ネコカリシウイルス遺伝子の発現用ベクター及びこれを用いたウイルスの製造方法
【課題】新たな、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）のリバースジェネティクス系を構築して、ＦＣＶを、より簡便かつ効率的に作出する手段を提供すること。
【解決手段】ＥＦ１αプロモーター配列の下流に、ＦＣＶ遺伝子ＤＮＡ又は塩基配列の一部に欠失、置換若しくは挿入がなされたＦＣＶ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた、ＦＣＶ遺伝子又はその変異遺伝子の発現用ベクターを提供し、当該発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換された宿主細胞の培養に伴い複製されるＦＣＶを、分離して得る、ＦＣＶの製造方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【解決手段】ＥＦ１αプロモーター配列の下流に、ＦＣＶ遺伝子ＤＮＡ又は塩基配列の一部に欠失、置換若しくは挿入がなされたＦＣＶ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた、ＦＣＶ遺伝子又はその変異遺伝子の発現用ベクターを提供し、当該発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換された宿主細胞の培養に伴い複製されるＦＣＶを、分離して得る、ＦＣＶの製造方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの発現ベクターと、当該ベクターを用いるウイルスの製造方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、プラスの一本鎖ＲＮＡウイルスで、カリシウイルス科ベジウイルス属に分類される。ＦＣＶは、ネコに、経口又は経鼻で感染し、口内炎や呼吸器感染症を引き起こすことが知られている。飼い猫などには、ＦＣＶに対するワクチン接種が行われているが、ＦＣＶ感染症は、全世界のネコに広く蔓延している。また、最近になり、ワクチンが無効の高病原性のＦＣＶの出現が報告されているため、新たなワクチンの開発や、増殖阻害物質の提供が求められている。
【０００３】
ＦＣＶは、ＣＲＦＫ細胞などの培養細胞における増殖が可能なウイルスである。よって、ＦＣＶは、同じカリシウイルス科に属し、培養細胞における増殖ができない、ノロウイルス、サポウイルス、ラゴウイルスなどのモデルとして利用することが可能であると考えられる。また、ＦＣＶは、カリシウイルス全般の、ゲノム複製や増殖のメカニズムの研究、抗原性や病原性の研究、不活性化条件の検討、さらに、増殖阻害物質の開発への活用が期待されている。
【０００４】
そのため、ＦＣＶの作出を行うことを目的とする、ＦＣＶのリバースジェネティクス(reverse genetics)系が行われている。
【０００５】
非特許文献１〜４には、プラスミドを鋳型として、試験管内でcapped RNAを合成後、感受性細胞に遺伝子を導入した例が開示されている（先行技術１：図２に概略を示す）。また、非特許文献３〜５には、感受性細胞に、予め、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素を発現させておき、そこに、Ｔ７プロモーター配列と、ＦＣＶ遺伝子を含むプラスミドを導入した例が開示されている（先行技術２：図３に概略を示す）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sosnovtsev S.,et al.,Virology 210,pp383-390(1995)
【非特許文献２】Neill JD,et al.,J.Virol.74(3),pp1079-1084(2000)
【非特許文献３】Thumfart JO,et al., J.Virol.76(12),pp6398-6407(2002)
【非特許文献４】Sosnovtsev S.,et al., J.Virol.79(7),pp4012-4024(2005)
【非特許文献５】Sosnovtsev S.,et al., J.Virol.76(14),pp7060-7072(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１の方法は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）遺伝子を含むプラスミドからcapped RNAを、予め試験管内(in vitro)で合成する必要があり、煩雑である。また、非特許文献２の方法も、ＦＣＶ遺伝子を含むプラスミドを導入する細胞に、予めＴ７ファージ由来のＲＮＡ合成酵素を発現する必要がある等、これも煩雑である。
【０００８】
本発明の課題は、新たなＦＣＶのリバースジェネティクス系を構築して、ＦＣＶ（所望の遺伝子改変を行ったものを含む）を、より簡便かつ効率的に作出する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、哺乳動物細胞で機能するＥＦ１αプロモーター配列を有するベクターにネコカリシウイルス（ＦＣＶ）遺伝子を組み込んだベクターを培養細胞に導入するだけで、所望のＦＣＶを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ＥＦ１αプロモーター配列の下流に、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）遺伝子ＤＮＡ又は塩基配列の一部に欠失、置換若しくは挿入がなされたＦＣＶ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた、ＦＣＶ遺伝子又はその変異遺伝子の発現用ベクター（以下、本発明のＦＣＶ発現ベクターともいう）を提供する発明である。また、本発明は、当該発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換された宿主細胞の培養に伴い複製されるＦＣＶを、分離して得る、ＦＣＶの製造方法（以下、本発明のウイルス製造方法ともいう）を提供する発明である。
【００１１】
ＥＦ１αプロモーターは、１９８９年に発表された、ヒトの蛋白質合成におけるポリペプチド伸長因子のプロモーターであり、哺乳動物細胞で機能することが知られている (Uetsuki T. et al., 1989. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 264, No. 10., 5791-5798)。ＦＣＶ遺伝子は、ｃＤＮＡとして、全長にわたって塩基配列とこれによりコードされるアミノ酸配列が決定されている。すなわち、ＦＣＶ Ｆ４は、geneBANK番号 D31836（配列番号１）として遺伝子登録されている。図１に、ＦＣＶの遺伝子構造を示す。図１に示すように、配列番号１の塩基配列のＦＣＶ遺伝子は、対応するアミノ酸配列のレベルで見ると、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、及び、ＯＲＦ３で構成されている。ＯＲＦ１のアミノ酸配列を配列番号２（配列番号１の塩基配列の２０〜５３１１番目の塩基に対応する）で示し、ＯＲＦ２を配列番号３（配列番号１の塩基配列の５３１４〜７３２０番目の塩基に対応する）で示し、ＯＲＦ３を配列番号４（配列番号１の塩基配列の７３１７〜７６３７番目の塩基に対応する）で示した。本発明を定義づけるFCV発現ベクターは、ＥＦ１αプロモーターを有するベクターに、ＦＣＶ Ｆ４の塩基配列又はこれを改変した塩基配列を組み込んだものであり、その具体例として、ＥＦ１αプロモーターを有するプラスミドベクターであるｐＫＳ４３５に、ＦＣＶ Ｆ４の塩基配列を組み込んだものが挙げられる。
【００１２】
また、上記の配列番号２、３、又は、４に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列のＤＮＡをＦＣＶ遺伝子として用いることは、本発明の典型的な態様の一つである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新たなネコカリシウイルスのリバースジェネティクス系を構築して、ＦＣＶ（所望の遺伝子改変を行ったものを含む）を、より簡便かつ効率的に作出する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の遺伝子構造を示した図面である。
【図２】先行技術１の概略を示した図面である。
【図３】先行技術２の概略を示した図面である。
【図４】pDONR221/FCV fullのＦＣＶ遺伝子（４０４８Ｔ→Ｃ）を含む実質部分の配列構成を示した図面である。当該ＦＣＶ遺伝子の５’末端側の付加配列（１）と３’末端側の付加配列（２）の内容を具体的な塩基配列を伴い示している。
【図５】pDONR221/FCV fullの作成工程を示した図面である。
【図６】pKS435-A1-gateway vectorの全体構造を示した図面である。
【図７】pKS435-A1-gateway/FCV fullの作成工程を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ａ．本発明の発現ベクターの製造
本発明の発現ベクターの製造は、（１）ＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡクローニング、（２）必要に応じた改変ゲノムの調製、（３）ベクターへのクローニング、の工程を経ることにより行うことができる。
【００１６】
（１）ＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡクローニング
ＦＣＶ全長ゲノムのｃＤＮＡクローニングは、常法を用いて行うことができる。すなわち、ＦＣＶの全長をコードする全核酸（ＲＮＡ）の抽出を行い、これを、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、これを鋳型とするＰＣＲを行って（ＲＴ−ＰＣＲ法）、所望するＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡクローニングを行うことができる。
【００１７】
（２）改変ゲノムの調製
上述のように、（１）にて得られたＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡは、必要に応じて改変、すなわち、その塩基配列において、塩基欠失、塩基置換、又は、塩基挿入を行うことにより、例えば、上記のＦＣＶｃＤＮＡに、（ａ）自己切断箇所を設ける、（ｂ）機能蛋白質の活性発現に重要なアミノ酸の同定、（ｃ）細胞指向性等のカリシウイルス株間の表現型や抗原性の相違を引き起こす原因の解析、等の目的から、点塩基変異や、遺伝子の欠失変異の導入が行われる。また、ＦＣＶ感染の可視化、定量化を目的として、ＧＦＰやLuciferase等の外来マーカー遺伝子の挿入を行うことも可能である。これらのＦＣＶ遺伝子の改変は、常法に従い行うことができる。例えば、inverse ＰＣＲ法、アニーリング法、ランダム変異体作成法（「新遺伝子工学ハンドブック（改訂第４版）」（羊土社）、第８２〜８８頁）等を用いて、所望の改変ゲノムを作出することができる。
【００１８】
（３）ベクターへのクローニング
用いるベクターは、ＥＦ１αプロモーターが作動可能なベクターを用いることが必要である。具体的には、pKS435(Arita M.,et al.,2006.Journal of General Viorogy,Vol.87,3317-3327)、pKS336 (Saijo M., et al., 2002. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 40. No. 2., 372-375.), pEF-BOS (Mizushima S et al. 1990. Nucleic Acids Research, vol.18, No. 17, p5322 (1ページのみ)), pEF-DEST51 (Invitrogen), 等の哺乳動物ベクターが挙げられる。選択されたベクターに、用いるＦＣＶ遺伝子又はその改変遺伝子をクローニングして、所望のＦＣＶ発現ベクターを調製することができる。なお、当該ベクターは、通常はプラスミドベクターである。
【００１９】
Ｂ．本発明のウイルス製造方法
（４）宿主細胞への遺伝子導入
次いで、上記の要領で得られたＦＣＶ発現ベクターを、宿主細胞にトランスフェクションを行う。このトランスフェクションの手法は、宿主の種類を考慮した常法を行うことができる。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母等、CRFK、Tg、FLF等の動物細胞、Sf9、Tn5等の昆虫細胞等を用いることができるが、その複製能力を考慮すると、真核生物、特に、哺乳動物培養細胞や動物を用いることが好適である。遺伝子導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等を用いることが可能である。
【００２０】
（５）形質導入細胞の培養とＦＣＶの調製、分離
上述のようにして、ＦＣＶ発現ベクター（本発明の遺伝子発現ベクター）がトランスフェクションされ、形質導入がなされた宿主細胞（形質導入細胞）を、宿主として選択された細胞の種類に応じた培養（３７℃、５％CO2 incubatorなど一般的な条件）を行い、十分にＦＣＶ（変異導入株を含む）を増幅させて、培養上清中あるいは培養細胞中にFCVを調製する。培養上清中のＦＣＶのウイルス力価測定は、５０％細胞変性終末点（ＴＣＩＤ50）の算出や、プラークアッセイ等の常法に基づいて行うことができる。必要があれば当該培養物から、遠心分離、ゲル濾過等によってＦＣＶを分離する。
【００２１】
本発明により、従来のＦＣＶのリバースジェネティクス系では達成されなかった、シングルステップのリバースジェネティクス系、すなわち、ＦＣＶゲノムを含むベクターを、宿主細胞にトランスフェクションを行うことのみにより、ＦＣＶを当該宿主細胞内において製造することが可能となった。
【００２２】
ＦＣＶ等のＲＮＡウイルスは、培養細胞への感染を繰り返すうちに、ゲノム中に変異が導入され、不均一な集団となることが知られている。本発明は、ゲノムｃＤＮＡから、安定的に同じ配列を有するＦＣＶを製造することが可能であり、研究目的のみならず、ワクチンウイルスの安定生産等への応用が可能である。また、所望により、特定の遺伝子改変をＦＣＶ遺伝子において行うことにより、ウイルスのゲノム複製、翻訳の機能解析に応用できるだけではなく、ウイルス自体が入手できない場合でも、データベースの配列を基に、構造蛋白質のコード領域を、他のＦＣＶ感染株と入れ替えることによって、異なる抗原性を有するＦＣＶの製造や、薬剤抵抗性の評価が可能となる。さらに、ウイルスゲノムへのマーカー遺伝子の組み込みによって、ＦＣＶの感染の可視化や、増殖の定量化も可能となる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を、実施例を用いて具体的に説明する。
［実施例１］ 本発明のFCV発現ベクターの構築
（１）pDONR221/FCV fullの構築
ＦＣＶ Ｆ４全長ｃＤＮＡのうち、一カ所の塩基が配列番号１に記載された塩基配列と異なる塩基配列（当該の一カ所が異なる塩基配列は、配列番号１に記載された塩基配列の４０４８番目のＴがＣに置換された塩基配列（４０４８Ｔ→Ｃ）であり、当該両塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は、双方とも配列番号２〜４にて示されているアミノ酸配列である）を含むプラスミドpUC19/FCV F4 full-length(Oka T.,Journal of Virology,2007,81(13)6798-6806)を鋳型として、attB1配列を有するforward primer（5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccGTAAAAGAAATTTGAGACAATGTCTC-3’：配列番号５）とattB2配列を有するreverse primer（5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtGCGGCCGCGAGCTCAGATCTCCTTTCAGCAAAAAAACCCC-3’：配列番号６）を用いて、ＦＣＶ ｃＤＮＡ全長領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅した。なお、上記プラスミドpUC19/FCV F4 full-lengthにおける一塩基のみ置換されたＦＣＶ Ｆ４遺伝子（４０４８Ｔ→Ｃ）の塩基配列部分の下流には、PolyＡ配列、ribozyme配列、Ｔ７terminator配列が連結している（上記Oka T.,Journal of Virology,2007,81(13)6798-6806を参照のこと）。
【００２４】
このＰＣＲ反応は、KOD Plus DNA Polymerase (Toyobo)を用い、GeneAmpR PCR System 2700 (Applied Biosystems)で、94℃にて10分反応後、94℃・30秒、55℃・30秒、68℃・10分を１セットとして25cycles反応し、その後、68℃・15分反応させて、ＰＣＲによる遺伝子増幅断片を得た。ＦＣＶ遺伝子（４０４８Ｔ→Ｃ）を含む当該増幅断片配列の全長配列を「cloning sequence」として配列番号７に示し、その配列構成を図４に示した。図４中、四角で囲んで示した真ん中の部分がFCV full配列（一塩基置換（４０４８Ｔ→Ｃ））である。このようにして得られたＰＣＲ増幅断片を、ＢＰclonase II(Invitrogen社)を用いて、ｐＤＯＮＲ２２１ベクター(Invitrogen社)に組み込み、pDONR221/FCV fullを作成した（図５）。
【００２５】
（２）本発明のＦＣＶ発現ベクターの構築
ｐＫＳ４３５ベクター(Journal of Genelal Virology (2006),87,3317-3327)を制限酵素Xho Iで切断後、DNA Blunting Kit（タカラバイオ社）を用いて平滑末端処理を行った。さらに、Gatewayベクターコンバージョンシステム(Invitrogen社)を用いて、ｐＫＳ４３５ベクターに、gatway cloningのためのカセット配列を挿入して、pKS435-A1-gateway vectorを作成した（このpKS435-A1-gateway vectorに関しては、研究用途に限り、要望に応じて国立感染症研究所より第三者に提供することができる）。次いで、このpKS435-A1-gateway vectorと、前述のpDONR221/FCV fullを、LR clonase II(Invitrogen社)の存在下で反応させた。これにより、pKS435-A1-gateway vector（図６）のクローニングサイトに、前述の「cloning sequence」が組み込まれた、pKS435-A1-gateway/FCV fullを作成した（当該ベクターの全長配列は、配列番号８に示した）。このベクターは、ＥＦ１αプロモーター配列の下流にＦＣＶのｃＤＮＡ（４０４８Ｔ→Ｃ）を含む「cloning sequence」が組み込まれた、本発明のＦＣＶ発現ベクターの一態様である。なお、この発現ベクターpKS435-A1-gateway/FCV fullにおけるＦＣＶの発現において、ＦＣＶ構造遺伝子部分と一緒に組み込まれた、図４に示した５’末端側と３’末端側の付加配列のうちα部分は、一連の研究活動に付随する便宜上のものであって、後述するＦＣＶの発現には実質的な貢献はしないものと考えられる。
【００２６】
（３）ＦＣＶの発現
このpKS435-A1-gateway/FCV fullを、６ウェルプレートにて培養したネコ腎由来株化細胞（CRFK細胞）に、Effectene Transfection Kit(QIAGEN社)を用いてtransfectし、３７℃・５％ＣＯ２下で培養した。plasmid transfect後、３〜４日目の培養上清中のＦＣＶの力価は、１．３６×１０４〜６TCID５０／50μLであった。このように、pKS435-A1-gateway vector は、確かに宿主細胞中にて、ＦＣＶを発現させていることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの発現ベクターと、当該ベクターを用いるウイルスの製造方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、プラスの一本鎖ＲＮＡウイルスで、カリシウイルス科ベジウイルス属に分類される。ＦＣＶは、ネコに、経口又は経鼻で感染し、口内炎や呼吸器感染症を引き起こすことが知られている。飼い猫などには、ＦＣＶに対するワクチン接種が行われているが、ＦＣＶ感染症は、全世界のネコに広く蔓延している。また、最近になり、ワクチンが無効の高病原性のＦＣＶの出現が報告されているため、新たなワクチンの開発や、増殖阻害物質の提供が求められている。
【０００３】
ＦＣＶは、ＣＲＦＫ細胞などの培養細胞における増殖が可能なウイルスである。よって、ＦＣＶは、同じカリシウイルス科に属し、培養細胞における増殖ができない、ノロウイルス、サポウイルス、ラゴウイルスなどのモデルとして利用することが可能であると考えられる。また、ＦＣＶは、カリシウイルス全般の、ゲノム複製や増殖のメカニズムの研究、抗原性や病原性の研究、不活性化条件の検討、さらに、増殖阻害物質の開発への活用が期待されている。
【０００４】
そのため、ＦＣＶの作出を行うことを目的とする、ＦＣＶのリバースジェネティクス(reverse genetics)系が行われている。
【０００５】
非特許文献１〜４には、プラスミドを鋳型として、試験管内でcapped RNAを合成後、感受性細胞に遺伝子を導入した例が開示されている（先行技術１：図２に概略を示す）。また、非特許文献３〜５には、感受性細胞に、予め、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素を発現させておき、そこに、Ｔ７プロモーター配列と、ＦＣＶ遺伝子を含むプラスミドを導入した例が開示されている（先行技術２：図３に概略を示す）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sosnovtsev S.,et al.,Virology 210,pp383-390(1995)
【非特許文献２】Neill JD,et al.,J.Virol.74(3),pp1079-1084(2000)
【非特許文献３】Thumfart JO,et al., J.Virol.76(12),pp6398-6407(2002)
【非特許文献４】Sosnovtsev S.,et al., J.Virol.79(7),pp4012-4024(2005)
【非特許文献５】Sosnovtsev S.,et al., J.Virol.76(14),pp7060-7072(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１の方法は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）遺伝子を含むプラスミドからcapped RNAを、予め試験管内(in vitro)で合成する必要があり、煩雑である。また、非特許文献２の方法も、ＦＣＶ遺伝子を含むプラスミドを導入する細胞に、予めＴ７ファージ由来のＲＮＡ合成酵素を発現する必要がある等、これも煩雑である。
【０００８】
本発明の課題は、新たなＦＣＶのリバースジェネティクス系を構築して、ＦＣＶ（所望の遺伝子改変を行ったものを含む）を、より簡便かつ効率的に作出する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、哺乳動物細胞で機能するＥＦ１αプロモーター配列を有するベクターにネコカリシウイルス（ＦＣＶ）遺伝子を組み込んだベクターを培養細胞に導入するだけで、所望のＦＣＶを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ＥＦ１αプロモーター配列の下流に、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）遺伝子ＤＮＡ又は塩基配列の一部に欠失、置換若しくは挿入がなされたＦＣＶ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた、ＦＣＶ遺伝子又はその変異遺伝子の発現用ベクター（以下、本発明のＦＣＶ発現ベクターともいう）を提供する発明である。また、本発明は、当該発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換された宿主細胞の培養に伴い複製されるＦＣＶを、分離して得る、ＦＣＶの製造方法（以下、本発明のウイルス製造方法ともいう）を提供する発明である。
【００１１】
ＥＦ１αプロモーターは、１９８９年に発表された、ヒトの蛋白質合成におけるポリペプチド伸長因子のプロモーターであり、哺乳動物細胞で機能することが知られている (Uetsuki T. et al., 1989. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 264, No. 10., 5791-5798)。ＦＣＶ遺伝子は、ｃＤＮＡとして、全長にわたって塩基配列とこれによりコードされるアミノ酸配列が決定されている。すなわち、ＦＣＶ Ｆ４は、geneBANK番号 D31836（配列番号１）として遺伝子登録されている。図１に、ＦＣＶの遺伝子構造を示す。図１に示すように、配列番号１の塩基配列のＦＣＶ遺伝子は、対応するアミノ酸配列のレベルで見ると、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、及び、ＯＲＦ３で構成されている。ＯＲＦ１のアミノ酸配列を配列番号２（配列番号１の塩基配列の２０〜５３１１番目の塩基に対応する）で示し、ＯＲＦ２を配列番号３（配列番号１の塩基配列の５３１４〜７３２０番目の塩基に対応する）で示し、ＯＲＦ３を配列番号４（配列番号１の塩基配列の７３１７〜７６３７番目の塩基に対応する）で示した。本発明を定義づけるFCV発現ベクターは、ＥＦ１αプロモーターを有するベクターに、ＦＣＶ Ｆ４の塩基配列又はこれを改変した塩基配列を組み込んだものであり、その具体例として、ＥＦ１αプロモーターを有するプラスミドベクターであるｐＫＳ４３５に、ＦＣＶ Ｆ４の塩基配列を組み込んだものが挙げられる。
【００１２】
また、上記の配列番号２、３、又は、４に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列のＤＮＡをＦＣＶ遺伝子として用いることは、本発明の典型的な態様の一つである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新たなネコカリシウイルスのリバースジェネティクス系を構築して、ＦＣＶ（所望の遺伝子改変を行ったものを含む）を、より簡便かつ効率的に作出する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の遺伝子構造を示した図面である。
【図２】先行技術１の概略を示した図面である。
【図３】先行技術２の概略を示した図面である。
【図４】pDONR221/FCV fullのＦＣＶ遺伝子（４０４８Ｔ→Ｃ）を含む実質部分の配列構成を示した図面である。当該ＦＣＶ遺伝子の５’末端側の付加配列（１）と３’末端側の付加配列（２）の内容を具体的な塩基配列を伴い示している。
【図５】pDONR221/FCV fullの作成工程を示した図面である。
【図６】pKS435-A1-gateway vectorの全体構造を示した図面である。
【図７】pKS435-A1-gateway/FCV fullの作成工程を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ａ．本発明の発現ベクターの製造
本発明の発現ベクターの製造は、（１）ＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡクローニング、（２）必要に応じた改変ゲノムの調製、（３）ベクターへのクローニング、の工程を経ることにより行うことができる。
【００１６】
（１）ＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡクローニング
ＦＣＶ全長ゲノムのｃＤＮＡクローニングは、常法を用いて行うことができる。すなわち、ＦＣＶの全長をコードする全核酸（ＲＮＡ）の抽出を行い、これを、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、これを鋳型とするＰＣＲを行って（ＲＴ−ＰＣＲ法）、所望するＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡクローニングを行うことができる。
【００１７】
（２）改変ゲノムの調製
上述のように、（１）にて得られたＦＣＶの全長ゲノムのｃＤＮＡは、必要に応じて改変、すなわち、その塩基配列において、塩基欠失、塩基置換、又は、塩基挿入を行うことにより、例えば、上記のＦＣＶｃＤＮＡに、（ａ）自己切断箇所を設ける、（ｂ）機能蛋白質の活性発現に重要なアミノ酸の同定、（ｃ）細胞指向性等のカリシウイルス株間の表現型や抗原性の相違を引き起こす原因の解析、等の目的から、点塩基変異や、遺伝子の欠失変異の導入が行われる。また、ＦＣＶ感染の可視化、定量化を目的として、ＧＦＰやLuciferase等の外来マーカー遺伝子の挿入を行うことも可能である。これらのＦＣＶ遺伝子の改変は、常法に従い行うことができる。例えば、inverse ＰＣＲ法、アニーリング法、ランダム変異体作成法（「新遺伝子工学ハンドブック（改訂第４版）」（羊土社）、第８２〜８８頁）等を用いて、所望の改変ゲノムを作出することができる。
【００１８】
（３）ベクターへのクローニング
用いるベクターは、ＥＦ１αプロモーターが作動可能なベクターを用いることが必要である。具体的には、pKS435(Arita M.,et al.,2006.Journal of General Viorogy,Vol.87,3317-3327)、pKS336 (Saijo M., et al., 2002. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 40. No. 2., 372-375.), pEF-BOS (Mizushima S et al. 1990. Nucleic Acids Research, vol.18, No. 17, p5322 (1ページのみ)), pEF-DEST51 (Invitrogen), 等の哺乳動物ベクターが挙げられる。選択されたベクターに、用いるＦＣＶ遺伝子又はその改変遺伝子をクローニングして、所望のＦＣＶ発現ベクターを調製することができる。なお、当該ベクターは、通常はプラスミドベクターである。
【００１９】
Ｂ．本発明のウイルス製造方法
（４）宿主細胞への遺伝子導入
次いで、上記の要領で得られたＦＣＶ発現ベクターを、宿主細胞にトランスフェクションを行う。このトランスフェクションの手法は、宿主の種類を考慮した常法を行うことができる。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母等、CRFK、Tg、FLF等の動物細胞、Sf9、Tn5等の昆虫細胞等を用いることができるが、その複製能力を考慮すると、真核生物、特に、哺乳動物培養細胞や動物を用いることが好適である。遺伝子導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等を用いることが可能である。
【００２０】
（５）形質導入細胞の培養とＦＣＶの調製、分離
上述のようにして、ＦＣＶ発現ベクター（本発明の遺伝子発現ベクター）がトランスフェクションされ、形質導入がなされた宿主細胞（形質導入細胞）を、宿主として選択された細胞の種類に応じた培養（３７℃、５％CO2 incubatorなど一般的な条件）を行い、十分にＦＣＶ（変異導入株を含む）を増幅させて、培養上清中あるいは培養細胞中にFCVを調製する。培養上清中のＦＣＶのウイルス力価測定は、５０％細胞変性終末点（ＴＣＩＤ50）の算出や、プラークアッセイ等の常法に基づいて行うことができる。必要があれば当該培養物から、遠心分離、ゲル濾過等によってＦＣＶを分離する。
【００２１】
本発明により、従来のＦＣＶのリバースジェネティクス系では達成されなかった、シングルステップのリバースジェネティクス系、すなわち、ＦＣＶゲノムを含むベクターを、宿主細胞にトランスフェクションを行うことのみにより、ＦＣＶを当該宿主細胞内において製造することが可能となった。
【００２２】
ＦＣＶ等のＲＮＡウイルスは、培養細胞への感染を繰り返すうちに、ゲノム中に変異が導入され、不均一な集団となることが知られている。本発明は、ゲノムｃＤＮＡから、安定的に同じ配列を有するＦＣＶを製造することが可能であり、研究目的のみならず、ワクチンウイルスの安定生産等への応用が可能である。また、所望により、特定の遺伝子改変をＦＣＶ遺伝子において行うことにより、ウイルスのゲノム複製、翻訳の機能解析に応用できるだけではなく、ウイルス自体が入手できない場合でも、データベースの配列を基に、構造蛋白質のコード領域を、他のＦＣＶ感染株と入れ替えることによって、異なる抗原性を有するＦＣＶの製造や、薬剤抵抗性の評価が可能となる。さらに、ウイルスゲノムへのマーカー遺伝子の組み込みによって、ＦＣＶの感染の可視化や、増殖の定量化も可能となる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を、実施例を用いて具体的に説明する。
［実施例１］ 本発明のFCV発現ベクターの構築
（１）pDONR221/FCV fullの構築
ＦＣＶ Ｆ４全長ｃＤＮＡのうち、一カ所の塩基が配列番号１に記載された塩基配列と異なる塩基配列（当該の一カ所が異なる塩基配列は、配列番号１に記載された塩基配列の４０４８番目のＴがＣに置換された塩基配列（４０４８Ｔ→Ｃ）であり、当該両塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は、双方とも配列番号２〜４にて示されているアミノ酸配列である）を含むプラスミドpUC19/FCV F4 full-length(Oka T.,Journal of Virology,2007,81(13)6798-6806)を鋳型として、attB1配列を有するforward primer（5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccGTAAAAGAAATTTGAGACAATGTCTC-3’：配列番号５）とattB2配列を有するreverse primer（5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtGCGGCCGCGAGCTCAGATCTCCTTTCAGCAAAAAAACCCC-3’：配列番号６）を用いて、ＦＣＶ ｃＤＮＡ全長領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅した。なお、上記プラスミドpUC19/FCV F4 full-lengthにおける一塩基のみ置換されたＦＣＶ Ｆ４遺伝子（４０４８Ｔ→Ｃ）の塩基配列部分の下流には、PolyＡ配列、ribozyme配列、Ｔ７terminator配列が連結している（上記Oka T.,Journal of Virology,2007,81(13)6798-6806を参照のこと）。
【００２４】
このＰＣＲ反応は、KOD Plus DNA Polymerase (Toyobo)を用い、GeneAmpR PCR System 2700 (Applied Biosystems)で、94℃にて10分反応後、94℃・30秒、55℃・30秒、68℃・10分を１セットとして25cycles反応し、その後、68℃・15分反応させて、ＰＣＲによる遺伝子増幅断片を得た。ＦＣＶ遺伝子（４０４８Ｔ→Ｃ）を含む当該増幅断片配列の全長配列を「cloning sequence」として配列番号７に示し、その配列構成を図４に示した。図４中、四角で囲んで示した真ん中の部分がFCV full配列（一塩基置換（４０４８Ｔ→Ｃ））である。このようにして得られたＰＣＲ増幅断片を、ＢＰclonase II(Invitrogen社)を用いて、ｐＤＯＮＲ２２１ベクター(Invitrogen社)に組み込み、pDONR221/FCV fullを作成した（図５）。
【００２５】
（２）本発明のＦＣＶ発現ベクターの構築
ｐＫＳ４３５ベクター(Journal of Genelal Virology (2006),87,3317-3327)を制限酵素Xho Iで切断後、DNA Blunting Kit（タカラバイオ社）を用いて平滑末端処理を行った。さらに、Gatewayベクターコンバージョンシステム(Invitrogen社)を用いて、ｐＫＳ４３５ベクターに、gatway cloningのためのカセット配列を挿入して、pKS435-A1-gateway vectorを作成した（このpKS435-A1-gateway vectorに関しては、研究用途に限り、要望に応じて国立感染症研究所より第三者に提供することができる）。次いで、このpKS435-A1-gateway vectorと、前述のpDONR221/FCV fullを、LR clonase II(Invitrogen社)の存在下で反応させた。これにより、pKS435-A1-gateway vector（図６）のクローニングサイトに、前述の「cloning sequence」が組み込まれた、pKS435-A1-gateway/FCV fullを作成した（当該ベクターの全長配列は、配列番号８に示した）。このベクターは、ＥＦ１αプロモーター配列の下流にＦＣＶのｃＤＮＡ（４０４８Ｔ→Ｃ）を含む「cloning sequence」が組み込まれた、本発明のＦＣＶ発現ベクターの一態様である。なお、この発現ベクターpKS435-A1-gateway/FCV fullにおけるＦＣＶの発現において、ＦＣＶ構造遺伝子部分と一緒に組み込まれた、図４に示した５’末端側と３’末端側の付加配列のうちα部分は、一連の研究活動に付随する便宜上のものであって、後述するＦＣＶの発現には実質的な貢献はしないものと考えられる。
【００２６】
（３）ＦＣＶの発現
このpKS435-A1-gateway/FCV fullを、６ウェルプレートにて培養したネコ腎由来株化細胞（CRFK細胞）に、Effectene Transfection Kit(QIAGEN社)を用いてtransfectし、３７℃・５％ＣＯ２下で培養した。plasmid transfect後、３〜４日目の培養上清中のＦＣＶの力価は、１．３６×１０４〜６TCID５０／50μLであった。このように、pKS435-A1-gateway vector は、確かに宿主細胞中にて、ＦＣＶを発現させていることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＦ１αプロモーター配列の下流に、ネコカリシウイルス遺伝子ＤＮＡ又は塩基配列の一部に欠失、置換若しくは挿入がなされたネコカリシウイルス遺伝子ＤＮＡ、が組み込まれた、ネコカリシウイルス遺伝子又はその変異遺伝子の発現用ベクター。
【請求項２】
ネコカリシウイルス遺伝子ＤＮＡは、配列番号２、３、又は、４に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列のＤＮＡである、請求項１に記載の発現用ベクター。
【請求項３】
前記発現用ベクターは、プラスミドベクターであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の発現用ベクター。
【請求項４】
前記プラスミドベクターは、ｐＫＳ４３５であることを特徴とする、請求項３に記載の発現用ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換された宿主細胞の培養に伴い複製されるネコカリシウイルスを、分離して得る、ネコカリシウイルスの製造方法。
【請求項１】
ＥＦ１αプロモーター配列の下流に、ネコカリシウイルス遺伝子ＤＮＡ又は塩基配列の一部に欠失、置換若しくは挿入がなされたネコカリシウイルス遺伝子ＤＮＡ、が組み込まれた、ネコカリシウイルス遺伝子又はその変異遺伝子の発現用ベクター。
【請求項２】
ネコカリシウイルス遺伝子ＤＮＡは、配列番号２、３、又は、４に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列のＤＮＡである、請求項１に記載の発現用ベクター。
【請求項３】
前記発現用ベクターは、プラスミドベクターであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の発現用ベクター。
【請求項４】
前記プラスミドベクターは、ｐＫＳ４３５であることを特徴とする、請求項３に記載の発現用ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換された宿主細胞の培養に伴い複製されるネコカリシウイルスを、分離して得る、ネコカリシウイルスの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−４４９１０（Ｐ２０１２−４４９１０Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８８８８２（Ｐ２０１０−１８８８８２）
【出願日】平成２２年８月２５日（２０１０．８．２５）
【出願人】（５１０２３０６３２）株式会社中部衛生検査センター (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２５日（２０１０．８．２５）
【出願人】（５１０２３０６３２）株式会社中部衛生検査センター (1)
【Ｆターム（参考）】
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