ニューカッスル病ウイルス感染性クローン、ワクチンおよび診断アッセイ
【課題】 本発明はクローン化した完全長ｃＤＮＡから感染性ニューカッスル病ウイルスを完全に生成させる方法、および前記方法により生成した、また前記方法から誘導したワクチンおよび診断アッセイに関する。
【解決手段】 該方法は遺伝子修飾によりＮＤＶゲノムを修飾する可能性を提供し、突然変異、欠失、および／または挿入の導入を可能とする。該方法はＮＤＶの毒性を修飾するために使用し得るものであり、それによって高い特性の新しい弱毒化生ワクチンを生成させることができる。該方法はＮＤＶの抗原性構造を修飾するために使用し得るものであり、したがって、ＮＤＶ野生株と血清学的に識別し得る生菌ＮＤＶマーカーワクチンの生成を可能とする。
【解決手段】 該方法は遺伝子修飾によりＮＤＶゲノムを修飾する可能性を提供し、突然変異、欠失、および／または挿入の導入を可能とする。該方法はＮＤＶの毒性を修飾するために使用し得るものであり、それによって高い特性の新しい弱毒化生ワクチンを生成させることができる。該方法はＮＤＶの抗原性構造を修飾するために使用し得るものであり、したがって、ＮＤＶ野生株と血清学的に識別し得る生菌ＮＤＶマーカーワクチンの生成を可能とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は家禽のニューカッスル病のウイルスの感染に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、死に到る、最も多様な鳥類伝染病原菌の一つである。ニューカッスル病は明らかに新しい病気として、いくつかの地理的に異なる場所でほとんど同時期に発生し、しかもその病気のタイプと重篤度が非常に多様であることから、学名を付けるに当たりいくつかの問題を引き起こした。
【０００３】
この病気は、偽性鶏ペスト、偽性家禽ペスト、鳥類ペスト、鳥類ジステンパー、鳥類気脳炎と命名されている。この病気が重大となったのは、主として、２０世紀において家禽産業が、各国間における集約的な取引に依存する非常に効率のよい国際的産業に発展したためである。
【０００４】
ニューカッスル病は、１９２６年にジャワ（インドネシア）およびタイン川上流のニューカッスル（イギリス）で最初に発生したと一般的に推測されている（Kraneveld、１９２６(非特許文献１）；Doyle、１９２７（非特許文献２））。ニューカッスル病という名前は、他の病気と間違われる可能性がある記述的な名前を避け、仮の名前としてドイルによって作り出された。後に、重篤度において劣る他の病気が、ＮＤＶと見分けがつかないウイルスが原因であることが明らかとなった。アメリカにおいては、比較的軽度の呼吸器系の病気が鳥類気脳炎と名付けられ、ＮＤＶが原因であることが示された（Beach、１９４４（非特許文献３））。２，３年以内に、鶏において非常に軽度の病気の原因となる、または、病気の原因とならない、多くのＮＤＶの単離が世界中で行われた。
【０００５】
以下の方法は、この病気の拡大に関係するものであった：１）生活している鳥、野生の鳥、猟用鳥類、レース用鳩、商用家禽の移動、２）人間や備品の移動、３）家禽製品の移動、４）風媒による拡大、５）家禽の餌の汚染、６）水の汚染、７）不活性化が不完全な、または、異種起源のワクチン。ＯＩＥによれば、ニューカッスル病は、生後１日のひよこにおける大脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）が０．７またはそれ以上をもつ鳥類パラミクソウイルス血清型１（ＡＰＭＶ−１）のウイルスが原因の家禽の病気である。悪性のウイルスは、残基１１７におけるＦ２タンパク質およびＦ（フェニルアラニン）のC末端、Ｆ１タンパク質のＮ末端における多数の基本的アミノ酸の存在によって確認することも出来る。このアミノ酸配列を実証できなければＩＣＰＩテストによる特徴づけを必要とするであろう。「家禽」と言う語は、繁殖用、消費用の肉、卵の生産用、狩猟のための供給補充用として、飼育されている鶏、七面鳥、ホロホロ鳥、アヒル、がちょう、うずら、鳩、キジ、やまうずら、走鳥類などを言う。
【０００６】
アレクサンダー（Alexander）（１９８８）によれば、ニューカッスル病を初めて認識してから、この病気の三つの動物疫病汎流行があった。第一は、この病気の初期の発生にあたるもので、東南アジアで起こったと思われる。１９２６年にイギリスで発生したような孤立した突然の発生は、この病気が主としてアジアを経てヨーロッパへゆっくり移動する前に起こった思いがけないものであった。
【０００７】
第二の流行は、１９６０年代の後半に中東ではじまったようであり、１９７３年までにはほとんどの国々に広がっていた。第二の流行がより急速に広がったのは、おそらく、相当な国際的な取引となった家禽産業の大変革によるものであった。
【０００８】
第三の流行は、主として、鳩などの飼われている鳥に影響した（Vindevogel and Duchatel、１９８８（非特許文献４））。この病気は見たところ１９７０年代後半に中東で起こったようである。１９８１年までに、ヨーロッパに広がり、その後、主として、競技やショーでの鳥間の接触の結果として、および、かかる鳥の国際的取引の結果として急速に世界の各地に広がった。
【０００９】
今日もなお、ニューカッスル病は、アジア、アフリカ、アメリカおよびヨーロッパの多くの国々において広範囲に広がっている。オセアニアの国々だけは比較的この病気が起こらないようである（Spradbrow、１９８８（非特許文献５））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kraneveld，F．C．（1926）A poultry disease in the Dutch East Indies．Ned．Indisch Bl．Diergeneesk．38：448-450
【非特許文献２】Doyle,T.M.(1927)A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus.J.Comp.Pathol.Ther.40:144-169
【非特許文献３】Beach,JR.(1944)The neutralization in vitro of avian pneumoencephalitis virus by Newcastle disease immune serum. Science 100:361-362.
【非特許文献４】Vindevogel and Duchatel、1988
【非特許文献５】Spradbrow,P.B(1988)Geographical distribution.In D.J.Alexander(ed),Newcastle Disease,pp.247-255.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＮＤＶは、Mononegavirales目、パラミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、Rubulavirus属に属している。通常、鳥類パラミクソウイルスタイプ−１と呼ばれているＮＤＶは別として、鳥類パラミクソウイルスタイプ−２から−９と称される他の８つの血清型は、赤血球凝集抑制テストや血清中和テストにおいて、それらの抗原の関係性に基づいて区別することが可能である（Alexander、１９９３）。
【００１２】
血清学的グループ分けの一致にもかかわらず、異なる血清型のウイルス間でいくつかの交差した関係がある。
【００１３】
NDV遺伝子は、陰性極性で、ウイルスタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ遺伝子はおよそ大きさでは１５，２００ヌクレオチドであり、以下の遺伝子産生物（遺伝子ＲＮＡの３‘末端から５’末端に記録されている）をコードしている：ヌクレキャプシドタンパク質（ＮＰ）、りんタンパク質（Ｐ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）、融合タンパク質（Ｆ）、赤血球凝集ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、そして大きなポリメラーゼタンパク質（Ｌ）（Chamber et al、１９８６年）。
【００１４】
このＲＮＡは、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質との複合体で、リボ核酸キャプシド粒子（ＲＮＰ）を形成し、該RNPは、内部にＭタンパク質が並んでいるエンベロープによって囲まれている。このエンベロープは、宿主の吸着と侵入に関係するＦとＨＮタンパク質を含んでいる。
【００１５】
ＮＤＶの複製は、他のパラミクソウイルス属によって使用される方法と類似している。最初の段階は、ＨＮタンパク質によって媒介される宿主受容体へのウイルスの吸着である。宿主細胞膜とウイルスエンベロープとの融合は、ＨＮとＦタンパク質の両方の働きに依存しており、ウイルスの複製される細胞質にＲＮＰが放たれる結果となる。
【００１６】
ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＰの一部である）は、mＲＮＡとして働き、ウイルスタンパク質合成のための細胞の翻訳部分に使用される相補的な転写物を産生する。ＮＰタンパク質の蓄積により、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、転写から複製にスウィッチングされ、結果として、完全長のゲノムおよび相補ゲノムＲＮＡ分子の合成がなされる。
【００１７】
新たに形成されたＲＮＰは、細胞原形質膜に蓄積されているF、HNタンパク質、およびMタンパク質の働きによって細胞膜において包膜される。新たに形成されたウイルス粒子は、出芽メカニズムによって、感染した細胞から放出される。ＮＤＶの複製についてのより詳細な情報については、Pieeples（１９８８年）を参照。パラミクソウイルス属の分子生物学についての最近の論文については、LambとKolalofsky（１９９６年）を参照。
【００１８】
商用家禽（すなわち、鶏、七面鳥、きじ、ほろほろ鳥、アヒル、ガチョウ、はと）を別にすれば、とらわれていたり、半家禽状態であったり、渡り鳥である水鳥を含む野生の鳥の多くは、ＮＤＶに感染しやすく、主要な感染源となっているかもしれない（Kaleta and Baldauf、１９８８）。
【００１９】
ＮＤＶ株の病原性は、宿主によってかなり異なっている。最も抵抗のある種は、水生の鳥のようであり、一方、最も感染しやすい鳥は、一時的に、または永久的に群れを作る群居する鳥である。鶏は最も感染しやすいが、しかしながらアヒルやガチョウは、感染するかもしれないが、鶏にとっては死に到るウイルス株であったとしても、臨床的な兆候をほとんど、または、まったく示さない。
【００２０】
ニューカッスル病は、ウイルスの異なる単離体と菌株が、この病気の大きな重篤度の差をもたらしているという点において複雑な病気である。ビヤード（Beard）とハンソン（Hanson）（１９８４年）は、ＮＤＶ株と単離体を、十分に感染しやすい鶏に見られるうる病気の兆候に関係する異なる病理型にグループ分けした：１）内臓に多量出血性の損傷が目立つ急性の致死感染を引き起こす、内臓向性の速現性ＮＤＶ、および、呼吸器や神経系の兆候が先行し、内臓損傷は起こらない、高い致死率の神経向性の速現性ＮＤＶ、２）いくらかの鳥類に低致死率で急性の呼吸系の病気や神経系の兆候を示す亜病原性のＮＤＶ、３）軽度の、または不顕性の呼吸系感染を示す長い潜伏期間をもつＮＤＶ、または腸器官系において主に複製するように思われる無毒性のウイルスである無病候性の腸ＮＤＶ。さまざまなグループと関連している、それらの兆候の間にあるいくつかの重複が報告されている。
【００２１】
ウイルスは、呼吸器系や腸器官、または目を通って体内に侵入してくる。気管においてウイルスは繊毛運動によって広がり、そして、細胞から細胞へ広がっていく。最初に入ってきた場所における初期の増殖の後、ウイルス血症のエピソードの間、ウイルスは脾臓、肝臓、腎臓、そして肺へと運ばれる。ウイルスのいくつかの株は、病気の兆候が明らかになる前に鳥たちが死んでしまうかもしれないほど非常に急速に、肝臓や腎臓のような必須器官に達する。
【００２２】
ほとんどのウイルスは、有意な量の抗体が存在するようになる前に、血液を通って、中枢神経系に到達する。オウム類において起こっていると推測される長期間の保菌状態は、家禽産業にとっては恐ろしい存在となる可能性がある。長い潜伏期間を有するウイルスと速現性のウイルスの両方を長い間保菌する状態は、鶏にも存在しうる（Heuschele and Easterday、１９７０）。
【００２３】
ＮＤＶの複製の間、前駆体の糖タンパクFOがF1とF2に切断され、子孫ウイルスが感染性となることが必要である（Rott and Klank、１９８８年）。この翻訳後の切断は宿主プロテアーゼによって媒介される。切断が行われなければ、非感染性のウイルス粒子が産生され、ウイルスの複製は進行し得ない。伝染力の強いウイルスのＦ０タンパク質は、広範囲のプロテアーゼによって切断可能であるが、しかしながら、感染力の低いウイルスのＦ０タンパク質は、その感受性に限界があり、これらのウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるいくつかの型の宿主細胞内でのみ増殖することができ、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは増殖できない。
【００２４】
長い潜伏期間を持つウイルスは、呼吸器系や腸器官のようにトリプシンに似た酵素のある領域において複製されるのみであるのに対し、感染力の強いウイルスは、組織や器官の範囲で複製可能であり、致命的な全身感染という結果となる。
【００２５】
Ｆ０前駆体のアミノ酸配列は、低い感染力のウイルスは、Ｆ２鎖とＦ１鎖をつなげている単一のアルギニン（Ｒ）を持っていることを示し、それに対し、感染力の強い株は、切断の部位で、Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ−Ｆなどの２つのペアを形成する付加的必須アミノ酸を有していることを示している。さらに、感染力の強い株のＦ２鎖は、通常、フェニルアラニン残基で始まっているが、感染力のない株のＦ２鎖は、通常、ロイシンで始まっている。
【００２６】
ＮＤＶのいくつかの株の場合は、ＨＮタンパク質も、生物学的に活性となるには切断を必要とする前駆体として産生される（ガルテン その他 １９８０年、ミラー その他 １９８８年）。
【００２７】
ＦおよびＨＮタンパク質の切断可能性に加えて、ウイルスの他の要因も病理型に寄与している可能性がある。マダンスキー（Madansky）およびブラット（Bratt）（１９７８、１９８１ａ、１９８１ｂ）は、転写と翻訳の変化は、ウイルスの増殖と細胞間の拡大、および／または細胞変性を調節可能であることを示した。
【００２８】
ＮＤＶの感染に対する最初の免疫応答は、細胞媒介であり、生ワクチン株で感染後、２、３日で検出可能である。これはおそらく、測定可能な抗体応答が見られる前に、ワクチン接種された鳥に、対抗に対する防御が早くから記録されていたことを示している（Gough and Alexander、１９７３）。
【００２９】
感染後約一週間で、循環する抗体は、再感染から宿主を保護するであろう。初期の段階で、ＩｇＭが関与し、ＩｇＧが続く。力価と防御は約三週間後にピークに達し、ブースティングがなければ次第に低下していく。これは、年をとった鳥に対しては、再びワクチンを接種させることが必要であることを意味している。
【００３０】
呼吸器系のルートで投与された生ワクチンのみが、血清と同様にすべての粘膜の表面で抗体を刺激する。不活性ワクチンは、筋肉内ルートで投与されたときでさえ、血清抗体が高濃度であるにもかかわらず、呼吸器官において局部の抵抗を誘発しない。
【００３１】
このことは、局所免疫性と体系的免疫性の両方を誘発させるには、上部呼吸器官にウイルス抗原を与えることが可能な生ワクチンが重要であることを強調している。小さな小滴が下部呼吸器官の内部にしみとおり、それによって、主に体液性免疫応答を刺激し、一方、粒の粗い小滴が、上部呼吸器官において局部免疫を刺激する。
【００３２】
したがって、広範囲の小滴サイズによるエーロゾルが、全体として最良の局所的および体液性免疫を生じる。
【００３３】
しかし、高レベルの抗体価を生じる現行ワクチンにより徹底的に予防接種しているにもかかわらず、ウイルスは今なお粘膜表面から回収されることに留意すべきである。
【００３４】
米国ではニューカッスル病の同定が不活化ワクチンを使用させることになった（Hofstad、１９５３）。地方病ウイルスのある種のものが極めて軽度の病気を発病させるという観察が、亜病原性生ワクチン・ロアキン（Roakin）の開発に先ず帰着した（Beaudette et al.、１９４９）が、続いてより緩和なヒッチナー（Hitchner）Ｂ１株（Hitchner and Johnson、１９４８）およびラソタ（LaSota）株(Goldhaft、１９８０）の開発に至り、それらが現在最も広く使用される生ワクチンである。
【００３５】
ＮＤＶ生ワクチンは２つのグループ、長潜伏期性および亜病原性に分けることができる。亜病原性株はその強い毒性のために鳥類の二次予防接種についてのみ適している。免疫応答性は生ワクチンの病原性が増大するにつれて増大する。したがって、重篤な反応なしに所望レベルの防御を得るために、徐々に毒性の強くなるワクチンを連続的に使用するか、または生ワクチンに続いて不活化ワクチンを使用することからなる予防接種プログラムが現在使用されている。
【００３６】
生ワクチンの主たる利点の一つは、該ワクチンが安価な集団投与技法により投与し得ることである。共通した投与方法は飲料水によることである。しかし、飲料水による投与は、過剰の熱や光によって、また、飲料水中の殺ウイルス性不純物により、ウイルスが不活化されている可能性があるので、注意深くモニターしなければならない。
【００３７】
多数のトリを短時間に予防接種するのが容易なために、スプレーおよびエーロゾルによる生ワクチンの集団投与もまた非常にポピュラーである。粒子が生じる条件を制御することによって適正な粒子サイズを得ることが重要である。
【００３８】
現在使用されている生ワクチンは幾つかの欠点を有する。ワクチンは今なお環境条件と複雑な感染の存在に左右されて病気の徴候を引起すことがある。それ故に、一次予防接種では非常に穏やかなウイルスを使用することが重要であり、結果として、複数回の予防接種が通常必要とされる。さらに、母性誘導抗体が長潜伏期性生ワクチンによる一次予防接種の成功を妨げる可能性がある。
【００３９】
不活化ワクチンは通常感染性尿膜腔液から製造されるが、該尿膜腔液はホルマリンまたはベータプロピオラクトンで処理してウイルスを殺し、適当なアジュバントと混合する。不活化ワクチンは筋肉内または皮下注射により投与する。不活化ワクチンは製造にも投与にも費用がかかる。
【００４０】
しかし、不活化油性乳剤ワクチンは生ワクチン程に母仔免疫の悪影響を受けず、日齢のヒナに使用することができる。不活化ワクチンの利点は予防接種したトリの有害反応のレベルが低いこと、防御抗体のレベルが高いこと、そして防御期間の長いことである。上記ワクチンのいずれもが野生型ＮＤＶを血清学的に識別し得ない。
【００４１】
組換えウイルス・ワクチンの開発は家禽産業における多年にわたる興味の対象であった。この概念は対象疾病作因の決定的な免疫化エピトープ遺伝子をベクターウイルスの非必須遺伝子に挿入することである。このように、組換えウイルスによる予防接種はベクターウイルスならびに対象疾病作因双方に対し免疫化するに至る。
【００４２】
数種のウイルスが家禽用の有力な生菌ウイルスワクチンとして評価されている。最も注目された鳥類ウイルスは鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）と七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。鶏痘ウイルスは大型のゲノムをもつＤＮＡウイルスであり、したがって、外来遺伝子を担持する余地をもつと考えられる。
【００４３】
弱毒化すると、ＦＰＶは臨床的疾病を引き起こさず、一般にニワトリのワクチンとして使用される。ＨＶＴもＤＮＡウイルスであり、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）族の血清型として分類される。ＨＶＴはニワトリに対しては非病原性であり、しかもＭＤＶに対して交差防御的であり、一般にマレック病に対しニワトリを予防接種するために使用する。
【００４４】
ニューカッスル病に対する防御は組換えＨＶＴまたはＦＰＶワクチンを使用することにより誘発し得ることが示されている（Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al. 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990)。
【００４５】
しかし、ＮＤＶ Ｆタンパク質またはＦおよびＨＮタンパク質双方を発現するような組換えワクチンによる予防接種に続くニューカッスル病に対する防御の始まりは、常套の生菌または不活化ＮＤＶワクチンでの予防接種に続く防御の始まりよりも大幅に遅延するが、その理由は恐らく組換えワクチンが、組換えワクチンにより発現されるＮＤＶタンパク質上に見出されるエピトープ以外に、広範囲の十分に免疫的なスペクトルを有し抗原的に関連するＮＤＶエピトープを提供しないか、または免疫系に適切に提示されないからである。
【００４６】
さらに、局所的（粘膜、呼吸器または腸内の）防御は組換え体を接種したトリにおいて有効に誘発されなかった。これは決定的な欠点であるが、その理由は呼吸器病に対する一次予防接種に使用したワクチンが、野外条件で飼育したニワトリに感染する毒性ウイルスの感染と伝播を防御する局所免疫を誘発しなければならないからである。
【００４７】
宿主を防御し得るＮＤＶに対する抗体は、ウイルス中和試験により測定することができる。しかし、中和応答は赤血球凝集抑制（ＨＩ）応答と平行していると思われるので、後者の試験は多くの場合、防御応答、特に予防接種後の応答を評価するために用いる。
【００４８】
ＦおよびＨＮタンパク質双方に対する抗体はＮＤＶを中和し得る。しかし、Ｆタンパク質に対する抗体は生体内および生体外試験においてＨＮに対する抗体よりもより顕著な中和反応を誘発すると思われる（Meulemans et al., 1986)。
【００４９】
トリの血清中にＮＤＶに対する特異抗体が存在したとしても、ＮＤＶの感染株に関する情報は僅かであり、したがって、診断的価値は限られる。
【００５０】
殆どの国で鳥類の長潜伏期性ＮＤＶ株が偏在すること、また、少なくとも血清学的に野生型ＮＤＶと区別し得ない生ワクチンが殆ど普遍的に使用されていることは、単に感染したことを証明することが適用すべき抑制手段についての正当な理由にはなっていないことを意味する。野外での疾病がウイルスの真の毒力についての信頼し得ない尺度である可能性があるので、発見されるウイルスについてさらに特性化することが必要である。
【００５１】
現在、感染株の特性化を可能とするニューカッスル病診断の唯一の方法は、ウイルスの単離と、引続いての病原性試験である。現在３つの生体内試験法がこの目的に使用される；１）卵での平均死亡時間（ＭＤＴ）；２）１日齢ヒナの脳内病原性指標（ＩＣＰＩ）；３）６週齢のトリにおける静脈内病原性指標（ＩＶＰＩ）。
【００５２】
これらの試験法は多くの欠点、例えば、動物の入手可能性、乏しい再現性、および比較的長期の試験などに悩まされている。最後ではあるが大事なことは、これらの試験法がワクチンを接種したまたは野生型株を感染させた家禽類の簡単な血清学的同定を許さないことである。
【００５３】
生体内試験法に替わり得るものとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が毒性分離株と非毒性分離株との間を区別するために成功裏に使用され
ている（Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997)が、しかし、さらに血清学的な区別は不可能である。
【００５４】
家禽類の飼育とその製品の交易は今や国際ベースで、多くの場合多国籍企業の管理下に組織化されている。ニューカッスル病の脅威はかかる交易上の顕著な抑制となっていることを示している。
【００５５】
ニューカッスル病の成功裏の抑制は、すべての国が発生を報告するようになったときにのみ取り組むことになろう。しかし、国際間の取決めは異なる国での疾病監視の程度に大きな違いがあるために単純ではない。ある国では予防接種をせず、如何なる形状であってもＮＤＶを家禽類に取込ませようとしないが、その理由は予防接種した家禽が野生型のＮＶＤに感染した家禽と区別し得ないからである。
【００５６】
別の国では特定の生ワクチンの使用のみを許可しており、他のワクチンは受け入れ難い毒性をもつと考えている。さらに他の国では循環型の毒性の高いウイルスが存在し続けており、明白な病気が予防接種により隠蔽されるという理由で、そのままでは認められない。
【００５７】
多くの国では、起こり得るニューカッスル病発生を抑制するための法律が存在する。国家的抑制手段は持ち込みと拡散を防止することに向けられる。殆どの国が家禽製品、卵、および生きた家禽の商取引に制限を設けている。殆どの国が取分けオウム病鳥類の輸入に際しての検疫手続を確立している。
【００５８】
一部の国では感染した鳥類の強制的屠殺、その接触物、および産物について根絶政策を適用している。他の国は発生がなくても鳥類の予防的接種を要求し、一方、一部の国は緩衝帯を確立するために発生地周辺で包囲種痘の政策を採っている。
【００５９】
明らかなことは、ニューカッスル病の制御に使用し得るよりよいワクチンとよりよい診断方法が必要なことである。生ワクチンの集団投与に際し、個々のトリが受ける用量に大きな差異のあることと、また、若いヒナでの母仔免疫レベルに変動のあることのために、生ワクチンによる接種後反応が避けられない。このことが予防接種を強制される国における農夫の主要関心事の一つである。
【００６０】
さらに、多くのワクチンが分集団の混合物である。クローン化する場合、これらの分集団はその免疫原性および病原性において互いに有意に異なる可能性がある（Hanson, 1988)。
【００６１】
しかし、現在使用されている生ワクチンおよび不活化ワクチンの最も大きな欠点は、予防接種を受けた動物が現在用いられているスクリーニング技法、例えば、赤血球凝集抑制またはウイルス中和試験により感染した動物と区別し得ないという事実である。
【００６２】
毒性のある野生ウイルスが今なお予防接種した群れに広がる可能性があるが、その理由は病気の症状が予防接種により隠蔽されるからである。生体内技法によりウイルスの単離と毒性の特性化が大規模で実行不能である以上、血清学的に野生ウイルスと識別し得る新しい効果的な弱毒化生ワクチンが是非とも必要である。
【００６３】
ＮＤＶマーカーワクチンと呼ぶ（また、診断法とキットを伴う）かかるワクチンは、抗原性と関連するＮＤＶエピトープの最大限可能な免疫スペクトルを提供すべきものであり、かつ、野生型ＮＤＶと血清学的にまったく異なるべきであるが、今なお入手し得ない。
【課題を解決するための手段】
【００６４】
本発明は遺伝子修飾により鳥類のパラミクソウイルスゲノムを修飾する方法を提供し、遺伝子修飾した鳥類のパラミクソウイルスおよび鳥類パラミクソウイルス・マーカーワクチンを提供する。
【００６５】
現代分子生物学技術の出現が、マイナス鎖ウイルスを含む多くのＲＮＡウイルスの遺伝子修飾を可能としている。この技法はしばしば“逆遺伝”と言われる。先ず、ウイルスＲＮＡの（完全長）ｃＤＮＡコピーを提供し、それに続いてこのＤＮＡを感受性細胞内で転写して、感染性ＲＮＡを産生させ、それが再び感染性ウイルス粒子を産生するようにする。
【００６６】
一般に、標準的な分子生物学技術によりこれまでｃＤＮＡについてなされた修飾により、遺伝子的に修飾したＲＮＡウイルスを得ることが可能である。しかし、このことはＮＤＶまたは鳥類パラミクソウイルスについて具体化されたことはなく、鳥類パラミクソウイルスの複製事象研究のために、鳥類パラミクソウイルス・ゲノム・フラグメントのミニゲノム・フラグメントまたはプラスミドを生成させ、それによって感染性のコピーウイルスをどのように構築すべきかについての理解を得ることが、未だに可能ではない。
【００６７】
驚くべきことに、本明細書においては、当該鳥類パラミクソウイルスのゲノムが今までに配列決定されたすべてのパラミクソウイルス・ゲノムの中で最も小型であるということをこの度完全に確立したが、取分けＮＤＶゲノムの５’末端配列が、以前に確立されたもの、また、他のパラミクソウイルス科と比較して期待されたものよりもかなり長い。本発明はこの度初めて完全な鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの配列を提供し、かつ、かかるウイルスの完全長またはミニゲノム長のｃＤＮＡを提供する。
【００６８】
本発明は、鳥類パラミクソウイルスの感染性コピー生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなる鳥類パラミクソウイルスｃＤＮＡをこのように提供するが、当該ｃＤＮＡは、好ましくは完全長のｃＤＮＡを含んでなる。しかし、本発明はまた、鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなるｃＤＮＡを提供するが、それによって複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノムの生成を可能とする。かかるミニゲノムは、有利にはＲＮＡの転写および／または修飾核酸配列からのタンパク質発現に使用し得る。本発明はニューカッスル病ウイルスから少なくとも部分的に誘導される本発明のｃＤＮＡを提供するが、例えば、その場合の当該ニューカッスル病ウイルスは長潜伏期性ウイルスであり、好ましくは、ラソタ（LaSota)株ＡＴＣＣ ＶＲ−６９９などのワクチン株から誘導される。
【００６９】
本発明はさらに核酸における削除、挿入、突然変異、復帰突然変異などの修飾を含む、本発明に従ったｃＤＮＡを提供する。例えば、当該修飾が修飾プロテアーゼ切断部位をエンコードする核酸を含むｃＤＮＡが、例えば、当該切断部位が融合（Ｆ）タンパク質のプロテアーゼ切断部位であるｃＤＮＡが提供される。
【００７０】
さらに他の実施の形態において、本発明は、当該修飾がハイブリッド・ウイルスタンパク質、例えば、本発明の実験の部に記載したようなハイブリッド赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質などをエンコードする核酸を含む、本発明によるｃＤＮＡを提供する。本発明はまた、当該修飾がマトリックス（Ｍ）タンパク質などのウイルスタンパク質をエンコードする核酸において欠失を含む、本発明によるｃＤＮＡを提供する。
【００７１】
本発明はさらに異種抗原をエンコードする核酸をさらに供給する本発明のｃＤＮＡを提供するが、好ましくはその場合の当該抗原は家禽の病原、例えば下記のごとき病原から由来する。本発明によるｃＤＮＡから得られるＲＮＡまたはそれから由来するタンパク質もまた提供される。
【００７２】
近年、多くの非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスが完全に特性化され、当該ウイルスのクローン化ｃＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることにより完全に感染性のウイルスを生成させることが可能となり、それらのゲノムの複製と発現に関する基礎研究が最高潮に達した（Conzelmannによる概説、１９９６）。
【００７３】
今日まで、非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスの感染性ウイルスは、例えば、狂犬病ウイルス（Schnell et al., 1994, Conzelmann; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、（Schnell et al., 1994; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、水疱性口内炎ウイルス（Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995)、センダイウイルス（Garcin et al., 1995)、麻疹ウイルス（Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; ＥＰＯ７８０４７５Ａ１）、ヒト呼吸器シンシチウム・ウイルス（Collins et al., 1995)、牛疫ウイルス（Baron and Barrett, 1997)、およびヒト・パラインフルエンザ・ウイルス３型（Hoffman and Banerjee, 1997, Conzelmann; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、（Schnell et al.,1994; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）のクローン化ｃＤＮＡから生成させていた。
【００７４】
しかし、上記の感染性コピーウイルスのすべては、種々起源の宿主、組織または細胞において生体内ならびに生体外双方において増殖可能であり、適切な細胞系において容易なｃＤＮＡトランスフェクションと感染性ウイルス粒子の複製および生成を可能とする。
【００７５】
かかる可能性はＮＤＶについては存在せず、ワクチンを供給し得る長潜伏期性ＮＤＶ株については確実に存在しない。かかるＮＤＶ株の毒性は広範な細胞内で複製するその能力と関連しており、毒性株は生体外および生体内で容易に複製可能であるが、一方、ワクチン株は生体内のみで複製し得るという事実に反映されている。
【００７６】
このように、ＮＤＶについて歯止め２２の位置づけは明らかである。例えば、感染性ｃＤＮＡから感染性コピーウイルスを生成させる試みは、恐らく感染性ウイルスを結果として生じる可能性のある一方、かかるウイルスは一般にワクチンとしての使用に適さないが、その理由はこのように生成させた感染性ウイルスが余りに毒性が強いためにワクチンとしての使用を果たし得ないからである；それが細胞系に対してｃＤＮＡをトランスフェクションした後に生成、複製され得るという事実が、ＮＤＶの毒力の性質について上記で検討したように、Ｆｏタンパク質をＦ１とＦ２に容易に切断し得ることを反映している。
【００７７】
ｃＤＮＡに対する親材料としてワクチン株を使用してもこの問題を解決することにはならない；ワクチン株、特に長潜伏期型のワクチン株は容易に切断し得るＦｏタンパク質を含み、初代ウイルスが複製し続けるのを不可能にしている。トランスフェクションに使用する細胞にはまったく感受性がなく、非切断Ｆｏタンパク質をもつワクチン型ウイルスの一回またはそれ以上の複製を持続させる。
【００７８】
本発明はこの問題の解決法を手際よく提供し、それと共に感染性コピーＮＤＶ、例えば、ワクチンに使用するためのＮＤＶを提供する。
【００７９】
本発明は感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスの生成法を提供するものであり、該方法はウイルスＲＮＡとの複合体を形成するウイルスＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現し得る細胞に、当該ウイルスのクローン化完全長またはゲノム長ｃＤＮＡをトランスフェクションすることを含み、また、さらに当該ウイルスのＦｏタンパク質切断を可能とするタンパク質分解活性を有する増殖培地中で当該細胞をインキュベートすることを含む。
【００８０】
我々の系では、ＮＰを発現するプラスミドの同時トランスフェクションを省くことができる。ＮＰはＮＰ遺伝子が抗ゲノムＲＮＡの５’末端に続く最初の遺伝子である故に、恐らく完全長ｃＤＮＡから発現される。真核細胞ｍＲＮＡは通常単シストロン性であるので、遠位遺伝子の発現は期待されない。しかし、ＮＤＶ遺伝子の相対位置が変化している完全長ｃＤＮＡを生成させることは可能である。もしかかるｃＤＮＡの最初の遺伝子がＰまたはＬ遺伝子であるならば、同時トランスフェクションしたプラスミドから対応する遺伝子産物を発現させる必要はない。
【００８１】
完全長ｃＤＮＡを用いる代りとして、複製応答能のあるサブゲノムＲＮＡを産生させ、かつ、鳥類パラミクソウイルスタンパク質の完全な補体を共に発現する２つ以上のサブゲノムＲＮＡを使用することが可能である。たとえＲＮＡが別々に詰込まれていたとしても、得られるウイルス様粒子は同時感染と遺伝子機能の補完性により連続的複製のために使用することができる。
【００８２】
好適な実施の形態において、本発明は当該タンパク質分解活性がトリプシン様酵素などの酵素に由来するか、または当該タンパク質分解活性を有する組成物に由来する場合の方法を提供する。特に好適な実施の形態において、当該増殖培地はタンパク質分解活性を有する尿膜液を含んでなる。Ｆｏタンパク質の切断は感染性ウイルスの生成にとって必要である。外部からタンパク質分解活性を加えずに長潜伏期性株から感染性ウイルスを生成させることが可能である。孵化鶏卵の尿膜腔にトランスフェクションした細胞の上清を接種することにより、尿膜液に存在するタンパク質分解活性がＦｏタンパク質を切断し、融合適格Ｆ１−Ｆ２複合体を生成させることができる。かかる活性化Ｆタンパク質をもつビリオンは感受性細胞に感染することが可能であって、所望のタンパク質分解活性を発現する細胞での複製が感染性の子孫を生み出す。トランスフェクションした細胞の上清に所望のタンパク質分解活性を与える代りとして、例えば、ＮＤＶに対し許容性であって、かつ、当該タンパク質分解活性をすでに発現している細胞を使用することが可能である。かかる細胞系を用い、外部からタンパク質分解活性を加えることなしに感染性の長潜伏期性ＮＤＶを生成させる。かかる細胞系は当該活性を特定する遺伝子をもつ細胞系の安定なトランスフェクションにより生成させることもできる。さらに、ウイルス・エンベロープ内に野生型Ｆタンパク質を発現する安定なトランスフェクション細胞を生成させ、それによって細胞に侵入する手段をもつ感染性粒子（それ自体は野生型Ｆタンパク質をエンコードするゲノム情報を備えていない）を提供することが可能である。感染性長潜伏期性ウイルスの救済もＮＤＶヘルパーウイルスをトランスフェクション細胞に感染させることにより可能である。かかるヘルパーウイルスを本質的に必要とするのは、それを抗体に対して選択し得る場合であり、例えば、ヘルパーウイルスを除去し、長潜伏期性ウイルスとは反応しない抗体を中和することによる。最終的に、３種の必須ＮＤＶタンパク質ＮＰ、ＰおよびＬの１つ、２つ、またはすべてを発現する安定にトランスフェクションした細胞系を構築することができる。かかる細胞系は３種の必須ＮＤＶタンパク質のサブセットのみを同時発現するか、または感染性コピーウイルスの生成を維持するためにまったく同時発現しないことが必要である。
【００８３】
好適な実施の形態において、本発明はトランスフェクションに使用される当該細胞がニワトリの一次または二次細胞または細胞系由来である方法を提供する。本明細書で提供するのは、例えば、ＣＥＲまたはＣＥＦ細胞であって、これらは、一般に殆ど生体外細胞として、ＮＤＶのＦｏタンパク質、例えば、ラソタ（LaSota）株のタンパク質を切断するのに必要な、適切なプロテアーゼを欠いている。しかし、例えば、他の鳥類から由来する細胞も使用することができる。
【００８４】
本発明はさらに感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスの生成法を提供するものであり、該方法は、例えば、図３に同定した当該ウイルスのクローン化完全長またはゲノム長のｃＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることを含み、またさらに、当該ウイルスのＦｏタンパク質を切断し得るタンパク質分解活性を有する増殖培地中で当該細胞をインキュベートすることを含み、さらに、当該細胞を培養し、当該培養細胞から由来する物質を孵化鶏卵の尿膜腔に接種することにより感染ウイルスを回収することを含む。当該物質は、例えば、当該細胞培養物由来の（収獲または凍結融解した）細胞または細胞残渣または上清を含む。
【００８５】
例えば、本明細書で記載するのは感染性ウイルスの回収方法であるが、該方法ではトランスフェクションしたＣＥＦ単層の上清を孵化鶏卵の尿膜腔に接種した。４日後に、尿膜液を収獲し、赤血球凝集反応アッセイにより分析し、次いでさらに鶏卵に継代した。
【００８６】
さらに、本発明は、尿膜液を収獲し、孵化鶏卵に再接種することにより当該感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを継代することをさらに含む方法を提供する。
【００８７】
本発明の好適な実施の形態においては、当該ウイルスが、例えば、ＮＤＶの無毒性野外事例由来またはＮＤＶのラソタ（LaSota）株などのＮＤＶワクチン株由来の長潜伏期性ウイルスであることを特徴とする方法が提供される。さらに、１つまたはそれ以上の突然変異、欠失、および／または挿入の導入またはその他の修飾を可能とする遺伝子修飾により、鳥類パラミクソウイルス・ゲノムを修飾する方法が提供される。例えば、Ｖタンパク質などのウイルスタンパク質をエンコードするｃＤＮＡを修飾することにより、また、当該修飾したｃＤＮＡを完全長ｃＤＮＡにクローニングし、当該完全長ｃＤＮＡから感染性コピーウイルスを生成させることにより、例えば、鳥類パラミクソウイルスの毒性を弱毒化または修飾する方法が提供され、それによって改善された性質を有する新規ＮＤＶ株または新規弱毒化生ワクチンを生成させる。
【００８８】
遺伝子産物の修飾による弱毒化の他に、転写および／複写に関わるヌクレオチド配列の修飾によっても鳥類パラミクソウイルスを弱毒化することが可能である。かかる修飾は、多様な細胞において生体外および生体内双方で切断し得る、また結果として古典的なワクチン株よりもより免疫原性である野生型様Ｆタンパク質を発現する弱毒化株を結果として与える。
【００８９】
好適な実施の形態において、本発明はニューカッスル病ウイルスなどの鳥類パラミクソウイルスの毒性を弱毒化または修飾する方法であって、ウイルスタンパク質のプロテアーゼ切断部位を、当該切断部位をエンコードするｃＤＮＡを修飾することにより修飾することを含み、さらに、当該ｃＤＮＡを、例えば、ニューカッスル病ウイルスのゲノム長ｃＤＮＡにクローニングし、感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを生成させることを含む方法を提供する。当該切断部位は、例えば、ニューカッスル病ウイルスのＦまたはＨＮタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位である。弱毒化は一般に毒性の低下に限定されるが、比較的無毒性のＮＤＶ株を用い、例えば、特定の細胞型において複製が増加する傾向を与えることにより毒性の高くなったかかる株の子孫を提供することも今や可能である。このように、まったく異なる毒物特性をＮＤＶに与えることも今や可能である。
【００９０】
本発明はニューカッスル病ウイルスなどの鳥類パラミクソウイルスを抗原性について修飾する方法であって、少なくとも１つの免疫優性エピトープを取込んでいるウイルスタンパク質の少なくとも一部をエンコードするｃＤＮＡを修飾することを含み、さらに、当該ｃＤＮＡをニューカッスル病ウイルスのゲノム長ｃＤＮＡにクローニングし、感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを生成させることを含む方法を提供する。
【００９１】
例えば、本発明は、例えば、提供されたＮＤＶ（ワクチン）の感染性コピーを産生する方法を用いてＮＤＶを（さらに）修飾する方法を提供し、組換えマーカーＮＤＶワクチンを産生する方法が提供され、マーカーワクチンは抗原性に適切なＮＤＶエピトープの、最も可能性の高いまたは必要度の高い免疫スペクトルを含み、さらに、明瞭な血清学的に適切なエピトープまたはマーカーが組換え技術により取除かれているために、血清学的に野生型ＮＤＶとは別個のものである。本発明はＮＤＶなどの鳥類パラミクソウイルスの抗原性構造を修飾する方法を提供し、かくして、例えば、鳥類パラミクソウイルスの野生株と血清学的に区別し得る生菌ＮＤＶマーカーワクチンの生成を可能とする。
【００９２】
一実施の形態において、本発明は感染性コピーＮＤＶを提供し、その場合のＮＤＶのＨＮタンパク質は、当該ＨＮタンパク質の一部をエンコードするｃＤＮＡを鳥類パラミクソウイルス、例えば、タイプ２またはタイプ４から由来するＨＮタンパク質の一部をエンコードするｃＤＮＡと組換えることにより修飾されている。当該ハイブリッドＨＮタンパク質はこのようにして得た感染性コピーＮＤＶ株に対し血清学的なマーカーとして働くか、または鳥類パラミクソウイルスの指向性を他の細胞および／または組織に変えるように働く。本発明により提供されるこれらのいわゆるマーカー株は、世界中を巡る商業用の鳥の群れにおいて、ＮＤＶの流行を評価するための非常に貴重な道具であるワクチンの生成を可能とする。さらに、かかるマーカーワクチンの大規模適用は、感染した鳥の群れの徹底的なスクリーニングと鎮圧の過程により、ＮＤＶの完全な撲滅に導くであろう。
【００９３】
さらに、他の病原から１つまたはそれ以上の抗原を発現し、かつ、複数の疾病に対する予防接種に使用し得る感染性コピーＮＤＶ株を生成する方法が提供される。例えば、かかる感染性コピーＮＤＶウイルスは、例えば、トリ・インフルエンザ（ＡＩ）（赤血球凝集素（Ｈ５およびＨ７）およびノイラミニダーゼ）、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）（エンベロープタンパク質（ｇｐ８５））、ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）（ＶＰ１＋ＶＰ２）、メレック病ウイルス（ＭＤＶ）（糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ）、感染性喉頭気管支炎ウイルス（ＩＬＴ）（ｇＢ、ｇＨ、ｇＤ）、感染性嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（ＶＰ２およびＶＰ３）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）（融合（Ｆ）タンパク質）、鳥類パラミクソウイルス−２、−３、−６（ＰＭＶ）（Ｆ−タンパク質、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、またはその他）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（ぺプロマータンパク質、核タンパク質）、レオウイルス（シグマタンパク質）、アデノウイルス、肺炎ウイルス、サルモネラ腸炎、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、大腸菌、ボルデテラ・アビアム（Bordetella avium; 以前はアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faeclis）、ヘモフィルス・パラガリナルム（Haemophilus paragallinarum）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida)、オルニトバクテリウム・リノトラキエレ（Ornithobacterium rhinotracheale)、リエメレラ（以前はパスツレラ（Pasteurella））アナチペスチファー（Riemerella anatipestifer)、マイコプラズマ（Mycoplasmata)（マイコプラズマ・ガリセプチクム（M. gallisepticum)、マイコプラズマ・シノビエ（M. synoviae)、マイコプラズマ・メレアグリディス（M. mereagridis)、マイコプラズマ・アイオワエ（M. iowae))、またはアスペルギルス（Aspergilli)（アスペルギルス・フラーブス（A. flavus)、アスペルギルス・フミガーツス（A. fumigatus)）などから得られる異種タンパク質をエンコードする異種ｃＤＮＡを含んでなる。
【００９４】
本発明は他の家禽病原からの抗原を発現させるワクチン・ベクターとして使用し得る鳥類パラミクソウイルスまたはそれから由来する株を提供する。幾つかの性質がＮＤＶを呼吸器または腸内疾患に対する予防接種用の理想的なワクチン・ベクターとする。１）ＮＤＶは孵化鶏卵において非常に高い力価まで容易に培養することができる。２）孵化鶏卵におけるＮＤＶの大量培養が比較的安価である。３）ＮＤＶワクチンは比較的安定で、集団投与法、例えば、飲料水により、またはスプレーもしくはエーロゾル製剤により簡単に投与することができる。４）ＮＤＶの自然感染経路は呼吸器管および／または腸管によるが、多くの他の家禽病原の主たる自然感染経路であもある。５）ＮＤＶは、循環している移行抗体が存在しているにもかかわらず、局所免疫を誘発することができる。
【００９５】
ＮＤＶは強力な抗腫瘍性ならびに免疫刺激性を有することが示されている（総説として参照：Schirrmacher et al., 1998)(Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H.-H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. and Hagmuller, E. (1998) ウイルス修飾腫瘍細胞による免疫化；腫瘍学セミナー２５：６７７〜６９６）。ＮＤＶはヒト正常細胞において活発に複製され得るようには見えないが、ヒト癌細胞の選択的ＮＤＶ−介在致死が認められた。局所ＮＤＶ治療後、ヒト腫瘍異種移植片のウイルス腫瘍崩壊および完全寛解がヌードマウスで認められた。このことは腫瘍治療に対するＮＤＶの使用に通じる。しかし、問題はかかる適用が局所治療に限定されることである。
【００９６】
ＮＤＶの感染はインターフェロン、ケモカイン、および他の潜在的に重要な遺伝子産物を誘発し、多形質発現性免疫刺激性を腫瘍細胞に誘導する。この概念は、ＮＤＶを感染させた新鮮な有効試料からなる自家腫瘍細胞ワクチンの産生に使用されている。このタイプのワクチンは自家腫瘍ワクチン−ＮＤＶまたはＡＴＶ−ＮＤＶと呼ばれる（Schirrmacher et al., 1998)。ＮＤＶ感染細胞はガンマ線照射により不活化するが、この照射は細胞分裂を阻止するが、感染細胞の細胞質においてなおＮＤＶの複製を可能とする。ＡＴＶ−ＮＤＶを患者に接種した後、Ｔ細胞がＮＤＶ−誘発ケモカインを介して能力を回復する。これらＴ細胞の一部はＴ細胞レセプターを発現し、それが細胞表面で主要組織適合性複合体クラスＩ分子と複合体を形成して腫瘍関連抗原からのペプチドと相互作用し得る。この相互作用は結果として細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発し、自家腫瘍細胞を特異的に致死させる。
【００９７】
本発明はＮＤＶ感染により誘発されるケモカインと免疫刺激性タンパク質の、レパートリーと量とが調節されることを提供する。本発明は異種遺伝子を取込み、発現するように修飾した組換えＮＤＶを生成する方法を提供する。かかる組換えＮＤＶは感染細胞において免疫刺激性タンパク質のレパートリーと量を改変するために使用し得る。一実施の形態において、本発明は、ヒト・インターフェロン、ケモカインまたは他の免疫刺激性タンパク質をエンコードする遺伝子を取込み、発現する組換えＮＤＶを提供する。当該組換えＮＤＶは通常のＡＴＶ−ＮＤＶよりもより強力なＡＴＶ−ＮＤＶ産生のために使用される。例えば、サイトカイン、ＩＦＮ−α、−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６；ケモカイン、ランテス（RANTES）、ＩＰ−１０；他の遺伝子、例えば、ＨＳＰ、ＡＣＴＨ、エンドルフィン、ｉＮＯＳ、ＥＰＡ／ＴＩＭＰ、ＮＦｋＢ。ＮＤＶの多形質発現性免疫刺激性は、感染疾患に対する動物およびヒトの予防接種用のアジュバントとしても使用し得る。本発明の一実施の形態において、感染作用因子の適切な抗原をエンコードする外来遺伝子はＮＤＶゲノムに導入され、感染細胞による抗原と免疫刺激タンパク質の同時発現が感染作用因子に対する強い免疫応答を誘発する。本発明の他の実施の形態において、ＮＤＶの免疫刺激性は、抗原と特異的免疫刺激タンパク質を同時に発現するＮＤＶ組換え体を使用することでさらに増強される。好適な実施の形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の関連抗原を単独または免疫刺激タンパク質との併用において発現するＮＤＶ組換え体の使用により、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）ワクチンを生成させるために使用される。
【００９８】
ＮＤＶはまた感染性疾患に対して動物およびヒトに予防接種を行うためのアジュバントとしても使用される。本発明の一実施の形態において、感染性作用因子の適切な抗原をエンコードする異種または外来性遺伝子はＮＤＶゲノムに導入され、感染細胞による抗原と免疫刺激タンパク質の同時発現が感染作用因子に対する強い免疫応答を誘発する。本発明の他の実施の形態において、ＮＤＶの免疫刺激性は、抗原と特異的免疫刺激タンパク質を同時に発現するＮＤＶ組換え体を使用することでさらに増強される。好適な実施の形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の関連抗原を単独または免疫刺激タンパク質との併用において発現するＮＤＶ組換え体の使用により、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）ワクチンを生成させるために使用される。
【００９９】
また、自己制限非伝染性（キャリアー）ワクチンとして使用し得る条件致死ＮＤＶ欠失突然変異体を生成させる方法が提供される。ＮＤＶ欠失変異体は生成されても、内部細胞膜でＮＤＶの出芽に関与するマトリックス（Ｍ）タンパク質を発現できない。本発明は、例えば、Ｍタンパク質は発現し得ないが、細胞に感染し、細胞から細胞への伝播により拡散し得る、表現型に相補性であるＮＤＶ株を提供する。しかし、突然変異ウイルスは非相補性細胞上感染性の子孫を生成することができない。このことは、表現型に相補性であるＮＤＶ欠失突然変異体が、環境に拡散することのできない安全な自己制限ワクチンとして使用し得ることを示している。かかる非伝染性ワクチンは、最も重要な生ワクチンの利点、すなわち、有効性と、最も重要な死菌ワクチンの利点、すなわち、安全性が組み合わさっている。
【０１００】
本発明は、ニューカッスル病ウイルス、または、例えば、孵化鶏卵または適当な細胞にて継代し、またはさらに培養することによって誘導したその株、すなわち、本発明により提供される方法により得られる感染性コピーウイルスから誘導した株を提供する。
【０１０１】
例えば、ＮＤＶは、弱毒化、毒性修飾、抗原性修飾した感染性コピーニューカッスル病ウイルスを生成する少なくとも１つの方法で修飾したものであって、異種抗原を発現するかまたは非伝染性またはその組合わせであるＮＤＶが提供される。
【０１０２】
このようにして、本発明は、例えば、明瞭な毒性の特質または明瞭な抗原特性を担持することで特徴づけられるＮＤＶワクチンであって、マーカーワクチンを目的とするか、および／または他の病原から由来する異種抗原を発現するためのものであるか、伝染性および／または非伝染性型のものであるＮＤＶワクチンを提供する。
【０１０３】
かかるワクチンは死菌ワクチンであっても、生ワクチンであってもよい。好ましくは、かかるワクチンは生菌ワクチンであるが、本発明により提供される死菌ワクチンは生菌ワクチンが、例えば、商業上の制限により、または疾患管理当局が定めた他の条件のために、適用できないか、適用し難い状況下で有利である。
【０１０４】
本発明はこのようにして、当該血清学的に関連した免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体を検出するための診断法および対応するテスト・キットをも提供し、それによって家禽におけるＮＤＶおよび／または他の家禽類疾病を抑制する、および／または撲滅する方法を実施するための方法および／または手段を提供する。本発明は新規・有効なワクチンであって、野生型ウイルスおよび旧型ウイルスとから血清学的に識別し得るワクチンを提供する。かかる新規ワクチンはＮＤＶマーカーワクチンと称し、抗原的に適切なＮＤＶエピトープの最も可能性の高い免疫スペクトルを提供し、さらに随伴する診断法とキットを適用することにより野生型ＮＤＶから血清学的に区別される。
【０１０５】
本発明は未予防接種動物または本発明方法によるＮＤＶワクチンを接種した動物を、野生型ＮＤＶに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏期性ＮＤＶ−ワクチン株を接種した動物から識別する方法を提供し、該方法は最少量の１サンプル（例えば、血清、血液、卵または眼液）を当該動物から採取し、当該サンプルについて、当該野生型または未修飾ＮＤＶによって発現されるが、本発明のワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体の存在を決定することを含む。
【０１０６】
本発明は、当該抗体がＮＤＶのＨＮまたはＦタンパク質、例えば、本明細書の実験の部に記載したハイブリッドタンパク質に対するものである場合の方法を提供する。本発明は、例えば、当該動物が家禽類からなる群から選択される、好ましくはニワトリである場合の診断方法を提供する。
【０１０７】
また、本発明は動物間で血清学的に識別する方法に使用する診断キットを提供する。本発明の一実施の形態においては、簡単で迅速な赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験を用い、予防接種した動物と感染した動物間の識別をする。ＮＤＶのＨＮの完全球状頭部が他の血清型ＨＮの対応部分と置換わっているマーカーワクチンを接種した動物は、ＮＤＶのＨＮに対し抗体を誘発しないので、ＮＤＶビリオンによる赤血球凝集反応を阻害しない。
【０１０８】
ＨＩ試験においてマーカーワクチンビリオンを使用することにより、ハイブリッドＨＮタンパク質に対する抗体を検出し、予防接種の有効性に対する尺度として用いることができる。代替法として、ＮＤＶのＦタンパク質に対する抗体を検出するＥＬＩＳＡを使用して、予防接種の有効性を測定する。
【０１０９】
ＨＩ試験の他にも、ＥＬＩＳＡを用い、ＮＤＶのＨＮに対する抗体の存在を決定することができる。かかる試験において使用される抗原は、例えば、組換えＤＮＡ技法により発現されるＮＤＶのＨＮであるか、またはＮＤＶのＨＮからの保存ペプチドである。遮断ＥＬＩＳＡを用いることもできる。この事例では、ＮＤＶのＨＮの保存ペプチドに対する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を使用し、競合する抗体がワクチン接種した動物からのサンプルに存在するか否かを決定する。ＥＬＩＳＡ試験は、もしマーカーワクチンがキメラＨＮタンパク質のみを含んでいるならば、あるいはＮＤＶのＨＮの少数のエピトープが置換わっている場合、有利に使用することができる。
【０１１０】
本発明をさらに本明細書の実験の部において説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】転写ベクターｐＯＬＴＶ５はPattnaikら（1992)によって記述された転写ベクターの誘導体である。構築の詳細については本文参照のこと。プラスミドはＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（肉太活字で示した）と、それに続く単一のＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位、およびデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）からの自己触媒性リボザイムを含む。ＤＮＡフラグメントはＳｔｕＩおよびＳｍａＩ部位の間にクローン化されることが可能であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインヴィトロまたはインヴィヴォのいずれかにおいて転写されることが可能である。結果として生じる転写物の５´末端は、インサートにはコード化されていない二つの余分のＧ−残基を含む。リボザイムの働きにより、当該転写物の３´末端はインサートの最後のヌクレオチドに正確に対応する。
【図２】ミニゲノムプラスミド、ｐＯＬＴＶ５３５（図２Ａ）およびｐＯＬＴＶ５５３（図２Ｂ）の構造。ニニゲノムプラスミドは、転写プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１を参照）を主成分とし、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコード化している遺伝子の側面に並んでいる、ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶの３´領域（ｎｔ １〜１１９）と、５´領域（ ｎｔ １４９７０〜１５１８６）とを含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｐＯＬＴＶ５３５の転写は、反ゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ）を生じるが、一方ｐＯＬＴＶ５５３の転写は、ゲノムＲＮＡ（または[−]−ＲＮＡ）を生じる。ウイルス転写の開始および終止シグナルである、開始（Ｓ）および終止（Ｅ）ボックスが示されている。ＳＥＡＰ遺伝子の開始コドンには下線が付されている。各々１ｎｔずつ長さの異なるミニゲノムプラスミド（各々ｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜Ｎ５）を生じるＣｌａＩ部位のインサーション（Ｎ０〜Ｎ５）の配列も示されている。
【図３】ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶのゲノムのヌクレオチド配列および、推定されるＮＤＶ遺伝子のアミノ酸配列。示した配列は反ゲノム鎖に対応しており、５´から３´の方向へ、ｓｓＤＮＡの形で示されている。この図に示された配列は、全ＮＤＶゲノムにわたる二つの独立した重複するサブゲノムｃＤＮＡのセットの完全なシーケンシングにより決定された共通配列のものである。残りのアンビギュイティー（おそらくＰＣＲのエラーの結果）は、第３の独立したクローンのセットについての関連領域のシーケンシングによって解明された。重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンから組立てられた完全長のｃＤＮＡクローンｐＮＤＦＬ＋（図４参照）の配列は、以下の位置においてＮＤＶの共通配列のそれと異なっている（括弧間共通配列）：ｎｔ １７５５，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ３７６６，Ａ（Ｇ）；ｎｔ ５１０９，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ６９９９，Ｔ（Ｃ）；ｎｔ ７０５６，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ９３３７，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ９４８６，Ａ（Ｔ）；ｎｔ １０１９５，Ｔ（Ｃ）；ｎｔ １３０７５，Ａ（Ｇ）。これらの差は結果として３つのアミノ酸の変化を生じる（括弧間共通配列）：Ｆタンパク質、Ｒ189（Ｑ）；ＨＮタンパク質Ｓ200（Ｐ）Ｌ−タンパク質Ｎ369（Ｉ）。
【図４】（Ａ）重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンからの完全長のＮＤＶｃＤＮＡの組立てに用いられた総体的な方法。ｃＤＮＡは、ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶの３´および５´末端をすでに含んでいるプラスミドｐＯＬＴＶ５３５（図２参照）において組立てられた。結果として生じるプラスミドはｐＮＤＦＬ＋と名付けられ、感染性ＮＤＶの生成に使用された。 （Ｂ）重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンからの完全長のＮＤＶｃＤＮＡの組立てのための詳細なクローニング法。Ｃｍは、表現形のタグとして一時的に導入されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を示す（詳細は本文参照）。 （Ｃ）遺伝学的に変異された完全長のＮＤＶｃＤＮＡの生成のための詳細なクローニング法。変異は、Ｆ遺伝子に導入された３つのヌクレオチドの変化から成り、その結果Ｆタンパク質のタンパク質分解部位のアミノ酸配列の変異を生じる（詳細は本文参照）。
【図５】（Ａ）ｐＯＬＴＶ５３５系 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写は反ゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ）を生じるが、それは細胞によりＳＥＡＰタンパク質に直接翻訳されることが可能である。ヘルパーウイルスによる細胞感染の後（またはＮＰ、Ｐ、およびＬをコード化しているプラスミドの同時トランスフェクションの後）、ゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）合成のため、反ゲノムＲＮＡがウイルスポリメラーゼ複合体によって使用される。ゲノムＲＮＡは次に、ウイルスポリメラーゼ複合体によりｍＲＮＡ（特異的な転写開始［Ｓ］および終止［Ｅ］ボックスの使用による）および反ゲノムＲＮＡの両者の合成に用いられる。 （Ｂ）ｐＯＬＴＶ５５３系Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写はゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）を生じるが、それはＳＥＡＰタンパク質に翻訳されることができない。ヘルパーウイルスによる細胞感染の後（またはＮＰ、Ｐ、およびＬをコード化しているプラスミドの同時トランスフェクションの後）、ｍＲＮＡ（特異的な転写開始［Ｓ］および終止［Ｅ］ボックスの使用による）および反ゲノムＲＮＡの両者の合成のため、ゲノムＲＮＡがウイルスポリメラーゼ複合体によって使用される。
【図６】ＮＤＶＬａＳｏｔａおよび他のパラミクソウイルスの、５´末端の核酸配列のアラインメントが、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属の４つの仲間、パラミクソウイルスの３つの仲間、およびモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属の３つの仲間にわたるＮＤＶの配列の比較として示されている。配列はＬ遺伝子の終止ボックスから５´末端まで（３´〜５´ｃＤＮＡ）描かれている。 ＮＤＶ，ニューカッスル病ウイルス；ｈＰＩＶ２，ヒトパラインフルエンザウイルス２；ＭｕＶ，おたふくかぜウイルス；ＳＶ５およびＳＶ４１，各々シミアンウイルス５および４１；ＳｅＶ，センダイウイルス；ｂＰＩＶ３，およびｈＰＩＶ３ 各々ウシおよびヒトのパラインフルエンザウイルス；ＣＤＶ，イヌジステンパーウイルス；ＭｅＶ はしかウイルス；ＲＰＶ，牛疫ウイルス。全ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）配列は、以下のように取得された（受託番号）：ＮＤＶ（ＡＦ０７７７６１）；ｈＰＩＶ２（Ｘ５７５５９）；ＭｕＶ（ＡＢ０００３８８）；ＳＶ５（ＡＦ０５２７５５）；ＳＶ４１（Ｘ６４２７５）；ｂＰＩＶ３（Ｄ８４０９５）；ｈＰＩＶ３（Ｚ１１５７５）；ＣＤＶ（Ｌ１３１９４）；ＭｅＶ（Ｘ１６５６５）；ＲＰＶ（Ｚ３０６９７）。
【実施例】
【０１１２】
実施例
材料および方法
標準クローニング法は、別に記載しない場合は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（１９８９）によって行った。複製連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成したＤＮＡ断片を含む全構成分は、塩基配列分析によって確認した。下に挙げるプライマーの配列において、下線を引いた塩基はＮＤＶの配列に対応し、ＮＤＶゲノム内のポジションを表示する。クローニングに使用した制限部位の塩基配列は、太字で示す。
細胞およびウイルス
ウシ胎児血清５％ならびに１０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μｇ／ｍｌファンギゾン、５００μｇ／ｍｌポリミキシンＢおよび１０ｍｇ／ｍｌカナマイシンからなる抗生物質ミックスを２％含むＧＭＥM／ＥＭＥM（１：１）中でＣＥＲ細胞（Ｓｍｉｔｈら、１９７６）を培養した。ＱＴ３５細胞（Ｍｏｓｃｏｖｉｃｉら、１９７７；Ｃｈｏ、１９８２）は、ＦＣＳ５％および抗生物質ミックス２％を追加した、ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって供給された培地（カタログ番号Ｎｏ．０４１−９１５３６；Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅが独占権をもつ組成物）で培養した。ＱＭ５細胞（ＡｎｔｉｎおよびＯｒｄａｈｌ、１９９１）は、燐酸トリプトースブイヨン１０％、ＦＣＳ１０％および混合抗生物質２％を追加したＭ１９９培地で培養した。
【０１１３】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａはＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６９９）から入手し、有胚鶏卵で２回経代培養した。ｃＤＮＡの構築およびクローニングを始める前に、該ウイルスは、ニワトリ原発性胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）上でのプラーク精製を３回繰り返して精製した。この目的のために、ウシ胎児血清５％、抗生物質ミックス２％、尿膜腔液５％、ＭｇＣｌ2３０ｍＭ、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）２００μｇ／ｍｌおよび寒天Ｎｏｂｅｌ（Ｄｉｆｃｏ）０．８％を含むＧＭＥM／ＥＭＥM（１：１）で培養したＣＥＦ細胞上に該ウイルスを滴下した。プラーク精製の第３回目から得られたウイルス（クローンＥ１３−１と表示する）を有胚鶏卵で培養し、接種後４日目に尿膜腔液を採取し、そのアリコートを−７０℃で保存した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する組替え鶏痘ウイルスｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９６；以後ＦＰＶ−Ｔ７と称す）は、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｋｉｎｎｅｒ博士からの恵贈品であり、ＱＴ３５細胞上で培養した。
【０１１４】
ウイルスＲＮＡの単離
操作はすべて、ＲＮアーゼの存在しないガラス容器またはプラスチック容器で行い、溶液はすべて、１％ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＲＮアーゼ除去の水で作成した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０遠心機による、２１，０００ｒｐｍ、４℃で７０分間の遠心分離により、尿膜腔液からウイルスをペレット化した。このペレットをホモジナイズ化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＳＤＳ）に再懸濁し、絶えず攪拌しながら３７℃で９０分間プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌ）で処理した。溶菌液を、等量のフェノール／クロロホルム（１：１）（ｐＨ５．４）で２回、等量のクロロホルムで１回抽出した。ウイルスＲＮＡは、３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．３）および２．５倍量の１００％エタノールを添加して水相から沈殿させた。沈殿は、遠心により採取して、７０％エタノールで１回洗浄し、水に再懸濁させ、分割して−７０℃で保存した。
【０１１５】
逆転写
ウイルスＲＮＡ（１．５μｇ）を、１２μｌの容量にプライマー５００ｎｇを含む液と混合し、７０℃で１０分間インキュベートした。５ｘＲＴ緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2；ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌおよび１０ｍＭ ｄＮＴＰ'ｓ ２μｌ（各２．５ｍＭ）を添加し、混合液を４２℃で２分間インキュベートした。最終容量２０μｌ中で、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II；ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００単位を添加し、ついで４２℃で６０分間インキュベートすることにより逆転写を行った。
【０１１６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＮＤＶゲノムの３'および５'末端を決定するために使用したＰＣＲ反応（下記参照）はすべて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。個々のＮＤＶ遺伝子または大サブゲノムｃＤＮＡのクローニングのために、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｗｏか、ＴａｑとＰｗｏの混合物（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙキットまたはＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅキット）を、メーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示書に従って使用した。試料はすべて、指示された回数のＰＣＲサイクルの開始前に９４℃で２分間インキュベートした。指示された回数のＰＣＲサイクルの後、試料を、ＰＣＲサイクルの伸長反応時間の少なくとも３倍の時間、伸長反応温度でインキュベートした。ＰＣＲ断片を、高純度ＰＣＲ製品精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で直接精製するか、またはアガロースゲル電気泳動の後、ＱｉａｅｘII抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を基本的にメーカーの指示どおりに使用して精製した。
【０１１７】
塩基配列分析
塩基配列はすべて、ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて決定した。反応混合液（５μｌ）をＧｅｎｅＡｍｐ２４００サーモサイクラー中で２５サイクルの線形増幅（９４℃で１０秒、５０℃で５秒、および６０℃で４分）にかけた。その後、反応混合体をエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＳＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１５μｌで再懸濁させ、９４℃で２分間加熱した後、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢ３１０自動シークエンサーにかけた。
【０１１８】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムの配列決定に用いたプライマーの塩基配列は、公表されている配列から、またはこの配列決定計画の間に確立された配列から引き出した。プライマー類を表１に示す。
【０１１９】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'および５'末端のクローニングおよび配列決定
ＮＤＶゲノムの３'および５'末端の塩基配列は、ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）を用いて決定した。プライマーｐ３６０（５'−ＧＧＣＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＧＣＣＴＡＧＴＧＣＴＴ−３'；ｎｔ １４７５６−１４７７９）（ＮＤＶのＬ−遺伝子の公表された塩基配列（Ｙｕｓｏｆｆら、１９８７）から引き出した）を用いる、最終容量２０μｌでの逆転写反応には、ＮＤＶ ＲＮＡを使用した。一本鎖ｃＤＮＡ（ＲＴ混合物の２．５μｌ）を、アンカープライマーＡＬＧ３（５'−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣ−３'）８ｐｍｏｌに添加し、Ｔｅｓｓｉｅｒら（１９８６）による記載のとおりに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５％ ＰＥＧ、１ｍＭ ＨＣＣ、２０μＭ ＡＴＰおよびＴ４ ＲＮＡ リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１０単位を含む反応混合液２０μｌの中で、室温で一夜連結反応をさせた。連結反応の１μｌを、プライマーｐ３７５（５'−ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴ−３'；ｎｔ １４９６４−１４９８３）およびＡＬＧ４（５'−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧ−３'）を用いるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。後者のプライマーは、アンカープライマーＡＬＧ３に対し相補的である。ＰＣＲの条件（４０サイクル）は次のとおりである：９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間。ＰＣＲ生成物を精製し、Ｔ−ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＴＳＫ（ＩｃｈｉｈａｒａおよびＫｕｒｏｓａｗａ、１９９３）中にクローニングした。あるいはその代わりに、精製したＰＣＲ生成物をＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端を作り、プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｃII部位にクローニングした。１３個の独立クローン（８×ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＴＳＫおよび５×ｐＧＥＭ４Ｚ）を配列して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａゲノムの５'末端の塩基配列を決定した。３'末端の塩基配列は、二つの独立した方法によって決定した。方法Ｉでは、Ｓｃｈｕｔｚｅら（１９９５）によって記載されているとおりに、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いることによって、プライマーＡＬＧ３をウイルスＲＮＡの３'末端に連結させた。反応混合液（最終容量１０μｌ）には、ＮＤＶ ＲＮＡ ２．５μｇ、ＡＬＧ３ １００ｐｍｏｌ、１０× Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ）１μｌ、ＤＭＳＯ １μｌ、１０μＭ ヘキサミン−塩化コバルト １μｌ、ＲＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１０単位が含まれていた。この混合液を室温で１夜インキュベートし、この連結反応の５μｌを、プライマーとしてＡＬＧ４を用いる逆転写反応のテンプレートして使用した。プライマーＡＬＧ４およびｐ３７６（５'−ＧＡＧＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＴＣ−３'；ｎｔ １３７−１６４）（この塩基配列は、ＮＤＶの３'末端の公表された塩基配列（Ｉｓｈｉｄａら、１９８６）から引き出した）を用いるＰＣＲ反応にＲＴ−反応の１μｌを使用した。ＰＣＲ条件は、５'ＲＡＣＥについて上に記載したのと同じであった。方法IIにおいては、方法Ｉについて記載したのと同じ条件で、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いることによってウイルス性ＮＤＶ ＲＮＡの３'と５'末端を互いに連結した。連結反応混合液の５μｌを、プライマーｐ３６０を用いる逆転写反応においてテンプレートとして使用した。プライマーｐ３７５およびｐ３７６を用い、かつ５'ＲＡＣＥについて上に記載したＰＣＲ条件を用いるＰＣＲ反応に、ＲＴ反応の１μｌを使用した。ＰＣＲ生成物は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端を作り、プラスミドｐＧＥＭ４ＺのＨｉｎｃII部位（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。１０個の独立したクローン（方法Ｉから４個、方法IIから６個）の配列を分析して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'末端の塩基配列を決定した。
【０１２０】
転写ベクターの構築
基本レプリコンとしてプラスミドｐＯＫ１２（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、１９９１）を用いることによって低コピー番号の転写ベクターを構築した。プラスミドｐＯＫ１２をＰｖｕIIで消化し、複製開始起点およびカナマイシン−抵抗遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を、転写ベクター２．０（Ａｎｄｒｅｗ Ｂａｌｌ博士の恵贈品；Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）から得たＥｃｏ４７III−ＡｆｌII断片（ＡｆｌII部位は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑にした）に連結した。得られたプラスミドからＸｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を削除して、できるだけ多くの特定の制限部位を減らした。得られたプラスミドをｐＯＬＴＶ５と称す（図１）。転写ベクターｐＯＬＴＶ５には、特異なＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位が後続するＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）由来の自己触媒性リボザイムおよびバクテリオファージＴ７由来の転写終結シグナルが含まれている。ＳｔｕＩ部位とＳｍａＩ制限部位の間にクローニングされた断片は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、インビトロでもインビボでも転写することができる。転写の後、得られた転写産物の５'末端には、プラスミドによってコードされた２個のＧ残基が含まれている。ＨＤＶリボザイムの自己触媒作用により、転写産物の３'末端は、クローニングされたＤＮＡ断片の正確な末端塩基に対応している（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）。
【０１２１】
ミニゲノムプラスミドの構築
ＮＤＶの複製および転写の要件を調べるために、全ＮＤＶ遺伝子を置換したレポーター遺伝子を側に配置しているＮＤＶの３'および５'末端部分を含んだミニゲノムプラスミドを構築した（図２）。ＮＤＶの３'および５'末端領域に対応するＤＮＡ断片を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（３０サイクル；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒および７２℃で３０秒）を用いること、ならびにテンプレートとして３'および５'ＲＡＣＥ断片（上記参照）を含んだプラスミドを用いることによるＰＣＲ法によって産生した。
【０１２２】
３'領域（ｎｔ １〜１１９）は、プライマー３ＵＩＴ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＡ−３'、ｎｔ １〜２７）およびＳＥＡＰ３（５'−ＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧ−３'、ｎｔ １０２〜１１９）を用いることによって作った。５'領域（ｎｔ １４９７３〜１５１８６）は、プライマーＳＥＡＰ５（５'−ＧＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴ−３'、ｎｔ １４９７３〜１４９９０）および５ＮＤＶ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＣＧＡ−３'、ｎｔ １５１５８〜１５１８６）を用いることによって作った。２個のＤＮＡ断片を、プライマー３ＵＩＴおよび５ＮＤＶを用いることによる重複ＰＣＲ法（重複は、上に示したプライマーの塩基配列においてイタリックで示してある）で結合した。得られたＤＮＡ断片（これは、２０個の塩基によって分離されたＮＤＶの３'および５'末端の融合である）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの処理によってホスホリル化し、ＳｔｕＩおよびＳｍａＩで切断してウシ腸管ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱ホスホリル化した転写プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１）中の両方の位置にクローニングした。最後に、分泌したアルカリ性ホスファターゼをコードするＳＥＡＰ−遺伝子を、ＳｐｈＩおよびＣｌａＩでの消化によってプラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から回収し、ＮＤＶの３'と５'末端の間のＳｐｈＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３と称した。プラスミドｐＯＬＴＶ５３５のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビボまたはインビトロの転写により、アンチゲノムＲＮＡ（〔＋〕−ＲＮＡ）が生成する。一方、プラスミドｐＯＬＴＶ５５３の転写により、ゲノムＲＮＡ（〔−〕ＲＮＡ）が生成する。
【０１２３】
プラスミドｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜−Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜−Ｎ５は、それぞれ、ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３の中のＳＥＡＰ−遺伝子とＮＤＶの５'末端との間に存在するＣｌａＩ部位に自己相補性オリゴヌクレオチドを挿入することによって産生させた（図２参照）。使用したオリゴヌクレオチド：Ｎ０には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ１には、５'−ＣＧＣＧＡＧＳＣＴＣＧ−３'；Ｎ２には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ３には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ４には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＡＴＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ５には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＡＳＴＧＣＴＣＧ−３'（ここでＷ＝ＡまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ）であった。
【０１２４】
プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３中のＴ７プロモーターの修飾
ＮＤＶの標準５'および３'末端を含むインビトロまたはインビボの転写産物を生成させるために、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３中のＴ７プロモーターを、転写がＮＤＶの３'および５'末端の最初の塩基から始まるように修飾した。
【０１２５】
１）ＢＧｌI−制限部位、２）Ｔ７プロモーターの末端にある２個のＧ残基がＡ残基で置換されるように修飾したＴ７プロモーター（イタリックで表示）の塩基配列、ならびに３）ＮＤＶの３'末端（ｎｔ １〜２１）または５'末端（ｎｔ １５１６４〜１５１８６）、を含むプライマーを設計した。プライマーＢＧＬ３Ｆ２（５'−ＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧ−３'）およびＳＥＡＰ３（上記参照）を用いて、ｐＯＬＴＶ５３５中のＳＥＡＰ遺伝子の起点までに修飾したＴ７プロモーターおよびＮＤＶの全３'末端を含むＤＮＡ断片を作製した。同様に、プライマーＢＧＬ５Ｆ２（５'−ＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴ
ＧＧＴＧＡＡＴＧ−３'）およびＳＥＡＰ５を用いることによって、ｐＯＬＴＶ５５３中のＳＥＡＰ遺伝子の終点までに修飾したＴ７プロモーターおよびＮＤＶの全５'末端を含むＤＮＡ断片を作製した。得られた断片を、それぞれ、ＢｇｌＩとＳｐｈＩ（３'末端）で、またはＢｇｌＩとＣｌａＩ（５'末端）で消化し、ｐＯＬＴＶ５３５中のＢｇｌＩ−ＳｐｈＩ断片またはｐＯＬＴＶ５５３中のＢｇｌＩ−ＣｌａＩ断片に置換するのに使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＯＬＴＶ７３５およびｐＯＬＴＶ７５３と称した。プラスミドｐＯＬＴＶ７３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ７５３Ｎ３は、ＳＥＡＰ遺伝子と、それぞれ、ｐＯＬＴＶ７３５およびｐＯＬＴＶ７５３の中にあるＮＤＶの５'末端との間に位置するＣｌａＩ部位に、自己相補性オリゴヌクレオチド（５'−ＣＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３'；Ｗ＝ＡまたはＴ）を挿入することによって作製した。
【０１２６】
ＳＥＡＰレポータープラスミドの構築
真核生物の発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏＩ部位とＳｍａＩ部位との間に、プラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得たＳＥＡＰ−遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片（ＣｌａＩ部位は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑にした）をクローニングすることによってプラスミドｐＣＩｎｅｏＳＥＡＰを構築した。プラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃには、バクテリオファージＴ７プロモーターに加えてヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）が含まれている。Ｔ７プロモーターだけから作製した転写産物によるＳＥＡＰ発現を検査・定量するために、ｈＣＭＶプロモーターを欠いた他のプラスミドを構築した。この目的のために、ＨｉｎｄIIIでの部分消化とそれに続くＢｇｌIIでの完全消化によって、ｐＣＩｎｅｏからｈＣＭＶプロモーターを削除した。ｈＣＭＶプロモーターを削除したＤＮＡ断片（Ｃｌｏｎｔｅｃｈの番号付けによれば、ｎｔ ７５６〜５４６９）を単離し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作成し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて再環化した。得られたプラスミドは、ｐＣＩｎｅｏＤと称した。最後に、ＳＥＡＰ遺伝子を、ｐＳＥＡＰ−ＢａｃｉｓからＭｌｕＩ−ＡｃｃＩ断片として回収し、ｐＣＩｎｅｏＤ中、ＭｌｕＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＣＩｎｅｏＤ ＳＥＡＰと称した。
【０１２７】
トランスフェクション
細胞を、２４穴のペトリ皿に植付け、１夜増殖させて６０〜８０％の集密度にし、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１で、３７℃１時間、ＦＰＶ−Ｔ７に感染させた。この細胞に、基本的にメーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示どおりにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥおよびＯｐｔｉＭｅｍ３μｌを用いて、ミニゲノムプラスミドＤＮＡ０．５μｇをトランスフェクションした。３７℃で４時間（ＣＥＲ細胞）または１６時間（ＱＭ５細胞）インキュベートした後、細胞に、多重感染度５で１時間、ＮＤＶ（Ｄｕｔｃｈ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅ番号１５２６０８；ウエル当たり２００μｌ）に感染させるか、または感染させないままで放置した。接種物を吸引し、完全培地１ｍｌで置換し、細胞を３７℃でさらにインキュベートした。コトランスフェクションのために、６穴のペトリ皿で細胞を増殖させ、上記と同じようにＦＰＶ−Ｔ７に感染させた。細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥ ８μｌまたはＦｕＧｅｎｅTM６（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）９μｌを使用することによって、ミニゲノムプラスミドＤＮＡ ０．２５μｇ、ｐＣＩｎｅｏＮＰ ０．４μｇ、ｐＣＩｎｅｏＰ ０．２μｇおよびｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）またはｐＣＩｎｅｏ ０．２μｇをコトランスフェクションした。感染性ウイルスを産生するために、ミニゲノムプラスミドを、全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを含んだ転写プラスミドに置換した。
【０１２８】
ＳＥＡＰ活性の定量
Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔTM Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔを基本的にメーカー（Ｔｒｏｐｉｘ）の記載どおりに使用して、９６穴の使い捨てプレート上で、トランスフェクションした細胞の培地に分泌されたＳＥＡＰの量を測定した。化学発光を、液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ １４５０ ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＰＬＵＳ）を用いて定量した。
【０１２９】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムに亘るｃＤＮＡのクローニングおよび塩基配列の決定
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムをクローニングし、塩基配列を決めるために、ＲＴ−ＰＣＲによって大サブゲノムｃＤＮＡクローンを作製し、ｐＧＥＭ−Ｔの中にクローニングした。上記のごとく、プライマー３ＵＩＴを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ反応の１μｌを、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いるＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ法は、９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間および６８℃で６分間のサイクル５回、さらに９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、および６８℃で６分間のサイクル１０回からなっていた。その中で、６８℃での伸長反応時間は、サイクルごとに２０秒ずつ延ばした。ＰＣＲ断片は、基本的にメーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）が記載しているとおりにｐＧＥＭ−Ｔクローニングキットを使用してｐＧＥＭ−Ｔ中にクローニングした。連結反応混合液をＥ．Ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ II（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換した。２回の独立したＲＴ−ＰＣＲ反応（ＡおよびＢ）を行い、おのおのでｃＤＮＡクローンの類似セットを得た。サブゲノムｃＤＮＡクローンの塩基配列は、ＮＤＶ−特異的プライマー（表１）を用いて、かつ挿入体の側に配置しているプライマーによって決定した。クローンのＡおよびＢシリーズの塩基配列を比較した後、残っているあいまいさをｃＤＮＡの第３独立シリーズ（Ｃシリーズ）の相当領域の塩基配列を決めることによって取り除いた。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの塩基配列を図３に示す。
【０１３０】
ＮＤＶの全鎖長ゲノムｃＤＮＡクローンの構築
出発プラスミドとしてｐＯＬＴＶ５３５を用いることによって転写プラスミドｐＯＬＴＶ５に全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを集めた。これらのＤＮＡ断片を、図４Ｂに示すように通常の制限酵素を用いて重複点で結合した。一連のクローニング段階で、ポジション３５２１および１２３５５でＣｌａＩ部位を結合することによって生成した、ＣｌａＩ部位によって分離されたヌクレオチド１〜３５２１および１２３５５〜１５１８６を含むプラスミド（ｐ５３５−ＤＩと命名）を構築した。他の系列のクローニング段階で、ヌクレオチド３５２１〜１２３５５（ＣｌａＩ断片）を含むＮＤＶゲノムの一部を含んだプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｂと命名）を構築した。クローニングを容易にするために、後者のＣｌａＩ断片に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から得たクロラムフェニコール抵抗性（Ｃｍ）遺伝子を標識に付けた（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、１９７８）。この目的のために、プライマーＣＡＴ−Ｆ（５'−ＧＣＧＴＡＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＧ−３'）およびＣＡＴ−Ｒ（５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧ−３'）を用いるＰＣＲによってｐＡＣＹＣ１８４からＣｍ遺伝子を回収した。ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、９４℃で３０秒、６０℃で４５秒および７２℃で６０秒のサイクル３０回からなっていた。得られたＰＣＲ断片をＢｓｉＷＩで消化し、ｐＧＥＭ−Ｂの特定ＢｓｉＷＩ部位にクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｂ（ＣＡＴ）を得た。ｐＧＥＭ−Ｂ（ＣＡＴ）から得たＣｌａＩ断片は、ｐ５３５−ＤＩの特定ＣｌａＩ部位にクローニングして、ｐＮＤＦＬ（ＣＡＴ）を得た。最後に、このプラスミドからＣｍ遺伝子を、ＢｓｉＷＩでの消化とそれに続くＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａの再連結および形質転換によって除去した。得られたプラスミドをｐＮＤＦＬ＋と称した。これには、転写プラスミドｐＯＬＴＶ５の中のＴ７プロモーターおよびＨＤＶリボザイムの間にクローニングしたＮＤＶ ｃＤＮＡ全塩基配列が含まれている。
【０１３１】
個々のＮＤＶ遺伝子のクローニングおよび発現
ＮＤＶ ＬａＳｏｔａ遺伝子の各々を含むＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ法によって作成し、ｐＣＩｎｅｏ中にクローニングした。クローニングの後、断片すべての塩基配列を、挿入配列を側に持つプライマーを用いることによって、かつ遺伝子特異的プライマーによって決定した。
【０１３２】
ＮＰ−遺伝子：プライマー３８６（５'−ＧＡＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧ−３'、ｎｔ ４０〜６９）を逆転写に使用した。プライマー３６５（５'−ＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧ−３'；ｎｔ ７７〜９４）および８９２（５'−ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＴＣ−３'；ｎｔ １５７７〜１５９３）を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法に使用した。次のＰＣＲプロフィール（３０サイクル）を使用した：９５℃で３０秒、６５℃で４０秒および７２℃で４５秒。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。ＮＰタンパク質の発現は、モノクローナル抗体３８（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いて、Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９９２）によって記載されている免疫ペルオキシダーゼ単層検定法（ＩＰＭＡ）で確認した。
【０１３３】
ｐ−遺伝子：プライマーｐＲＴｌ（5'−ＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＧＴＡＧＡＡ−３'；ｎｔ １７９４〜１８１４）を逆転写に使用した。プライマーｐＲＴｌおよびｐ２（５'−ＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＣ−３'；ｎｔ ３０５３〜３０７１）を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法に使用した。次のＰＣＲプロフィール（３０サイクル）を使用した：９５℃で３０秒間、６５℃で４０秒間および７２℃で６０秒間。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングした。Ｐタンパク質の発現は、モノクローナル抗体６８８（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いて、ＩＰＭＡで確認した。
【０１３４】
Ｍ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＡ−３'；ｎｔ １〜２７）を逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５Ｍ（５'−ＧＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡ−３'；ｎｔ ３２６８〜３２８８）およびＮＤＶ３Ｍ（５'−ＴＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴ−３'；ｎｔ ４３６８〜４３８９）を、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。このＰＣＲ法は、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で２分間のサイクル５回、ついで６８℃での伸長反応時間をサイクルごとに２０秒ずつ長くしたサイクル１５回からなっていた。得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑端を作り、ＮｈｅＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。Ｍタンパク質の発現は、モノクローナル抗体４２４（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いてＩＰＭＡで確認した。
【０１３５】
Ｆ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴ（上記参照）を逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５Ｆ（５'−ＡＣＧＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＴＧＧ―３'；ｎｔ ４５０８〜４５２６）およびＮＤＶ３Ｆ（５'−ＡＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＴＣＣＴＣＡＴ−３'；ｎｔ ６２１２〜６２３１）を、Ｍ−遺伝子について上に記載した条件を用いて、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。得られたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＮｈｅＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。Ｆタンパク質の発現は、モノクローナル抗体８Ｅ１２Ａ８Ｃ３（ＩＤ−ＤＬＯ、哺乳動物ウイルス学の部門）を用いて、ＩＰＭＡで確認した。
【０１３６】
ＨＮ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴを逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５ＨＮ（５'−ＧＴＡＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'；ｎｔ ６３３５〜６３５４）およびＮＤＶ３ＨＮ（５'−ＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３'；ｎｔ ８２０５〜８２２７）を、Ｍ−遺伝子について上に記載した条件を用いて、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。得られたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＸｍａＩによる消化の後、ｐＣＩｎｅｏ中、平滑にした（Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼによる）ＮｈｅＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。ＨＮ−タンパク質の発現は、モノクローナル抗体８６（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いてＩＰＭＡで確認した。
【０１３７】
Ｌ−遺伝子：ＳａｃIIおよびＳａｌＩで消化することによって、ｃＤＮＡクローンｐＧＥＭ−Ｌ７ａ（図４Ａ）からＬ−遺伝子を回収した。ＳａｌＩでの消化の前に、ＳａｃII部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの処理によって平滑にした。得られた断片は、ｐＣＩｎｅｏ中、平滑にした（Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼによる）ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングした。Ｌ−遺伝子のＴ７プロモーターとＡＴＧ開始コドンの間にある５'非翻訳領域には、Ｌタンパク質の正しい発現を阻害するかもしれない２個のフレーム外ＡＴＧコドンが含まれていた。したがって、第一ＡＴＧを欠き、第二ＡＴＧがＰＣＲ突然変異誘発によってＡＡＧに変化した新しいプラスミドを、下記のように、構築した。プライマー５ＬＥ（Ｅ）（５'−ＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＧＧＧ−３'；ｎｔ ８３３２〜８３７４）および３ＬＥ（Ｂ）（５'−ＧＴＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＡＡＴＧＣ−３'；ｎｔ ８８４７〜８８７０）を、プラスミドｐＧＥＭ−Ｌ７ａ（図４）を用いるＰＣＲ反応に使用した。本ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、９４℃で３０秒間、６０℃で４５秒間および７２℃で６０秒間のサイクル３０回からなっていた。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐＣＩｎｅｏＬ（Ｎ）を作成した。続いて、Ｌ−遺伝子（ｎｔ ８８５２〜１５０４６）の残りの部分を含んでいるｐＧＥＭ−Ｌ７ａから得たＢｓｉＷＩ−ＳａｌＩ断片をｐＣＩｎｅｏＬ（Ｎ）中、ＢｓｉＷＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、プラスミドｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）を作成した。Ｌタンパク質に対する抗体は入手不能なので、Ｌタンパク質の発現は、免疫化学によっては確認できなかった。
【０１３８】
Ｆ−遺伝子への遺伝的標識の導入
クローニングした全鎖長ｃＤＮＡから感染性ウイルスを産生させうることを明白に示すために、ＰＣＲ突然変異誘発によってＦ遺伝子に遺伝的タグを導入した。この目的のために、２個の重複ＰＣＲ断片を用いてＦ遺伝子をクローニングした。第一ＰＣＲ断片は、プライマー類ＮＤＶ５Ｆ（上記参照）およびプライマーＦ５Ｒ（５'−ＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＴＣＡＣ−３'；ｎｔ ４８５９〜４８９４）を使用することによって生成した。太字で示した残基は、Ｆ１とＦ２との間のタンパク質分解的切断部位のアミノ酸配列を、ＮＤＶ ＬａＳｏｔａ株（ＧＧＲＱＧＲ｜Ｌ）の配列から毒性のあるＮＤＶ株（ＧＲＲＱＲＲ｜Ｆ）のための共通切断部位のそれに変えるために、プライマーに導入した変換部分である。第二ＰＣＲ断片は、プライマーＦ３Ｆ（５'−ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＴＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴＴＧＧ−３'；ｎｔ ４８７５〜４９１１）およびＩＶ０９（５'−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣ−３'；ｎｔ ６２４６〜６２６６）を使用することによって産生した。ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで行い、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間のサイクル２５回からなっていた。２個の重複ＰＣＲ断片（重複は、プライマーの塩基配列においてイタリックで示す）は、プライマーＮＤＶ５ＦとＩＶ０９を用い、かつ同一のＰＣＲ条件を用いる第二ＰＣＲ法で、結合させた。得られた断片（Ｆ遺伝子の全ＯＲＦを含み、ビルレント共通切断部位をコードしている）をＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位との間にクローニングして、ｐＣＩｎｅｏＦwtを産生した。ｐＣＩｎｅｏＦwtから得たＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片（ｎｔ ４６４６〜４９５２）を使用して、ｐ５３５−ＤＩ中、ＣｌａＩ部位とＳｃａＩ部位との間にｐＧＥＭ−Ｂから得たＣｌａＩ−ＳｃａＩ断片（ｎｔ ３５２１〜１０３１１）を挿入することによって構築したプラスミドｐ５３５−Ｓ中の対応する断片を置換した（図４Ｃ参照）。得られたプラスミドは、ｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］と称した。ｐＡＣＹＣ１８４（上記参照）由来のＣｍ−抵抗性遺伝子を含むＰＣＲ断片を、ＸｂａＩ断片としてプラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］の特定ＸｂａＩ部位（ＮＤＶの塩基配列のポジション６１７２）にクローニングして、プラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］Ｃｍを産生した。続いて、このプラスミドのＣｍで標識を付けたＡｐａＩ−ＳｐｅＩ断片（ｎｔ ２２８５〜８０９４）を用いて、全鎖長ｃＤＮＡ クローンｐＮＤＦＬ+の対応する断片を置換した。最後に、ＸｂａＩでの消化とそれに続くＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる再環化によって、このプラスミドからＣｍ遺伝子を除去した。得られたプラスミド（遺伝的に標識を付けた全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを含んでいる）をｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］と称した。
【０１３９】
個々のＮＤＶ遺伝子を発現する、安定に形質転換した細胞系の生成
プラスミド類ｐＣＩｎｅｏＮＰ、ｐＣＩｎｅｏＰ、ｐＣＩｎｅｏＭ、ｐＣＩｎｅｏＦ、ｐＣＩｎｅｏＦwtおよびｐＣＩｎｅｏＨＮを使用して、個別にこれらのタンパク質を発現する、安定に形質転換した細胞系を生成させた。トランスフェクションの前日に、６ｃｍのペトリ皿にＣＥＲ細胞を播種し、一夜インキュベートして６０〜８０％の集密度を得た。この細胞を、基本的にメーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示どおりにＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅとＯｐｔｉＭｅｍの１２μｌを用いて、プラスミドＤＮＡ２μｇでトランスフェクションした。４８時間後、細胞にトリプシン処理をし、希釈液を、１０ｃｍペトリ皿中、Ｇ４１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）５００μｇ/ｍｌを含む培地に播種した。３日毎に、培地を新しい培地に置換したが、その際Ｇ４１８を１００μｇ／ｍｌずつ増量し、最終濃度は８００μｇ／ｍｌに至った。Ｇ４１８ ８００μｇ／ｍｌ含有培地に細胞を入れたままにし、トランスフェクションの３週間後、個々のコロニーをつまんで、９６穴のペトリ皿に移した。クローニングした細胞系について、一過性発現試験について上に記載したのと同じようにＩＰＭＡを用いて、個々のＮＤＶ遺伝子の発現を調べた。
【０１４０】
ＮＰ、Ｐ、ＭまたはＦを構成的に発現する細胞系を確認することができ、単離した。しかしながら、ＨＮタンパク質を発現する細胞系を産生させることはできなかった。恐らく、ＨＮの構成的発現が細胞に対して有毒になるのであろう。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する、安定に形質転換させた細胞系の生成
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩでの消化によってプラスミドｐＲＴ７ＮＴ（Ｒｅｎe ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐ、ＩＤ−ＤＬＯ、哺乳動物ウイルス学の部門）から回収した。得られた断片には、バキュロウイルスｐ１０プロモーターの背後に隠れて存在するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が含まれている。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＩｎｅｏ０中、ＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングして、プラスミドｐＣＩｎｅｏ１０７を産生した。プラスミドｐＣＩｎｅｏ０は、Ｔ７プロモーターを欠いているが、ＮｈｅＩでの切断、続いてのＳｃａＩによる部分切断、付着末端へのＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼの導入、ならびにＴ４ ＤＮＡ リガーゼによる再環化によってｐＣＩｎｅｏ１０７から誘導した。ＥｃｏＲＩとＰａｃＩによる消化、続いての平滑末端を作成するためのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理、および再環化によって、ｐＣＩｎｅｏ１０７からバキュロウイルスの塩基配列を除去した。得られたプラスミドをｐＣＩｎｅｏ００７と称した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現は、細胞をｐＣＩｎｅｏ００７とｐＰＲｈ０１でコトランスフェクションすることによって確認した。後者のプラスミドには、Ｔ７プロモーターの背後にクローニングされ、内在性リボソーム侵入部位（Ｒｅｎe ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐ、私信）を含む古典的なブタコレラウイルスのＥ２が含まれている。Ｅ２タンパク質の発現は、モノクローナル抗体Ｖ４（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１９８６）を用いるＩＰＭＡで測定した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する安定に形質変換したＣＥＲ細胞を、１０ｃｍのペトリ皿を使用したことおよびｐＣＩｎｅｏ００７ ＤＮＡ ５μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ２５μｌで細胞をトランスフェクションしたことを除いて上記と同じように、産生し、単離した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現について個々の細胞系を調べるために、細胞を、プラスミドｐＰＲｈ０１でトランスフェクションし、Ｅ２の発現（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに依存する）を、モノクローナル抗体Ｖ４を用いてＩＰＭＡで測定した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現した数個の細胞系を同定した。１細胞系（ＣＥＲ−Ｃ９と称する）をその後の実験に使用した。
【０１４１】
ＨＮ遺伝子およびハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニングおよび発現
上記したように、プライマー３ＵＩＴを使用して、ＮＤＶの一本鎖ｃＤＮＡならびにトリパラミクソウイルスの血清型２および４（ＡＰＭＶ２およびＡＰＭＶ４）を作製した。その後のＰＣＲ反応はすべて、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間のサイクル２５回の条件を用いて行った。
【０１４２】
ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子の全コード領域は、プライマーＩＶ０３（５'−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＣ−３'）およびＩＶ０５（５'−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＡＡＴＧ−３'）（塩基配列は、ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１４０３０）から引き出した）を用いるＰＣＲ法によって回収した。ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子の全コード領域は、プライマーＩＶ０６（５'−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＣ−３'）およびＩＶ０８（５'−ＡＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＧ−３'） （塩基配列は、ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１４０３１）から引き出した）を用いて、ＰＣＲ法によって回収した。得られたＰＣＲ断片を（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔでのサブクローニングの後に）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２およびｐＣＩｎｅｏＨＮ４と称した。
【０１４３】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＨＮ遺伝子とＡＰＭＶ２および４のＨＮ遺伝子との間のハイブリッドを、次のように重複ＰＣＲ法によって構築した。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＨＮ遺伝子のＮ末端部（ａａ １−１４１）を、プライマーＩＶ０１Ｂ（５'−ＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'；ｎｔ ６３２５〜６３５４）およびＩＶ１０（５'−ＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣ−３'；ｎｔ ６８１１〜６８３４）を用いて、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子のＣ末端部（ａａ １４２〜５８０）を、プライマーＩＶ１１Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣ−３'）およびＩＶ０５を用いてＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。得られたＰＣＲ断片を、重複ＰＣＲ（重複はイタリックで表示）においてプライマーＩＶ０１ＢおよびＩＶ０５を用いることによって、かつＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素ミックスを用いることによって連結させた。得られたＰＣＲ断片を（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおけるサブクローニングの後）、ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化させ、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドには、ＮＤＶのａａ １〜１４１およびＡＰＭＶ２のａａ １４２〜５８０からなるハイブリッドＨＮ遺伝子が含まれており、これをｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２141と称した。
【０１４４】
ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子のＣ末端部（ａａ １４３〜５６９）を、プライマーＩＶ１４Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣ−３'）およびＩＶ０８を用いることによって増幅した。この断片は、プライマーＩＶ０１ＢおよびＩＶ０８を用いて、重複ＰＣＲにおいてＮＤＶのＨＮ遺伝子のＮ末端部（上記参照）と連結させた。得られたＰＣＲ断片を、（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおいてサブクローニングした後）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、ＮＤＶのａａ １〜１４１とＡＰＭＶ４のａａ １４３〜５６９とからなっているハイブリッドＨＮ遺伝子を含んでおり、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４141と称した。
【０１４５】
上記の構築に類似して、ＮＤＶのａａ １〜１４３とＡＰＭＶ２のａａ １４４〜５８０、またはＮＤＶのａａ １〜１４３とＡＰＭＶ４のａａ １４５〜５６９からハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。これらの構築のために、下記のプライマーのペアを使用してＰＣＲ断片を得た；ＮＤＶ ａａ １〜１４３には、プライマーＩＶ０１ＢとＩＶ１３（５'−ＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣ−３'；ｎｔ ６８１６〜６８４０）；ＡＰＭＶ２ ａａ １４４〜５８０には、プライマーＩＶ１４Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣ−３'）とＩＶ０５；ＡＰＭＶ４ ａａ １４５〜５６９には、プライマーＩＶ１５Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧ−３'）とＩＶ０８。これらのＰＣＲ断片を、（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおいてサブクローニングした後）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏ１／２143およびｐＣＩｎｅｏ１／４143と称した。ＨＮタンパク質の発現を調べるために、ＣＥＲ細胞またはＱＭ５細胞をＦＰＶ−Ｔ７に感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１で１時間感染させ、プラスミド類ｐＣＩｎｅｏＨＮ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２、ｐＣＩｎｅｏＨＮ４、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２141、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143、そしてトランスフェクションの２４時間後、その単層を室温で４５分間、ニワトリ赤血球の１％ＰＢＳ懸濁液で覆った。その後、その単層をＰＢＳで注意深く３回洗浄し、トランスフェクションした細胞への赤血球の付着を顕微鏡で調べた。ＨＮおよびＦタンパク質の共発現後の細胞融合の誘導を調べるために、ＣＥＲ細胞またはＱＭ５細胞を、ｐＣＩｎｅｏＦwtと、ｐＣＩｎｅｏ−ＨＮ１、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２、ｐＣＩｎｅｏＨＮ４、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２141、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４141またはｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143のいずれかとコトランスフェクションした。２〜３日間インキュベートした後、その単層をＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｅｍｓａ溶液（水で３０倍希釈）で１５分間染色し、顕微鏡で調べた。
【０１４６】
全鎖長ゲノムＮＤＶ ｃＤＮＡへのハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニング
オリゴヌクレオチドＨＮ１２ａ（５'−ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＡ−３'）とＨＮ１２ｂ（５'−ＣＴＡＧＴＡＡＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣ−３'）とを用いて、一つの合成リンカー（ＨＮ１２と表示）をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部位との間に挿入した。オリゴヌクレオチドＨＮ１４ａ（５'−ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＡ−３'）とＨＮ１４ｂ（５'−ＣＴＡＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣ−３'）とを用いて、一つの合成リンカー（ＨＮ１４）をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部位との間に挿入した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１２およびｐＧＥＭ−ＨＮ１４と称した。これらのプラスミドをＮｏｔＩとＸｂａＩで消化し、プラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］Ｃｍから得たＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片（ｎｔ ３３９０〜７４８８）をクローニングするために使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳと称した。これらのプラスミドのＨＮ遺伝子を、それぞれ、プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143から得たハイブリッドＨＮ遺伝子で置換した（「ＨＮ遺伝子およびハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニングおよび発現」のセクション参照）。この目的のために、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143をＮｈｅＩとＳｍａＩで消化し、プラスミドｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳのＮｈｅＩ部位とＨｐａＩ部位との間にクローニングして、それぞれ、ｐＧＥＭ＋ＨＮ１２およびｐＧＥＭ＋ＨＮ１４を得た。
【０１４７】
後者のプラスミドを用いて、ＮＤＶの全鎖長ゲノムｃＤＮＡクローンにハイブリッドＨＮ遺伝子を導入した。この目的のために、プラスミドｐＧＥＭ＋ＨＮ１２およびｐＧＥＭ＋ＨＮ１４を、ＮｏｔＩとＳｐｅＩで消化し、ＨＮ１２またはＨＮ１４遺伝子のいずれかを含む断片を用いて、ｐＮＤＦＬ＋の対応する断片を置換し、それぞれ、ｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２143ＣｍおよびｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４143Ｃｍを産生した。これらのプラスミドから、ＸｂａＩでの消化とそれに続くＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いる再環化によってＣｍ遺伝子を取り除いた。「６の法則」を満たすために、自己相補性オリゴヌクレオチドを用いて、これらのプラスミドの特定ＳｐｅＩ部位にリンカーを導入した。リンカーＨ２（５'−ＣＴＡＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ−３'）をプラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２143に、リンカーＨ３（５'−ＣＴＡＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３）をプラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４143に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２143（Ｈ２）およびｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４143（Ｈ３）を産生した。
【０１４８】
ＮＤＶ ＬａＳｏｔａのＨＮタンパク質にある特異的エピトープの削除
ＭＡｂ ４Ｄ６によって認識される（Ｌｏｎｇら、１９８６；Ｍｅｕｌｅｍａｎｓら、１９８６）、ＮＤＶ ＬａＳｏｔａのＨＮタンパク質中の特異的エピトープ、すなわちアミノ酸３４６〜３５４（ＰＤＥＱＤＹＱＩＲ）を、この配列をＡＰＭＶ−２（ＮＲＴＤＩＱＱＴＩ）またはＡＰＭＶ−４（ＰＤＰＬＱＤＱＩＬ）のいずれかのＨＮタンパク質の相当する配列に置換することによって、削除した。この目的のために、プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ（「個々のＮＤＶ遺伝子のクローニングおよび発現」のセクション参照）をテンプレートとして用いて、重複ＰＣＲ断片を作製した。ＡＰＭＶ−２配列のために、プライマー類ＩＶ０１（５'−ＧＴＡＧＡＣＧＣＧＴＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'）およびプライマー３ＨＮ２（５'−ＧＡＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＣＡＧＴＣＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣ−３'）を用いて第一ＰＣＲ断片を作製した。第二ＰＣＲ断片は、プライマー５ＨＮ２（５'−ＡＡＴＣＧＧＡＣＴＧＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣ−３'）およびＮＤＶ３−ＨＮ（５'−ＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３'）を用いて作製した。得られた断片を結合させて、プライマー類ＩＶ０１Ｂ（５'−ＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'）およびプライマーＮＤＶ３−ＨＮを用いる第三ＰＣＲ法のためのテンプレートとして使用した。ＡＰＭＶ−４配列のために、第一ＰＣＲ断片を、プライマー類ＩＶ０１およびプライマー３ＨＮ４（５'−ＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣ−３'）を用いて作製した。第二ＰＣＲ断片は、プライマー５ＨＮ４（５'−ＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣ−３'）およびＮＤＶ３−ＨＮを用いることによって作製した。得られた断片を結合して、プライマーＩＶ０１ＢおよびＮＤＶ３−ＨＮを用いる第三ＰＣＲ法のためのテンプレートとして使用した。プライマー３ＨＮ２／５ＨＮ２および３ＨＮ４／５ＨＮ４は、一部相補的であり、それぞれ、ＨＮ２配列（ＮＲＴＤＩＱＱＴＩ）およびＨＮ４（ＰＤＰＬＱＤＱＩＬ）のための遺伝子コードを含んでいる。ＰＣＲ法は、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。このＰＣＲ法は、９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間および６８℃で２分間のサイクル３０回、続いて６８℃で４分間のサイクル１回からなっていた。ＰＣＲ断片は、ＥｃｏＮＩとＢｓｕ３６Ｉで消化し、ｐＣＩｎｅｏＨＮのＥｃｏＮＩ部位とＢｓｕ３６Ｉ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ４ｅ）と称した。検討した一過性発現は、修飾したタンパク質が正しく発現されて、ニワトリ赤血球を用いる赤血球吸着ウイルス試験から判断されるように、細胞表面に輸送されたことを示した。
【０１４９】
さらに、ＮＤＶのＨＮの線状エピトープに対抗するよう向けられており、アミノ酸３４６〜３５４からなる（または、少なくともそれを含む）ＭＡｂ ６Ｄ４は、修飾ＨＮタンパク質とは反応しなかった。
【０１５０】
プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ４ｅ）をＮａｒＩとＳｐｅＩで消化し、修飾ＨＮ遺伝子を含む断片を、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳのＮａｒＩ部位とＳｐｅＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＧＥＭ−ＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＧＥＭ−ＨＮ１（ＨＮ４ｅ）と表示）をＮｏｔＩとＳｐｅＩで消化し、ｐＭＤＦＬ＋中のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片と置換するのに使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ２ｅ）ＣｍおよびｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ４ｅ）Ｃｍと称した。これらのプラスミドから、ＸｂａＩで消化させて再連結することによってＣｍ遺伝子を取り除いた。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ２ｅ）およびｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ４ｅ）と称した。
【０１５１】
結果
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'および５'末端部の塩基配列
ＮＤＶゲノムの推定３'末端の配列は、ここで用いたＮＤ株（ＬａＳｏｔａ）とは異なる株（Ｄ２６）ではあるが、すでに公表されている（Ｉｓｈｉｄａら、１９８６）。Ｙｕｓｏｆｆら（１９８７）は、Ｌ遺伝子およびＮＤＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ＣのＬ遺伝子の背後にある比較的大きな非コード領域の配列を公表した。しかしながら、本出願に示すように、この配列には、感染性模写ＮＤＶを生成することを不可能にするウイルスゲノムの５'末端全体が含まれていなかった。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムの３'および５'末端部は、複製および転写の基本的な機能を果たす（ＬａｍｂおよびＫｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９６）。それゆえ、逆遺伝学による感染性ウイルスの作製（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、１９９６）に使用することができる、全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを作製するためには、ウイルスゲノムの正確な３'および５'末端を含めることが絶対的に必須である。したがって、われわれは、３'および５'ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）を利用して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムＲＮＡの３'および５'両末端の正確な塩基配列を決定した。５'末端は、一本鎖アンカープライマー（ＡＬＧ３）を、ゲノムＲＮＡの５'末端の逆転写によって産生した一本鎖ｃＤＮＡに連結した後、ＰＣＲ法によって回収した。アンカープライマーに相補的なプライマー（ＡＬＧ４）およびＮＤＶ特異的プライマーを用いることによって、５'末端を含んだＰＣＲ生成物を産生した。
【０１５２】
ＮＤＶの３'末端をクローニングするために、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、一本鎖アンカープライマーＡＬＧ３をウイルスＲＮＡの３'末端に連結し、プライマーＡＬＧ４およびＮＤＶ特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた（方法Ｉ）。別法としては、ＮＤＶ ＲＮＡの３'および５'末端を、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、得られたコンカテナン（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）ＲＮＡを、連結点をそばに置いたＮＤＶ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ法に使用した（方法II）。３'および５'ＲＡＣＥ生成物は、ＴベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII−ＴＳＫ（ＩｃｈｉｈａｒａおよびＫｕｒｏｓａｗａ、１９９３）またはｐＧＥＭ４Ｚの中にクローニングし、数個の独立したクローンを単離し、塩基配列を決定した。結果は、表２にまとめてある。
【０１５３】
３'および５'末端の直接の比較を可能にするために、塩基配列はＤＮＡの形で示し、ゲノム鎖の３'末端は、アンチゲノム鎖の５'末端として表示する。ゲノムＲＮＡのレベルでは、３'末端は、３'−ＵＧＧＵＵＵＧＵＣＵＣＵＵＡＧと読める。一方、５'末端の配列は、ＵＵＵＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡ−５'と読める。この３'末端の配列は、公表されたＮＶＤ株Ｄ２６の３'末端配列（Ｉｓｈｉｄａら、１９８６）にほぼ類似している。しかしながら、５'末端の配列は、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａが、ＮＤＶ株ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣのＬ遺伝子の公表された配列（Ｙｕｓｏｆｆら、１９８７）と比較すると、６４個の塩基が余計に存在することを示した（図６）。
【０１５４】
ヘルパーウイルスによるＮＤＶミニゲノムの複製
ＮＤＶの３'および５'末端が複製および転写に機能しているかどうかを決定するために、ＮＤＶの３'末端（ｎｔ １〜１１９）、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードしているレポーター遺伝子およびＮＤＶの５'末端（ｎｔ １４９７３〜１５１８６）からなったミニゲノムを構築した（図２）。
【０１５５】
これらのミニゲノムを、転写ベクターｐＯＬＴＶ５中で両方向にクローニングして、それぞれ、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３を産生した（構築の詳細は「材料および方法」参照）。プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１）には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれ、その結果、特異ＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位、Ｄ型肝炎ウイルス由来の自己触媒リボザイムおよびバクテリオファージＴ７由来の転写終結シグナルが含まれている（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）。プラスミドｐＯＬＴＶ５３５のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビボまたはインビトロの転写により、アンチゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ）が生成し、一方、プラスミドｐＯＬＴＶ５５３の転写では、ゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）が生成する（図５）。
【０１５６】
プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３によって産生したミニゲノムＲＮＡが、ヘルパーウイルスとしてＮＤＶを用いることによって複製されかつ発現されるかどうかを調べるために、構成的に（ＣＥＲ−Ｃ９細胞、「材料および方法」参照）、またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する鶏痘組換え体ｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９５；以後ＦＰＶ−Ｔ７と称す）で感染させた後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現したＣＥＲ細胞を使用した。ＣＥＲ−Ｃ９細胞およびＦＰＶ−Ｔ７感染ＣＥＲ細胞を、ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションし、３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を、１時間ＮＤＶに感染させるか、または未感染のままに放置した。トランスフェクションの約２４時間後、培地から細胞を採取して、ＳＥＡＰ活性を検定した。結果は、ｐＯＬＴＶ５３５でトランスフェクションしたＦＰＶ−Ｔ７感染細胞においてＳＥＡＰ発現が非常に高いことを示した。これは驚くべきことではない。何故なら、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写により、アンチゲノム［＋］−ＲＮＡが生成し、これが鶏痘酵素によってキャップを付けられ、宿主細胞によって効果的に翻訳されるからである。ｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションした細胞において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写によって、ゲノム［−］−ＲＮＡが生成するが、これがＳＥＡＰタンパク質に翻訳されるためには、ヘルパーウイルスによって［＋］−ＲＮＡに変換されねばならない（図５参照）。両方の場合に、非感染性細胞と比較して、ＮＤＶ感染細胞におけるＳＥＡＰ発現の増加は認められなかった。反対に、ＮＤＶ感染細胞のＳＥＡＰ発現は、非感染細胞におけるよりも常に約２倍低かった（データは示さず）。ｐＯＬＴＶ５３５をトランスフェクションした細胞に関しては、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって作り出された転写によるＳＥＡＰ発現のレベルがすでに非常に高いことで説明できるかもしれない。
【０１５７】
しかしながら、ｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションした細胞において、ここではＳＥＡＰの効果的な発現がウイルスポリメラーゼ複合体によるアンチゲノム［＋］−ＲＮＡまたはｍＲＮＡへのゲノム［−］−ＲＮＡの転換に依存しているが、われわれはＮＤＶ感染後のＳＥＡＰ発現の増加を期待したのであった。
【０１５８】
われわれは、このミニゲノムがＮＤＶによって発現され、複製されることがなかった二つの理由を考慮することができる。第一に、ミニゲノムＲＮＡの大きさがいわゆる「６の法則」（ＣａｌａｉｎおよびＲｏｕｘ、１９９３；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら、１９９８）に従っていないことである。この法則によれば、パラミクソウイルスゲノムは、その長さが６の倍数のｎｔであるときにのみ、効果的に複製されるのである。第二に、ミニゲノムＲＮＡの５'末端に存在する２個の余分のＧ残基が、ウイルスポリメラーゼ複合体による正しい複製および／または転写を妨害するのかもしれない。ゲノムの複製が「６の法則」に依存しているかどうかを確認するために、われわれは、サイズで１ｎｔだけ大きくした短い自己相補オリゴヌクレオチドの１系列を、ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３の特異的ＣｌａＩ部位に挿入した（図２）。得られたプラスミド（ｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜Ｎ５）は、サイズが１〜６ｎｔだけ異なっており、したがってそれらの一つによって、「６の法則」に合致するミニゲノムＲＮＡが生成するに違いない。これらのプラスミドを用いて、上に記載したように、ＣＥＲ細胞またはＦＰＶ−Ｔ７感染ＣＥＲ−Ｃ９細胞をトランスフェクションした。その結果、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３だけがＮＤＶ感染後のＳＥＡＰ活性の上昇を引き起こした。これらのプラスミドからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって生成したミニゲノムＲＮＡの長さは、計算すると６ｎ＋２であった。ミニゲノムＲＮＡの５'末端には２個の余分のＧ残基が存在するので、これらの結果は、ミニゲノムＲＮＡの真正の３'末端と５'末端の間に存在するＲＮＡ配列のサイズだけが「６の法則」に関係していることを示唆している。このことは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写開始を、ＲＮＡに組み入れた最初のヌクレオチドがＮＤＶの３'または５'末端のヌクレオチドとなるように変えたミニゲノムプラスミドを構築することによって確認された（「材料および方法」参照）。これらのプラスミドのトランスフェクションは、プラスミドｐＯＬＴＶ７３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ７５３Ｎ３によって生成したミニゲノムＲＮＡだけがヘルパーウイルスによって複製されることを示した（実験結果は示さず）。これらの発見は、再度、ＮＤＶの複製が６の法則に厳密に依存していることを示唆している。さらに、これらの発見は、ミニゲノムＲＮＡの５'末端にある余分のＧ残基２個は正確な複製を妨害しないことを示している。他のパラミクソウイルス科由来のミニゲノムプラスミド（またはＤＩプラスミド）でも同様の結果が得られた（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２；ＨａｒｔｙおよびＰａｌｅｓｅ、１９９５）。
【０１５９】
ヘルパーウイルスによるＮＤＶミニゲノムのパッケージング
ミニゲノムＲＮＡがＮＤＶヘルパーウイルスでパッケージされるか否かを決定するために、トランスフェクションした細胞の培地を新しい単層に移し、１時間の吸着の後、その単層をＰＢＳで３回洗浄し、さらに完全培地でインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、培地中のＳＥＡＰ活性を測定した。その結果、ＳＥＡＰ活性はミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３でトランスフェクションした細胞からの培地で処理した細胞にだけ存在することが判った（表４）。この発見は、ミニゲノムＲＮＡが、ＮＤＶエンベロープにパッケージされ得ることおよびこれらの粒子が細胞を感染させ得ることを示している。さらに、これらの結果が示していることは、パッケージングが複製に依存していることであり、このことは、ウイルス性ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質と複合体を形成するＲＮＡ分子だけがウイルス様粒子にパッケージされることを示している。
【０１６０】
ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドによるＮＤＶミニゲノムの複製
ミニゲノムＲＮＡも基本的なＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているプラスミドによって複製されるかどうかを決定するために、われわれは、ＦＰＶ−Ｔ７に感染した細胞でコトランスフェクション実験を行った。ミニゲノムプラスミドならびに、それぞれ、プラスミドｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）からなるプラスミドの組み合わせで細胞をトランスフェクションした。ネガティブコントロールとして、ｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）（基本的Ｌタンパク質をコードしている）を、ベクタープラスミドｐＣＩｎｅｏで置換した。その結果（表５）、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているプラスミドは事実、ミニゲノムＲＮＡを複製し得ることが判明した。さらにこれらの結果は、ヘルパーウイルスによるミニゲノム複製に類似して、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質による複製もまた、６の法則に依存していることを示している。
【０１６１】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムの塩基配列
全ＮＤＶゲノムに亘るサブゲノムｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ法によって構築した（図４）。ＰＣＲエラーの数を最小限に保つために、プルーフリーディング酵素ミックス（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、限られた回数のＰＣＲサイクル（１５サイクル）と組み合わせて使用した。ＮＤＶ ＲＮＡの３'末端に相補的であるプライマー３ＵＩＴを逆転写のために使用し、そして遺伝子特異的プライマーをＰＣＲ法のために使用した。起こり得るＰＣＲエラーを確認するために、３つの独立したＲＴ反応を行い、サブゲノムｃＤＮＡの３つの独立した組を作製した。サイズにおいて約４ｋｂから７ｋｂまでばらついているｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ中にクローニングした。公表されたＮＤＶ配列から引き出したプライマーを用いることによって、あるいはこの配列決定プロジェクトの間に引き出されたＮＤＶ配列から取り出したプライマーによって、二組のｃＤＮＡの塩基配列を決定した（表１）。残っている不確かさは、第３組のｃＤＮＡクローンの相当領域の配列決定をすることで解消した。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムは、１５１８６ｎｔからなっている（図３）が、これは、このゲノムが、今日までに全配列が確立されたパラミクソウイルスゲノム全体の中で最小のゲノムであることを示している（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９８）。
【０１６２】
転写プラスミドｐＯＬＴＶ５中の全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡクローンの構築
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全鎖長ｃＤＮＡクローンを構築するために、図４に示されている戦略に従って、全ＮＤＶゲノムに亘る重複ｃＤＮＡクローンを共有制限部位で結合した。転写プラスミドｐＯＬＴＶ５から導出されるミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５（上記参照）の中に全ＮＤＶ ｃＤＮＡを集めた。
【０１６３】
図４Ｂに見られるように、全ＮＤＶ ｃＤＮＡの構築の最終段階は、ｐＧＥＭ−Ｂから得た約８．８ｋｂ ＣｌａＩ（ｎｔ ３５２１〜１２３５５）断片を、両側にＣａｌＩ部位を配置しているＮＤＶ配列（すなわち、それぞれ、ｎｔ １〜３５２１および１２３５５〜１５１８６）を含んだｐ５３５−ＤＩにクローニングすることであった。この段階は、非常に困難であることが判った。われわれは、正確なクローンを産生することに何度も失敗した。そこで、ｐＧＥＭ−ＢのＣｌａＩ断片に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から得たクロラムフェニコール抵抗性（Ｃｍ）遺伝子を標識として付けた。Ｃｍ遺伝子を持つＣｌａＩ断片を単離して、ｐ５３５−ＤＩのＣｌａＩ部位にクローニングし、ＣｍとＫｍ両者に対して抵抗する形質変換体を選び出した。形質変換体は、増殖が遅いので、抗生物質の選択を、Ｃｍは１５μｇ／ｍｌ、Ｋｍは１０μｇ／ｍｌに落とし、インキュベーション温度を３７℃から３２℃に下げた。最後に、このプラスミドからＣｍ遺伝子を、ＢｓｉＷＩでの消化とそれに続くＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いる再環化で除去した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換の後、Ｃｍ感受性の両方についてスクリーニングすることによって、適切なプラスミドを持つ細胞を、表現型によって同定した。転写プラスミドｐＯＬＴＶ５のＳｍａＩ部位とＳｔｕＩ部位との間にクローニングした全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡからなる、得られたプラスミドをｐＮＤＦＬ＋と称した。
【０１６４】
全鎖長ｃＤＮＡからの感染性ＮＤＶの産生
クローニングしたｃＤＮＡだけから感染性ＮＤＶを産生するために、ミニゲノムプラスミドについて上に記載したように、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）を用いるコトランスフェクション実験において、プラスミドｐＮＤＦＬ＋を使用した。ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３を用いること、およびＳＥＡＰ発現を測定することによってＣＥＲおよびＣＥＦ細胞のトランスフェクションを監視した。ネガティブコントロールとしては、ｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）をｐＣＩｎｅｏに置換した。コトランスフェクションの後、５％尿膜腔液を含む培地で３〜６日間細胞をインキュベートした。尿膜腔液の添加は必要である。なぜなら、ＣＥＲおよびＣＥＦ細胞は、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＦタンパク質を切断するために必要とされる適当なプロテアーゼを欠いているからである。
【０１６５】
Ｆタンパク質の開裂は、感染性ウイルスの細胞から細胞への伝播および産生のために絶対必要である。３日間のインキュベーションの後、われわれは、Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて固定単層の免疫学的染色を行った。その結果、抗体で染色した細胞はｐＮＤＦＬ（＋）、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−ＰおよびＬ（ｃ）でトランスフェクションした単層にのみ存在することが判明した。この結果は、ゲノムの複製および発現がこれらの細胞で起こっていることを示した。コトランスフェクション実験でｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）をｐＣＩｎｅｏに置換した場合には、染色した細胞は認められなかった。
【０１６６】
感染性ウイルスを回収するために、トランスフェクションしたＣＥＦ単層の上清を有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。４日後、尿膜腔液を採取し、血球凝集反応検定法で分析し、さらに卵中で経代培養した。その結果、ｐＮＤＦＬ（＋）、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）の複合体でトランスフェクションした細胞の上清だけが、血球凝集検定法で陽性の反応を示した。血球凝集反応陽性を示した尿膜腔液は、続いて、異なるＮＤＶ株間を区別するのに使用することのできるモノクローナル抗体７Ｂ７、８Ｃ１１、５Ａ１、７Ｄ４および４Ｄ６（Ｌｏｎｇら、１９８６）を用いて、血球凝集抑制検定法で分析した。この検定法の結果では、接種した卵から回収したＮＤＶ株は、元のＬａＳｏｔａ株と同じ活性を示した。接種した鶏卵から回収したウイルスは、元のＬａＳｏｔａ株からのものと区別するためにＮＤＦＬと称した。
【０１６７】
完全長ｃＤＮＡからの遺伝的に修飾したＮＤＶの作成
共存形質移入（コトランスフェクション）を用いて、クローニングした完全長のＮＤＶのｃＤＮＡから感染性ウイルスを回収することができることをはっきりと示すために、プラスミドｐＮＤＦＬ（＋）に遺伝子タグを導入した。この目的のために、ＰＣＲの変異誘発（詳細は材料と方法の項参照）によって、Ｆｏタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を、ＬａＳｏｔａ株の配列（ＧＧＲＱＧＲ／Ｌ）から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス配列（ＧＲＲＱＲＲ／Ｆ）に変更した。上記共存形質移入システムを用いて、ウイルスを作成するために、出来上ったプラスミドｐＤＮＦＬ＋［Ｆwt］を使用した。共存形質移入したＣＥＦ細胞の培養液を接種した胚含有卵の尿膜腔液から感染性ウイルスを回収した。ＨＩ試験では、ＬａＳｏｔａ株に特異的な７Ｄ４を含むあらゆるＭＡｂは、新しく作成したウイルスとの間で元々のＬａＳｏｔａ株との反応性と同一の反応性を示した。Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位をコードする領域の核酸配列はＲＴ−ＰＣＲによって決定した。結果は当該核酸配列が、元々のＬａＳｏｔａ配列を修飾するのに使用された変異プライマーに導入された核酸の正確な変更を含むことを示した。この知見は、当該ウイルスがプラスミドｐＤＮＦＬ＋［Ｆwt］に由来することを示し、（遺伝的に修飾された）ＮＤＶが、クローニングした完全長ＮＤＶｃＤＮＡから完全に作成できることを明らかにしている。ＮＤＶのＦｏタンパク質のプロテアーゼ切断部位は毒性に対する鍵となる決定基である。
【０１６８】
一般的に、Ｆｏタンパク質のプロテアーゼ切断部位におけるアミノ酸配列は、様々なＮＤＶ株における毒性にとって鍵となる決定基であると思われている。プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を遅現性（非毒性）から速現性（毒性）のＮＤＶ株の配列に変更した遺伝的に修飾したＬａＳｏｔａ株の作成によって、この仮定を試す独特の機会が提供された。従って、新しく作成したウイルスＮＤＦＬ［Ｆwt］の大脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）を測定し、ＮＤＦＬ株及びＬａＳｏｔａ株（クローンＥ１３−１）のＩＣＰＩと比較した。その結果、ＮＤＦＬ［Ｆwt］のＩＣＰＩは１．３であり、ＮＤＦＬ（ＩＣＰＩ＝０．０）及びクローンＥ１３−１（ＩＣＰＩ＝０．３）株の値よりもはるかに高いことが示された。このような結果は、予想通り、ＮＤＶの毒性はＦｏタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列によって大きく左右されることを示している。
【０１６９】
血清学的なマーカーの導入
ＮＤＶにおける包膜糖タンパク質Ｆ及びＨＮはウイルスで最も免疫原性のあるタンパク質である。感染後、Ｆ及びＨＮタンパク質は、強い抗体中和反応を引き出す。そのような抗体中和反応の誘導は、（広く用いられているＬａＳｏｔａ株のような）非毒性ＮＤＶ株によるワクチン接種が上手く行く基礎となる。
【０１７０】
しかしながら、ＮＤＶワクチン株に対する抗体反応は毒性のあるＮＤＶ野生株に対する抗体反応と区別することができない。従って、血清学的な方法によって毒性のある野生株による感染を追跡することはできない。野生型ウイルスによる感染がワクチン接種により隠され、野生株によって起きた臨床的な徴候が見落とされる可能性があり、又はワクチンのせいにすらされるので、この状況は望ましくない。ワクチン接種と感染を上手く区別することは、ＮＤＶ撲滅には必須のことなので、我々は、ワクチン接種に使用することができ、ＮＤＶ野生株と血清学的に区別できるような遺伝的に修飾したＮＤＶの開発に乗り出した（いわゆる標識ワクチン）。
【０１７１】
ＮＤＶ標識ワクチンを開発するために、（主要な）抗原の１つで１個又は数個の免疫的に優勢なエピトープを欠失する、又は修飾することができるようにウイルスは遺伝的に修飾されなければならない。必須タンパク質部位の欠失は、当該タンパク質の生物機能を損なう可能性がある。従って、我々は、タンパク質の生物機能を保ったままで、修飾したタンパク質に対する抗体のレパトアが元々のタンパク質に対するものとは異なるような方法で、ＮＤＶの免疫的に優勢な包膜タンパク質の１つを修飾することを選択する。以下に特定するような理由で、我々は発明の実施態様を１つ選択し、ＮＤＶのＨＮタンパク質を修飾する。ＮＤＶの感染は、宿主細胞の原形質膜とビリオン包膜との融合によって開始する。この工程のためにＦタンパク質とＨＮタンパク質の両方が必要となる。Ｆタンパク質とＨＮタンパク質は物理的に相互作用し、この相互作用には膜の融合が必要であることが明らかにされている（Deng et al., 1995)。その上、その相互作用は型特異的である、即ち、Ｆ及びＨＮタンパク質は、融合活性を示すには同一ウイルスに由来しなければならないことが示されている。ＮＤＶにおけるＨＮタンパク質の相互作用するドメインはタンパク質のいわゆる柄領域又は茎領域に位置し、ＨＮタンパク質の外部ドメインである９２個のアミノ酸配列を含んでいる（Deng et al., 1995)。ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１とヒトのパラインフルエンザ３型のアミノ酸１４１〜５７２（ｈＰＩＶ３）から成るハイブリッドＨＮタンパク質は、ＮＤＶのＦタンパク質と共に共存発現させた場合、融合活性を保持していることが示された。このような知見は、ＮＤＶの柄領域とそれに続く別の鳥類のパラミクソウイルスの血清型のＨＮタンパク質の球状頭部から成るハイブリッドＨＮタンパク質を抱く遺伝的に修飾されたＮＤＶ株が生存可能であることを示唆している。
【０１７２】
更に、そのような株はＮＤＶとは異なった抗ＨＮ抗体反応を引出す。Ｆタンパク質に対する中和抗体反応は、ウイルス感染のチャレンジに対して効果的に防御できるほど十分なので、そのような遺伝的に修飾されたＮＤＶ株は、標識ワクチンに必須の２つの必要事項、即ち、疾患に対する防御と血清学的な区別を満たしている。
【０１７３】
ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１及び鳥類パラミクソウイルス２型のアミノ酸１４２〜５８０（ＡＰＭＶ２）（ＨＮ１／２141と命名）又はＮＤＶのアミノ酸１〜１４３及びＡＰＭＶ２のアミノ酸１４４〜５８０（ＨＮ１／２143と命名）のどちらかの融合から成るハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。
【０１７４】
同様に、ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１及びＡＰＭＶ４のアミノ酸１４３〜５６９（ＨＮ１／４141と命名）又はＮＤＶのアミノ酸１〜１４３及びＡＰＭＶ４のアミノ酸１４５〜５６９（ＨＮ１／４143と命名）のどちらかの融合から成るハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。有核細胞の発現ベクターｐＣＩｎｅｏでハイブリッド遺伝子をクローニングし、ＮＤＶのＦタンパク質を含むプラスミドと共に共存形質移入実験に用いた。この目的で、Ｆ２とＦ１の間のタンパク質分解切断部位をＬａＳｏｔａ配列から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス配列（材料と方法の項を参照）のものに変更するようにＦタンパク質を修飾した。ＣＥＦ細胞及びＱＭ５細胞における共存形質移入実験によって、ＨＮ１／２141及びＨＮ１／２143の両方共、ＨＮ１／４141及びＨＮ１／４143同様に、Ｆwtタンパク質と共に共存発現させた場合、細胞融合を誘導することが示された。このような結果は、ハイブリッドＨＮタンパク質とＦタンパク質との複合体が生物活性を持つことを示している。ハイブリッドＨＮタンパク質ＨＮ１／２143及びＨＮ１／４143を用いて、完全長クローンｐＮＤＦＬ＋における元々のＨＮ遺伝子と入れ替え、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ１／２143及びｐＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143を得た。上記共存形質移入システムを用いて、感染性ウイルスを作成するために続いて後者２つのプラスミドを使用した。形質移入した単層培養細胞の培養上清を接種した胚含有卵の尿膜腔液から生きた組換えウイルス（ＮＤＦＬ−ＮＨ１／２143及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143と命名された）を単離することができた。
【０１７５】
各２つの組換え産物におけるハイブリッドＨＮ遺伝子の存在はＲＴ−ＰＣＲによって確認した。赤血球凝集抑制試験によって、ＮＤＶに対するモノクローナル抗体及び多価抗血清は組換えウイルスＮＤＦＬ−ＮＨ１／２143及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143によるニワトリ赤血球の凝集を阻止できないことが示された。このような結果は、従来のＮＤＶワクチンとは血清学的に区別することができるワクチンとしてＮＤＦＬ−ＮＨ１／２143及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143株を使用してもよいことを示している。
【０１７６】
組換えＮＤＶからのヘテロ接合体タンパク質の発現
外来遺伝子をＮＤＶゲノムに挿入することができるかどうかを調べるために、我々は、ＳＥＡＰリポーター遺伝子を持つ組換えウイルスを構築した。ＳＥＡＰ遺伝子は、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５に由来し、ＮＤＶの典型的な転写開始ボックスと転写停止ボックスを含むように修飾した。転写開始ボックスと転写停止ボックスが後に続いたＳＥＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］のＸｍｎＩ部位（ｎｔ１０９）に挿入した。共存形質移入システムによってＮＤＦＬ−ＡＰと命名した感染性ウイルスを作成し、ＲＴ−ＰＣＲによってＳＥＡＰ遺伝子の存在を確認した。ＮＤＦＬ−ＡＰ株を感染させた細胞は、極めて高いレベルでＳＥＡＰタンパク質を発現した。ＳＥＡＰタンパク質の比活性を用いて、我々はＮＤＦＬ−ＡＰを感染させた細胞に発現されているタンパク質のｘ％がＳＥＡＰタンパク質から成っていることを算出した。このような結果は、組換えＮＤＶから極めて高いレベルでヘテロ接合体遺伝子が発現されうることを示している。
【０１７７】
トランス型相補性細胞株におけるＮＤＶ欠失変異の作成
ＮＤＶのＭタンパク質の発現を除くために、ＢｓａＡＩ（ｎｔ３０８７）によるｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］の消化とその後のＨｉｎｄＩＩＩ（ｎｔ４２５２）による部分消化によってＭ遺伝子の大部分を削除した。ＨｉｎｄＩＩＩ末端をＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで埋めた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって再び環状化し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するのに用いた。ｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］ｄＭと命名された出来上ったプラスミドを用いて、ＮＤＶのＭタンパク質を発現しているトランス型相補性のＣＥＲ−Ｍ細胞において共存形質移入によってウイルスを作成した。形質移入した単層培養細胞の培養上清でＣＥＲ−Ｍ細胞を３回継代し、ウイルスの存在を分析した。３回継代した培養上清が赤血球凝集試験（ＨＡ）及び赤血球凝集抑制試験（ＨＩ）の陽性結果を生じたということを証拠としてウイルスが得られた。ウイルスをＮＤＦＬ−ｄＭと命名した。ＮＤＦＬ−ｄＭを用いて単層ＣＥＦ細胞に感染させた場合、Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてＩＰＭＡで見られるように、ウイルスは依然として細胞から細胞への伝染することによって広がっていくことができた。予想通り、Ｍタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたＩＰＭＡではＭタンパク質の発現を明らかにすることはできなかった。培養上清を用いてＣＥＦ細胞又はＣＥＦ−Ｍ細胞に感染させた場合、ＩＰＭＡによってこのような単層培養細胞において複製しているウイルスの存在を示すことはできなかった。このような知見は感染性ウイルスは非相補性ＣＥＦ細胞では作られなかったことを示している。感染させたＣＥＦ細胞から得た培養上清を接種した胚含有卵では、ＨＡ試験又はＨＩ試験で調べたとき、子孫ウイルスを生じなかったという観察によってこの知見は裏付けられた。
【０１７８】
より良いＮＤＶワクチンの必要性、及び特にＮＤＶ標識ワクチンの必要性に促されて我々は、遺伝的修飾ができる逆遺伝システムを開発した。本明細書で我々は、クローニングした完全長ｃＤＮＡに完全に由来する感染性ＮＤＶの作成を記載する。我々は、Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位の特異性を決定するたった３個のヌクレオチドによってＮＤＶの毒性を劇的に変えられることを明らかにする。この場合、プロテアーゼ切断部位は、ＬａＳｏｔａ株の切断部位から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス切断部位のプロテアーゼ切断部位に変更した。この遺伝的に修飾されたＮＤＶ株を作成するために、我々は、Ｆタンパク質の切断可能性が鍵となる決定基（しかし唯一の決定基ではない）であるという公式な証明を届ける。同じ逆遺伝学的アプローチを用いて、切断部位を意のままに他のいかなるアミノ酸配列にも変更することができる。これによって毒性レベルのスペクトルを呈する一連のＮＤＶ株の作成が導かれる。
【０１７９】
ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）
既に上述したように、Ｆ及びＨＭタンパク質の切断可能性のほかに、他のウイルス因子が病原性に寄与している可能性があることが示されている。転写及び翻訳における改変がウイルス及び又は細胞病原性の増殖や細胞から細胞への広がりに介在する可能性がある。ＮＤＶの感染性ｃＤＮＡによって転写や複製を含む配列の酵素的な改変ができるようになる。これによって現実には存在しない毒性への最適な免疫原性を保った新しいＮＤＶワクチンの設計が導かれる可能性がある。
【０１８０】
安全性は生ワクチンの最も重要な特徴の１つである。しかしながら、ＮＤＶを含めて多くの生ワクチンでは、免疫原性は逆に毒性に関係することが多い。従って、免疫原性を失わずに生ワクチンをさらに減毒化することは、遺伝的修飾を使用することができる改変の最も所望のものの１つである。この点に関して、センダイ・ウイルスのＶタンパク質の発現を除くことによってマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ病原性を著しく低下させたというのは価値ある記述である（Kato et al., 1997)。センダイ・ウイルスと同様に、ＮＤＶもまたＲＮＡ編集として知られるメカニズムによってＶタンパク質を生じる(Steward et al., 1993)。ＮＤＶのＶタンパク質の発現を除くことによってもｉｎ ｖｉｖｏで減毒化された表現型を生じる可能性があることが予測可能である。
【０１８１】
ＮＤＶの毒性の変更とは別に、我々は、ＮＤＶ野生株と血清学的に区別できる株を作成できるような方法で、ＮＤＶの抗原の性質を修飾することが可能であることを明らかにする。このような所謂、標識ワクチンは、世界中の商業的な群集団におけるＮＤＶの流行を見極めるのに貴重なツールである。
【０１８２】
更に、そのような標識ワクチンを大規模に適用するということは、徹底的なスクリーニング過程と感染した群れの一掃することによって完全な撲滅を導くことになる。本明細書で我々は、外来遺伝子をＮＤＶのゲノムに挿入できることを明らかにする。このような外来遺伝子は、感染細胞に極めて高レベルで発現されうる。このことは、他の（トリの）病原体に由来する抗原を発現するためにワクチン・ベクターとしてＮＤＶを使用できることを示している。いくつかの特徴によってＮＤＶは、呼吸器疾患又は腸疾患に対するワクチン接種にとって理想的なワクチン・ベクターとなっている。 １）ＮＤＶは、胚含有卵において極めて高い力価で容易に培養することができる。 ２）胚含有卵におけるＮＤＶの大量培養は比較的安価である。３）ＮＤＶワクチンは相対的に安定であり、飲み水への添加、スプレー又はエアゾール形状によって簡単に投与することができる。４）ＮＤＶの自然感染経路は呼吸器及び／又は腸管によるものであり、それは、他の多くの鳥類病原体の主要な自然感染経路である。５）ＮＤＶは、循環する母体抗体が存在するにもかかわらず、局所免疫を誘導することができる。
【０１８３】
最後に我々は、トランス型相補性細胞株を用いて、ＮＤＶの可変欠失変異を作成することができることを明らかにする。内細胞膜でのＮＤＶの出芽に関与するマトリックス（Ｍ）タンパク質を発現できないＮＤＶ欠失変異を作成した。我々は、Ｍタンパク質を発現できない、表現型上相補性のあるＮＤＶ株が、依然として細胞に感染することができ、細胞から細胞への伝染によって広がることができることを明らかにする。しかしながら、変異ウイルスは、非相補性細胞では感染性の子孫を生じることはできない。この知見は、表現型の上で相補性のあるＮＤＶ欠失変異体は、環境に広がることができない安全な自己制約的ワクチンとして使用してもよいことを示している。そのような非伝染性ワクチンは、例えば安全性のような、例えば死菌ワクチンの最も重要な利点を伴った有効性のような、生ワクチンの最も重要な利点を兼ね備えている。
【０１８４】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【０１８５】
【表２−１】
【表２−２】
【０１８６】
【表３】
【０１８７】
【表４】
【０１８８】
【表５】
【０１８９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は家禽のニューカッスル病のウイルスの感染に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、死に到る、最も多様な鳥類伝染病原菌の一つである。ニューカッスル病は明らかに新しい病気として、いくつかの地理的に異なる場所でほとんど同時期に発生し、しかもその病気のタイプと重篤度が非常に多様であることから、学名を付けるに当たりいくつかの問題を引き起こした。
【０００３】
この病気は、偽性鶏ペスト、偽性家禽ペスト、鳥類ペスト、鳥類ジステンパー、鳥類気脳炎と命名されている。この病気が重大となったのは、主として、２０世紀において家禽産業が、各国間における集約的な取引に依存する非常に効率のよい国際的産業に発展したためである。
【０００４】
ニューカッスル病は、１９２６年にジャワ（インドネシア）およびタイン川上流のニューカッスル（イギリス）で最初に発生したと一般的に推測されている（Kraneveld、１９２６(非特許文献１）；Doyle、１９２７（非特許文献２））。ニューカッスル病という名前は、他の病気と間違われる可能性がある記述的な名前を避け、仮の名前としてドイルによって作り出された。後に、重篤度において劣る他の病気が、ＮＤＶと見分けがつかないウイルスが原因であることが明らかとなった。アメリカにおいては、比較的軽度の呼吸器系の病気が鳥類気脳炎と名付けられ、ＮＤＶが原因であることが示された（Beach、１９４４（非特許文献３））。２，３年以内に、鶏において非常に軽度の病気の原因となる、または、病気の原因とならない、多くのＮＤＶの単離が世界中で行われた。
【０００５】
以下の方法は、この病気の拡大に関係するものであった：１）生活している鳥、野生の鳥、猟用鳥類、レース用鳩、商用家禽の移動、２）人間や備品の移動、３）家禽製品の移動、４）風媒による拡大、５）家禽の餌の汚染、６）水の汚染、７）不活性化が不完全な、または、異種起源のワクチン。ＯＩＥによれば、ニューカッスル病は、生後１日のひよこにおける大脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）が０．７またはそれ以上をもつ鳥類パラミクソウイルス血清型１（ＡＰＭＶ−１）のウイルスが原因の家禽の病気である。悪性のウイルスは、残基１１７におけるＦ２タンパク質およびＦ（フェニルアラニン）のC末端、Ｆ１タンパク質のＮ末端における多数の基本的アミノ酸の存在によって確認することも出来る。このアミノ酸配列を実証できなければＩＣＰＩテストによる特徴づけを必要とするであろう。「家禽」と言う語は、繁殖用、消費用の肉、卵の生産用、狩猟のための供給補充用として、飼育されている鶏、七面鳥、ホロホロ鳥、アヒル、がちょう、うずら、鳩、キジ、やまうずら、走鳥類などを言う。
【０００６】
アレクサンダー（Alexander）（１９８８）によれば、ニューカッスル病を初めて認識してから、この病気の三つの動物疫病汎流行があった。第一は、この病気の初期の発生にあたるもので、東南アジアで起こったと思われる。１９２６年にイギリスで発生したような孤立した突然の発生は、この病気が主としてアジアを経てヨーロッパへゆっくり移動する前に起こった思いがけないものであった。
【０００７】
第二の流行は、１９６０年代の後半に中東ではじまったようであり、１９７３年までにはほとんどの国々に広がっていた。第二の流行がより急速に広がったのは、おそらく、相当な国際的な取引となった家禽産業の大変革によるものであった。
【０００８】
第三の流行は、主として、鳩などの飼われている鳥に影響した（Vindevogel and Duchatel、１９８８（非特許文献４））。この病気は見たところ１９７０年代後半に中東で起こったようである。１９８１年までに、ヨーロッパに広がり、その後、主として、競技やショーでの鳥間の接触の結果として、および、かかる鳥の国際的取引の結果として急速に世界の各地に広がった。
【０００９】
今日もなお、ニューカッスル病は、アジア、アフリカ、アメリカおよびヨーロッパの多くの国々において広範囲に広がっている。オセアニアの国々だけは比較的この病気が起こらないようである（Spradbrow、１９８８（非特許文献５））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kraneveld，F．C．（1926）A poultry disease in the Dutch East Indies．Ned．Indisch Bl．Diergeneesk．38：448-450
【非特許文献２】Doyle,T.M.(1927)A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus.J.Comp.Pathol.Ther.40:144-169
【非特許文献３】Beach,JR.(1944)The neutralization in vitro of avian pneumoencephalitis virus by Newcastle disease immune serum. Science 100:361-362.
【非特許文献４】Vindevogel and Duchatel、1988
【非特許文献５】Spradbrow,P.B(1988)Geographical distribution.In D.J.Alexander(ed),Newcastle Disease,pp.247-255.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＮＤＶは、Mononegavirales目、パラミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、Rubulavirus属に属している。通常、鳥類パラミクソウイルスタイプ−１と呼ばれているＮＤＶは別として、鳥類パラミクソウイルスタイプ−２から−９と称される他の８つの血清型は、赤血球凝集抑制テストや血清中和テストにおいて、それらの抗原の関係性に基づいて区別することが可能である（Alexander、１９９３）。
【００１２】
血清学的グループ分けの一致にもかかわらず、異なる血清型のウイルス間でいくつかの交差した関係がある。
【００１３】
NDV遺伝子は、陰性極性で、ウイルスタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ遺伝子はおよそ大きさでは１５，２００ヌクレオチドであり、以下の遺伝子産生物（遺伝子ＲＮＡの３‘末端から５’末端に記録されている）をコードしている：ヌクレキャプシドタンパク質（ＮＰ）、りんタンパク質（Ｐ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）、融合タンパク質（Ｆ）、赤血球凝集ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、そして大きなポリメラーゼタンパク質（Ｌ）（Chamber et al、１９８６年）。
【００１４】
このＲＮＡは、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質との複合体で、リボ核酸キャプシド粒子（ＲＮＰ）を形成し、該RNPは、内部にＭタンパク質が並んでいるエンベロープによって囲まれている。このエンベロープは、宿主の吸着と侵入に関係するＦとＨＮタンパク質を含んでいる。
【００１５】
ＮＤＶの複製は、他のパラミクソウイルス属によって使用される方法と類似している。最初の段階は、ＨＮタンパク質によって媒介される宿主受容体へのウイルスの吸着である。宿主細胞膜とウイルスエンベロープとの融合は、ＨＮとＦタンパク質の両方の働きに依存しており、ウイルスの複製される細胞質にＲＮＰが放たれる結果となる。
【００１６】
ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＰの一部である）は、mＲＮＡとして働き、ウイルスタンパク質合成のための細胞の翻訳部分に使用される相補的な転写物を産生する。ＮＰタンパク質の蓄積により、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、転写から複製にスウィッチングされ、結果として、完全長のゲノムおよび相補ゲノムＲＮＡ分子の合成がなされる。
【００１７】
新たに形成されたＲＮＰは、細胞原形質膜に蓄積されているF、HNタンパク質、およびMタンパク質の働きによって細胞膜において包膜される。新たに形成されたウイルス粒子は、出芽メカニズムによって、感染した細胞から放出される。ＮＤＶの複製についてのより詳細な情報については、Pieeples（１９８８年）を参照。パラミクソウイルス属の分子生物学についての最近の論文については、LambとKolalofsky（１９９６年）を参照。
【００１８】
商用家禽（すなわち、鶏、七面鳥、きじ、ほろほろ鳥、アヒル、ガチョウ、はと）を別にすれば、とらわれていたり、半家禽状態であったり、渡り鳥である水鳥を含む野生の鳥の多くは、ＮＤＶに感染しやすく、主要な感染源となっているかもしれない（Kaleta and Baldauf、１９８８）。
【００１９】
ＮＤＶ株の病原性は、宿主によってかなり異なっている。最も抵抗のある種は、水生の鳥のようであり、一方、最も感染しやすい鳥は、一時的に、または永久的に群れを作る群居する鳥である。鶏は最も感染しやすいが、しかしながらアヒルやガチョウは、感染するかもしれないが、鶏にとっては死に到るウイルス株であったとしても、臨床的な兆候をほとんど、または、まったく示さない。
【００２０】
ニューカッスル病は、ウイルスの異なる単離体と菌株が、この病気の大きな重篤度の差をもたらしているという点において複雑な病気である。ビヤード（Beard）とハンソン（Hanson）（１９８４年）は、ＮＤＶ株と単離体を、十分に感染しやすい鶏に見られるうる病気の兆候に関係する異なる病理型にグループ分けした：１）内臓に多量出血性の損傷が目立つ急性の致死感染を引き起こす、内臓向性の速現性ＮＤＶ、および、呼吸器や神経系の兆候が先行し、内臓損傷は起こらない、高い致死率の神経向性の速現性ＮＤＶ、２）いくらかの鳥類に低致死率で急性の呼吸系の病気や神経系の兆候を示す亜病原性のＮＤＶ、３）軽度の、または不顕性の呼吸系感染を示す長い潜伏期間をもつＮＤＶ、または腸器官系において主に複製するように思われる無毒性のウイルスである無病候性の腸ＮＤＶ。さまざまなグループと関連している、それらの兆候の間にあるいくつかの重複が報告されている。
【００２１】
ウイルスは、呼吸器系や腸器官、または目を通って体内に侵入してくる。気管においてウイルスは繊毛運動によって広がり、そして、細胞から細胞へ広がっていく。最初に入ってきた場所における初期の増殖の後、ウイルス血症のエピソードの間、ウイルスは脾臓、肝臓、腎臓、そして肺へと運ばれる。ウイルスのいくつかの株は、病気の兆候が明らかになる前に鳥たちが死んでしまうかもしれないほど非常に急速に、肝臓や腎臓のような必須器官に達する。
【００２２】
ほとんどのウイルスは、有意な量の抗体が存在するようになる前に、血液を通って、中枢神経系に到達する。オウム類において起こっていると推測される長期間の保菌状態は、家禽産業にとっては恐ろしい存在となる可能性がある。長い潜伏期間を有するウイルスと速現性のウイルスの両方を長い間保菌する状態は、鶏にも存在しうる（Heuschele and Easterday、１９７０）。
【００２３】
ＮＤＶの複製の間、前駆体の糖タンパクFOがF1とF2に切断され、子孫ウイルスが感染性となることが必要である（Rott and Klank、１９８８年）。この翻訳後の切断は宿主プロテアーゼによって媒介される。切断が行われなければ、非感染性のウイルス粒子が産生され、ウイルスの複製は進行し得ない。伝染力の強いウイルスのＦ０タンパク質は、広範囲のプロテアーゼによって切断可能であるが、しかしながら、感染力の低いウイルスのＦ０タンパク質は、その感受性に限界があり、これらのウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるいくつかの型の宿主細胞内でのみ増殖することができ、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは増殖できない。
【００２４】
長い潜伏期間を持つウイルスは、呼吸器系や腸器官のようにトリプシンに似た酵素のある領域において複製されるのみであるのに対し、感染力の強いウイルスは、組織や器官の範囲で複製可能であり、致命的な全身感染という結果となる。
【００２５】
Ｆ０前駆体のアミノ酸配列は、低い感染力のウイルスは、Ｆ２鎖とＦ１鎖をつなげている単一のアルギニン（Ｒ）を持っていることを示し、それに対し、感染力の強い株は、切断の部位で、Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ−Ｆなどの２つのペアを形成する付加的必須アミノ酸を有していることを示している。さらに、感染力の強い株のＦ２鎖は、通常、フェニルアラニン残基で始まっているが、感染力のない株のＦ２鎖は、通常、ロイシンで始まっている。
【００２６】
ＮＤＶのいくつかの株の場合は、ＨＮタンパク質も、生物学的に活性となるには切断を必要とする前駆体として産生される（ガルテン その他 １９８０年、ミラー その他 １９８８年）。
【００２７】
ＦおよびＨＮタンパク質の切断可能性に加えて、ウイルスの他の要因も病理型に寄与している可能性がある。マダンスキー（Madansky）およびブラット（Bratt）（１９７８、１９８１ａ、１９８１ｂ）は、転写と翻訳の変化は、ウイルスの増殖と細胞間の拡大、および／または細胞変性を調節可能であることを示した。
【００２８】
ＮＤＶの感染に対する最初の免疫応答は、細胞媒介であり、生ワクチン株で感染後、２、３日で検出可能である。これはおそらく、測定可能な抗体応答が見られる前に、ワクチン接種された鳥に、対抗に対する防御が早くから記録されていたことを示している（Gough and Alexander、１９７３）。
【００２９】
感染後約一週間で、循環する抗体は、再感染から宿主を保護するであろう。初期の段階で、ＩｇＭが関与し、ＩｇＧが続く。力価と防御は約三週間後にピークに達し、ブースティングがなければ次第に低下していく。これは、年をとった鳥に対しては、再びワクチンを接種させることが必要であることを意味している。
【００３０】
呼吸器系のルートで投与された生ワクチンのみが、血清と同様にすべての粘膜の表面で抗体を刺激する。不活性ワクチンは、筋肉内ルートで投与されたときでさえ、血清抗体が高濃度であるにもかかわらず、呼吸器官において局部の抵抗を誘発しない。
【００３１】
このことは、局所免疫性と体系的免疫性の両方を誘発させるには、上部呼吸器官にウイルス抗原を与えることが可能な生ワクチンが重要であることを強調している。小さな小滴が下部呼吸器官の内部にしみとおり、それによって、主に体液性免疫応答を刺激し、一方、粒の粗い小滴が、上部呼吸器官において局部免疫を刺激する。
【００３２】
したがって、広範囲の小滴サイズによるエーロゾルが、全体として最良の局所的および体液性免疫を生じる。
【００３３】
しかし、高レベルの抗体価を生じる現行ワクチンにより徹底的に予防接種しているにもかかわらず、ウイルスは今なお粘膜表面から回収されることに留意すべきである。
【００３４】
米国ではニューカッスル病の同定が不活化ワクチンを使用させることになった（Hofstad、１９５３）。地方病ウイルスのある種のものが極めて軽度の病気を発病させるという観察が、亜病原性生ワクチン・ロアキン（Roakin）の開発に先ず帰着した（Beaudette et al.、１９４９）が、続いてより緩和なヒッチナー（Hitchner）Ｂ１株（Hitchner and Johnson、１９４８）およびラソタ（LaSota）株(Goldhaft、１９８０）の開発に至り、それらが現在最も広く使用される生ワクチンである。
【００３５】
ＮＤＶ生ワクチンは２つのグループ、長潜伏期性および亜病原性に分けることができる。亜病原性株はその強い毒性のために鳥類の二次予防接種についてのみ適している。免疫応答性は生ワクチンの病原性が増大するにつれて増大する。したがって、重篤な反応なしに所望レベルの防御を得るために、徐々に毒性の強くなるワクチンを連続的に使用するか、または生ワクチンに続いて不活化ワクチンを使用することからなる予防接種プログラムが現在使用されている。
【００３６】
生ワクチンの主たる利点の一つは、該ワクチンが安価な集団投与技法により投与し得ることである。共通した投与方法は飲料水によることである。しかし、飲料水による投与は、過剰の熱や光によって、また、飲料水中の殺ウイルス性不純物により、ウイルスが不活化されている可能性があるので、注意深くモニターしなければならない。
【００３７】
多数のトリを短時間に予防接種するのが容易なために、スプレーおよびエーロゾルによる生ワクチンの集団投与もまた非常にポピュラーである。粒子が生じる条件を制御することによって適正な粒子サイズを得ることが重要である。
【００３８】
現在使用されている生ワクチンは幾つかの欠点を有する。ワクチンは今なお環境条件と複雑な感染の存在に左右されて病気の徴候を引起すことがある。それ故に、一次予防接種では非常に穏やかなウイルスを使用することが重要であり、結果として、複数回の予防接種が通常必要とされる。さらに、母性誘導抗体が長潜伏期性生ワクチンによる一次予防接種の成功を妨げる可能性がある。
【００３９】
不活化ワクチンは通常感染性尿膜腔液から製造されるが、該尿膜腔液はホルマリンまたはベータプロピオラクトンで処理してウイルスを殺し、適当なアジュバントと混合する。不活化ワクチンは筋肉内または皮下注射により投与する。不活化ワクチンは製造にも投与にも費用がかかる。
【００４０】
しかし、不活化油性乳剤ワクチンは生ワクチン程に母仔免疫の悪影響を受けず、日齢のヒナに使用することができる。不活化ワクチンの利点は予防接種したトリの有害反応のレベルが低いこと、防御抗体のレベルが高いこと、そして防御期間の長いことである。上記ワクチンのいずれもが野生型ＮＤＶを血清学的に識別し得ない。
【００４１】
組換えウイルス・ワクチンの開発は家禽産業における多年にわたる興味の対象であった。この概念は対象疾病作因の決定的な免疫化エピトープ遺伝子をベクターウイルスの非必須遺伝子に挿入することである。このように、組換えウイルスによる予防接種はベクターウイルスならびに対象疾病作因双方に対し免疫化するに至る。
【００４２】
数種のウイルスが家禽用の有力な生菌ウイルスワクチンとして評価されている。最も注目された鳥類ウイルスは鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）と七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。鶏痘ウイルスは大型のゲノムをもつＤＮＡウイルスであり、したがって、外来遺伝子を担持する余地をもつと考えられる。
【００４３】
弱毒化すると、ＦＰＶは臨床的疾病を引き起こさず、一般にニワトリのワクチンとして使用される。ＨＶＴもＤＮＡウイルスであり、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）族の血清型として分類される。ＨＶＴはニワトリに対しては非病原性であり、しかもＭＤＶに対して交差防御的であり、一般にマレック病に対しニワトリを予防接種するために使用する。
【００４４】
ニューカッスル病に対する防御は組換えＨＶＴまたはＦＰＶワクチンを使用することにより誘発し得ることが示されている（Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al. 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990)。
【００４５】
しかし、ＮＤＶ Ｆタンパク質またはＦおよびＨＮタンパク質双方を発現するような組換えワクチンによる予防接種に続くニューカッスル病に対する防御の始まりは、常套の生菌または不活化ＮＤＶワクチンでの予防接種に続く防御の始まりよりも大幅に遅延するが、その理由は恐らく組換えワクチンが、組換えワクチンにより発現されるＮＤＶタンパク質上に見出されるエピトープ以外に、広範囲の十分に免疫的なスペクトルを有し抗原的に関連するＮＤＶエピトープを提供しないか、または免疫系に適切に提示されないからである。
【００４６】
さらに、局所的（粘膜、呼吸器または腸内の）防御は組換え体を接種したトリにおいて有効に誘発されなかった。これは決定的な欠点であるが、その理由は呼吸器病に対する一次予防接種に使用したワクチンが、野外条件で飼育したニワトリに感染する毒性ウイルスの感染と伝播を防御する局所免疫を誘発しなければならないからである。
【００４７】
宿主を防御し得るＮＤＶに対する抗体は、ウイルス中和試験により測定することができる。しかし、中和応答は赤血球凝集抑制（ＨＩ）応答と平行していると思われるので、後者の試験は多くの場合、防御応答、特に予防接種後の応答を評価するために用いる。
【００４８】
ＦおよびＨＮタンパク質双方に対する抗体はＮＤＶを中和し得る。しかし、Ｆタンパク質に対する抗体は生体内および生体外試験においてＨＮに対する抗体よりもより顕著な中和反応を誘発すると思われる（Meulemans et al., 1986)。
【００４９】
トリの血清中にＮＤＶに対する特異抗体が存在したとしても、ＮＤＶの感染株に関する情報は僅かであり、したがって、診断的価値は限られる。
【００５０】
殆どの国で鳥類の長潜伏期性ＮＤＶ株が偏在すること、また、少なくとも血清学的に野生型ＮＤＶと区別し得ない生ワクチンが殆ど普遍的に使用されていることは、単に感染したことを証明することが適用すべき抑制手段についての正当な理由にはなっていないことを意味する。野外での疾病がウイルスの真の毒力についての信頼し得ない尺度である可能性があるので、発見されるウイルスについてさらに特性化することが必要である。
【００５１】
現在、感染株の特性化を可能とするニューカッスル病診断の唯一の方法は、ウイルスの単離と、引続いての病原性試験である。現在３つの生体内試験法がこの目的に使用される；１）卵での平均死亡時間（ＭＤＴ）；２）１日齢ヒナの脳内病原性指標（ＩＣＰＩ）；３）６週齢のトリにおける静脈内病原性指標（ＩＶＰＩ）。
【００５２】
これらの試験法は多くの欠点、例えば、動物の入手可能性、乏しい再現性、および比較的長期の試験などに悩まされている。最後ではあるが大事なことは、これらの試験法がワクチンを接種したまたは野生型株を感染させた家禽類の簡単な血清学的同定を許さないことである。
【００５３】
生体内試験法に替わり得るものとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が毒性分離株と非毒性分離株との間を区別するために成功裏に使用され
ている（Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997)が、しかし、さらに血清学的な区別は不可能である。
【００５４】
家禽類の飼育とその製品の交易は今や国際ベースで、多くの場合多国籍企業の管理下に組織化されている。ニューカッスル病の脅威はかかる交易上の顕著な抑制となっていることを示している。
【００５５】
ニューカッスル病の成功裏の抑制は、すべての国が発生を報告するようになったときにのみ取り組むことになろう。しかし、国際間の取決めは異なる国での疾病監視の程度に大きな違いがあるために単純ではない。ある国では予防接種をせず、如何なる形状であってもＮＤＶを家禽類に取込ませようとしないが、その理由は予防接種した家禽が野生型のＮＶＤに感染した家禽と区別し得ないからである。
【００５６】
別の国では特定の生ワクチンの使用のみを許可しており、他のワクチンは受け入れ難い毒性をもつと考えている。さらに他の国では循環型の毒性の高いウイルスが存在し続けており、明白な病気が予防接種により隠蔽されるという理由で、そのままでは認められない。
【００５７】
多くの国では、起こり得るニューカッスル病発生を抑制するための法律が存在する。国家的抑制手段は持ち込みと拡散を防止することに向けられる。殆どの国が家禽製品、卵、および生きた家禽の商取引に制限を設けている。殆どの国が取分けオウム病鳥類の輸入に際しての検疫手続を確立している。
【００５８】
一部の国では感染した鳥類の強制的屠殺、その接触物、および産物について根絶政策を適用している。他の国は発生がなくても鳥類の予防的接種を要求し、一方、一部の国は緩衝帯を確立するために発生地周辺で包囲種痘の政策を採っている。
【００５９】
明らかなことは、ニューカッスル病の制御に使用し得るよりよいワクチンとよりよい診断方法が必要なことである。生ワクチンの集団投与に際し、個々のトリが受ける用量に大きな差異のあることと、また、若いヒナでの母仔免疫レベルに変動のあることのために、生ワクチンによる接種後反応が避けられない。このことが予防接種を強制される国における農夫の主要関心事の一つである。
【００６０】
さらに、多くのワクチンが分集団の混合物である。クローン化する場合、これらの分集団はその免疫原性および病原性において互いに有意に異なる可能性がある（Hanson, 1988)。
【００６１】
しかし、現在使用されている生ワクチンおよび不活化ワクチンの最も大きな欠点は、予防接種を受けた動物が現在用いられているスクリーニング技法、例えば、赤血球凝集抑制またはウイルス中和試験により感染した動物と区別し得ないという事実である。
【００６２】
毒性のある野生ウイルスが今なお予防接種した群れに広がる可能性があるが、その理由は病気の症状が予防接種により隠蔽されるからである。生体内技法によりウイルスの単離と毒性の特性化が大規模で実行不能である以上、血清学的に野生ウイルスと識別し得る新しい効果的な弱毒化生ワクチンが是非とも必要である。
【００６３】
ＮＤＶマーカーワクチンと呼ぶ（また、診断法とキットを伴う）かかるワクチンは、抗原性と関連するＮＤＶエピトープの最大限可能な免疫スペクトルを提供すべきものであり、かつ、野生型ＮＤＶと血清学的にまったく異なるべきであるが、今なお入手し得ない。
【課題を解決するための手段】
【００６４】
本発明は遺伝子修飾により鳥類のパラミクソウイルスゲノムを修飾する方法を提供し、遺伝子修飾した鳥類のパラミクソウイルスおよび鳥類パラミクソウイルス・マーカーワクチンを提供する。
【００６５】
現代分子生物学技術の出現が、マイナス鎖ウイルスを含む多くのＲＮＡウイルスの遺伝子修飾を可能としている。この技法はしばしば“逆遺伝”と言われる。先ず、ウイルスＲＮＡの（完全長）ｃＤＮＡコピーを提供し、それに続いてこのＤＮＡを感受性細胞内で転写して、感染性ＲＮＡを産生させ、それが再び感染性ウイルス粒子を産生するようにする。
【００６６】
一般に、標準的な分子生物学技術によりこれまでｃＤＮＡについてなされた修飾により、遺伝子的に修飾したＲＮＡウイルスを得ることが可能である。しかし、このことはＮＤＶまたは鳥類パラミクソウイルスについて具体化されたことはなく、鳥類パラミクソウイルスの複製事象研究のために、鳥類パラミクソウイルス・ゲノム・フラグメントのミニゲノム・フラグメントまたはプラスミドを生成させ、それによって感染性のコピーウイルスをどのように構築すべきかについての理解を得ることが、未だに可能ではない。
【００６７】
驚くべきことに、本明細書においては、当該鳥類パラミクソウイルスのゲノムが今までに配列決定されたすべてのパラミクソウイルス・ゲノムの中で最も小型であるということをこの度完全に確立したが、取分けＮＤＶゲノムの５’末端配列が、以前に確立されたもの、また、他のパラミクソウイルス科と比較して期待されたものよりもかなり長い。本発明はこの度初めて完全な鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの配列を提供し、かつ、かかるウイルスの完全長またはミニゲノム長のｃＤＮＡを提供する。
【００６８】
本発明は、鳥類パラミクソウイルスの感染性コピー生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなる鳥類パラミクソウイルスｃＤＮＡをこのように提供するが、当該ｃＤＮＡは、好ましくは完全長のｃＤＮＡを含んでなる。しかし、本発明はまた、鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなるｃＤＮＡを提供するが、それによって複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノムの生成を可能とする。かかるミニゲノムは、有利にはＲＮＡの転写および／または修飾核酸配列からのタンパク質発現に使用し得る。本発明はニューカッスル病ウイルスから少なくとも部分的に誘導される本発明のｃＤＮＡを提供するが、例えば、その場合の当該ニューカッスル病ウイルスは長潜伏期性ウイルスであり、好ましくは、ラソタ（LaSota)株ＡＴＣＣ ＶＲ−６９９などのワクチン株から誘導される。
【００６９】
本発明はさらに核酸における削除、挿入、突然変異、復帰突然変異などの修飾を含む、本発明に従ったｃＤＮＡを提供する。例えば、当該修飾が修飾プロテアーゼ切断部位をエンコードする核酸を含むｃＤＮＡが、例えば、当該切断部位が融合（Ｆ）タンパク質のプロテアーゼ切断部位であるｃＤＮＡが提供される。
【００７０】
さらに他の実施の形態において、本発明は、当該修飾がハイブリッド・ウイルスタンパク質、例えば、本発明の実験の部に記載したようなハイブリッド赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質などをエンコードする核酸を含む、本発明によるｃＤＮＡを提供する。本発明はまた、当該修飾がマトリックス（Ｍ）タンパク質などのウイルスタンパク質をエンコードする核酸において欠失を含む、本発明によるｃＤＮＡを提供する。
【００７１】
本発明はさらに異種抗原をエンコードする核酸をさらに供給する本発明のｃＤＮＡを提供するが、好ましくはその場合の当該抗原は家禽の病原、例えば下記のごとき病原から由来する。本発明によるｃＤＮＡから得られるＲＮＡまたはそれから由来するタンパク質もまた提供される。
【００７２】
近年、多くの非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスが完全に特性化され、当該ウイルスのクローン化ｃＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることにより完全に感染性のウイルスを生成させることが可能となり、それらのゲノムの複製と発現に関する基礎研究が最高潮に達した（Conzelmannによる概説、１９９６）。
【００７３】
今日まで、非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスの感染性ウイルスは、例えば、狂犬病ウイルス（Schnell et al., 1994, Conzelmann; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、（Schnell et al., 1994; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、水疱性口内炎ウイルス（Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995)、センダイウイルス（Garcin et al., 1995)、麻疹ウイルス（Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; ＥＰＯ７８０４７５Ａ１）、ヒト呼吸器シンシチウム・ウイルス（Collins et al., 1995)、牛疫ウイルス（Baron and Barrett, 1997)、およびヒト・パラインフルエンザ・ウイルス３型（Hoffman and Banerjee, 1997, Conzelmann; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、（Schnell et al.,1994; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）のクローン化ｃＤＮＡから生成させていた。
【００７４】
しかし、上記の感染性コピーウイルスのすべては、種々起源の宿主、組織または細胞において生体内ならびに生体外双方において増殖可能であり、適切な細胞系において容易なｃＤＮＡトランスフェクションと感染性ウイルス粒子の複製および生成を可能とする。
【００７５】
かかる可能性はＮＤＶについては存在せず、ワクチンを供給し得る長潜伏期性ＮＤＶ株については確実に存在しない。かかるＮＤＶ株の毒性は広範な細胞内で複製するその能力と関連しており、毒性株は生体外および生体内で容易に複製可能であるが、一方、ワクチン株は生体内のみで複製し得るという事実に反映されている。
【００７６】
このように、ＮＤＶについて歯止め２２の位置づけは明らかである。例えば、感染性ｃＤＮＡから感染性コピーウイルスを生成させる試みは、恐らく感染性ウイルスを結果として生じる可能性のある一方、かかるウイルスは一般にワクチンとしての使用に適さないが、その理由はこのように生成させた感染性ウイルスが余りに毒性が強いためにワクチンとしての使用を果たし得ないからである；それが細胞系に対してｃＤＮＡをトランスフェクションした後に生成、複製され得るという事実が、ＮＤＶの毒力の性質について上記で検討したように、Ｆｏタンパク質をＦ１とＦ２に容易に切断し得ることを反映している。
【００７７】
ｃＤＮＡに対する親材料としてワクチン株を使用してもこの問題を解決することにはならない；ワクチン株、特に長潜伏期型のワクチン株は容易に切断し得るＦｏタンパク質を含み、初代ウイルスが複製し続けるのを不可能にしている。トランスフェクションに使用する細胞にはまったく感受性がなく、非切断Ｆｏタンパク質をもつワクチン型ウイルスの一回またはそれ以上の複製を持続させる。
【００７８】
本発明はこの問題の解決法を手際よく提供し、それと共に感染性コピーＮＤＶ、例えば、ワクチンに使用するためのＮＤＶを提供する。
【００７９】
本発明は感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスの生成法を提供するものであり、該方法はウイルスＲＮＡとの複合体を形成するウイルスＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現し得る細胞に、当該ウイルスのクローン化完全長またはゲノム長ｃＤＮＡをトランスフェクションすることを含み、また、さらに当該ウイルスのＦｏタンパク質切断を可能とするタンパク質分解活性を有する増殖培地中で当該細胞をインキュベートすることを含む。
【００８０】
我々の系では、ＮＰを発現するプラスミドの同時トランスフェクションを省くことができる。ＮＰはＮＰ遺伝子が抗ゲノムＲＮＡの５’末端に続く最初の遺伝子である故に、恐らく完全長ｃＤＮＡから発現される。真核細胞ｍＲＮＡは通常単シストロン性であるので、遠位遺伝子の発現は期待されない。しかし、ＮＤＶ遺伝子の相対位置が変化している完全長ｃＤＮＡを生成させることは可能である。もしかかるｃＤＮＡの最初の遺伝子がＰまたはＬ遺伝子であるならば、同時トランスフェクションしたプラスミドから対応する遺伝子産物を発現させる必要はない。
【００８１】
完全長ｃＤＮＡを用いる代りとして、複製応答能のあるサブゲノムＲＮＡを産生させ、かつ、鳥類パラミクソウイルスタンパク質の完全な補体を共に発現する２つ以上のサブゲノムＲＮＡを使用することが可能である。たとえＲＮＡが別々に詰込まれていたとしても、得られるウイルス様粒子は同時感染と遺伝子機能の補完性により連続的複製のために使用することができる。
【００８２】
好適な実施の形態において、本発明は当該タンパク質分解活性がトリプシン様酵素などの酵素に由来するか、または当該タンパク質分解活性を有する組成物に由来する場合の方法を提供する。特に好適な実施の形態において、当該増殖培地はタンパク質分解活性を有する尿膜液を含んでなる。Ｆｏタンパク質の切断は感染性ウイルスの生成にとって必要である。外部からタンパク質分解活性を加えずに長潜伏期性株から感染性ウイルスを生成させることが可能である。孵化鶏卵の尿膜腔にトランスフェクションした細胞の上清を接種することにより、尿膜液に存在するタンパク質分解活性がＦｏタンパク質を切断し、融合適格Ｆ１−Ｆ２複合体を生成させることができる。かかる活性化Ｆタンパク質をもつビリオンは感受性細胞に感染することが可能であって、所望のタンパク質分解活性を発現する細胞での複製が感染性の子孫を生み出す。トランスフェクションした細胞の上清に所望のタンパク質分解活性を与える代りとして、例えば、ＮＤＶに対し許容性であって、かつ、当該タンパク質分解活性をすでに発現している細胞を使用することが可能である。かかる細胞系を用い、外部からタンパク質分解活性を加えることなしに感染性の長潜伏期性ＮＤＶを生成させる。かかる細胞系は当該活性を特定する遺伝子をもつ細胞系の安定なトランスフェクションにより生成させることもできる。さらに、ウイルス・エンベロープ内に野生型Ｆタンパク質を発現する安定なトランスフェクション細胞を生成させ、それによって細胞に侵入する手段をもつ感染性粒子（それ自体は野生型Ｆタンパク質をエンコードするゲノム情報を備えていない）を提供することが可能である。感染性長潜伏期性ウイルスの救済もＮＤＶヘルパーウイルスをトランスフェクション細胞に感染させることにより可能である。かかるヘルパーウイルスを本質的に必要とするのは、それを抗体に対して選択し得る場合であり、例えば、ヘルパーウイルスを除去し、長潜伏期性ウイルスとは反応しない抗体を中和することによる。最終的に、３種の必須ＮＤＶタンパク質ＮＰ、ＰおよびＬの１つ、２つ、またはすべてを発現する安定にトランスフェクションした細胞系を構築することができる。かかる細胞系は３種の必須ＮＤＶタンパク質のサブセットのみを同時発現するか、または感染性コピーウイルスの生成を維持するためにまったく同時発現しないことが必要である。
【００８３】
好適な実施の形態において、本発明はトランスフェクションに使用される当該細胞がニワトリの一次または二次細胞または細胞系由来である方法を提供する。本明細書で提供するのは、例えば、ＣＥＲまたはＣＥＦ細胞であって、これらは、一般に殆ど生体外細胞として、ＮＤＶのＦｏタンパク質、例えば、ラソタ（LaSota）株のタンパク質を切断するのに必要な、適切なプロテアーゼを欠いている。しかし、例えば、他の鳥類から由来する細胞も使用することができる。
【００８４】
本発明はさらに感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスの生成法を提供するものであり、該方法は、例えば、図３に同定した当該ウイルスのクローン化完全長またはゲノム長のｃＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることを含み、またさらに、当該ウイルスのＦｏタンパク質を切断し得るタンパク質分解活性を有する増殖培地中で当該細胞をインキュベートすることを含み、さらに、当該細胞を培養し、当該培養細胞から由来する物質を孵化鶏卵の尿膜腔に接種することにより感染ウイルスを回収することを含む。当該物質は、例えば、当該細胞培養物由来の（収獲または凍結融解した）細胞または細胞残渣または上清を含む。
【００８５】
例えば、本明細書で記載するのは感染性ウイルスの回収方法であるが、該方法ではトランスフェクションしたＣＥＦ単層の上清を孵化鶏卵の尿膜腔に接種した。４日後に、尿膜液を収獲し、赤血球凝集反応アッセイにより分析し、次いでさらに鶏卵に継代した。
【００８６】
さらに、本発明は、尿膜液を収獲し、孵化鶏卵に再接種することにより当該感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを継代することをさらに含む方法を提供する。
【００８７】
本発明の好適な実施の形態においては、当該ウイルスが、例えば、ＮＤＶの無毒性野外事例由来またはＮＤＶのラソタ（LaSota）株などのＮＤＶワクチン株由来の長潜伏期性ウイルスであることを特徴とする方法が提供される。さらに、１つまたはそれ以上の突然変異、欠失、および／または挿入の導入またはその他の修飾を可能とする遺伝子修飾により、鳥類パラミクソウイルス・ゲノムを修飾する方法が提供される。例えば、Ｖタンパク質などのウイルスタンパク質をエンコードするｃＤＮＡを修飾することにより、また、当該修飾したｃＤＮＡを完全長ｃＤＮＡにクローニングし、当該完全長ｃＤＮＡから感染性コピーウイルスを生成させることにより、例えば、鳥類パラミクソウイルスの毒性を弱毒化または修飾する方法が提供され、それによって改善された性質を有する新規ＮＤＶ株または新規弱毒化生ワクチンを生成させる。
【００８８】
遺伝子産物の修飾による弱毒化の他に、転写および／複写に関わるヌクレオチド配列の修飾によっても鳥類パラミクソウイルスを弱毒化することが可能である。かかる修飾は、多様な細胞において生体外および生体内双方で切断し得る、また結果として古典的なワクチン株よりもより免疫原性である野生型様Ｆタンパク質を発現する弱毒化株を結果として与える。
【００８９】
好適な実施の形態において、本発明はニューカッスル病ウイルスなどの鳥類パラミクソウイルスの毒性を弱毒化または修飾する方法であって、ウイルスタンパク質のプロテアーゼ切断部位を、当該切断部位をエンコードするｃＤＮＡを修飾することにより修飾することを含み、さらに、当該ｃＤＮＡを、例えば、ニューカッスル病ウイルスのゲノム長ｃＤＮＡにクローニングし、感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを生成させることを含む方法を提供する。当該切断部位は、例えば、ニューカッスル病ウイルスのＦまたはＨＮタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位である。弱毒化は一般に毒性の低下に限定されるが、比較的無毒性のＮＤＶ株を用い、例えば、特定の細胞型において複製が増加する傾向を与えることにより毒性の高くなったかかる株の子孫を提供することも今や可能である。このように、まったく異なる毒物特性をＮＤＶに与えることも今や可能である。
【００９０】
本発明はニューカッスル病ウイルスなどの鳥類パラミクソウイルスを抗原性について修飾する方法であって、少なくとも１つの免疫優性エピトープを取込んでいるウイルスタンパク質の少なくとも一部をエンコードするｃＤＮＡを修飾することを含み、さらに、当該ｃＤＮＡをニューカッスル病ウイルスのゲノム長ｃＤＮＡにクローニングし、感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを生成させることを含む方法を提供する。
【００９１】
例えば、本発明は、例えば、提供されたＮＤＶ（ワクチン）の感染性コピーを産生する方法を用いてＮＤＶを（さらに）修飾する方法を提供し、組換えマーカーＮＤＶワクチンを産生する方法が提供され、マーカーワクチンは抗原性に適切なＮＤＶエピトープの、最も可能性の高いまたは必要度の高い免疫スペクトルを含み、さらに、明瞭な血清学的に適切なエピトープまたはマーカーが組換え技術により取除かれているために、血清学的に野生型ＮＤＶとは別個のものである。本発明はＮＤＶなどの鳥類パラミクソウイルスの抗原性構造を修飾する方法を提供し、かくして、例えば、鳥類パラミクソウイルスの野生株と血清学的に区別し得る生菌ＮＤＶマーカーワクチンの生成を可能とする。
【００９２】
一実施の形態において、本発明は感染性コピーＮＤＶを提供し、その場合のＮＤＶのＨＮタンパク質は、当該ＨＮタンパク質の一部をエンコードするｃＤＮＡを鳥類パラミクソウイルス、例えば、タイプ２またはタイプ４から由来するＨＮタンパク質の一部をエンコードするｃＤＮＡと組換えることにより修飾されている。当該ハイブリッドＨＮタンパク質はこのようにして得た感染性コピーＮＤＶ株に対し血清学的なマーカーとして働くか、または鳥類パラミクソウイルスの指向性を他の細胞および／または組織に変えるように働く。本発明により提供されるこれらのいわゆるマーカー株は、世界中を巡る商業用の鳥の群れにおいて、ＮＤＶの流行を評価するための非常に貴重な道具であるワクチンの生成を可能とする。さらに、かかるマーカーワクチンの大規模適用は、感染した鳥の群れの徹底的なスクリーニングと鎮圧の過程により、ＮＤＶの完全な撲滅に導くであろう。
【００９３】
さらに、他の病原から１つまたはそれ以上の抗原を発現し、かつ、複数の疾病に対する予防接種に使用し得る感染性コピーＮＤＶ株を生成する方法が提供される。例えば、かかる感染性コピーＮＤＶウイルスは、例えば、トリ・インフルエンザ（ＡＩ）（赤血球凝集素（Ｈ５およびＨ７）およびノイラミニダーゼ）、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）（エンベロープタンパク質（ｇｐ８５））、ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）（ＶＰ１＋ＶＰ２）、メレック病ウイルス（ＭＤＶ）（糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ）、感染性喉頭気管支炎ウイルス（ＩＬＴ）（ｇＢ、ｇＨ、ｇＤ）、感染性嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（ＶＰ２およびＶＰ３）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）（融合（Ｆ）タンパク質）、鳥類パラミクソウイルス−２、−３、−６（ＰＭＶ）（Ｆ−タンパク質、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、またはその他）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（ぺプロマータンパク質、核タンパク質）、レオウイルス（シグマタンパク質）、アデノウイルス、肺炎ウイルス、サルモネラ腸炎、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、大腸菌、ボルデテラ・アビアム（Bordetella avium; 以前はアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faeclis）、ヘモフィルス・パラガリナルム（Haemophilus paragallinarum）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida)、オルニトバクテリウム・リノトラキエレ（Ornithobacterium rhinotracheale)、リエメレラ（以前はパスツレラ（Pasteurella））アナチペスチファー（Riemerella anatipestifer)、マイコプラズマ（Mycoplasmata)（マイコプラズマ・ガリセプチクム（M. gallisepticum)、マイコプラズマ・シノビエ（M. synoviae)、マイコプラズマ・メレアグリディス（M. mereagridis)、マイコプラズマ・アイオワエ（M. iowae))、またはアスペルギルス（Aspergilli)（アスペルギルス・フラーブス（A. flavus)、アスペルギルス・フミガーツス（A. fumigatus)）などから得られる異種タンパク質をエンコードする異種ｃＤＮＡを含んでなる。
【００９４】
本発明は他の家禽病原からの抗原を発現させるワクチン・ベクターとして使用し得る鳥類パラミクソウイルスまたはそれから由来する株を提供する。幾つかの性質がＮＤＶを呼吸器または腸内疾患に対する予防接種用の理想的なワクチン・ベクターとする。１）ＮＤＶは孵化鶏卵において非常に高い力価まで容易に培養することができる。２）孵化鶏卵におけるＮＤＶの大量培養が比較的安価である。３）ＮＤＶワクチンは比較的安定で、集団投与法、例えば、飲料水により、またはスプレーもしくはエーロゾル製剤により簡単に投与することができる。４）ＮＤＶの自然感染経路は呼吸器管および／または腸管によるが、多くの他の家禽病原の主たる自然感染経路であもある。５）ＮＤＶは、循環している移行抗体が存在しているにもかかわらず、局所免疫を誘発することができる。
【００９５】
ＮＤＶは強力な抗腫瘍性ならびに免疫刺激性を有することが示されている（総説として参照：Schirrmacher et al., 1998)(Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H.-H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. and Hagmuller, E. (1998) ウイルス修飾腫瘍細胞による免疫化；腫瘍学セミナー２５：６７７〜６９６）。ＮＤＶはヒト正常細胞において活発に複製され得るようには見えないが、ヒト癌細胞の選択的ＮＤＶ−介在致死が認められた。局所ＮＤＶ治療後、ヒト腫瘍異種移植片のウイルス腫瘍崩壊および完全寛解がヌードマウスで認められた。このことは腫瘍治療に対するＮＤＶの使用に通じる。しかし、問題はかかる適用が局所治療に限定されることである。
【００９６】
ＮＤＶの感染はインターフェロン、ケモカイン、および他の潜在的に重要な遺伝子産物を誘発し、多形質発現性免疫刺激性を腫瘍細胞に誘導する。この概念は、ＮＤＶを感染させた新鮮な有効試料からなる自家腫瘍細胞ワクチンの産生に使用されている。このタイプのワクチンは自家腫瘍ワクチン−ＮＤＶまたはＡＴＶ−ＮＤＶと呼ばれる（Schirrmacher et al., 1998)。ＮＤＶ感染細胞はガンマ線照射により不活化するが、この照射は細胞分裂を阻止するが、感染細胞の細胞質においてなおＮＤＶの複製を可能とする。ＡＴＶ−ＮＤＶを患者に接種した後、Ｔ細胞がＮＤＶ−誘発ケモカインを介して能力を回復する。これらＴ細胞の一部はＴ細胞レセプターを発現し、それが細胞表面で主要組織適合性複合体クラスＩ分子と複合体を形成して腫瘍関連抗原からのペプチドと相互作用し得る。この相互作用は結果として細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発し、自家腫瘍細胞を特異的に致死させる。
【００９７】
本発明はＮＤＶ感染により誘発されるケモカインと免疫刺激性タンパク質の、レパートリーと量とが調節されることを提供する。本発明は異種遺伝子を取込み、発現するように修飾した組換えＮＤＶを生成する方法を提供する。かかる組換えＮＤＶは感染細胞において免疫刺激性タンパク質のレパートリーと量を改変するために使用し得る。一実施の形態において、本発明は、ヒト・インターフェロン、ケモカインまたは他の免疫刺激性タンパク質をエンコードする遺伝子を取込み、発現する組換えＮＤＶを提供する。当該組換えＮＤＶは通常のＡＴＶ−ＮＤＶよりもより強力なＡＴＶ−ＮＤＶ産生のために使用される。例えば、サイトカイン、ＩＦＮ−α、−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６；ケモカイン、ランテス（RANTES）、ＩＰ−１０；他の遺伝子、例えば、ＨＳＰ、ＡＣＴＨ、エンドルフィン、ｉＮＯＳ、ＥＰＡ／ＴＩＭＰ、ＮＦｋＢ。ＮＤＶの多形質発現性免疫刺激性は、感染疾患に対する動物およびヒトの予防接種用のアジュバントとしても使用し得る。本発明の一実施の形態において、感染作用因子の適切な抗原をエンコードする外来遺伝子はＮＤＶゲノムに導入され、感染細胞による抗原と免疫刺激タンパク質の同時発現が感染作用因子に対する強い免疫応答を誘発する。本発明の他の実施の形態において、ＮＤＶの免疫刺激性は、抗原と特異的免疫刺激タンパク質を同時に発現するＮＤＶ組換え体を使用することでさらに増強される。好適な実施の形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の関連抗原を単独または免疫刺激タンパク質との併用において発現するＮＤＶ組換え体の使用により、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）ワクチンを生成させるために使用される。
【００９８】
ＮＤＶはまた感染性疾患に対して動物およびヒトに予防接種を行うためのアジュバントとしても使用される。本発明の一実施の形態において、感染性作用因子の適切な抗原をエンコードする異種または外来性遺伝子はＮＤＶゲノムに導入され、感染細胞による抗原と免疫刺激タンパク質の同時発現が感染作用因子に対する強い免疫応答を誘発する。本発明の他の実施の形態において、ＮＤＶの免疫刺激性は、抗原と特異的免疫刺激タンパク質を同時に発現するＮＤＶ組換え体を使用することでさらに増強される。好適な実施の形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の関連抗原を単独または免疫刺激タンパク質との併用において発現するＮＤＶ組換え体の使用により、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）ワクチンを生成させるために使用される。
【００９９】
また、自己制限非伝染性（キャリアー）ワクチンとして使用し得る条件致死ＮＤＶ欠失突然変異体を生成させる方法が提供される。ＮＤＶ欠失変異体は生成されても、内部細胞膜でＮＤＶの出芽に関与するマトリックス（Ｍ）タンパク質を発現できない。本発明は、例えば、Ｍタンパク質は発現し得ないが、細胞に感染し、細胞から細胞への伝播により拡散し得る、表現型に相補性であるＮＤＶ株を提供する。しかし、突然変異ウイルスは非相補性細胞上感染性の子孫を生成することができない。このことは、表現型に相補性であるＮＤＶ欠失突然変異体が、環境に拡散することのできない安全な自己制限ワクチンとして使用し得ることを示している。かかる非伝染性ワクチンは、最も重要な生ワクチンの利点、すなわち、有効性と、最も重要な死菌ワクチンの利点、すなわち、安全性が組み合わさっている。
【０１００】
本発明は、ニューカッスル病ウイルス、または、例えば、孵化鶏卵または適当な細胞にて継代し、またはさらに培養することによって誘導したその株、すなわち、本発明により提供される方法により得られる感染性コピーウイルスから誘導した株を提供する。
【０１０１】
例えば、ＮＤＶは、弱毒化、毒性修飾、抗原性修飾した感染性コピーニューカッスル病ウイルスを生成する少なくとも１つの方法で修飾したものであって、異種抗原を発現するかまたは非伝染性またはその組合わせであるＮＤＶが提供される。
【０１０２】
このようにして、本発明は、例えば、明瞭な毒性の特質または明瞭な抗原特性を担持することで特徴づけられるＮＤＶワクチンであって、マーカーワクチンを目的とするか、および／または他の病原から由来する異種抗原を発現するためのものであるか、伝染性および／または非伝染性型のものであるＮＤＶワクチンを提供する。
【０１０３】
かかるワクチンは死菌ワクチンであっても、生ワクチンであってもよい。好ましくは、かかるワクチンは生菌ワクチンであるが、本発明により提供される死菌ワクチンは生菌ワクチンが、例えば、商業上の制限により、または疾患管理当局が定めた他の条件のために、適用できないか、適用し難い状況下で有利である。
【０１０４】
本発明はこのようにして、当該血清学的に関連した免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体を検出するための診断法および対応するテスト・キットをも提供し、それによって家禽におけるＮＤＶおよび／または他の家禽類疾病を抑制する、および／または撲滅する方法を実施するための方法および／または手段を提供する。本発明は新規・有効なワクチンであって、野生型ウイルスおよび旧型ウイルスとから血清学的に識別し得るワクチンを提供する。かかる新規ワクチンはＮＤＶマーカーワクチンと称し、抗原的に適切なＮＤＶエピトープの最も可能性の高い免疫スペクトルを提供し、さらに随伴する診断法とキットを適用することにより野生型ＮＤＶから血清学的に区別される。
【０１０５】
本発明は未予防接種動物または本発明方法によるＮＤＶワクチンを接種した動物を、野生型ＮＤＶに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏期性ＮＤＶ−ワクチン株を接種した動物から識別する方法を提供し、該方法は最少量の１サンプル（例えば、血清、血液、卵または眼液）を当該動物から採取し、当該サンプルについて、当該野生型または未修飾ＮＤＶによって発現されるが、本発明のワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体の存在を決定することを含む。
【０１０６】
本発明は、当該抗体がＮＤＶのＨＮまたはＦタンパク質、例えば、本明細書の実験の部に記載したハイブリッドタンパク質に対するものである場合の方法を提供する。本発明は、例えば、当該動物が家禽類からなる群から選択される、好ましくはニワトリである場合の診断方法を提供する。
【０１０７】
また、本発明は動物間で血清学的に識別する方法に使用する診断キットを提供する。本発明の一実施の形態においては、簡単で迅速な赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験を用い、予防接種した動物と感染した動物間の識別をする。ＮＤＶのＨＮの完全球状頭部が他の血清型ＨＮの対応部分と置換わっているマーカーワクチンを接種した動物は、ＮＤＶのＨＮに対し抗体を誘発しないので、ＮＤＶビリオンによる赤血球凝集反応を阻害しない。
【０１０８】
ＨＩ試験においてマーカーワクチンビリオンを使用することにより、ハイブリッドＨＮタンパク質に対する抗体を検出し、予防接種の有効性に対する尺度として用いることができる。代替法として、ＮＤＶのＦタンパク質に対する抗体を検出するＥＬＩＳＡを使用して、予防接種の有効性を測定する。
【０１０９】
ＨＩ試験の他にも、ＥＬＩＳＡを用い、ＮＤＶのＨＮに対する抗体の存在を決定することができる。かかる試験において使用される抗原は、例えば、組換えＤＮＡ技法により発現されるＮＤＶのＨＮであるか、またはＮＤＶのＨＮからの保存ペプチドである。遮断ＥＬＩＳＡを用いることもできる。この事例では、ＮＤＶのＨＮの保存ペプチドに対する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を使用し、競合する抗体がワクチン接種した動物からのサンプルに存在するか否かを決定する。ＥＬＩＳＡ試験は、もしマーカーワクチンがキメラＨＮタンパク質のみを含んでいるならば、あるいはＮＤＶのＨＮの少数のエピトープが置換わっている場合、有利に使用することができる。
【０１１０】
本発明をさらに本明細書の実験の部において説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】転写ベクターｐＯＬＴＶ５はPattnaikら（1992)によって記述された転写ベクターの誘導体である。構築の詳細については本文参照のこと。プラスミドはＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（肉太活字で示した）と、それに続く単一のＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位、およびデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）からの自己触媒性リボザイムを含む。ＤＮＡフラグメントはＳｔｕＩおよびＳｍａＩ部位の間にクローン化されることが可能であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインヴィトロまたはインヴィヴォのいずれかにおいて転写されることが可能である。結果として生じる転写物の５´末端は、インサートにはコード化されていない二つの余分のＧ−残基を含む。リボザイムの働きにより、当該転写物の３´末端はインサートの最後のヌクレオチドに正確に対応する。
【図２】ミニゲノムプラスミド、ｐＯＬＴＶ５３５（図２Ａ）およびｐＯＬＴＶ５５３（図２Ｂ）の構造。ニニゲノムプラスミドは、転写プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１を参照）を主成分とし、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコード化している遺伝子の側面に並んでいる、ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶの３´領域（ｎｔ １〜１１９）と、５´領域（ ｎｔ １４９７０〜１５１８６）とを含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｐＯＬＴＶ５３５の転写は、反ゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ）を生じるが、一方ｐＯＬＴＶ５５３の転写は、ゲノムＲＮＡ（または[−]−ＲＮＡ）を生じる。ウイルス転写の開始および終止シグナルである、開始（Ｓ）および終止（Ｅ）ボックスが示されている。ＳＥＡＰ遺伝子の開始コドンには下線が付されている。各々１ｎｔずつ長さの異なるミニゲノムプラスミド（各々ｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜Ｎ５）を生じるＣｌａＩ部位のインサーション（Ｎ０〜Ｎ５）の配列も示されている。
【図３】ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶのゲノムのヌクレオチド配列および、推定されるＮＤＶ遺伝子のアミノ酸配列。示した配列は反ゲノム鎖に対応しており、５´から３´の方向へ、ｓｓＤＮＡの形で示されている。この図に示された配列は、全ＮＤＶゲノムにわたる二つの独立した重複するサブゲノムｃＤＮＡのセットの完全なシーケンシングにより決定された共通配列のものである。残りのアンビギュイティー（おそらくＰＣＲのエラーの結果）は、第３の独立したクローンのセットについての関連領域のシーケンシングによって解明された。重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンから組立てられた完全長のｃＤＮＡクローンｐＮＤＦＬ＋（図４参照）の配列は、以下の位置においてＮＤＶの共通配列のそれと異なっている（括弧間共通配列）：ｎｔ １７５５，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ３７６６，Ａ（Ｇ）；ｎｔ ５１０９，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ６９９９，Ｔ（Ｃ）；ｎｔ ７０５６，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ９３３７，Ｇ（Ａ）；ｎｔ ９４８６，Ａ（Ｔ）；ｎｔ １０１９５，Ｔ（Ｃ）；ｎｔ １３０７５，Ａ（Ｇ）。これらの差は結果として３つのアミノ酸の変化を生じる（括弧間共通配列）：Ｆタンパク質、Ｒ189（Ｑ）；ＨＮタンパク質Ｓ200（Ｐ）Ｌ−タンパク質Ｎ369（Ｉ）。
【図４】（Ａ）重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンからの完全長のＮＤＶｃＤＮＡの組立てに用いられた総体的な方法。ｃＤＮＡは、ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶの３´および５´末端をすでに含んでいるプラスミドｐＯＬＴＶ５３５（図２参照）において組立てられた。結果として生じるプラスミドはｐＮＤＦＬ＋と名付けられ、感染性ＮＤＶの生成に使用された。 （Ｂ）重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンからの完全長のＮＤＶｃＤＮＡの組立てのための詳細なクローニング法。Ｃｍは、表現形のタグとして一時的に導入されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を示す（詳細は本文参照）。 （Ｃ）遺伝学的に変異された完全長のＮＤＶｃＤＮＡの生成のための詳細なクローニング法。変異は、Ｆ遺伝子に導入された３つのヌクレオチドの変化から成り、その結果Ｆタンパク質のタンパク質分解部位のアミノ酸配列の変異を生じる（詳細は本文参照）。
【図５】（Ａ）ｐＯＬＴＶ５３５系 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写は反ゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ）を生じるが、それは細胞によりＳＥＡＰタンパク質に直接翻訳されることが可能である。ヘルパーウイルスによる細胞感染の後（またはＮＰ、Ｐ、およびＬをコード化しているプラスミドの同時トランスフェクションの後）、ゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）合成のため、反ゲノムＲＮＡがウイルスポリメラーゼ複合体によって使用される。ゲノムＲＮＡは次に、ウイルスポリメラーゼ複合体によりｍＲＮＡ（特異的な転写開始［Ｓ］および終止［Ｅ］ボックスの使用による）および反ゲノムＲＮＡの両者の合成に用いられる。 （Ｂ）ｐＯＬＴＶ５５３系Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写はゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）を生じるが、それはＳＥＡＰタンパク質に翻訳されることができない。ヘルパーウイルスによる細胞感染の後（またはＮＰ、Ｐ、およびＬをコード化しているプラスミドの同時トランスフェクションの後）、ｍＲＮＡ（特異的な転写開始［Ｓ］および終止［Ｅ］ボックスの使用による）および反ゲノムＲＮＡの両者の合成のため、ゲノムＲＮＡがウイルスポリメラーゼ複合体によって使用される。
【図６】ＮＤＶＬａＳｏｔａおよび他のパラミクソウイルスの、５´末端の核酸配列のアラインメントが、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属の４つの仲間、パラミクソウイルスの３つの仲間、およびモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属の３つの仲間にわたるＮＤＶの配列の比較として示されている。配列はＬ遺伝子の終止ボックスから５´末端まで（３´〜５´ｃＤＮＡ）描かれている。 ＮＤＶ，ニューカッスル病ウイルス；ｈＰＩＶ２，ヒトパラインフルエンザウイルス２；ＭｕＶ，おたふくかぜウイルス；ＳＶ５およびＳＶ４１，各々シミアンウイルス５および４１；ＳｅＶ，センダイウイルス；ｂＰＩＶ３，およびｈＰＩＶ３ 各々ウシおよびヒトのパラインフルエンザウイルス；ＣＤＶ，イヌジステンパーウイルス；ＭｅＶ はしかウイルス；ＲＰＶ，牛疫ウイルス。全ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）配列は、以下のように取得された（受託番号）：ＮＤＶ（ＡＦ０７７７６１）；ｈＰＩＶ２（Ｘ５７５５９）；ＭｕＶ（ＡＢ０００３８８）；ＳＶ５（ＡＦ０５２７５５）；ＳＶ４１（Ｘ６４２７５）；ｂＰＩＶ３（Ｄ８４０９５）；ｈＰＩＶ３（Ｚ１１５７５）；ＣＤＶ（Ｌ１３１９４）；ＭｅＶ（Ｘ１６５６５）；ＲＰＶ（Ｚ３０６９７）。
【実施例】
【０１１２】
実施例
材料および方法
標準クローニング法は、別に記載しない場合は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（１９８９）によって行った。複製連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成したＤＮＡ断片を含む全構成分は、塩基配列分析によって確認した。下に挙げるプライマーの配列において、下線を引いた塩基はＮＤＶの配列に対応し、ＮＤＶゲノム内のポジションを表示する。クローニングに使用した制限部位の塩基配列は、太字で示す。
細胞およびウイルス
ウシ胎児血清５％ならびに１０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μｇ／ｍｌファンギゾン、５００μｇ／ｍｌポリミキシンＢおよび１０ｍｇ／ｍｌカナマイシンからなる抗生物質ミックスを２％含むＧＭＥM／ＥＭＥM（１：１）中でＣＥＲ細胞（Ｓｍｉｔｈら、１９７６）を培養した。ＱＴ３５細胞（Ｍｏｓｃｏｖｉｃｉら、１９７７；Ｃｈｏ、１９８２）は、ＦＣＳ５％および抗生物質ミックス２％を追加した、ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって供給された培地（カタログ番号Ｎｏ．０４１−９１５３６；Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅが独占権をもつ組成物）で培養した。ＱＭ５細胞（ＡｎｔｉｎおよびＯｒｄａｈｌ、１９９１）は、燐酸トリプトースブイヨン１０％、ＦＣＳ１０％および混合抗生物質２％を追加したＭ１９９培地で培養した。
【０１１３】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａはＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＶＲ−６９９）から入手し、有胚鶏卵で２回経代培養した。ｃＤＮＡの構築およびクローニングを始める前に、該ウイルスは、ニワトリ原発性胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）上でのプラーク精製を３回繰り返して精製した。この目的のために、ウシ胎児血清５％、抗生物質ミックス２％、尿膜腔液５％、ＭｇＣｌ2３０ｍＭ、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）２００μｇ／ｍｌおよび寒天Ｎｏｂｅｌ（Ｄｉｆｃｏ）０．８％を含むＧＭＥM／ＥＭＥM（１：１）で培養したＣＥＦ細胞上に該ウイルスを滴下した。プラーク精製の第３回目から得られたウイルス（クローンＥ１３−１と表示する）を有胚鶏卵で培養し、接種後４日目に尿膜腔液を採取し、そのアリコートを−７０℃で保存した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する組替え鶏痘ウイルスｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９６；以後ＦＰＶ−Ｔ７と称す）は、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｋｉｎｎｅｒ博士からの恵贈品であり、ＱＴ３５細胞上で培養した。
【０１１４】
ウイルスＲＮＡの単離
操作はすべて、ＲＮアーゼの存在しないガラス容器またはプラスチック容器で行い、溶液はすべて、１％ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＲＮアーゼ除去の水で作成した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０遠心機による、２１，０００ｒｐｍ、４℃で７０分間の遠心分離により、尿膜腔液からウイルスをペレット化した。このペレットをホモジナイズ化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＳＤＳ）に再懸濁し、絶えず攪拌しながら３７℃で９０分間プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌ）で処理した。溶菌液を、等量のフェノール／クロロホルム（１：１）（ｐＨ５．４）で２回、等量のクロロホルムで１回抽出した。ウイルスＲＮＡは、３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．３）および２．５倍量の１００％エタノールを添加して水相から沈殿させた。沈殿は、遠心により採取して、７０％エタノールで１回洗浄し、水に再懸濁させ、分割して−７０℃で保存した。
【０１１５】
逆転写
ウイルスＲＮＡ（１．５μｇ）を、１２μｌの容量にプライマー５００ｎｇを含む液と混合し、７０℃で１０分間インキュベートした。５ｘＲＴ緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ2；ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌおよび１０ｍＭ ｄＮＴＰ'ｓ ２μｌ（各２．５ｍＭ）を添加し、混合液を４２℃で２分間インキュベートした。最終容量２０μｌ中で、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II；ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００単位を添加し、ついで４２℃で６０分間インキュベートすることにより逆転写を行った。
【０１１６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＮＤＶゲノムの３'および５'末端を決定するために使用したＰＣＲ反応（下記参照）はすべて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。個々のＮＤＶ遺伝子または大サブゲノムｃＤＮＡのクローニングのために、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｗｏか、ＴａｑとＰｗｏの混合物（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙキットまたはＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅキット）を、メーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示書に従って使用した。試料はすべて、指示された回数のＰＣＲサイクルの開始前に９４℃で２分間インキュベートした。指示された回数のＰＣＲサイクルの後、試料を、ＰＣＲサイクルの伸長反応時間の少なくとも３倍の時間、伸長反応温度でインキュベートした。ＰＣＲ断片を、高純度ＰＣＲ製品精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で直接精製するか、またはアガロースゲル電気泳動の後、ＱｉａｅｘII抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を基本的にメーカーの指示どおりに使用して精製した。
【０１１７】
塩基配列分析
塩基配列はすべて、ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて決定した。反応混合液（５μｌ）をＧｅｎｅＡｍｐ２４００サーモサイクラー中で２５サイクルの線形増幅（９４℃で１０秒、５０℃で５秒、および６０℃で４分）にかけた。その後、反応混合体をエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＳＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１５μｌで再懸濁させ、９４℃で２分間加熱した後、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢ３１０自動シークエンサーにかけた。
【０１１８】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムの配列決定に用いたプライマーの塩基配列は、公表されている配列から、またはこの配列決定計画の間に確立された配列から引き出した。プライマー類を表１に示す。
【０１１９】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'および５'末端のクローニングおよび配列決定
ＮＤＶゲノムの３'および５'末端の塩基配列は、ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）を用いて決定した。プライマーｐ３６０（５'−ＧＧＣＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＧＣＣＴＡＧＴＧＣＴＴ−３'；ｎｔ １４７５６−１４７７９）（ＮＤＶのＬ−遺伝子の公表された塩基配列（Ｙｕｓｏｆｆら、１９８７）から引き出した）を用いる、最終容量２０μｌでの逆転写反応には、ＮＤＶ ＲＮＡを使用した。一本鎖ｃＤＮＡ（ＲＴ混合物の２．５μｌ）を、アンカープライマーＡＬＧ３（５'−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣ−３'）８ｐｍｏｌに添加し、Ｔｅｓｓｉｅｒら（１９８６）による記載のとおりに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５％ ＰＥＧ、１ｍＭ ＨＣＣ、２０μＭ ＡＴＰおよびＴ４ ＲＮＡ リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１０単位を含む反応混合液２０μｌの中で、室温で一夜連結反応をさせた。連結反応の１μｌを、プライマーｐ３７５（５'−ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴ−３'；ｎｔ １４９６４−１４９８３）およびＡＬＧ４（５'−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧ−３'）を用いるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。後者のプライマーは、アンカープライマーＡＬＧ３に対し相補的である。ＰＣＲの条件（４０サイクル）は次のとおりである：９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間。ＰＣＲ生成物を精製し、Ｔ−ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＴＳＫ（ＩｃｈｉｈａｒａおよびＫｕｒｏｓａｗａ、１９９３）中にクローニングした。あるいはその代わりに、精製したＰＣＲ生成物をＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端を作り、プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｃII部位にクローニングした。１３個の独立クローン（８×ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＴＳＫおよび５×ｐＧＥＭ４Ｚ）を配列して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａゲノムの５'末端の塩基配列を決定した。３'末端の塩基配列は、二つの独立した方法によって決定した。方法Ｉでは、Ｓｃｈｕｔｚｅら（１９９５）によって記載されているとおりに、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いることによって、プライマーＡＬＧ３をウイルスＲＮＡの３'末端に連結させた。反応混合液（最終容量１０μｌ）には、ＮＤＶ ＲＮＡ ２．５μｇ、ＡＬＧ３ １００ｐｍｏｌ、１０× Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ）１μｌ、ＤＭＳＯ １μｌ、１０μＭ ヘキサミン−塩化コバルト １μｌ、ＲＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１０単位が含まれていた。この混合液を室温で１夜インキュベートし、この連結反応の５μｌを、プライマーとしてＡＬＧ４を用いる逆転写反応のテンプレートして使用した。プライマーＡＬＧ４およびｐ３７６（５'−ＧＡＧＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＴＣ−３'；ｎｔ １３７−１６４）（この塩基配列は、ＮＤＶの３'末端の公表された塩基配列（Ｉｓｈｉｄａら、１９８６）から引き出した）を用いるＰＣＲ反応にＲＴ−反応の１μｌを使用した。ＰＣＲ条件は、５'ＲＡＣＥについて上に記載したのと同じであった。方法IIにおいては、方法Ｉについて記載したのと同じ条件で、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いることによってウイルス性ＮＤＶ ＲＮＡの３'と５'末端を互いに連結した。連結反応混合液の５μｌを、プライマーｐ３６０を用いる逆転写反応においてテンプレートとして使用した。プライマーｐ３７５およびｐ３７６を用い、かつ５'ＲＡＣＥについて上に記載したＰＣＲ条件を用いるＰＣＲ反応に、ＲＴ反応の１μｌを使用した。ＰＣＲ生成物は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端を作り、プラスミドｐＧＥＭ４ＺのＨｉｎｃII部位（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。１０個の独立したクローン（方法Ｉから４個、方法IIから６個）の配列を分析して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'末端の塩基配列を決定した。
【０１２０】
転写ベクターの構築
基本レプリコンとしてプラスミドｐＯＫ１２（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、１９９１）を用いることによって低コピー番号の転写ベクターを構築した。プラスミドｐＯＫ１２をＰｖｕIIで消化し、複製開始起点およびカナマイシン−抵抗遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を、転写ベクター２．０（Ａｎｄｒｅｗ Ｂａｌｌ博士の恵贈品；Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）から得たＥｃｏ４７III−ＡｆｌII断片（ＡｆｌII部位は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑にした）に連結した。得られたプラスミドからＸｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を削除して、できるだけ多くの特定の制限部位を減らした。得られたプラスミドをｐＯＬＴＶ５と称す（図１）。転写ベクターｐＯＬＴＶ５には、特異なＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位が後続するＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）由来の自己触媒性リボザイムおよびバクテリオファージＴ７由来の転写終結シグナルが含まれている。ＳｔｕＩ部位とＳｍａＩ制限部位の間にクローニングされた断片は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、インビトロでもインビボでも転写することができる。転写の後、得られた転写産物の５'末端には、プラスミドによってコードされた２個のＧ残基が含まれている。ＨＤＶリボザイムの自己触媒作用により、転写産物の３'末端は、クローニングされたＤＮＡ断片の正確な末端塩基に対応している（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）。
【０１２１】
ミニゲノムプラスミドの構築
ＮＤＶの複製および転写の要件を調べるために、全ＮＤＶ遺伝子を置換したレポーター遺伝子を側に配置しているＮＤＶの３'および５'末端部分を含んだミニゲノムプラスミドを構築した（図２）。ＮＤＶの３'および５'末端領域に対応するＤＮＡ断片を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（３０サイクル；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒および７２℃で３０秒）を用いること、ならびにテンプレートとして３'および５'ＲＡＣＥ断片（上記参照）を含んだプラスミドを用いることによるＰＣＲ法によって産生した。
【０１２２】
３'領域（ｎｔ １〜１１９）は、プライマー３ＵＩＴ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＡ−３'、ｎｔ １〜２７）およびＳＥＡＰ３（５'−ＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧ−３'、ｎｔ １０２〜１１９）を用いることによって作った。５'領域（ｎｔ １４９７３〜１５１８６）は、プライマーＳＥＡＰ５（５'−ＧＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴ−３'、ｎｔ １４９７３〜１４９９０）および５ＮＤＶ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＣＧＡ−３'、ｎｔ １５１５８〜１５１８６）を用いることによって作った。２個のＤＮＡ断片を、プライマー３ＵＩＴおよび５ＮＤＶを用いることによる重複ＰＣＲ法（重複は、上に示したプライマーの塩基配列においてイタリックで示してある）で結合した。得られたＤＮＡ断片（これは、２０個の塩基によって分離されたＮＤＶの３'および５'末端の融合である）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの処理によってホスホリル化し、ＳｔｕＩおよびＳｍａＩで切断してウシ腸管ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱ホスホリル化した転写プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１）中の両方の位置にクローニングした。最後に、分泌したアルカリ性ホスファターゼをコードするＳＥＡＰ−遺伝子を、ＳｐｈＩおよびＣｌａＩでの消化によってプラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から回収し、ＮＤＶの３'と５'末端の間のＳｐｈＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３と称した。プラスミドｐＯＬＴＶ５３５のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビボまたはインビトロの転写により、アンチゲノムＲＮＡ（〔＋〕−ＲＮＡ）が生成する。一方、プラスミドｐＯＬＴＶ５５３の転写により、ゲノムＲＮＡ（〔−〕ＲＮＡ）が生成する。
【０１２３】
プラスミドｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜−Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜−Ｎ５は、それぞれ、ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３の中のＳＥＡＰ−遺伝子とＮＤＶの５'末端との間に存在するＣｌａＩ部位に自己相補性オリゴヌクレオチドを挿入することによって産生させた（図２参照）。使用したオリゴヌクレオチド：Ｎ０には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ１には、５'−ＣＧＣＧＡＧＳＣＴＣＧ−３'；Ｎ２には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ３には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ４には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＡＴＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ５には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＡＳＴＧＣＴＣＧ−３'（ここでＷ＝ＡまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ）であった。
【０１２４】
プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３中のＴ７プロモーターの修飾
ＮＤＶの標準５'および３'末端を含むインビトロまたはインビボの転写産物を生成させるために、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３中のＴ７プロモーターを、転写がＮＤＶの３'および５'末端の最初の塩基から始まるように修飾した。
【０１２５】
１）ＢＧｌI−制限部位、２）Ｔ７プロモーターの末端にある２個のＧ残基がＡ残基で置換されるように修飾したＴ７プロモーター（イタリックで表示）の塩基配列、ならびに３）ＮＤＶの３'末端（ｎｔ １〜２１）または５'末端（ｎｔ １５１６４〜１５１８６）、を含むプライマーを設計した。プライマーＢＧＬ３Ｆ２（５'−ＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧ−３'）およびＳＥＡＰ３（上記参照）を用いて、ｐＯＬＴＶ５３５中のＳＥＡＰ遺伝子の起点までに修飾したＴ７プロモーターおよびＮＤＶの全３'末端を含むＤＮＡ断片を作製した。同様に、プライマーＢＧＬ５Ｆ２（５'−ＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴ
ＧＧＴＧＡＡＴＧ−３'）およびＳＥＡＰ５を用いることによって、ｐＯＬＴＶ５５３中のＳＥＡＰ遺伝子の終点までに修飾したＴ７プロモーターおよびＮＤＶの全５'末端を含むＤＮＡ断片を作製した。得られた断片を、それぞれ、ＢｇｌＩとＳｐｈＩ（３'末端）で、またはＢｇｌＩとＣｌａＩ（５'末端）で消化し、ｐＯＬＴＶ５３５中のＢｇｌＩ−ＳｐｈＩ断片またはｐＯＬＴＶ５５３中のＢｇｌＩ−ＣｌａＩ断片に置換するのに使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＯＬＴＶ７３５およびｐＯＬＴＶ７５３と称した。プラスミドｐＯＬＴＶ７３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ７５３Ｎ３は、ＳＥＡＰ遺伝子と、それぞれ、ｐＯＬＴＶ７３５およびｐＯＬＴＶ７５３の中にあるＮＤＶの５'末端との間に位置するＣｌａＩ部位に、自己相補性オリゴヌクレオチド（５'−ＣＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３'；Ｗ＝ＡまたはＴ）を挿入することによって作製した。
【０１２６】
ＳＥＡＰレポータープラスミドの構築
真核生物の発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏＩ部位とＳｍａＩ部位との間に、プラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得たＳＥＡＰ−遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片（ＣｌａＩ部位は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑にした）をクローニングすることによってプラスミドｐＣＩｎｅｏＳＥＡＰを構築した。プラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃには、バクテリオファージＴ７プロモーターに加えてヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）が含まれている。Ｔ７プロモーターだけから作製した転写産物によるＳＥＡＰ発現を検査・定量するために、ｈＣＭＶプロモーターを欠いた他のプラスミドを構築した。この目的のために、ＨｉｎｄIIIでの部分消化とそれに続くＢｇｌIIでの完全消化によって、ｐＣＩｎｅｏからｈＣＭＶプロモーターを削除した。ｈＣＭＶプロモーターを削除したＤＮＡ断片（Ｃｌｏｎｔｅｃｈの番号付けによれば、ｎｔ ７５６〜５４６９）を単離し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作成し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて再環化した。得られたプラスミドは、ｐＣＩｎｅｏＤと称した。最後に、ＳＥＡＰ遺伝子を、ｐＳＥＡＰ−ＢａｃｉｓからＭｌｕＩ−ＡｃｃＩ断片として回収し、ｐＣＩｎｅｏＤ中、ＭｌｕＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＣＩｎｅｏＤ ＳＥＡＰと称した。
【０１２７】
トランスフェクション
細胞を、２４穴のペトリ皿に植付け、１夜増殖させて６０〜８０％の集密度にし、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１で、３７℃１時間、ＦＰＶ−Ｔ７に感染させた。この細胞に、基本的にメーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示どおりにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥおよびＯｐｔｉＭｅｍ３μｌを用いて、ミニゲノムプラスミドＤＮＡ０．５μｇをトランスフェクションした。３７℃で４時間（ＣＥＲ細胞）または１６時間（ＱＭ５細胞）インキュベートした後、細胞に、多重感染度５で１時間、ＮＤＶ（Ｄｕｔｃｈ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅ番号１５２６０８；ウエル当たり２００μｌ）に感染させるか、または感染させないままで放置した。接種物を吸引し、完全培地１ｍｌで置換し、細胞を３７℃でさらにインキュベートした。コトランスフェクションのために、６穴のペトリ皿で細胞を増殖させ、上記と同じようにＦＰＶ−Ｔ７に感染させた。細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥ ８μｌまたはＦｕＧｅｎｅTM６（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）９μｌを使用することによって、ミニゲノムプラスミドＤＮＡ ０．２５μｇ、ｐＣＩｎｅｏＮＰ ０．４μｇ、ｐＣＩｎｅｏＰ ０．２μｇおよびｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）またはｐＣＩｎｅｏ ０．２μｇをコトランスフェクションした。感染性ウイルスを産生するために、ミニゲノムプラスミドを、全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを含んだ転写プラスミドに置換した。
【０１２８】
ＳＥＡＰ活性の定量
Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔTM Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔを基本的にメーカー（Ｔｒｏｐｉｘ）の記載どおりに使用して、９６穴の使い捨てプレート上で、トランスフェクションした細胞の培地に分泌されたＳＥＡＰの量を測定した。化学発光を、液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ １４５０ ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＰＬＵＳ）を用いて定量した。
【０１２９】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムに亘るｃＤＮＡのクローニングおよび塩基配列の決定
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムをクローニングし、塩基配列を決めるために、ＲＴ−ＰＣＲによって大サブゲノムｃＤＮＡクローンを作製し、ｐＧＥＭ−Ｔの中にクローニングした。上記のごとく、プライマー３ＵＩＴを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ反応の１μｌを、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いるＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ法は、９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間および６８℃で６分間のサイクル５回、さらに９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、および６８℃で６分間のサイクル１０回からなっていた。その中で、６８℃での伸長反応時間は、サイクルごとに２０秒ずつ延ばした。ＰＣＲ断片は、基本的にメーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）が記載しているとおりにｐＧＥＭ−Ｔクローニングキットを使用してｐＧＥＭ−Ｔ中にクローニングした。連結反応混合液をＥ．Ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ II（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換した。２回の独立したＲＴ−ＰＣＲ反応（ＡおよびＢ）を行い、おのおのでｃＤＮＡクローンの類似セットを得た。サブゲノムｃＤＮＡクローンの塩基配列は、ＮＤＶ−特異的プライマー（表１）を用いて、かつ挿入体の側に配置しているプライマーによって決定した。クローンのＡおよびＢシリーズの塩基配列を比較した後、残っているあいまいさをｃＤＮＡの第３独立シリーズ（Ｃシリーズ）の相当領域の塩基配列を決めることによって取り除いた。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの塩基配列を図３に示す。
【０１３０】
ＮＤＶの全鎖長ゲノムｃＤＮＡクローンの構築
出発プラスミドとしてｐＯＬＴＶ５３５を用いることによって転写プラスミドｐＯＬＴＶ５に全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを集めた。これらのＤＮＡ断片を、図４Ｂに示すように通常の制限酵素を用いて重複点で結合した。一連のクローニング段階で、ポジション３５２１および１２３５５でＣｌａＩ部位を結合することによって生成した、ＣｌａＩ部位によって分離されたヌクレオチド１〜３５２１および１２３５５〜１５１８６を含むプラスミド（ｐ５３５−ＤＩと命名）を構築した。他の系列のクローニング段階で、ヌクレオチド３５２１〜１２３５５（ＣｌａＩ断片）を含むＮＤＶゲノムの一部を含んだプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｂと命名）を構築した。クローニングを容易にするために、後者のＣｌａＩ断片に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から得たクロラムフェニコール抵抗性（Ｃｍ）遺伝子を標識に付けた（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、１９７８）。この目的のために、プライマーＣＡＴ−Ｆ（５'−ＧＣＧＴＡＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＧ−３'）およびＣＡＴ−Ｒ（５'−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧ−３'）を用いるＰＣＲによってｐＡＣＹＣ１８４からＣｍ遺伝子を回収した。ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、９４℃で３０秒、６０℃で４５秒および７２℃で６０秒のサイクル３０回からなっていた。得られたＰＣＲ断片をＢｓｉＷＩで消化し、ｐＧＥＭ−Ｂの特定ＢｓｉＷＩ部位にクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｂ（ＣＡＴ）を得た。ｐＧＥＭ−Ｂ（ＣＡＴ）から得たＣｌａＩ断片は、ｐ５３５−ＤＩの特定ＣｌａＩ部位にクローニングして、ｐＮＤＦＬ（ＣＡＴ）を得た。最後に、このプラスミドからＣｍ遺伝子を、ＢｓｉＷＩでの消化とそれに続くＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａの再連結および形質転換によって除去した。得られたプラスミドをｐＮＤＦＬ＋と称した。これには、転写プラスミドｐＯＬＴＶ５の中のＴ７プロモーターおよびＨＤＶリボザイムの間にクローニングしたＮＤＶ ｃＤＮＡ全塩基配列が含まれている。
【０１３１】
個々のＮＤＶ遺伝子のクローニングおよび発現
ＮＤＶ ＬａＳｏｔａ遺伝子の各々を含むＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ法によって作成し、ｐＣＩｎｅｏ中にクローニングした。クローニングの後、断片すべての塩基配列を、挿入配列を側に持つプライマーを用いることによって、かつ遺伝子特異的プライマーによって決定した。
【０１３２】
ＮＰ−遺伝子：プライマー３８６（５'−ＧＡＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧ−３'、ｎｔ ４０〜６９）を逆転写に使用した。プライマー３６５（５'−ＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧ−３'；ｎｔ ７７〜９４）および８９２（５'−ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＴＣ−３'；ｎｔ １５７７〜１５９３）を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法に使用した。次のＰＣＲプロフィール（３０サイクル）を使用した：９５℃で３０秒、６５℃で４０秒および７２℃で４５秒。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。ＮＰタンパク質の発現は、モノクローナル抗体３８（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いて、Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９９２）によって記載されている免疫ペルオキシダーゼ単層検定法（ＩＰＭＡ）で確認した。
【０１３３】
ｐ−遺伝子：プライマーｐＲＴｌ（5'−ＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＧＴＡＧＡＡ−３'；ｎｔ １７９４〜１８１４）を逆転写に使用した。プライマーｐＲＴｌおよびｐ２（５'−ＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＣ−３'；ｎｔ ３０５３〜３０７１）を、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法に使用した。次のＰＣＲプロフィール（３０サイクル）を使用した：９５℃で３０秒間、６５℃で４０秒間および７２℃で６０秒間。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングした。Ｐタンパク質の発現は、モノクローナル抗体６８８（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いて、ＩＰＭＡで確認した。
【０１３４】
Ｍ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＡ−３'；ｎｔ １〜２７）を逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５Ｍ（５'−ＧＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡ−３'；ｎｔ ３２６８〜３２８８）およびＮＤＶ３Ｍ（５'−ＴＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴ−３'；ｎｔ ４３６８〜４３８９）を、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。このＰＣＲ法は、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で２分間のサイクル５回、ついで６８℃での伸長反応時間をサイクルごとに２０秒ずつ長くしたサイクル１５回からなっていた。得られたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑端を作り、ＮｈｅＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。Ｍタンパク質の発現は、モノクローナル抗体４２４（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いてＩＰＭＡで確認した。
【０１３５】
Ｆ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴ（上記参照）を逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５Ｆ（５'−ＡＣＧＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＴＧＧ―３'；ｎｔ ４５０８〜４５２６）およびＮＤＶ３Ｆ（５'−ＡＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＴＣＣＴＣＡＴ−３'；ｎｔ ６２１２〜６２３１）を、Ｍ−遺伝子について上に記載した条件を用いて、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。得られたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＮｈｅＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。Ｆタンパク質の発現は、モノクローナル抗体８Ｅ１２Ａ８Ｃ３（ＩＤ−ＤＬＯ、哺乳動物ウイルス学の部門）を用いて、ＩＰＭＡで確認した。
【０１３６】
ＨＮ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴを逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５ＨＮ（５'−ＧＴＡＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'；ｎｔ ６３３５〜６３５４）およびＮＤＶ３ＨＮ（５'−ＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３'；ｎｔ ８２０５〜８２２７）を、Ｍ−遺伝子について上に記載した条件を用いて、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。得られたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＸｍａＩによる消化の後、ｐＣＩｎｅｏ中、平滑にした（Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼによる）ＮｈｅＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。ＨＮ−タンパク質の発現は、モノクローナル抗体８６（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いてＩＰＭＡで確認した。
【０１３７】
Ｌ−遺伝子：ＳａｃIIおよびＳａｌＩで消化することによって、ｃＤＮＡクローンｐＧＥＭ−Ｌ７ａ（図４Ａ）からＬ−遺伝子を回収した。ＳａｌＩでの消化の前に、ＳａｃII部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの処理によって平滑にした。得られた断片は、ｐＣＩｎｅｏ中、平滑にした（Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼによる）ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングした。Ｌ−遺伝子のＴ７プロモーターとＡＴＧ開始コドンの間にある５'非翻訳領域には、Ｌタンパク質の正しい発現を阻害するかもしれない２個のフレーム外ＡＴＧコドンが含まれていた。したがって、第一ＡＴＧを欠き、第二ＡＴＧがＰＣＲ突然変異誘発によってＡＡＧに変化した新しいプラスミドを、下記のように、構築した。プライマー５ＬＥ（Ｅ）（５'−ＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＧＧＧ−３'；ｎｔ ８３３２〜８３７４）および３ＬＥ（Ｂ）（５'−ＧＴＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＡＡＴＧＣ−３'；ｎｔ ８８４７〜８８７０）を、プラスミドｐＧＥＭ−Ｌ７ａ（図４）を用いるＰＣＲ反応に使用した。本ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、９４℃で３０秒間、６０℃で４５秒間および７２℃で６０秒間のサイクル３０回からなっていた。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐＣＩｎｅｏＬ（Ｎ）を作成した。続いて、Ｌ−遺伝子（ｎｔ ８８５２〜１５０４６）の残りの部分を含んでいるｐＧＥＭ−Ｌ７ａから得たＢｓｉＷＩ−ＳａｌＩ断片をｐＣＩｎｅｏＬ（Ｎ）中、ＢｓｉＷＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、プラスミドｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）を作成した。Ｌタンパク質に対する抗体は入手不能なので、Ｌタンパク質の発現は、免疫化学によっては確認できなかった。
【０１３８】
Ｆ−遺伝子への遺伝的標識の導入
クローニングした全鎖長ｃＤＮＡから感染性ウイルスを産生させうることを明白に示すために、ＰＣＲ突然変異誘発によってＦ遺伝子に遺伝的タグを導入した。この目的のために、２個の重複ＰＣＲ断片を用いてＦ遺伝子をクローニングした。第一ＰＣＲ断片は、プライマー類ＮＤＶ５Ｆ（上記参照）およびプライマーＦ５Ｒ（５'−ＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＴＣＡＣ−３'；ｎｔ ４８５９〜４８９４）を使用することによって生成した。太字で示した残基は、Ｆ１とＦ２との間のタンパク質分解的切断部位のアミノ酸配列を、ＮＤＶ ＬａＳｏｔａ株（ＧＧＲＱＧＲ｜Ｌ）の配列から毒性のあるＮＤＶ株（ＧＲＲＱＲＲ｜Ｆ）のための共通切断部位のそれに変えるために、プライマーに導入した変換部分である。第二ＰＣＲ断片は、プライマーＦ３Ｆ（５'−ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＴＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴＴＧＧ−３'；ｎｔ ４８７５〜４９１１）およびＩＶ０９（５'−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣ−３'；ｎｔ ６２４６〜６２６６）を使用することによって産生した。ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで行い、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間のサイクル２５回からなっていた。２個の重複ＰＣＲ断片（重複は、プライマーの塩基配列においてイタリックで示す）は、プライマーＮＤＶ５ＦとＩＶ０９を用い、かつ同一のＰＣＲ条件を用いる第二ＰＣＲ法で、結合させた。得られた断片（Ｆ遺伝子の全ＯＲＦを含み、ビルレント共通切断部位をコードしている）をＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位との間にクローニングして、ｐＣＩｎｅｏＦwtを産生した。ｐＣＩｎｅｏＦwtから得たＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片（ｎｔ ４６４６〜４９５２）を使用して、ｐ５３５−ＤＩ中、ＣｌａＩ部位とＳｃａＩ部位との間にｐＧＥＭ−Ｂから得たＣｌａＩ−ＳｃａＩ断片（ｎｔ ３５２１〜１０３１１）を挿入することによって構築したプラスミドｐ５３５−Ｓ中の対応する断片を置換した（図４Ｃ参照）。得られたプラスミドは、ｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］と称した。ｐＡＣＹＣ１８４（上記参照）由来のＣｍ−抵抗性遺伝子を含むＰＣＲ断片を、ＸｂａＩ断片としてプラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］の特定ＸｂａＩ部位（ＮＤＶの塩基配列のポジション６１７２）にクローニングして、プラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］Ｃｍを産生した。続いて、このプラスミドのＣｍで標識を付けたＡｐａＩ−ＳｐｅＩ断片（ｎｔ ２２８５〜８０９４）を用いて、全鎖長ｃＤＮＡ クローンｐＮＤＦＬ+の対応する断片を置換した。最後に、ＸｂａＩでの消化とそれに続くＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる再環化によって、このプラスミドからＣｍ遺伝子を除去した。得られたプラスミド（遺伝的に標識を付けた全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを含んでいる）をｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］と称した。
【０１３９】
個々のＮＤＶ遺伝子を発現する、安定に形質転換した細胞系の生成
プラスミド類ｐＣＩｎｅｏＮＰ、ｐＣＩｎｅｏＰ、ｐＣＩｎｅｏＭ、ｐＣＩｎｅｏＦ、ｐＣＩｎｅｏＦwtおよびｐＣＩｎｅｏＨＮを使用して、個別にこれらのタンパク質を発現する、安定に形質転換した細胞系を生成させた。トランスフェクションの前日に、６ｃｍのペトリ皿にＣＥＲ細胞を播種し、一夜インキュベートして６０〜８０％の集密度を得た。この細胞を、基本的にメーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示どおりにＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅとＯｐｔｉＭｅｍの１２μｌを用いて、プラスミドＤＮＡ２μｇでトランスフェクションした。４８時間後、細胞にトリプシン処理をし、希釈液を、１０ｃｍペトリ皿中、Ｇ４１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）５００μｇ/ｍｌを含む培地に播種した。３日毎に、培地を新しい培地に置換したが、その際Ｇ４１８を１００μｇ／ｍｌずつ増量し、最終濃度は８００μｇ／ｍｌに至った。Ｇ４１８ ８００μｇ／ｍｌ含有培地に細胞を入れたままにし、トランスフェクションの３週間後、個々のコロニーをつまんで、９６穴のペトリ皿に移した。クローニングした細胞系について、一過性発現試験について上に記載したのと同じようにＩＰＭＡを用いて、個々のＮＤＶ遺伝子の発現を調べた。
【０１４０】
ＮＰ、Ｐ、ＭまたはＦを構成的に発現する細胞系を確認することができ、単離した。しかしながら、ＨＮタンパク質を発現する細胞系を産生させることはできなかった。恐らく、ＨＮの構成的発現が細胞に対して有毒になるのであろう。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する、安定に形質転換させた細胞系の生成
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩでの消化によってプラスミドｐＲＴ７ＮＴ（Ｒｅｎe ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐ、ＩＤ−ＤＬＯ、哺乳動物ウイルス学の部門）から回収した。得られた断片には、バキュロウイルスｐ１０プロモーターの背後に隠れて存在するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が含まれている。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＩｎｅｏ０中、ＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングして、プラスミドｐＣＩｎｅｏ１０７を産生した。プラスミドｐＣＩｎｅｏ０は、Ｔ７プロモーターを欠いているが、ＮｈｅＩでの切断、続いてのＳｃａＩによる部分切断、付着末端へのＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼの導入、ならびにＴ４ ＤＮＡ リガーゼによる再環化によってｐＣＩｎｅｏ１０７から誘導した。ＥｃｏＲＩとＰａｃＩによる消化、続いての平滑末端を作成するためのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理、および再環化によって、ｐＣＩｎｅｏ１０７からバキュロウイルスの塩基配列を除去した。得られたプラスミドをｐＣＩｎｅｏ００７と称した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現は、細胞をｐＣＩｎｅｏ００７とｐＰＲｈ０１でコトランスフェクションすることによって確認した。後者のプラスミドには、Ｔ７プロモーターの背後にクローニングされ、内在性リボソーム侵入部位（Ｒｅｎe ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐ、私信）を含む古典的なブタコレラウイルスのＥ２が含まれている。Ｅ２タンパク質の発現は、モノクローナル抗体Ｖ４（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１９８６）を用いるＩＰＭＡで測定した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する安定に形質変換したＣＥＲ細胞を、１０ｃｍのペトリ皿を使用したことおよびｐＣＩｎｅｏ００７ ＤＮＡ ５μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ２５μｌで細胞をトランスフェクションしたことを除いて上記と同じように、産生し、単離した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現について個々の細胞系を調べるために、細胞を、プラスミドｐＰＲｈ０１でトランスフェクションし、Ｅ２の発現（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに依存する）を、モノクローナル抗体Ｖ４を用いてＩＰＭＡで測定した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現した数個の細胞系を同定した。１細胞系（ＣＥＲ−Ｃ９と称する）をその後の実験に使用した。
【０１４１】
ＨＮ遺伝子およびハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニングおよび発現
上記したように、プライマー３ＵＩＴを使用して、ＮＤＶの一本鎖ｃＤＮＡならびにトリパラミクソウイルスの血清型２および４（ＡＰＭＶ２およびＡＰＭＶ４）を作製した。その後のＰＣＲ反応はすべて、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間のサイクル２５回の条件を用いて行った。
【０１４２】
ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子の全コード領域は、プライマーＩＶ０３（５'−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＣ−３'）およびＩＶ０５（５'−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＡＡＴＧ−３'）（塩基配列は、ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１４０３０）から引き出した）を用いるＰＣＲ法によって回収した。ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子の全コード領域は、プライマーＩＶ０６（５'−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＣ−３'）およびＩＶ０８（５'−ＡＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＧ−３'） （塩基配列は、ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１４０３１）から引き出した）を用いて、ＰＣＲ法によって回収した。得られたＰＣＲ断片を（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔでのサブクローニングの後に）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２およびｐＣＩｎｅｏＨＮ４と称した。
【０１４３】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＨＮ遺伝子とＡＰＭＶ２および４のＨＮ遺伝子との間のハイブリッドを、次のように重複ＰＣＲ法によって構築した。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＨＮ遺伝子のＮ末端部（ａａ １−１４１）を、プライマーＩＶ０１Ｂ（５'−ＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'；ｎｔ ６３２５〜６３５４）およびＩＶ１０（５'−ＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣ−３'；ｎｔ ６８１１〜６８３４）を用いて、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子のＣ末端部（ａａ １４２〜５８０）を、プライマーＩＶ１１Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣ−３'）およびＩＶ０５を用いてＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。得られたＰＣＲ断片を、重複ＰＣＲ（重複はイタリックで表示）においてプライマーＩＶ０１ＢおよびＩＶ０５を用いることによって、かつＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素ミックスを用いることによって連結させた。得られたＰＣＲ断片を（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおけるサブクローニングの後）、ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化させ、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドには、ＮＤＶのａａ １〜１４１およびＡＰＭＶ２のａａ １４２〜５８０からなるハイブリッドＨＮ遺伝子が含まれており、これをｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２141と称した。
【０１４４】
ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子のＣ末端部（ａａ １４３〜５６９）を、プライマーＩＶ１４Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣ−３'）およびＩＶ０８を用いることによって増幅した。この断片は、プライマーＩＶ０１ＢおよびＩＶ０８を用いて、重複ＰＣＲにおいてＮＤＶのＨＮ遺伝子のＮ末端部（上記参照）と連結させた。得られたＰＣＲ断片を、（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおいてサブクローニングした後）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、ＮＤＶのａａ １〜１４１とＡＰＭＶ４のａａ １４３〜５６９とからなっているハイブリッドＨＮ遺伝子を含んでおり、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４141と称した。
【０１４５】
上記の構築に類似して、ＮＤＶのａａ １〜１４３とＡＰＭＶ２のａａ １４４〜５８０、またはＮＤＶのａａ １〜１４３とＡＰＭＶ４のａａ １４５〜５６９からハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。これらの構築のために、下記のプライマーのペアを使用してＰＣＲ断片を得た；ＮＤＶ ａａ １〜１４３には、プライマーＩＶ０１ＢとＩＶ１３（５'−ＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣ−３'；ｎｔ ６８１６〜６８４０）；ＡＰＭＶ２ ａａ １４４〜５８０には、プライマーＩＶ１４Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣ−３'）とＩＶ０５；ＡＰＭＶ４ ａａ １４５〜５６９には、プライマーＩＶ１５Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧ−３'）とＩＶ０８。これらのＰＣＲ断片を、（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおいてサブクローニングした後）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏ１／２143およびｐＣＩｎｅｏ１／４143と称した。ＨＮタンパク質の発現を調べるために、ＣＥＲ細胞またはＱＭ５細胞をＦＰＶ−Ｔ７に感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１で１時間感染させ、プラスミド類ｐＣＩｎｅｏＨＮ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２、ｐＣＩｎｅｏＨＮ４、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２141、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143、そしてトランスフェクションの２４時間後、その単層を室温で４５分間、ニワトリ赤血球の１％ＰＢＳ懸濁液で覆った。その後、その単層をＰＢＳで注意深く３回洗浄し、トランスフェクションした細胞への赤血球の付着を顕微鏡で調べた。ＨＮおよびＦタンパク質の共発現後の細胞融合の誘導を調べるために、ＣＥＲ細胞またはＱＭ５細胞を、ｐＣＩｎｅｏＦwtと、ｐＣＩｎｅｏ−ＨＮ１、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２、ｐＣＩｎｅｏＨＮ４、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２141、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４141またはｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143のいずれかとコトランスフェクションした。２〜３日間インキュベートした後、その単層をＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｅｍｓａ溶液（水で３０倍希釈）で１５分間染色し、顕微鏡で調べた。
【０１４６】
全鎖長ゲノムＮＤＶ ｃＤＮＡへのハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニング
オリゴヌクレオチドＨＮ１２ａ（５'−ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＡ−３'）とＨＮ１２ｂ（５'−ＣＴＡＧＴＡＡＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣ−３'）とを用いて、一つの合成リンカー（ＨＮ１２と表示）をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部位との間に挿入した。オリゴヌクレオチドＨＮ１４ａ（５'−ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＡ−３'）とＨＮ１４ｂ（５'−ＣＴＡＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣ−３'）とを用いて、一つの合成リンカー（ＨＮ１４）をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部位との間に挿入した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１２およびｐＧＥＭ−ＨＮ１４と称した。これらのプラスミドをＮｏｔＩとＸｂａＩで消化し、プラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆwtｃ］Ｃｍから得たＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片（ｎｔ ３３９０〜７４８８）をクローニングするために使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳと称した。これらのプラスミドのＨＮ遺伝子を、それぞれ、プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143から得たハイブリッドＨＮ遺伝子で置換した（「ＨＮ遺伝子およびハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニングおよび発現」のセクション参照）。この目的のために、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２143およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４143をＮｈｅＩとＳｍａＩで消化し、プラスミドｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳのＮｈｅＩ部位とＨｐａＩ部位との間にクローニングして、それぞれ、ｐＧＥＭ＋ＨＮ１２およびｐＧＥＭ＋ＨＮ１４を得た。
【０１４７】
後者のプラスミドを用いて、ＮＤＶの全鎖長ゲノムｃＤＮＡクローンにハイブリッドＨＮ遺伝子を導入した。この目的のために、プラスミドｐＧＥＭ＋ＨＮ１２およびｐＧＥＭ＋ＨＮ１４を、ＮｏｔＩとＳｐｅＩで消化し、ＨＮ１２またはＨＮ１４遺伝子のいずれかを含む断片を用いて、ｐＮＤＦＬ＋の対応する断片を置換し、それぞれ、ｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２143ＣｍおよびｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４143Ｃｍを産生した。これらのプラスミドから、ＸｂａＩでの消化とそれに続くＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いる再環化によってＣｍ遺伝子を取り除いた。「６の法則」を満たすために、自己相補性オリゴヌクレオチドを用いて、これらのプラスミドの特定ＳｐｅＩ部位にリンカーを導入した。リンカーＨ２（５'−ＣＴＡＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ−３'）をプラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２143に、リンカーＨ３（５'−ＣＴＡＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３）をプラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４143に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２143（Ｈ２）およびｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４143（Ｈ３）を産生した。
【０１４８】
ＮＤＶ ＬａＳｏｔａのＨＮタンパク質にある特異的エピトープの削除
ＭＡｂ ４Ｄ６によって認識される（Ｌｏｎｇら、１９８６；Ｍｅｕｌｅｍａｎｓら、１９８６）、ＮＤＶ ＬａＳｏｔａのＨＮタンパク質中の特異的エピトープ、すなわちアミノ酸３４６〜３５４（ＰＤＥＱＤＹＱＩＲ）を、この配列をＡＰＭＶ−２（ＮＲＴＤＩＱＱＴＩ）またはＡＰＭＶ−４（ＰＤＰＬＱＤＱＩＬ）のいずれかのＨＮタンパク質の相当する配列に置換することによって、削除した。この目的のために、プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ（「個々のＮＤＶ遺伝子のクローニングおよび発現」のセクション参照）をテンプレートとして用いて、重複ＰＣＲ断片を作製した。ＡＰＭＶ−２配列のために、プライマー類ＩＶ０１（５'−ＧＴＡＧＡＣＧＣＧＴＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'）およびプライマー３ＨＮ２（５'−ＧＡＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＣＡＧＴＣＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣ−３'）を用いて第一ＰＣＲ断片を作製した。第二ＰＣＲ断片は、プライマー５ＨＮ２（５'−ＡＡＴＣＧＧＡＣＴＧＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣ−３'）およびＮＤＶ３−ＨＮ（５'−ＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３'）を用いて作製した。得られた断片を結合させて、プライマー類ＩＶ０１Ｂ（５'−ＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'）およびプライマーＮＤＶ３−ＨＮを用いる第三ＰＣＲ法のためのテンプレートとして使用した。ＡＰＭＶ−４配列のために、第一ＰＣＲ断片を、プライマー類ＩＶ０１およびプライマー３ＨＮ４（５'−ＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣ−３'）を用いて作製した。第二ＰＣＲ断片は、プライマー５ＨＮ４（５'−ＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣ−３'）およびＮＤＶ３−ＨＮを用いることによって作製した。得られた断片を結合して、プライマーＩＶ０１ＢおよびＮＤＶ３−ＨＮを用いる第三ＰＣＲ法のためのテンプレートとして使用した。プライマー３ＨＮ２／５ＨＮ２および３ＨＮ４／５ＨＮ４は、一部相補的であり、それぞれ、ＨＮ２配列（ＮＲＴＤＩＱＱＴＩ）およびＨＮ４（ＰＤＰＬＱＤＱＩＬ）のための遺伝子コードを含んでいる。ＰＣＲ法は、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。このＰＣＲ法は、９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間および６８℃で２分間のサイクル３０回、続いて６８℃で４分間のサイクル１回からなっていた。ＰＣＲ断片は、ＥｃｏＮＩとＢｓｕ３６Ｉで消化し、ｐＣＩｎｅｏＨＮのＥｃｏＮＩ部位とＢｓｕ３６Ｉ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ４ｅ）と称した。検討した一過性発現は、修飾したタンパク質が正しく発現されて、ニワトリ赤血球を用いる赤血球吸着ウイルス試験から判断されるように、細胞表面に輸送されたことを示した。
【０１４９】
さらに、ＮＤＶのＨＮの線状エピトープに対抗するよう向けられており、アミノ酸３４６〜３５４からなる（または、少なくともそれを含む）ＭＡｂ ６Ｄ４は、修飾ＨＮタンパク質とは反応しなかった。
【０１５０】
プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ４ｅ）をＮａｒＩとＳｐｅＩで消化し、修飾ＨＮ遺伝子を含む断片を、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳのＮａｒＩ部位とＳｐｅＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＧＥＭ−ＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＧＥＭ−ＨＮ１（ＨＮ４ｅ）と表示）をＮｏｔＩとＳｐｅＩで消化し、ｐＭＤＦＬ＋中のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片と置換するのに使用した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ２ｅ）ＣｍおよびｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ４ｅ）Ｃｍと称した。これらのプラスミドから、ＸｂａＩで消化させて再連結することによってＣｍ遺伝子を取り除いた。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ２ｅ）およびｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ４ｅ）と称した。
【０１５１】
結果
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'および５'末端部の塩基配列
ＮＤＶゲノムの推定３'末端の配列は、ここで用いたＮＤ株（ＬａＳｏｔａ）とは異なる株（Ｄ２６）ではあるが、すでに公表されている（Ｉｓｈｉｄａら、１９８６）。Ｙｕｓｏｆｆら（１９８７）は、Ｌ遺伝子およびＮＤＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ＣのＬ遺伝子の背後にある比較的大きな非コード領域の配列を公表した。しかしながら、本出願に示すように、この配列には、感染性模写ＮＤＶを生成することを不可能にするウイルスゲノムの５'末端全体が含まれていなかった。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムの３'および５'末端部は、複製および転写の基本的な機能を果たす（ＬａｍｂおよびＫｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９６）。それゆえ、逆遺伝学による感染性ウイルスの作製（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、１９９６）に使用することができる、全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡを作製するためには、ウイルスゲノムの正確な３'および５'末端を含めることが絶対的に必須である。したがって、われわれは、３'および５'ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）を利用して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムＲＮＡの３'および５'両末端の正確な塩基配列を決定した。５'末端は、一本鎖アンカープライマー（ＡＬＧ３）を、ゲノムＲＮＡの５'末端の逆転写によって産生した一本鎖ｃＤＮＡに連結した後、ＰＣＲ法によって回収した。アンカープライマーに相補的なプライマー（ＡＬＧ４）およびＮＤＶ特異的プライマーを用いることによって、５'末端を含んだＰＣＲ生成物を産生した。
【０１５２】
ＮＤＶの３'末端をクローニングするために、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、一本鎖アンカープライマーＡＬＧ３をウイルスＲＮＡの３'末端に連結し、プライマーＡＬＧ４およびＮＤＶ特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた（方法Ｉ）。別法としては、ＮＤＶ ＲＮＡの３'および５'末端を、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、得られたコンカテナン（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）ＲＮＡを、連結点をそばに置いたＮＤＶ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ法に使用した（方法II）。３'および５'ＲＡＣＥ生成物は、ＴベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII−ＴＳＫ（ＩｃｈｉｈａｒａおよびＫｕｒｏｓａｗａ、１９９３）またはｐＧＥＭ４Ｚの中にクローニングし、数個の独立したクローンを単離し、塩基配列を決定した。結果は、表２にまとめてある。
【０１５３】
３'および５'末端の直接の比較を可能にするために、塩基配列はＤＮＡの形で示し、ゲノム鎖の３'末端は、アンチゲノム鎖の５'末端として表示する。ゲノムＲＮＡのレベルでは、３'末端は、３'−ＵＧＧＵＵＵＧＵＣＵＣＵＵＡＧと読める。一方、５'末端の配列は、ＵＵＵＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡ−５'と読める。この３'末端の配列は、公表されたＮＶＤ株Ｄ２６の３'末端配列（Ｉｓｈｉｄａら、１９８６）にほぼ類似している。しかしながら、５'末端の配列は、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａが、ＮＤＶ株ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣのＬ遺伝子の公表された配列（Ｙｕｓｏｆｆら、１９８７）と比較すると、６４個の塩基が余計に存在することを示した（図６）。
【０１５４】
ヘルパーウイルスによるＮＤＶミニゲノムの複製
ＮＤＶの３'および５'末端が複製および転写に機能しているかどうかを決定するために、ＮＤＶの３'末端（ｎｔ １〜１１９）、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードしているレポーター遺伝子およびＮＤＶの５'末端（ｎｔ １４９７３〜１５１８６）からなったミニゲノムを構築した（図２）。
【０１５５】
これらのミニゲノムを、転写ベクターｐＯＬＴＶ５中で両方向にクローニングして、それぞれ、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３を産生した（構築の詳細は「材料および方法」参照）。プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１）には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれ、その結果、特異ＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位、Ｄ型肝炎ウイルス由来の自己触媒リボザイムおよびバクテリオファージＴ７由来の転写終結シグナルが含まれている（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）。プラスミドｐＯＬＴＶ５３５のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビボまたはインビトロの転写により、アンチゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ）が生成し、一方、プラスミドｐＯＬＴＶ５５３の転写では、ゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）が生成する（図５）。
【０１５６】
プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３によって産生したミニゲノムＲＮＡが、ヘルパーウイルスとしてＮＤＶを用いることによって複製されかつ発現されるかどうかを調べるために、構成的に（ＣＥＲ−Ｃ９細胞、「材料および方法」参照）、またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する鶏痘組換え体ｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９５；以後ＦＰＶ−Ｔ７と称す）で感染させた後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現したＣＥＲ細胞を使用した。ＣＥＲ−Ｃ９細胞およびＦＰＶ−Ｔ７感染ＣＥＲ細胞を、ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションし、３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を、１時間ＮＤＶに感染させるか、または未感染のままに放置した。トランスフェクションの約２４時間後、培地から細胞を採取して、ＳＥＡＰ活性を検定した。結果は、ｐＯＬＴＶ５３５でトランスフェクションしたＦＰＶ−Ｔ７感染細胞においてＳＥＡＰ発現が非常に高いことを示した。これは驚くべきことではない。何故なら、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写により、アンチゲノム［＋］−ＲＮＡが生成し、これが鶏痘酵素によってキャップを付けられ、宿主細胞によって効果的に翻訳されるからである。ｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションした細胞において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写によって、ゲノム［−］−ＲＮＡが生成するが、これがＳＥＡＰタンパク質に翻訳されるためには、ヘルパーウイルスによって［＋］−ＲＮＡに変換されねばならない（図５参照）。両方の場合に、非感染性細胞と比較して、ＮＤＶ感染細胞におけるＳＥＡＰ発現の増加は認められなかった。反対に、ＮＤＶ感染細胞のＳＥＡＰ発現は、非感染細胞におけるよりも常に約２倍低かった（データは示さず）。ｐＯＬＴＶ５３５をトランスフェクションした細胞に関しては、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって作り出された転写によるＳＥＡＰ発現のレベルがすでに非常に高いことで説明できるかもしれない。
【０１５７】
しかしながら、ｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションした細胞において、ここではＳＥＡＰの効果的な発現がウイルスポリメラーゼ複合体によるアンチゲノム［＋］−ＲＮＡまたはｍＲＮＡへのゲノム［−］−ＲＮＡの転換に依存しているが、われわれはＮＤＶ感染後のＳＥＡＰ発現の増加を期待したのであった。
【０１５８】
われわれは、このミニゲノムがＮＤＶによって発現され、複製されることがなかった二つの理由を考慮することができる。第一に、ミニゲノムＲＮＡの大きさがいわゆる「６の法則」（ＣａｌａｉｎおよびＲｏｕｘ、１９９３；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら、１９９８）に従っていないことである。この法則によれば、パラミクソウイルスゲノムは、その長さが６の倍数のｎｔであるときにのみ、効果的に複製されるのである。第二に、ミニゲノムＲＮＡの５'末端に存在する２個の余分のＧ残基が、ウイルスポリメラーゼ複合体による正しい複製および／または転写を妨害するのかもしれない。ゲノムの複製が「６の法則」に依存しているかどうかを確認するために、われわれは、サイズで１ｎｔだけ大きくした短い自己相補オリゴヌクレオチドの１系列を、ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３の特異的ＣｌａＩ部位に挿入した（図２）。得られたプラスミド（ｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜Ｎ５）は、サイズが１〜６ｎｔだけ異なっており、したがってそれらの一つによって、「６の法則」に合致するミニゲノムＲＮＡが生成するに違いない。これらのプラスミドを用いて、上に記載したように、ＣＥＲ細胞またはＦＰＶ−Ｔ７感染ＣＥＲ−Ｃ９細胞をトランスフェクションした。その結果、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３だけがＮＤＶ感染後のＳＥＡＰ活性の上昇を引き起こした。これらのプラスミドからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって生成したミニゲノムＲＮＡの長さは、計算すると６ｎ＋２であった。ミニゲノムＲＮＡの５'末端には２個の余分のＧ残基が存在するので、これらの結果は、ミニゲノムＲＮＡの真正の３'末端と５'末端の間に存在するＲＮＡ配列のサイズだけが「６の法則」に関係していることを示唆している。このことは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写開始を、ＲＮＡに組み入れた最初のヌクレオチドがＮＤＶの３'または５'末端のヌクレオチドとなるように変えたミニゲノムプラスミドを構築することによって確認された（「材料および方法」参照）。これらのプラスミドのトランスフェクションは、プラスミドｐＯＬＴＶ７３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ７５３Ｎ３によって生成したミニゲノムＲＮＡだけがヘルパーウイルスによって複製されることを示した（実験結果は示さず）。これらの発見は、再度、ＮＤＶの複製が６の法則に厳密に依存していることを示唆している。さらに、これらの発見は、ミニゲノムＲＮＡの５'末端にある余分のＧ残基２個は正確な複製を妨害しないことを示している。他のパラミクソウイルス科由来のミニゲノムプラスミド（またはＤＩプラスミド）でも同様の結果が得られた（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２；ＨａｒｔｙおよびＰａｌｅｓｅ、１９９５）。
【０１５９】
ヘルパーウイルスによるＮＤＶミニゲノムのパッケージング
ミニゲノムＲＮＡがＮＤＶヘルパーウイルスでパッケージされるか否かを決定するために、トランスフェクションした細胞の培地を新しい単層に移し、１時間の吸着の後、その単層をＰＢＳで３回洗浄し、さらに完全培地でインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、培地中のＳＥＡＰ活性を測定した。その結果、ＳＥＡＰ活性はミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３でトランスフェクションした細胞からの培地で処理した細胞にだけ存在することが判った（表４）。この発見は、ミニゲノムＲＮＡが、ＮＤＶエンベロープにパッケージされ得ることおよびこれらの粒子が細胞を感染させ得ることを示している。さらに、これらの結果が示していることは、パッケージングが複製に依存していることであり、このことは、ウイルス性ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質と複合体を形成するＲＮＡ分子だけがウイルス様粒子にパッケージされることを示している。
【０１６０】
ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドによるＮＤＶミニゲノムの複製
ミニゲノムＲＮＡも基本的なＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているプラスミドによって複製されるかどうかを決定するために、われわれは、ＦＰＶ−Ｔ７に感染した細胞でコトランスフェクション実験を行った。ミニゲノムプラスミドならびに、それぞれ、プラスミドｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）からなるプラスミドの組み合わせで細胞をトランスフェクションした。ネガティブコントロールとして、ｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）（基本的Ｌタンパク質をコードしている）を、ベクタープラスミドｐＣＩｎｅｏで置換した。その結果（表５）、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているプラスミドは事実、ミニゲノムＲＮＡを複製し得ることが判明した。さらにこれらの結果は、ヘルパーウイルスによるミニゲノム複製に類似して、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質による複製もまた、６の法則に依存していることを示している。
【０１６１】
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムの塩基配列
全ＮＤＶゲノムに亘るサブゲノムｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ法によって構築した（図４）。ＰＣＲエラーの数を最小限に保つために、プルーフリーディング酵素ミックス（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、限られた回数のＰＣＲサイクル（１５サイクル）と組み合わせて使用した。ＮＤＶ ＲＮＡの３'末端に相補的であるプライマー３ＵＩＴを逆転写のために使用し、そして遺伝子特異的プライマーをＰＣＲ法のために使用した。起こり得るＰＣＲエラーを確認するために、３つの独立したＲＴ反応を行い、サブゲノムｃＤＮＡの３つの独立した組を作製した。サイズにおいて約４ｋｂから７ｋｂまでばらついているｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ中にクローニングした。公表されたＮＤＶ配列から引き出したプライマーを用いることによって、あるいはこの配列決定プロジェクトの間に引き出されたＮＤＶ配列から取り出したプライマーによって、二組のｃＤＮＡの塩基配列を決定した（表１）。残っている不確かさは、第３組のｃＤＮＡクローンの相当領域の配列決定をすることで解消した。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムは、１５１８６ｎｔからなっている（図３）が、これは、このゲノムが、今日までに全配列が確立されたパラミクソウイルスゲノム全体の中で最小のゲノムであることを示している（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９８）。
【０１６２】
転写プラスミドｐＯＬＴＶ５中の全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡクローンの構築
ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全鎖長ｃＤＮＡクローンを構築するために、図４に示されている戦略に従って、全ＮＤＶゲノムに亘る重複ｃＤＮＡクローンを共有制限部位で結合した。転写プラスミドｐＯＬＴＶ５から導出されるミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５（上記参照）の中に全ＮＤＶ ｃＤＮＡを集めた。
【０１６３】
図４Ｂに見られるように、全ＮＤＶ ｃＤＮＡの構築の最終段階は、ｐＧＥＭ−Ｂから得た約８．８ｋｂ ＣｌａＩ（ｎｔ ３５２１〜１２３５５）断片を、両側にＣａｌＩ部位を配置しているＮＤＶ配列（すなわち、それぞれ、ｎｔ １〜３５２１および１２３５５〜１５１８６）を含んだｐ５３５−ＤＩにクローニングすることであった。この段階は、非常に困難であることが判った。われわれは、正確なクローンを産生することに何度も失敗した。そこで、ｐＧＥＭ−ＢのＣｌａＩ断片に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から得たクロラムフェニコール抵抗性（Ｃｍ）遺伝子を標識として付けた。Ｃｍ遺伝子を持つＣｌａＩ断片を単離して、ｐ５３５−ＤＩのＣｌａＩ部位にクローニングし、ＣｍとＫｍ両者に対して抵抗する形質変換体を選び出した。形質変換体は、増殖が遅いので、抗生物質の選択を、Ｃｍは１５μｇ／ｍｌ、Ｋｍは１０μｇ／ｍｌに落とし、インキュベーション温度を３７℃から３２℃に下げた。最後に、このプラスミドからＣｍ遺伝子を、ＢｓｉＷＩでの消化とそれに続くＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いる再環化で除去した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換の後、Ｃｍ感受性の両方についてスクリーニングすることによって、適切なプラスミドを持つ細胞を、表現型によって同定した。転写プラスミドｐＯＬＴＶ５のＳｍａＩ部位とＳｔｕＩ部位との間にクローニングした全鎖長ＮＤＶ ｃＤＮＡからなる、得られたプラスミドをｐＮＤＦＬ＋と称した。
【０１６４】
全鎖長ｃＤＮＡからの感染性ＮＤＶの産生
クローニングしたｃＤＮＡだけから感染性ＮＤＶを産生するために、ミニゲノムプラスミドについて上に記載したように、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）を用いるコトランスフェクション実験において、プラスミドｐＮＤＦＬ＋を使用した。ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３を用いること、およびＳＥＡＰ発現を測定することによってＣＥＲおよびＣＥＦ細胞のトランスフェクションを監視した。ネガティブコントロールとしては、ｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）をｐＣＩｎｅｏに置換した。コトランスフェクションの後、５％尿膜腔液を含む培地で３〜６日間細胞をインキュベートした。尿膜腔液の添加は必要である。なぜなら、ＣＥＲおよびＣＥＦ細胞は、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＦタンパク質を切断するために必要とされる適当なプロテアーゼを欠いているからである。
【０１６５】
Ｆタンパク質の開裂は、感染性ウイルスの細胞から細胞への伝播および産生のために絶対必要である。３日間のインキュベーションの後、われわれは、Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて固定単層の免疫学的染色を行った。その結果、抗体で染色した細胞はｐＮＤＦＬ（＋）、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−ＰおよびＬ（ｃ）でトランスフェクションした単層にのみ存在することが判明した。この結果は、ゲノムの複製および発現がこれらの細胞で起こっていることを示した。コトランスフェクション実験でｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）をｐＣＩｎｅｏに置換した場合には、染色した細胞は認められなかった。
【０１６６】
感染性ウイルスを回収するために、トランスフェクションしたＣＥＦ単層の上清を有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。４日後、尿膜腔液を採取し、血球凝集反応検定法で分析し、さらに卵中で経代培養した。その結果、ｐＮＤＦＬ（＋）、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）の複合体でトランスフェクションした細胞の上清だけが、血球凝集検定法で陽性の反応を示した。血球凝集反応陽性を示した尿膜腔液は、続いて、異なるＮＤＶ株間を区別するのに使用することのできるモノクローナル抗体７Ｂ７、８Ｃ１１、５Ａ１、７Ｄ４および４Ｄ６（Ｌｏｎｇら、１９８６）を用いて、血球凝集抑制検定法で分析した。この検定法の結果では、接種した卵から回収したＮＤＶ株は、元のＬａＳｏｔａ株と同じ活性を示した。接種した鶏卵から回収したウイルスは、元のＬａＳｏｔａ株からのものと区別するためにＮＤＦＬと称した。
【０１６７】
完全長ｃＤＮＡからの遺伝的に修飾したＮＤＶの作成
共存形質移入（コトランスフェクション）を用いて、クローニングした完全長のＮＤＶのｃＤＮＡから感染性ウイルスを回収することができることをはっきりと示すために、プラスミドｐＮＤＦＬ（＋）に遺伝子タグを導入した。この目的のために、ＰＣＲの変異誘発（詳細は材料と方法の項参照）によって、Ｆｏタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を、ＬａＳｏｔａ株の配列（ＧＧＲＱＧＲ／Ｌ）から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス配列（ＧＲＲＱＲＲ／Ｆ）に変更した。上記共存形質移入システムを用いて、ウイルスを作成するために、出来上ったプラスミドｐＤＮＦＬ＋［Ｆwt］を使用した。共存形質移入したＣＥＦ細胞の培養液を接種した胚含有卵の尿膜腔液から感染性ウイルスを回収した。ＨＩ試験では、ＬａＳｏｔａ株に特異的な７Ｄ４を含むあらゆるＭＡｂは、新しく作成したウイルスとの間で元々のＬａＳｏｔａ株との反応性と同一の反応性を示した。Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位をコードする領域の核酸配列はＲＴ−ＰＣＲによって決定した。結果は当該核酸配列が、元々のＬａＳｏｔａ配列を修飾するのに使用された変異プライマーに導入された核酸の正確な変更を含むことを示した。この知見は、当該ウイルスがプラスミドｐＤＮＦＬ＋［Ｆwt］に由来することを示し、（遺伝的に修飾された）ＮＤＶが、クローニングした完全長ＮＤＶｃＤＮＡから完全に作成できることを明らかにしている。ＮＤＶのＦｏタンパク質のプロテアーゼ切断部位は毒性に対する鍵となる決定基である。
【０１６８】
一般的に、Ｆｏタンパク質のプロテアーゼ切断部位におけるアミノ酸配列は、様々なＮＤＶ株における毒性にとって鍵となる決定基であると思われている。プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を遅現性（非毒性）から速現性（毒性）のＮＤＶ株の配列に変更した遺伝的に修飾したＬａＳｏｔａ株の作成によって、この仮定を試す独特の機会が提供された。従って、新しく作成したウイルスＮＤＦＬ［Ｆwt］の大脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）を測定し、ＮＤＦＬ株及びＬａＳｏｔａ株（クローンＥ１３−１）のＩＣＰＩと比較した。その結果、ＮＤＦＬ［Ｆwt］のＩＣＰＩは１．３であり、ＮＤＦＬ（ＩＣＰＩ＝０．０）及びクローンＥ１３−１（ＩＣＰＩ＝０．３）株の値よりもはるかに高いことが示された。このような結果は、予想通り、ＮＤＶの毒性はＦｏタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列によって大きく左右されることを示している。
【０１６９】
血清学的なマーカーの導入
ＮＤＶにおける包膜糖タンパク質Ｆ及びＨＮはウイルスで最も免疫原性のあるタンパク質である。感染後、Ｆ及びＨＮタンパク質は、強い抗体中和反応を引き出す。そのような抗体中和反応の誘導は、（広く用いられているＬａＳｏｔａ株のような）非毒性ＮＤＶ株によるワクチン接種が上手く行く基礎となる。
【０１７０】
しかしながら、ＮＤＶワクチン株に対する抗体反応は毒性のあるＮＤＶ野生株に対する抗体反応と区別することができない。従って、血清学的な方法によって毒性のある野生株による感染を追跡することはできない。野生型ウイルスによる感染がワクチン接種により隠され、野生株によって起きた臨床的な徴候が見落とされる可能性があり、又はワクチンのせいにすらされるので、この状況は望ましくない。ワクチン接種と感染を上手く区別することは、ＮＤＶ撲滅には必須のことなので、我々は、ワクチン接種に使用することができ、ＮＤＶ野生株と血清学的に区別できるような遺伝的に修飾したＮＤＶの開発に乗り出した（いわゆる標識ワクチン）。
【０１７１】
ＮＤＶ標識ワクチンを開発するために、（主要な）抗原の１つで１個又は数個の免疫的に優勢なエピトープを欠失する、又は修飾することができるようにウイルスは遺伝的に修飾されなければならない。必須タンパク質部位の欠失は、当該タンパク質の生物機能を損なう可能性がある。従って、我々は、タンパク質の生物機能を保ったままで、修飾したタンパク質に対する抗体のレパトアが元々のタンパク質に対するものとは異なるような方法で、ＮＤＶの免疫的に優勢な包膜タンパク質の１つを修飾することを選択する。以下に特定するような理由で、我々は発明の実施態様を１つ選択し、ＮＤＶのＨＮタンパク質を修飾する。ＮＤＶの感染は、宿主細胞の原形質膜とビリオン包膜との融合によって開始する。この工程のためにＦタンパク質とＨＮタンパク質の両方が必要となる。Ｆタンパク質とＨＮタンパク質は物理的に相互作用し、この相互作用には膜の融合が必要であることが明らかにされている（Deng et al., 1995)。その上、その相互作用は型特異的である、即ち、Ｆ及びＨＮタンパク質は、融合活性を示すには同一ウイルスに由来しなければならないことが示されている。ＮＤＶにおけるＨＮタンパク質の相互作用するドメインはタンパク質のいわゆる柄領域又は茎領域に位置し、ＨＮタンパク質の外部ドメインである９２個のアミノ酸配列を含んでいる（Deng et al., 1995)。ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１とヒトのパラインフルエンザ３型のアミノ酸１４１〜５７２（ｈＰＩＶ３）から成るハイブリッドＨＮタンパク質は、ＮＤＶのＦタンパク質と共に共存発現させた場合、融合活性を保持していることが示された。このような知見は、ＮＤＶの柄領域とそれに続く別の鳥類のパラミクソウイルスの血清型のＨＮタンパク質の球状頭部から成るハイブリッドＨＮタンパク質を抱く遺伝的に修飾されたＮＤＶ株が生存可能であることを示唆している。
【０１７２】
更に、そのような株はＮＤＶとは異なった抗ＨＮ抗体反応を引出す。Ｆタンパク質に対する中和抗体反応は、ウイルス感染のチャレンジに対して効果的に防御できるほど十分なので、そのような遺伝的に修飾されたＮＤＶ株は、標識ワクチンに必須の２つの必要事項、即ち、疾患に対する防御と血清学的な区別を満たしている。
【０１７３】
ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１及び鳥類パラミクソウイルス２型のアミノ酸１４２〜５８０（ＡＰＭＶ２）（ＨＮ１／２141と命名）又はＮＤＶのアミノ酸１〜１４３及びＡＰＭＶ２のアミノ酸１４４〜５８０（ＨＮ１／２143と命名）のどちらかの融合から成るハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。
【０１７４】
同様に、ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１及びＡＰＭＶ４のアミノ酸１４３〜５６９（ＨＮ１／４141と命名）又はＮＤＶのアミノ酸１〜１４３及びＡＰＭＶ４のアミノ酸１４５〜５６９（ＨＮ１／４143と命名）のどちらかの融合から成るハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。有核細胞の発現ベクターｐＣＩｎｅｏでハイブリッド遺伝子をクローニングし、ＮＤＶのＦタンパク質を含むプラスミドと共に共存形質移入実験に用いた。この目的で、Ｆ２とＦ１の間のタンパク質分解切断部位をＬａＳｏｔａ配列から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス配列（材料と方法の項を参照）のものに変更するようにＦタンパク質を修飾した。ＣＥＦ細胞及びＱＭ５細胞における共存形質移入実験によって、ＨＮ１／２141及びＨＮ１／２143の両方共、ＨＮ１／４141及びＨＮ１／４143同様に、Ｆwtタンパク質と共に共存発現させた場合、細胞融合を誘導することが示された。このような結果は、ハイブリッドＨＮタンパク質とＦタンパク質との複合体が生物活性を持つことを示している。ハイブリッドＨＮタンパク質ＨＮ１／２143及びＨＮ１／４143を用いて、完全長クローンｐＮＤＦＬ＋における元々のＨＮ遺伝子と入れ替え、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ１／２143及びｐＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143を得た。上記共存形質移入システムを用いて、感染性ウイルスを作成するために続いて後者２つのプラスミドを使用した。形質移入した単層培養細胞の培養上清を接種した胚含有卵の尿膜腔液から生きた組換えウイルス（ＮＤＦＬ−ＮＨ１／２143及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143と命名された）を単離することができた。
【０１７５】
各２つの組換え産物におけるハイブリッドＨＮ遺伝子の存在はＲＴ−ＰＣＲによって確認した。赤血球凝集抑制試験によって、ＮＤＶに対するモノクローナル抗体及び多価抗血清は組換えウイルスＮＤＦＬ−ＮＨ１／２143及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143によるニワトリ赤血球の凝集を阻止できないことが示された。このような結果は、従来のＮＤＶワクチンとは血清学的に区別することができるワクチンとしてＮＤＦＬ−ＮＨ１／２143及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４143株を使用してもよいことを示している。
【０１７６】
組換えＮＤＶからのヘテロ接合体タンパク質の発現
外来遺伝子をＮＤＶゲノムに挿入することができるかどうかを調べるために、我々は、ＳＥＡＰリポーター遺伝子を持つ組換えウイルスを構築した。ＳＥＡＰ遺伝子は、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５に由来し、ＮＤＶの典型的な転写開始ボックスと転写停止ボックスを含むように修飾した。転写開始ボックスと転写停止ボックスが後に続いたＳＥＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］のＸｍｎＩ部位（ｎｔ１０９）に挿入した。共存形質移入システムによってＮＤＦＬ−ＡＰと命名した感染性ウイルスを作成し、ＲＴ−ＰＣＲによってＳＥＡＰ遺伝子の存在を確認した。ＮＤＦＬ−ＡＰ株を感染させた細胞は、極めて高いレベルでＳＥＡＰタンパク質を発現した。ＳＥＡＰタンパク質の比活性を用いて、我々はＮＤＦＬ−ＡＰを感染させた細胞に発現されているタンパク質のｘ％がＳＥＡＰタンパク質から成っていることを算出した。このような結果は、組換えＮＤＶから極めて高いレベルでヘテロ接合体遺伝子が発現されうることを示している。
【０１７７】
トランス型相補性細胞株におけるＮＤＶ欠失変異の作成
ＮＤＶのＭタンパク質の発現を除くために、ＢｓａＡＩ（ｎｔ３０８７）によるｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］の消化とその後のＨｉｎｄＩＩＩ（ｎｔ４２５２）による部分消化によってＭ遺伝子の大部分を削除した。ＨｉｎｄＩＩＩ末端をＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで埋めた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって再び環状化し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するのに用いた。ｐＮＤＦＬ＋［Ｆwt］ｄＭと命名された出来上ったプラスミドを用いて、ＮＤＶのＭタンパク質を発現しているトランス型相補性のＣＥＲ−Ｍ細胞において共存形質移入によってウイルスを作成した。形質移入した単層培養細胞の培養上清でＣＥＲ−Ｍ細胞を３回継代し、ウイルスの存在を分析した。３回継代した培養上清が赤血球凝集試験（ＨＡ）及び赤血球凝集抑制試験（ＨＩ）の陽性結果を生じたということを証拠としてウイルスが得られた。ウイルスをＮＤＦＬ−ｄＭと命名した。ＮＤＦＬ−ｄＭを用いて単層ＣＥＦ細胞に感染させた場合、Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてＩＰＭＡで見られるように、ウイルスは依然として細胞から細胞への伝染することによって広がっていくことができた。予想通り、Ｍタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたＩＰＭＡではＭタンパク質の発現を明らかにすることはできなかった。培養上清を用いてＣＥＦ細胞又はＣＥＦ−Ｍ細胞に感染させた場合、ＩＰＭＡによってこのような単層培養細胞において複製しているウイルスの存在を示すことはできなかった。このような知見は感染性ウイルスは非相補性ＣＥＦ細胞では作られなかったことを示している。感染させたＣＥＦ細胞から得た培養上清を接種した胚含有卵では、ＨＡ試験又はＨＩ試験で調べたとき、子孫ウイルスを生じなかったという観察によってこの知見は裏付けられた。
【０１７８】
より良いＮＤＶワクチンの必要性、及び特にＮＤＶ標識ワクチンの必要性に促されて我々は、遺伝的修飾ができる逆遺伝システムを開発した。本明細書で我々は、クローニングした完全長ｃＤＮＡに完全に由来する感染性ＮＤＶの作成を記載する。我々は、Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位の特異性を決定するたった３個のヌクレオチドによってＮＤＶの毒性を劇的に変えられることを明らかにする。この場合、プロテアーゼ切断部位は、ＬａＳｏｔａ株の切断部位から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス切断部位のプロテアーゼ切断部位に変更した。この遺伝的に修飾されたＮＤＶ株を作成するために、我々は、Ｆタンパク質の切断可能性が鍵となる決定基（しかし唯一の決定基ではない）であるという公式な証明を届ける。同じ逆遺伝学的アプローチを用いて、切断部位を意のままに他のいかなるアミノ酸配列にも変更することができる。これによって毒性レベルのスペクトルを呈する一連のＮＤＶ株の作成が導かれる。
【０１７９】
ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）
既に上述したように、Ｆ及びＨＭタンパク質の切断可能性のほかに、他のウイルス因子が病原性に寄与している可能性があることが示されている。転写及び翻訳における改変がウイルス及び又は細胞病原性の増殖や細胞から細胞への広がりに介在する可能性がある。ＮＤＶの感染性ｃＤＮＡによって転写や複製を含む配列の酵素的な改変ができるようになる。これによって現実には存在しない毒性への最適な免疫原性を保った新しいＮＤＶワクチンの設計が導かれる可能性がある。
【０１８０】
安全性は生ワクチンの最も重要な特徴の１つである。しかしながら、ＮＤＶを含めて多くの生ワクチンでは、免疫原性は逆に毒性に関係することが多い。従って、免疫原性を失わずに生ワクチンをさらに減毒化することは、遺伝的修飾を使用することができる改変の最も所望のものの１つである。この点に関して、センダイ・ウイルスのＶタンパク質の発現を除くことによってマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ病原性を著しく低下させたというのは価値ある記述である（Kato et al., 1997)。センダイ・ウイルスと同様に、ＮＤＶもまたＲＮＡ編集として知られるメカニズムによってＶタンパク質を生じる(Steward et al., 1993)。ＮＤＶのＶタンパク質の発現を除くことによってもｉｎ ｖｉｖｏで減毒化された表現型を生じる可能性があることが予測可能である。
【０１８１】
ＮＤＶの毒性の変更とは別に、我々は、ＮＤＶ野生株と血清学的に区別できる株を作成できるような方法で、ＮＤＶの抗原の性質を修飾することが可能であることを明らかにする。このような所謂、標識ワクチンは、世界中の商業的な群集団におけるＮＤＶの流行を見極めるのに貴重なツールである。
【０１８２】
更に、そのような標識ワクチンを大規模に適用するということは、徹底的なスクリーニング過程と感染した群れの一掃することによって完全な撲滅を導くことになる。本明細書で我々は、外来遺伝子をＮＤＶのゲノムに挿入できることを明らかにする。このような外来遺伝子は、感染細胞に極めて高レベルで発現されうる。このことは、他の（トリの）病原体に由来する抗原を発現するためにワクチン・ベクターとしてＮＤＶを使用できることを示している。いくつかの特徴によってＮＤＶは、呼吸器疾患又は腸疾患に対するワクチン接種にとって理想的なワクチン・ベクターとなっている。 １）ＮＤＶは、胚含有卵において極めて高い力価で容易に培養することができる。 ２）胚含有卵におけるＮＤＶの大量培養は比較的安価である。３）ＮＤＶワクチンは相対的に安定であり、飲み水への添加、スプレー又はエアゾール形状によって簡単に投与することができる。４）ＮＤＶの自然感染経路は呼吸器及び／又は腸管によるものであり、それは、他の多くの鳥類病原体の主要な自然感染経路である。５）ＮＤＶは、循環する母体抗体が存在するにもかかわらず、局所免疫を誘導することができる。
【０１８３】
最後に我々は、トランス型相補性細胞株を用いて、ＮＤＶの可変欠失変異を作成することができることを明らかにする。内細胞膜でのＮＤＶの出芽に関与するマトリックス（Ｍ）タンパク質を発現できないＮＤＶ欠失変異を作成した。我々は、Ｍタンパク質を発現できない、表現型上相補性のあるＮＤＶ株が、依然として細胞に感染することができ、細胞から細胞への伝染によって広がることができることを明らかにする。しかしながら、変異ウイルスは、非相補性細胞では感染性の子孫を生じることはできない。この知見は、表現型の上で相補性のあるＮＤＶ欠失変異体は、環境に広がることができない安全な自己制約的ワクチンとして使用してもよいことを示している。そのような非伝染性ワクチンは、例えば安全性のような、例えば死菌ワクチンの最も重要な利点を伴った有効性のような、生ワクチンの最も重要な利点を兼ね備えている。
【０１８４】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【０１８５】
【表２−１】
【表２−２】
【０１８６】
【表３】
【０１８７】
【表４】
【０１８８】
【表５】
【０１８９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）の感染性コピー生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなる鳥類パラミクソウイルスｃＤＮＡ。
【請求項２】
完全長ｃＤＮＡを含んでなることを特徴とする請求項１記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】
複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノム生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなることを特徴とするｃＤＮＡ。
【請求項４】
ニューカッスル病ウイルスから少なくとも一部由来することを特徴とする請求項１、２または３記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
前記ニューカッスル病ウイルスが長潜伏期性ウイルス、好ましくはワクチン株由来のものであることを特徴とする請求項４記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
前記ワクチン株がラソタ（LaSota）株ＡＴＣＣ ＶＲ−６９９であることを特徴とする請求項５記載のｃＤＮＡ。
【請求項７】
さらに核酸内に修飾を含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のｃＤＮＡ。
【請求項８】
前記修飾が修飾プロテアーゼ切断部位をエンコードする核酸を含んでなることを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項９】
前記切断部位が融合（Ｆ）タンパク質のプロテアーゼ切断部位であることを特徴とする請求項８記載のｃＤＮＡ。
【請求項１０】
前記修飾がハイブリッド・ウイルスタンパク質をエンコードする核酸を含むことを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１１】
前記タンパク質が赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質であることを特徴とする請求項１０記載のｃＤＮＡ。
【請求項１２】
前記修飾がウイルスタンパク質をエンコードする核酸において欠失を含むことを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１３】
前記ウイルスタンパク質がマトリックス（Ｍ）タンパク質であることを特徴とする請求項１２記載のｃＤＮＡ。
【請求項１４】
異種抗原をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項１ないし１３のいずれかに記載のｃＤＮＡ。
【請求項１５】
前記抗原が家禽病原に由来することを特徴とする請求項１４記載のｃＤＮＡ。
【請求項１６】
免疫刺激タンパク質またはその部分をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項１４または１５記載のｃＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のｃＤＮＡから得られるＲＮＡ。
【請求項１８】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のｃＤＮＡを少なくとも１つの細胞にトランスフェクションすることを含む感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスの生成方法。
【請求項１９】
前記細胞がウイルス・ヌクレオカプシド（ＮＰ）、ホスホ−（Ｐ）または大型ポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を少なくとも発現し得るものであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスの融合タンパク質切断を可能とすることをさらに含むことを特徴とする請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質分解活性を含む増殖培地中で前記細胞をインキュベートすることをさらに含むことを特徴とする請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地が前記タンパク質分解活性を有する尿膜液を含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がニワトリ細胞由来のものであることを特徴とする請求項１８ないし２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８ないし２３のいずれかに記載の方法により得られる感染性コピー・鳥類パラミクソウイルス。
【請求項２５】
請求項２４記載のウイルスを含んでなるワクチン。
【請求項２６】
請求項２５記載の生ワクチン。
【請求項２７】
前記感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に少なくとも部分的に由来するものであることを特徴とする請求項２５または２６記載のワクチン。
【請求項２８】
未予防接種動物または請求項２７記載のＮＤＶワクチンを接種した動物を、野生型ＮＤＶに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏期性ＮＤＶ株を接種した動物から識別する方法であって、最少量の１サンプルを前記動物から採取し、前記サンプルについて、前記野生型または未修飾ＮＤＶによって発現されるが、前記ワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体の存在を決定することを含んでなる方法。
【請求項２９】
前記抗体がＮＤＶのＨＮまたはＦタンパク質に対するものであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が家禽類からなる群から選択される、好ましくはニワトリであることを特徴とする請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８ないし３０のいずれかに記載の方法に使用する診断キット。
【請求項１】
鳥類パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）の感染性コピー生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなる鳥類パラミクソウイルスｃＤＮＡ。
【請求項２】
完全長ｃＤＮＡを含んでなることを特徴とする請求項１記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】
複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノム生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなることを特徴とするｃＤＮＡ。
【請求項４】
ニューカッスル病ウイルスから少なくとも一部由来することを特徴とする請求項１、２または３記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
前記ニューカッスル病ウイルスが長潜伏期性ウイルス、好ましくはワクチン株由来のものであることを特徴とする請求項４記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
前記ワクチン株がラソタ（LaSota）株ＡＴＣＣ ＶＲ−６９９であることを特徴とする請求項５記載のｃＤＮＡ。
【請求項７】
さらに核酸内に修飾を含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のｃＤＮＡ。
【請求項８】
前記修飾が修飾プロテアーゼ切断部位をエンコードする核酸を含んでなることを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項９】
前記切断部位が融合（Ｆ）タンパク質のプロテアーゼ切断部位であることを特徴とする請求項８記載のｃＤＮＡ。
【請求項１０】
前記修飾がハイブリッド・ウイルスタンパク質をエンコードする核酸を含むことを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１１】
前記タンパク質が赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質であることを特徴とする請求項１０記載のｃＤＮＡ。
【請求項１２】
前記修飾がウイルスタンパク質をエンコードする核酸において欠失を含むことを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１３】
前記ウイルスタンパク質がマトリックス（Ｍ）タンパク質であることを特徴とする請求項１２記載のｃＤＮＡ。
【請求項１４】
異種抗原をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項１ないし１３のいずれかに記載のｃＤＮＡ。
【請求項１５】
前記抗原が家禽病原に由来することを特徴とする請求項１４記載のｃＤＮＡ。
【請求項１６】
免疫刺激タンパク質またはその部分をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項１４または１５記載のｃＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のｃＤＮＡから得られるＲＮＡ。
【請求項１８】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のｃＤＮＡを少なくとも１つの細胞にトランスフェクションすることを含む感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスの生成方法。
【請求項１９】
前記細胞がウイルス・ヌクレオカプシド（ＮＰ）、ホスホ−（Ｐ）または大型ポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を少なくとも発現し得るものであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスの融合タンパク質切断を可能とすることをさらに含むことを特徴とする請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質分解活性を含む増殖培地中で前記細胞をインキュベートすることをさらに含むことを特徴とする請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地が前記タンパク質分解活性を有する尿膜液を含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がニワトリ細胞由来のものであることを特徴とする請求項１８ないし２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８ないし２３のいずれかに記載の方法により得られる感染性コピー・鳥類パラミクソウイルス。
【請求項２５】
請求項２４記載のウイルスを含んでなるワクチン。
【請求項２６】
請求項２５記載の生ワクチン。
【請求項２７】
前記感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に少なくとも部分的に由来するものであることを特徴とする請求項２５または２６記載のワクチン。
【請求項２８】
未予防接種動物または請求項２７記載のＮＤＶワクチンを接種した動物を、野生型ＮＤＶに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏期性ＮＤＶ株を接種した動物から識別する方法であって、最少量の１サンプルを前記動物から採取し、前記サンプルについて、前記野生型または未修飾ＮＤＶによって発現されるが、前記ワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープまたはマーカーに対する抗体の存在を決定することを含んでなる方法。
【請求項２９】
前記抗体がＮＤＶのＨＮまたはＦタンパク質に対するものであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が家禽類からなる群から選択される、好ましくはニワトリであることを特徴とする請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８ないし３０のいずれかに記載の方法に使用する診断キット。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図３−８】
【図３−９】
【図３−１０】
【図３−１１】
【図３−１２】
【図３−１３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ−１】
【図４Ｂ−２】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図３−８】
【図３−９】
【図３−１０】
【図３−１１】
【図３−１２】
【図３−１３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ−１】
【図４Ｂ−２】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２６１３８７（Ｐ２００９−２６１３８７Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３３４９（Ｐ２００９−２３３４９）
【出願日】平成２１年２月４日（２００９．２．４）
【分割の表示】特願２００５−３４７８８８（Ｐ２００５−３４７８８８）の分割
【原出願日】平成１１年６月１７日（１９９９．６．１７）
【出願人】（５００５７９３２７）イーデー−レーリスタット，インスティチュート フォール ディールハウデレイ エン ディールゲゾントヘイト ベー．フェー． (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｄｉｅｒｈｏｕｄｅｒｉｊ ｅｎ Ｄｉｅｒｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月４日（２００９．２．４）
【分割の表示】特願２００５−３４７８８８（Ｐ２００５−３４７８８８）の分割
【原出願日】平成１１年６月１７日（１９９９．６．１７）
【出願人】（５００５７９３２７）イーデー−レーリスタット，インスティチュート フォール ディールハウデレイ エン ディールゲゾントヘイト ベー．フェー． (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｄｉｅｒｈｏｕｄｅｒｉｊ ｅｎ Ｄｉｅｒｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
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