレート、参照番号３は基板、参照番号４はナノワイヤスポットを示す。また、図１（ａ）は、ＺｎＯナノワイヤスポットが形成された基板と、この基板が質量分析計の試料検査プレートに挿入されたターゲットプレートの写真を示す。図１（ｂ）と（ｃ）は、走査電子顕微鏡で撮影された成長したナノワイヤの拡大した写真を示す。ナノワイヤスポット（４）上に成長したに対するＺｎＯの成長条件を、平均直径１００ｎｍ、平均長さ３μｍ、平均密度約１×１０6ナノワイヤ（ＮＷｓ）／ｍｍ2に制限した。ナノワイヤスポット（４）の直径を０．２ｍｍに制限し、試料の結晶は試料のイオン化のためにレーザーの円形スポット（直径０．２ｍｍ）により照射された。上述のように、試料結晶の大部分がレーザーに曝され、従って、試料の結晶表面を通してイオン化した試料の量が試料の濃度と定量的な関係を持つようにした。
【００５３】
質量分析には、Bruker Daltonics社（ドイツ）のリフレックス３を使用した。
【００５４】
試料としては、ペプチドであるアンギオテンシン（ＭＷ１０１４、Sigma Chemical社、米国）とロイシンエンケファリン（ＭＷ５８８、Sigma Chemical社、米国）を各々使用した。
【００５５】
図２は、ＺｎＯナノワイヤ上に試料なしにレーザーを照射した後の分子量ピークを示したグラフである。図２に示すように、ＺｎＯナノワイヤは試料のピークと混乱させうる分子量ピークを生成しない。
【００５６】
図３は、ロイシンエンケファリンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．１３、０．２５、０．５０、及び１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ加えた後、質量分析を行った結果を示す。上記の結果から、ＺｎＯナノワイヤチップを用いて質量分析が可能であることが分かった。また、ＺｎＯナノワイヤチップの各々の濃度に対する質量比較の結果は、ロイシンエンケファリンの分子量に対するピークの高さと上記の濃度が定量関係を有することを示す。
【００５７】
図４は、アンギオテンシンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．２５、０．５０、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ加えた後、質量分析を行った結果を示す。ロイシンエンケファリンの場合のように、質量比較の結果はアンギオテンシンの分子量に対するピークの高さと上記の濃度が定量関係を有することを示す。
【００５８】
上述のように、本発明によるナノワイヤチップのターゲットプレートを用いるとき、マトリクスなしに質量分析を行うことが可能であり、また、定量分析が可能であることも示す。比較のために同一試料と典型的な金属ターゲットプレートを用いて質量分析を行ったところ、胆管癌（ＣＣＡ）をマトリクスとして使用した場合にはＣＣＡ自体のピークとペプチドのピークがともに得られたが、マトリクスを使用しなかった場合は高濃度の試料でも分子量ピークが得られなかった。即ち、典型的な金属ターゲットプレートをマトリクスなしで用いる場合、試料の質量分析は不可能であった。
【００５９】
一方、典型的なマトリクスを使用せずに質量分析が行える多孔性シリコンを用いたＤＩＯＳ法において、シリコンを除いて他の物質を使用することができないため、用いるエネルギー伝達のための物質に制限がある。反対に、本発明のＭＡＬＤＩターゲットを用いると、多様なエネルギーギャップを有するナノワイヤ物質を選択することが可能であり、従って試料に応じて望まれる範囲内でレーザーエネルギーが伝達されるのを制御することができる。下記の表１に、種々のナノワイヤ物質に応じたバンドギャップに基づくＤＩＯＳとペプチドを使用したＤＩＯＳ実験の実施を示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
本発明において、ナノワイヤスポットの代わりに、定量分析のための典型的なＭＡＬＤＩにおいて用いられる金属ターゲットプレートによるナノワイヤ懸濁液を用いる方法を提供する。この方法は、金属ターゲットプレートを変性せずに用いることにより、ナノワイヤスポットを用いずに、マトリクスのピークの干渉なしに、１０００ダルトンの分子量の範囲で質量分析を行うことを可能にする。
【００６２】
上述のナノワイヤチップを使用した定量実験で説明したように、試料の結晶中心がレーザー照射に対応できるように、金属ターゲットプレートの１つのスポットに焦点を決めてナノワイヤアイレットを形成し、また、この目的のために、アンカー（ankers）が配列されたターゲットプレート（ＭＴＰプレート、Bruker社、ドイツ）を使用した。
【００６３】
水溶液の試料の場合、ターゲットプレートのアンカー点は、試料の溶媒が乾燥して結晶を形成する位置である。本発明において、水溶液中で調製されたナノワイヤ懸濁液の溶媒が乾燥してくる一方で、ナノワイヤアイレットがこのようなアンカー点に多量に形成されるようにした。即ち、ナノワイヤ懸濁液を揮発性イソプロンパノールと混合し、それを金属ターゲットプレートに分注することによりナノワイヤアイレットを形成した。さらに、ナノワイヤアイレットに少量の試料を分注し、その後に乾燥させることで試料の結晶を形成した。図５において、ＺｎＯ、ＳｉＣ、ＳｎＯ２、ＧａＮのナノワイヤ懸濁液を使用した。ここで、シリコン基板に約５０００ＮＷｓ／ｍｍ２の密度で成長させたナノワイヤチップ（ナノワイヤを成長させた基板）を蒸留水に入れ、超音波を印加してナノワイヤを分離し、それによって上記の材料のナノワイヤおよび蒸留水のナノワイヤ懸濁液を形成した。
【００６４】
図５は、上記の４つの異なる種類のナノワイヤを用いて得られたペプチドの分子量ピークを示す。上述のアンカーが配列されたターゲットプレート上にナノワイヤアイレットを形成した後、ペプチドであるロイシンエンケファリン（分子量１０１４、Sigma Chemical社、米国）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、それから各ナノワイヤアイレットに１０μＬずつ加え、室内で乾燥させた。質量分析のために、Bruker Daltonics社（ドイツ）のリフレックス３を使用した。
【００６５】
多孔性シリコンは、酸化によりＤＩＯＳの効率が著しく落ちるという報告がなされており、従って商品化された多孔性シリコンからなるＤＩＯＳ用ターゲットプレートは使い捨てとしてアルゴンを使用して個別に包装されている。上記の表１に示すように、ナノワイヤを用いたターゲットプレートは酸化した生成物の使用が可能であり、このために相対的な簡易な包装を提供でき、また、大気中で長期保管することも可能である。また、典型的金属プレートにおいてナノワイヤが用いられている本発明のターゲットプレートにおいて、適切な洗浄の後で再使用が可能である。反対に、多孔性シリコンを用いたＤＩＯＳ用ターゲットプレートにおいては、多孔質シリコンの構造上の問題から使用済みのターゲットプレートにおいて試料結晶を洗浄することはできない。従って、多孔性シリコンの使用のためのＤＩＯＳターゲットプレートは一度使用したら廃棄される。反対に、ナノワイヤを用いたターゲットプレートにおいては、ターゲットプレートは、蒸留水、イソプロピル・アルコール、アセトンなどで順番に洗浄した後、再使用が可能であり、それは金属ターゲットプレートと同様である。
【００６６】
図６は、ＺｎＯナノワイヤチップを１０回洗浄したリサイクルの後での、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のロイシンエンケファリン（分子量１０１４、Sigma Chemical社、米国）の質量分析の結果を示す。結果は、洗浄後にナノワイヤチップを再使用することが可能であることを明確に示す。
【００６７】
また、典型的な金属ターゲットを用い、ナノワイヤと試料を混合して形成された懸濁液を、ＭＡＬＤＩターゲット基板にスプレーするとき、得られる試料は均一に分布して、結晶がレーザーエネルギーを効果的に吸収することができる。従って、これを考慮すると、再使用が可能な典型的なＭＡＬＤＩターゲットの独特な特徴を保持しながら、優れた質量分析の効果を達成することができる。
【００６８】
本発明の上記及び他の目的及び特徴が、添付の図面に関連付けして、本発明の下記の記載から明らかになるだろう。
【００６９】
以下、本発明の脱離／イオン化によるナノワイヤを用いた質量分析方法が、下記の実施例を基に以下に記載されるが、それらは本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００７０】
（実施例）
（実施例１） ナノワイヤを用いた質量分析
シリコン基板の表面にスパッタリング気相成長法によりＡｕを２ｎｍの厚さで堆積させ、ここで、堆積の領域はマスクを用いて直径２００μｍの円形に形成した。それから、化学気相成長法（ＣＶＤ）により、基板にＳｉＣｌ４を５００℃で供給し、それによってシリコンナノワイヤが成長し、図１は基板上に成長したシリコンナノワイヤを示す。用いたシリコンナノワイヤは、長さが５μｍ、直径が１００ｎｍ、密度が約１．８×１０６ＮＷｓ／ｍｍ２に制限した。このようにナノワイヤを成長させた基板を質量分析計の試料検査プレートに挿入した。質量分析は、Bruker Daltonics社（ドイツ）のリフレックス（Reflex）３を使用して行った。用いた試料は２種類のペプチド、アンギオテンシンとロイシンエンケファリンであった。ナノワイヤスポットの直径を０．２ｍｍに制限し、試料のイオン化のために、レーザーの円形スポット（直径０．２ｍｍ）で試料の結晶を照射した。上記のように、試料の結晶の大部分がレーザーに曝され、このように、イオン化した試料の量は試料の量と定量的な関係を有するようにした。検査で、マトリクスなしでナノワイヤ試料プレートを用いたＭＡＬＤＩによるペプチドの質量分析が見出された。結果の比較のために質量分析計の試料検査プレートを使用したとき、ペプチドの質量分析を行うことはできなかった。また、実験結果から上記の方法で試料の定量が可能であることが見出された。
【００７１】
（実施例２） ナノワイヤ懸濁液を利用した質量分析
シリコン基板の表面にスパッタリング気相成長法によりＡｕを２ｎｍの厚さで堆積させ、ここで、化学気相成長法（ＣＶＤ）によりＩｎＣｌ３およびＮＨ３を５００℃で供給することによって、ＩｎＮナノワイヤを成長させた。上記のシリコン基板をイソプロピルアルコールに入れて１０秒間超音波を印加して、基板からナノワイヤを分離することにより、ナノワイヤ懸濁液を調製した。典型的なマトリクスの代りにBruker Daltonics社（ドイツ）のＭＡＬＤＩターゲットを用いることにより、ナノワイヤ懸濁液を用いてＭＡＬＤＩ測定を行った。試料の結晶中心がアンカーに集中するというＭＡＬＤＩターゲットの特別な特徴を利用して、少量のナノワイヤ懸濁液を処理してアンカーの周辺にナノワイヤアイレットを形成した。それから、上記のナノワイヤアイレットに試料のペプチドを滴下し、試料の結晶を形成させた。検査で、ナノワイヤ懸濁液はマトリクスに置き換えることができ、結果として定量的な結果が得られたことが見出された。
【００７２】
（実施例３） ナノワイヤを用いた結合反応の検出
実施例１のようにナノワイヤが成長したナノワイヤターゲットにＢ型肝炎の抗原溶液を加え、ナノワイヤ上にＢ型肝炎の抗原が固定されるように１時間水分で飽和された３７℃の恒温槽で培養した。それから、固定されなかったＢ型肝炎の抗原を分離するために、ナノワイヤターゲットを洗浄液に浸漬した。抗体−抗原反応を誘起するため、Ｂ型肝炎の抗原を含有する試料溶液をナノワイヤに加え、それから抗体−抗原反応の後で残された試料を除去するためにナノワイヤターゲットを洗浄溶液に入れた。それから、ＭＡＬＤＩは、ナノワイヤと結合された抗原−抗体結合物の定性分析と同様に定量分析を行うことが可能であることが確認された。同じように、ナノワイヤＭＡＬＤＩターゲットを用いて、ＤＮＡ間、ＤＮＡとＲＮＡ間、あるいはタンパク質間の結合体を定量的に検出することが可能である。さらに、有機物と無機物などのリガンド（ligand）およびレセプタ（receptor）間の結合体を定量的に検出することも可能である。
【００７３】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に説明された。しかし、開示の考察から、当業者が本発明の範囲及び趣旨内で修正及び改善を行えることが認識されるだろう。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
上述のように、ナノワイヤ支援レーザー脱離／イオン化質量分析によれば、試料を固定し、試料に照射されるレーザーエネルギーを効果的に伝達して試料の脱離／イオン化を行うことができるナノワイヤを用いることにより、マトリクスなしで試料の質量分析が可能である。
【００７５】
即ち、本発明は、上記のナノワイヤを使用することにより、上述のナノワイヤを用いて効果的に試料を脱離／イオン化させることを可能にし、それによって低分子量の試料と同様に、試料の定性的、定量的、及び微量分析を効果的に行うことができる。さらに、本発明はＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ ＭＳで用いられる典型的な質量分析計にも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１（ａ）はＺｎＯナノワイヤスポットを形成させた基板およびこれを質量分析計の試料検査プレートに挿入したターゲットプレートを示す写真であり、図１（ｂ）と（ｃ）は走査電子顕微鏡で撮影した成長したナノワイヤの拡大写真を示す。ここで、参照番号１は検査プレートを示し、参照番号２はターゲットプレートを示し、参照番号３は基板を示し、参照番号４はナノワイヤしポットを示す。
【図２】図２はＺｎＯナノワイヤ上に試料なしでレーザーを照射した後の分子量のピークを示すグラフである。
【図３】図３はロイシンエンケファリンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．１３、０．２５、０．５０、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた後の質量分析の結果を示す。
【図４】図４はアンギオテンシンをＺｎＯナノワイヤチップに各々０．２５、０．５０、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた後の質量分析の結果を示す。
【図５】図５はＺｎＯ、ＳｉＣ、ＳｎＯ２、ＧａＮの４つの異なる種類のナノワイヤ懸濁液を用いて得られたペプチドの分子量のピークを示す。
【図６】図６はＺｎＯナノワイヤチップの１０回の洗浄でリサイクルした後の０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でロイシンエンケファリンの質量分析の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法であって、
（ａ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に多数の微細なナノワイヤを成長させることによりナノワイヤスポットを形成する工程と、
（ｂ）分析しようとする物質を含む前記試料を前記ナノワイヤスポットに配置し、乾燥により結晶化させる工程と、
（ｃ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で前記試料が前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した前記ナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを試料に伝達して、前記イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有するナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２】
前記ナノワイヤスポットを形成する工程において、前記ナノワイヤは直径５００ｎｍ以下であり、アスペクト比が１０以上であるナノワイヤが成長を許容される
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項３】
前記ナノワイヤスポットを形成する工程において、成長させる前記ナノワイヤは、シリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項４】
前記ナノワイヤスポットを形成する工程において、前記ナノワイヤスポットの面積がレーザーの照射面積と等しく、または、小さくなるように形成する
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項５】
前記試料は塩および分析しようとする物質を有し、前記塩の濃度は１０ｍＭより大きい
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項６】
前記試料における前記分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含まれる
請求項１または請求項５記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項７】
照射される前記レーザーは、選択されるナノワイヤの種類に応じて前記半導体の基板上に成長したナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有する
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項８】
前記イオン化された物質の質量分析を行うときに、イオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項９】
レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法であって、
（ａ）多数の微細なナノワイヤを含有するナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布された前記ナノワイヤ懸濁液を乾燥させてナノワイヤアイレット（ｉｓｌｅｔ）を形成する工程と、
（ｃ）分析しようとする物質を含む前記試料を前記ナノワイヤスポットに配置し、乾燥により結晶化させる工程と、
（ｄ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で前記試料が前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した前記ナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを前記試料に伝達して、前記イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有するナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１０】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、ナノワイヤを成長させた半導体の基板を揮発性溶液に入れた後、超音波を印加することによりナノワイヤを前記半導体の基板から分離させることで、前記揮発性溶液にナノワイヤを有する混合された状態として前記ナノワイヤ懸濁液が形成される
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１１】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤは直径５００ｎｍ以下であり、アスペクト比が１０以上である
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１２】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤはシリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１３】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、前記ナノワイヤ懸濁液は前記半導体の基板上の選択された領域へのスプレーにより形成される
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１４】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、前記ナノワイヤスポットの面積がレーザーの照射面積と等しく、または、小さくなるように形成する
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１５】
前記試料は塩および分析しようとする物質を有し、前記塩の濃度は１０ｍＭより大きい
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１６】
前記試料における前記分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含まれる
請求項９または請求項１５記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１７】
照射される前記レーザーは、選択されるナノワイヤの種類に応じて前記半導体の基板上に成長したナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有する
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１８】
前記イオン化された物質の質量分析を行うときに、イオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１９】
レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法であって、
（ａ）多数の微細なナノワイヤと分析しようとする物質を含有する試料溶液を混合してナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布された前記ナノワイヤ懸濁液を乾燥させて、ナノワイヤと前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した試料を有するナノワイヤアイレット（ｉｓｌｅｔ）を形成する工程と、
（ｃ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で前記ナノワイヤアイレット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを前記試料に伝達して、前記イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有するナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２０】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤは直径５００ｎｍ以下であり、アスペクト比が１０以上である
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２１】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤはシリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２２】
前記試料は塩および分析しようとする物質を有し、前記塩の濃度は１０ｍＭより大きい
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２３】
前記試料における前記分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含まれる
請求項１９または請求項２２記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２４】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、前記ナノワイヤ懸濁液は前記半導体の基板上の選択された領域へのスプレーにより形成される
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２５】
前記ナノワイヤスポットの面積がレーザーの照射面積と等しく、または、小さくなるように形成する
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２６】
照射される前記レーザーは、選択されるナノワイヤの種類に応じて前記半導体の基板上に成長したナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有する
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２７】
前記イオン化された物質の質量分析を行うときに、イオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１】
レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法であって、
（ａ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に多数の微細なナノワイヤを成長させることによりナノワイヤスポットを形成する工程と、
（ｂ）分析しようとする物質を含む前記試料を前記ナノワイヤスポットに配置し、乾燥により結晶化させる工程と、
（ｃ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で前記試料が前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した前記ナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを試料に伝達して、前記イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有するナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２】
前記ナノワイヤスポットを形成する工程において、前記ナノワイヤは直径５００ｎｍ以下であり、アスペクト比が１０以上であるナノワイヤが成長を許容される
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項３】
前記ナノワイヤスポットを形成する工程において、成長させる前記ナノワイヤは、シリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項４】
前記ナノワイヤスポットを形成する工程において、前記ナノワイヤスポットの面積がレーザーの照射面積と等しく、または、小さくなるように形成する
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項５】
前記試料は塩および分析しようとする物質を有し、前記塩の濃度は１０ｍＭより大きい
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項６】
前記試料における前記分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含まれる
請求項１または請求項５記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項７】
照射される前記レーザーは、選択されるナノワイヤの種類に応じて前記半導体の基板上に成長したナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有する
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項８】
前記イオン化された物質の質量分析を行うときに、イオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する
請求項１記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項９】
レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法であって、
（ａ）多数の微細なナノワイヤを含有するナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布された前記ナノワイヤ懸濁液を乾燥させてナノワイヤアイレット（ｉｓｌｅｔ）を形成する工程と、
（ｃ）分析しようとする物質を含む前記試料を前記ナノワイヤスポットに配置し、乾燥により結晶化させる工程と、
（ｄ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で前記試料が前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した前記ナノワイヤスポット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを前記試料に伝達して、前記イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有するナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１０】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、ナノワイヤを成長させた半導体の基板を揮発性溶液に入れた後、超音波を印加することによりナノワイヤを前記半導体の基板から分離させることで、前記揮発性溶液にナノワイヤを有する混合された状態として前記ナノワイヤ懸濁液が形成される
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１１】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤは直径５００ｎｍ以下であり、アスペクト比が１０以上である
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１２】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤはシリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１３】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、前記ナノワイヤ懸濁液は前記半導体の基板上の選択された領域へのスプレーにより形成される
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１４】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、前記ナノワイヤスポットの面積がレーザーの照射面積と等しく、または、小さくなるように形成する
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１５】
前記試料は塩および分析しようとする物質を有し、前記塩の濃度は１０ｍＭより大きい
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１６】
前記試料における前記分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含まれる
請求項９または請求項１５記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１７】
照射される前記レーザーは、選択されるナノワイヤの種類に応じて前記半導体の基板上に成長したナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有する
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１８】
前記イオン化された物質の質量分析を行うときに、イオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する
請求項９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項１９】
レーザーをエネルギー源として用いる脱離／イオン化による試料のナノワイヤ支援質量分析方法であって、
（ａ）多数の微細なナノワイヤと分析しようとする物質を含有する試料溶液を混合してナノワイヤ懸濁液を形成する工程と、
（ｂ）電圧を印加することができる導電体または半導体の基板上の選択された領域に塗布された前記ナノワイヤ懸濁液を乾燥させて、ナノワイヤと前記ナノワイヤに吸着及び結晶化した試料を有するナノワイヤアイレット（ｉｓｌｅｔ）を形成する工程と、
（ｃ）前記基板に電圧を印加した状態で、減圧下で前記ナノワイヤアイレット上に同時にレーザーを照射して、前記ナノワイヤを通してエネルギーを前記試料に伝達して、前記イオン化された分析しようとする物質の質量分析を行う工程と
を有するナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２０】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤは直径５００ｎｍ以下であり、アスペクト比が１０以上である
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２１】
前記ナノワイヤ懸濁液を形成する工程において、前記ナノワイヤはシリコンを含有する単一金属、酸化物、炭化物、窒化物、リン化物およびヒ化物半導体ナノワイヤからなる群から選択される
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２２】
前記試料は塩および分析しようとする物質を有し、前記塩の濃度は１０ｍＭより大きい
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２３】
前記試料における前記分析しようとする物質の濃度は１フェムトモルより小さく含まれる
請求項１９または請求項２２記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２４】
前記ナノワイヤアイレットを形成する工程において、前記ナノワイヤ懸濁液は前記半導体の基板上の選択された領域へのスプレーにより形成される
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２５】
前記ナノワイヤスポットの面積がレーザーの照射面積と等しく、または、小さくなるように形成する
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２６】
照射される前記レーザーは、選択されるナノワイヤの種類に応じて前記半導体の基板上に成長したナノワイヤのバンドギャップより大きいエネルギーを有する
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【請求項２７】
前記イオン化された物質の質量分析を行うときに、イオンの質量／電荷の値（ｍ／ｚ）を測定する
請求項１９記載のナノワイヤ支援質量分析方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【公表番号】特表２００７−５２９７４０（Ｐ２００７−５２９７４０Ａ）
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０３８２８（Ｐ２００７−５０３８２８）
【出願日】平成１７年３月１５日（２００５．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８８２９３
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５９５００１１８１）コリア インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１５日（２００５．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８８２９３
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５９５００１１８１）コリア インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (25)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]