ナノ加工表面におけるＤＮＡ浄化および分析
人間の白血球からゲノムＤＮＡを単離し、同時に、遺伝子分析を簡素化するためにＤＮＡを補足して測定するマイクロ流体装置である。装置は、流体入口ポート、流体出口ポート、および流体入口ポートに連結したＤＮＡ結合チャネルを含み、ＤＮＡ結合チャネルの少なくとも１つの表面の少なくとも一部が、ＤＮＡが表面に特異的に結合するように結合試薬で改質される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府の関与］
この発明はＳＢＩＲ許諾番号ＧＭ０７２１７８−０１の下で政府の支援の下でなされた。政府はこの発明に関し所定の権利を有するかもしれない。
［関連出願の相互参照］
この出願は２００５年１月２６日に提出された米国特許出願第１１／０４３，５６１により生じる利益を要求し、その出願の内容は参照してここに組み入れる。
【０００２】
この発明は全般的にはＤＮＡの浄化に関し、具体的には、ＤＮＡの浄化および分析におけるナノ加工表面の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ゲノムＤＮＡの単離、操作、および測定を簡略化する技術が、携帯型の医療診断または生体防御の用途に必要とされている。人体の組織から単離された核酸の質は、再生産可能で正確で詳細な遺伝子分析データに決定的である。ＤＮＡ単離製品は商業的に重要なので、この分野における研究も沢山ある。
【０００４】
著しい進展が見られる１つの技術は遺伝子分析を行うためのマイクロ流体装置である。多くのマイクロアレイ分析フォーマットが入手可能であり、これらは共通して単一のサンプルから広範囲の遺伝子ターゲットを同時に調べることができる。
【０００５】
二重螺旋ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の濃度を蛍光性マイナーグルーブ結合分子（ＭＢ）を利用して測定する高感度の液相分析が、すでに開発されている。ＤＮＡがないときには、その分子は溶液内で自由に回転でき、これは低蛍光背景に欠かせない。ｄｓＤＮＡに結合すると、この化合物は疎水性のマイナーグルーブにおいて堅固な平面配座を形成し、これが蛍光を増大させる。蛍光ＭＢの表面への結合を注意深く操作することにより、マイクロ流体装置を通過するときに、ＤＮＡの料を測定できる。
【発明の開示】
【０００６】
したがって、この発明の目的は、同時に、ゲノムＤＮＡを単離し、精製したＤＮＡの量を測定し、下流の分析のための特定の濃度の標準化ＤＮＡ溶液を分配するマイクロ流体装置を提供することである。
【０００７】
この発明のさらなる目的は、装置のコストおよび複雑さを最小化してＤＮＡを単離して準備するＤＮＡ単離用のマイクロ流体装置を提供することである。
【０００８】
この発明のさらなる目的は、同時に、生物学的流体から二重螺旋ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を補足し、固定化したＤＮＡの料を測定することができるマイクロ流体装置を提供することである。
【０００９】
この発明のさらなる目的は、求電子性または求核性リンカー基を具備する蛍光性マイナーグルーブバインダ薬剤（ＭＢ）を合成し、ｄｓＤＮＡの存在下で増大した蛍光性を明らかにすることである。
【００１０】
この発明のこれらの目的および他の目的は以下の説明および図面からより容易に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ｄｓＤＮＡの濃度を測定する高感度の液相分析が蛍光性マイナーグルーブ結合（ＭＢ）試薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）を用いて開発されている。ＤＮＡがないときには、その分子は溶液内で自由に回転でき、これは低蛍光背景に欠かせない。ｄｓＤＮＡに結合すると、この化合物は疎水性のマイナーグルーブにおいて堅固な平面配座を形成し、これが蛍光を増大させる。蛍光ＭＢの表面への結合を注意深く操作することにより、マイクロ流体装置を通過するときに、ＤＮＡの料を測定できる。共役化学を用いて、立体配座の自由度を最大化させターゲットＤＮＡにアクセスするように設計された高分子構造上で蛍光体を位置決めする。
【００１２】
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８分子は多環式構造を有し、これが、Ｂ−フォームＤＮＡのマイナーグルーブに同等螺旋で合致する（ｉｓｏｈｅｌｉｃａｌ）三日月構造を形成できる。図１は、合成１２−ｍｅｒのＤＮＡ二本鎖に結合するＨｏｅｃｈｓｔの溶液ＮＭＲ構造を示す。三日月形状の分子のフェノール末端は、共役基で結合するための便利な結合点である。液体溶液中の構造は柔軟であり、そうたいてきには非蛍光性である。未結合の分子を３５６ｎｍの光で励起すると、４９２ｎｍで弱い蛍光性を示す。ただし、ｄｓＤＮＡに結合すると、ベンズイミダゾール環が平坦配座に固定され、大規模な芳香族系が形成され４５８ｎｍで強い蛍光を発散する。この分子はマイナーグルーブ中でむず分子から遮蔽され、これによりさらに蛍光が増大する。Ｈ３３２５８ｎｏこのような蛍光性特徴によりｄｓＤＮＡの濃度を測定する高感度な分析が開発され、これは簡単な分析であり、細胞係数に用いられる。
【００１３】
ＤＮＡに結合するＨ３３２５８の構造に関心がもたれてきた。ＭＢは疎水性相互作用、バンデルワールス力およびイミダゾール残留による水素結合によって適所に保持される。Ｈ３３２５８の強力なマイナーグルーブ結合によりｄｓＤＮＡを直接に単離する機構も実現できる。アデニン／チミンが多い配列に対するＭＢのマイナーグルーブ結合が好ましく、ＤＮＡ結合定数は挿入剤のような他の小さなＭＷ試薬よりも大きなオーダーとなる。挿入蛍光試薬も十分に試された。このクラスのＤＮＡ結合試薬の例は臭化エチジウムであり、電気泳動後のゲル中のＤＮＡを染色するために広く用いられている。メチジウム染料は、セファロース粒子に結合されてＤＮＡ単離製品を実現してきた。メチジウムのような挿入染料はマイナーグルーブバインダのクラスの染料ほど結合力が大きくない。メチジウムはセフロース粒子にカチオンスペルミンリンカーを利用して結合された。これは明らかにＤＮＡ結合を改善した。さらに、エチジウムは、ｄｓＤＮＡに結合して、量子収率をわずかだけ向上させる。メチジウム・セフロース粒子の蛍光特性は説明されていなかった。
【００１４】
シアニン型の挿入染料はエチジウム挿入剤よりかなり多くの蛍光性を有する。チアゾールオレンジ（ＴＯ）は、２つの二環芳香族環構造からなる非対称なシアニン染料である。５０９ｎｍの光で励起されると、これら２つの構造が相互に自由に回転し、蛍光性はほとんどない。しかし、ｄｓＤＮＡがあると、ＴＯは塩基対の間に入り込み、環システムが平坦になるように強制する。強い蛍光を５３３ｎｍで生じる大きな芳香族系ができる。ＴＯはマイナーグルーブ結合試薬のように強固にｄｓＤＮＡには結合しないが、２つのＴＯ分子が一緒に結合して強固な結合二重挿入剤（ｂｉｓ−ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を形成できる。
【００１５】
高感度のＤＮＡ結合分析がシアニン型の染料の蛍光特性に基づいて開発されてきた。ＴＯもＲＮＡの存在下で３０００倍までの増大を示す。この特性は興味深いものであり、ＲＮＡ単離装置に適用できる。
【００１６】
これら蛍光性化合物は、オリゴヌクレオチドに結合されて、ハイブリダイズ分析中でｄｓＤＮＡの形成を監視するＤＮＡプローブを形成してきた。Ｈ３３２５８のいくつかの反応性誘導体はＤＮＡプローブへの結合用に開発されてきた。図２は、ＤＮＡプローブのリンカーに結合させるために開発されたＨ３３２５８のいくつかの反応性類似物を示す。
例えば、Ｈ３３２５８のブロモアセチル類似物はスルフヒドリル改質オリゴヌクレオチドと共役であった。高感度のＤＮＡ結合分析がシアニン型の染料の蛍光特性に基づいて開発されてきた。ＴＯもＲＮＡの存在下で３０００倍までの増大を示す。この特性は興味深いものであり、ＲＮＡ単離装置に適用できる。
【００１７】
これら蛍光性化合物は、オリゴヌクレオチドに結合されて、ハイブリダイズ分析中でｄｓＤＮＡの形成を監視するＤＮＡプローブを形成してきた。Ｈ３３２５８のいくつかの反応性誘導体はＤＮＡプローブへの結合用に開発されてきた。図２は、ＤＮＡプローブのリンカーに結合させるために開発されたＨ３３２５８のいくつかの反応性類似物を示す。相補的な単一螺旋のＤＮＡターゲットへのハイブリダイズは結合親和力を増大させ、結合時に蛍光を２３倍まで増大させる。改善された結合効率（ＤＮＡ溶融温度）は、配列特異的なものである。Ａ／Ｔ領域がリガンドの結合点の近くに配置されると、ＴＭが急激に増加し、Ｈ３３２５８の強力なＤＮＡ結合作用を実現する。同様の合成化学を用いてこれら蛍光性染料の反応性類似物を準備してアミン改質ガラスまたはプラスチック表面と共役させることができる。
【００１８】
オリゴのシアニン染料共役物は、相補的なＤＮＡ螺旋を付加したときに、予想通りのハイブリダイズ誘引の蛍光を示した。蛍光性は、形成された二本線の末端配列に応じて変化した。ＴＯのＤＮＡ二重線への結合は、配列依存であることが知られている。シアニン染料のＨＮＳエステル類似物はアミン改質オリゴヌクレオチドと反応して蛍光性「実時間」ＰＣＲ分析に使用されるＤＮＡプローブを実現した。蛍光の２０倍までの増加がオリゴヌクレオチド共役物において観察された。ＭＧＢおよびシアニン型蛍光性オリゴヌクレオチド共役物の双方のＤＮＡプローブへの適用は、染料の配列依存の結合ゆえに、複雑であった。ＤＮＡのゲノム片の異種集団に焦点があてられるので、結合部位の配列依存によりｓＤＮＡの結合測定が影響を受けないようにすべきである。
【００１９】
核酸は、高濃度のカオトロピック塩溶液の存在下で、ガラス表面と極めて高い親和性を有し、多くのガラスベースのＤＮＡ単離製品が商業的に入手できる。これら製品は使いやすいけれども、複数のピペット操作、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブまたは９６ウェルプレート、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）、遠心分離機のような装置へのアクセスを必要とする。操作は開放された研究施設で行われ、溶液の蒸散による問題を回避するために比較的大きな資料体積を必要とする。ＤＮＡ濃度は通常ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計により測定され、再現可能な結果をえるためには良好な技術が必要とされる。それにもかかわらず、種々の生物学的資料からＤＮＡを単離するためにガラスが使用され続けてきた。
【００２０】
ＤＮＡ結合のガラスへの初期の適用は、アガロースゲルから電気泳動的に浄化されたＤＮＡを単離するためのものであった。ソーダライムまたはボロシリケートガラスのＤＮＡ結合能力は、８００ｍｍ２あたりＤＮＡを約３００ｎｇと同等のものであった。８００ｍｍ２は、ほぼ、ガラス顕微鏡スライドおよび２０×２０ｍｍカバースリップの間に形成されるチャンバの表面面積である。多くのマイクロ流体ＤＮＡ単離アプリケーションでは、チューブまたはファイバーからの粉末ガラス、二酸化珪素、または珪藻のシリカスケルトンを利用する。これらのサポートは平坦な表面よりかなり大きな表面面積を確保できるからである。マイクロ流体装置は、溶液の体積が小さく（蒸散の問題がない）、ＰＣＲゲースのゲノム分析に必要とされる捕捉ＤＮＡの量が著しく少ないので、締結号の平坦なガラス表面を用いることができる。平坦なガラスは種々の組成物、サイズ、および、粗さで入手でき、より表面面積が必要ならばさらなるエッチングを行える。
【００２１】
ｍＲＮＡまたはＤＮＡの液相分析は、一端に蛍光レポータ基を他端に蛍光消光分子を担持するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲサイクルにおいて実現される。１つのフォーマット（ＴａｑＭａｎ分析）において、プローブは、Ｔａｑポリメラーゼの３'−エキソヌクレアーゼにより要約される短い単一螺旋のオリゴである。他の蛍光性フォーマット（分子ビーコン分析）は、幹部に隣接蛍光体および消光分子を具備するヘアピン形状のオリゴを用いる。ヘアピンは、相補的なＤＮＡ螺旋の存在下で開いて蛍光信号を付与する。これら蛍光性フォーマットの各々は、それぞれの増幅サイクルが成功して蛍光信号を増大させるので、ＰＣＲの進捗をモニターするのに用いることができる。これらＰＣＲベースのフォーマットの双方は、分析サイズの下限が処理上の問題（小さな胆石の染色）および利用可能な装置の解像度のみに制約されるだけであるので、マイクロ流体ベースのプラットホームに理想的である。好評な（高スループット）の熱サイクル蛍光光度計は、ＡＢＩ７９００ＨＴであり、これは３８４ウェルプレートを分析でき、ＰＣＲの間に測定される各遺伝子のウェル当たり１０ｕＬである。ウェルあたり１０ｐｇ−１０ｎｇのゲノムＤＮＡが好ましく、これはＰＣＲシステムの効率およびＤＮＡの量に左右される。
【００２２】
ガラス顕微鏡スライドがＤＮＡマイクロアレイの慣用的な基板である。多くのマイクロアレイ分析フォーマットが入手可能であり、これらは共通して単一のサンプルから広範囲の遺伝子ターゲットを同時に調べることができる。合成オリゴヌクレオチドのアレイは、ガラスサポートから直接に合成され、改質合成プローブの終点結合により準備されてきた。ガンマアミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）は、ガラス表面を官能化するのに用いることが可能な揮発性試薬であり、いくつかのＧＡＰＳスライドの製造者がある。ＧＡＰＳスライドのアミン被覆表面を二官能性リンカーを用いて活性化して、アミン改質オリゴの溶液と反応する親電子性表面を生成できる。種々の共役化学を用いて蛍光性ＤＮＡ結合染料を結合するのに用いることができる。
【００２３】
オリゴヌクレオチドのアタッチメントの密度はハイブリダイズの効率上重要な要素である。高密度のオリゴはガラスから直接合成して実現できるけれども、捕捉プローブが過剰に緊密に包まれるときにラベルＤＮＡターゲットのハイブリダイズが実際に落ちることが判明した。ガラスアタッチメント点およびオリゴヌクレオチド配列の間のリンカーの長さを長くしたときにハイブリダイズの効率が改善した。長さが８０原子までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のリンカーハイブリダイズ信号を改善し続けた。このことは、液相パフォーマンスを再現するためには固体サポートおよびＤＮＡプローブの間の長いリンカーが重要であることを示す。
【００２４】
ＤＮＡプローブをガラス表面に長いポリエチレングリコールで結合すると効率を改善した。種々の官能基を伴う高分子ＰＥＧリンカーは商業的に入手可能であり（Ｑｕａｎｔａ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｏｈｉｏ）、薬物動態特性を改善するためにたんぱく薬剤に結合させるために主に用いられた。他の高分子構造が固定化ＤＮＡプローブの性能を改善するために採用された。例えば、ビオチン改質分子ビーコンがアビジン被覆ガラスサポートに結合されて配列特異的なＤＮＡ分析に用いられた。アビジンまたはストレプトアビジンをスペーサとして用いてＤＮＡをガラス表面から離して配置することが、プローブの機能として同様に重要である。考慮すべき他のタイプの高分子リンカーはデンドリマーポリマーである。これら商業的に袖手可能な（Ａｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ワイオミング州、ミルオーキ）分子は、合成の「ジェネレーション」に応じてアミノ基およびカルボキシレート基の交互の層の中に合成される。これら分子の三次元構造は良好に制御され、その特定は良く理解できる。アミン豊富デンドリマー構造は、細胞中でＤＮＡを包囲するのに重要なヒストンタンパク質と類似している。これらは、見込みのある遺伝子治療用途のために細胞中にＤＮＡ系列を導入するために成功裏に使用されてきた。デンドリマーリンカーは固定化ＭＢ分子をＤＮＡ豊富溶液中に実現する良好な骨格を形成すると考えられる。デンドリマーリンカーおよび蛍光性ＤＮＡ検出分子（Ｓｙｔｏｘ １３、分子プローブ）を含むバイオセンサーフィルムを用いてプラスチック表面上の生細菌のレベルを測定した。これら材料は、リンカー、蛍光性染料またはプラスチック表面の間に共有リンクを含まなかったけれども、疎水性力により一体になっていた。
【００２５】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、閉鎖されているマイクロ流体処理から便宜を受ける小型分析を実現する。例えば、連続流で動作するマイクロマシン化化学増幅器は１７６−塩基対フラグメントの２０サイクルのポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）増幅を示した。流れチャンバーにおいて堰後方で捕捉された白血球からのゲノムＤＮＡターゲットのＰＣＲ増幅は、シリカガラスマイクロチップ中の全血液から示された。ＤＮＡチップアレイを用いた中程度の密度のアレイメソッドが、ＰＣＲ製品の診察用系列用に開発されて、使用する際のコストや手間が省かれた。抗生物質耐性臨床分離株が、ＰＣＲ増幅の後、１時間以内に視覚的に検出された。他の用途は、漢方薬において用いられる毒性薬草のＤＮＡ系列ベースの特定である。２００１年、Ｐｅｔｒｉｋは、Ｃ型肝炎ウイルスについて献血を大規模にスクリーニングするゲノムプロジェクト用に当初開発されたマイクロアレイデバイスの使用を調査した。ＰＣＲ分析用に一体化したシステムは、二重ペルティエ熱電気要素を電気泳動サイジングおよび検出にマイクロチップ上で結合することにより取得できた。ＤＮＡ濃縮注入スキームの使用により、１０熱サイクル程度の回数でＰＣＲ生成物の検出が可能になった。マイクロ流体カートリッジは、超音波分断、崩壊した胞子へのＰＣＲ試薬の添加、およびＰＣＲチューブ中の混合物の注入によりＰＣＲ分析用に胞子を準備するために開発された。胞子ＤＮＡの処理および検出は２０分以内に完了された。単一ＤＮＡテンプレート分子の統計的ＰＣＲ増幅を、これに続く生成物の電気泳動分析に組み合わせた一体化したマイクロ流体装置が、開発された。繰り返されたＰＣＲ分析から正規化されたピーク領域のヒストグラムが、反応装置中の単一の成長可能なテンプレート分子コピーによる量子化を示した。核酸系列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）により増幅されたＲＮＡを検出するためのマイクロ流体チップが開発された。クリプトスポリジウムパルバム（ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖａｍ）のサンプルが検出され、増幅ＲＮＡをＮＡＳＢＡ混合物から分離することなしに明瞭に比較例（ｃｏｎｔｒｏｌ）から区別できた。ほおの細胞から直接にナロリットルＤＮＡ分析を行うための自動化マイクロ流体システムが開発された。これは、ＤＮＡ分析に必要なすべてのステップ、すなわち、注入、混合、溶解、ＰＣＲ、分離、サイジング、および検出を含む。このシステムをさらに小型化する可能性が確立された。一体化されたマイクロ流体チップベースシステムが、遺伝子組み替え型の、アデノウイルスの、治療プロダクトの品質制御テスト用に開発された。ウイルス特定テストがＤＮＡ断片の寸法を図り計量し、アガロースゲル法に較べて１００倍少ないサンプルしか必要としない。
【００２６】
少量の人の血液（＜２０μＬ）を処理して遺伝子分析用の標準化ゲノムＤＮＡサンプルを放出するＤＮＡ単離装置を開発する必要がある。種々のＤＮＡ処理チャンバーを流れる流体の流れを制御するマイクロポンプ駆動機器中に挿入できる単一回数使用のマイクロ流体カードが開発できる。固定化さら計量化されたＤＮＡも即座の使用のために溶液中に放出され、または将来の分析用に保存される。装置内の固定化ＤＮＡの捕捉および開放を蛍光性により測定する能力により、この新規なＤＮＡ処理システムの処理通の制御が可能になる。この技術は、分子生物学的な研究における汎用のスタンドアローン製品の開発に用いることができ、また生物医療用途の遺伝子分析を簡素化するためのより複雑な装置を開発するのに用いることができる。開発された単一ウェル装置で単離された、精製し、変性したＤＮＡは、マイクロ流体チャネルを介して、実時間ＰＣＲまたはＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子分析のために種々のマイクロウェルフォーマットへ分配できる。図３は、細胞からゲノムＤＮＡを単離するのに用いることができる小型生物医療装置の開発に必要なマイクロスケール物理過程を示すことを意図している。
【００２７】
図３は、血液全体からＤＮＡを単離することを目論むマイクロ流体装置のチャネル内を流れる血液全体および他の流体の間の相互作用を示す。小型化生物医療装置の開発において使用されるマイクロスケールの物理的過程を、細胞からゲノムＤＮＡを単離するのに用いることが可能であることが示される。ここで図３を参照すると、血液全体５４に含まれる小さな粒子５２を含む第１の流れ５０と、純粋な溶液６０中の小さな粒子５８を含む第２の流れ５６が共通チャネル６２に導入され、ここで、これらが層状の流体拡散インタフェース（ＬＦＤＩ）を形成する。粒子５２、５８は、それらの拡散係数に依存して、ＬＦＤＩを境にして拡散を開始し、この場合、より小さな粒子５８がより速く拡散する。この装置を用いて、小さな粒子を血液全体から抽出し、または、予想可能な連続的な手法で血液全体に試薬を導入できる。
【００２８】
Ｈｏｅｃｈｓｔ染料の研究から得られる予備的な観察もこの用途に適切である。Ｈｏｅｃｈｓｔ染料の滴を水または緩衝溶液中に落とすと、その点が乾燥するときに、蛍光が増大する。これは、蛍光環境の「水和成分」（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）に関係し、蛍光背景に影響を与える。蛍光体は低背景のために十分に水和されている必要があり、疎水性表面被覆の重要性を強調する。
【００２９】
最初の焦点は、ｄｓＤＮＡを結合し測定する蛍光性固体サポートを合成し試験することにある。アミン反応性官能基を伴う蛍光性ＭＢが初めに種々の既知の手法を用いて準備される。これらエージェントはアミン改質ガラスまたはプラスチックに固定化され、ＤＮＡで処理される前後で蛍光性が測定される。種々のリンカー構造が、ＤＮＡ濃度に対する蛍光性を測定する能力に関連して評価される。結合されたＭＢを伴う蛍光性表面が加工されて、低蛍光背景および良好なＤＮＡ結合を実現する。研究対象の典型的な表面を図４に示す。固体サポート（ガラスまたはプラスチック）、リンカー化学、および蓋をなす基のような変更物が試される。蛍光性ＭＢの化学量論（結合の密度）を試してＤＮＡ測定の最大ダイナミックレンジをなす表面を決定する。ＤＮＡ結合能力も試験する。
【００３０】
図４を参照すると、装置１００は、マイナーグルーブバインダ（ＭＢ）１０４を具備するアミン改質表面１０２を有する。未反応のアミンを残してカチオン表面を実現できる。装置１１０はサクシニル化により未反応のアミンに蓋をしてアニオン表面１１２を実現できることを示す。装置１２０は、最初にポリマーアミン含有リンカー（星型デドリマー、ジアミノ−ＰＥＧ、ポリ−Ｌ−リジン）を表面１２２に結合し、その後ＭＢ誘導体と反応させることによりＭＢ１０４を溶液へと拡張できることを示す。
【００３１】
所望の蛍光表面の開発と同時にＤＮＡ単離用のマイクロ流体装置も計画される。種々のサイズのＤＮＡサンプルを取得して（Ｓｉｇｍａ）、同一の蛍光性化合物を用いて固相および液相の双方において捕捉効率が蛍光性測定により決定される。装置からのＤＮＡの開放をモニターしてＤＮＡの純化および復元が良好であることを確かめる。ＤＮＡの捕捉および開放の条件が、蛍光性プレートリーダーにより測定される。ＤＮＡ結合能力および洗浄実験を行った後、蛍光装置が構築できる。蛍光性サポートを開発した後、装置のＤＮＡ捕捉および測定機能が組み合わされる。
【００３２】
種々のアミン改質固体サポートが入手できるので、誘導体が、活性求電子官能基、例えば、ヨードアセテート基、塩化シアヌル基、ＮＨＳエステル基、および他のアミン反応性部分を用いて準備可能である。固体サポート上の相補的な官能基と反応可能な所望の求電子または求核「ハンドル」を具備するＨ３３２５８類似体を実現する２つの合成手法が示されている。最も直接的なルートは、Ｈ３３２５８の十分に組み合わされた複素環式環構造からのものである。ＰＥＧの臭素アルキル誘導体の反応が、アリールエステルを高効率に生成する条件下でＨ３３２５８と反応することを示した。Ｈ３３２５８はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（５００ｍｇ＝２２０．８０ドル）から入手できる。ｔ−ブチルオキシカルボニル防護のヘキシルアミンリンカーは容易に合成され、トシレート誘導体が製造できた。臭素誘導体は容易にアクセス可能で、Ｈ３３２５８と反応可能と考えられ、これは図５に示す。図５を参照すると、Ｈ３３２５８がアルキル化Ｂｏｃ誘導体と反応される。求核アミノアルキル基（Ｒ＝Ｈ）を直接に求電子表面に固定化できる。代替的には、アミノ基を、図５に示すように、求核表面への固定化のために、求電子基、例えば、塩化シアヌル誘導体に変換できる。Ｂｏｃは希釈酸による処理で除去され、塩基で中和され第１ヘキシルアミン基（Ｒ＝Ｈ）を付与する。求核性の第１アミンは、第３アミンによる若干の競合的なアルキル化を伴う溶液中で選択的に求電子物質と反応できる。このような化学過程は、求電子官能基でコートされた固体表面の改質にも適用できるであろう。代替的には、Ｈ３３２５８のヘキシルアミン類似体は求電子残留物を残す二官能性リンカーと反応できる。塩化シアヌルは二官能性リンカーのように振る舞い官能基を含むアミンと結合する。残っている３番目の塩素基は２つノアミノ気が結合した後は非反応性である。この共役化学過程は改質表面を合成するために後に使用できる。他の代替手法は、Ｈ３３２５８をアニオン表面に結合することであり、カルボン酸基により生成されるものと同様である。これら表面は適宜に安定し、柔軟であり、ＤＮＡへの所望の蛍光性応答を実現できる。
【００３３】
多くの固相化学過程と同様に、試薬を大幅に過剰にするのは容易であり（入手可能な表面基に対して）、過剰な試薬を洗浄して除去することも容易である。したがって、結合効率は極めて高い（高密度パックが実現できる）。ガラスおよびプラスチック基体の表面面積、固定化化学過程、リンカーのタイプ、および「結合可能」蛍光性化合物（蛍光体）は最適化される。商業的に入手可能なデンドリマーリンカー、ポリ−Ｌ−リジン、およびポリエチレングリコールジアミンは溶液中で蛍光体を表面からｄｓＤＮＡへと離すように配置するであろう。目標は、固定化された蛍光体の配座自由度を最大化し、ｄｓＤＮＡへのアクセスを最大化することである（ＤＮＡ結合および動力学を最適化することである）。
【００３４】
アミン改質のガラスおよびプラスチックサポートは、１×３インチの顕微鏡スライドとして入手可能であり、ＤＮＡマイクロアレイ用の一般的な基体である。多くのガラススライドはソーダライムガラスから製造され（Ｅｒｉｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューハンプシャー州ポーツマス）、（ガンマ）アミノプロピルシラン基で改質されて第１アミンの密度を均一にする。ＧＡＰＳスライドも他のガラスタイプとして入手可能であり（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ）、粗さが大きい（Ｅｒｉｅ）。アミノプロピル塗布のプラスチックスライドも入手して使用できる（Ｎｕｎｃ、デンマーク）。アミンにより官能化されたポリエステルフィルム（Ｍｙｌａｒ）もシートとして入手可能であり（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｍｉｎａｔｉｏｎｓ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ、カリフォルニア州オーシャンサイド、またはＡｄｈｅｓｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルバニア州グレンロック）、試験される。これら基体は求電子ＭＢ類似体を固定化するために直接的に用いてもよいし、求電子表面を実現するために二官能性リンカーで「活性化」（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）されてもよい。図６は１つの実現可能な共益化学システムを示す。塩化シアヌルの活性化が、他の脂肪族の二官能性リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）と同様に試験されるべきである。ガラススライドは、疎水性求電子物質、例えば塩化シアヌルを伴う無水有機溶媒中で活性化して試薬の水和を回避し、求電子改質濃度を向上させることができる。このため、ＰＥＧアミン（または他のポリアミン）の高度の充填が期待できる。蛍光性ＭＢ求電子物質の直接の結合（例えば図５のシアヌレート）が初めに試され、この（リンカーがない）蛍光性表面が特性化され種々の蛍光性検討の比較例（コントロール）として用いられる。
【００３５】
プラスチックスライドには穏やかな液体活性条件およびカルボジイミド結合または活性化されたエステルリンカーの使用が必要である。各末端にＮＨＳエステルを含むＰＥＧ高分子が商業的に入手可能である。商業的に入手可能なポリカルボキシレートデンドリマーは、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）化学過程を用いてアミン含有サポートに結合できるであろう。親水性のＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ３．５および４．５ＰＡＭＡＭデンドリマーは、それらの分子が６４および１２８の表面カルボキシレートをそれぞれ具備するので、とくに魅力的である。これら分子は大きなデンドリマーに悪影響を与える、高密度に「星型」に群れることがない。表面の残りのアミンをブロックしたのち（無水酢酸により）、リンカーのカルボキシレートは再びＥＤＣにより活性化されヘキシルアミン含有ＭＢと結合可能となり、これは図５から理解できる。完全に洗浄した後、スライドに共有結合したＭＢの量をプレートリーダーの吸収により測定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８発色体は３５６ｎｍで吸収を行い、Ｂｉｏ−Ｔｅｋプレートリーダーは適当なフィルタを用いてこの波長を顕微鏡スライド上で直接に測定できる。このスライドは乾燥でき、将来の使用のために評価できる。表面上の単一層の蛍光染料の安定性（貯蔵状態）を調査すべきである。
【００３６】
高分子リンカー構造は、溶液中で、蛍光性ＭＢセンサをｄｓＤＮＡに広げる骨格として働く。表面構造の蛍光特性がｄｓＤＮＡがある場合とない場合で試験されるべきである。Ｈ３３２５８誘導体はガラス上に歓送されているときに蛍光性があると知られているので、これら表面は、蛍光性ＤＮＡ結合特性について評価されるときに十分に水和されていることが重要である。平衡時間はマイクロ流体環境において迅速であり、これは有利である。種々のリンカー構造の蛍光性背景が、「かん流チャンバー」（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）を対象のスライドの表面に結合することにより測定される。これらは、単純なゴムガスケットであり、これらをスライドに接着して、その後、入り口ポートおよび出口ポートを具備するカバースリップで被覆する。チャンバーが構築された後、目的の検体溶液がピペットで流入され、ポートは封止可能である。２００μＬのチャンバサイズが利用される。
【００３７】
種々のＤＮＡサンプルを外部ソース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）から入手する。ゲノムＤＮＡは、マイクロ流体装置内で採用される緩慢な流れの下でマイクロチャネルを通過するときにもつれないように刈り上げる必要があるであろう。ゲノムＤＮＡの刈り込みは、１８ゲージ針と通じて数階溶液を引き抜くことにより容易に実現される。種々の長さ（４０ｋｂ、４０００ｂｐ、４００ｂｐ、および４０ｂｐ）のＭＷ標準も考慮されるべきである。最初に、中和緩衝剤を関心対象の蛍光性気体上に付加し、蛍光性背景（４５８ｎｍおよび４９２ｎｍで）をプレートリーダー（励起＝３５６ｎｍ）上でゆっくり時間をかけて測定する。安定した背景測定は、ＭＢ被覆が十分に水和されているときに実現されるに違いない。そののち、種々の濃度のｄｓＤＮＡ（Ａ２６０で測定される。５０ｕｇのｄｓＤＮＡ＝１０Ｄ単位）がかん流チャンバーに案内され、この場合、読取の間にチャンバーを確実に洗浄するようになす。４５８ｎｍの蛍光（ｄｓＤＮＡ結合の特性）は、ＤＮＡ濃度が増加すると線形に増加する。ＭＢの濃度は測定のダイナミックレンジに関係するようであり、これを考慮すべきである。先に説明したように、ＭＢパックの濃度は基体のＡ３５６から決定される。マイクロ流体装置は高濃度のＤＮＡ溶液を処理し、それゆえ、蛍光のためのＤＮＡ濃度「閾値」（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）がゴールである。ＤＮＡ濃度が蛍光閾値を下回れば、単離田潤を継続する。同様に、蛍光信号が閾値を越えると、要求される最少のＤＮＡ濃度が達成される。蛍光性ガラスサポートを用いたＤＮＡ検出は生理食塩濃度で検査されることに留意されたい。この場合にガラスによるＤＮＡ結合が最大化されるに違いない。
【００３８】
蛍光性表面の開発と同時に、ｄｓＤＮＡのガラスに対する固定化および開放を効率的に行うために必要とされるパラメータも小体積の溶液を用いて検査される。ｄｓＤＮＡの小体積の緩衝剤への開放は数学モデルにより最適化される。ＤＮＡをガラスに結合するうえでの処理ステップは生物的サンプルの性質に依存し、その手法も多くの変形例がある。以下に説明されるステップは、ＤＮＡ豊富なソースおよびシリカ粒子に対して実行された。細胞が、まず、グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）緩衝液（ｐＨ６．４）の２Ｍの溶液を付加することにより溶解される。このカオトロピック塩溶液は、また、ゲノムＤＮＡからヒストンタンパク質を除去し、ヌクレアーゼを非活性化し、ＤＮＡ−シリカ錯体の形成を助長する。固定化されたＤＮＡ−シリカは渦巻き駆動され、また遠心分離処理され（これは長いＤＮＡ螺旋を刈り込むようである）、細胞の破片はより多くのＧｕＳＣＮ緩衝剤により洗い流される。最後にＤＮＡ−シリカが歓送され、純化されたＤＮＡが低塩の緩衝在中に溶出されて２６０ｎｍの吸収により測定される。このプロセスは単純であるけれども、これらステップはシリカ粒子が渦巻き処理の後に一様になることを確実にするために人での作業および人による入力を必要とする。マイクロ流体フォーマットは以下の表Ａで説明されるような処理を合理化すべきである。
【００３９】
表Ａ
１．高濃度のＧｕＳＣＮを用いて細胞を溶解し、ヒストンを除去し、ＤＮＡをガラスに結合する。
２．ガラス結合ＤＮＡを高濃度ＧｕＳＣＮで洗浄する。
３．生理食塩で結合ＤＮＡをガラスから開放する。
４．蛍光性基体を用いてチャンバー内の開放ＤＮＡの濃度を読み取る。
５．ＤＮＡを蛍光性基体から開放してＰＣＲベースの分析に使用するために調整する。
【００４０】
ガラス基体（顕微鏡スライド）のＤＮＡ結合能力を評価するために、ステップ２、３、４および５のみ試験する。処理ステップは、ガラスカバースリップを伴うかん流チャンバー内で実行できる。種々のサイズ・濃度のＤＮＡをＧｕＳＣＮで混合することがＤＮＡ結合で重要である。ゴールは、スライドのガラス表面およびカバースリップの間の３００ｎｇの発表されているＤＮＡ結合能力に接近させることである。結合後に、チャンバーから高濃度のＧｕＳＣＮを引き抜き、生理食塩で満たす。平衡状態に達した後、結合ＤＮＡはチャンバー内で自由でチャンバーから回収できるに違いない。濃縮されたＤＮＡの分割単位（ａｌｉｑｕｏｔ）が、開放後に、Ｈ３３２５８について公表されている蛍光手法を用いて測定される。ＤＮＡは最終的にはＰＣＲベースの分析に用いられるので、溶出緩衝剤はこの用途と一貫性をもつものである。
【００４１】
蛍光ＭＢ基体のＤＮＡ結合能力も試験される。同一のかん流チャンバーシステムが種々のＤＮＡ濃度を試験するのに用いられる。結合能力は、最終的な装置で遭遇する種々の緩衝剤を用いて試験される。ｄｓＤＮＡをＭＢ被覆基体から開放することがとくに興味深い。結合ＤＮＡ二本線は変性して基体から開放する必要があるであろう。なぜならば、これはメチジウムＤＮＡ補足ビーズを具備するケースだからである。この場合に、希釈ＮａＯＨ溶液が用いられて、変性されたＤＮＡ溶液は、最終的に、アンモニウムアセテートにより中和される。
【００４２】
精製された結合および開放データは、マイクロ流体装置の設計を支援するマルチフィジックスモデルのための基礎として用いられる。このモデルは、表面結合、核酸、移流、および塩およびＤＮＡの最終的な各部の濃度を、プロトタイプの幾何、溶媒および溶質の特性、および精製されたデータによって特徴付けられる結合挙動に基づいて計算する。最良の予測性能を伴う装置設計が所望のプロトタイプ設計になる。全体としての性能はモデルの予想値と比較され、これが、実験的に取得できない装置内部の局所的な物理過程の情報を提供する。
【００４３】
種々の表面の特性に依存して、いくつかの設計が実現可能であり、これは図７から理解できる。例えば、蛍光性ＭＢサポート１５０がＤＮＡ結合および測定の二重の目的で働くことができるであろう。これはメチジウム粒子の使用に類似する。ガラス表面はより大きな結合能力を有しても良く、単一のチャンバー設計１５２は、ＤＮＡ測定用の蛍光性ＭＢ表面を具備するガラス補足表面と組み合わせることができる。ＤＮＡ結合および測定に異なる条件を要求しても良く、２つのチャンバーを用いる装置１５４が最良の設計であろう。予め行った計算によれば、図８に示すような、ガラス表面でＤＮＡ結合を行ない、プラスチックの対向表面でＭＢ測定を行う単一チャンバー設計は、平滑なガラス表面であっても、８４ｎｇのＤＮＡを補足して測定することが可能であることを示唆した（粗なガラス表面はより顕著に大きな量のＤＮＡを結合するであろう）。
【００４４】
図８は、６２×４０×３．５５ｎｍのマイクロ流体装置１６０を示し、これは、５μｌのＤＮＡ結合チャンバー１６２、７５０μｌの廃棄チャネル１６４、および２処理の最後に開放ＤＮＡを保持するための５μｌのチャネル１６６を含む。流体はピペットにより注入ポート１６８を通じて注入される。流体は、廃棄排出口１６８または出力ポート１７０のどちらが開いているかに応じて廃棄チャネル１６４または開放ＤＮＡチャネル１６６へと進む。開放ＤＮＡはカード１６０からピペットを用いて生成物排出口１７２または出力ポート１７０を通じて除去される。図９は、装置を構成する５枚のラミネート層すべてを分解して示す。層１８０は０．１２５ｍｍのビニルから構成され、層１８２は０．０２５ｍｍの接着層であり、層１８４は３．１７５ｎｍのＰＭＭＡであり、層１８６は０．１００ｎｍのＡＣＡであり、層１８８は０．１２５ｍｍのビニルであり、層１９０は、層１８０に挿入されるＰｙｒｅｘカバースリップインサートである。各層は３つのレジスト穴１９２を整列用に含む。層１８２および１８６は、漏れ止めの態様で装置の各層を一体に保持する接着剤を含む。
【００４５】
表Ａの処理ステップは図１０Ａ〜Ｅに準じに示される。図１０Ａは、溶解したサンプル細胞を含む高濃度のＧｕＳＣＮ内のＤＮＡの混合物２０２をピペットで注入した後のマイクロ流体装置１６０を示す。結合チャネル１６２を通じて棄チャネル１６４へと流される高濃度の塩、ＧｕＳＣＮを用いて洗浄したのち（図１０Ｂ）、チャンバー１６２は生理食塩で洗い流され（図１０Ｃ）、食塩２０５によりガラス１９０から開放されたＤＮＡがＭＢに結合し、このＭＢがｄｓＤＮＡ濃度２０９が読み取れるように蛍光する（図１０Ｄ）。最後に、脱イオン化された水（ＤＩ）が結合チャネル１６２を通じてピペット注入されＤＮＡを押し出して開放ＤＮＡチャネル１６６に運び、チャンバー１６２から純化されたものを最終的に分配する。これを図１０Ｅに示す。この時点で、生成物排出口１３２（図８参照）が開放されてＤＮＡを取り出すことができるであろう。この装置は十分に小さく９６−ウェルのプレートリーダー上に容易に配置でき、６ウェル中心ロケーションが結合チャネル内にあって正確にＤＮＡ濃度を多数読み出せるように設計される。この処理が最後に、固定化蛍光性ＭＧ基（おそらく、現時点では非蛍光性）が固定サポート上に残され、実験室廃棄物流に装置の残りが廃棄される。
【００４６】
例
結合ヘキシルアミンがリンクされた蛍光性Ｈｏｅｃｈｓｔ染料の合成が実行された。ここで図１１を参照すると、合成が図示される。とくに断らない限り、試薬はＳｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈから取得した。無水性溶媒が確実に封止されたビン中に取得された。７ｃｍ長のＴＬＣストリップを５×７ｃｍのシリカ被覆アルミニウムシート（Ｍｅｒｃｋ）から切り出し、手持ち長波長ＵＶランプを用いて照射して蛍光により全般的に視覚化した。溶媒前面（Ｒｆ）に対する蛍光スポットの移動をＴＬＣ分析のために測定した。蛍光性ＤＮＡ結合分析用に用いられるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８標準（ビスベンズイミド、ＢＢ−ＯＨ）は、Ｓｉｇｍａ社から販売されているＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ中に取得した。このキットはビスベンズイミド（水中で１０ｍｇ／ｍＬ）、１０倍蛍光分析緩衝剤（１０×ＦＡＢ＝１００ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、およびＤＮＡ標準（刈り込まれたｃａｒｆ胸腺ＤＮＡ、１×ＦＡＢ中に１ｍｇ／ｍＬ）を含む。このキットは、図１２に示されるＤＮＡの蛍光性測定の標準測定として用いられた。
【００４７】
ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）防護アミノヘキサノール開始材料がＳｉｇｍａ社から購入され、その５００ｍｇを、公表されている手順（ＫｅｌｌｅｒおよびＨａｎｅｒ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍｉ． Ａｃｔａ，７６（１９９３）８８４−８９２）に従って所望の臭化アルキルに変換した。この生成物は、カラムクロマトグラフィによりシリカゲルを介して単離され、生成物の２９２ｍｇ（４５％の収率）を淡黄色の液体として生じる。他の汚染物から所望の生成物を分離するのは、臭化アルキル用の良好なＴＬＣインジケータを欠いているので、困難であった。ヨウ素チャンバー中の汚染は低感度でしか動作しなかった。ＴＬＣ（２：１のヘキサン／エチルアセテート）：開始ＲＯＨのＲｆ＝０．１７、ＲＢｒのＲｆ＝０．６７である。
【００４８】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料（ビスベンズイミド、ＢＢ−ＯＨ）が、Ａｌｄｒｉｃｈ社からトリヒドロクロライド塩（ペンタハイドレート）として購入した。９．５ｍｇの染料（１５．２μモル）が、乾燥した１５ｍＬ球底フラスコ中で１５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解された。３６．５ｍｇ（２６５μモル）の炭酸カリウムおよび７．１μＬ（８．５ｍｇ、３０．４μモル）のＢｏｃ防護臭化ヘキシルアミンである。混合物は５３度で６時間、室温で日間、磁気的に攪拌された。ＴＬＣ（１０％メタノール、５％エチルジイソプロピルアミン、８５％ジクロロメタン）が長波長のＵＶランプ（３６５ｎｍ）で照射したときに青色の蛍光スポットの混合を示した。開始ＢＢ−ＯＨ（Ｒｆ＝０）が所望の生成物（Ｒｆ＝０．３）および高移動度側生成物（Ｒｆ＝０．５）に変換された。上澄みのＤＭＦ溶液は上澄み移動させられ、残りの炭酸カリウムは付加的な２ｍＬのＤＭＦで洗浄された。組み合わされた混合物は、真空下で回転蒸発により濃縮された。残留物は５％メタノール、５％エチルジイソプロピルアミン、９０％ジクロロメタンの２ｍＬ中に溶解され、同一の溶媒でパックされた２×１０ｃｍのシリカゲルカラム（２３０−４００メッシュ）に供給された。５０ｍＬの前留分が廃棄された後、高移動度側の生成物が約７５ｍＬで集められた。クロマトグラフィの進捗が、手持ちＵＶランプを用いて続けられる。溶質中のメタノールの百分率が１０％に増大し、所望の生成物が９０ｍＬの溶媒中に単離された。回転蒸発器を用いて溶媒を除去して１０．５ｍｇの黄色の固体を得た（理論的な収率＝９．５ｍｇ）。生成物はＴＬＣによる１つの主たる青い蛍光バンドであり、他の蛍光汚染物のトレースを伴っていた。生成物は将来のＮＭＲに備えて２ｍＬの第２クロロホルム中に溶解された。ＣＤＣｌ３溶液の１ｍＬ部分は下記のように保護外とした。
【００４９】
封止されたガラスアンプルからのトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）が、１ｍＬのＣＤＣｌ３中の５ｍｇのＢＢ−ＮＨＢｏｃに添加された。一様な溶液は封止された１ドラムのガラス製薬ビン中に保持された。保護解除はＴＬＣ（３５％メタノール、５％エチルジイソプロピルアミン、６０％ジクロロメタン）により引き継がれた。開始ＢＢ−ＮＨＢｏｃ（Ｒｆ＝０．７）は、ゆっくりと保護解除されて低移動度生成物（Ｒｆ＝０）へと移行する低移動度塩（Ｒｆ＝０．５）へと変換された。２４時間後、１００μＬの分割単位（ａｌｉｑｕｏｔ）の反応混合物が、過剰のＴＦＡを回転蒸発器で除去し、メタノールに溶解させ、さらに少量の炭酸カリウムを添加することにより、無塩基へと変換された。室温で取得された無塩基形態のＢＢ−ＮＨ２は単一の主たる蛍光バンド（Ｒｆ＝０．０７）および蛍光汚染物質のトレースを示した。バルクの反応混合物は上述したように無塩基へと変換され、３ｍＬの２：１メタノール／クロロホルム中に溶解された。生成物は秤量されなかったが（約１．７ｍｇ／ｍＬ）、収率は、開始ビスベンズイミド染料（ＢＢ−ＯＨ）のＵＶ吸収との比較から計算された。
【００５０】
１×ＦＡＢ中のＢＢ−ＯＨの１０μＭ溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは３４０ｎｍの吸収極大（０．１８ユニット）を有する。ＢＢ−ＮＨ２の溶液は、９９５．７μＬの１×ＦＡＢ中に、４．３μＬの約１．７ｍｇ／ｍＬの溶液を溶解することにより準備された。吸収極大は３４２ｎｍ（０．０７５ユニット）であった。ＢＢ−ＯＨおよびＢＢ−ＮＨ２は同一の減衰係数を有し、ＢＢ−ＮＨ２のＵＶ−ｖｉｓサンプルの濃度が計算された（１０μＭ×（０．０７５／０．１８）＝４．４μＭ）。この結果、約１．７ｍｇ／ｍＬの溶液の測定濃度が０．７ｍｇ／ｍＬ（０．９８ｍＭ）とされた。ＢＢ−ＮＨ２の収率（２．１ｍｇ、２．９ｍモル）は開始ＢＢ−ＯＨからの３８％収率に対応する。この分析は、少量を秤量するより収率の決定を正確に行える。秤量では、塩および不可視（ＮＭＲによる）のトリフルオロ酢酸が誤差を与えると考えられる。
【００５１】
図１２において２２０により示されるＢＢ−ＯＨ分子の蛍光は、ｄｓＤＮＡの存在下では、４９２ｎｍの弱い発光から４５８ｎｍの強い発光へと変化する。Ｓｉｇｍａ社からのＤＮＡ定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）キット（ＢＢ−ＯＨベース）を用いてＢｉｏ−Ｔｅｋ ＦＬ６００蛍光プレートリーダー上で標準曲線を生成した。分析は、供給されたプロトコルに従って９６−ウェルの透明な底板中で実行された。０．１μｇ／ｍＬのＢＢ−ＯＨ濃度を、各ＤＮＡ標準（２０−１０００μｇ／ｍＬ）に対する指示緩衝剤として用いた。結果を図１２に示す。図１２は、２２２で参照されるＭＭ−ＮＨ２がビスベンズイミド染料の蛍光性ＤＮＡ検出特性を保持していたことを示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８分子上のフェノールの改質はＵＶ−ｖｉｓ吸収（極大波長が約３４０ｎｍ）を変更せず、ヘキシルアミン改質類似体が３６０ｎｍ（４０ｎｍスリット幅）で励起されたときに強い蛍光信号（４６０ｎｍ、４０ｎｍのスリット幅での検出）を示した。ヘキシルアミンリンカーは、ＤＮＡ特異性蛍光を改善し、これはＤＮＡのカチオンの第１アミンに対して親和性が大きいからと考えられる。ＢＢ−ＮＨ２分子は、平坦なビスベンズイミド構造の各末端にカチオンのアミノ基を有し、このため、これをＤＮＡのマイナーグルーブバインダにしっかりと固定させる。他のＤＮＡ親和剤（オリゴヌクレオチドのように）は溶液中で蛍光性プローブとしての機能を示した。
【００５２】
蛍光性ＭＢ表面を準備するための種々の固定化の化学過程が考慮された。ｄｓＤＮＡ検出表面の設計における３つの主たる要素は以下のとおりである。
１．インジケータ：
ｄｓＤＮＡの存在下でのみ蛍光性である。
リンカーはほとんど蛍光性を持たない背景とともにスペーサ分子に結合する。
２．基体：
関与対象のスペクトル領域で透明である。
スペーサ／インジケータ分子で簡単に被覆される。
３．スペーサ：
蛍光性インジケータおよび基体に対して簡易に共役化される。
蛍光性ＭＢを立体障害を伴うことなくｄｓＤＮＡにアクセス可能にする。
【００５３】
図１２に説明するＢＢ−ＯＨおよびＢＢ−ＮＨ２ ＤＮＡインジケータは所望のＤＮＡ特異性蛍光特性を有し、結合点として働く特別な官能基を有する。求電子物質、例えば、活性化エステルまたは塩化シアヌルとの反応が分子中の多数の位置で起こり得、これら側部反応が所望のＤＮＡ特異性蛍光を減少させることがある。三日月形状のＤＮＡ結合領域中の「損傷」（ｄａｍａｇｅｄ）構造がＤＮＡ特異性発光を変更する可能性がある。両分子は、環状の第３アルキルアミン基を１つの末端に有し、これがアルキル化され得る。イミダゾール基もアルキル化が発生可能なサイトを有する。種々の表面構造が所望のＤＮＡ特性蛍光を持ち得るけれども、一貫したＤＮＡ特異性蛍光を与える一様で再生成可能な表面構造を持つことが有益である。ＢＢ−ＮＨ２リンカーは求電子物質と選択的に反応可能な第１ヘキシルアミン基を含む。必要であれば、リンカーの腕をポリエチレングリコールにより延長可能である。Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社はＢｏｃ防護されたカルボン酸を販売しており、これはより親水性で立体配座上柔軟な、ＢＢ蛍光体を固体サポート（基体）にけつごうさせるためのリンカーを提供する。
【００５４】
プラスチック（ｍｙｌａｒ）基体への関心は、３６０ｎｍで照射したとき４６０ｎｍで顕著な背景蛍光が起こることが見いだされるかどうかに左右される。Ｓｃｏｔｃｈ（商標）テープ（装置のポートを封止するのに用いられる）は顕著な４６０ｎｍの蛍光性を有することも見いだされた。ＤＮＡマイクロアレイ用にオリゴヌクレオチドを１×３ｃｍのスライドに固定化する多くの文献およびいくつかの化学過程が存在する。アミン被覆スライド（アミノプロピルシラン）を、リンカーおよびインジケータ分子をナノ加工するための基体としてＳｉｇｍａ社から取得した。他の商業的に入手可能なスライド化学（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からのＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標））も試された。これらスライドは活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸エステル）基において終端する伸長したリンカー構造を有する。ＣｏｄｅＬｉｎｋ社のスライダは「アミン末端オリゴヌクレオチドの固定化を可能にし、長いＰＥＧリンカーを必要とすることなくハイブリダイズを行える」ことを宣伝文句としている。ＢＢ−ＮＨ２蛍光体はこの表面と直接に作用させられることが可能であろうから、最初に試験された。
【００５５】
ＢＢ−ＮＨ２の固定化は３Ｄ−Ｌｉｎｋスライドの上でカバースリップの下でｐＨ８．５において試された。１つの巣零度あたり最高で１６ウェルまで同時に試験することが可能な複数ウェルハイブリダイズチャンバー（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）を購入した。種々の時間、反応させた後、スライドの過剰なＢＢ−ＮＨ２を緩衝剤で洗浄し、同一のカバースリップ手法で蓋をした。蛍光性ＤＮＡ結合特性を評価する前に、１×ＦＡＢで最後に洗浄した。
【００５６】
ＢＢ−ＮＨ２インジケータの特性が予想通りに改善できた。４６０ｎｍでの蛍光背景は、最適化可能な重要な特性である。高い背景またはｄｓＤＮＡの不十分な開放が問題ならば、他の表面が、アミン被覆スライドを用いて試される。ＣｏｄｅＬｉｎｋスライドに関連して試される１つのキーとなる変更点は、ＢＢ−ＮＨ２の固定化の後に種々のアミンで蓋をする効果である。これにより、溶液中のＢＢ蛍光性分子、スペーサ、およびｄｓＤＮＡのインタフェースで分子特性が変更される。このインタフェースの性質は、蛍光体のｄｓＤＮＡへの結合やＤＮＡの固体表面への結合態様に影響を与えるようである。ＣｏｄＬｉｎｋ社は５０ｍＬのエタノールアミンで蓋をすることを推奨し、これが中性の表面被覆をなすに違いない。ジアミンまたは他のポリアミンによる蓋は正味で正の電荷をスライド表面に付与し、非可逆的に（開放なし）ＤＮＡを結合することができるであろう。他方、これら正の電荷が結合速度を高速にし、またｄｓＤＮＡの局所的な濃度を増大できるであろう（寄り良好な信号となる）。活性化エステルをリジン基で蓋をすると、双性イオンのアミノ酸表面を実現し、これがＤＮＡに対して非吸引的であり、このため表面を「不動態化」（ｐａｓｓｉｖａｔｉｎｇ）する。カルボン酸基を表面に導入する他の方法は、ＢＢ−ＮＨ２の固定化の後に、ＨＮＳエステルを単純に加水分解することである。固定化は高ｐＨ（８．５）で起こるので、スライドを緩衝在中に１晩保持しておけば、スライド表面上の入手可能なＮＨＳエステルが加水分解される傾向がある。これにより、スライド表面およびＤＮＡのインタフェースに正味で負の電荷が付与され、蛍光信号および背景に影響を与えるであろう。これは、カチオンの蛍光性インジケータを固定化する手法としても採用できる。
【００５７】
ＣｏｄｅＫｉｎｋスライドはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手し、以下のプロトコルに従って用いた。単一スライドを、１６の異なる固定化反応の試験のために用いた。１６ウェルシリコーンゴムガスケットを、「９６−ウェルフォーマット」クランプシステム（ＰｒｏＰｌａｔｅ（商標）、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−ｌａｂｓ）を用いてプレートに接着させた。スライド上に形成された四角なウェルは３００μＬまでの体積を有し、透明なプラスチック接着封止フィルム（与えられている）でカバーできる。活性化エステルスライド表面は上方を向き、配向目的で、スライド状の「ＣｏｄｅＬｉｎｋ」の名称がウェル１および２の頂部に位置するようになす。ＢＢ−ＯＨ（水中で１ｍｇ／ｍＬ）およびＢＢ−ＮＨ２（メタノール中で０．７ｍｇ／ｍＬ）溶液が先に説明したように準備された。３ｍｇ／ｍＬのアミノエタノール（５０ｎＭ）を含むｐＨ８．５の重炭酸塩（０．１Ｍ）をキャップ溶液として用いた。
【００５８】
ＢＢ−ＮＨ２溶液（１００μＬ）が３００μＬのメタノールと混合され、６００ｍＬのｐＨ８．５の重炭酸ナトリウム（０．１Ｍ）で希釈した。この溶液（７０μｇ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ８．５の十炭酸塩中で７μｇ／ｍＬのＢＢ−ＮＨ２および０．７μｇ／ｍＬの溶液を準備した。この溶液は、長波長ＵＶ（３５６ｎｍ）のランプの下で淡緑色の蛍光性を有する。ｐＨ８．５の絨毯酸塩中で１０μｇ／ｍＬのＢＢ−ＯＨ溶液が１ｍｇ／ｍＬ溶液から準備された。ＣｏｄｅＬｉｎｋスライド表面上の１６個のウェルは以下のように処理された。ウェル１−４は０．７μｇ／ｍＬのＢＢ−ＮＨ２、ウェル５−８は７μｇ／ｍＬのＢＢ−ＮＨ２、ウェル９−１２は７０μｇ／ｍＬ、ウェル１３−１６は１０μｇ／ｍＬのＢＢ−ＯＨである。ウェルに充填した後（ウェル当たり０．２ｍＬ）、巣零度分子は接着フィルムで被覆されて室温で１８時間保持された（暗所で）。フィルムが除去され、ＢＢ含有溶液が各ウェルから除去され、０．２ｍＬのキャップ溶液が添加され、ウェルが再封止された。７時間後、キャップ溶液が各ウェルから除去され、ガスケットが洗浄のためにスライドから除去された。スライドは、５０ｍＬ遠心分離チューブ中で２０分、４０ｍＬの４０％メタノール／６０％重炭酸ナトリウム（０．１Ｍ）中に浸され、１×ＦＡＢ中で２０分、除去され、浸される。スライドを取り外し、蛍光プレートリーダー上で分析される。
【００５９】
ＤＮＡ指示表面の感度および精度は特徴的であった。ＢＢ−ＮＨ２含有スライド表面の評価は、先に説明したｄｓＤＮＡと、類似のプレートリーダー分析フォーマットとを用いて試された。
【００６０】
先に準備されたＢＢ−ＮＨ２処理ウェルおよびＢＢ−ＯＨ処理ウェルが評価された。１６ウェルシリコーンゴムガスケットが処理されたＣｏｄｅＬｉｎｋスライド上に組み立て直された。残りの１×ＦＡＢ緩衝剤はＫｉｍｗａｉｐｅでたたいてスライド表面から除去した（わずかな滴は残った）。固定化混合物の各々のための４つのウェルの各々が以下の溶液の１つで再び水和される。すなわち、１０００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡ、２００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡ、１×ＦＡＢ、液体なしである。用意したばかりの溶液が通常の４６０ｎｍの蛍光について試験された（ボトムリード、感度＝１１５）。ウェルを読み取った後に、脱イオン化水を用いて洗浄してＤＮＡを除去し、再度測定した。
【００６１】
ＢＢ処理したスライド表面のすべてはｄｓＤＮＡの存在下で４６０ｎｍの蛍光の増大を示した。これを図１３に示す。最も大きな濃度のＢＢ−ＮＨ２（７０μｇ／ｍＬ）との固定化反応は、２３０で示され、最も大きな蛍光信号を示した。ただし、高注入レベルは高蛍光背景（ＤＮＡなしで５０，０００カウントより大きい）ももたらした。７μｇ／ｍＬの固定化反応が、２３２で示され、最も良好な性能を示した。用量反応は最低で２００μｇ／ｍＬのＤＮＡまで観測できた。固定化反応におけるＢＢ−ＮＨ２の最低レベルは、２３４で示され、最低で２００μｇ／ｍＬのＤＮＡまでの用量応答が実現された。信号は小さいけれども、ＢＢ−ＯＨインジケータさえも、２３６で示すように、ＤＮＡ濃度が増加すると４６０ｎｍの蛍光の所望の増加を実現した。水でウェルのＤＮＡを洗い落とした後、ウェルは４６０ｎｍでＤＮＡ特異の蛍光の証拠を示さなかった。同一レベルの固定化蛍光体を伴うすべてのウェルは類似の蛍光性を有した。
【００６２】
図１３のデータにおいては溶液中に蛍光染料がない。ＤＮＡ結合分析は固定化されたＢＢ−ＮＨ２またはＢＢ−ＯＨを用いる。すべての表面は、ＤＮＡがない場合でさえ、４６０ｎｍで所定の蛍光信号をＢＢ−ＮＨ２固定化領域中で示す。ｄｓＤＮＡが結合表面に導入されると、４６０ｎｍの蛍光が増大する。スライド表面のコントロール（比較）領域（ＤＮＡなし）を用いて、背景差分を可能にする。
【００６３】
固定化ＢＢ−ＮＨ２蛍光体はｄｓＤＮＡの存在下で良好な用量反応を実現する。４６０ｎｍにおける蛍光信号の強さは、溶液中のＢＢ−ＮＨ２反応とほぼ同じであるけれども、背景はより大きい（図１３参照）。固定化ＢＢ−ＮＨ２の主たる利点は、小さな体積しか必要としないということである。液相分析で必要とされる２００μＬのウェルの容積と異なって、固定化ＢＢ表面を十分に塗らすに足るＤＮＡ溶液だけで十分である。これにより、ＤＮＡ精製のマイクロ流体装置の準備が可能になる。
【００６４】
ガラス表面を用いて複雑な生物学的混合物からＤＮＡを精製することが他者により示されており、これら結果を蛍光性ＢＢ分析を用いて検証した。マイクロ流体装置に必要なステップは以下の表Ｂに示される。液相ＢＢ分析を用いて未改質ガラスのＤＮＡ結合および開放レベルを決定した。
【００６５】
表Ｂ
１．高濃度のＧｕＳＣＮを用いて、細胞を溶解し、ヒストンを除去し、ＤＮＡをガラスに結合する。
２．ガラス結合ＤＮＡを高濃度ＧｕＳＣＮで洗浄する。
３．生理食塩で結合ＤＮＡをガラスから開放する。
４．蛍光性基体を用いてチャンバー内の開放ＤＮＡの濃度を読み取る。
５．ＤＮＡを蛍光性基体から開放してＰＣＲベースの分析に使用するために調整する。
【００６６】
グアニジウムチオシアネート（１０Ｍ）が、蛍光性ＤＮＡ結合分析において試験され、高濃度で、４６０ｎｍの蛍光性背景を実現することがわかった。ＤＮＡをガラスに結合するために用いる他の慣用的なカオトロープは沃化ナトリウム（１２Ｍ）である。それは低いバックグラウンドを伴ったけれども、過塩素酸ナトリウムに較べより高価であり、より扱いにくい（溶液が変色する）。したがって、過塩素酸ナトリウム（６Ｍ）が開発用に選ばれた。０．１ｍＬ中に５０、５００または５０００ｎｇのＤＮＡの溶液が６Ｍ過塩素酸ナトリウム（ｐＨ８ Ｔｒｉｓ）中で準備された。これらの０．１ｍＬ容積がポリスチレンのペトリー皿に移されて、２２×２２ｍｍのカバースリップ（ガラスまたはプラスチック）がそれらの上に配置された。室温で１．５時間保持した後に、スリップを注意深く斜めに上げて残りの液体から取り除いた。このスリップをＫｉｍｗｉｐｅ上に載せ（ＤＮＡは下向き）いずれの残留滴を除去した。各スリップをペトリー皿中の０．１ｍＬの容積の１×蛍光分析緩衝剤へと移した（１×ＦＡＢ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）。室温で４時間保持した後に、スリップを取り外し、ＤＮＡ側を０．１５ｍＬの１×ＦＡＢで洗浄した。各スライドからの組み合わせ緩衝剤は１×ＦＡＢで０．２７ｍＬをもたらし、３０μＬの１μｇ／ｍＬのビスベンズイミド（ＢＢ−ＯＨ）溶液（１×ＦＡＢ中で）が付加された。各スリップから２００マイクロリットルの容積がマイクロウェル（透明な底）へ移され、サンプルがＢｉｏｔｅｋ ＦＬ−６００プレートリーダー上で読み取られた。蛍光は４６０ｎｍで読み取られ、ＤＮＡ濃度は標準曲線から決定された。
【００６７】
図１４を参照すると、カバースリップに対するＤＮＡ補足および開放の効率が示される。プラスチックカバースリップは２５０で示すようにＤＮＡ結合を示さない。ガラスカバースリップに対するＤＮＡ補足および開放の効率は、２５２で示され、少量のＤＮＡに対して最大となる。カバースリップ当たり５０ｎｇのＤＮＡで、７．２ｎｇが復元された（１４％の効率）。カバースリップ当たり５００ｎｇのＤＮＡで、６８ｎｇが復元された（１４％の効率）。カバースリップ当たり５０００ｎｇのＤＮＡで、１１３ｎｇのＤＮＡが復元された（２％の効率）。これらの結果から、ガラスカバースリットがμ流体ＤＮＡ精製用に適した表面であり、少なくとも６８ｎｇのＤＮＡが５００ｎｇのサンプルから効率的に復元することができることがわかる。
【００６８】
プロトタイプカードが、手作業のピペットによる溶液の付加に対して最適化されており、１分当たり１００μＬの流速が、手慣れた作業およびＲａｉｎｉｎ ２００ μＬ Ｐｉｐｅｍａｎにより実現できた。より遅い流速（泡の形成を最小化するのに重要）は、実現がより困難であるけれども、２００μＬの分注器を成功裏に用いてＤＮＡ結合チャネル（２０μＬ）を泡を導入することなしに満たすことができた。
【００６９】
今まで検討したカードは、いくつかの小幅な変形例でもうまくいった。ガラスの一列のチャネルは低流速で十分に湿潤となり、流体は、チャネルを通じて空気を流すことにより除去できた。ＤＮＡ捕捉ウェルは蛍光性プレートリーダーを用いた分析のために精製したＤＮＡをすべて回収する設計とした。固定化ＢＢ表面を用いて、ＤＮＡ捕捉ウェルは薄型のチャネルを実現する設計を採用でき、このチャネルは、蛍光性分析の後に、ＤＮＡを他のチャネルに分配させるように容易に構成できる。蛍光性ＢＢ染料は固定化されるので、精製ＤＮＡは、下流のＤＮＡ分析チャンバーにうちした時にも指示用蛍光体で汚染されているということがない。
【００７０】
この発明は好ましい実施例との関連で開示され説明されてきたけれども、この発明はどの実施例にも制約されず、この発明の真実の精神および範囲は添付の実施例に規定され、これから逸脱することなしに変更を行えることに留意されたい。
【００７１】
ここに開示された発明の例示的な実施例がこの発明の目的を達成することは明らかであるが、当業者が種々の変形や他の実施例を構成できることは容易に理解できる。さらに、任意の実施例の特徴および／または要素を、単独で、または他の実施例の特徴および／または要素と組み合わせて使用できる。添付の特許請求の範囲は、これらすべての変形例や実施例を、その趣旨を逸脱することなくカバーすることを意図するものであることは、容易に理解できる。
【００７２】
添付図面は明細書の一部を形成し、明細書との関連において理解されるべきであり、種々の図において類似の参照番号は類似の部分を示すために用いられる。添付図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】合成１２−ｍｅｒＤＮＡ二本鎖に結合したＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８の構造を示す図である。
【図２】ＤＮＡプローブ上のリンカーに結合するよう開発されたＨ３３２５８ｎｏ反応性類似物の構造を示す図である。
【図３】マイクロ流体装置内を流れる２つの流体の相互作用を示す図である。
【図４】蛍光性マイナーグルーブバインダ（ＭＢ）を連結させたいくつかのアミン改質表面を示す図である。
【図５】反応基をともなう蛍光性ＭＢの合成を示す図である。
【図６】有機溶液中における塩化シアヌルによるスライドのアミン改質ガラス表面の活性化を示す図である。
【図７】この発明に使用して好適なマイクロ流体装置の実現可能なチャンバー設計を示す図である。
【図８】この発明に使用して好適なマイクロ流体カードの正面図である。
【図９】マイクロ流体カードをその層を分離して示す分解図である。
【図１０】図９のカードの使用時の連続事象を示す正面図である。
【図１１】結合したヘキシルアミンリンカーを伴う蛍光性Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の合成を説明する図である。
【図１２】３６０ｎｍで励起された、ＢＢ−ＮＨ２分子 ｖｓ ＢＢ−ＯＨの蛍光性を示す図である。
【図１３】４つの異なるビスベンズイミド表面の４６０ｎｍの蛍光性を示す図である。
【図１４】ガラスおよびプラスチックカバースリップに対して付与されたＤＮＡの量に対する結合されたＤＮＡの量を示す図である。
【符号の説明】
【００７４】
５０ 第１の流れ
５２、５８ 小さな粒子
５４ 血液全体
５６ 第２の流れ
６０ 純粋な溶液
６２ 共通チャネル
【技術分野】
【０００１】
［政府の関与］
この発明はＳＢＩＲ許諾番号ＧＭ０７２１７８−０１の下で政府の支援の下でなされた。政府はこの発明に関し所定の権利を有するかもしれない。
［関連出願の相互参照］
この出願は２００５年１月２６日に提出された米国特許出願第１１／０４３，５６１により生じる利益を要求し、その出願の内容は参照してここに組み入れる。
【０００２】
この発明は全般的にはＤＮＡの浄化に関し、具体的には、ＤＮＡの浄化および分析におけるナノ加工表面の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ゲノムＤＮＡの単離、操作、および測定を簡略化する技術が、携帯型の医療診断または生体防御の用途に必要とされている。人体の組織から単離された核酸の質は、再生産可能で正確で詳細な遺伝子分析データに決定的である。ＤＮＡ単離製品は商業的に重要なので、この分野における研究も沢山ある。
【０００４】
著しい進展が見られる１つの技術は遺伝子分析を行うためのマイクロ流体装置である。多くのマイクロアレイ分析フォーマットが入手可能であり、これらは共通して単一のサンプルから広範囲の遺伝子ターゲットを同時に調べることができる。
【０００５】
二重螺旋ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の濃度を蛍光性マイナーグルーブ結合分子（ＭＢ）を利用して測定する高感度の液相分析が、すでに開発されている。ＤＮＡがないときには、その分子は溶液内で自由に回転でき、これは低蛍光背景に欠かせない。ｄｓＤＮＡに結合すると、この化合物は疎水性のマイナーグルーブにおいて堅固な平面配座を形成し、これが蛍光を増大させる。蛍光ＭＢの表面への結合を注意深く操作することにより、マイクロ流体装置を通過するときに、ＤＮＡの料を測定できる。
【発明の開示】
【０００６】
したがって、この発明の目的は、同時に、ゲノムＤＮＡを単離し、精製したＤＮＡの量を測定し、下流の分析のための特定の濃度の標準化ＤＮＡ溶液を分配するマイクロ流体装置を提供することである。
【０００７】
この発明のさらなる目的は、装置のコストおよび複雑さを最小化してＤＮＡを単離して準備するＤＮＡ単離用のマイクロ流体装置を提供することである。
【０００８】
この発明のさらなる目的は、同時に、生物学的流体から二重螺旋ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を補足し、固定化したＤＮＡの料を測定することができるマイクロ流体装置を提供することである。
【０００９】
この発明のさらなる目的は、求電子性または求核性リンカー基を具備する蛍光性マイナーグルーブバインダ薬剤（ＭＢ）を合成し、ｄｓＤＮＡの存在下で増大した蛍光性を明らかにすることである。
【００１０】
この発明のこれらの目的および他の目的は以下の説明および図面からより容易に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ｄｓＤＮＡの濃度を測定する高感度の液相分析が蛍光性マイナーグルーブ結合（ＭＢ）試薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）を用いて開発されている。ＤＮＡがないときには、その分子は溶液内で自由に回転でき、これは低蛍光背景に欠かせない。ｄｓＤＮＡに結合すると、この化合物は疎水性のマイナーグルーブにおいて堅固な平面配座を形成し、これが蛍光を増大させる。蛍光ＭＢの表面への結合を注意深く操作することにより、マイクロ流体装置を通過するときに、ＤＮＡの料を測定できる。共役化学を用いて、立体配座の自由度を最大化させターゲットＤＮＡにアクセスするように設計された高分子構造上で蛍光体を位置決めする。
【００１２】
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８分子は多環式構造を有し、これが、Ｂ−フォームＤＮＡのマイナーグルーブに同等螺旋で合致する（ｉｓｏｈｅｌｉｃａｌ）三日月構造を形成できる。図１は、合成１２−ｍｅｒのＤＮＡ二本鎖に結合するＨｏｅｃｈｓｔの溶液ＮＭＲ構造を示す。三日月形状の分子のフェノール末端は、共役基で結合するための便利な結合点である。液体溶液中の構造は柔軟であり、そうたいてきには非蛍光性である。未結合の分子を３５６ｎｍの光で励起すると、４９２ｎｍで弱い蛍光性を示す。ただし、ｄｓＤＮＡに結合すると、ベンズイミダゾール環が平坦配座に固定され、大規模な芳香族系が形成され４５８ｎｍで強い蛍光を発散する。この分子はマイナーグルーブ中でむず分子から遮蔽され、これによりさらに蛍光が増大する。Ｈ３３２５８ｎｏこのような蛍光性特徴によりｄｓＤＮＡの濃度を測定する高感度な分析が開発され、これは簡単な分析であり、細胞係数に用いられる。
【００１３】
ＤＮＡに結合するＨ３３２５８の構造に関心がもたれてきた。ＭＢは疎水性相互作用、バンデルワールス力およびイミダゾール残留による水素結合によって適所に保持される。Ｈ３３２５８の強力なマイナーグルーブ結合によりｄｓＤＮＡを直接に単離する機構も実現できる。アデニン／チミンが多い配列に対するＭＢのマイナーグルーブ結合が好ましく、ＤＮＡ結合定数は挿入剤のような他の小さなＭＷ試薬よりも大きなオーダーとなる。挿入蛍光試薬も十分に試された。このクラスのＤＮＡ結合試薬の例は臭化エチジウムであり、電気泳動後のゲル中のＤＮＡを染色するために広く用いられている。メチジウム染料は、セファロース粒子に結合されてＤＮＡ単離製品を実現してきた。メチジウムのような挿入染料はマイナーグルーブバインダのクラスの染料ほど結合力が大きくない。メチジウムはセフロース粒子にカチオンスペルミンリンカーを利用して結合された。これは明らかにＤＮＡ結合を改善した。さらに、エチジウムは、ｄｓＤＮＡに結合して、量子収率をわずかだけ向上させる。メチジウム・セフロース粒子の蛍光特性は説明されていなかった。
【００１４】
シアニン型の挿入染料はエチジウム挿入剤よりかなり多くの蛍光性を有する。チアゾールオレンジ（ＴＯ）は、２つの二環芳香族環構造からなる非対称なシアニン染料である。５０９ｎｍの光で励起されると、これら２つの構造が相互に自由に回転し、蛍光性はほとんどない。しかし、ｄｓＤＮＡがあると、ＴＯは塩基対の間に入り込み、環システムが平坦になるように強制する。強い蛍光を５３３ｎｍで生じる大きな芳香族系ができる。ＴＯはマイナーグルーブ結合試薬のように強固にｄｓＤＮＡには結合しないが、２つのＴＯ分子が一緒に結合して強固な結合二重挿入剤（ｂｉｓ−ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を形成できる。
【００１５】
高感度のＤＮＡ結合分析がシアニン型の染料の蛍光特性に基づいて開発されてきた。ＴＯもＲＮＡの存在下で３０００倍までの増大を示す。この特性は興味深いものであり、ＲＮＡ単離装置に適用できる。
【００１６】
これら蛍光性化合物は、オリゴヌクレオチドに結合されて、ハイブリダイズ分析中でｄｓＤＮＡの形成を監視するＤＮＡプローブを形成してきた。Ｈ３３２５８のいくつかの反応性誘導体はＤＮＡプローブへの結合用に開発されてきた。図２は、ＤＮＡプローブのリンカーに結合させるために開発されたＨ３３２５８のいくつかの反応性類似物を示す。
例えば、Ｈ３３２５８のブロモアセチル類似物はスルフヒドリル改質オリゴヌクレオチドと共役であった。高感度のＤＮＡ結合分析がシアニン型の染料の蛍光特性に基づいて開発されてきた。ＴＯもＲＮＡの存在下で３０００倍までの増大を示す。この特性は興味深いものであり、ＲＮＡ単離装置に適用できる。
【００１７】
これら蛍光性化合物は、オリゴヌクレオチドに結合されて、ハイブリダイズ分析中でｄｓＤＮＡの形成を監視するＤＮＡプローブを形成してきた。Ｈ３３２５８のいくつかの反応性誘導体はＤＮＡプローブへの結合用に開発されてきた。図２は、ＤＮＡプローブのリンカーに結合させるために開発されたＨ３３２５８のいくつかの反応性類似物を示す。相補的な単一螺旋のＤＮＡターゲットへのハイブリダイズは結合親和力を増大させ、結合時に蛍光を２３倍まで増大させる。改善された結合効率（ＤＮＡ溶融温度）は、配列特異的なものである。Ａ／Ｔ領域がリガンドの結合点の近くに配置されると、ＴＭが急激に増加し、Ｈ３３２５８の強力なＤＮＡ結合作用を実現する。同様の合成化学を用いてこれら蛍光性染料の反応性類似物を準備してアミン改質ガラスまたはプラスチック表面と共役させることができる。
【００１８】
オリゴのシアニン染料共役物は、相補的なＤＮＡ螺旋を付加したときに、予想通りのハイブリダイズ誘引の蛍光を示した。蛍光性は、形成された二本線の末端配列に応じて変化した。ＴＯのＤＮＡ二重線への結合は、配列依存であることが知られている。シアニン染料のＨＮＳエステル類似物はアミン改質オリゴヌクレオチドと反応して蛍光性「実時間」ＰＣＲ分析に使用されるＤＮＡプローブを実現した。蛍光の２０倍までの増加がオリゴヌクレオチド共役物において観察された。ＭＧＢおよびシアニン型蛍光性オリゴヌクレオチド共役物の双方のＤＮＡプローブへの適用は、染料の配列依存の結合ゆえに、複雑であった。ＤＮＡのゲノム片の異種集団に焦点があてられるので、結合部位の配列依存によりｓＤＮＡの結合測定が影響を受けないようにすべきである。
【００１９】
核酸は、高濃度のカオトロピック塩溶液の存在下で、ガラス表面と極めて高い親和性を有し、多くのガラスベースのＤＮＡ単離製品が商業的に入手できる。これら製品は使いやすいけれども、複数のピペット操作、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブまたは９６ウェルプレート、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）、遠心分離機のような装置へのアクセスを必要とする。操作は開放された研究施設で行われ、溶液の蒸散による問題を回避するために比較的大きな資料体積を必要とする。ＤＮＡ濃度は通常ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計により測定され、再現可能な結果をえるためには良好な技術が必要とされる。それにもかかわらず、種々の生物学的資料からＤＮＡを単離するためにガラスが使用され続けてきた。
【００２０】
ＤＮＡ結合のガラスへの初期の適用は、アガロースゲルから電気泳動的に浄化されたＤＮＡを単離するためのものであった。ソーダライムまたはボロシリケートガラスのＤＮＡ結合能力は、８００ｍｍ２あたりＤＮＡを約３００ｎｇと同等のものであった。８００ｍｍ２は、ほぼ、ガラス顕微鏡スライドおよび２０×２０ｍｍカバースリップの間に形成されるチャンバの表面面積である。多くのマイクロ流体ＤＮＡ単離アプリケーションでは、チューブまたはファイバーからの粉末ガラス、二酸化珪素、または珪藻のシリカスケルトンを利用する。これらのサポートは平坦な表面よりかなり大きな表面面積を確保できるからである。マイクロ流体装置は、溶液の体積が小さく（蒸散の問題がない）、ＰＣＲゲースのゲノム分析に必要とされる捕捉ＤＮＡの量が著しく少ないので、締結号の平坦なガラス表面を用いることができる。平坦なガラスは種々の組成物、サイズ、および、粗さで入手でき、より表面面積が必要ならばさらなるエッチングを行える。
【００２１】
ｍＲＮＡまたはＤＮＡの液相分析は、一端に蛍光レポータ基を他端に蛍光消光分子を担持するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲサイクルにおいて実現される。１つのフォーマット（ＴａｑＭａｎ分析）において、プローブは、Ｔａｑポリメラーゼの３'−エキソヌクレアーゼにより要約される短い単一螺旋のオリゴである。他の蛍光性フォーマット（分子ビーコン分析）は、幹部に隣接蛍光体および消光分子を具備するヘアピン形状のオリゴを用いる。ヘアピンは、相補的なＤＮＡ螺旋の存在下で開いて蛍光信号を付与する。これら蛍光性フォーマットの各々は、それぞれの増幅サイクルが成功して蛍光信号を増大させるので、ＰＣＲの進捗をモニターするのに用いることができる。これらＰＣＲベースのフォーマットの双方は、分析サイズの下限が処理上の問題（小さな胆石の染色）および利用可能な装置の解像度のみに制約されるだけであるので、マイクロ流体ベースのプラットホームに理想的である。好評な（高スループット）の熱サイクル蛍光光度計は、ＡＢＩ７９００ＨＴであり、これは３８４ウェルプレートを分析でき、ＰＣＲの間に測定される各遺伝子のウェル当たり１０ｕＬである。ウェルあたり１０ｐｇ−１０ｎｇのゲノムＤＮＡが好ましく、これはＰＣＲシステムの効率およびＤＮＡの量に左右される。
【００２２】
ガラス顕微鏡スライドがＤＮＡマイクロアレイの慣用的な基板である。多くのマイクロアレイ分析フォーマットが入手可能であり、これらは共通して単一のサンプルから広範囲の遺伝子ターゲットを同時に調べることができる。合成オリゴヌクレオチドのアレイは、ガラスサポートから直接に合成され、改質合成プローブの終点結合により準備されてきた。ガンマアミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）は、ガラス表面を官能化するのに用いることが可能な揮発性試薬であり、いくつかのＧＡＰＳスライドの製造者がある。ＧＡＰＳスライドのアミン被覆表面を二官能性リンカーを用いて活性化して、アミン改質オリゴの溶液と反応する親電子性表面を生成できる。種々の共役化学を用いて蛍光性ＤＮＡ結合染料を結合するのに用いることができる。
【００２３】
オリゴヌクレオチドのアタッチメントの密度はハイブリダイズの効率上重要な要素である。高密度のオリゴはガラスから直接合成して実現できるけれども、捕捉プローブが過剰に緊密に包まれるときにラベルＤＮＡターゲットのハイブリダイズが実際に落ちることが判明した。ガラスアタッチメント点およびオリゴヌクレオチド配列の間のリンカーの長さを長くしたときにハイブリダイズの効率が改善した。長さが８０原子までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のリンカーハイブリダイズ信号を改善し続けた。このことは、液相パフォーマンスを再現するためには固体サポートおよびＤＮＡプローブの間の長いリンカーが重要であることを示す。
【００２４】
ＤＮＡプローブをガラス表面に長いポリエチレングリコールで結合すると効率を改善した。種々の官能基を伴う高分子ＰＥＧリンカーは商業的に入手可能であり（Ｑｕａｎｔａ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｏｈｉｏ）、薬物動態特性を改善するためにたんぱく薬剤に結合させるために主に用いられた。他の高分子構造が固定化ＤＮＡプローブの性能を改善するために採用された。例えば、ビオチン改質分子ビーコンがアビジン被覆ガラスサポートに結合されて配列特異的なＤＮＡ分析に用いられた。アビジンまたはストレプトアビジンをスペーサとして用いてＤＮＡをガラス表面から離して配置することが、プローブの機能として同様に重要である。考慮すべき他のタイプの高分子リンカーはデンドリマーポリマーである。これら商業的に袖手可能な（Ａｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ワイオミング州、ミルオーキ）分子は、合成の「ジェネレーション」に応じてアミノ基およびカルボキシレート基の交互の層の中に合成される。これら分子の三次元構造は良好に制御され、その特定は良く理解できる。アミン豊富デンドリマー構造は、細胞中でＤＮＡを包囲するのに重要なヒストンタンパク質と類似している。これらは、見込みのある遺伝子治療用途のために細胞中にＤＮＡ系列を導入するために成功裏に使用されてきた。デンドリマーリンカーは固定化ＭＢ分子をＤＮＡ豊富溶液中に実現する良好な骨格を形成すると考えられる。デンドリマーリンカーおよび蛍光性ＤＮＡ検出分子（Ｓｙｔｏｘ １３、分子プローブ）を含むバイオセンサーフィルムを用いてプラスチック表面上の生細菌のレベルを測定した。これら材料は、リンカー、蛍光性染料またはプラスチック表面の間に共有リンクを含まなかったけれども、疎水性力により一体になっていた。
【００２５】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、閉鎖されているマイクロ流体処理から便宜を受ける小型分析を実現する。例えば、連続流で動作するマイクロマシン化化学増幅器は１７６−塩基対フラグメントの２０サイクルのポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）増幅を示した。流れチャンバーにおいて堰後方で捕捉された白血球からのゲノムＤＮＡターゲットのＰＣＲ増幅は、シリカガラスマイクロチップ中の全血液から示された。ＤＮＡチップアレイを用いた中程度の密度のアレイメソッドが、ＰＣＲ製品の診察用系列用に開発されて、使用する際のコストや手間が省かれた。抗生物質耐性臨床分離株が、ＰＣＲ増幅の後、１時間以内に視覚的に検出された。他の用途は、漢方薬において用いられる毒性薬草のＤＮＡ系列ベースの特定である。２００１年、Ｐｅｔｒｉｋは、Ｃ型肝炎ウイルスについて献血を大規模にスクリーニングするゲノムプロジェクト用に当初開発されたマイクロアレイデバイスの使用を調査した。ＰＣＲ分析用に一体化したシステムは、二重ペルティエ熱電気要素を電気泳動サイジングおよび検出にマイクロチップ上で結合することにより取得できた。ＤＮＡ濃縮注入スキームの使用により、１０熱サイクル程度の回数でＰＣＲ生成物の検出が可能になった。マイクロ流体カートリッジは、超音波分断、崩壊した胞子へのＰＣＲ試薬の添加、およびＰＣＲチューブ中の混合物の注入によりＰＣＲ分析用に胞子を準備するために開発された。胞子ＤＮＡの処理および検出は２０分以内に完了された。単一ＤＮＡテンプレート分子の統計的ＰＣＲ増幅を、これに続く生成物の電気泳動分析に組み合わせた一体化したマイクロ流体装置が、開発された。繰り返されたＰＣＲ分析から正規化されたピーク領域のヒストグラムが、反応装置中の単一の成長可能なテンプレート分子コピーによる量子化を示した。核酸系列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）により増幅されたＲＮＡを検出するためのマイクロ流体チップが開発された。クリプトスポリジウムパルバム（ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖａｍ）のサンプルが検出され、増幅ＲＮＡをＮＡＳＢＡ混合物から分離することなしに明瞭に比較例（ｃｏｎｔｒｏｌ）から区別できた。ほおの細胞から直接にナロリットルＤＮＡ分析を行うための自動化マイクロ流体システムが開発された。これは、ＤＮＡ分析に必要なすべてのステップ、すなわち、注入、混合、溶解、ＰＣＲ、分離、サイジング、および検出を含む。このシステムをさらに小型化する可能性が確立された。一体化されたマイクロ流体チップベースシステムが、遺伝子組み替え型の、アデノウイルスの、治療プロダクトの品質制御テスト用に開発された。ウイルス特定テストがＤＮＡ断片の寸法を図り計量し、アガロースゲル法に較べて１００倍少ないサンプルしか必要としない。
【００２６】
少量の人の血液（＜２０μＬ）を処理して遺伝子分析用の標準化ゲノムＤＮＡサンプルを放出するＤＮＡ単離装置を開発する必要がある。種々のＤＮＡ処理チャンバーを流れる流体の流れを制御するマイクロポンプ駆動機器中に挿入できる単一回数使用のマイクロ流体カードが開発できる。固定化さら計量化されたＤＮＡも即座の使用のために溶液中に放出され、または将来の分析用に保存される。装置内の固定化ＤＮＡの捕捉および開放を蛍光性により測定する能力により、この新規なＤＮＡ処理システムの処理通の制御が可能になる。この技術は、分子生物学的な研究における汎用のスタンドアローン製品の開発に用いることができ、また生物医療用途の遺伝子分析を簡素化するためのより複雑な装置を開発するのに用いることができる。開発された単一ウェル装置で単離された、精製し、変性したＤＮＡは、マイクロ流体チャネルを介して、実時間ＰＣＲまたはＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子分析のために種々のマイクロウェルフォーマットへ分配できる。図３は、細胞からゲノムＤＮＡを単離するのに用いることができる小型生物医療装置の開発に必要なマイクロスケール物理過程を示すことを意図している。
【００２７】
図３は、血液全体からＤＮＡを単離することを目論むマイクロ流体装置のチャネル内を流れる血液全体および他の流体の間の相互作用を示す。小型化生物医療装置の開発において使用されるマイクロスケールの物理的過程を、細胞からゲノムＤＮＡを単離するのに用いることが可能であることが示される。ここで図３を参照すると、血液全体５４に含まれる小さな粒子５２を含む第１の流れ５０と、純粋な溶液６０中の小さな粒子５８を含む第２の流れ５６が共通チャネル６２に導入され、ここで、これらが層状の流体拡散インタフェース（ＬＦＤＩ）を形成する。粒子５２、５８は、それらの拡散係数に依存して、ＬＦＤＩを境にして拡散を開始し、この場合、より小さな粒子５８がより速く拡散する。この装置を用いて、小さな粒子を血液全体から抽出し、または、予想可能な連続的な手法で血液全体に試薬を導入できる。
【００２８】
Ｈｏｅｃｈｓｔ染料の研究から得られる予備的な観察もこの用途に適切である。Ｈｏｅｃｈｓｔ染料の滴を水または緩衝溶液中に落とすと、その点が乾燥するときに、蛍光が増大する。これは、蛍光環境の「水和成分」（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）に関係し、蛍光背景に影響を与える。蛍光体は低背景のために十分に水和されている必要があり、疎水性表面被覆の重要性を強調する。
【００２９】
最初の焦点は、ｄｓＤＮＡを結合し測定する蛍光性固体サポートを合成し試験することにある。アミン反応性官能基を伴う蛍光性ＭＢが初めに種々の既知の手法を用いて準備される。これらエージェントはアミン改質ガラスまたはプラスチックに固定化され、ＤＮＡで処理される前後で蛍光性が測定される。種々のリンカー構造が、ＤＮＡ濃度に対する蛍光性を測定する能力に関連して評価される。結合されたＭＢを伴う蛍光性表面が加工されて、低蛍光背景および良好なＤＮＡ結合を実現する。研究対象の典型的な表面を図４に示す。固体サポート（ガラスまたはプラスチック）、リンカー化学、および蓋をなす基のような変更物が試される。蛍光性ＭＢの化学量論（結合の密度）を試してＤＮＡ測定の最大ダイナミックレンジをなす表面を決定する。ＤＮＡ結合能力も試験する。
【００３０】
図４を参照すると、装置１００は、マイナーグルーブバインダ（ＭＢ）１０４を具備するアミン改質表面１０２を有する。未反応のアミンを残してカチオン表面を実現できる。装置１１０はサクシニル化により未反応のアミンに蓋をしてアニオン表面１１２を実現できることを示す。装置１２０は、最初にポリマーアミン含有リンカー（星型デドリマー、ジアミノ−ＰＥＧ、ポリ−Ｌ−リジン）を表面１２２に結合し、その後ＭＢ誘導体と反応させることによりＭＢ１０４を溶液へと拡張できることを示す。
【００３１】
所望の蛍光表面の開発と同時にＤＮＡ単離用のマイクロ流体装置も計画される。種々のサイズのＤＮＡサンプルを取得して（Ｓｉｇｍａ）、同一の蛍光性化合物を用いて固相および液相の双方において捕捉効率が蛍光性測定により決定される。装置からのＤＮＡの開放をモニターしてＤＮＡの純化および復元が良好であることを確かめる。ＤＮＡの捕捉および開放の条件が、蛍光性プレートリーダーにより測定される。ＤＮＡ結合能力および洗浄実験を行った後、蛍光装置が構築できる。蛍光性サポートを開発した後、装置のＤＮＡ捕捉および測定機能が組み合わされる。
【００３２】
種々のアミン改質固体サポートが入手できるので、誘導体が、活性求電子官能基、例えば、ヨードアセテート基、塩化シアヌル基、ＮＨＳエステル基、および他のアミン反応性部分を用いて準備可能である。固体サポート上の相補的な官能基と反応可能な所望の求電子または求核「ハンドル」を具備するＨ３３２５８類似体を実現する２つの合成手法が示されている。最も直接的なルートは、Ｈ３３２５８の十分に組み合わされた複素環式環構造からのものである。ＰＥＧの臭素アルキル誘導体の反応が、アリールエステルを高効率に生成する条件下でＨ３３２５８と反応することを示した。Ｈ３３２５８はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（５００ｍｇ＝２２０．８０ドル）から入手できる。ｔ−ブチルオキシカルボニル防護のヘキシルアミンリンカーは容易に合成され、トシレート誘導体が製造できた。臭素誘導体は容易にアクセス可能で、Ｈ３３２５８と反応可能と考えられ、これは図５に示す。図５を参照すると、Ｈ３３２５８がアルキル化Ｂｏｃ誘導体と反応される。求核アミノアルキル基（Ｒ＝Ｈ）を直接に求電子表面に固定化できる。代替的には、アミノ基を、図５に示すように、求核表面への固定化のために、求電子基、例えば、塩化シアヌル誘導体に変換できる。Ｂｏｃは希釈酸による処理で除去され、塩基で中和され第１ヘキシルアミン基（Ｒ＝Ｈ）を付与する。求核性の第１アミンは、第３アミンによる若干の競合的なアルキル化を伴う溶液中で選択的に求電子物質と反応できる。このような化学過程は、求電子官能基でコートされた固体表面の改質にも適用できるであろう。代替的には、Ｈ３３２５８のヘキシルアミン類似体は求電子残留物を残す二官能性リンカーと反応できる。塩化シアヌルは二官能性リンカーのように振る舞い官能基を含むアミンと結合する。残っている３番目の塩素基は２つノアミノ気が結合した後は非反応性である。この共役化学過程は改質表面を合成するために後に使用できる。他の代替手法は、Ｈ３３２５８をアニオン表面に結合することであり、カルボン酸基により生成されるものと同様である。これら表面は適宜に安定し、柔軟であり、ＤＮＡへの所望の蛍光性応答を実現できる。
【００３３】
多くの固相化学過程と同様に、試薬を大幅に過剰にするのは容易であり（入手可能な表面基に対して）、過剰な試薬を洗浄して除去することも容易である。したがって、結合効率は極めて高い（高密度パックが実現できる）。ガラスおよびプラスチック基体の表面面積、固定化化学過程、リンカーのタイプ、および「結合可能」蛍光性化合物（蛍光体）は最適化される。商業的に入手可能なデンドリマーリンカー、ポリ−Ｌ−リジン、およびポリエチレングリコールジアミンは溶液中で蛍光体を表面からｄｓＤＮＡへと離すように配置するであろう。目標は、固定化された蛍光体の配座自由度を最大化し、ｄｓＤＮＡへのアクセスを最大化することである（ＤＮＡ結合および動力学を最適化することである）。
【００３４】
アミン改質のガラスおよびプラスチックサポートは、１×３インチの顕微鏡スライドとして入手可能であり、ＤＮＡマイクロアレイ用の一般的な基体である。多くのガラススライドはソーダライムガラスから製造され（Ｅｒｉｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューハンプシャー州ポーツマス）、（ガンマ）アミノプロピルシラン基で改質されて第１アミンの密度を均一にする。ＧＡＰＳスライドも他のガラスタイプとして入手可能であり（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ）、粗さが大きい（Ｅｒｉｅ）。アミノプロピル塗布のプラスチックスライドも入手して使用できる（Ｎｕｎｃ、デンマーク）。アミンにより官能化されたポリエステルフィルム（Ｍｙｌａｒ）もシートとして入手可能であり（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｍｉｎａｔｉｏｎｓ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ、カリフォルニア州オーシャンサイド、またはＡｄｈｅｓｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルバニア州グレンロック）、試験される。これら基体は求電子ＭＢ類似体を固定化するために直接的に用いてもよいし、求電子表面を実現するために二官能性リンカーで「活性化」（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）されてもよい。図６は１つの実現可能な共益化学システムを示す。塩化シアヌルの活性化が、他の脂肪族の二官能性リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）と同様に試験されるべきである。ガラススライドは、疎水性求電子物質、例えば塩化シアヌルを伴う無水有機溶媒中で活性化して試薬の水和を回避し、求電子改質濃度を向上させることができる。このため、ＰＥＧアミン（または他のポリアミン）の高度の充填が期待できる。蛍光性ＭＢ求電子物質の直接の結合（例えば図５のシアヌレート）が初めに試され、この（リンカーがない）蛍光性表面が特性化され種々の蛍光性検討の比較例（コントロール）として用いられる。
【００３５】
プラスチックスライドには穏やかな液体活性条件およびカルボジイミド結合または活性化されたエステルリンカーの使用が必要である。各末端にＮＨＳエステルを含むＰＥＧ高分子が商業的に入手可能である。商業的に入手可能なポリカルボキシレートデンドリマーは、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）化学過程を用いてアミン含有サポートに結合できるであろう。親水性のＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ３．５および４．５ＰＡＭＡＭデンドリマーは、それらの分子が６４および１２８の表面カルボキシレートをそれぞれ具備するので、とくに魅力的である。これら分子は大きなデンドリマーに悪影響を与える、高密度に「星型」に群れることがない。表面の残りのアミンをブロックしたのち（無水酢酸により）、リンカーのカルボキシレートは再びＥＤＣにより活性化されヘキシルアミン含有ＭＢと結合可能となり、これは図５から理解できる。完全に洗浄した後、スライドに共有結合したＭＢの量をプレートリーダーの吸収により測定する。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８発色体は３５６ｎｍで吸収を行い、Ｂｉｏ−Ｔｅｋプレートリーダーは適当なフィルタを用いてこの波長を顕微鏡スライド上で直接に測定できる。このスライドは乾燥でき、将来の使用のために評価できる。表面上の単一層の蛍光染料の安定性（貯蔵状態）を調査すべきである。
【００３６】
高分子リンカー構造は、溶液中で、蛍光性ＭＢセンサをｄｓＤＮＡに広げる骨格として働く。表面構造の蛍光特性がｄｓＤＮＡがある場合とない場合で試験されるべきである。Ｈ３３２５８誘導体はガラス上に歓送されているときに蛍光性があると知られているので、これら表面は、蛍光性ＤＮＡ結合特性について評価されるときに十分に水和されていることが重要である。平衡時間はマイクロ流体環境において迅速であり、これは有利である。種々のリンカー構造の蛍光性背景が、「かん流チャンバー」（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）を対象のスライドの表面に結合することにより測定される。これらは、単純なゴムガスケットであり、これらをスライドに接着して、その後、入り口ポートおよび出口ポートを具備するカバースリップで被覆する。チャンバーが構築された後、目的の検体溶液がピペットで流入され、ポートは封止可能である。２００μＬのチャンバサイズが利用される。
【００３７】
種々のＤＮＡサンプルを外部ソース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）から入手する。ゲノムＤＮＡは、マイクロ流体装置内で採用される緩慢な流れの下でマイクロチャネルを通過するときにもつれないように刈り上げる必要があるであろう。ゲノムＤＮＡの刈り込みは、１８ゲージ針と通じて数階溶液を引き抜くことにより容易に実現される。種々の長さ（４０ｋｂ、４０００ｂｐ、４００ｂｐ、および４０ｂｐ）のＭＷ標準も考慮されるべきである。最初に、中和緩衝剤を関心対象の蛍光性気体上に付加し、蛍光性背景（４５８ｎｍおよび４９２ｎｍで）をプレートリーダー（励起＝３５６ｎｍ）上でゆっくり時間をかけて測定する。安定した背景測定は、ＭＢ被覆が十分に水和されているときに実現されるに違いない。そののち、種々の濃度のｄｓＤＮＡ（Ａ２６０で測定される。５０ｕｇのｄｓＤＮＡ＝１０Ｄ単位）がかん流チャンバーに案内され、この場合、読取の間にチャンバーを確実に洗浄するようになす。４５８ｎｍの蛍光（ｄｓＤＮＡ結合の特性）は、ＤＮＡ濃度が増加すると線形に増加する。ＭＢの濃度は測定のダイナミックレンジに関係するようであり、これを考慮すべきである。先に説明したように、ＭＢパックの濃度は基体のＡ３５６から決定される。マイクロ流体装置は高濃度のＤＮＡ溶液を処理し、それゆえ、蛍光のためのＤＮＡ濃度「閾値」（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）がゴールである。ＤＮＡ濃度が蛍光閾値を下回れば、単離田潤を継続する。同様に、蛍光信号が閾値を越えると、要求される最少のＤＮＡ濃度が達成される。蛍光性ガラスサポートを用いたＤＮＡ検出は生理食塩濃度で検査されることに留意されたい。この場合にガラスによるＤＮＡ結合が最大化されるに違いない。
【００３８】
蛍光性表面の開発と同時に、ｄｓＤＮＡのガラスに対する固定化および開放を効率的に行うために必要とされるパラメータも小体積の溶液を用いて検査される。ｄｓＤＮＡの小体積の緩衝剤への開放は数学モデルにより最適化される。ＤＮＡをガラスに結合するうえでの処理ステップは生物的サンプルの性質に依存し、その手法も多くの変形例がある。以下に説明されるステップは、ＤＮＡ豊富なソースおよびシリカ粒子に対して実行された。細胞が、まず、グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）緩衝液（ｐＨ６．４）の２Ｍの溶液を付加することにより溶解される。このカオトロピック塩溶液は、また、ゲノムＤＮＡからヒストンタンパク質を除去し、ヌクレアーゼを非活性化し、ＤＮＡ−シリカ錯体の形成を助長する。固定化されたＤＮＡ−シリカは渦巻き駆動され、また遠心分離処理され（これは長いＤＮＡ螺旋を刈り込むようである）、細胞の破片はより多くのＧｕＳＣＮ緩衝剤により洗い流される。最後にＤＮＡ−シリカが歓送され、純化されたＤＮＡが低塩の緩衝在中に溶出されて２６０ｎｍの吸収により測定される。このプロセスは単純であるけれども、これらステップはシリカ粒子が渦巻き処理の後に一様になることを確実にするために人での作業および人による入力を必要とする。マイクロ流体フォーマットは以下の表Ａで説明されるような処理を合理化すべきである。
【００３９】
表Ａ
１．高濃度のＧｕＳＣＮを用いて細胞を溶解し、ヒストンを除去し、ＤＮＡをガラスに結合する。
２．ガラス結合ＤＮＡを高濃度ＧｕＳＣＮで洗浄する。
３．生理食塩で結合ＤＮＡをガラスから開放する。
４．蛍光性基体を用いてチャンバー内の開放ＤＮＡの濃度を読み取る。
５．ＤＮＡを蛍光性基体から開放してＰＣＲベースの分析に使用するために調整する。
【００４０】
ガラス基体（顕微鏡スライド）のＤＮＡ結合能力を評価するために、ステップ２、３、４および５のみ試験する。処理ステップは、ガラスカバースリップを伴うかん流チャンバー内で実行できる。種々のサイズ・濃度のＤＮＡをＧｕＳＣＮで混合することがＤＮＡ結合で重要である。ゴールは、スライドのガラス表面およびカバースリップの間の３００ｎｇの発表されているＤＮＡ結合能力に接近させることである。結合後に、チャンバーから高濃度のＧｕＳＣＮを引き抜き、生理食塩で満たす。平衡状態に達した後、結合ＤＮＡはチャンバー内で自由でチャンバーから回収できるに違いない。濃縮されたＤＮＡの分割単位（ａｌｉｑｕｏｔ）が、開放後に、Ｈ３３２５８について公表されている蛍光手法を用いて測定される。ＤＮＡは最終的にはＰＣＲベースの分析に用いられるので、溶出緩衝剤はこの用途と一貫性をもつものである。
【００４１】
蛍光ＭＢ基体のＤＮＡ結合能力も試験される。同一のかん流チャンバーシステムが種々のＤＮＡ濃度を試験するのに用いられる。結合能力は、最終的な装置で遭遇する種々の緩衝剤を用いて試験される。ｄｓＤＮＡをＭＢ被覆基体から開放することがとくに興味深い。結合ＤＮＡ二本線は変性して基体から開放する必要があるであろう。なぜならば、これはメチジウムＤＮＡ補足ビーズを具備するケースだからである。この場合に、希釈ＮａＯＨ溶液が用いられて、変性されたＤＮＡ溶液は、最終的に、アンモニウムアセテートにより中和される。
【００４２】
精製された結合および開放データは、マイクロ流体装置の設計を支援するマルチフィジックスモデルのための基礎として用いられる。このモデルは、表面結合、核酸、移流、および塩およびＤＮＡの最終的な各部の濃度を、プロトタイプの幾何、溶媒および溶質の特性、および精製されたデータによって特徴付けられる結合挙動に基づいて計算する。最良の予測性能を伴う装置設計が所望のプロトタイプ設計になる。全体としての性能はモデルの予想値と比較され、これが、実験的に取得できない装置内部の局所的な物理過程の情報を提供する。
【００４３】
種々の表面の特性に依存して、いくつかの設計が実現可能であり、これは図７から理解できる。例えば、蛍光性ＭＢサポート１５０がＤＮＡ結合および測定の二重の目的で働くことができるであろう。これはメチジウム粒子の使用に類似する。ガラス表面はより大きな結合能力を有しても良く、単一のチャンバー設計１５２は、ＤＮＡ測定用の蛍光性ＭＢ表面を具備するガラス補足表面と組み合わせることができる。ＤＮＡ結合および測定に異なる条件を要求しても良く、２つのチャンバーを用いる装置１５４が最良の設計であろう。予め行った計算によれば、図８に示すような、ガラス表面でＤＮＡ結合を行ない、プラスチックの対向表面でＭＢ測定を行う単一チャンバー設計は、平滑なガラス表面であっても、８４ｎｇのＤＮＡを補足して測定することが可能であることを示唆した（粗なガラス表面はより顕著に大きな量のＤＮＡを結合するであろう）。
【００４４】
図８は、６２×４０×３．５５ｎｍのマイクロ流体装置１６０を示し、これは、５μｌのＤＮＡ結合チャンバー１６２、７５０μｌの廃棄チャネル１６４、および２処理の最後に開放ＤＮＡを保持するための５μｌのチャネル１６６を含む。流体はピペットにより注入ポート１６８を通じて注入される。流体は、廃棄排出口１６８または出力ポート１７０のどちらが開いているかに応じて廃棄チャネル１６４または開放ＤＮＡチャネル１６６へと進む。開放ＤＮＡはカード１６０からピペットを用いて生成物排出口１７２または出力ポート１７０を通じて除去される。図９は、装置を構成する５枚のラミネート層すべてを分解して示す。層１８０は０．１２５ｍｍのビニルから構成され、層１８２は０．０２５ｍｍの接着層であり、層１８４は３．１７５ｎｍのＰＭＭＡであり、層１８６は０．１００ｎｍのＡＣＡであり、層１８８は０．１２５ｍｍのビニルであり、層１９０は、層１８０に挿入されるＰｙｒｅｘカバースリップインサートである。各層は３つのレジスト穴１９２を整列用に含む。層１８２および１８６は、漏れ止めの態様で装置の各層を一体に保持する接着剤を含む。
【００４５】
表Ａの処理ステップは図１０Ａ〜Ｅに準じに示される。図１０Ａは、溶解したサンプル細胞を含む高濃度のＧｕＳＣＮ内のＤＮＡの混合物２０２をピペットで注入した後のマイクロ流体装置１６０を示す。結合チャネル１６２を通じて棄チャネル１６４へと流される高濃度の塩、ＧｕＳＣＮを用いて洗浄したのち（図１０Ｂ）、チャンバー１６２は生理食塩で洗い流され（図１０Ｃ）、食塩２０５によりガラス１９０から開放されたＤＮＡがＭＢに結合し、このＭＢがｄｓＤＮＡ濃度２０９が読み取れるように蛍光する（図１０Ｄ）。最後に、脱イオン化された水（ＤＩ）が結合チャネル１６２を通じてピペット注入されＤＮＡを押し出して開放ＤＮＡチャネル１６６に運び、チャンバー１６２から純化されたものを最終的に分配する。これを図１０Ｅに示す。この時点で、生成物排出口１３２（図８参照）が開放されてＤＮＡを取り出すことができるであろう。この装置は十分に小さく９６−ウェルのプレートリーダー上に容易に配置でき、６ウェル中心ロケーションが結合チャネル内にあって正確にＤＮＡ濃度を多数読み出せるように設計される。この処理が最後に、固定化蛍光性ＭＧ基（おそらく、現時点では非蛍光性）が固定サポート上に残され、実験室廃棄物流に装置の残りが廃棄される。
【００４６】
例
結合ヘキシルアミンがリンクされた蛍光性Ｈｏｅｃｈｓｔ染料の合成が実行された。ここで図１１を参照すると、合成が図示される。とくに断らない限り、試薬はＳｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈから取得した。無水性溶媒が確実に封止されたビン中に取得された。７ｃｍ長のＴＬＣストリップを５×７ｃｍのシリカ被覆アルミニウムシート（Ｍｅｒｃｋ）から切り出し、手持ち長波長ＵＶランプを用いて照射して蛍光により全般的に視覚化した。溶媒前面（Ｒｆ）に対する蛍光スポットの移動をＴＬＣ分析のために測定した。蛍光性ＤＮＡ結合分析用に用いられるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８標準（ビスベンズイミド、ＢＢ−ＯＨ）は、Ｓｉｇｍａ社から販売されているＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ中に取得した。このキットはビスベンズイミド（水中で１０ｍｇ／ｍＬ）、１０倍蛍光分析緩衝剤（１０×ＦＡＢ＝１００ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、およびＤＮＡ標準（刈り込まれたｃａｒｆ胸腺ＤＮＡ、１×ＦＡＢ中に１ｍｇ／ｍＬ）を含む。このキットは、図１２に示されるＤＮＡの蛍光性測定の標準測定として用いられた。
【００４７】
ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）防護アミノヘキサノール開始材料がＳｉｇｍａ社から購入され、その５００ｍｇを、公表されている手順（ＫｅｌｌｅｒおよびＨａｎｅｒ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍｉ． Ａｃｔａ，７６（１９９３）８８４−８９２）に従って所望の臭化アルキルに変換した。この生成物は、カラムクロマトグラフィによりシリカゲルを介して単離され、生成物の２９２ｍｇ（４５％の収率）を淡黄色の液体として生じる。他の汚染物から所望の生成物を分離するのは、臭化アルキル用の良好なＴＬＣインジケータを欠いているので、困難であった。ヨウ素チャンバー中の汚染は低感度でしか動作しなかった。ＴＬＣ（２：１のヘキサン／エチルアセテート）：開始ＲＯＨのＲｆ＝０．１７、ＲＢｒのＲｆ＝０．６７である。
【００４８】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料（ビスベンズイミド、ＢＢ−ＯＨ）が、Ａｌｄｒｉｃｈ社からトリヒドロクロライド塩（ペンタハイドレート）として購入した。９．５ｍｇの染料（１５．２μモル）が、乾燥した１５ｍＬ球底フラスコ中で１５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解された。３６．５ｍｇ（２６５μモル）の炭酸カリウムおよび７．１μＬ（８．５ｍｇ、３０．４μモル）のＢｏｃ防護臭化ヘキシルアミンである。混合物は５３度で６時間、室温で日間、磁気的に攪拌された。ＴＬＣ（１０％メタノール、５％エチルジイソプロピルアミン、８５％ジクロロメタン）が長波長のＵＶランプ（３６５ｎｍ）で照射したときに青色の蛍光スポットの混合を示した。開始ＢＢ−ＯＨ（Ｒｆ＝０）が所望の生成物（Ｒｆ＝０．３）および高移動度側生成物（Ｒｆ＝０．５）に変換された。上澄みのＤＭＦ溶液は上澄み移動させられ、残りの炭酸カリウムは付加的な２ｍＬのＤＭＦで洗浄された。組み合わされた混合物は、真空下で回転蒸発により濃縮された。残留物は５％メタノール、５％エチルジイソプロピルアミン、９０％ジクロロメタンの２ｍＬ中に溶解され、同一の溶媒でパックされた２×１０ｃｍのシリカゲルカラム（２３０−４００メッシュ）に供給された。５０ｍＬの前留分が廃棄された後、高移動度側の生成物が約７５ｍＬで集められた。クロマトグラフィの進捗が、手持ちＵＶランプを用いて続けられる。溶質中のメタノールの百分率が１０％に増大し、所望の生成物が９０ｍＬの溶媒中に単離された。回転蒸発器を用いて溶媒を除去して１０．５ｍｇの黄色の固体を得た（理論的な収率＝９．５ｍｇ）。生成物はＴＬＣによる１つの主たる青い蛍光バンドであり、他の蛍光汚染物のトレースを伴っていた。生成物は将来のＮＭＲに備えて２ｍＬの第２クロロホルム中に溶解された。ＣＤＣｌ３溶液の１ｍＬ部分は下記のように保護外とした。
【００４９】
封止されたガラスアンプルからのトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）が、１ｍＬのＣＤＣｌ３中の５ｍｇのＢＢ−ＮＨＢｏｃに添加された。一様な溶液は封止された１ドラムのガラス製薬ビン中に保持された。保護解除はＴＬＣ（３５％メタノール、５％エチルジイソプロピルアミン、６０％ジクロロメタン）により引き継がれた。開始ＢＢ−ＮＨＢｏｃ（Ｒｆ＝０．７）は、ゆっくりと保護解除されて低移動度生成物（Ｒｆ＝０）へと移行する低移動度塩（Ｒｆ＝０．５）へと変換された。２４時間後、１００μＬの分割単位（ａｌｉｑｕｏｔ）の反応混合物が、過剰のＴＦＡを回転蒸発器で除去し、メタノールに溶解させ、さらに少量の炭酸カリウムを添加することにより、無塩基へと変換された。室温で取得された無塩基形態のＢＢ−ＮＨ２は単一の主たる蛍光バンド（Ｒｆ＝０．０７）および蛍光汚染物質のトレースを示した。バルクの反応混合物は上述したように無塩基へと変換され、３ｍＬの２：１メタノール／クロロホルム中に溶解された。生成物は秤量されなかったが（約１．７ｍｇ／ｍＬ）、収率は、開始ビスベンズイミド染料（ＢＢ−ＯＨ）のＵＶ吸収との比較から計算された。
【００５０】
１×ＦＡＢ中のＢＢ−ＯＨの１０μＭ溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは３４０ｎｍの吸収極大（０．１８ユニット）を有する。ＢＢ−ＮＨ２の溶液は、９９５．７μＬの１×ＦＡＢ中に、４．３μＬの約１．７ｍｇ／ｍＬの溶液を溶解することにより準備された。吸収極大は３４２ｎｍ（０．０７５ユニット）であった。ＢＢ−ＯＨおよびＢＢ−ＮＨ２は同一の減衰係数を有し、ＢＢ−ＮＨ２のＵＶ−ｖｉｓサンプルの濃度が計算された（１０μＭ×（０．０７５／０．１８）＝４．４μＭ）。この結果、約１．７ｍｇ／ｍＬの溶液の測定濃度が０．７ｍｇ／ｍＬ（０．９８ｍＭ）とされた。ＢＢ−ＮＨ２の収率（２．１ｍｇ、２．９ｍモル）は開始ＢＢ−ＯＨからの３８％収率に対応する。この分析は、少量を秤量するより収率の決定を正確に行える。秤量では、塩および不可視（ＮＭＲによる）のトリフルオロ酢酸が誤差を与えると考えられる。
【００５１】
図１２において２２０により示されるＢＢ−ＯＨ分子の蛍光は、ｄｓＤＮＡの存在下では、４９２ｎｍの弱い発光から４５８ｎｍの強い発光へと変化する。Ｓｉｇｍａ社からのＤＮＡ定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）キット（ＢＢ−ＯＨベース）を用いてＢｉｏ−Ｔｅｋ ＦＬ６００蛍光プレートリーダー上で標準曲線を生成した。分析は、供給されたプロトコルに従って９６−ウェルの透明な底板中で実行された。０．１μｇ／ｍＬのＢＢ−ＯＨ濃度を、各ＤＮＡ標準（２０−１０００μｇ／ｍＬ）に対する指示緩衝剤として用いた。結果を図１２に示す。図１２は、２２２で参照されるＭＭ−ＮＨ２がビスベンズイミド染料の蛍光性ＤＮＡ検出特性を保持していたことを示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８分子上のフェノールの改質はＵＶ−ｖｉｓ吸収（極大波長が約３４０ｎｍ）を変更せず、ヘキシルアミン改質類似体が３６０ｎｍ（４０ｎｍスリット幅）で励起されたときに強い蛍光信号（４６０ｎｍ、４０ｎｍのスリット幅での検出）を示した。ヘキシルアミンリンカーは、ＤＮＡ特異性蛍光を改善し、これはＤＮＡのカチオンの第１アミンに対して親和性が大きいからと考えられる。ＢＢ−ＮＨ２分子は、平坦なビスベンズイミド構造の各末端にカチオンのアミノ基を有し、このため、これをＤＮＡのマイナーグルーブバインダにしっかりと固定させる。他のＤＮＡ親和剤（オリゴヌクレオチドのように）は溶液中で蛍光性プローブとしての機能を示した。
【００５２】
蛍光性ＭＢ表面を準備するための種々の固定化の化学過程が考慮された。ｄｓＤＮＡ検出表面の設計における３つの主たる要素は以下のとおりである。
１．インジケータ：
ｄｓＤＮＡの存在下でのみ蛍光性である。
リンカーはほとんど蛍光性を持たない背景とともにスペーサ分子に結合する。
２．基体：
関与対象のスペクトル領域で透明である。
スペーサ／インジケータ分子で簡単に被覆される。
３．スペーサ：
蛍光性インジケータおよび基体に対して簡易に共役化される。
蛍光性ＭＢを立体障害を伴うことなくｄｓＤＮＡにアクセス可能にする。
【００５３】
図１２に説明するＢＢ−ＯＨおよびＢＢ−ＮＨ２ ＤＮＡインジケータは所望のＤＮＡ特異性蛍光特性を有し、結合点として働く特別な官能基を有する。求電子物質、例えば、活性化エステルまたは塩化シアヌルとの反応が分子中の多数の位置で起こり得、これら側部反応が所望のＤＮＡ特異性蛍光を減少させることがある。三日月形状のＤＮＡ結合領域中の「損傷」（ｄａｍａｇｅｄ）構造がＤＮＡ特異性発光を変更する可能性がある。両分子は、環状の第３アルキルアミン基を１つの末端に有し、これがアルキル化され得る。イミダゾール基もアルキル化が発生可能なサイトを有する。種々の表面構造が所望のＤＮＡ特性蛍光を持ち得るけれども、一貫したＤＮＡ特異性蛍光を与える一様で再生成可能な表面構造を持つことが有益である。ＢＢ−ＮＨ２リンカーは求電子物質と選択的に反応可能な第１ヘキシルアミン基を含む。必要であれば、リンカーの腕をポリエチレングリコールにより延長可能である。Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社はＢｏｃ防護されたカルボン酸を販売しており、これはより親水性で立体配座上柔軟な、ＢＢ蛍光体を固体サポート（基体）にけつごうさせるためのリンカーを提供する。
【００５４】
プラスチック（ｍｙｌａｒ）基体への関心は、３６０ｎｍで照射したとき４６０ｎｍで顕著な背景蛍光が起こることが見いだされるかどうかに左右される。Ｓｃｏｔｃｈ（商標）テープ（装置のポートを封止するのに用いられる）は顕著な４６０ｎｍの蛍光性を有することも見いだされた。ＤＮＡマイクロアレイ用にオリゴヌクレオチドを１×３ｃｍのスライドに固定化する多くの文献およびいくつかの化学過程が存在する。アミン被覆スライド（アミノプロピルシラン）を、リンカーおよびインジケータ分子をナノ加工するための基体としてＳｉｇｍａ社から取得した。他の商業的に入手可能なスライド化学（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からのＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標））も試された。これらスライドは活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸エステル）基において終端する伸長したリンカー構造を有する。ＣｏｄｅＬｉｎｋ社のスライダは「アミン末端オリゴヌクレオチドの固定化を可能にし、長いＰＥＧリンカーを必要とすることなくハイブリダイズを行える」ことを宣伝文句としている。ＢＢ−ＮＨ２蛍光体はこの表面と直接に作用させられることが可能であろうから、最初に試験された。
【００５５】
ＢＢ−ＮＨ２の固定化は３Ｄ−Ｌｉｎｋスライドの上でカバースリップの下でｐＨ８．５において試された。１つの巣零度あたり最高で１６ウェルまで同時に試験することが可能な複数ウェルハイブリダイズチャンバー（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）を購入した。種々の時間、反応させた後、スライドの過剰なＢＢ−ＮＨ２を緩衝剤で洗浄し、同一のカバースリップ手法で蓋をした。蛍光性ＤＮＡ結合特性を評価する前に、１×ＦＡＢで最後に洗浄した。
【００５６】
ＢＢ−ＮＨ２インジケータの特性が予想通りに改善できた。４６０ｎｍでの蛍光背景は、最適化可能な重要な特性である。高い背景またはｄｓＤＮＡの不十分な開放が問題ならば、他の表面が、アミン被覆スライドを用いて試される。ＣｏｄｅＬｉｎｋスライドに関連して試される１つのキーとなる変更点は、ＢＢ−ＮＨ２の固定化の後に種々のアミンで蓋をする効果である。これにより、溶液中のＢＢ蛍光性分子、スペーサ、およびｄｓＤＮＡのインタフェースで分子特性が変更される。このインタフェースの性質は、蛍光体のｄｓＤＮＡへの結合やＤＮＡの固体表面への結合態様に影響を与えるようである。ＣｏｄＬｉｎｋ社は５０ｍＬのエタノールアミンで蓋をすることを推奨し、これが中性の表面被覆をなすに違いない。ジアミンまたは他のポリアミンによる蓋は正味で正の電荷をスライド表面に付与し、非可逆的に（開放なし）ＤＮＡを結合することができるであろう。他方、これら正の電荷が結合速度を高速にし、またｄｓＤＮＡの局所的な濃度を増大できるであろう（寄り良好な信号となる）。活性化エステルをリジン基で蓋をすると、双性イオンのアミノ酸表面を実現し、これがＤＮＡに対して非吸引的であり、このため表面を「不動態化」（ｐａｓｓｉｖａｔｉｎｇ）する。カルボン酸基を表面に導入する他の方法は、ＢＢ−ＮＨ２の固定化の後に、ＨＮＳエステルを単純に加水分解することである。固定化は高ｐＨ（８．５）で起こるので、スライドを緩衝在中に１晩保持しておけば、スライド表面上の入手可能なＮＨＳエステルが加水分解される傾向がある。これにより、スライド表面およびＤＮＡのインタフェースに正味で負の電荷が付与され、蛍光信号および背景に影響を与えるであろう。これは、カチオンの蛍光性インジケータを固定化する手法としても採用できる。
【００５７】
ＣｏｄｅＫｉｎｋスライドはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手し、以下のプロトコルに従って用いた。単一スライドを、１６の異なる固定化反応の試験のために用いた。１６ウェルシリコーンゴムガスケットを、「９６−ウェルフォーマット」クランプシステム（ＰｒｏＰｌａｔｅ（商標）、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−ｌａｂｓ）を用いてプレートに接着させた。スライド上に形成された四角なウェルは３００μＬまでの体積を有し、透明なプラスチック接着封止フィルム（与えられている）でカバーできる。活性化エステルスライド表面は上方を向き、配向目的で、スライド状の「ＣｏｄｅＬｉｎｋ」の名称がウェル１および２の頂部に位置するようになす。ＢＢ−ＯＨ（水中で１ｍｇ／ｍＬ）およびＢＢ−ＮＨ２（メタノール中で０．７ｍｇ／ｍＬ）溶液が先に説明したように準備された。３ｍｇ／ｍＬのアミノエタノール（５０ｎＭ）を含むｐＨ８．５の重炭酸塩（０．１Ｍ）をキャップ溶液として用いた。
【００５８】
ＢＢ−ＮＨ２溶液（１００μＬ）が３００μＬのメタノールと混合され、６００ｍＬのｐＨ８．５の重炭酸ナトリウム（０．１Ｍ）で希釈した。この溶液（７０μｇ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ８．５の十炭酸塩中で７μｇ／ｍＬのＢＢ−ＮＨ２および０．７μｇ／ｍＬの溶液を準備した。この溶液は、長波長ＵＶ（３５６ｎｍ）のランプの下で淡緑色の蛍光性を有する。ｐＨ８．５の絨毯酸塩中で１０μｇ／ｍＬのＢＢ−ＯＨ溶液が１ｍｇ／ｍＬ溶液から準備された。ＣｏｄｅＬｉｎｋスライド表面上の１６個のウェルは以下のように処理された。ウェル１−４は０．７μｇ／ｍＬのＢＢ−ＮＨ２、ウェル５−８は７μｇ／ｍＬのＢＢ−ＮＨ２、ウェル９−１２は７０μｇ／ｍＬ、ウェル１３−１６は１０μｇ／ｍＬのＢＢ−ＯＨである。ウェルに充填した後（ウェル当たり０．２ｍＬ）、巣零度分子は接着フィルムで被覆されて室温で１８時間保持された（暗所で）。フィルムが除去され、ＢＢ含有溶液が各ウェルから除去され、０．２ｍＬのキャップ溶液が添加され、ウェルが再封止された。７時間後、キャップ溶液が各ウェルから除去され、ガスケットが洗浄のためにスライドから除去された。スライドは、５０ｍＬ遠心分離チューブ中で２０分、４０ｍＬの４０％メタノール／６０％重炭酸ナトリウム（０．１Ｍ）中に浸され、１×ＦＡＢ中で２０分、除去され、浸される。スライドを取り外し、蛍光プレートリーダー上で分析される。
【００５９】
ＤＮＡ指示表面の感度および精度は特徴的であった。ＢＢ−ＮＨ２含有スライド表面の評価は、先に説明したｄｓＤＮＡと、類似のプレートリーダー分析フォーマットとを用いて試された。
【００６０】
先に準備されたＢＢ−ＮＨ２処理ウェルおよびＢＢ−ＯＨ処理ウェルが評価された。１６ウェルシリコーンゴムガスケットが処理されたＣｏｄｅＬｉｎｋスライド上に組み立て直された。残りの１×ＦＡＢ緩衝剤はＫｉｍｗａｉｐｅでたたいてスライド表面から除去した（わずかな滴は残った）。固定化混合物の各々のための４つのウェルの各々が以下の溶液の１つで再び水和される。すなわち、１０００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡ、２００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡ、１×ＦＡＢ、液体なしである。用意したばかりの溶液が通常の４６０ｎｍの蛍光について試験された（ボトムリード、感度＝１１５）。ウェルを読み取った後に、脱イオン化水を用いて洗浄してＤＮＡを除去し、再度測定した。
【００６１】
ＢＢ処理したスライド表面のすべてはｄｓＤＮＡの存在下で４６０ｎｍの蛍光の増大を示した。これを図１３に示す。最も大きな濃度のＢＢ−ＮＨ２（７０μｇ／ｍＬ）との固定化反応は、２３０で示され、最も大きな蛍光信号を示した。ただし、高注入レベルは高蛍光背景（ＤＮＡなしで５０，０００カウントより大きい）ももたらした。７μｇ／ｍＬの固定化反応が、２３２で示され、最も良好な性能を示した。用量反応は最低で２００μｇ／ｍＬのＤＮＡまで観測できた。固定化反応におけるＢＢ−ＮＨ２の最低レベルは、２３４で示され、最低で２００μｇ／ｍＬのＤＮＡまでの用量応答が実現された。信号は小さいけれども、ＢＢ−ＯＨインジケータさえも、２３６で示すように、ＤＮＡ濃度が増加すると４６０ｎｍの蛍光の所望の増加を実現した。水でウェルのＤＮＡを洗い落とした後、ウェルは４６０ｎｍでＤＮＡ特異の蛍光の証拠を示さなかった。同一レベルの固定化蛍光体を伴うすべてのウェルは類似の蛍光性を有した。
【００６２】
図１３のデータにおいては溶液中に蛍光染料がない。ＤＮＡ結合分析は固定化されたＢＢ−ＮＨ２またはＢＢ−ＯＨを用いる。すべての表面は、ＤＮＡがない場合でさえ、４６０ｎｍで所定の蛍光信号をＢＢ−ＮＨ２固定化領域中で示す。ｄｓＤＮＡが結合表面に導入されると、４６０ｎｍの蛍光が増大する。スライド表面のコントロール（比較）領域（ＤＮＡなし）を用いて、背景差分を可能にする。
【００６３】
固定化ＢＢ−ＮＨ２蛍光体はｄｓＤＮＡの存在下で良好な用量反応を実現する。４６０ｎｍにおける蛍光信号の強さは、溶液中のＢＢ−ＮＨ２反応とほぼ同じであるけれども、背景はより大きい（図１３参照）。固定化ＢＢ−ＮＨ２の主たる利点は、小さな体積しか必要としないということである。液相分析で必要とされる２００μＬのウェルの容積と異なって、固定化ＢＢ表面を十分に塗らすに足るＤＮＡ溶液だけで十分である。これにより、ＤＮＡ精製のマイクロ流体装置の準備が可能になる。
【００６４】
ガラス表面を用いて複雑な生物学的混合物からＤＮＡを精製することが他者により示されており、これら結果を蛍光性ＢＢ分析を用いて検証した。マイクロ流体装置に必要なステップは以下の表Ｂに示される。液相ＢＢ分析を用いて未改質ガラスのＤＮＡ結合および開放レベルを決定した。
【００６５】
表Ｂ
１．高濃度のＧｕＳＣＮを用いて、細胞を溶解し、ヒストンを除去し、ＤＮＡをガラスに結合する。
２．ガラス結合ＤＮＡを高濃度ＧｕＳＣＮで洗浄する。
３．生理食塩で結合ＤＮＡをガラスから開放する。
４．蛍光性基体を用いてチャンバー内の開放ＤＮＡの濃度を読み取る。
５．ＤＮＡを蛍光性基体から開放してＰＣＲベースの分析に使用するために調整する。
【００６６】
グアニジウムチオシアネート（１０Ｍ）が、蛍光性ＤＮＡ結合分析において試験され、高濃度で、４６０ｎｍの蛍光性背景を実現することがわかった。ＤＮＡをガラスに結合するために用いる他の慣用的なカオトロープは沃化ナトリウム（１２Ｍ）である。それは低いバックグラウンドを伴ったけれども、過塩素酸ナトリウムに較べより高価であり、より扱いにくい（溶液が変色する）。したがって、過塩素酸ナトリウム（６Ｍ）が開発用に選ばれた。０．１ｍＬ中に５０、５００または５０００ｎｇのＤＮＡの溶液が６Ｍ過塩素酸ナトリウム（ｐＨ８ Ｔｒｉｓ）中で準備された。これらの０．１ｍＬ容積がポリスチレンのペトリー皿に移されて、２２×２２ｍｍのカバースリップ（ガラスまたはプラスチック）がそれらの上に配置された。室温で１．５時間保持した後に、スリップを注意深く斜めに上げて残りの液体から取り除いた。このスリップをＫｉｍｗｉｐｅ上に載せ（ＤＮＡは下向き）いずれの残留滴を除去した。各スリップをペトリー皿中の０．１ｍＬの容積の１×蛍光分析緩衝剤へと移した（１×ＦＡＢ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）。室温で４時間保持した後に、スリップを取り外し、ＤＮＡ側を０．１５ｍＬの１×ＦＡＢで洗浄した。各スライドからの組み合わせ緩衝剤は１×ＦＡＢで０．２７ｍＬをもたらし、３０μＬの１μｇ／ｍＬのビスベンズイミド（ＢＢ−ＯＨ）溶液（１×ＦＡＢ中で）が付加された。各スリップから２００マイクロリットルの容積がマイクロウェル（透明な底）へ移され、サンプルがＢｉｏｔｅｋ ＦＬ−６００プレートリーダー上で読み取られた。蛍光は４６０ｎｍで読み取られ、ＤＮＡ濃度は標準曲線から決定された。
【００６７】
図１４を参照すると、カバースリップに対するＤＮＡ補足および開放の効率が示される。プラスチックカバースリップは２５０で示すようにＤＮＡ結合を示さない。ガラスカバースリップに対するＤＮＡ補足および開放の効率は、２５２で示され、少量のＤＮＡに対して最大となる。カバースリップ当たり５０ｎｇのＤＮＡで、７．２ｎｇが復元された（１４％の効率）。カバースリップ当たり５００ｎｇのＤＮＡで、６８ｎｇが復元された（１４％の効率）。カバースリップ当たり５０００ｎｇのＤＮＡで、１１３ｎｇのＤＮＡが復元された（２％の効率）。これらの結果から、ガラスカバースリットがμ流体ＤＮＡ精製用に適した表面であり、少なくとも６８ｎｇのＤＮＡが５００ｎｇのサンプルから効率的に復元することができることがわかる。
【００６８】
プロトタイプカードが、手作業のピペットによる溶液の付加に対して最適化されており、１分当たり１００μＬの流速が、手慣れた作業およびＲａｉｎｉｎ ２００ μＬ Ｐｉｐｅｍａｎにより実現できた。より遅い流速（泡の形成を最小化するのに重要）は、実現がより困難であるけれども、２００μＬの分注器を成功裏に用いてＤＮＡ結合チャネル（２０μＬ）を泡を導入することなしに満たすことができた。
【００６９】
今まで検討したカードは、いくつかの小幅な変形例でもうまくいった。ガラスの一列のチャネルは低流速で十分に湿潤となり、流体は、チャネルを通じて空気を流すことにより除去できた。ＤＮＡ捕捉ウェルは蛍光性プレートリーダーを用いた分析のために精製したＤＮＡをすべて回収する設計とした。固定化ＢＢ表面を用いて、ＤＮＡ捕捉ウェルは薄型のチャネルを実現する設計を採用でき、このチャネルは、蛍光性分析の後に、ＤＮＡを他のチャネルに分配させるように容易に構成できる。蛍光性ＢＢ染料は固定化されるので、精製ＤＮＡは、下流のＤＮＡ分析チャンバーにうちした時にも指示用蛍光体で汚染されているということがない。
【００７０】
この発明は好ましい実施例との関連で開示され説明されてきたけれども、この発明はどの実施例にも制約されず、この発明の真実の精神および範囲は添付の実施例に規定され、これから逸脱することなしに変更を行えることに留意されたい。
【００７１】
ここに開示された発明の例示的な実施例がこの発明の目的を達成することは明らかであるが、当業者が種々の変形や他の実施例を構成できることは容易に理解できる。さらに、任意の実施例の特徴および／または要素を、単独で、または他の実施例の特徴および／または要素と組み合わせて使用できる。添付の特許請求の範囲は、これらすべての変形例や実施例を、その趣旨を逸脱することなくカバーすることを意図するものであることは、容易に理解できる。
【００７２】
添付図面は明細書の一部を形成し、明細書との関連において理解されるべきであり、種々の図において類似の参照番号は類似の部分を示すために用いられる。添付図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】合成１２−ｍｅｒＤＮＡ二本鎖に結合したＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８の構造を示す図である。
【図２】ＤＮＡプローブ上のリンカーに結合するよう開発されたＨ３３２５８ｎｏ反応性類似物の構造を示す図である。
【図３】マイクロ流体装置内を流れる２つの流体の相互作用を示す図である。
【図４】蛍光性マイナーグルーブバインダ（ＭＢ）を連結させたいくつかのアミン改質表面を示す図である。
【図５】反応基をともなう蛍光性ＭＢの合成を示す図である。
【図６】有機溶液中における塩化シアヌルによるスライドのアミン改質ガラス表面の活性化を示す図である。
【図７】この発明に使用して好適なマイクロ流体装置の実現可能なチャンバー設計を示す図である。
【図８】この発明に使用して好適なマイクロ流体カードの正面図である。
【図９】マイクロ流体カードをその層を分離して示す分解図である。
【図１０】図９のカードの使用時の連続事象を示す正面図である。
【図１１】結合したヘキシルアミンリンカーを伴う蛍光性Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の合成を説明する図である。
【図１２】３６０ｎｍで励起された、ＢＢ−ＮＨ２分子 ｖｓ ＢＢ−ＯＨの蛍光性を示す図である。
【図１３】４つの異なるビスベンズイミド表面の４６０ｎｍの蛍光性を示す図である。
【図１４】ガラスおよびプラスチックカバースリップに対して付与されたＤＮＡの量に対する結合されたＤＮＡの量を示す図である。
【符号の説明】
【００７４】
５０ 第１の流れ
５２、５８ 小さな粒子
５４ 血液全体
５６ 第２の流れ
６０ 純粋な溶液
６２ 共通チャネル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体入口ポートと、
上記流体入口ポートに接続されたＤＮＡ結合チャネルと、
流体出力ポートとを有し、
上記ＤＮＡ結合チャネル内の少なくとも１つの表面の少なくとも一部が、ＤＮＡが特異的に上記表面に結合するような結合試薬により改質されたことを特徴とするマイクロ流体システム。
【請求項２】
上記結合チャネルは、基本的に矩形の断面を有し、頂壁、底壁、および２つの側壁を有する請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
上記結合チャネルは頂壁および底壁の間に２００マイクロメータの距離を有し、結合試薬により改質された上記ＤＮＡ結合チャネル内の上記表面は上記頂壁または上記底壁、または上記頂壁および上記底壁に位置する請求項２記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
上記流体入口ポートは、ピペット先端用の圧縮シールを実現する請求項１記載の装置。
【請求項５】
少なくとも１つの壁は他の壁と異なる材料で製造される請求項２記載の装置。
【請求項６】
上記少なくとも１つの壁はガラスで製造される請求項２記載の装置。
【請求項７】
上記ＤＮＡ結合チャネルに結合された廃棄物貯蔵チャネルをも有する請求項２記載の装置。
【請求項８】
上記ＤＮＡ結合チャネルに結合された生成物ウェルをも有する請求項２記載の装置。
【請求項９】
上記ＤＮＡ結合チャネルに結合された生成物ウェルをも有する請求項２記載の装置。
【請求項１０】
上記装置は、上記装置内に含まれる染料分子を励起する光、および、上記染料分子から発光される光を透過させることができる材料から製造される請求項１記載の装置。
【請求項１１】
９６ウェルプレートリーダー中での配置および読み出しに適合化されたサイズおよび幾何形状を有する請求項１記載の装置。
【請求項１２】
ポリマー性ＤＮＡおよりＲＮＡの濃度を決定するための、固定化された核酸（ＮＡ）指示蛍光分子を有する組成物。
【請求項１３】
蛍光測定用の所望の光学特性を具備するＮＡ指示分子を結合可能な基体をさらに有する請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
上記ＮＡ指示分子は二重螺旋ＤＮＡまたは単一螺旋ＤＮＡに特異的である請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
上記ＮＡ指示分子はベンズイミダゾール染料（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）およびＤＮＡターゲットシアニン染料（ビス−シアニン染料）を含むグループから採用される請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
上記ＮＡ指示分子はＲＮＡに対して特異的であり、チアゾールオレンジを含むグループから採用される請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
流体入口ポートと、
上記流体入口ポートに接続されたＤＮＡ結合チャネルと、
流体出力ポートとを有し、
上記ＤＮＡ結合チャネル内の少なくとも１つの表面の少なくとも一部が、ＤＮＡが特異的に上記表面に結合するような結合試薬により改質され、上記結合試薬はポリマー性ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度を決定するための、固定化された核酸（ＮＡ）指示蛍光分子を有することを特徴とするマイクロ流体システム。
【請求項１８】
核酸を単離し精製するための未改質の表面をも有する請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
上記基体は、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、金属、または他のポリマー材料からなるグループから採用される請求項１３記載の組成物。
【請求項２０】
上記基体は、上記ＮＡ指示蛍光分子中のアミド基と結合可能な活性化エステル基またはシアヌル酸残余のような求電子基により活性化されたガラススライドを有する請求項１３記載の組成物。
【請求項１】
流体入口ポートと、
上記流体入口ポートに接続されたＤＮＡ結合チャネルと、
流体出力ポートとを有し、
上記ＤＮＡ結合チャネル内の少なくとも１つの表面の少なくとも一部が、ＤＮＡが特異的に上記表面に結合するような結合試薬により改質されたことを特徴とするマイクロ流体システム。
【請求項２】
上記結合チャネルは、基本的に矩形の断面を有し、頂壁、底壁、および２つの側壁を有する請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
上記結合チャネルは頂壁および底壁の間に２００マイクロメータの距離を有し、結合試薬により改質された上記ＤＮＡ結合チャネル内の上記表面は上記頂壁または上記底壁、または上記頂壁および上記底壁に位置する請求項２記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
上記流体入口ポートは、ピペット先端用の圧縮シールを実現する請求項１記載の装置。
【請求項５】
少なくとも１つの壁は他の壁と異なる材料で製造される請求項２記載の装置。
【請求項６】
上記少なくとも１つの壁はガラスで製造される請求項２記載の装置。
【請求項７】
上記ＤＮＡ結合チャネルに結合された廃棄物貯蔵チャネルをも有する請求項２記載の装置。
【請求項８】
上記ＤＮＡ結合チャネルに結合された生成物ウェルをも有する請求項２記載の装置。
【請求項９】
上記ＤＮＡ結合チャネルに結合された生成物ウェルをも有する請求項２記載の装置。
【請求項１０】
上記装置は、上記装置内に含まれる染料分子を励起する光、および、上記染料分子から発光される光を透過させることができる材料から製造される請求項１記載の装置。
【請求項１１】
９６ウェルプレートリーダー中での配置および読み出しに適合化されたサイズおよび幾何形状を有する請求項１記載の装置。
【請求項１２】
ポリマー性ＤＮＡおよりＲＮＡの濃度を決定するための、固定化された核酸（ＮＡ）指示蛍光分子を有する組成物。
【請求項１３】
蛍光測定用の所望の光学特性を具備するＮＡ指示分子を結合可能な基体をさらに有する請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
上記ＮＡ指示分子は二重螺旋ＤＮＡまたは単一螺旋ＤＮＡに特異的である請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
上記ＮＡ指示分子はベンズイミダゾール染料（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）およびＤＮＡターゲットシアニン染料（ビス−シアニン染料）を含むグループから採用される請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
上記ＮＡ指示分子はＲＮＡに対して特異的であり、チアゾールオレンジを含むグループから採用される請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
流体入口ポートと、
上記流体入口ポートに接続されたＤＮＡ結合チャネルと、
流体出力ポートとを有し、
上記ＤＮＡ結合チャネル内の少なくとも１つの表面の少なくとも一部が、ＤＮＡが特異的に上記表面に結合するような結合試薬により改質され、上記結合試薬はポリマー性ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度を決定するための、固定化された核酸（ＮＡ）指示蛍光分子を有することを特徴とするマイクロ流体システム。
【請求項１８】
核酸を単離し精製するための未改質の表面をも有する請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
上記基体は、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、金属、または他のポリマー材料からなるグループから採用される請求項１３記載の組成物。
【請求項２０】
上記基体は、上記ＮＡ指示蛍光分子中のアミド基と結合可能な活性化エステル基またはシアヌル酸残余のような求電子基により活性化されたガラススライドを有する請求項１３記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５３２４８５（Ｐ２００８−５３２４８５Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５３２１４（Ｐ２００７−５５３２１４）
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００２７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８１３２４
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＲＥＸ
【出願人】（５０７２５３２２２）
【出願人】（５０７２５３２３３）
【出願人】（５０７２５３２１１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００２７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８１３２４
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＲＥＸ
【出願人】（５０７２５３２２２）
【出願人】（５０７２５３２３３）
【出願人】（５０７２５３２１１）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]