ハイブリッド種子における目的産物の安全な産生
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド種子（Ｆ１種子）における高収率で安全な目的産物の産生方法に関する。また、本発明は、それにより産生される種子及び前記種子から単離される目的産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の最近の遺伝子工学的方法における主な問題は、以下のように要約することができる：
１． 通常、目的産物の収率が低い。例は薬用タンパク質、酵素、他のタンパク質、ポリマー、糖、多糖類などである。低収率とは、精製／後処理費用が高いことを意味する。
２． 遺伝子改変植物と非トランスジェニック亜種又は野生型相対物との自由な交雑、及び収穫後の農場における「自生」植物の存在による遺伝子汚染。植物は自己複製生物であるため、又はヒトの過ち若しくは故意の行動のため、そのようなイベントは自然発生的に容易に起こる。
【０００３】
２つの問題は同一問題の全く反対の側面である：低収率は、通常、完全な発育及び生殖サイクルを経由する能力も同時に保持する産生体である植物を構築したいという欲求の結果である。発育及び生殖の工程と導入遺伝子発現工程との組み合わせは解決策を与えない。誘導性システム（ＵＳ０５１８７２８７号；ＵＳ０５８４７１０２号；Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０．４５６７−４５７１；Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号；Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号；Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）も器官特異的導入遺伝子発現システム（ＵＳ０５９５５３６１号；ＷＯ０９８２８４３１号；Ｄｅ Ｊａｅｇｅｒら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、１２６５−１２６８）も遺伝子汚染の問題に対する解決策を提供せず、高収率の目的産物も提供しない。上記システムに用いる誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターは全て、例えば「漏出性」の定常活性を有し、これは発生の過程で導入遺伝子サイレンシングを引き起こし、必然的に目的産物の収率が減少する。更に、そのような誘導性システムの制御下にある組換え遺伝子を有するトランスジェニック植物は、例えば組換え生物医薬品を産生する場合に、厳格な生物安全性の基準を満たさないため、収率が唯一の問題ではない。
【０００４】
植物ウイルス配列に基づいた増幅ベクターの使用は、上記問題、特にそのようなベクターを一過性の発現に用いた場合の部分的解決策を潜在的に提供することができる（ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２２９０６８号）。しかしながら、一過性発現実験用ベクターの多くは、選択された植物種、大部分はタバコファミリーのために開発されている（ＵＳ５４６６７８８号；ＵＳ５６７０３５３号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２０８８３６９号）。目的の組換えタンパク質／ＲＮＡを産生するためのウイルスベクターの効率性は、効率的な細胞間移行及び全体移行の能力によっても決定される。後者のパラメータは、種及び亜種依存的であり、したがって、一過性発現のために宿主を選択する自由を厳しく制限する。この問題の潜在的解決策は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクターを有するトランスジェニック植物を設計することである。形質移入又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組み込みを介して外来配列を植物で発現させるために設計されたウイルスベクターの使用について多くの総説に記載されている（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．１９９３、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．、３、９１−９６；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．１９９５、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１５５−１６５；Ｐｏｒｔａ，Ｃ．＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．＆Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１９、２４５−２９１；Ａｗｒａｍら、２００２、Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５８、８１−１２４）。しかしながら、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたアンプリコンベクターを有するトランスジェニック植物を設計する試みは、通常、導入遺伝子サイレンシングの問題に直面し、このアプローチを役に立たないものにしている。最良の場合、ＧＵＳ遺伝子及びＮＰＴ遺伝子に関してＨａｙｅｓと同僚によって８０年代後半に示されたように、強力な構成的プロモーターによって提供されるよりもわずかに高い収率を提供する（Ｈａｙｅｓら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７．２３９１−２４０３）。それ以来、ウイルスレプリコンに基づいたトランスジェニック植物における高収率で生物学的に安全な組換えタンパク質の産生を達成する上で特筆すべき突破口は無かった。
【０００５】
ハイブリッド植物が転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のサプレッサーを提供する、ハイブリッド植物のアンプリコンに関するＭａｌｌｏｒｙと同僚の研究（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）は、問題の部分的解決策を与える。しかしながら、このアプローチは目的産物の収率が高くなく、正常な植物の発育とは両立しなかった。更に、バイオセイフティ問題に対処していなかった。Ｇｏｏｄｉｎｇと同僚（１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８）は、科学的研究で単離コムギ胚におけるジェミニウイルスベクターの複製について報告している。可能な技術応用に取り組んでいなかった。更に、この方法は規模を大きくすることができず、したがって、技術応用に使用されていない。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を、特に高収率で産生するための新規方法を提供することである。本発明の他の目的は、植物産生システムにおいて目的産物、特に目的タンパク質を産生するための生物学的に安全な方法を提供することであり、この方法に関与するトランスジェニック遺伝物質の環境への分布は厳しく制御され、発生する可能性が低い。本発明の更なる目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を産生する方法を提供することであり、目的産物の収率又は品質を損なうことなく、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概説
これらの目的は、Ｆ１種子において目的産物を産生する方法によって達成され、この方法は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによってＦ１種子を得ることを含み、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生ずる。次に目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔くことができる。
【０００８】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【０００９】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【００１０】
更に、上記方法によって産生されるか又は産生可能な種子、及び前記種子から単離される目的産物が提供される。好ましくは、前記種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、より好ましくは前記植物は性的に不稔である。
【００１１】
発明者らは、植物種子（Ｆ１種子）において目的産物を産生する方法を見出した。前記方法に必要な遺伝子供与は、親植物をハイブリダイズすることによって前記種子で生ずる。即ち、いずれの親植物も前記方法に必要な完全な遺伝子供与を有していない。目的産物を産生する種子は、目的産物をそこから単離するときに破壊される。その結果として、本発明の方法は、前記方法に必要な遺伝子供与物が環境に分布する可能性が非常に低いため、生物学的安全性が高い。更に、前記種子から生長する植物は生殖できないため、生物学的安全性を更に高めるためにＦ１種子は不稔であり得る。更に、本発明の方法は、目的産物を産生する上で遺伝子サイレンシングは問題ではないという驚くべき利点を有する。これは、種子における親植物の部分的遺伝子供与物の共存が短いことによるかもしれない。特に、目的産物の産生が基本的に親植物では起こらないため、導入遺伝子サイレンシングを種子に伝達することができない。導入遺伝子サイレンシングがほとんど起こらないため、目的産物を高収率で産生することができる。通常、目的産物は他の植物組織におけるよりも種子においてより安定であるため、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができることが本発明の更なる利点である。これは、本発明の方法全体に柔軟性を与える。
【００１２】
第１及び第２のトランスジェニック親植物は、それぞれ第１及び第２の部分的遺伝子供与物を含有する。部分的遺伝子供与物はトランスジェニックであることが好ましい。第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において遺伝子供与を生ずる。種子において遺伝子供与が生ずると、種子における目的産物の産生が誘発される。ハイブリダイズとは、第１及び第２のトランスジェニック親植物の人工受粉を意味することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２の部分的遺伝子供与物を組み合わせ、Ｆ１種子に遺伝子供与物を供与する。第１及び第２の遺伝子供与物はともに種子における目的産物の産生に必要である。したがって、目的産物は第１又は第２の親植物では発現しない。例えば第１又は第２の部分的供与物からの漏出性発現により、親植物において微量レベルの目的産物の産生が起こり得る。そのような漏出性の発現は、目的産物の経済的産生に対して非常に弱い。しかしながら、第１及び第２の親植物のいずれにおいても目的産物の産生は起こらないことが好ましい。
【００１３】
前記方法によって産生される目的産物は、目的タンパク質、例えば薬用タンパク質であることが好ましい。本発明にしたがい、２、３以上の目的タンパク質を種子で産生することもできる。目的タンパク質は、種子の植物に対して異種タンパク質であることが好ましい。目的タンパク質は酵素でもよい。種子で酵素を産生する場合、産物は、とりわけ前記酵素の作用によって種子で産生される化学化合物でもよい。化学化合物の産生には２、３以上の酵素が必要とされるかもしれない。本発明を用いて産生し得る化学化合物の例としては、ビタミン、ポリマー（例えばポリヒドロキシブチル酸及び他の生分解性ポリエステル）、脂肪酸、脂肪、油、炭水化物、高級イソプレノイドなどが挙げられる。公知の手順にしたがい、目的産物を含有する種子を親植物から収穫し、目的タンパク質又は化学化合物を種子から単離することができる。目的産物が単離される種子発芽していてもよい。目的産物は発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子に蓄積し得る。
【００１４】
遺伝子供与が生ずることによる目的産物又はタンパク質の産生は、多くのさまざまな方法で達成することができる。タンパク質が産生される場合、それぞれの部分的遺伝子供与物はタンパク質のコード配列の一部を提供することができ、前記部分は例えばＤＮＡレベルでの組換え、ＲＮＡレベルでのＲＮＡトランススプライシング、又はタンパク質レベルでのタンパク質トランススプライシングによって種子で組み合わせられることができる。他の一般的なアプローチは、目的タンパク質のコード配列にタンパク質が発現不可能な形態で第１の部分的供与を提供し、遺伝子成分にタンパク質の発現を誘発する第２の部分的供与を提供することである。例えば、植物に固有のポリメラーゼには認識されない異種プロモーターからのコード配列の転写を可能にするＲＮＡポリメラーゼに第２の部分的供与を提供することによって、又は例えばコード配列をプロモーターの制御下に置くことによってコード配列を発現可能にするリコンビナーゼに第２の部分的供与を提供することによって、発現を誘発することができる。種子における目的産物の産生に対する制御を更に増加させるために、産生を誘発するリコンビナーゼ又は他の酵素のコード配列を２つの断片に分割することができる。一方の断片を第１親植物によって種子に提供し、他方の断片を第２親植物によって種子に提供することができる。２つの断片は、２つの異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下で発現させ、Ｆ１種子においてインテイン介在性トランススプライシングによって活性リコンビナーゼ又は酵素に組み立てることができる。このようにして、目的産物の産生開始を制御することができ、例えば種子発育の後期にシフトさせることができる。インテイン介在性トランススプライシングについての詳細は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に見出すことができる。
【００１５】
重要な態様では、遺伝子供与は、ハイブリダイゼーションによって生ずる複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む。複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは目的産物の産生に関与する。目的タンパク質が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡから発現することが好ましい。複製ＤＮＡはレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有することができる。レプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ＤＮＡウイルスレプリカーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＤＮＡウイルス成分を有し得る。同様に、複製ＲＮＡはＲＮＡレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有し得る。ＲＮＡレプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＲＮＡウイルス成分を有し得る。最も好ましくは、ＤＮＡウイルスレプリコン又はＲＮＡウイルスレプリコンは目的タンパク質をコードすることができる。
【００１６】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは植物ウイルスを起源とすることができる。複製ＤＮＡはジェミニウイルスに基づくことができる。複製ＲＮＡの場合、複製ＲＮＡは１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づくことが好ましい。好ましい１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスはトバモウイルスである。複製ＲＮＡはタバコモザイクウイルスに基づくことが最も好ましい。
【００１７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分から生ずることができる。ＤＮＡレプリコンは、第１の部分的遺伝子供与物としてそのゲノムにレプリコンの前駆体を組み込ませた第１親植物を、前駆体からレプリコンを生じさせること（又は複製をもたらすこと）が可能な成分を含有するか又はコードすることができる第２親植物とハイブリダイズさせることによって種子において生ずることができる。第２親植物によって提供される成分は、レプリコンの前駆体を再構築することによってレプリコンを生じさせることが可能な酵素（部位特異的リコンビナーゼ、フリッパーゼ又はインテグラーゼのような）であり得る。この態様の例を図３、図７及び図９に示す。
【００１８】
複製ＲＮＡは、第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずることができる。あるいは、第１の部分的遺伝子供与は、複製ＲＮＡの前駆体を含むことができる。前駆体は、第１親植物のゲノムに組み込まれた複製ＲＮＡのＤＮＡコピーであり得る。次に、複製ＲＮＡは、第２の部分的遺伝子供与物にコードされる成分、特にＲＮＡポリメラーゼによる複製ＲＮＡのＤＮＡコピーの転写によって種子において生ずることができる。ＲＮＡポリメラーゼを前記成分として用いる場合、ＲＮＡポリメラーゼは、複製ＲＮＡのＤＮＡコピーを転写するために用いるプロモーターに適応させる必要がある。
【００１９】
目的産物、特に目的タンパク質が第１の部分的遺伝子供与物にコードされ、第２の部分的遺伝子供与物が例えば産生のための調節機能を提供する場合、雌性親植物によるハイブリダイゼーションに第１の部分的遺伝子供与物を提供することが好ましい。より好ましくは、雌性親植物は雄性不稔である。このようにして、第１（雌性）トランスジェニック親植物由来の花粉は環境に分布せず、第２（雄性）親植物由来の花粉は目的産物をコードしないため、生物学的安全性を更に高めることができる。同様に、遺伝子供与物が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む場合は、複製ＤＮＡ又はＲＮＡは雌性親植物の部分的遺伝子供与によって提供されることが好ましい。
【００２０】
第１の部分的遺伝子供与物及び第２の部分的遺伝子供与物は、種子に伝達できるようにそれぞれの親植物に組み込まれていることが好ましい。この目的のため、これらは親植物のゲノムに安定に組み込まれていることが好ましい。親植物は、植物バイオテクノロジーの公知の方法にしたがって所望の部分的遺伝子供与物を含有するベクターで植物を形質転換することによって産生することができる。親植物は、部分的遺伝子供与物に関して同型であることが好ましい。親植物株は維持されて、自殖によって繁殖することができる。
【００２１】
本発明の種子（Ｆ１種子）を収穫して目的産物の単離に用いることができる。したがって、種子に含有される遺伝子供与物を含めたトランスジェニック材料は環境に分布せず、種子の子孫への移行による繁殖はしない。トランスジェニック材料が種子の子孫へ移行するのを妨げるため、好ましくは、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除され、より好ましくはＦ１種子は不稔である。好ましい態様では、目的産物の強力な発現のために、あるいは複製ＤＮＡ又はＲＮＡの強力な複製のために、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれているか又は種子は不稔である。あるいは又は更に、種子から生長する植物の発育は遺伝子操作によって生殖生長期に達する前にブロックされており、これは正常な植物の発育を妨げる毒性物質又は毒性タンパク質の組織特異的発現によって達成することができる。そのような毒性タンパク質は、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択することができる。好ましくは、植物発育は開花期前にブロックされ、より好ましくは第１葉形成前にブロックされる。
【００２２】
毒性タンパク質（バルナーゼなど、実施例５を参照されたい）はタンパク質断片として発現させることができ、タンパク質断片のタンパク質トランススプライシングによって毒性タンパク質の融合物を生じ、機能性毒性タンパク質を形成する。毒性タンパク質を２つの断片として発現させる場合、これら２つの断片は、２つの異なるプロモーター、特に２つの異なる組織特異的プロモーター又は２つの異なる発生学的に活性なプロモーターの制御下で転写させることができる。したがって、機能性毒性タンパク質の形成は、組織特異性が異なる２つのプロモーターに依存し得る。即ち、毒性タンパク質は、２つのプロモーターが活性な組織において活性型で形成される。このアプローチは、しばしば漏出性発現をする１つの組織特異的プロモーターによって達成されるよりも、機能性毒性タンパク質の発現に対してより厳格な制御を可能にする。更に、このアプローチは、新規発現パターン、例えば公知の組織特異的プロモーターでは達成できない発現パターンの達成を可能にする；２つの断片のために異なる組織特異的プロモーターを組み合わせることにより、可能な発現パターンの組み合わせの多様性を広げる。
【００２３】
本発明の方法は、大規模適用に完全な可能性を示す。大規模とは、多くの植物を同時に、例えば温室で適用することを意味する。最も好ましくは、大規模とは農場での適用を意味する。大規模適用では、第１親植物株の多くの植物と第２親植物株の多くの植物は、第１親植物株の植物と第２親植物株の植物との効率的な人工受粉を可能にするために、互いに近接して蒔かれるか又は植えられる。自家受粉を避けるために、例えば第１又は第２の親植物のいずれかの雄性不稔を用いる公知のハイブリッド種子産生方法を本発明の方法と組み合わせることができる。そのような方法の１例は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に記載のものである。
【００２４】
本特許出願の優先権証明書ＤＥ １０３ ２５ ８１４号は、本明細書中にその全体が援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の最良の形態及び詳細な説明
本発明の発明者らは、驚くべきことに、高率細胞分裂は、少なくとも双子葉植物の胚におけるウイルス複製を提供するのに単独では十分でなく、その上、胚発育期に依存し、通常、種子発育のより後期にシフトするすることを発見した。他の驚くべき発見は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスに基づくレプリコン前駆体がトランスジェニック種子（Ｆ１種子）における活性化によって複製する能力である。我々の知る限りでは、この現象について記載する先行技術ない。
【００２６】
本発明の方法では、植物の生殖と植物に基づいた目的産物の産生とは厳密に分離しており、産物の収率が大幅に向上する。目的産物を産生するために植物の発育及び生殖に通常必要とされる資源を、例えば、好ましくは特定の最も好適な発育期又は初期発芽期に、種子において目的産物を産生することによって利用することは、遺伝子汚染を制御することに役立つ。
【００２７】
発育期、より詳細には配偶子融合及び受精期を、種子生長期を産生期に変換する遺伝子スイッチとして用いることを提唱する。遺伝子供与の異なる成分を異なる親植物へ操作した。前記成分（部分的遺伝子供与物）は、親植物内では不活性であるが、ハイブリダイゼーション行程後に遺伝子供与を生じ、それにより目的産物の産生を誘発する。好ましい態様では、複製ＤＮＡ又はＲＮＡ（増幅工程）を産生に使用し、それにより胚及び／又は胚乳産生を支配する高収率産生システムが作製され、発育種子に目的産物の蓄積をもたらし、一方で、種子をその後の有性生殖ができないようにすることが好ましい。目的産物が蓄積し、発育種子、成熟種子、又は発芽種子から単離することができる。
【００２８】
本発明の基礎は、以下の驚くべき発見にある：
（ａ） ウイルスベクターは、種子発育のより後期及び種子発芽の初期に植物種子において複製可能であるが、特に双子葉植物では、種子形成の初期段階には全く又はほとんど不可能である；
（ｂ） 染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクター前駆体は、アクチベーター配列を提供する植物との交雑によって、ハイブリッド種子内で効率的に活性化されることができる。
【００２９】
植物発育の費用で染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたレプリコンを種子において活性化することはこれまでに示されていない。これは本発明の方法を厳重に制御することを可能にし、導入遺伝子サイレンシングを誘発するか又は種子発育を極初期に妨げ得る漏出性の複製を妨げる。
【００３０】
Ｂｅａｎ Ｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス（ＢＧＭＶ）に基づいたレプリコンの設計は、実施例１に記載され、図２及び図３に示されている。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をレポーター遺伝子として有するベクターｐＩＣＨ４３００を用いて、ジェミニウイルスを複製するために胚のさまざまな発育期の能力を試験した。これらの実験の結果を図４に示す。照射した若いマメの胚の表面に可視化したウイルス複製の兆候はない（ＧＦＰ発現なし）が、多くの進行した発育後期の細胞に明瞭なＧＦＰ発現が検出されたことは明らかである（図４）。種子発芽のあいだにも効率的複製が起こる（図５）。コムギＤｗａｒｆウイルス（ＷＤＶ）に基づいたベクターの設計は実施例２に記載されている。図７は、一過性発現実験のためのＷＤＶベクターを概略的に示す。コムギ及びトウモロコシの種子を用いた実験結果を図８に示す。ＷＤＶベクターはコムギ及びトウモロコシの胚において効率的に複製するが、トウモロコシの胚乳ではより効率が低いことが明らかである。種子発育の望ましくない段階（極初期）での漏出性の複製は、種子生長及びこのアプローチの技術適用性を危うくするため、これらのデータは本発明の実行可能性を確立する上で重要である。また、部位特異的組換えによる複製行程を誘発するための種子特異的プロモーターの幅広い選択を可能にする。胚発育初期段階においてウイルスベクターをその部分の組換え介在反転によって活性化することは（図３及び図９）、レプリコン前駆体を複製適格期にし得るが、胚が発育のより進行した段階（「複製適格期」）に達するまで複製は起こらないことが好ましい。
【００３１】
プロモーターの選択はこの技術の効率に影響する。誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターを用いて、種子における高収率産生を誘発することができる。誘導性プロモーターは、誘導条件によって２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるもの、及び生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるもの。第１カテゴリーの例は、とりわけ熱誘導性プロモーター（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性プロモーター（ＵＳ０５８４７１０２号）、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号）、及びテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学的に誘導可能なシステムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的に誘導可能なシステムの総説としては：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、１４６−１５１）を参照されたい。しかしながら、本発明を実施する上で最も好適なプロモーターは種子特異的プロモーターである。
【００３２】
本発明の実施に有用であり得る種子特異的プロモーターには幅広い選択肢がある。そのようなプロモーターには、とりわけ、エンドウマメ レクチン（Ｐｓｌ１）遺伝子のプロモーター（ｄｅ Ｐａｔｅｒら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、５１５−５２３）、ＵＳＰと呼ばれるＶｉｃｉａ ｆａｂａ非貯蔵性種子タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、オーツムギ グロブリン遺伝子ａｓｇｌｏ５の胚乳特異的プロモーター（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６、２０３−２１０）、トウモロコシ Ｏ２遺伝子のプロモーター（Ｇａｌｌｕｓｃｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１５、３９１−４００）、後期胚形成において豊富な遺伝子（ｌｅａ）、具体的にはシロイヌナズナ胚のいたるところに発現するＡｔＥｍ６のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、β−ファセオリン及びβ−コングリシニンのプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６、４４７−４５８）、インゲンマメのａｒｃｅｌｉｎ−５遺伝子のプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎｓら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２０、１０９５−１１０４）、Ｄ−ホルデイン遺伝子プロモーター（Ｈｏｒｗａｔｈら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１９１４−１９１９）、オオムギ リポキシゲナーゼ１（Ｌｏｘ１）遺伝子のプロモーター（Ｒｏｕｓｔｅｒら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５．４３５−４４０）などが含まれる。
【００３３】
目的タンパク質の発現を駆動するために選択したプロモーターの適用性を予備的に評価するため、ｐＩＣ０１由来の構築体（図６）を用いた一過性発現実験に、ＧＵＳレポーター遺伝子を使用した。ここで、３４Ｓプロモーターは種子特異的プロモーターに置換されている。インテグラーゼ ＰｈｉＣ３１の発現を駆動するため、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びコメ アクチン１遺伝子の構成的プロモーター（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐＩＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）を含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した。他の部位特異的リコンビナーゼの多くは本発明に用いることができる。そのようなシステムの例としては、とりわけ、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−Ｌｏｘシステム（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２５、７２９−７３６）、サッカロミセス・セレビジエ由来のＦｌｐ−Ｆｒｔシステム（Ｂｒｏａｃｈら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２９、２２７−２３４）、チゴサッカロミセス・ｒｏｕｘｉｉ由来のＲ−ＲＳシステム（Ａｒａｋｉら、１９８５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８２、１９１−２０３）が挙げられる。
【００３４】
天然宿主及び非宿主植物種の胚におけるウイルスレプリコンに関する先行技術文献がある（Ｗａｎｇ＆Ｍａｕｌｅ、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６、７７７−７８７；Ｇｏｏｄｉｎｇら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８；Ｅｓｃａｌｅｒら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、３１８−３２５；Ｕｇａｋｉら、１９９１、１９、３７１−３７７）。細胞間移行及び全体移行などの宿主特異性を決定するウイルスレプリコンの特定の特性を犠牲にすれば、宿主範囲が著しく増加すると思われる。そのようなウイルスレプリコンは、種子細胞を含めた広範な植物種の細胞で効率的に複製することができると思われる。ここで、前記植物種はウイルスレプリコンに対する天然宿主ではない。そのような場合、ウイルスレプリコンの全体移行及び細胞間移行は影響を受けるが、複製能は影響を受けない。実際に、本発明の原理にしたがって、ウイルスに基づいたベクターを構築するために、さまざまな分類群に属するウイルスを用いることができる。これは、ＲＮＡ含有ウイルス及びＤＮＡ含有ウイルスの両方にあてはまる。それらの例を以下に示す（本明細書にわたり、それぞれの基準種名はそれが属する目、ファミリー及び属の名称によって先行される。目、ファミリー及び属の名称は、ＩＣＴＶに承認されている場合はイタリック体である。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（俗名）は標準体で示す。属又はファミリーについて正式命名ないウイルスが示されている）：
ＤＮＡウイルス：
環状ｄｓＤＮＡウイルス：ファミリー：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ、基準種：ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：カリフラワーモザイクウイルス、属“ＳｂＣＭＶ様ウイルス”、基準種：ダイズｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅウイルス、属“ＣｓＶＭＶ様ウイルス”、基準種：Ｃａｓｓａｖａ ｖｅｉｎ モザイクウイルス、属“ＲＴＢＶ様ウイルス”、基準種：コメｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ、属：“Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ様ウイルス”、基準種：Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス；
環状ｓｓＤＮＡウイルス：ファミリー：Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ（サブグループＩ ジェミニウイルス）、基準種：トウモロコシ ｓｔｒｅａｋウイルス、属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ（サブグループＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐウイルス、属：Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ（サブグループＩＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ｂｅａｎ ｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス；
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：ファミリー：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：アルファルファ モザイクウイルス、属：Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｓｔｒｅａｋウイルス、属：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｂｒｏｍｅモザイクウイルス、属：Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：キュウリモザイクウイルス；
ファミリー：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｂｅｅｔ ｙｅｌｌｏｗｓウイルス、属：Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ、基準種：レタス ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｙｅｌｌｏｗｓウイルス、ファミリー：Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｃｏｗｐｅａモザイクウイルス、属：Ｆａｂａｖｉｒｕｓ、基準種：ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｗｉｌｔ ウイルス １、属：Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｒｉｎｇｓｐｏｔウイルス；
ファミリー：Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ、基準種：ジャガイモウイルスＹ、属：Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｒｙｅｇｒａｓｓ モザイクウイルス、属：Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
ファミリー：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ、基準種：ｐａｒｓｎｉｐ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋウイルス、属：Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ、基準種：コメ ｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；ファミリー：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｒｉｎｇｓｐｏｔウイルス、属：Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：トウモロコシ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｎｅｃｒｏｓｉｓウイルス、属：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ、基準種：トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス、
Ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｓｓＲＮＡウイルス、属：Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ、基準種：リンゴｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｌａｔｅｎｔウイルス；属：Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｐｅａ ｅｎａｔｉｏｎ モザイクウイルス、
属：Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｓｏｉｌ−ｂｏｒｎｅ コムギ モザイクウイルス、属：Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆウイルス；
属：Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ、基準種：オオムギ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆウイルス；属：Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ、基準種：トウモロコシ ｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス；属：Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ、基準種：ジャガイモウイルス Ｘ；属：Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｒａｔｔｌｅウイルス、
属：Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス；属：Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｔｕｒｎｉｐ 黄斑モザイクウイルス；属：Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｒｏｔ ｍｏｔｔｌｅウイルス；Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｓＲＮＡウイルス：目：Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ、ファミリー：Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、基準種：レタス壊死性黄変病ウイルス、属：Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、基準種：ジャガイモ黄萎病ウイルス；
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｓＲＮＡウイルス：ファミリー：Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
ｄｓＲＮＡウイルス：ファミリー：Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｗｈｉｔｅ クローバー ｃｒｙｐｔｉｃウイルス１、属：Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｗｈｉｔｅ クローバー ｃｒｙｐｔｉｃウイルス２、ファミリー：Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ、基準種：Ｆｉｊｉ ｄｉｓｅａｓｅウイルス、属：Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｗｏｕｎｄ ｔｕｍｏｒウイルス、属：Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ、基準種：コメｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未命名ウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種：バナナ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐウイルス、種：ｃｏｃｏｎｕｔ ｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙウイルス、種：ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ クローバー ｓｔｕｎｔウイルス、
ゲノム：ｄｓＤＮＡ、種：キュウリ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｉｎｇウイルス；ゲノム：ｄｓＲＮＡ、種：タバコ矮化ウイルス、
ゲノム：ｓｓＲＮＡ、種：ＧａｒｌｉｃウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシ ｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅ モザイクウイルス、種：ｏｌｉｖｅ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ２、種：ｏｕｒｍｉａ メロンウイルス、種：Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス；
Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ及びＶｉｒｏｉｄｓ：Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ：ｓｓＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅウイルス：サブグループ２ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅウイルス、基準種：タバコｎｅｃｒｏｓｉｓ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ、
Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＲＮＡ、サブグループ２ Ｂ型ｍＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ、サブグループ３ Ｃ型線状ＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ、サブグループ４ Ｄ型環状ＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ、
Ｖｉｒｏｉｄｓ、基準種：ジャガイモｓｐｉｎｄｌｅ ｔｕｂｅｒ ｖｉｒｏｉｄ。
【００３５】
大部分は、植物ウイルス起源のベクターは、植物において自律複製可能なプラスミド（レプリコン）として本発明に用いられる。しかしながら、非ウイルス配列を用いるそのようなプラスミドの操作に必要な原理は公知である。例えば、植物細胞に由来する多くの推定複製起点が記載されている（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１６１−１６２；Ｈｅｒｎａｎｄｅｓら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、４１３−４２２；Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１７３−１８２；Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。高等植物ゲノム由来の自律複製配列（ＡＲＳ配列）は、酵母及び高等動物のＡＲＳ配列と共通した構造的特長及び配列的特徴を有することが示されている（Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。植物ＡＲＳ配列はサッカロミセス・セレビジエ中のプラスミドに自律複製能を付与可能である。酵母においてプラスミドの自律複製を促進可能なトウモロコシの核ＤＮＡ配列の研究により、トウモロコシゲノム内に２つのファミリーの高度反復配列を表すことが示された。それらの配列は特徴的なゲノムハイブリダイゼーションパターンを有する。典型的には、それぞれの１２〜１５ｋｂのゲノム断片上にＡＲＳ相同配列のコピーがたった１つ存在した（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：１６１−１６２）。植物起源のレプリコンの他の供給源は、植物において異種遺伝子の増幅及び発現を刺激することができる植物リボソームＤＮＡスペーサー配列である（Ｂｏｒｉｓｊｕｋら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１８、１３０３−１３０６）。高率増幅による所望の効果は、強力なプロモーターを用いることによっ達成することもできる。そのようなプロモーターは高コピー数の目的転写物を提供することができ、複製ベクターに類似の最終結果を生ずる。
【００３６】
したがって、本発明で意図するレプリコン又は前駆体ベクターは必ずしも植物ウイルスに由来する必要はない。植物ＤＮＡウイルスは、標的ＤＮＡの形質転換に特に有用なレプリコン（ベクター）を操作する容易な方法を提供するが、植物ＲＮＡウイルス又は非植物ウイルスであっても、全体的に又は部分的にこれに由来する配列で作製されるベクターは可能である。植物ウイルスに基づいたレプリコンは明らかに有益である。そのようなレプリコンは、複製に加えて、例えば細胞間移行及び長距離移行のための更なる有用な機能を提供することができる。更に、それらは、感染植物からウイルスを根絶するための公知の方法を用いることによって、しばしば植物細胞から帰納的により容易に除去することができる。
【００３７】
本発明では、ウイルスベクターの特定部分の部位特異的組換え（反転）によって活性化することができるウイルスレプリコンを用いることが好ましい（図３、図９及び図１１を参照されたい）。これらのレプリコンはＤＮＡウイルス（ＢＧＭＶ、ＷＤＶ）及びＲＮＡウイルス（ＴＭＶ）に基づくことができる。部位特異的組換えによるＤＮＡウイルスベクターの再構築は、ウイルスＤＮＡの複製開始に十分であることは図面から明らかである。ＴＭＶに基づくベクターの場合、ＤＮＡの再構築のみでは複製開始に通常十分でないため、状況が異なる。そのようなＲＮＡレプリコンの増幅を誘発するためには転写が必要とされる。転写を駆動する構成的プロモーター（図１１を参照されたい）は誘導性プロモーター又は種子特異的プロモーターに置換し得るため、こうした必要性は、ＲＮＡに基づいたアンプリコンの発現のために更なる制御工程の使用を可能にし、、増幅の空間的及び一時的制限方法を厳重に制御し、より柔軟性を与える。
【００３８】
発明を効率的に実施するには、可能な最高収率を提供する最良の可能な組み合わせを見出すために、それぞれのウイルスレプリコンのタイプについて種子特異的プロモーターの多くの異なる組み合わせを解析することが好ましい。
【００３９】
本発明の重要な要素は、ハイブリッド種子が子孫を作れないということである。即ち、例えば稔性植物への発育が不可能であることにより、種子は不稔であることが好ましい。多くの場合、ウイルスベクターの複製はこの所望の効果を提供し、したがって更なる種子の発育を損なうことが期待される。しかしながら、目的産物を提供するベクターの複製十分でない場合、所望の効果を達成するために追加の技術を適用することができる。実施例５には、ハイブリッド種子においてインテイン介在性トランススプライシングによってくみ立てられる細胞毒性遺伝子（バルナーゼ）の使用について記載されている。インテインが融合したバルナーゼ断片は異なる親植物中に局在し、異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下にあることができる。断片はともにハイブリダイゼーションによってもたらされ、インテイン介在性トランススプライシングの結果として細胞毒性産物を形成することができる。異なるが部分的に重複する発現パターンを有する異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を、バルナーゼ断片の発現をともに駆動する同一の組織特異的プロモーターを用いるよりも、必要とする組織に正確な方法で制限することができる。シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）とシロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を実施例５で使用し、２つのバルナーゼ断片の発現を駆動させた（図１５を参照されたい）。これらのプロモーターは、活性が発芽種子の頂端分裂組織に重複するため、好適なバルナーゼ活性パターンを提供する。多くの他の発生学的に調節されたプロモーター及び組織特異的プロモーターを本態様の実施に用いることができるため、本発明はこれら２つのプロモーターの使用に限定されない。本態様に有用なプロモーターの例としては、光合成の活性な組織で発現されるシロイヌナズナＨＢＰ−１ａ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｋａｍｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４８、５７３−５８２）、種子特異的ｎａｐｉｎ遺伝子プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１０１９−１０２７）、発生学的に調節されたｒｂｃＳ遺伝子のプロモーター（Ｍａｎｚａｒａら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３、１３０５−１３１６）、などが挙げられる。
【００４０】
実施例では、主に植物細胞におけるアグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ送達を使用し、Ｔ−ＤＮＡは第１及び／又は第２の部分的遺伝子供与物をベクターとして含有する。植物細胞にベクターを送達するために、微粒子銃、エレクトロポーレーション又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換による細胞へのベクターの直接導入のような異なる方法を用いてもよい。アグロバクテリウム介在植物形質転換が好ましい。したがって、アグロバクテリウムによって運搬されるＴｉ−プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、粒子又は微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）などのさまざまな好適な技術によってＤＮＡで植物細胞を形質転換することができる。原理上、例えばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６号；ＷＯ０９４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポーレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）などの他の植物形質転換法を用いることもできる。形質転換法の選択は、形質転換すべき植物種に依存する。例えば、単子葉植物の形質転換には微粒子銃が好ましく、双子葉植物には通常アグロバクテリウム介在形質転換がより良い結果与えることができる。
【００４１】
本発明は、高等多細胞植物を用いて実施することが好ましい。本発明での使用に好ましい植物には、農学的及び園芸学的に重要な種に関連した植物種が含まれる。本発明に使用するための一般的な作物には、アルファルファ、オオ麦、インゲン豆、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズ豆、ルピナス、キビ、オート麦、エンドウ豆、落花生、米、ライ麦、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、大豆、ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｒｉｔｉｃａｌｅ、クズイモ、ハッショウ豆、ソラ豆、コムギ、フジ、及びｎｕｔ ｐｌａｎｔｓが含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、限定されるものではないが、イネ科、キク科、ナス科及びバラ科の代表的なものが挙げられる。
【００４２】
本発明での使用に更に好ましい種は、以下の属に由来する植物である：シロイヌナズナ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ、カンキツ、Ｃｏｆｆｅａ、ジュズダマ、キュウリ、Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、Ｌｅｎｓ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、Ｎｅｍｅｓｉａ、タバコ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、Ｐｈｌｅｕｍ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、セネシオ、セタリア、Ｓｉｎａｐｉｓ、ナス、ソルガム、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、カカオ、ジャジクソウ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ、及びＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ並びにその他多くのもの。
【００４３】
好ましいのは、ハイブリッド種子産生システムが存在する植物である。第１及び第２の親植物のハイブリッドである種子を高率で産生するためには、これらのシステムを、本発明とともに使用することが好ましい。最も好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、チカラシバ、ダイズ、ナタネ種子、カノーラ、タバコ、及びコメである。
【００４４】
本発明を用いてセンス方向又はアンチセンス方向に発現させることができる目的タンパク質、又はその断片には以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ｐｏｌｙｆｒｕｃｔａｎスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ｈｅｒｂｉｃｏｌａ リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ｋｅｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、アセトアセチル ＣｏＡ レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、アシルキャリアータンパク質、ｎａｐｉｎ、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、ｔｒａｉｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ 光合成 ｏｒ 植物細胞のプラスチド機能、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、ｃｈｌｏｒｏｍｕｃｏｎａｔｅ シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、ウンベルラリア ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｃ１２：０ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、６−不飽和化酵素、植物細胞における脂肪酸のｐｅｒｏｘｙｓｏｍａｌ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎにおいて酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインから成るタンパク質融合物、オレオシンタンパク質と融合タンパク質を脂質相に標的化可能な目的タンパク質との翻訳融合物、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、プラスチドの内側エンベロープ膜にある成熟リン酸輸送体タンパク質のアミノ末端疎水性領域と前記膜に標的化された目的タンパク質との融合物など。
【００４５】
ヒト又は動物のいかなるタンパク質も、特に本発明のシステムを用いたハイブリッド種子において発現させることができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、以下のタンパク質（薬用タンパク質）が挙げられる：免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカイン及びその受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、線維素溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、並びに上記タンパク質の融合体、変異体型及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質。
【００４６】
本発明の方法は、トランスジェニックコード配列の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を抑制するために、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質又はその機能保存的変異体若しくは断片をコードする遺伝子を植物において発現させることを更に含むことができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質遺伝子又はその機能保存的変異体若しくは断片を、トランスジェニックコード配列を有する同一ベクター上で又は余分のベクター上で植物に提供することができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質は、ウイルス又は植物起源であることが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質の例は、ジャガイモウイルスＸ ｐ２５タンパク質、アフリカ キャッサバモザイクウイルス ＡＣ２タンパク質、コメ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅウイルスＰ１タンパク質、トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス １９Ｋタンパク質、ｒｇｓ ＣＡＭ、又はこれらのタンパク質のうちの１つの機能保存的変異体若しくは断片である。機能保存的変異体又は断片は、上記タンパク質の１つに対し、７５％の配列同一性を有することが好ましく、好ましくは少なくとも７５％同一である。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質及びその使用に関する詳細は、ＷＯ０１３８５１２号に見出すことができる。
【実施例１】
【００４７】
ＢＧＭＶベクター
ＧＦＰを有するジェミニウイルス複製ベクターのクローニング：
ｐＵＣ１９ ＤＮＡを、ｄｎａａｐｒ７プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇｔ ｃｔａ ｇａｃ ｔｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ｔｔｔ ｔａｃ ａａｃ）及びｄｎａａｐｒ８プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇａ ａｃａ ａｔｔ ｇｃｔ ｃｇａ ｇｇｃ ｇｔａ ａｔｃ ａｔｇ ｇｔｃ ａ）を用いて増幅し、増幅断片をＰｓｔＩで消化し、再連結した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１１４４は、ｐＵＣ１９に類似するが、ポリリンカーがＸｈｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＰｓｔＩで置換されている。ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したインゲンｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス（ＢＧＭＶ）単離物ＤＳＭＺ ＰＶ−００９４を感染させたインゲンマメ組織から、ＤＮＡを抽出した。ＢＧＭＶ共通領域を包含するゲノムの断片（ＣＲ；ＢＧＭＶの複製起点を含有）を、ｄｎａａｐｒ３プライマー（ｇｇｇ ａａｔ ｔｃａ ｃｔａ ｇｔａ ａａｇ ａｔｃ ｔｇｃ ｃｇｔ ｃｇａ ｃｔｔ ｇｇａ ａｔｔ ｇ）及びｄｎａａｐｒ４プライマー（ｃａａ ｔｇｃ ａｔｃ ａｔｇ ｇｃｇ ｃａｔ ｃａｃ ｇｃｔ ｔａｇ ｇ）を用いてＰＣＲで増幅し、ＭｆｅＩ及びＰｓｔＩで消化したｐＩＣＨ１１４４中にＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１１５６を得る。ｐＩＣＨ１１５６中のＢＧＭＶ挿入物を配列決定した。他の２つのＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノム断片を、ＢＧＭＶを感染させたインゲンマメＤＮＡから、ｄｎａａｐｒ９プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａａｇ ｇａｔ ｃｃｔ ｃｔｇ ｇａｃ ｔｔａ ｃａｃ ｇｔｇ ｇａａ ｔｇｇ）／ｄｎａａｐｒ１３プライマー（ｃｇｃ ｔｃｇ ａｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ａｃｔ ｔｇｇ ａａｔ ｔｇｔ ｃ）ペア、及びｄｎａａｐｒ５プライマー（ｇａａ ｇａｔ ｃｔｇ ｃａａ ｇａｇ ｇａｇ ｇｔｃ ａｇｃ ａ）／ｄｎａａｐｒ１０プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａｔｃ ｔａｔ ｔｔｃ ｔａｔ ｇａｔ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｃ）ペアを用いて増幅させた。これらの断片の合計は、コートタンパク質のない完全長ＢＧＭＶゲノムになる。これらの断片をそれぞれＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ及びＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｐＩＣＨ１１５６に、３通りの連結法でクローニングした。得られたプラスミドは、重複したＢＧＭＶ ＤＮＡＡ共通領域に隣接するコートタンパク質遺伝子のない１つの完全長ＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノムを含有する。試験のために３つのクローン：ｐＩＣＨ１６６３、１６６４及び１６６７を保存した。コートタンパク質遺伝子がＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを含有するマルチクローニング部位に置換されている。ｐＩＣ０１１（ｐＵＣ１８内にＨｂｔプロモーター−合成ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーター）由来の合成ＧＦＰ（ＳＧＦＰ）コード配列を、ｐＩＣＨ１６６３、ｐＩＣＨ１６６４及びｐＩＣＨ１６６７のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位にＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７を得る。ＧＦＰをコートタンパク質プロモーターの制御下に置く。クローンｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７の機能性に関して試験するために、ベンサミアナタバコ及びインゲンマメの切除葉に、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ粒子送達システム１０００／ＨＥ（バイオラッド）を用いて照射した。翌日、３つの構築体全てに関し、両方の種の葉においてＧＦＰ発現上皮細胞が検出されるであろう。
【００４８】
バイナリーベクターでのクローニング
ｐＩＣＨ１６９４のＸｈｏＩ−ＮａｒＩ断片を、ＸｈｏＩ及びＣｌａＩで消化したｐＩＣＢＶ１１にサブクローニングすることによって、ｐＩＣＨ１６９４のプロレプリコン部分を含有するバイナリーベクターを作製した。得られたクローンｐＩＣＨ４３００（図２）は、ＢＧＭＶコートタンパク質プロモーターの制御下にあるＧＦＰ遺伝子、及び重複ＣＲ間にＡＩ１／２／３遺伝子を含有する。
【００４９】
「反転した」ジェミニウイルスプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ７３００はｐＩＣＨ４３００に類似するが、いくつかの制限酵素部位（ＳａｌＩ、ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＢｇｌＩＩ）が、制限部位が重複する変異プライマーを用いたＰＣＲで除去されている。レプリカーゼの部分と共通領域うちの１つを含有する断片の転置によって複製不可能なクローンｐＩＣＨ１５００（図３）を作製するための開始点としてｐＩＣＨ７３００を用いた。ＡｔｔＰ及びＡｔｔＢ組換え部位を転置の先端に置き、インテグラーゼを提供することによって転置領域の反転を可能にし、それにより機能性ベクターを得る。ＡｔｔＢ及びＡｔｔＢ部位は人工イントロン配列に隣接しており、インテグラーゼ介在性組換えによって生ずるＡｔｔＲ配列の、Ａｌ１転写物からのスプライシングを可能にする。
【００５０】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適格性を試験する：
ｐＩＣＨ４３００プラスミドＤＮＡを一連の植物組織に照射した。インゲンマメの葉、成熟種子、水分補給したマメの子葉及び発芽苗、並びに未成熟胚において明るい蛍光細胞が検出されるであろう。ＧＦＰ蛍光によってアッセイしたように、胚発育期の全てにおいてジェミニウイルスの複製を起こしやすいわけではない。長さ４〜５ｍｍまでの子葉がある小さな白い胚にはＧＦＰ発現細胞がなかった。逆に、より緑色したより大きな子葉はジェミニウイルスの複製に非常に適していた。
【００５１】
タバコ、ベンサミアナタバコ、シロイヌナズナ、Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ ｖｉｏｌａｃｅｓ及びマングビーンを含めた他の種も、少なくとも葉において、ジェミニウイルスの複製を起こしやすかった。
【００５２】
ＰｈｉＣ３１インテグラーゼクローンのクローニング
ｐＩＣＰ１０１０は、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（プロモーター、第１エクソン、第１イントロン、及びアクチン２遺伝子の第１エクソンの１０ヌクレオチドを含有する１３４４ヌクレオチド断片）に融合したストレプトミセスファージＣ３１インテグラーゼ（ｆｒｏｍ Ｄａｖｉｄ Ｏｗ、植物遺伝子発現センター、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ−Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ａｌｂａｎｙ、ＣＡ９４７１０、ＵＳＡ）を含有するバイナリーベクターである。核へのインテグラーゼの輸送を増加させるために、ＳＶ４０ Ｔ抗原由来の核局在シグナル（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｎｄｒｅａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０、２２９９−２３０６）を、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼのＣ末端に融合させた。ｃ３１ｐｒ１プライマー（ｇｃａ ｃｇｃ ｃｇａ ａｇｇ ｃｇａ ｃｇａ ａｇ）及びＮＬＳ配列（３１ｎｌｓ１：ｇｇａ ｔｃｃ ｔａａ ａｃｃ ｔｔｃ ｃｔｃ ｔｔｃ ｔｔｃ ｔｔａ ｇｇｃ ｇｃｃ ｇｃｔ ａｃｇ ｔｃｔ ｔｃｃ ｇｔｇ）を含有する伸長部を含有するＰＣＲプライマーを用いたｐＩＣＰ１０１０からのＰＣＲ増幅によってＮＬＳ配列をインテグラーゼ配列に付加し、ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＰ１０１０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１０８８１（図６）を得る。異なるプロモーターを容易にサブクローニングするために、ｐＩＣＨ１０８８１からインテグラーゼ及びＮｏｓターミネーターをＰｓｔＩ／ＡｐａＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１へサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１３９０１（示していない）を得た。このベクターは、Ｎｏｓプロモーター−ＮｐｔＩＩコード配列−Ｎｏｓターミネーター 選択カセット及びポリリンカーＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ−ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。適当な種のゲノムＤＮＡから、遺伝子特異的プライマーを用いていくつかのプロモーターを増幅し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１にクローニングした。前記プロモーターを更にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣ０１にサブクローニングし（図６）、発育種子の微粒子銃を用いてＧＵＳレポーター遺伝子との融合物としてそれらの活性について試験した（示していない）。
【００５３】
インテグラーゼＰｈｉＣ３１の発現を駆動するために、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びコメ アクチン１遺伝子の構成的プロモーターを含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐIＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐIＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）。
【００５４】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ベンサミアナタバコの葉ディスクを、構築体ｐIＣＨ１５００、ｐＩＣＨ４５５０及びｐＩＣＨ４５４０（インテグラーゼ）で形質転換し、各構築体について独立した形質転換体を得た。ｐＩＣＨ１５００の１０個の形質転換体を、各インテグラーゼ構築体の少なくとも５つの形質転換体と交雑させた。未成熟発育種子を切開し、ＧＦＰ蛍光を顕微鏡を用いて青色光下で観察した。
【実施例２】
【００５５】
ＷＤＶベクター
ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したコムギｄｗａｒｆウイルス（ＷＤＶ）を感染させたコムギ葉サンプルからＤＮＡを抽出した。互いに逆向きでゲノムのユニークＥｃｏＲＩ部位が重複するプライマーを用いて、ＷＤＶの完全長ゲノム（ｃａ．２．８ｋｂ）をＰＣＲで増幅させた：
ＦｗｄｖＥ１ ａＧＡＡＴＴＣａｃａｃｃｇａｔｇｇｇｃｔｃ
ＲｅｗｄｖＥ１ ｔＧＡＡＴＴＣｔｇｃａｃａｃｔｃｃｃａｃｇ
増幅断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にクローニングした。２つのクローンについて塩基配列を決定した。ＢＬＡＳＴ解析は、増幅配列が、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに存在する完全に配列決定した４つのＷＤＶ株（ＧＥＷＤＶＸＸ、ＷＤＶＧＮＳ、ＷＤＷ３１１０３１、ＮＣ ００３３２６）とは著しく異なるが、ハンガリーで単離された部分的に配列決定した（１．２ｋｂ）ウイルス（ＡＪ３１１０３８；Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４７（１）：２０５−２１６、２００２）とは密接に適合することを示した。
【００５６】
コートタンパク質遺伝子を除いた完全長ゲノムを増幅するために、得られた配列データに基づいて２つのプライマーを設計した（ｔｔＣ ＣＡＴ Ｇｇａ ｇｔｔ ａｃｃ ｔｃｇ ｇｇ ａｇｔ ｃｃｔ ｔｇｔ ｔｇ 及び ｔｔＧ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ Ｇｃａ ａａａ ｔａｇ ｔａｔ ｔｔｔ ａｔｔ ｃａｔ ｃｔｃ ａｔｇ ｔｃ）。上記感染葉ＤＮＡからＰＣＲを行った。
【００５７】
ＰＣＲ増幅産物を、ＳｐｈＩ及びＮｃｏＩで消化したＧＦＰの変異型（Ｓ６５ＴＧＦＰ）を含有するｐＵＣ１９ベクターにＳｐｈＩ−ＮｃｏＩ断片としてクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１０６８０は、ＣＰをＧＦＰで置換した唯一のＷＤＶゲノムを含有する（図１３）。
【００５８】
重複ＬＩＲを有する完全長ゲノムを２工程でバイナリーベクターにクローニングした。第１に、ｐＩＣＨ１０６８０のＢａｍＨＩ−ＡｐａI断片を、ＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで消化したバイナリーベクターにサブクローニングした。この中間体クローンは、ＣＰのかわりにＧＦＰを有する部分ＷＤＶゲノムを含有するが、ＰｓｐｏＭＩ及びＰｃｉＩで消化し（Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化）、ｐIＣＨ１０６８０のＳｍａI−ＮｏｔＩ断片をクローニングする第２工程に用いた。得られたクローンｐIＣＨ１０８３０（図７）は、ＣＰをＧＦＰで置換した完全長ＷＤＶゲノムを含有し、重複ＬＩＲに隣接し、ａｌｌｏｗｉｎｇ ＷＤＶ−ＧＦＰレプリコンの切り出し及び増幅を可能にする。
【００５９】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適合性を試験する：
ｐＩＣＨ１０８３０をコムギ及びトウモロコシの発育胚に照射した。胚に強力なＧＦＰ蛍光を発する細胞が観察されたが、胚乳でも検出されるであろう（図８）。
【００６０】
「反転した」ＷＤＶプロベクターのクローニング
ＢＧＭＶベクターに関して記載したのと同一のストラテジーを用いて、「反転した」ＷＤＶベクターｐＩＣＨ１４５２０を作製した（図９）。このクローンが複製開始可能になるのは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼに曝露して反転させた後のみである。このクローンの機能性を試験するため、トウモロコシの胚に単独で、又はインテグラーゼクローンｐＩＣＨ１４５３０若しくはｐＩＣＨ１４５６０とともに照射した。ｐＩＣＨ１４５２０をインテグラーゼとともに照射したときのみＧＦＰ蛍光細胞が検出されるであろう。
【００６１】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ｐＩＣＨ１４５２０及びインテグラーゼクローンをトウモロコシに形質転換した。
両方の構築体から選択した形質転換体を両方向で交雑させ、さまざまな発育期で未成熟種子を切開し、顕微鏡又は携帯ＵＶランプを用いて青色光下で観察した。
【実施例３】
【００６２】
ＣＲ−ＴＭＶベクター
ＧＦＰを有するｃｒ−ＴＭＶ複製ベクターのクローニング：
ｐＩＣＨ４３５１（図１０）はｃｒ−ＴＭＶ、アブラナ感染トバモウイルス（Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５０、５−８）に基づいたウイルスベクターである。ｐＩＣＨ４３５１は、Ｃｒ−ＴＭＶの５’非翻訳配列、続いてＲｄＲｐ及びＭＰを含有し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド１〜５６２９、ＭＰの最後の１６アミノ酸を、ＭＰ機能を喪失することなく切断し、Ｚ２９３７０中の５６０５位のＴをＣに変異させた）、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（７８７ヌクレオチド断片、転写開始の５’側、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ４１９９８、Ａｎら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０、１０７−１２１）に融合している。ＭＰの後にＬｏｘＰ部位が続く。この部位は、この構築体の使用に関して機能的に意味がなく、それを構築するために用いたプラスミドにも存在しているために存在している。ＬｏｘＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ由来のＩＲＥＳ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド４８０４〜４８７３）、及びＧＦＰ ＯＲＦが続く。ＧＦＰ発現を増加させるための翻訳エンハンサーとしてＩｒｅｓをこの位置にクローニングした。ＧＦＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド６０８３〜６３１２）、アグロバクテリウム Ｎｏｓターミネーターが続く。この構築体を、植物でカナマイシン選択するためのカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターｐＩＣＢＶ１０にクローニングする（Ｎｏｓプロモーター−ＮＰＴＩＩコード配列ｓ−Ｎｏｓターミネーター）。この構築体では、ＧＦＰはＭＰの末端に局在するＣＰサブゲノムプロモーターから発現される。照射又はａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによる核への送達後、核においてアクチン２プロモーターから作製された第１転写物は、複製が起こる細胞質へ輸送される。
【００６３】
「反転した」ｃｒ−ＴＭＶプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ１０９２１はｐＩＣＨ４３５１から作製したウイルスプロベクターである（図１１）。これは、ＩｒｅｓからＮｏｓターミネーターまで伸びたＤＮＡ断片が逆方向に反転して構築体を複製不可能にしているという事実によってｐＩＣＨ４３５１とは異なっている。この断片の反転を可能にするために、ＰｈｉＣ３１のＡｔｔＰ部位（ｇｔａ ｇｔｇ ｃｃｃ ｃａａ ｃｔｇ ｇｇｇ ｔａａ ｃｃｔ ｔｔｇ ａｇｔ ｔｃｔ ｃｔｃ ａｇｔ ｔｇｇ ｇｇｇ ｃｇｔ ａｇａ）及びＡｔｔＢ部位（ｔｃｇ ａａｇ ｃｃｇ ｃｇｇ ｔｇｃ ｇｇｇ ｔｇｃ ｃａｇ ｇｇｃ ｇｔｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｇｇｃ ｔｃｃ ｃｃｇ ｇｇｃ ｇｃｇ ｔａｃ ｔｃｃ ａｃｃ ｔｃａ ｃｃｃ ａｔｃ）を転置の末端にで位置付ける。
【００６４】
転置部分の反転が機能性ベクターをもたらすか同化を試験するため、ｐＩＣＨ１０９２１でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉のａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎに用いた。ｐＩＣＨ１０９２１を単独で浸潤させたときはＧＦＰスポットは検出されなかったが、ｐＩＣＨ１０９２１をｐＩＣＨ１０８８１（インテグラーゼ発現ベクターを含有）で形質転換したアグロバクテリウムとともに共浸潤させたときは非常に多くのＧＦＰ複製フォーカスが見られるであろう。
【００６５】
安定な形質転換及びハイブリダイゼーション実験
５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを形質転換体の選択に用いて、ｐＩＣＨ１０９２１、ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０及びｐｌＣＨ１４５５０で、ベンサミアナタバコを葉ディスク形質転換によって個別に形質転換した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）。両構築体から選択した形質転換体を両方向で交雑させ、未成熟種子を切開し、顕微鏡を用いて青色光下で観察した。ハイブリッド種子においてＧＦＰ発現が検出された。
【実施例４】
【００６６】
トランスジェニックトウモロコシ植物の作製
トウモロコシのユビキチンプロモーターの制御下で、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）を単子葉植物形質転換のための選択可能マーカーとして用いた（図１２）。選択薬剤としてハイグロマイシンＢを２５〜１００ｍｇ／ｌの濃度で適用した。
【００６７】
トランスジェニックトウモロコシ植物を作製するために以下の方法を用いた：
Ａ１８８株、Ｈｉｌｌ株などの成熟及び未成熟胚からカルス培養を誘導した。培地はＣｈｕ（Ｎ６）塩及びビタミンに基づいている（Ｃｈｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ、１８（５）：６５９−６８，１９７５）。
カルス誘導培地及び繁殖培地には３０ｇ／ｌのショ糖、６００ｍｇ／ｌのＬ−プロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ及び０．３％ゲルライトが添加されている。
プレ再生培地は使用しなかった。再生培地は、Ｎ６塩及びビタミン、３０ｇ／ｌのショ糖、２ｍｇ／ｌのゼアチン及び０．０５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含有する。再生培地にはチオ硫酸銀が０．０１〜０．０６ｍＭの濃度で含まれている。
【００６８】
微粒子銃
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム（バイオラッド）を用いて微粒子銃を実施した。細胞を、９００〜１１００ｐｓｉで、マクロキャリアー発射点から停止スクリーンまで１５ｍｍの距離で、及び停止スクリーンから標的組織まで６０ｍｍの距離で照射した。破裂ディスクとマクロキャリアーの発射点との距離は１２ｍｍであった。細胞を、４時間の浸透圧前処理後に照射した。
【００６９】
ＤＮＡ−金コーティングを、バイオラッドのオリジナルプロトコール（Ｓａｎｆｏｒｄら、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｗｕ編、２１７、４８３−５０９）にしたがって以下のように行なった：２５μｌの金粉末（０．６、１．０ｍｍ）を５０％グリセロール（６０ｍｇ／ｍｌ）中で、０．２μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ５μｌ、２５μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）及び１０μｌの０．１Ｍ スペルミジンと混合した。混合物を２分間ボルテックスし、続いて室温で３０分間インキュベーションし、遠心（２０００ｒｐｍ、１分）し、７０％及び９９．５％のエタノールで洗浄した。最後に、沈殿を３０μｌの９９．５％エタノール（６μｌ／ショット）に再懸濁した。
【００７０】
新規のＤＮＡ−金コーティング法（ＰＥＧ／Ｍｇ）を以下のように行った：２５μｌの金懸濁液（５０％グリセロル中に６０ｍｇ／ｍｌ）をエッペンドルフチューブ中で５μｌのプラスミドＤＮＡと混合し、次に３０μｌの４０％ＰＥＧ（１．０Ｍ ＭｇＣｌ２中）を添加する。混合物を２分間ボルテックスし、室温で３０分間、混合せずにインキュベートした。遠心（２０００ｒｐｍ、１分）後、沈殿を１ｍｌの７０％エタノールで２回、１ｍｌの９９．５％エタノールで１回洗浄し、最後に３０μｌの９９．５％エタノール中に分散させた。ＤＮＡ−金 エタノール懸濁液のアリコート（６μｌ）をマクロキャリアーディスクにロードし、５〜１０分間乾燥した。
【００７１】
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドで大腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換し、ＬＢ培地中でｍａｘｉ ｐｒｅｐを増殖させ、キアゲンキットを用いてＤＮＡを精製した。
【００７２】
選択
安定な形質転換実験のために、処置細胞を有するフィルターを、ろ過滅菌した適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ））、３％ショ糖を有する固形ＭＳ２培地上に移して遮光した。７日毎に材料を新鮮な選択培地に移した。プレートを暗所保存し、およそ６週間後、植物材料を再生培地及び適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ）の入ったペトリ皿に移した。ペトリ皿を強い光度でインキュベートした。日照時間１６時間。
【実施例５】
【００７３】
ハイブリッド種子の発育を制御するためのバルナーゼに基づいたシステム
バルナーゼ遺伝子を、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３ ＤｎａＢ インテインを用いて分割した。適当な制限部位に隣接したバルナーゼのＮ端部分及びＣ端部分のＤＮＡ断片を営利なＤＮＡ合成会社で化学的に合成した。
【００７４】
Ｎ末端の配列は以下の通りである：
５’ｇｃａａｔｃｇａｔｇ ｇｃａｃａｇｇｔｔａ ｔｃａａｃａｃｇｔｔ ｔｇａｃｇｇｇｇｔｔ ｇｃｇｇａｔｔａｔｃ ｔｔｃａｇａｃａｔａ ｔｃａｔａａｇｃｔａ ｃｃｔｇａｔａａｔｔ ａｃａｔｔａｃａａａ ａｔｃａｇａａｇｃａ ｃａａｇｃｃｃｔｃｇ ｇｃｔｇｇｇａｃｇｔ ｃｃｇｃ ３’。
【００７５】
Ｃ末端の配列は以下の通りである：
５’ｃｇｃｃａｔｇｇｇｇ ｔｇｇｃａｔｃａａａ ａｇｇｇａａｃｃｔｔ ｇｃａｇａｃｇｔｃｇ ｃｔｃｃｇｇｇｇａａ ａａｇｃａｔｃｇｇｃ ｇｇａｇａｃａｔｃｔ ｔｃｔｃａａａｃａｇ ｇｇａａｇｇｃａａａ ｃｔｃｃｃｇｇｇｃａ ａａａｇｃｇｇａｃｇ ａａｃａｔｇｇｃｇｔ ｇａａｇｃｇｇａｔａ ｔｔａａｃｔａｔａｃ ａｔｃａｇｇｃｔｔｃ ａｇａａａｔｔｃａｇ ａｃｃｇｇａｔｔｃｔ ｔｔａｃｔｃａａｇｃ ｇａｃｔｇｇｃｔｇａ ｔｔｔａｃａａａａｃ ａａｃｇｇａｃｃａｔ ｔａｔｃａｇａｃｃｔ ｔｔａｃａａａａａｔ ｃａｇａｔａａｇｇａ ｔｃｃｇｃ ３’。
【００７６】
バルナーゼのＮ末端をＤｎａＢインテインのＮ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｎ断片をＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＤＮＡから、ＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ１プライマー（５’ｇｔＡＡＧＣＴＴＧＡ ＣＧＴｃａｇａｇａｇ ａｇｔｇｇａｔｇｃａ ｔｃａｇｔｇｇａｇａ ｔａｇ３’）及びＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ２プライマー（５’ｃａＣＴＧＣＡＧｃｔ ａｔａａｔｔｇｔａａ ａｇａｇｇａｇｃｔｔ ｔｃｔａｇ３’）を用いて増幅した。バルナーゼ断片（ＣｌａＩ／ＡａｔＩＩ断片）及びインテイン断片（ＡａｔＩＩ／ＰｓｔＩ断片）をアイコン・ジェネティクス バイナリーベクターにクローングし、ｐＩＣＨ１２７９４クローンを得た（図１４）。
【００７７】
バルナーゼのＣ末端をＤｎａＢインテインのＣ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｃ断片を、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＤＮＡから、ｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ１プライマー（ｇｔ ＧＡＧ ＣＴＣ Ｇ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＡ ｇｃｃ ｃａｇ ａａａ ｔａｇ ａａａ ａｇｔ ｔｇｔ ｃｔｃ）及びｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ２プライマー（ｔｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ｔｃｔ ｔｇｃ ｔｃｔ ｔｃａ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｇ ａｃａ ａｔｇ ａｔｇ ｔｃａ ｔ）を用いて増幅した。インテイン断片（ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ断片）及びバルナーゼ断片（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片）をアイコン・ジェネティクスバイナリーベクターにクローニングし、クローンｐＩＣＨ１２８２０を得た（図１４）。
【００７８】
ベンサミアナタバコの葉のａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによって、Ｎ端及びＣ端 バルナーゼ−インテイン融合クローンの機能性を試験した。予想通り、両構築体をともに浸潤させた葉領域は壊死したが、いずれかの構築体を単独で浸潤させた領域は健常のままであった。
【００７９】
ＰＩＣＨ１２７９４及びｐＩＣＨ１２８２０をｐＩＣＢＶ１６にサブクローニングした。これは植物形質転換体をカナマイシンで選択するためのＮｐｔＩＩカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。得られたプラスミドはｐＩＣＨ１４７８０及びｐｌＣＨ１４７７０である（図１４）。
【００８０】
シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）を、ＳＴＭｆｗｄプライマー（ｃｇ ｃａａｔｔｇ ｇｔｇｇｃａａｇａｇｇｔｃｔａｃｃａｔｃｔ）及びＳＴＭｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃａｃｔａｇｔａｔｔ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＭｆｅＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０及びｐＩＣＨ１４７８０（ＥｃｏＲＩ ＳａｃＩで消化）にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００を得た（図１５）。２つのプラスミドのプロモーター領域を配列決定した。ｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００は、ＳＴＭプロモーターの制御下にあるＣ末端及びＮ末端バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８１】
シロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を、ＡＴＨＢ５Ｆｗｄプライマー（ｃｇ ｇａａｔｔ ｃｃａｇｃｔｃａｔｃａａｃｃａａａｃｔｃｔｇｔ）及びＡＴＨＢ５ｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｔｇｃｔｃｔｇｔｇｔｃｔａｇａｃｔａｔｃｃ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４８１０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０から増幅した断片を配列決定し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７８０にサブクローニングし、ｐＩＣＨ１４８２０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０及びｐＩＣＨ１４８２０は、発芽特異的プロモーターの制御下にある５’及び３’バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８２】
４つのプラスミド全てをアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に導入し、シロイヌナズナの形質転換に用いた。全てのトランスジェニック植物は表現型が正常である。トランスジェニック植物を、同一のプロモーター又は異なるプロモーターを有する相補的バルナーゼ構築体を含有する植物と交雑させた。異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を用いたプロモーターの重複領域まで制限することが可能である。Ｆ１種子を乾燥させて種を蒔いた後に収穫した。これらは発芽したが、成長点の欠失により拘束された。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ａ−本発明の一般的原理。第１親植物株Ａを第２親植物株ＢとハイブリダイズさせてＦ１種子を産生する。親株の種子は目的産物を産生しないが、生育可能である。Ｆ１種子では遺伝子供与が生じ、目的産物の産生を可能にする。この場合はその蛍光によって観察されるＧＦＰである（写真中の光の点）。場合により目的産物をコードするウイルスベクターの強力な複製と組み合わせた、目的産物の強力な発現の結果、Ｆ１種子は生育不可能である。
【図１Ｂ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ｂ−植物発育期（フレーム内）。精細胞と雌性配偶体とのハイブリダイゼーション後、目的産物（左の囲み）を発現する種子（Ｆ１種子）が産生される。Ｆ１種子からの植物の発育はブロックされている。右の囲みは、Ｆ１種子が稔性植物に生長できないことを示す。
【図２】図２は、プラスミドｐＩＣＨ４３００のＴ−ＤＮＡ領域、及びハイブリッド種子におけるＢＧＭＶ（Ｂｅａｎ Ｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。
【図３】図３は、プラスミドｐＩＣＨ１５００のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼ活性の存在下におけるＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。ｐＩＣＨ１５００の遺伝要素は、第１の部分的遺伝子供与によって種子に提供することができる。インテグラーゼＰｈｉＣ３１はコードされ、第２の部分的遺伝子供与によって種子に提供されることができる。
【図４】図４は、プラスミドｐＩＣＨ５１８４を照射した、インゲンマメの未成熟胚（Ａ、左の大きな写真）、及びマングビーン Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａの発芽種子からの子葉（Ｂ、右の小さな写真）を示す。ＧＦＰを目的産物として発現するマメの胚が円で囲まれている。
【図５】図５は、ｐＩＣＨ５１８４ベクターを照射したマングビーンの発芽種子の苗条を日光下（左）及びＵＶ光下（右）で示す。
【図６】図６は、構築体ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１４５３０、及び構築体ｐＩＣ０１のＴ−ＤＮＡ領域のスキームを示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＩＣＨ１０８３０のＴ−ＤＮＡ領域、及びＷＤＶ（コムギＤｗａｒｆウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成のスキームを示す（実施例２を参照されたい）。
【図８】図８は、コムギ胚（Ａ）及びトウモロコシ種子組織（Ｂ）においてコムギｄｗａｒｆウイルス（ＷＤＶ）−ＧＦＰ発現カセットを含有するプラスミドｐＩＨ１０８３０を照射し、形質転換後４日の結果を示す。
【図９】図９は、プラスミドｐＩＣＨ１４５２０のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼＰｈｉＣ３１活性の存在下におけるレプリコン形成のスキームを示す。ＬＩＲ及びＳＩＲはコムギｄｗａｒｆウイルスの長い及び短い遺伝子間領域である；ＭＰ−移行タンパク質；Ｒｅｐ−ウイルスレプリカーゼ；ＲｅｐＡ−ウイルスレプリカーゼＡ。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＩＣＨ４３５１のＴ−ＤＮＡ領域及びＲＮＡレプリコンの形成を示す。ＧＦＰに隣接するグレーのドット領域はＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列を示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＩＣＨ１０９２１のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼＰｈｉＣ３１活性の存在下におけるＲＮＡレプリコンの形成を示す。
【図１２】図１２はプラスミドｐＩＣＨ１６００の略図を示す。
【図１３】図１３は構築体ｐＩＣＨ１０６８０の略図を示す。
【図１４】図１４は、構築体ｐＩＣＨ１２７８４、ｐＩＣＨ１２８２０、ｐＩＣＨ１４７８０及びｐＩＣＨ１４７７０の略図を示す。
【図１５】図１５は、構築体ｐＩＣＨ１４８００、ｐＩＣＨ１４７９０、ｐＩＣＨ１４８２０及びｐＩＣＨ１４８１０の略図を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド種子（Ｆ１種子）における高収率で安全な目的産物の産生方法に関する。また、本発明は、それにより産生される種子及び前記種子から単離される目的産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の最近の遺伝子工学的方法における主な問題は、以下のように要約することができる：
１． 通常、目的産物の収率が低い。例は薬用タンパク質、酵素、他のタンパク質、ポリマー、糖、多糖類などである。低収率とは、精製／後処理費用が高いことを意味する。
２． 遺伝子改変植物と非トランスジェニック亜種又は野生型相対物との自由な交雑、及び収穫後の農場における「自生」植物の存在による遺伝子汚染。植物は自己複製生物であるため、又はヒトの過ち若しくは故意の行動のため、そのようなイベントは自然発生的に容易に起こる。
【０００３】
２つの問題は同一問題の全く反対の側面である：低収率は、通常、完全な発育及び生殖サイクルを経由する能力も同時に保持する産生体である植物を構築したいという欲求の結果である。発育及び生殖の工程と導入遺伝子発現工程との組み合わせは解決策を与えない。誘導性システム（ＵＳ０５１８７２８７号；ＵＳ０５８４７１０２号；Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０．４５６７−４５７１；Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号；Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号；Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）も器官特異的導入遺伝子発現システム（ＵＳ０５９５５３６１号；ＷＯ０９８２８４３１号；Ｄｅ Ｊａｅｇｅｒら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、１２６５−１２６８）も遺伝子汚染の問題に対する解決策を提供せず、高収率の目的産物も提供しない。上記システムに用いる誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターは全て、例えば「漏出性」の定常活性を有し、これは発生の過程で導入遺伝子サイレンシングを引き起こし、必然的に目的産物の収率が減少する。更に、そのような誘導性システムの制御下にある組換え遺伝子を有するトランスジェニック植物は、例えば組換え生物医薬品を産生する場合に、厳格な生物安全性の基準を満たさないため、収率が唯一の問題ではない。
【０００４】
植物ウイルス配列に基づいた増幅ベクターの使用は、上記問題、特にそのようなベクターを一過性の発現に用いた場合の部分的解決策を潜在的に提供することができる（ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２２９０６８号）。しかしながら、一過性発現実験用ベクターの多くは、選択された植物種、大部分はタバコ科のために開発されている（ＵＳ５４６６７８８号；ＵＳ５６７０３５３号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２０８８３６９号）。目的の組換えタンパク質／ＲＮＡを産生するためのウイルスベクターの効率性は、効率的な細胞間移行及び全体移行の能力によっても決定される。後者のパラメータは、種及び亜種依存的であり、したがって、一過性発現のために宿主を選択する自由を厳しく制限する。この問題の潜在的解決策は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクターを有するトランスジェニック植物を設計することである。形質移入又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組み込みを介して外来配列を植物で発現させるために設計されたウイルスベクターの使用について多くの総説に記載されている（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．１９９３、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．、３、９１−９６；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．１９９５、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１５５−１６５；Ｐｏｒｔａ，Ｃ．＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．＆Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１９、２４５−２９１；Ａｗｒａｍら、２００２、Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５８、８１−１２４）。しかしながら、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたアンプリコンベクターを有するトランスジェニック植物を設計する試みは、通常、導入遺伝子サイレンシングの問題に直面し、このアプローチを役に立たないものにしている。最良の場合、ＧＵＳ遺伝子及びＮＰＴ遺伝子に関してＨａｙｅｓと同僚によって８０年代後半に示されたように、強力な構成的プロモーターによって提供されるよりもわずかに高い収率を提供する（Ｈａｙｅｓら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７．２３９１−２４０３）。それ以来、ウイルスレプリコンに基づいたトランスジェニック植物における高収率で生物学的に安全な組換えタンパク質の産生を達成する上で特筆すべき突破口は無かった。
【０００５】
ハイブリッド植物が転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のサプレッサーを提供する、ハイブリッド植物のアンプリコンに関するＭａｌｌｏｒｙと同僚の研究（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）は、問題の部分的解決策を与える。しかしながら、このアプローチは目的産物の収率が高くなく、正常な植物の発育とは両立しなかった。更に、バイオセイフティ問題に対処していなかった。Ｇｏｏｄｉｎｇと同僚（１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８）は、科学的研究で単離コムギ胚におけるジェミニウイルスベクターの複製について報告している。可能な技術応用に取り組んでいなかった。更に、この方法は規模を大きくすることができず、したがって、技術応用に使用されていない。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を、特に高収率で産生するための新規方法を提供することである。本発明の他の目的は、植物産生システムにおいて目的産物、特に目的タンパク質を産生するための生物学的に安全な方法を提供することであり、この方法に関与するトランスジェニック遺伝物質の環境への分布は厳しく制御され、発生する可能性が低い。本発明の更なる目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を産生する方法を提供することであり、目的産物の収率又は品質を損なうことなく、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概説
これらの目的は、Ｆ１種子において目的産物を産生する方法によって達成され、この方法は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによってＦ１種子を得ることを含み、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生ずる。次に目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔くことができる。
【０００８】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【０００９】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【００１０】
更に、上記方法によって産生されるか又は産生可能な種子、及び前記種子から単離される目的産物が提供される。好ましくは、前記種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、より好ましくは前記植物は性的に不稔である。
【００１１】
発明者らは、植物種子（Ｆ１種子）において目的産物を産生する方法を見出した。前記方法に必要な遺伝子供与は、親植物をハイブリダイズすることによって前記種子で生ずる。即ち、いずれの親植物も前記方法に必要な完全な遺伝子供与物を有していない。目的産物を産生する種子は、目的産物をそこから単離するときに破壊される。その結果として、本発明の方法は、前記方法に必要な遺伝子供与物が環境に分布する可能性が非常に低いため、生物学的安全性が高い。更に、前記種子から生長する植物は生殖できないため、生物学的安全性を更に高めるためにＦ１種子は不稔であり得る。更に、本発明の方法は、目的産物を産生する上で遺伝子サイレンシングは問題ではないという驚くべき利点を有する。これは、種子における親植物の部分的遺伝子供与物の共存が短いことによるかもしれない。特に、目的産物の産生が基本的に親植物では起こらないため、導入遺伝子サイレンシングを種子に伝達することができない。導入遺伝子サイレンシングがほとんど起こらないため、目的産物を高収率で産生することができる。通常、目的産物は他の植物組織におけるよりも種子においてより安定であるため、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができることが本発明の更なる利点である。これは、本発明の方法全体に柔軟性を与える。
【００１２】
第１及び第２のトランスジェニック親植物は、それぞれ第１及び第２の部分的遺伝子供与物を含有する。部分的遺伝子供与物はトランスジェニックであることが好ましい。第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において遺伝子供与を生ずる。種子において遺伝子供与が生ずると、種子における目的産物の産生が誘発される。ハイブリダイズとは、第１及び第２のトランスジェニック親植物の人工受粉を意味することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２の部分的遺伝子供与物を組み合わせ、Ｆ１種子に遺伝子供与物を供与する。第１及び第２の遺伝子供与物はともに種子における目的産物の産生に必要である。したがって、目的産物は第１及び第２の親植物では発現しない。例えば第１又は第２の部分的供与物からの漏出性発現により、親植物において微量レベルの目的産物の産生が起こり得る。そのような漏出性の発現は、目的産物の経済的産生に対して非常に弱い。しかしながら、第１及び第２の親植物のいずれにおいても目的産物の産生は起こらないことが好ましい。
【００１３】
前記方法によって産生される目的産物は、目的タンパク質、例えば薬用タンパク質であることが好ましい。本発明にしたがい、２、３以上の目的タンパク質を種子で産生することもできる。目的タンパク質は、種子の植物に対して異種タンパク質であることが好ましい。目的タンパク質は酵素でもよい。種子で酵素を産生する場合、産物は、とりわけ前記酵素の作用によって種子で産生される化学化合物でもよい。化学化合物の産生には２、３以上の酵素が必要とされるかもしれない。本発明を用いて産生し得る化学化合物の例としては、ビタミン、ポリマー（例えばポリヒドロキシブチル酸及び他の生分解性ポリエステル）、脂肪酸、脂肪、油、炭水化物、高級イソプレノイドなどが挙げられる。公知の手順にしたがい、目的産物を含有する種子を親植物から収穫し、目的タンパク質又は化学化合物を種子から単離することができる。目的産物が単離される種子は発芽していてもよい。目的産物は発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子に蓄積し得る。
【００１４】
遺伝子供与が生ずることによる目的産物又はタンパク質の産生は、多くのさまざまな方法で達成することができる。タンパク質が産生される場合、それぞれの部分的遺伝子供与物はタンパク質のコード配列の一部を提供することができ、前記部分は例えばＤＮＡレベルでの組換え、ＲＮＡレベルでのＲＮＡトランススプライシング、又はタンパク質レベルでのタンパク質トランススプライシングによって種子で組み合わせられることができる。他の一般的なアプローチは、目的タンパク質のコード配列に、タンパク質が発現不可能な形態で第１の部分的供与物を提供し、遺伝子成分に、タンパク質の発現を誘発する第２の部分的供与物を提供することである。例えば、植物に固有のポリメラーゼには認識されない異種プロモーターからのコード配列の転写を可能にするＲＮＡポリメラーゼに第２の部分的供与物を提供することによって、又は例えばコード配列をプロモーターの制御下に置くことによってコード配列を発現可能にするリコンビナーゼに第２の部分的供与物を提供することによって、発現を誘発することができる。種子における目的産物の産生に対する制御を更に増加させるために、産生を誘発するリコンビナーゼ又は他の酵素のコード配列を２つの断片に分割することができる。一方の断片を第１親植物によって種子に提供し、他方の断片を第２親植物によって種子に提供することができる。２つの断片は、２つの異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下で発現させ、Ｆ１種子においてインテイン介在性トランススプライシングによって活性リコンビナーゼ又は酵素に組み立てることができる。このようにして、目的産物の産生開始を制御することができ、例えば種子発育の後期にシフトさせることができる。インテイン介在性トランススプライシングについての詳細は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に見出すことができる。
【００１５】
重要な態様では、遺伝子供与物は、ハイブリダイゼーションによって生ずる複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む。複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは目的産物の産生に関与する。目的タンパク質が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡから発現することが好ましい。複製ＤＮＡはレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有することができる。レプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ＤＮＡウイルスレプリカーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＤＮＡウイルス成分を有し得る。同様に、複製ＲＮＡはＲＮＡレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有し得る。ＲＮＡレプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＲＮＡウイルス成分を有し得る。最も好ましくは、ＤＮＡウイルスレプリコン又はＲＮＡウイルスレプリコンは目的タンパク質をコードすることができる。
【００１６】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは植物ウイルスを起源とすることができる。複製ＤＮＡはジェミニウイルスに基づくことができる。複製ＲＮＡの場合、複製ＲＮＡは１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づくことが好ましい。好ましい１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスはトバモウイルスである。複製ＲＮＡはタバコモザイクウイルスに基づくことが最も好ましい。
【００１７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分から生ずることができる。ＤＮＡレプリコンは、第１の部分的遺伝子供与物としてそのゲノムにレプリコンの前駆体を組み込ませた第１親植物を、前駆体からレプリコンを生じさせること（又は複製をもたらすこと）が可能な成分を含有するか又はコードすることができる第２親植物とハイブリダイズさせることによって種子において生ずることができる。第２親植物によって提供される成分は、レプリコンの前駆体を再構築することによってレプリコンを生じさせることが可能な酵素（部位特異的リコンビナーゼ、フリッパーゼ又はインテグラーゼのような）であり得る。この態様の例を図３、図７及び図９に示す。
【００１８】
複製ＲＮＡは、第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずることができる。あるいは、第１の部分的遺伝子供与は、複製ＲＮＡの前駆体を含むことができる。前駆体は、第１親植物のゲノムに組み込まれた複製ＲＮＡのＤＮＡコピーであり得る。次に、複製ＲＮＡは、第２の部分的遺伝子供与物にコードされる成分、特にＲＮＡポリメラーゼによる複製ＲＮＡのＤＮＡコピーの転写によって種子において生ずることができる。ＲＮＡポリメラーゼを前記成分として用いる場合、ＲＮＡポリメラーゼは、複製ＲＮＡのＤＮＡコピーを転写するために用いるプロモーターに適応させる必要がある。
【００１９】
目的産物、特に目的タンパク質が第１の部分的遺伝子供与物にコードされ、第２の部分的遺伝子供与物が例えば産生のための調節機能を提供する場合、雌性親植物によってハイブリダイゼーションに第１の部分的遺伝子供与物を提供することが好ましい。より好ましくは、雌性親植物は雄性不稔である。このようにして、第１（雌性）トランスジェニック親植物由来の花粉は環境に分布せず、第２（雄性）親植物由来の花粉は目的産物をコードしないため、生物学的安全性を更に高めることができる。同様に、遺伝子供与物が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む場合は、複製ＤＮＡ又はＲＮＡは雌性親植物の部分的遺伝子供与によって提供されることが好ましい。
【００２０】
第１の部分的遺伝子供与物及び第２の部分的遺伝子供与物は、種子に伝達できるようにそれぞれの親植物に組み込まれていることが好ましい。この目的のため、これらは親植物のゲノムに安定に組み込まれていることが好ましい。親植物は、植物バイオテクノロジーの公知の方法にしたがって、所望の部分的遺伝子供与物を含有するベクターで植物を形質転換することによって産生することができる。親植物は、部分的遺伝子供与物に関して同型であることが好ましい。親植物株は維持されて、自殖によって繁殖することができる。
【００２１】
本発明の種子（Ｆ１種子）を収穫して目的産物の単離に用いることができる。したがって、種子に含有される遺伝子供与物を含めたトランスジェニック材料は環境に分布せず、種子の子孫への移行による繁殖はしない。トランスジェニック材料が種子の子孫へ移行するのを妨げるため、好ましくは、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除され、より好ましくはＦ１種子は不稔である。好ましい態様では、目的産物の強力な発現のために、あるいは複製ＤＮＡ又はＲＮＡの強力な複製のために、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれているか又は種子は不稔である。あるいは又は更に、種子から生長する植物の発育は遺伝子操作によって生殖生長期に達する前にブロックされており、これは正常な植物の発育を妨げる毒性物質又は毒性タンパク質の組織特異的発現によって達成することができる。そのような毒性タンパク質は、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択することができる。好ましくは、植物発育は開花期前にブロックされ、より好ましくは第１葉形成前にブロックされる。
【００２２】
毒性タンパク質（バルナーゼなど、実施例５を参照されたい）はタンパク質断片として発現させることができ、タンパク質断片のタンパク質トランススプライシングによって毒性タンパク質の融合物を生じ、機能性毒性タンパク質を形成する。毒性タンパク質を２つの断片として発現させる場合、これら２つの断片は、２つの異なるプロモーター、特に２つの異なる組織特異的プロモーター又は２つの異なる発生学的に活性なプロモーターの制御下で転写させることができる。したがって、機能性毒性タンパク質の形成は、組織特異性が異なる２つのプロモーターに依存し得る。即ち、毒性タンパク質は、２つのプロモーターが活性な組織において活性型で形成される。このアプローチは、しばしば漏出性発現をする１つの組織特異的プロモーターによって達成されるよりも、機能性毒性タンパク質の発現に対してより厳格な制御を可能にする。更に、このアプローチは、新規発現パターン、例えば公知の組織特異的プロモーターでは達成できない発現パターンの達成を可能にする；２つの断片のために異なる組織特異的プロモーターを組み合わせることにより、可能な発現パターンの組み合わせの多様性が広がる。
【００２３】
本発明の方法は、大規模適用に完全な可能性を示す。大規模とは、多くの植物を同時に、例えば温室で適用することを意味する。最も好ましくは、大規模とは農場での適用を意味する。大規模適用では、第１親植物株の多くの植物と第２親植物株の多くの植物は、第１親植物株の植物と第２親植物株の植物との効率的な人工受粉を可能にするために、互いに近接して蒔かれるか又は植えられる。自家受粉を避けるために、例えば第１又は第２の親植物のいずれかの雄性不稔を用いる公知のハイブリッド種子産生方法を本発明の方法と組み合わせることができる。そのような方法の１例は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に記載のものである。
【００２４】
本特許出願の優先権証明書ＤＥ １０３ ２５ ８１４号は、本明細書中にその全体が援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の最良の形態及び詳細な説明
本発明の発明者らは、驚くべきことに、高率細胞分裂は、少なくとも双子葉植物の胚におけるウイルス複製を提供するのに単独では十分でなく、その上、胚発育期に依存し、通常、種子発育のより後期にシフトするすることを発見した。他の驚くべき発見は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスに基づくレプリコン前駆体がトランスジェニック種子（Ｆ１種子）における活性化によって複製する能力である。我々の知る限りでは、この現象について記載する先行技術ない。
【００２６】
本発明の方法では、植物の生殖と植物に基づいた目的産物の産生とは厳密に分離しており、産物の収率が大幅に向上する。目的産物を産生するために植物の発育及び生殖に通常必要とされる資源を、例えば、好ましくは特定の最も好適な発育期又は初期発芽期に、種子において目的産物を産生することによって利用することは、遺伝子汚染を制御することに役立つ。
【００２７】
発育期、より詳細には配偶子融合及び受精期を、種子生長期を産生期に変換する遺伝子スイッチとして用いることを提唱する。遺伝子供与の異なる成分を異なる親植物へ操作した。前記成分（部分的遺伝子供与物）は、親植物内では不活性であるが、ハイブリダイゼーション行程後に遺伝子供与を生じ、それにより目的産物の産生を誘発する。好ましい態様では、複製ＤＮＡ又はＲＮＡ（増幅工程）を産生に使用し、それにより胚及び／又は胚乳産生を支配する高収率産生システムが作製され、発育種子に目的産物の蓄積をもたらし、一方で、種子をその後の有性生殖ができないようにすることが好ましい。目的産物が蓄積し、発育種子、成熟種子、又は発芽種子から単離することができる。
【００２８】
本発明の基礎は、以下の驚くべき発見にある：
（ａ） ウイルスベクターは、種子発育のより後期及び種子発芽の初期に植物種子において複製可能であるが、特に双子葉植物では、種子形成の初期段階には全く又はほとんど不可能である；
（ｂ） 染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクター前駆体は、アクチベーター配列を提供する植物との交雑によって、ハイブリッド種子内で効率的に活性化されることができる。
【００２９】
植物発育の費用で染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたレプリコンを種子において活性化することはこれまでに示されていない。これは本発明の方法を厳重に制御することを可能にし、導入遺伝子サイレンシングを誘発するか又は種子発育を極初期に妨げる、漏出性の複製を妨げる。
【００３０】
インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）に基づいたレプリコンの設計は、実施例１に記載され、図２及び図３に示されている。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をレポーター遺伝子として有するベクターｐＩＣＨ４３００を用いて、ジェミニウイルスを複製するために胚のさまざまな発育期の能力を試験した。これらの実験の結果を図４に示す。照射した若いマメの胚の表面に可視化したウイルス複製の兆候はない（ＧＦＰ発現なし）が、多くの進行した発育後期の細胞に明瞭なＧＦＰ発現が検出されたことは明らかである（図４）。種子発芽のあいだにも効率的複製が起こる（図５）。コムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）に基づいたベクターの設計は実施例２に記載されている。図７は、一過性発現実験のためのＷＤＶベクターを概略的に示す。コムギ及びトウモロコシの種子を用いた実験結果を図８に示す。ＷＤＶベクターはコムギ及びトウモロコシの胚において効率的に複製するが、トウモロコシの胚乳ではより効率が低いことが明らかである。種子発育の望ましくない段階（極初期）での漏出性の複製は、種子生長及びこのアプローチの技術適用性を危うくするため、これらのデータは本発明の実行可能性を確立する上で重要である。また、部位特異的組換えによる複製行程を誘発するための種子特異的プロモーターの幅広い選択を可能にする。胚発育初期段階においてウイルスベクターをその部分の組換え介在反転によって活性化することは（図３及び図９）、レプリコン前駆体を複製適格期にし得るが、胚が発育のより進行した段階（「複製適格期」）に達するまで複製は起こらないことが好ましい。
【００３１】
プロモーターの選択はこの技術の効率に影響する。誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターを用いて、種子における高収率産生を誘発することができる。誘導性プロモーターは、誘導条件によって２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるもの、及び生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるもの。第１カテゴリーの例は、とりわけ熱誘導性プロモーター（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性プロモーター（ＵＳ０５８４７１０２号）、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号）、及びテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学的に誘導可能なシステムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的に誘導可能なシステムの総説としては：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、１４６−１５１）を参照されたい。しかしながら、本発明を実施する上で最も好適なプロモーターは種子特異的プロモーターである。
【００３２】
本発明の実施に有用であり得る種子特異的プロモーターには幅広い選択肢がある。そのようなプロモーターには、とりわけ、エンドウマメ レクチン（Ｐｓｌ１）遺伝子のプロモーター（ｄｅ Ｐａｔｅｒら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、５１５−５２３）、ＵＳＰと呼ばれるソラマメ非貯蔵性種子タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、オーツムギ グロブリン遺伝子ａｓｇｌｏ５の胚乳特異的プロモーター（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６、２０３−２１０）、トウモロコシ Ｏ２遺伝子のプロモーター（Ｇａｌｌｕｓｃｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１５、３９１−４００）、後期胚形成において豊富な遺伝子（ｌｅａ）、具体的にはシロイヌナズナ胚のいたるところに発現するＡｔＥｍ６のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、β−ファセオリン及びβ−コングリシニンのプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６、４４７−４５８）、インゲンマメのアルセリン−５遺伝子のプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎｓら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２０、１０９５−１１０４）、Ｄ−ホルデイン遺伝子プロモーター（Ｈｏｒｗａｔｈら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１９１４−１９１９）、オオムギ リポキシゲナーゼ１（Ｌｏｘ１）遺伝子のプロモーター（Ｒｏｕｓｔｅｒら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５．４３５−４４０）などが含まれる。
【００３３】
目的タンパク質の発現を駆動するために選択したプロモーターの適用性を予備的に評価するため、ｐＩＣ０１由来の構築体（図６）を用いた一過性発現実験に、ＧＵＳレポーター遺伝子を使用した。ここで、３４Ｓプロモーターは種子特異的プロモーターに置換されている。インテグラーゼφＣ３１の発現を駆動するため、ソラマメ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びイネ アクチン１遺伝子の構成的プロモーター（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐＩＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）を含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した。他の部位特異的リコンビナーゼの多くは本発明に用いることができる。そのようなシステムの例としては、とりわけ、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−Ｌｏｘシステム（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２５、７２９−７３６）、サッカロミセス・セレビジエ由来のＦｌｐ−Ｆｒｔシステム（Ｂｒｏａｃｈら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２９、２２７−２３４）、チゴサッカロミセス・ルキシー由来のＲ−ＲＳシステム（Ａｒａｋｉら、１９８５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８２、１９１−２０３）が挙げられる。
【００３４】
天然宿主及び非宿主植物種の胚におけるウイルスレプリコンに関する先行技術文献がある（Ｗａｎｇ＆Ｍａｕｌｅ、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６、７７７−７８７；Ｇｏｏｄｉｎｇら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８；Ｅｓｃａｌｅｒら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、３１８−３２５；Ｕｇａｋｉら、１９９１、１９、３７１−３７７）。細胞間移行及び全体移行などの宿主特異性を決定するウイルスレプリコンの特定の特性を犠牲にすれば、宿主範囲が著しく増加すると思われる。そのようなウイルスレプリコンは、種子細胞を含めた広範な植物種の細胞で効率的に複製することができると思われる。ここで、前記植物種はウイルスレプリコンに対する天然宿主ではない。そのような場合、ウイルスレプリコンの全体移行及び細胞間移行は影響を受けるが、複製能は影響を受けない。実際に、本発明の原理にしたがって、ウイルスに基づいたベクターを構築するために、さまざまな分類群に属するウイルスを用いることができる。これは、ＲＮＡ含有ウイルス及びＤＮＡ含有ウイルスの両方にあてはまる。それらの例を以下に示す（本明細書にわたり、それぞれの基準種名はそれが属する目、科及び属の名称によって先行される。目、科及び属の名称は、ＩＣＴＶに承認されている場合はイタリック体である。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（俗名）は標準体で示す。属又は科について正式命名のないウイルスが示されている）：
ＤＮＡウイルス：
環状２本鎖ＤＮＡウイルス：科：カリモウイルス科、属：バドナウイルス属、基準種：ツユクサ黄斑ウイルス、属：カリモウイルス属、基準種：カリフラワーモザイクウイルス、属：“ＳｂＣＭＶ様ウイルス”、基準種：ダイズｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：“ＣｓＶＭＶ様ウイルス”、基準種：キャッサバ葉脈モザイクウイルス、属：“ＲＴＢＶ様ウイルス”、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ、属：“ペユニア葉脈ｃｌｅａｒｉｎｇ様ウイルス”、基準種：ペチュニア葉脈ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス；
環状１本鎖ＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス科、属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ（サブグループＩ ジェミニウイルス）、基準種：トウモロコシ条斑ウイルス、属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ（サブグループＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ビートカーリートップウイルス、属：ベゴモウイルス属（サブグループＩＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：インゲンマメモザイクウイルス；
ＲＮＡウイルス：
１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグラスモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアントウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス、
属が未分類の１本鎖ＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス科、基準種：リンゴｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：カーラウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス；属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス；属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス；属：ポテクスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス；属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス；属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジンｍｏｔｔｌｅウイルス；マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：サイトラブドウイルス属、基準種：レタス壊死性黄変病ウイルス、属：ヌクレオラブドウイルス属、基準種：ジャガイモ黄萎病ウイルス；
マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科、属：トスポウイルス属、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
２本鎖ＲＮＡウイルス：科：パーティティウイルス科、属：アルファクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス１、属：ベータクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス２、科：レオウイルス科、属：フィジーウイルス属、基準種：フィジー病ウイルス、属：ファイトレオウイルス属、基準種：創傷 腫瘍ウイルス、属：オリザウイルス属、基準種：イネｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未分類ウイルス：ゲノム１本鎖ＤＮＡ：種：バナナｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐウイルス、種：ココナッツｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙウイルス、種：サブタレニアン・クローバー矮化ウイルス、
ゲノム：２本鎖ＤＮＡ、種：キュウリ葉脈黄化ウイルス；ゲノム：２本鎖ＲＮＡ、種：タバコ矮化ウイルス、
ゲノム：１本鎖ＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅモザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ｏｕｒｍｉａ メロンウイルス、種：ペラルゴニウムｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス；
サテライト及びウイロイド：サテライト：１本鎖ＲＮＡサテライトウイルス：サブグループ２ サテライトウイルス、基準種：タバコ壊死サテライト、
サテライトＲＮＡ、サブグループ２ Ｂ型ｍＲＮＡサテライト、サブグループ３ Ｃ型線状ＲＮＡサテライト、サブグループ４ Ｄ型環状ＲＮＡサテライト、
ウイロイド、基準種：ジャガイモやせいも病ウイロイド。
【００３５】
多くの場合、植物ウイルス起源のベクターは、植物において自律複製可能なプラスミド（レプリコン）として本発明に用いられる。しかしながら、非ウイルス配列を用いるそのようなプラスミドの操作に必要な原理は公知である。例えば、植物細胞に由来する多くの推定複製起点が記載されている（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１６１−１６２；Ｈｅｒｎａｎｄｅｓら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、４１３−４２２；Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１７３−１８２；Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。高等植物ゲノム由来の自律複製配列（ＡＲＳ配列）は、酵母及び高等動物のＡＲＳ配列と共通した構造的特長及び配列的特徴を有することが示されている（Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。植物ＡＲＳ配列はサッカロミセス・セレビジエ中のプラスミドに自律複製能を付与可能である。酵母においてプラスミドの自律複製を促進可能なトウモロコシの核ＤＮＡ配列の研究により、トウモロコシゲノム内に２つのファミリーの高度反復配列を表すことが示された。それらの配列は特徴的なゲノムハイブリダイゼーションパターンを有する。典型的には、それぞれの１２〜１５ｋｂのゲノム断片上にＡＲＳ相同配列のコピーがたった１つ存在した（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：１６１−１６２）。植物起源のレプリコンの他の供給源は、植物において異種遺伝子の増幅及び発現を刺激することができる植物リボソームＤＮＡスペーサー配列である（Ｂｏｒｉｓｊｕｋら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１８、１３０３−１３０６）。高率増幅による所望の効果は、強力なプロモーターを用いることによって達成することもできる。そのようなプロモーターは高コピー数の目的転写物を提供することができ、複製ベクターに類似の最終結果を生ずる。
【００３６】
したがって、本発明で意図するレプリコン又は前駆体ベクターは必ずしも植物ウイルスに由来する必要はない。植物ＤＮＡウイルスは、標的ＤＮＡの形質転換に特に有用なレプリコン（ベクター）を操作する容易な方法を提供するが、植物ＲＮＡウイルス又は非植物ウイルスであっても、全体的に又は部分的にこれに由来する配列で作製されるベクターは可能である。植物ウイルスに基づいたレプリコンは明らかに有益である。そのようなレプリコンは、複製に加えて、例えば細胞間移行及び長距離移行のための更なる有用な機能を提供することができる。更に、それらは、感染植物からウイルスを根絶するための公知の方法を用いることによって、しばしば植物細胞から帰納的に、より容易に除去することができる。
【００３７】
本発明では、ウイルスベクターの特定部分の部位特異的組換え（反転）によって活性化することができるウイルスレプリコンを用いることが好ましい（図３、図９及び図１１を参照されたい）。これらのレプリコンはＤＮＡウイルス（ＢＧＭＶ、ＷＤＶ）及びＲＮＡウイルス（ＴＭＶ）に基づくことができる。部位特異的組換えによるＤＮＡウイルスベクターの再構築は、ウイルスＤＮＡの複製開始に十分であることは図面から明らかである。ＴＭＶに基づくベクターの場合、ＤＮＡの再構築のみでは複製開始に通常十分でないため、状況が異なる。そのようなＲＮＡレプリコンの増幅を誘発するためには転写が必要とされる。転写を駆動する構成的プロモーター（図１１を参照されたい）は誘導性プロモーター又は種子特異的プロモーターに置換し得るため、こうした必要性は、ＲＮＡに基づいたアンプリコン発現のための更なる制御工程の使用を可能にし、増幅の空間的及び一時的制限方法を厳重に制御し、より柔軟性を与える。
【００３８】
発明を効率的に実施するには、可能な最高収率を提供する最良の可能な組み合わせを見出すために、それぞれのウイルスレプリコンのタイプについて種子特異的プロモーターの多くの異なる組み合わせを解析することが好ましい。
【００３９】
本発明の重要な要素は、ハイブリッド種子が子孫を作れないということである。即ち、例えば稔性植物への発育が不可能であることにより、種子は不稔であることが好ましい。多くの場合、ウイルスベクターの複製はこの所望の効果を提供し、したがって更なる種子の発育を損なうことが期待される。しかしながら、目的産物を提供するベクターの複製が十分でない場合、所望の効果を達成するために追加の技術を適用することができる。実施例５には、ハイブリッド種子においてインテイン介在性トランススプライシングによって組み立てられる細胞毒性遺伝子（バルナーゼ）の使用について記載されている。インテインが融合したバルナーゼ断片は異なる親植物中に局在し、異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下にあることができる。断片はともにハイブリダイゼーションによってもたらされ、インテイン介在性トランススプライシングの結果として細胞毒性産物を形成することができる。異なるが部分的に重複する発現パターンを有する異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を、バルナーゼ断片の発現をともに駆動する同一の組織特異的プロモーターを用いるよりも、必要とする組織に正確な方法で制限することができる。シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）とシロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を実施例５で使用し、２つのバルナーゼ断片の発現を駆動させた（図１５を参照されたい）。これらのプロモーターは、活性が発芽種子の頂端分裂組織に重なるため、好適なバルナーゼ活性パターンを提供する。多くの他の発生学的に調節されたプロモーター及び組織特異的プロモーターを本態様の実施に用いることができるため、本発明はこれら２つのプロモーターの使用に限定されない。本態様に有用なプロモーターの例としては、光合成の活性な組織で発現されるシロイヌナズナＨＢＰ−１ａ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｋａｍｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４８、５７３−５８２）、種子特異的ナピン遺伝子プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１０１９−１０２７）、発生学的に調節されたｒｂｃＳ遺伝子のプロモーター（Ｍａｎｚａｒａら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３、１３０５−１３１６）、などが挙げられる。
【００４０】
実施例では、主に植物細胞におけるアグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ送達を使用し、Ｔ−ＤＮＡは第１及び／又は第２の部分的遺伝子供与物をベクターとして含有する。植物細胞にベクターを送達するために、微粒子銃、エレクトロポーレーション又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換による細胞へのベクターの直接導入のような異なる方法を用いてもよい。アグロバクテリウム介在植物形質転換が好ましい。したがって、アグロバクテリウムによって運搬されるＴｉ−プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、粒子又は微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）などのさまざまな好適な技術によってＤＮＡで植物細胞を形質転換することができる。原理上、例えばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６号；ＷＯ０９４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポーレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）などの他の植物形質転換法を用いることもできる。形質転換法の選択は、形質転換すべき植物種に依存する。例えば、単子葉植物の形質転換には微粒子銃が好ましく、双子葉植物には通常アグロバクテリウム介在形質転換がより良い結果与えることができる。
【００４１】
本発明は、高等多細胞植物を用いて実施することが好ましい。本発明での使用に好ましい植物には、農学的及び園芸学的に重要な種に関連した植物種が含まれる。本発明に使用するための一般的な作物には、アルファルファ、オオ麦、インゲン豆、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズ豆、ルピナス、キビ、オート麦、エンドウ豆、落花生、イネ、ライ麦、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、大豆、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウ豆、ソラ豆、コムギ、フジ、及び堅果植物が含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、限定されるものではないが、イネ科、キク科、ナス科及びバラ科の代表的なものが挙げられる。
【００４２】
本発明での使用に更に好ましい種は、以下の属に由来する植物である：シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、ライムギ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ、及びＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ並びにその他多くのもの。
【００４３】
好ましいのは、ハイブリッド種子産生システムが存在する植物である。第１及び第２の親植物のハイブリッドである種子を高率で産生するためには、これらのシステムを、本発明とともに使用することが好ましい。最も好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、チカラシバ、ダイズ、ナタネ種子、カノーラ、タバコ、及びイネである。
【００４４】
本発明を用いてセンス方向又はアンチセンス方向に発現させることができる目的タンパク質、又はその断片には以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ヘルビコラ リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ（ketohydrolase）、アセトアセチルＣｏＡ レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、カリホルニアウンベルラリア Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、６−不飽和化酵素、植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームでの酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインから成るタンパク質融合物、オレオシンタンパク質と融合タンパク質を脂質相に標的化可能な目的タンパク質との翻訳融合物、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、プラスチドの内側エンベロープ膜にある成熟リン酸輸送体タンパク質のアミノ末端疎水性領域と前記膜に標的化された目的タンパク質との融合物など。
【００４５】
ヒト又は動物のいかなるタンパク質も、特に本発明のシステムを用いたハイブリッド種子において発現させることができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、以下のタンパク質（薬用タンパク質）が挙げられる：免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカイン及びその受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、線維素溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、並びに上記タンパク質の融合体、変異体型及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質。
【００４６】
本発明の方法は、トランスジェニックコード配列の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を抑制するために、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質又はその機能保存的変異体若しくは断片をコードする遺伝子を植物において発現させることを更に含むことができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質遺伝子又はその機能保存的変異体若しくは断片を、トランスジェニックコード配列を有する同一ベクター上で又は余分のベクター上で植物に提供することができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質は、ウイルス又は植物起源であることが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質の例は、ジャガイモウイルスＸ ｐ２５タンパク質、アフリカ キャッサバモザイクウイルス ＡＣ２タンパク質、イネｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅウイルスＰ１タンパク質、トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス １９Ｋタンパク質、ｒｇｓ ＣＡＭ、又はこれらのタンパク質のうちの１つの機能保存的変異体若しくは断片である。機能保存的変異体又は断片は、上記タンパク質の１つに対し、７５％の配列同一性を有することが好ましく、好ましくは少なくとも７５％同一である。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質及びその使用に関する詳細は、ＷＯ０１３８５１２号に見出すことができる。
【実施例１】
【００４７】
ＢＧＭＶベクター
ＧＦＰを有するジェミニウイルス複製ベクターのクローニング：
ｐＵＣ１９ ＤＮＡを、ｄｎａａｐｒ７プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇｔ ｃｔａ ｇａｃ ｔｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ｔｔｔ ｔａｃ ａａｃ）及びｄｎａａｐｒ８プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇａ ａｃａ ａｔｔ ｇｃｔ ｃｇａ ｇｇｃ ｇｔａ ａｔｃ ａｔｇ ｇｔｃ ａ）を用いて増幅し、増幅断片をＰｓｔＩで消化し、再連結した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１１４４は、ｐＵＣ１９に類似するが、ポリリンカーがＸｈｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＰｓｔＩで置換されている。ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したインゲンゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）単離物ＤＳＭＺ ＰＶ−００９４を感染させたインゲンマメ組織から、ＤＮＡを抽出した。ＢＧＭＶ共通領域を包含するゲノムの断片（ＣＲ；ＢＧＭＶの複製起点を含有）を、ｄｎａａｐｒ３プライマー（ｇｇｇ ａａｔ ｔｃａ ｃｔａ ｇｔａ ａａｇ ａｔｃ ｔｇｃ ｃｇｔ ｃｇａ ｃｔｔ ｇｇａ ａｔｔ ｇ）及びｄｎａａｐｒ４プライマー（ｃａａ ｔｇｃ ａｔｃ ａｔｇ ｇｃｇ ｃａｔ ｃａｃ ｇｃｔ ｔａｇ ｇ）を用いてＰＣＲで増幅し、ＭｆｅＩ及びＰｓｔＩで消化したｐＩＣＨ１１４４中にＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１１５６を得た。ｐＩＣＨ１１５６中のＢＧＭＶ挿入物を配列決定した。他の２つのＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノム断片を、ＢＧＭＶを感染させたインゲンマメＤＮＡから、ｄｎａａｐｒ９プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａａｇ ｇａｔ ｃｃｔ ｃｔｇ ｇａｃ ｔｔａ ｃａｃ ｇｔｇ ｇａａ ｔｇｇ）／ｄｎａａｐｒ１３プライマー（ｃｇｃ ｔｃｇ ａｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ａｃｔ ｔｇｇ ａａｔ ｔｇｔ ｃ）ペア、及びｄｎａａｐｒ５プライマー（ｇａａ ｇａｔ ｃｔｇ ｃａａ ｇａｇ ｇａｇ ｇｔｃ ａｇｃ ａ）／ｄｎａａｐｒ１０プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａｔｃ ｔａｔ ｔｔｃ ｔａｔ ｇａｔ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｃ）ペアを用いて増幅させた。これらの断片の合計は、コートタンパク質のない完全長ＢＧＭＶゲノムになる。これらの断片をそれぞれＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ及びＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｐＩＣＨ１１５６に、３通りの連結法でクローニングした。得られたプラスミドは、重複したＢＧＭＶ ＤＮＡＡ共通領域に隣接するコートタンパク質遺伝子のない１つの完全長ＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノムを含有する。試験のために３つのクローン：ｐＩＣＨ１６６３、１６６４及び１６６７を保存した。コートタンパク質遺伝子がＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを含有するマルチクローニング部位に置換されている。ｐＩＣ０１１（ｐＵＣ１８内にＨｂｔプロモーター−合成ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーター）由来の合成ＧＦＰ（ＳＧＦＰ）コード配列を、ｐＩＣＨ１６６３、ｐＩＣＨ１６６４及びｐＩＣＨ１６６７のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位にＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７を得た。ＧＦＰをコートタンパク質プロモーターの制御下に置く。クローンｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７の機能性に関して試験するために、ベンサミアナタバコ及びインゲンマメの切除葉に、遺伝子銃粒子送達システム１０００／ＨＥ（バイオラッド）を用いて照射した。翌日、３つの構築体全てに関し、両方の種の葉においてＧＦＰ発現上皮細胞が検出されるであろう。
【００４８】
バイナリーベクターでのクローニング
ｐＩＣＨ１６９４のＸｈｏＩ−ＮａｒＩ断片を、ＸｈｏＩ及びＣｌａＩで消化したｐＩＣＢＶ１１にサブクローニングすることによって、ｐＩＣＨ１６９４のプロレプリコン部分を含有するバイナリーベクターを作製した。得られたクローンｐＩＣＨ４３００（図２）は、ＢＧＭＶコートタンパク質プロモーターの制御下にあるＧＦＰ遺伝子、及び重複ＣＲ間にＡＬ１／２／３遺伝子を含有する。
【００４９】
「反転した」ジェミニウイルスプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ７３００はｐＩＣＨ４３００に類似するが、いくつかの制限酵素部位（ＳａｌＩ、ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＢｇｌＩＩ）が、制限部位が重複する変異プライマーを用いたＰＣＲで除去されている。レプリカーゼの部分と共通領域うちの１つを含有する断片の転置によって複製不可能なクローンｐＩＣＨ１５００（図３）を作製するための開始点としてｐＩＣＨ７３００を用いた。ＡｔｔＰ及びＡｔｔＢ組換え部位を転置の先端に置き、インテグラーゼを提供することによって転置領域の反転を可能にし、それにより機能性ベクターを得る。ＡｔｔＢ及びＡｔｔＢ部位は人工イントロン配列に隣接しており、インテグラーゼ介在性組換えによって生ずるＡｔｔＲ配列の、ＡＬ１転写物からのスプライシングを可能にする。
【００５０】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適格性を試験する：
ｐＩＣＨ４３００プラスミドＤＮＡを一連の植物組織に照射した。インゲンマメの葉、成熟種子、水分補給したマメの子葉及び発芽苗、並びに未成熟胚において明るい蛍光細胞が検出されるであろう。ＧＦＰ蛍光によってアッセイしたように、胚発育期の全てにおいてジェミニウイルスの複製を起こしやすいわけではない。長さ４〜５ｍｍまでの子葉がある小さな白い胚にはＧＦＰ発現細胞がなかった。逆に、より緑色したより大きな子葉はジェミニウイルスの複製に非常に適していた。
【００５１】
タバコ、ベンサミアナタバコ、シロイヌナズナ、ショカツサイ及びマングビーンを含めた他の種も、少なくとも葉において、ジェミニウイルスの複製を起こしやすかった。
【００５２】
φＣ３１インテグラーゼクローンのクローニング
ｐＩＣＰ１０１０は、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（プロモーター、第１エクソン、第１イントロン、及びアクチン２遺伝子の第１エクソンの１０ヌクレオチドを含有する１３４４ヌクレオチド断片）に融合したストレプトミセスファージＣ３１インテグラーゼ（Ｄａｖｉｄ Ｏｗより、植物遺伝子発現センター、米国農務省−農業研究サービス、アルバニー、ＣＡ９４７１０、ＵＳＡ）を含有するバイナリーベクターである。核へのインテグラーゼの輸送を増加させるために、ＳＶ４０ Ｔ抗原由来の核局在シグナル（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｎｄｒｅａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０、２２９９−２３０６）を、φＣ３１インテグラーゼのＣ末端に融合させた。ｃ３１ｐｒ１プライマー（ｇｃａ ｃｇｃ ｃｇａ ａｇｇ ｃｇａ ｃｇａ ａｇ）及びＮＬＳ配列を含有する伸長部を含有するＰＣＲプライマー（３１ｎｌｓ１：ｇｇａ ｔｃｃ ｔａａ ａｃｃ ｔｔｃ ｃｔｃ ｔｔｃ ｔｔｃ ｔｔａ ｇｇｃ ｇｃｃ ｇｃｔ ａｃｇ ｔｃｔ ｔｃｃ ｇｔｇ）を用いたｐＩＣＰ１０１０からのＰＣＲ増幅によってＮＬＳ配列をインテグラーゼ配列に付加し、ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＰ１０１０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１０８８１（図６）を得た。異なるプロモーターを容易にサブクローニングするために、ｐＩＣＨ１０８８１からインテグラーゼ及びＮｏｓターミネーターをＰｓｔＩ／ＡｐａＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１へサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１３９０１（示していない）を得た。このベクターは、Ｎｏｓプロモーター−ＮｐｔＩＩコード配列−Ｎｏｓターミネーター 選択カセット及びポリリンカーＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ−ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。適当な種のゲノムＤＮＡから、遺伝子特異的プライマーを用いていくつかのプロモーターを増幅し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１にクローニングした。前記プロモーターを更にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣ０１にサブクローニングし（図６）、発育種子への微粒子銃によってＧＵＳレポーター遺伝子との融合物としてそれらの活性について試験した（示していない）。
【００５３】
インテグラーゼφＣ３１の発現を駆動するために、ソラマメ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びイネ アクチン１遺伝子の構成的プロモーターを含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐIＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐIＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）。
【００５４】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ベンサミアナタバコの葉ディスクを、構築体ｐIＣＨ１５００、ｐＩＣＨ４５５０及びｐＩＣＨ４５４０（インテグラーゼ）で形質転換し、各構築体について独立した形質転換体を得た。ｐＩＣＨ１５００の１０個の形質転換体を、各インテグラーゼ構築体の少なくとも５つの形質転換体と交雑させた。未成熟発育種子を切開し、ＧＦＰ蛍光を顕微鏡を用いて青色光下で観察した。
【実施例２】
【００５５】
ＷＤＶベクター
ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したコムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）を感染させたコムギ葉サンプルからＤＮＡを抽出した。互いに逆向きでゲノムのユニークＥｃｏＲＩ部位が重複するプライマーを用いて、ＷＤＶの完全長ゲノム（ｃａ．２．８ｋｂ）をＰＣＲで増幅させた：
ＦｗｄｖＥ１ ａＧＡＡＴＴＣａｃａｃｃｇａｔｇｇｇｃｔｃ
ＲｅｗｄｖＥ１ ｔＧＡＡＴＴＣｔｇｃａｃａｃｔｃｃｃａｃｇ
増幅断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にクローニングした。２つのクローンについて塩基配列を決定した。ＢＬＡＳＴ解析は、増幅配列が、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに存在する完全に配列決定した４つのＷＤＶ株（ＧＥＷＤＶＸＸ、ＷＤＶＧＮＳ、ＷＤＷ３１１０３１、ＮＣ ００３３２６）とは著しく異なるが、ハンガリーで単離された部分的に配列決定した（１．２ｋｂ）ウイルス（ＡＪ３１１０３８；Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４７（１）：２０５−２１６、２００２）とは密接に適合することを示した。
【００５６】
コートタンパク質遺伝子を除いた完全長ゲノムを増幅するために、得られた配列データに基づいて２つのプライマーを設計した（ｔｔＣ ＣＡＴ Ｇｇａ ｇｔｔ ａｃｃ ｔｃｇ ｇｇ ａｇｔ ｃｃｔ ｔｇｔ ｔｇ 及び ｔｔＧ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ Ｇｃａ ａａａ ｔａｇ ｔａｔ ｔｔｔ ａｔｔ ｃａｔ ｃｔｃ ａｔｇ ｔｃ）。上記感染葉ＤＮＡからＰＣＲを行った。
【００５７】
ＰＣＲ増幅産物を、ＳｐｈＩ及びＮｃｏＩで消化したＧＦＰの変異型（Ｓ６５ＴＧＦＰ）を含有するｐＵＣ１９ベクターにＳｐｈＩ−ＮｃｏＩ断片としてクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１０６８０は、ＣＰをＧＦＰで置換した唯一のＷＤＶゲノムを含有する（図１３）。
【００５８】
重複ＬＩＲを有する完全長ゲノムを２工程でバイナリーベクターにクローニングした。第１に、ｐＩＣＨ１０６８０のＢａｍＨＩ−ＡｐａI断片を、ＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで消化したバイナリーベクターにサブクローニングした。この中間体クローンは、ＣＰのかわりにＧＦＰを有する部分ＷＤＶゲノムを含有するが、ＰｓｐｏＭＩ及びＰｃｉＩで消化し（Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化）、ｐIＣＨ１０６８０のＳｍａI−ＮｏｔＩ断片をクローニングする第２工程に用いた。得られたクローンｐIＣＨ１０８３０（図７）は、ＣＰをＧＦＰで置換した完全長ＷＤＶゲノムを含有し、重複ＬＩＲに隣接し、ＷＤＶ−ＧＦＰレプリコンの切り出し及び増幅を可能にする。
【００５９】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適合性を試験する：
ｐＩＣＨ１０８３０をコムギ及びトウモロコシの発育胚に照射した。胚に強力なＧＦＰ蛍光を発する細胞が観察されたが、胚乳でも検出されるであろう（図８）。
【００６０】
「反転した」ＷＤＶプロベクターのクローニング
ＢＧＭＶベクターに関して記載したのと同一のストラテジーを用いて、「反転した」ＷＤＶベクターｐＩＣＨ１４５２０を作製した（図９）。このクローンが複製開始可能になるのは、φＣ３１インテグラーゼに曝露して反転させた後のみである。このクローンの機能性を試験するため、トウモロコシの胚に単独で、又はインテグラーゼクローンｐＩＣＨ１４５３０若しくはｐＩＣＨ１４５６０とともに照射した。ｐＩＣＨ１４５２０をインテグラーゼとともに照射したときのみＧＦＰ蛍光細胞が検出されるであろう。
【００６１】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ｐＩＣＨ１４５２０及びインテグラーゼクローンでトウモロコシを形質転換した。
両方の構築体に由来する選択した形質転換体を両方向で交雑させ、さまざまな発育期で未成熟種子を切開し、顕微鏡又は携帯ＵＶランプを用いて青色光下で観察した。
【実施例３】
【００６２】
ＣＲ−ＴＭＶベクター
ＧＦＰを有するｃｒ−ＴＭＶ複製ベクターのクローニング：
ｐＩＣＨ４３５１（図１０）はｃｒ−ＴＭＶ、アブラナ感染トバモウイルス（Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５０、５−８）に基づいたウイルスベクターである。ｐＩＣＨ４３５１は、Ｃｒ−ＴＭＶの５’非翻訳配列、続いてＲｄＲｐ及びＭＰを含有し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド１〜５６２９、ＭＰの最後の１６アミノ酸を、ＭＰ機能を喪失することなく切断し、Ｚ２９３７０中の５６０５位のＴをＣに変異させた）、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（７８７ヌクレオチド断片、転写開始の５’側、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ４１９９８、Ａｎら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０、１０７−１２１）に融合している。ＭＰの後にＬｏｘＰ部位が続く。この部位は、この構築体の使用に関して機能的に意味がなく、それを構築するために用いたプラスミドにも存在しているために存在している。ＬｏｘＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ由来のＩＲＥＳ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド４８０４〜４８７３）、及びＧＦＰ ＯＲＦが続く。ＧＦＰ発現を増加させるための翻訳エンハンサーとしてＩｒｅｓをこの位置にクローニングした。ＧＦＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド６０８３〜６３１２）、アグロバクテリウム Ｎｏｓターミネーターが続く。この構築体を、植物でカナマイシン選択するためのカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターｐＩＣＢＶ１０にクローニングする（Ｎｏｓプロモーター−ＮＰＴＩＩコード配列ｓ−Ｎｏｓターミネーター）。この構築体では、ＧＦＰはＭＰの末端に局在するＣＰサブゲノムプロモーターから発現される。照射又はアグロインフィルトレーション（agroinfiltration）による核への送達後、核においてアクチン２プロモーターから作製された第１転写物は、複製が起こる細胞質へ輸送される。
【００６３】
「反転した」ｃｒ−ＴＭＶプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ１０９２１はｐＩＣＨ４３５１から作製したウイルスプロベクターである（図１１）。これは、ＩｒｅｓからＮｏｓターミネーターまで伸びたＤＮＡ断片が逆方向に反転して構築体を複製不可能にしているという事実によってｐＩＣＨ４３５１とは異なっている。この断片の反転を可能にするために、φＣ３１のＡｔｔＰ部位（ｇｔａ ｇｔｇ ｃｃｃ ｃａａ ｃｔｇ ｇｇｇ ｔａａ ｃｃｔ ｔｔｇ ａｇｔ ｔｃｔ ｃｔｃ ａｇｔ ｔｇｇ ｇｇｇ ｃｇｔ ａｇａ）及びＡｔｔＢ部位（ｔｃｇ ａａｇ ｃｃｇ ｃｇｇ ｔｇｃ ｇｇｇ ｔｇｃ ｃａｇ ｇｇｃ ｇｔｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｇｇｃ ｔｃｃ ｃｃｇ ｇｇｃ ｇｃｇ ｔａｃ ｔｃｃ ａｃｃ ｔｃａ ｃｃｃ ａｔｃ）を転置の末端に位置付ける。
【００６４】
転置部分の反転が機能性ベクターをもたらすかどうかを試験するため、ｐＩＣＨ１０９２１でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉のａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎに用いた。ｐＩＣＨ１０９２１を単独で浸潤させたときはＧＦＰスポットが検出されなかったが、ｐＩＣＨ１０９２１をｐＩＣＨ１０８８１（インテグラーゼ発現ベクターを含有）で形質転換したアグロバクテリウムとともに共浸潤させたときは非常に多くのＧＦＰ複製フォーカスが見られるであろう。
【００６５】
安定な形質転換及びハイブリダイゼーション実験
ｐＩＣＨ１０９２１、ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０及びｐｌＣＨ１４５５０で、ベンサミアナタバコを葉ディスク形質転換によって個別に形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを形質転換体の選択に用いた（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）。両構築体に由来する選択した形質転換体を両方向で交雑させ、未成熟種子を切開し、顕微鏡を用いて青色光下で観察した。ハイブリッド種子においてＧＦＰ発現が検出された。
【実施例４】
【００６６】
トランスジェニックトウモロコシ植物の作製
トウモロコシのユビキチンプロモーターの制御下で、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）を単子葉植物形質転換のための選択可能マーカーとして用いた（図１２）。選択薬剤としてハイグロマイシンＢを２５〜１００ｍｇ／ｌの濃度で適用した。
【００６７】
トランスジェニックトウモロコシ植物を作製するために以下の方法を用いた：
Ａ１８８株、Ｈｉｌｌ株などの成熟及び未成熟胚からカルス培養を誘導した。培地はＣｈｕ（Ｎ６）塩及びビタミンに基づいている（Ｃｈｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ、１８（５）：６５９−６８，１９７５）。
カルス誘導培地及び繁殖培地には３０ｇ／ｌのショ糖、６００ｍｇ／ｌのＬ−プロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ及び０．３％ゲルライトが添加されている。
プレ再生培地は使用しなかった。再生培地は、Ｎ６塩及びビタミン、３０ｇ／ｌのショ糖、２ｍｇ／ｌのゼアチン及び０．０５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含有する。再生培地にはチオ硫酸銀が０．０１〜０．０６ｍＭの濃度で含まれている。
【００６８】
微粒子銃
遺伝子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム（バイオラッド）を用いて微粒子銃を実施した。細胞を、９００〜１１００ｐｓｉで、マクロキャリアー発射点から停止スクリーンまで１５ｍｍの距離で、及び停止スクリーンから標的組織まで６０ｍｍの距離で照射した。破裂ディスクとマクロキャリアーの発射点との距離は１２ｍｍであった。細胞を、４時間の浸透圧前処理後に照射した。
【００６９】
ＤＮＡ−金コーティングを、バイオラッドのオリジナルプロトコール（Ｓａｎｆｏｒｄら、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｗｕ編、２１７、４８３−５０９）にしたがって以下のように行なった：２５μｌの金粉末（０．６、１．０ｍｍ）を５０％グリセロール（６０ｍｇ／ｍｌ）中で、０．２μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ５μｌ、２５μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）及び１０μｌの０．１Ｍ スペルミジンと混合した。混合物を２分間ボルテックスし、続いて室温で３０分間インキュベーションし、遠心（２０００ｒｐｍ、１分）し、７０％及び９９．５％のエタノールで洗浄した。最後に、沈殿を３０μｌの９９．５％エタノール（６μｌ／ショット）に再懸濁した。
【００７０】
新規のＤＮＡ−金コーティング法（ＰＥＧ／Ｍｇ）を以下のように行った：２５μｌの金懸濁液（５０％グリセロル中に６０ｍｇ／ｍｌ）をエッペンドルフチューブ中で５μｌのプラスミドＤＮＡと混合し、次に３０μｌの４０％ＰＥＧ（１．０Ｍ ＭｇＣｌ２中）を添加する。混合物を２分間ボルテックスし、室温で３０分間、混合せずにインキュベートした。遠心（２０００ｒｐｍ、１分）後、沈殿を１ｍｌの７０％エタノールで２回、１ｍｌの９９．５％エタノールで１回洗浄し、最後に３０μｌの９９．５％エタノール中に分散させた。ＤＮＡ−金 エタノール懸濁液のアリコート（６μｌ）をマクロキャリアーディスクにロードし、５〜１０分間乾燥した。
【００７１】
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドで大腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換し、ＬＢ培地中でｍａｘｉ ｐｒｅｐを増殖させ、キアゲンキットを用いてＤＮＡを精製した。
【００７２】
選択
安定な形質転換実験のために、処置細胞を有するフィルターを、ろ過滅菌した適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ））、３％ショ糖を有する固形ＭＳ２培地上に移して遮光した。７日毎に材料を新鮮な選択培地に移した。プレートを暗所保存し、およそ６週間後、植物材料を再生培地及び適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ）の入ったペトリ皿に移した。ペトリ皿を強い光度でインキュベートした。日照時間１６時間。
【実施例５】
【００７３】
ハイブリッド種子の発育を制御するためのバルナーゼに基づいたシステム
バルナーゼ遺伝子を、ラン藻ＰＣＣ６８０３ ＤｎａＢ インテインを用いて分割した。適当な制限部位に隣接したバルナーゼのＮ端部分及びＣ端部分のＤＮＡ断片を営利なＤＮＡ合成会社で化学的に合成した。
【００７４】
Ｎ末端の配列は以下の通りである：
５’ｇｃａａｔｃｇａｔｇ ｇｃａｃａｇｇｔｔａ ｔｃａａｃａｃｇｔｔ ｔｇａｃｇｇｇｇｔｔ ｇｃｇｇａｔｔａｔｃ ｔｔｃａｇａｃａｔａ ｔｃａｔａａｇｃｔａ ｃｃｔｇａｔａａｔｔ ａｃａｔｔａｃａａａ ａｔｃａｇａａｇｃａ ｃａａｇｃｃｃｔｃｇ ｇｃｔｇｇｇａｃｇｔ ｃｃｇｃ３’。
【００７５】
Ｃ末端の配列は以下の通りである：
５’ｃｇｃｃａｔｇｇｇｇ ｔｇｇｃａｔｃａａａ ａｇｇｇａａｃｃｔｔ ｇｃａｇａｃｇｔｃｇ ｃｔｃｃｇｇｇｇａａ ａａｇｃａｔｃｇｇｃ ｇｇａｇａｃａｔｃｔ ｔｃｔｃａａａｃａｇ ｇｇａａｇｇｃａａａ ｃｔｃｃｃｇｇｇｃａ ａａａｇｃｇｇａｃｇ ａａｃａｔｇｇｃｇｔ ｇａａｇｃｇｇａｔａ ｔｔａａｃｔａｔａｃ ａｔｃａｇｇｃｔｔｃ ａｇａａａｔｔｃａｇ ａｃｃｇｇａｔｔｃｔ ｔｔａｃｔｃａａｇｃ ｇａｃｔｇｇｃｔｇａ ｔｔｔａｃａａａａｃ ａａｃｇｇａｃｃａｔ ｔａｔｃａｇａｃｃｔ ｔｔａｃａａａａａｔ ｃａｇａｔａａｇｇａ ｔｃｃｇｃ３’。
【００７６】
バルナーゼのＮ末端をＤｎａＢインテインのＮ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｎ断片をラン藻ＤＮＡから、ＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ１プライマー（５’ｇｔＡＡＧＣＴＴＧＡ ＣＧＴｃａｇａｇａｇ ａｇｔｇｇａｔｇｃａ ｔｃａｇｔｇｇａｇａ ｔａｇ３’）及びＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ２プライマー（５’ｃａＣＴＧＣＡＧｃｔ ａｔａａｔｔｇｔａａ ａｇａｇｇａｇｃｔｔ ｔｃｔａｇ３’）を用いて増幅した。バルナーゼ断片（ＣｌａＩ／ＡａｔＩＩ断片）及びインテイン断片（ＡａｔＩＩ／ＰｓｔＩ断片）をアイコン・ジェネティクス バイナリーベクターにクローングし、ｐＩＣＨ１２７９４クローンを得た（図１４）。
【００７７】
バルナーゼのＣ末端をＤｎａＢインテインのＣ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｃ断片を、ラン藻ＤＮＡから、ｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ１プライマー（ｇｔ ＧＡＧ ＣＴＣ Ｇ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＡ ｇｃｃ ｃａｇ ａａａ ｔａｇ ａａａ ａｇｔ ｔｇｔ ｃｔｃ）及びｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ２プライマー（ｔｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ｔｃｔ ｔｇｃ ｔｃｔ ｔｃａ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｇ ａｃａ ａｔｇ ａｔｇ ｔｃａ ｔ）を用いて増幅した。インテイン断片（ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ断片）及びバルナーゼ断片（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片）をアイコン・ジェネティクス バイナリーベクターにクローニングし、クローンｐＩＣＨ１２８２０を得た（図１４）。
【００７８】
ベンサミアナタバコの葉のアグロインフィルトレーションによって、Ｎ端及びＣ端 バルナーゼ−インテイン融合クローンの機能性を試験した。予想通り、両構築体をともに浸潤させた葉領域は壊死したが、いずれかの構築体を単独で浸潤させた領域は健常のままであった。
【００７９】
ｐＩＣＨ１２７９４及びｐＩＣＨ１２８２０をｐＩＣＢＶ１６にサブクローニングした。これは植物形質転換体をカナマイシンで選択するためのＮｐｔＩＩカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。得られたプラスミドはｐＩＣＨ１４７８０及びｐｌＣＨ１４７７０である（図１４）。
【００８０】
シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）を、ＳＴＭｆｗｄプライマー（ｃｇ ｃａａｔｔｇ ｇｔｇｇｃａａｇａｇｇｔｃｔａｃｃａｔｃｔ）及びＳＴＭｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃａｃｔａｇｔａｔｔ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＭｆｅＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０及びｐＩＣＨ１４７８０（ＥｃｏＲＩ ＳａｃＩで消化）にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００を得た（図１５）。２つのプラスミドのプロモーター領域を配列決定した。ｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００は、ＳＴＭプロモーターの制御下にあるＣ末端及びＮ末端バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８１】
シロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を、ＡＴＨＢ５Ｆｗｄプライマー（ｃｇ ｇａａｔｔ ｃｃａｇｃｔｃａｔｃａａｃｃａａａｃｔｃｔｇｔ）及びＡＴＨＢ５ｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｔｇｃｔｃｔｇｔｇｔｃｔａｇａｃｔａｔｃｃ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４８１０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０から増幅した断片を配列決定し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７８０にサブクローニングし、ｐＩＣＨ１４８２０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０及びｐＩＣＨ１４８２０は、発芽特異的プロモーターの制御下にある５’及び３’バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８２】
４つのプラスミド全てをアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に導入し、シロイヌナズナの形質転換に用いた。全てのトランスジェニック植物は表現型が正常である。トランスジェニック植物を、同一のプロモーター又は異なるプロモーターを有する相補的バルナーゼ構築体を含有する植物と交雑させた。異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を用いたプロモーターの重複領域まで制限することが可能である。Ｆ１種子を乾燥させて種を蒔いた後に収穫した。これらは発芽したが、成長点の欠失により拘束された。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ａ−本発明の一般的原理。第１親植物株Ａを第２親植物株ＢとハイブリダイズさせてＦ１種子を産生する。親株の種子は目的産物を産生しないが、生育可能である。Ｆ１種子では遺伝子供与が生じ、目的産物の産生を可能にする。この場合はその蛍光によって観察されるＧＦＰである（写真中の光の点）。場合により目的産物をコードするウイルスベクターの強力な複製と組み合わせた、目的産物の強力な発現の結果、Ｆ１種子は生育不可能である。
【図１Ｂ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ｂ−植物発育期（フレーム内）。精細胞と雌性配偶体とのハイブリダイゼーション後、目的産物（左の囲み）を発現する種子（Ｆ１種子）が産生される。Ｆ１種子からの植物の発育はブロックされている。右の囲みは、Ｆ１種子が稔性植物に生長できないことを示す。
【図２】図２は、プラスミドｐＩＣＨ４３００のＴ−ＤＮＡ領域、及びハイブリッド種子におけるＢＧＭＶ（インゲンマメモザイクウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。
【図３】図３は、プラスミドｐＩＣＨ１５００のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼ活性の存在下におけるＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。ｐＩＣＨ１５００の遺伝要素は、第１の部分的遺伝子供与によって種子に提供することができる。インテグラーゼφＣ３１はコードされ、第２の部分的遺伝子供与によって種子に提供されることができる。
【図４】図４は、プラスミドｐＩＣＨ５１８４を照射した、インゲンマメの未成熟胚（Ａ、左の大きな写真）、及びマングビーン リョウトクの発芽種子からの子葉（Ｂ、右の小さな写真）を示す。ＧＦＰを目的産物として発現するマメの胚が円で囲まれている。
【図５】図５は、ｐＩＣＨ５１８４ベクターを照射したマングビーンの発芽種子の苗条を日光下（左）及びＵＶ光下（右）で示す。
【図６】図６は、構築体ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１４５３０、及び構築体ｐＩＣ０１のＴ−ＤＮＡ領域のスキームを示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＩＣＨ１０８３０のＴ−ＤＮＡ領域、及びＷＤＶ（コムギ萎縮ウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成のスキームを示す（実施例２を参照されたい）。
【図８】図８は、コムギ胚（Ａ）及びトウモロコシ種子組織（Ｂ）においてコムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）−ＧＦＰ発現カセットを含有するプラスミドｐＩＨ１０８３０を照射し、形質転換後４日の結果を示す。
【図９】図９は、プラスミドｐＩＣＨ１４５２０のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼφＣ３１活性の存在下におけるレプリコン形成のスキームを示す。ＬＩＲ及びＳＩＲはコムギ萎縮ウイルスの長い及び短い遺伝子間領域である；ＭＰ−移行タンパク質；Ｒｅｐ−ウイルスレプリカーゼ；ＲｅｐＡ−ウイルスレプリカーゼＡ。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＩＣＨ４３５１のＴ−ＤＮＡ領域及びＲＮＡレプリコンの形成を示す。ＧＦＰに隣接するグレーのドット領域はＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列を示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＩＣＨ１０９２１のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼφＣ３１活性の存在下におけるＲＮＡレプリコンの形成を示す。
【図１２】図１２はプラスミドｐＩＣＨ１６００の略図を示す。
【図１３】図１３は構築体ｐＩＣＨ１０６８０の略図を示す。
【図１４】図１４は、構築体ｐＩＣＨ１２７８４、ｐＩＣＨ１２８２０、ｐＩＣＨ１４７８０及びｐＩＣＨ１４７７０の略図を示す。
【図１５】図１５は、構築体ｐＩＣＨ１４８００、ｐＩＣＨ１４７９０、ｐＩＣＨ１４８２０及びｐＩＣＨ１４８１０の略図を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド種子（Ｆ１種子）における高収率で安全な目的産物の産生方法に関する。また、本発明は、それにより産生される種子及び前記種子から単離される目的産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の最近の遺伝子工学的方法における主な問題は、以下のように要約することができる：
１． 通常、目的産物の収率が低い。例は薬用タンパク質、酵素、他のタンパク質、ポリマー、糖、多糖類などである。低収率とは、精製／後処理費用が高いことを意味する。
２． 遺伝子改変植物と非トランスジェニック亜種又は野生型相対物との自由な交雑、及び収穫後の農場における「自生」植物の存在による遺伝子汚染。植物は自己複製生物であるため、又はヒトの過ち若しくは故意の行動のため、そのようなイベントは自然発生的に容易に起こる。
【０００３】
２つの問題は同一問題の全く反対の側面である：低収率は、通常、完全な発育及び生殖サイクルを経由する能力も同時に保持する産生体である植物を構築したいという欲求の結果である。発育及び生殖の工程と導入遺伝子発現工程との組み合わせは解決策を与えない。誘導性システム（ＵＳ０５１８７２８７号；ＵＳ０５８４７１０２号；Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０．４５６７−４５７１；Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号；Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号；Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）も器官特異的導入遺伝子発現システム（ＵＳ０５９５５３６１号；ＷＯ０９８２８４３１号；Ｄｅ Ｊａｅｇｅｒら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、１２６５−１２６８）も遺伝子汚染の問題に対する解決策を提供せず、高収率の目的産物も提供しない。上記システムに用いる誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターは全て、例えば「漏出性」の定常活性を有し、これは発生の過程で導入遺伝子サイレンシングを引き起こし、必然的に目的産物の収率が減少する。更に、そのような誘導性システムの制御下にある組換え遺伝子を有するトランスジェニック植物は、例えば組換え生物医薬品を産生する場合に、厳格な生物安全性の基準を満たさないため、収率が唯一の問題ではない。
【０００４】
植物ウイルス配列に基づいた増幅ベクターの使用は、上記問題、特にそのようなベクターを一過性の発現に用いた場合の部分的解決策を潜在的に提供することができる（ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２２９０６８号）。しかしながら、一過性発現実験用ベクターの多くは、選択された植物種、大部分はタバコファミリーのために開発されている（ＵＳ５４６６７８８号；ＵＳ５６７０３５３号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２０８８３６９号）。目的の組換えタンパク質／ＲＮＡを産生するためのウイルスベクターの効率性は、効率的な細胞間移行及び全体移行の能力によっても決定される。後者のパラメータは、種及び亜種依存的であり、したがって、一過性発現のために宿主を選択する自由を厳しく制限する。この問題の潜在的解決策は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクターを有するトランスジェニック植物を設計することである。形質移入又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組み込みを介して外来配列を植物で発現させるために設計されたウイルスベクターの使用について多くの総説に記載されている（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．１９９３、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．、３、９１−９６；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．１９９５、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１５５−１６５；Ｐｏｒｔａ，Ｃ．＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．＆Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１９、２４５−２９１；Ａｗｒａｍら、２００２、Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５８、８１−１２４）。しかしながら、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたアンプリコンベクターを有するトランスジェニック植物を設計する試みは、通常、導入遺伝子サイレンシングの問題に直面し、このアプローチを役に立たないものにしている。最良の場合、ＧＵＳ遺伝子及びＮＰＴ遺伝子に関してＨａｙｅｓと同僚によって８０年代後半に示されたように、強力な構成的プロモーターによって提供されるよりもわずかに高い収率を提供する（Ｈａｙｅｓら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７．２３９１−２４０３）。それ以来、ウイルスレプリコンに基づいたトランスジェニック植物における高収率で生物学的に安全な組換えタンパク質の産生を達成する上で特筆すべき突破口は無かった。
【０００５】
ハイブリッド植物が転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のサプレッサーを提供する、ハイブリッド植物のアンプリコンに関するＭａｌｌｏｒｙと同僚の研究（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）は、問題の部分的解決策を与える。しかしながら、このアプローチは目的産物の収率が高くなく、正常な植物の発育とは両立しなかった。更に、バイオセイフティ問題に対処していなかった。Ｇｏｏｄｉｎｇと同僚（１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８）は、科学的研究で単離コムギ胚におけるジェミニウイルスベクターの複製について報告している。可能な技術応用に取り組んでいなかった。更に、この方法は規模を大きくすることができず、したがって、技術応用に使用されていない。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を、特に高収率で産生するための新規方法を提供することである。本発明の他の目的は、植物産生システムにおいて目的産物、特に目的タンパク質を産生するための生物学的に安全な方法を提供することであり、この方法に関与するトランスジェニック遺伝物質の環境への分布は厳しく制御され、発生する可能性が低い。本発明の更なる目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を産生する方法を提供することであり、目的産物の収率又は品質を損なうことなく、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概説
これらの目的は、Ｆ１種子において目的産物を産生する方法によって達成され、この方法は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによってＦ１種子を得ることを含み、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生ずる。次に目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔くことができる。
【０００８】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【０００９】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【００１０】
更に、上記方法によって産生されるか又は産生可能な種子、及び前記種子から単離される目的産物が提供される。好ましくは、前記種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、より好ましくは前記植物は性的に不稔である。
【００１１】
発明者らは、植物種子（Ｆ１種子）において目的産物を産生する方法を見出した。前記方法に必要な遺伝子供与は、親植物をハイブリダイズすることによって前記種子で生ずる。即ち、いずれの親植物も前記方法に必要な完全な遺伝子供与を有していない。目的産物を産生する種子は、目的産物をそこから単離するときに破壊される。その結果として、本発明の方法は、前記方法に必要な遺伝子供与物が環境に分布する可能性が非常に低いため、生物学的安全性が高い。更に、前記種子から生長する植物は生殖できないため、生物学的安全性を更に高めるためにＦ１種子は不稔であり得る。更に、本発明の方法は、目的産物を産生する上で遺伝子サイレンシングは問題ではないという驚くべき利点を有する。これは、種子における親植物の部分的遺伝子供与物の共存が短いことによるかもしれない。特に、目的産物の産生が基本的に親植物では起こらないため、導入遺伝子サイレンシングを種子に伝達することができない。導入遺伝子サイレンシングがほとんど起こらないため、目的産物を高収率で産生することができる。通常、目的産物は他の植物組織におけるよりも種子においてより安定であるため、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができることが本発明の更なる利点である。これは、本発明の方法全体に柔軟性を与える。
【００１２】
第１及び第２のトランスジェニック親植物は、それぞれ第１及び第２の部分的遺伝子供与物を含有する。部分的遺伝子供与物はトランスジェニックであることが好ましい。第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において遺伝子供与を生ずる。種子において遺伝子供与が生ずると、種子における目的産物の産生が誘発される。ハイブリダイズとは、第１及び第２のトランスジェニック親植物の人工受粉を意味することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２の部分的遺伝子供与物を組み合わせ、Ｆ１種子に遺伝子供与物を供与する。第１及び第２の遺伝子供与物はともに種子における目的産物の産生に必要である。したがって、目的産物は第１又は第２の親植物では発現しない。例えば第１又は第２の部分的供与物からの漏出性発現により、親植物において微量レベルの目的産物の産生が起こり得る。そのような漏出性の発現は、目的産物の経済的産生に対して非常に弱い。しかしながら、第１及び第２の親植物のいずれにおいても目的産物の産生は起こらないことが好ましい。
【００１３】
前記方法によって産生される目的産物は、目的タンパク質、例えば薬用タンパク質であることが好ましい。本発明にしたがい、２、３以上の目的タンパク質を種子で産生することもできる。目的タンパク質は、種子の植物に対して異種タンパク質であることが好ましい。目的タンパク質は酵素でもよい。種子で酵素を産生する場合、産物は、とりわけ前記酵素の作用によって種子で産生される化学化合物でもよい。化学化合物の産生には２、３以上の酵素が必要とされるかもしれない。本発明を用いて産生し得る化学化合物の例としては、ビタミン、ポリマー（例えばポリヒドロキシブチル酸及び他の生分解性ポリエステル）、脂肪酸、脂肪、油、炭水化物、高級イソプレノイドなどが挙げられる。公知の手順にしたがい、目的産物を含有する種子を親植物から収穫し、目的タンパク質又は化学化合物を種子から単離することができる。目的産物が単離される種子発芽していてもよい。目的産物は発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子に蓄積し得る。
【００１４】
遺伝子供与が生ずることによる目的産物又はタンパク質の産生は、多くのさまざまな方法で達成することができる。タンパク質が産生される場合、それぞれの部分的遺伝子供与物はタンパク質のコード配列の一部を提供することができ、前記部分は例えばＤＮＡレベルでの組換え、ＲＮＡレベルでのＲＮＡトランススプライシング、又はタンパク質レベルでのタンパク質トランススプライシングによって種子で組み合わせられることができる。他の一般的なアプローチは、目的タンパク質のコード配列にタンパク質が発現不可能な形態で第１の部分的供与を提供し、遺伝子成分にタンパク質の発現を誘発する第２の部分的供与を提供することである。例えば、植物に固有のポリメラーゼには認識されない異種プロモーターからのコード配列の転写を可能にするＲＮＡポリメラーゼに第２の部分的供与を提供することによって、又は例えばコード配列をプロモーターの制御下に置くことによってコード配列を発現可能にするリコンビナーゼに第２の部分的供与を提供することによって、発現を誘発することができる。種子における目的産物の産生に対する制御を更に増加させるために、産生を誘発するリコンビナーゼ又は他の酵素のコード配列を２つの断片に分割することができる。一方の断片を第１親植物によって種子に提供し、他方の断片を第２親植物によって種子に提供することができる。２つの断片は、２つの異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下で発現させ、Ｆ１種子においてインテイン介在性トランススプライシングによって活性リコンビナーゼ又は酵素に組み立てることができる。このようにして、目的産物の産生開始を制御することができ、例えば種子発育の後期にシフトさせることができる。インテイン介在性トランススプライシングについての詳細は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に見出すことができる。
【００１５】
重要な態様では、遺伝子供与は、ハイブリダイゼーションによって生ずる複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む。複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは目的産物の産生に関与する。目的タンパク質が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡから発現することが好ましい。複製ＤＮＡはレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有することができる。レプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ＤＮＡウイルスレプリカーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＤＮＡウイルス成分を有し得る。同様に、複製ＲＮＡはＲＮＡレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有し得る。ＲＮＡレプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＲＮＡウイルス成分を有し得る。最も好ましくは、ＤＮＡウイルスレプリコン又はＲＮＡウイルスレプリコンは目的タンパク質をコードすることができる。
【００１６】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは植物ウイルスを起源とすることができる。複製ＤＮＡはジェミニウイルスに基づくことができる。複製ＲＮＡの場合、複製ＲＮＡは１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づくことが好ましい。好ましい１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスはトバモウイルスである。複製ＲＮＡはタバコモザイクウイルスに基づくことが最も好ましい。
【００１７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分から生ずることができる。ＤＮＡレプリコンは、第１の部分的遺伝子供与物としてそのゲノムにレプリコンの前駆体を組み込ませた第１親植物を、前駆体からレプリコンを生じさせること（又は複製をもたらすこと）が可能な成分を含有するか又はコードすることができる第２親植物とハイブリダイズさせることによって種子において生ずることができる。第２親植物によって提供される成分は、レプリコンの前駆体を再構築することによってレプリコンを生じさせることが可能な酵素（部位特異的リコンビナーゼ、フリッパーゼ又はインテグラーゼのような）であり得る。この態様の例を図３、図７及び図９に示す。
【００１８】
複製ＲＮＡは、第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずることができる。あるいは、第１の部分的遺伝子供与は、複製ＲＮＡの前駆体を含むことができる。前駆体は、第１親植物のゲノムに組み込まれた複製ＲＮＡのＤＮＡコピーであり得る。次に、複製ＲＮＡは、第２の部分的遺伝子供与物にコードされる成分、特にＲＮＡポリメラーゼによる複製ＲＮＡのＤＮＡコピーの転写によって種子において生ずることができる。ＲＮＡポリメラーゼを前記成分として用いる場合、ＲＮＡポリメラーゼは、複製ＲＮＡのＤＮＡコピーを転写するために用いるプロモーターに適応させる必要がある。
【００１９】
目的産物、特に目的タンパク質が第１の部分的遺伝子供与物にコードされ、第２の部分的遺伝子供与物が例えば産生のための調節機能を提供する場合、雌性親植物によるハイブリダイゼーションに第１の部分的遺伝子供与物を提供することが好ましい。より好ましくは、雌性親植物は雄性不稔である。このようにして、第１（雌性）トランスジェニック親植物由来の花粉は環境に分布せず、第２（雄性）親植物由来の花粉は目的産物をコードしないため、生物学的安全性を更に高めることができる。同様に、遺伝子供与物が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む場合は、複製ＤＮＡ又はＲＮＡは雌性親植物の部分的遺伝子供与によって提供されることが好ましい。
【００２０】
第１の部分的遺伝子供与物及び第２の部分的遺伝子供与物は、種子に伝達できるようにそれぞれの親植物に組み込まれていることが好ましい。この目的のため、これらは親植物のゲノムに安定に組み込まれていることが好ましい。親植物は、植物バイオテクノロジーの公知の方法にしたがって所望の部分的遺伝子供与物を含有するベクターで植物を形質転換することによって産生することができる。親植物は、部分的遺伝子供与物に関して同型であることが好ましい。親植物株は維持されて、自殖によって繁殖することができる。
【００２１】
本発明の種子（Ｆ１種子）を収穫して目的産物の単離に用いることができる。したがって、種子に含有される遺伝子供与物を含めたトランスジェニック材料は環境に分布せず、種子の子孫への移行による繁殖はしない。トランスジェニック材料が種子の子孫へ移行するのを妨げるため、好ましくは、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除され、より好ましくはＦ１種子は不稔である。好ましい態様では、目的産物の強力な発現のために、あるいは複製ＤＮＡ又はＲＮＡの強力な複製のために、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれているか又は種子は不稔である。あるいは又は更に、種子から生長する植物の発育は遺伝子操作によって生殖生長期に達する前にブロックされており、これは正常な植物の発育を妨げる毒性物質又は毒性タンパク質の組織特異的発現によって達成することができる。そのような毒性タンパク質は、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択することができる。好ましくは、植物発育は開花期前にブロックされ、より好ましくは第１葉形成前にブロックされる。
【００２２】
毒性タンパク質（バルナーゼなど、実施例５を参照されたい）はタンパク質断片として発現させることができ、タンパク質断片のタンパク質トランススプライシングによって毒性タンパク質の融合物を生じ、機能性毒性タンパク質を形成する。毒性タンパク質を２つの断片として発現させる場合、これら２つの断片は、２つの異なるプロモーター、特に２つの異なる組織特異的プロモーター又は２つの異なる発生学的に活性なプロモーターの制御下で転写させることができる。したがって、機能性毒性タンパク質の形成は、組織特異性が異なる２つのプロモーターに依存し得る。即ち、毒性タンパク質は、２つのプロモーターが活性な組織において活性型で形成される。このアプローチは、しばしば漏出性発現をする１つの組織特異的プロモーターによって達成されるよりも、機能性毒性タンパク質の発現に対してより厳格な制御を可能にする。更に、このアプローチは、新規発現パターン、例えば公知の組織特異的プロモーターでは達成できない発現パターンの達成を可能にする；２つの断片のために異なる組織特異的プロモーターを組み合わせることにより、可能な発現パターンの組み合わせの多様性を広げる。
【００２３】
本発明の方法は、大規模適用に完全な可能性を示す。大規模とは、多くの植物を同時に、例えば温室で適用することを意味する。最も好ましくは、大規模とは農場での適用を意味する。大規模適用では、第１親植物株の多くの植物と第２親植物株の多くの植物は、第１親植物株の植物と第２親植物株の植物との効率的な人工受粉を可能にするために、互いに近接して蒔かれるか又は植えられる。自家受粉を避けるために、例えば第１又は第２の親植物のいずれかの雄性不稔を用いる公知のハイブリッド種子産生方法を本発明の方法と組み合わせることができる。そのような方法の１例は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に記載のものである。
【００２４】
本特許出願の優先権証明書ＤＥ １０３ ２５ ８１４号は、本明細書中にその全体が援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の最良の形態及び詳細な説明
本発明の発明者らは、驚くべきことに、高率細胞分裂は、少なくとも双子葉植物の胚におけるウイルス複製を提供するのに単独では十分でなく、その上、胚発育期に依存し、通常、種子発育のより後期にシフトするすることを発見した。他の驚くべき発見は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスに基づくレプリコン前駆体がトランスジェニック種子（Ｆ１種子）における活性化によって複製する能力である。我々の知る限りでは、この現象について記載する先行技術ない。
【００２６】
本発明の方法では、植物の生殖と植物に基づいた目的産物の産生とは厳密に分離しており、産物の収率が大幅に向上する。目的産物を産生するために植物の発育及び生殖に通常必要とされる資源を、例えば、好ましくは特定の最も好適な発育期又は初期発芽期に、種子において目的産物を産生することによって利用することは、遺伝子汚染を制御することに役立つ。
【００２７】
発育期、より詳細には配偶子融合及び受精期を、種子生長期を産生期に変換する遺伝子スイッチとして用いることを提唱する。遺伝子供与の異なる成分を異なる親植物へ操作した。前記成分（部分的遺伝子供与物）は、親植物内では不活性であるが、ハイブリダイゼーション行程後に遺伝子供与を生じ、それにより目的産物の産生を誘発する。好ましい態様では、複製ＤＮＡ又はＲＮＡ（増幅工程）を産生に使用し、それにより胚及び／又は胚乳産生を支配する高収率産生システムが作製され、発育種子に目的産物の蓄積をもたらし、一方で、種子をその後の有性生殖ができないようにすることが好ましい。目的産物が蓄積し、発育種子、成熟種子、又は発芽種子から単離することができる。
【００２８】
本発明の基礎は、以下の驚くべき発見にある：
（ａ） ウイルスベクターは、種子発育のより後期及び種子発芽の初期に植物種子において複製可能であるが、特に双子葉植物では、種子形成の初期段階には全く又はほとんど不可能である；
（ｂ） 染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクター前駆体は、アクチベーター配列を提供する植物との交雑によって、ハイブリッド種子内で効率的に活性化されることができる。
【００２９】
植物発育の費用で染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたレプリコンを種子において活性化することはこれまでに示されていない。これは本発明の方法を厳重に制御することを可能にし、導入遺伝子サイレンシングを誘発するか又は種子発育を極初期に妨げ得る漏出性の複製を妨げる。
【００３０】
Ｂｅａｎ Ｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス（ＢＧＭＶ）に基づいたレプリコンの設計は、実施例１に記載され、図２及び図３に示されている。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をレポーター遺伝子として有するベクターｐＩＣＨ４３００を用いて、ジェミニウイルスを複製するために胚のさまざまな発育期の能力を試験した。これらの実験の結果を図４に示す。照射した若いマメの胚の表面に可視化したウイルス複製の兆候はない（ＧＦＰ発現なし）が、多くの進行した発育後期の細胞に明瞭なＧＦＰ発現が検出されたことは明らかである（図４）。種子発芽のあいだにも効率的複製が起こる（図５）。コムギＤｗａｒｆウイルス（ＷＤＶ）に基づいたベクターの設計は実施例２に記載されている。図７は、一過性発現実験のためのＷＤＶベクターを概略的に示す。コムギ及びトウモロコシの種子を用いた実験結果を図８に示す。ＷＤＶベクターはコムギ及びトウモロコシの胚において効率的に複製するが、トウモロコシの胚乳ではより効率が低いことが明らかである。種子発育の望ましくない段階（極初期）での漏出性の複製は、種子生長及びこのアプローチの技術適用性を危うくするため、これらのデータは本発明の実行可能性を確立する上で重要である。また、部位特異的組換えによる複製行程を誘発するための種子特異的プロモーターの幅広い選択を可能にする。胚発育初期段階においてウイルスベクターをその部分の組換え介在反転によって活性化することは（図３及び図９）、レプリコン前駆体を複製適格期にし得るが、胚が発育のより進行した段階（「複製適格期」）に達するまで複製は起こらないことが好ましい。
【００３１】
プロモーターの選択はこの技術の効率に影響する。誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターを用いて、種子における高収率産生を誘発することができる。誘導性プロモーターは、誘導条件によって２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるもの、及び生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるもの。第１カテゴリーの例は、とりわけ熱誘導性プロモーター（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性プロモーター（ＵＳ０５８４７１０２号）、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号）、及びテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学的に誘導可能なシステムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的に誘導可能なシステムの総説としては：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、１４６−１５１）を参照されたい。しかしながら、本発明を実施する上で最も好適なプロモーターは種子特異的プロモーターである。
【００３２】
本発明の実施に有用であり得る種子特異的プロモーターには幅広い選択肢がある。そのようなプロモーターには、とりわけ、エンドウマメ レクチン（Ｐｓｌ１）遺伝子のプロモーター（ｄｅ Ｐａｔｅｒら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、５１５−５２３）、ＵＳＰと呼ばれるＶｉｃｉａ ｆａｂａ非貯蔵性種子タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、オーツムギ グロブリン遺伝子ａｓｇｌｏ５の胚乳特異的プロモーター（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６、２０３−２１０）、トウモロコシ Ｏ２遺伝子のプロモーター（Ｇａｌｌｕｓｃｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１５、３９１−４００）、後期胚形成において豊富な遺伝子（ｌｅａ）、具体的にはシロイヌナズナ胚のいたるところに発現するＡｔＥｍ６のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、β−ファセオリン及びβ−コングリシニンのプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６、４４７−４５８）、インゲンマメのａｒｃｅｌｉｎ−５遺伝子のプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎｓら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２０、１０９５−１１０４）、Ｄ−ホルデイン遺伝子プロモーター（Ｈｏｒｗａｔｈら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１９１４−１９１９）、オオムギ リポキシゲナーゼ１（Ｌｏｘ１）遺伝子のプロモーター（Ｒｏｕｓｔｅｒら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５．４３５−４４０）などが含まれる。
【００３３】
目的タンパク質の発現を駆動するために選択したプロモーターの適用性を予備的に評価するため、ｐＩＣ０１由来の構築体（図６）を用いた一過性発現実験に、ＧＵＳレポーター遺伝子を使用した。ここで、３４Ｓプロモーターは種子特異的プロモーターに置換されている。インテグラーゼ ＰｈｉＣ３１の発現を駆動するため、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びコメ アクチン１遺伝子の構成的プロモーター（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐＩＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）を含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した。他の部位特異的リコンビナーゼの多くは本発明に用いることができる。そのようなシステムの例としては、とりわけ、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−Ｌｏｘシステム（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２５、７２９−７３６）、サッカロミセス・セレビジエ由来のＦｌｐ−Ｆｒｔシステム（Ｂｒｏａｃｈら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２９、２２７−２３４）、チゴサッカロミセス・ｒｏｕｘｉｉ由来のＲ−ＲＳシステム（Ａｒａｋｉら、１９８５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８２、１９１−２０３）が挙げられる。
【００３４】
天然宿主及び非宿主植物種の胚におけるウイルスレプリコンに関する先行技術文献がある（Ｗａｎｇ＆Ｍａｕｌｅ、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６、７７７−７８７；Ｇｏｏｄｉｎｇら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８；Ｅｓｃａｌｅｒら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、３１８−３２５；Ｕｇａｋｉら、１９９１、１９、３７１−３７７）。細胞間移行及び全体移行などの宿主特異性を決定するウイルスレプリコンの特定の特性を犠牲にすれば、宿主範囲が著しく増加すると思われる。そのようなウイルスレプリコンは、種子細胞を含めた広範な植物種の細胞で効率的に複製することができると思われる。ここで、前記植物種はウイルスレプリコンに対する天然宿主ではない。そのような場合、ウイルスレプリコンの全体移行及び細胞間移行は影響を受けるが、複製能は影響を受けない。実際に、本発明の原理にしたがって、ウイルスに基づいたベクターを構築するために、さまざまな分類群に属するウイルスを用いることができる。これは、ＲＮＡ含有ウイルス及びＤＮＡ含有ウイルスの両方にあてはまる。それらの例を以下に示す（本明細書にわたり、それぞれの基準種名はそれが属する目、ファミリー及び属の名称によって先行される。目、ファミリー及び属の名称は、ＩＣＴＶに承認されている場合はイタリック体である。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（俗名）は標準体で示す。属又はファミリーについて正式命名ないウイルスが示されている）：
ＤＮＡウイルス：
環状ｄｓＤＮＡウイルス：ファミリー：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ、基準種：ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：カリフラワーモザイクウイルス、属“ＳｂＣＭＶ様ウイルス”、基準種：ダイズｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅウイルス、属“ＣｓＶＭＶ様ウイルス”、基準種：Ｃａｓｓａｖａ ｖｅｉｎ モザイクウイルス、属“ＲＴＢＶ様ウイルス”、基準種：コメｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ、属：“Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ様ウイルス”、基準種：Ｐｅｔｕｎｉａ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス；
環状ｓｓＤＮＡウイルス：ファミリー：Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ（サブグループＩ ジェミニウイルス）、基準種：トウモロコシ ｓｔｒｅａｋウイルス、属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ（サブグループＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐウイルス、属：Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ（サブグループＩＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ｂｅａｎ ｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス；
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：ファミリー：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：アルファルファ モザイクウイルス、属：Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｓｔｒｅａｋウイルス、属：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｂｒｏｍｅモザイクウイルス、属：Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：キュウリモザイクウイルス；
ファミリー：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｂｅｅｔ ｙｅｌｌｏｗｓウイルス、属：Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ、基準種：レタス ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｙｅｌｌｏｗｓウイルス、ファミリー：Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｃｏｗｐｅａモザイクウイルス、属：Ｆａｂａｖｉｒｕｓ、基準種：ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｗｉｌｔ ウイルス １、属：Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｒｉｎｇｓｐｏｔウイルス；
ファミリー：Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ、基準種：ジャガイモウイルスＹ、属：Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｒｙｅｇｒａｓｓ モザイクウイルス、属：Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
ファミリー：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ、基準種：ｐａｒｓｎｉｐ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋウイルス、属：Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ、基準種：コメ ｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；ファミリー：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｒｉｎｇｓｐｏｔウイルス、属：Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：トウモロコシ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｎｅｃｒｏｓｉｓウイルス、属：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ、基準種：トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス、
Ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ ｓｓＲＮＡウイルス、属：Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ、基準種：リンゴｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｌａｔｅｎｔウイルス；属：Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｐｅａ ｅｎａｔｉｏｎ モザイクウイルス、
属：Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｓｏｉｌ−ｂｏｒｎｅ コムギ モザイクウイルス、属：Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆウイルス；
属：Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ、基準種：オオムギ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆウイルス；属：Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ、基準種：トウモロコシ ｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス；属：Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ、基準種：ジャガイモウイルス Ｘ；属：Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、基準種：タバコｒａｔｔｌｅウイルス、
属：Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス；属：Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｔｕｒｎｉｐ 黄斑モザイクウイルス；属：Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ、基準種：ｃａｒｒｏｔ ｍｏｔｔｌｅウイルス；Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｓＲＮＡウイルス：目：Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ、ファミリー：Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、基準種：レタス壊死性黄変病ウイルス、属：Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、基準種：ジャガイモ黄萎病ウイルス；
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｓＲＮＡウイルス：ファミリー：Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
ｄｓＲＮＡウイルス：ファミリー：Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｗｈｉｔｅ クローバー ｃｒｙｐｔｉｃウイルス１、属：Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｗｈｉｔｅ クローバー ｃｒｙｐｔｉｃウイルス２、ファミリー：Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ、基準種：Ｆｉｊｉ ｄｉｓｅａｓｅウイルス、属：Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ、基準種：ｗｏｕｎｄ ｔｕｍｏｒウイルス、属：Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ、基準種：コメｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未命名ウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種：バナナ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐウイルス、種：ｃｏｃｏｎｕｔ ｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙウイルス、種：ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ クローバー ｓｔｕｎｔウイルス、
ゲノム：ｄｓＤＮＡ、種：キュウリ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｉｎｇウイルス；ゲノム：ｄｓＲＮＡ、種：タバコ矮化ウイルス、
ゲノム：ｓｓＲＮＡ、種：ＧａｒｌｉｃウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシ ｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅ モザイクウイルス、種：ｏｌｉｖｅ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ２、種：ｏｕｒｍｉａ メロンウイルス、種：Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス；
Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ及びＶｉｒｏｉｄｓ：Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ：ｓｓＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅウイルス：サブグループ２ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅウイルス、基準種：タバコｎｅｃｒｏｓｉｓ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ、
Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＲＮＡ、サブグループ２ Ｂ型ｍＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ、サブグループ３ Ｃ型線状ＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ、サブグループ４ Ｄ型環状ＲＮＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ、
Ｖｉｒｏｉｄｓ、基準種：ジャガイモｓｐｉｎｄｌｅ ｔｕｂｅｒ ｖｉｒｏｉｄ。
【００３５】
大部分は、植物ウイルス起源のベクターは、植物において自律複製可能なプラスミド（レプリコン）として本発明に用いられる。しかしながら、非ウイルス配列を用いるそのようなプラスミドの操作に必要な原理は公知である。例えば、植物細胞に由来する多くの推定複製起点が記載されている（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１６１−１６２；Ｈｅｒｎａｎｄｅｓら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、４１３−４２２；Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１７３−１８２；Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。高等植物ゲノム由来の自律複製配列（ＡＲＳ配列）は、酵母及び高等動物のＡＲＳ配列と共通した構造的特長及び配列的特徴を有することが示されている（Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。植物ＡＲＳ配列はサッカロミセス・セレビジエ中のプラスミドに自律複製能を付与可能である。酵母においてプラスミドの自律複製を促進可能なトウモロコシの核ＤＮＡ配列の研究により、トウモロコシゲノム内に２つのファミリーの高度反復配列を表すことが示された。それらの配列は特徴的なゲノムハイブリダイゼーションパターンを有する。典型的には、それぞれの１２〜１５ｋｂのゲノム断片上にＡＲＳ相同配列のコピーがたった１つ存在した（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：１６１−１６２）。植物起源のレプリコンの他の供給源は、植物において異種遺伝子の増幅及び発現を刺激することができる植物リボソームＤＮＡスペーサー配列である（Ｂｏｒｉｓｊｕｋら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１８、１３０３−１３０６）。高率増幅による所望の効果は、強力なプロモーターを用いることによっ達成することもできる。そのようなプロモーターは高コピー数の目的転写物を提供することができ、複製ベクターに類似の最終結果を生ずる。
【００３６】
したがって、本発明で意図するレプリコン又は前駆体ベクターは必ずしも植物ウイルスに由来する必要はない。植物ＤＮＡウイルスは、標的ＤＮＡの形質転換に特に有用なレプリコン（ベクター）を操作する容易な方法を提供するが、植物ＲＮＡウイルス又は非植物ウイルスであっても、全体的に又は部分的にこれに由来する配列で作製されるベクターは可能である。植物ウイルスに基づいたレプリコンは明らかに有益である。そのようなレプリコンは、複製に加えて、例えば細胞間移行及び長距離移行のための更なる有用な機能を提供することができる。更に、それらは、感染植物からウイルスを根絶するための公知の方法を用いることによって、しばしば植物細胞から帰納的により容易に除去することができる。
【００３７】
本発明では、ウイルスベクターの特定部分の部位特異的組換え（反転）によって活性化することができるウイルスレプリコンを用いることが好ましい（図３、図９及び図１１を参照されたい）。これらのレプリコンはＤＮＡウイルス（ＢＧＭＶ、ＷＤＶ）及びＲＮＡウイルス（ＴＭＶ）に基づくことができる。部位特異的組換えによるＤＮＡウイルスベクターの再構築は、ウイルスＤＮＡの複製開始に十分であることは図面から明らかである。ＴＭＶに基づくベクターの場合、ＤＮＡの再構築のみでは複製開始に通常十分でないため、状況が異なる。そのようなＲＮＡレプリコンの増幅を誘発するためには転写が必要とされる。転写を駆動する構成的プロモーター（図１１を参照されたい）は誘導性プロモーター又は種子特異的プロモーターに置換し得るため、こうした必要性は、ＲＮＡに基づいたアンプリコンの発現のために更なる制御工程の使用を可能にし、、増幅の空間的及び一時的制限方法を厳重に制御し、より柔軟性を与える。
【００３８】
発明を効率的に実施するには、可能な最高収率を提供する最良の可能な組み合わせを見出すために、それぞれのウイルスレプリコンのタイプについて種子特異的プロモーターの多くの異なる組み合わせを解析することが好ましい。
【００３９】
本発明の重要な要素は、ハイブリッド種子が子孫を作れないということである。即ち、例えば稔性植物への発育が不可能であることにより、種子は不稔であることが好ましい。多くの場合、ウイルスベクターの複製はこの所望の効果を提供し、したがって更なる種子の発育を損なうことが期待される。しかしながら、目的産物を提供するベクターの複製十分でない場合、所望の効果を達成するために追加の技術を適用することができる。実施例５には、ハイブリッド種子においてインテイン介在性トランススプライシングによってくみ立てられる細胞毒性遺伝子（バルナーゼ）の使用について記載されている。インテインが融合したバルナーゼ断片は異なる親植物中に局在し、異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下にあることができる。断片はともにハイブリダイゼーションによってもたらされ、インテイン介在性トランススプライシングの結果として細胞毒性産物を形成することができる。異なるが部分的に重複する発現パターンを有する異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を、バルナーゼ断片の発現をともに駆動する同一の組織特異的プロモーターを用いるよりも、必要とする組織に正確な方法で制限することができる。シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）とシロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を実施例５で使用し、２つのバルナーゼ断片の発現を駆動させた（図１５を参照されたい）。これらのプロモーターは、活性が発芽種子の頂端分裂組織に重複するため、好適なバルナーゼ活性パターンを提供する。多くの他の発生学的に調節されたプロモーター及び組織特異的プロモーターを本態様の実施に用いることができるため、本発明はこれら２つのプロモーターの使用に限定されない。本態様に有用なプロモーターの例としては、光合成の活性な組織で発現されるシロイヌナズナＨＢＰ−１ａ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｋａｍｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４８、５７３−５８２）、種子特異的ｎａｐｉｎ遺伝子プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１０１９−１０２７）、発生学的に調節されたｒｂｃＳ遺伝子のプロモーター（Ｍａｎｚａｒａら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３、１３０５−１３１６）、などが挙げられる。
【００４０】
実施例では、主に植物細胞におけるアグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ送達を使用し、Ｔ−ＤＮＡは第１及び／又は第２の部分的遺伝子供与物をベクターとして含有する。植物細胞にベクターを送達するために、微粒子銃、エレクトロポーレーション又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換による細胞へのベクターの直接導入のような異なる方法を用いてもよい。アグロバクテリウム介在植物形質転換が好ましい。したがって、アグロバクテリウムによって運搬されるＴｉ−プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、粒子又は微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）などのさまざまな好適な技術によってＤＮＡで植物細胞を形質転換することができる。原理上、例えばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６号；ＷＯ０９４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポーレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）などの他の植物形質転換法を用いることもできる。形質転換法の選択は、形質転換すべき植物種に依存する。例えば、単子葉植物の形質転換には微粒子銃が好ましく、双子葉植物には通常アグロバクテリウム介在形質転換がより良い結果与えることができる。
【００４１】
本発明は、高等多細胞植物を用いて実施することが好ましい。本発明での使用に好ましい植物には、農学的及び園芸学的に重要な種に関連した植物種が含まれる。本発明に使用するための一般的な作物には、アルファルファ、オオ麦、インゲン豆、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズ豆、ルピナス、キビ、オート麦、エンドウ豆、落花生、米、ライ麦、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、大豆、ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｒｉｔｉｃａｌｅ、クズイモ、ハッショウ豆、ソラ豆、コムギ、フジ、及びｎｕｔ ｐｌａｎｔｓが含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、限定されるものではないが、イネ科、キク科、ナス科及びバラ科の代表的なものが挙げられる。
【００４２】
本発明での使用に更に好ましい種は、以下の属に由来する植物である：シロイヌナズナ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ、カンキツ、Ｃｏｆｆｅａ、ジュズダマ、キュウリ、Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、Ｌｅｎｓ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、Ｎｅｍｅｓｉａ、タバコ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、Ｐｈｌｅｕｍ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、セネシオ、セタリア、Ｓｉｎａｐｉｓ、ナス、ソルガム、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、カカオ、ジャジクソウ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ、及びＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ並びにその他多くのもの。
【００４３】
好ましいのは、ハイブリッド種子産生システムが存在する植物である。第１及び第２の親植物のハイブリッドである種子を高率で産生するためには、これらのシステムを、本発明とともに使用することが好ましい。最も好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、チカラシバ、ダイズ、ナタネ種子、カノーラ、タバコ、及びコメである。
【００４４】
本発明を用いてセンス方向又はアンチセンス方向に発現させることができる目的タンパク質、又はその断片には以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ｐｏｌｙｆｒｕｃｔａｎスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ｈｅｒｂｉｃｏｌａ リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ｋｅｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、アセトアセチル ＣｏＡ レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、アシルキャリアータンパク質、ｎａｐｉｎ、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、ｔｒａｉｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ 光合成 ｏｒ 植物細胞のプラスチド機能、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、ｃｈｌｏｒｏｍｕｃｏｎａｔｅ シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、ウンベルラリア ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｃ１２：０ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、６−不飽和化酵素、植物細胞における脂肪酸のｐｅｒｏｘｙｓｏｍａｌ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎにおいて酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインから成るタンパク質融合物、オレオシンタンパク質と融合タンパク質を脂質相に標的化可能な目的タンパク質との翻訳融合物、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、プラスチドの内側エンベロープ膜にある成熟リン酸輸送体タンパク質のアミノ末端疎水性領域と前記膜に標的化された目的タンパク質との融合物など。
【００４５】
ヒト又は動物のいかなるタンパク質も、特に本発明のシステムを用いたハイブリッド種子において発現させることができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、以下のタンパク質（薬用タンパク質）が挙げられる：免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカイン及びその受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、線維素溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、並びに上記タンパク質の融合体、変異体型及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質。
【００４６】
本発明の方法は、トランスジェニックコード配列の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を抑制するために、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質又はその機能保存的変異体若しくは断片をコードする遺伝子を植物において発現させることを更に含むことができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質遺伝子又はその機能保存的変異体若しくは断片を、トランスジェニックコード配列を有する同一ベクター上で又は余分のベクター上で植物に提供することができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質は、ウイルス又は植物起源であることが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質の例は、ジャガイモウイルスＸ ｐ２５タンパク質、アフリカ キャッサバモザイクウイルス ＡＣ２タンパク質、コメ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅウイルスＰ１タンパク質、トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス １９Ｋタンパク質、ｒｇｓ ＣＡＭ、又はこれらのタンパク質のうちの１つの機能保存的変異体若しくは断片である。機能保存的変異体又は断片は、上記タンパク質の１つに対し、７５％の配列同一性を有することが好ましく、好ましくは少なくとも７５％同一である。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質及びその使用に関する詳細は、ＷＯ０１３８５１２号に見出すことができる。
【実施例１】
【００４７】
ＢＧＭＶベクター
ＧＦＰを有するジェミニウイルス複製ベクターのクローニング：
ｐＵＣ１９ ＤＮＡを、ｄｎａａｐｒ７プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇｔ ｃｔａ ｇａｃ ｔｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ｔｔｔ ｔａｃ ａａｃ）及びｄｎａａｐｒ８プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇａ ａｃａ ａｔｔ ｇｃｔ ｃｇａ ｇｇｃ ｇｔａ ａｔｃ ａｔｇ ｇｔｃ ａ）を用いて増幅し、増幅断片をＰｓｔＩで消化し、再連結した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１１４４は、ｐＵＣ１９に類似するが、ポリリンカーがＸｈｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＰｓｔＩで置換されている。ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したインゲンｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス（ＢＧＭＶ）単離物ＤＳＭＺ ＰＶ−００９４を感染させたインゲンマメ組織から、ＤＮＡを抽出した。ＢＧＭＶ共通領域を包含するゲノムの断片（ＣＲ；ＢＧＭＶの複製起点を含有）を、ｄｎａａｐｒ３プライマー（ｇｇｇ ａａｔ ｔｃａ ｃｔａ ｇｔａ ａａｇ ａｔｃ ｔｇｃ ｃｇｔ ｃｇａ ｃｔｔ ｇｇａ ａｔｔ ｇ）及びｄｎａａｐｒ４プライマー（ｃａａ ｔｇｃ ａｔｃ ａｔｇ ｇｃｇ ｃａｔ ｃａｃ ｇｃｔ ｔａｇ ｇ）を用いてＰＣＲで増幅し、ＭｆｅＩ及びＰｓｔＩで消化したｐＩＣＨ１１４４中にＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１１５６を得る。ｐＩＣＨ１１５６中のＢＧＭＶ挿入物を配列決定した。他の２つのＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノム断片を、ＢＧＭＶを感染させたインゲンマメＤＮＡから、ｄｎａａｐｒ９プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａａｇ ｇａｔ ｃｃｔ ｃｔｇ ｇａｃ ｔｔａ ｃａｃ ｇｔｇ ｇａａ ｔｇｇ）／ｄｎａａｐｒ１３プライマー（ｃｇｃ ｔｃｇ ａｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ａｃｔ ｔｇｇ ａａｔ ｔｇｔ ｃ）ペア、及びｄｎａａｐｒ５プライマー（ｇａａ ｇａｔ ｃｔｇ ｃａａ ｇａｇ ｇａｇ ｇｔｃ ａｇｃ ａ）／ｄｎａａｐｒ１０プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａｔｃ ｔａｔ ｔｔｃ ｔａｔ ｇａｔ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｃ）ペアを用いて増幅させた。これらの断片の合計は、コートタンパク質のない完全長ＢＧＭＶゲノムになる。これらの断片をそれぞれＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ及びＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｐＩＣＨ１１５６に、３通りの連結法でクローニングした。得られたプラスミドは、重複したＢＧＭＶ ＤＮＡＡ共通領域に隣接するコートタンパク質遺伝子のない１つの完全長ＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノムを含有する。試験のために３つのクローン：ｐＩＣＨ１６６３、１６６４及び１６６７を保存した。コートタンパク質遺伝子がＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを含有するマルチクローニング部位に置換されている。ｐＩＣ０１１（ｐＵＣ１８内にＨｂｔプロモーター−合成ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーター）由来の合成ＧＦＰ（ＳＧＦＰ）コード配列を、ｐＩＣＨ１６６３、ｐＩＣＨ１６６４及びｐＩＣＨ１６６７のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位にＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７を得る。ＧＦＰをコートタンパク質プロモーターの制御下に置く。クローンｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７の機能性に関して試験するために、ベンサミアナタバコ及びインゲンマメの切除葉に、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ粒子送達システム１０００／ＨＥ（バイオラッド）を用いて照射した。翌日、３つの構築体全てに関し、両方の種の葉においてＧＦＰ発現上皮細胞が検出されるであろう。
【００４８】
バイナリーベクターでのクローニング
ｐＩＣＨ１６９４のＸｈｏＩ−ＮａｒＩ断片を、ＸｈｏＩ及びＣｌａＩで消化したｐＩＣＢＶ１１にサブクローニングすることによって、ｐＩＣＨ１６９４のプロレプリコン部分を含有するバイナリーベクターを作製した。得られたクローンｐＩＣＨ４３００（図２）は、ＢＧＭＶコートタンパク質プロモーターの制御下にあるＧＦＰ遺伝子、及び重複ＣＲ間にＡＩ１／２／３遺伝子を含有する。
【００４９】
「反転した」ジェミニウイルスプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ７３００はｐＩＣＨ４３００に類似するが、いくつかの制限酵素部位（ＳａｌＩ、ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＢｇｌＩＩ）が、制限部位が重複する変異プライマーを用いたＰＣＲで除去されている。レプリカーゼの部分と共通領域うちの１つを含有する断片の転置によって複製不可能なクローンｐＩＣＨ１５００（図３）を作製するための開始点としてｐＩＣＨ７３００を用いた。ＡｔｔＰ及びＡｔｔＢ組換え部位を転置の先端に置き、インテグラーゼを提供することによって転置領域の反転を可能にし、それにより機能性ベクターを得る。ＡｔｔＢ及びＡｔｔＢ部位は人工イントロン配列に隣接しており、インテグラーゼ介在性組換えによって生ずるＡｔｔＲ配列の、Ａｌ１転写物からのスプライシングを可能にする。
【００５０】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適格性を試験する：
ｐＩＣＨ４３００プラスミドＤＮＡを一連の植物組織に照射した。インゲンマメの葉、成熟種子、水分補給したマメの子葉及び発芽苗、並びに未成熟胚において明るい蛍光細胞が検出されるであろう。ＧＦＰ蛍光によってアッセイしたように、胚発育期の全てにおいてジェミニウイルスの複製を起こしやすいわけではない。長さ４〜５ｍｍまでの子葉がある小さな白い胚にはＧＦＰ発現細胞がなかった。逆に、より緑色したより大きな子葉はジェミニウイルスの複製に非常に適していた。
【００５１】
タバコ、ベンサミアナタバコ、シロイヌナズナ、Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ ｖｉｏｌａｃｅｓ及びマングビーンを含めた他の種も、少なくとも葉において、ジェミニウイルスの複製を起こしやすかった。
【００５２】
ＰｈｉＣ３１インテグラーゼクローンのクローニング
ｐＩＣＰ１０１０は、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（プロモーター、第１エクソン、第１イントロン、及びアクチン２遺伝子の第１エクソンの１０ヌクレオチドを含有する１３４４ヌクレオチド断片）に融合したストレプトミセスファージＣ３１インテグラーゼ（ｆｒｏｍ Ｄａｖｉｄ Ｏｗ、植物遺伝子発現センター、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ−Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ａｌｂａｎｙ、ＣＡ９４７１０、ＵＳＡ）を含有するバイナリーベクターである。核へのインテグラーゼの輸送を増加させるために、ＳＶ４０ Ｔ抗原由来の核局在シグナル（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｎｄｒｅａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０、２２９９−２３０６）を、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼのＣ末端に融合させた。ｃ３１ｐｒ１プライマー（ｇｃａ ｃｇｃ ｃｇａ ａｇｇ ｃｇａ ｃｇａ ａｇ）及びＮＬＳ配列（３１ｎｌｓ１：ｇｇａ ｔｃｃ ｔａａ ａｃｃ ｔｔｃ ｃｔｃ ｔｔｃ ｔｔｃ ｔｔａ ｇｇｃ ｇｃｃ ｇｃｔ ａｃｇ ｔｃｔ ｔｃｃ ｇｔｇ）を含有する伸長部を含有するＰＣＲプライマーを用いたｐＩＣＰ１０１０からのＰＣＲ増幅によってＮＬＳ配列をインテグラーゼ配列に付加し、ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＰ１０１０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１０８８１（図６）を得る。異なるプロモーターを容易にサブクローニングするために、ｐＩＣＨ１０８８１からインテグラーゼ及びＮｏｓターミネーターをＰｓｔＩ／ＡｐａＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１へサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１３９０１（示していない）を得た。このベクターは、Ｎｏｓプロモーター−ＮｐｔＩＩコード配列−Ｎｏｓターミネーター 選択カセット及びポリリンカーＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ−ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。適当な種のゲノムＤＮＡから、遺伝子特異的プライマーを用いていくつかのプロモーターを増幅し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１にクローニングした。前記プロモーターを更にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣ０１にサブクローニングし（図６）、発育種子の微粒子銃を用いてＧＵＳレポーター遺伝子との融合物としてそれらの活性について試験した（示していない）。
【００５３】
インテグラーゼＰｈｉＣ３１の発現を駆動するために、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びコメ アクチン１遺伝子の構成的プロモーターを含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐIＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐIＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）。
【００５４】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ベンサミアナタバコの葉ディスクを、構築体ｐIＣＨ１５００、ｐＩＣＨ４５５０及びｐＩＣＨ４５４０（インテグラーゼ）で形質転換し、各構築体について独立した形質転換体を得た。ｐＩＣＨ１５００の１０個の形質転換体を、各インテグラーゼ構築体の少なくとも５つの形質転換体と交雑させた。未成熟発育種子を切開し、ＧＦＰ蛍光を顕微鏡を用いて青色光下で観察した。
【実施例２】
【００５５】
ＷＤＶベクター
ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したコムギｄｗａｒｆウイルス（ＷＤＶ）を感染させたコムギ葉サンプルからＤＮＡを抽出した。互いに逆向きでゲノムのユニークＥｃｏＲＩ部位が重複するプライマーを用いて、ＷＤＶの完全長ゲノム（ｃａ．２．８ｋｂ）をＰＣＲで増幅させた：
ＦｗｄｖＥ１ ａＧＡＡＴＴＣａｃａｃｃｇａｔｇｇｇｃｔｃ
ＲｅｗｄｖＥ１ ｔＧＡＡＴＴＣｔｇｃａｃａｃｔｃｃｃａｃｇ
増幅断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にクローニングした。２つのクローンについて塩基配列を決定した。ＢＬＡＳＴ解析は、増幅配列が、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに存在する完全に配列決定した４つのＷＤＶ株（ＧＥＷＤＶＸＸ、ＷＤＶＧＮＳ、ＷＤＷ３１１０３１、ＮＣ ００３３２６）とは著しく異なるが、ハンガリーで単離された部分的に配列決定した（１．２ｋｂ）ウイルス（ＡＪ３１１０３８；Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４７（１）：２０５−２１６、２００２）とは密接に適合することを示した。
【００５６】
コートタンパク質遺伝子を除いた完全長ゲノムを増幅するために、得られた配列データに基づいて２つのプライマーを設計した（ｔｔＣ ＣＡＴ Ｇｇａ ｇｔｔ ａｃｃ ｔｃｇ ｇｇ ａｇｔ ｃｃｔ ｔｇｔ ｔｇ 及び ｔｔＧ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ Ｇｃａ ａａａ ｔａｇ ｔａｔ ｔｔｔ ａｔｔ ｃａｔ ｃｔｃ ａｔｇ ｔｃ）。上記感染葉ＤＮＡからＰＣＲを行った。
【００５７】
ＰＣＲ増幅産物を、ＳｐｈＩ及びＮｃｏＩで消化したＧＦＰの変異型（Ｓ６５ＴＧＦＰ）を含有するｐＵＣ１９ベクターにＳｐｈＩ−ＮｃｏＩ断片としてクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１０６８０は、ＣＰをＧＦＰで置換した唯一のＷＤＶゲノムを含有する（図１３）。
【００５８】
重複ＬＩＲを有する完全長ゲノムを２工程でバイナリーベクターにクローニングした。第１に、ｐＩＣＨ１０６８０のＢａｍＨＩ−ＡｐａI断片を、ＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで消化したバイナリーベクターにサブクローニングした。この中間体クローンは、ＣＰのかわりにＧＦＰを有する部分ＷＤＶゲノムを含有するが、ＰｓｐｏＭＩ及びＰｃｉＩで消化し（Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化）、ｐIＣＨ１０６８０のＳｍａI−ＮｏｔＩ断片をクローニングする第２工程に用いた。得られたクローンｐIＣＨ１０８３０（図７）は、ＣＰをＧＦＰで置換した完全長ＷＤＶゲノムを含有し、重複ＬＩＲに隣接し、ａｌｌｏｗｉｎｇ ＷＤＶ−ＧＦＰレプリコンの切り出し及び増幅を可能にする。
【００５９】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適合性を試験する：
ｐＩＣＨ１０８３０をコムギ及びトウモロコシの発育胚に照射した。胚に強力なＧＦＰ蛍光を発する細胞が観察されたが、胚乳でも検出されるであろう（図８）。
【００６０】
「反転した」ＷＤＶプロベクターのクローニング
ＢＧＭＶベクターに関して記載したのと同一のストラテジーを用いて、「反転した」ＷＤＶベクターｐＩＣＨ１４５２０を作製した（図９）。このクローンが複製開始可能になるのは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼに曝露して反転させた後のみである。このクローンの機能性を試験するため、トウモロコシの胚に単独で、又はインテグラーゼクローンｐＩＣＨ１４５３０若しくはｐＩＣＨ１４５６０とともに照射した。ｐＩＣＨ１４５２０をインテグラーゼとともに照射したときのみＧＦＰ蛍光細胞が検出されるであろう。
【００６１】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ｐＩＣＨ１４５２０及びインテグラーゼクローンをトウモロコシに形質転換した。
両方の構築体から選択した形質転換体を両方向で交雑させ、さまざまな発育期で未成熟種子を切開し、顕微鏡又は携帯ＵＶランプを用いて青色光下で観察した。
【実施例３】
【００６２】
ＣＲ−ＴＭＶベクター
ＧＦＰを有するｃｒ−ＴＭＶ複製ベクターのクローニング：
ｐＩＣＨ４３５１（図１０）はｃｒ−ＴＭＶ、アブラナ感染トバモウイルス（Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５０、５−８）に基づいたウイルスベクターである。ｐＩＣＨ４３５１は、Ｃｒ−ＴＭＶの５’非翻訳配列、続いてＲｄＲｐ及びＭＰを含有し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド１〜５６２９、ＭＰの最後の１６アミノ酸を、ＭＰ機能を喪失することなく切断し、Ｚ２９３７０中の５６０５位のＴをＣに変異させた）、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（７８７ヌクレオチド断片、転写開始の５’側、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ４１９９８、Ａｎら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０、１０７−１２１）に融合している。ＭＰの後にＬｏｘＰ部位が続く。この部位は、この構築体の使用に関して機能的に意味がなく、それを構築するために用いたプラスミドにも存在しているために存在している。ＬｏｘＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ由来のＩＲＥＳ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド４８０４〜４８７３）、及びＧＦＰ ＯＲＦが続く。ＧＦＰ発現を増加させるための翻訳エンハンサーとしてＩｒｅｓをこの位置にクローニングした。ＧＦＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド６０８３〜６３１２）、アグロバクテリウム Ｎｏｓターミネーターが続く。この構築体を、植物でカナマイシン選択するためのカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターｐＩＣＢＶ１０にクローニングする（Ｎｏｓプロモーター−ＮＰＴＩＩコード配列ｓ−Ｎｏｓターミネーター）。この構築体では、ＧＦＰはＭＰの末端に局在するＣＰサブゲノムプロモーターから発現される。照射又はａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによる核への送達後、核においてアクチン２プロモーターから作製された第１転写物は、複製が起こる細胞質へ輸送される。
【００６３】
「反転した」ｃｒ−ＴＭＶプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ１０９２１はｐＩＣＨ４３５１から作製したウイルスプロベクターである（図１１）。これは、ＩｒｅｓからＮｏｓターミネーターまで伸びたＤＮＡ断片が逆方向に反転して構築体を複製不可能にしているという事実によってｐＩＣＨ４３５１とは異なっている。この断片の反転を可能にするために、ＰｈｉＣ３１のＡｔｔＰ部位（ｇｔａ ｇｔｇ ｃｃｃ ｃａａ ｃｔｇ ｇｇｇ ｔａａ ｃｃｔ ｔｔｇ ａｇｔ ｔｃｔ ｃｔｃ ａｇｔ ｔｇｇ ｇｇｇ ｃｇｔ ａｇａ）及びＡｔｔＢ部位（ｔｃｇ ａａｇ ｃｃｇ ｃｇｇ ｔｇｃ ｇｇｇ ｔｇｃ ｃａｇ ｇｇｃ ｇｔｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｇｇｃ ｔｃｃ ｃｃｇ ｇｇｃ ｇｃｇ ｔａｃ ｔｃｃ ａｃｃ ｔｃａ ｃｃｃ ａｔｃ）を転置の末端にで位置付ける。
【００６４】
転置部分の反転が機能性ベクターをもたらすか同化を試験するため、ｐＩＣＨ１０９２１でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉のａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎに用いた。ｐＩＣＨ１０９２１を単独で浸潤させたときはＧＦＰスポットは検出されなかったが、ｐＩＣＨ１０９２１をｐＩＣＨ１０８８１（インテグラーゼ発現ベクターを含有）で形質転換したアグロバクテリウムとともに共浸潤させたときは非常に多くのＧＦＰ複製フォーカスが見られるであろう。
【００６５】
安定な形質転換及びハイブリダイゼーション実験
５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを形質転換体の選択に用いて、ｐＩＣＨ１０９２１、ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０及びｐｌＣＨ１４５５０で、ベンサミアナタバコを葉ディスク形質転換によって個別に形質転換した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）。両構築体から選択した形質転換体を両方向で交雑させ、未成熟種子を切開し、顕微鏡を用いて青色光下で観察した。ハイブリッド種子においてＧＦＰ発現が検出された。
【実施例４】
【００６６】
トランスジェニックトウモロコシ植物の作製
トウモロコシのユビキチンプロモーターの制御下で、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）を単子葉植物形質転換のための選択可能マーカーとして用いた（図１２）。選択薬剤としてハイグロマイシンＢを２５〜１００ｍｇ／ｌの濃度で適用した。
【００６７】
トランスジェニックトウモロコシ植物を作製するために以下の方法を用いた：
Ａ１８８株、Ｈｉｌｌ株などの成熟及び未成熟胚からカルス培養を誘導した。培地はＣｈｕ（Ｎ６）塩及びビタミンに基づいている（Ｃｈｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ、１８（５）：６５９−６８，１９７５）。
カルス誘導培地及び繁殖培地には３０ｇ／ｌのショ糖、６００ｍｇ／ｌのＬ−プロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ及び０．３％ゲルライトが添加されている。
プレ再生培地は使用しなかった。再生培地は、Ｎ６塩及びビタミン、３０ｇ／ｌのショ糖、２ｍｇ／ｌのゼアチン及び０．０５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含有する。再生培地にはチオ硫酸銀が０．０１〜０．０６ｍＭの濃度で含まれている。
【００６８】
微粒子銃
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム（バイオラッド）を用いて微粒子銃を実施した。細胞を、９００〜１１００ｐｓｉで、マクロキャリアー発射点から停止スクリーンまで１５ｍｍの距離で、及び停止スクリーンから標的組織まで６０ｍｍの距離で照射した。破裂ディスクとマクロキャリアーの発射点との距離は１２ｍｍであった。細胞を、４時間の浸透圧前処理後に照射した。
【００６９】
ＤＮＡ−金コーティングを、バイオラッドのオリジナルプロトコール（Ｓａｎｆｏｒｄら、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｗｕ編、２１７、４８３−５０９）にしたがって以下のように行なった：２５μｌの金粉末（０．６、１．０ｍｍ）を５０％グリセロール（６０ｍｇ／ｍｌ）中で、０．２μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ５μｌ、２５μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）及び１０μｌの０．１Ｍ スペルミジンと混合した。混合物を２分間ボルテックスし、続いて室温で３０分間インキュベーションし、遠心（２０００ｒｐｍ、１分）し、７０％及び９９．５％のエタノールで洗浄した。最後に、沈殿を３０μｌの９９．５％エタノール（６μｌ／ショット）に再懸濁した。
【００７０】
新規のＤＮＡ−金コーティング法（ＰＥＧ／Ｍｇ）を以下のように行った：２５μｌの金懸濁液（５０％グリセロル中に６０ｍｇ／ｍｌ）をエッペンドルフチューブ中で５μｌのプラスミドＤＮＡと混合し、次に３０μｌの４０％ＰＥＧ（１．０Ｍ ＭｇＣｌ２中）を添加する。混合物を２分間ボルテックスし、室温で３０分間、混合せずにインキュベートした。遠心（２０００ｒｐｍ、１分）後、沈殿を１ｍｌの７０％エタノールで２回、１ｍｌの９９．５％エタノールで１回洗浄し、最後に３０μｌの９９．５％エタノール中に分散させた。ＤＮＡ−金 エタノール懸濁液のアリコート（６μｌ）をマクロキャリアーディスクにロードし、５〜１０分間乾燥した。
【００７１】
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドで大腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換し、ＬＢ培地中でｍａｘｉ ｐｒｅｐを増殖させ、キアゲンキットを用いてＤＮＡを精製した。
【００７２】
選択
安定な形質転換実験のために、処置細胞を有するフィルターを、ろ過滅菌した適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ））、３％ショ糖を有する固形ＭＳ２培地上に移して遮光した。７日毎に材料を新鮮な選択培地に移した。プレートを暗所保存し、およそ６週間後、植物材料を再生培地及び適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ）の入ったペトリ皿に移した。ペトリ皿を強い光度でインキュベートした。日照時間１６時間。
【実施例５】
【００７３】
ハイブリッド種子の発育を制御するためのバルナーゼに基づいたシステム
バルナーゼ遺伝子を、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３ ＤｎａＢ インテインを用いて分割した。適当な制限部位に隣接したバルナーゼのＮ端部分及びＣ端部分のＤＮＡ断片を営利なＤＮＡ合成会社で化学的に合成した。
【００７４】
Ｎ末端の配列は以下の通りである：
５’ｇｃａａｔｃｇａｔｇ ｇｃａｃａｇｇｔｔａ ｔｃａａｃａｃｇｔｔ ｔｇａｃｇｇｇｇｔｔ ｇｃｇｇａｔｔａｔｃ ｔｔｃａｇａｃａｔａ ｔｃａｔａａｇｃｔａ ｃｃｔｇａｔａａｔｔ ａｃａｔｔａｃａａａ ａｔｃａｇａａｇｃａ ｃａａｇｃｃｃｔｃｇ ｇｃｔｇｇｇａｃｇｔ ｃｃｇｃ ３’。
【００７５】
Ｃ末端の配列は以下の通りである：
５’ｃｇｃｃａｔｇｇｇｇ ｔｇｇｃａｔｃａａａ ａｇｇｇａａｃｃｔｔ ｇｃａｇａｃｇｔｃｇ ｃｔｃｃｇｇｇｇａａ ａａｇｃａｔｃｇｇｃ ｇｇａｇａｃａｔｃｔ ｔｃｔｃａａａｃａｇ ｇｇａａｇｇｃａａａ ｃｔｃｃｃｇｇｇｃａ ａａａｇｃｇｇａｃｇ ａａｃａｔｇｇｃｇｔ ｇａａｇｃｇｇａｔａ ｔｔａａｃｔａｔａｃ ａｔｃａｇｇｃｔｔｃ ａｇａａａｔｔｃａｇ ａｃｃｇｇａｔｔｃｔ ｔｔａｃｔｃａａｇｃ ｇａｃｔｇｇｃｔｇａ ｔｔｔａｃａａａａｃ ａａｃｇｇａｃｃａｔ ｔａｔｃａｇａｃｃｔ ｔｔａｃａａａａａｔ ｃａｇａｔａａｇｇａ ｔｃｃｇｃ ３’。
【００７６】
バルナーゼのＮ末端をＤｎａＢインテインのＮ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｎ断片をＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＤＮＡから、ＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ１プライマー（５’ｇｔＡＡＧＣＴＴＧＡ ＣＧＴｃａｇａｇａｇ ａｇｔｇｇａｔｇｃａ ｔｃａｇｔｇｇａｇａ ｔａｇ３’）及びＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ２プライマー（５’ｃａＣＴＧＣＡＧｃｔ ａｔａａｔｔｇｔａａ ａｇａｇｇａｇｃｔｔ ｔｃｔａｇ３’）を用いて増幅した。バルナーゼ断片（ＣｌａＩ／ＡａｔＩＩ断片）及びインテイン断片（ＡａｔＩＩ／ＰｓｔＩ断片）をアイコン・ジェネティクス バイナリーベクターにクローングし、ｐＩＣＨ１２７９４クローンを得た（図１４）。
【００７７】
バルナーゼのＣ末端をＤｎａＢインテインのＣ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｃ断片を、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＤＮＡから、ｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ１プライマー（ｇｔ ＧＡＧ ＣＴＣ Ｇ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＡ ｇｃｃ ｃａｇ ａａａ ｔａｇ ａａａ ａｇｔ ｔｇｔ ｃｔｃ）及びｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ２プライマー（ｔｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ｔｃｔ ｔｇｃ ｔｃｔ ｔｃａ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｇ ａｃａ ａｔｇ ａｔｇ ｔｃａ ｔ）を用いて増幅した。インテイン断片（ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ断片）及びバルナーゼ断片（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片）をアイコン・ジェネティクスバイナリーベクターにクローニングし、クローンｐＩＣＨ１２８２０を得た（図１４）。
【００７８】
ベンサミアナタバコの葉のａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによって、Ｎ端及びＣ端 バルナーゼ−インテイン融合クローンの機能性を試験した。予想通り、両構築体をともに浸潤させた葉領域は壊死したが、いずれかの構築体を単独で浸潤させた領域は健常のままであった。
【００７９】
ＰＩＣＨ１２７９４及びｐＩＣＨ１２８２０をｐＩＣＢＶ１６にサブクローニングした。これは植物形質転換体をカナマイシンで選択するためのＮｐｔＩＩカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。得られたプラスミドはｐＩＣＨ１４７８０及びｐｌＣＨ１４７７０である（図１４）。
【００８０】
シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）を、ＳＴＭｆｗｄプライマー（ｃｇ ｃａａｔｔｇ ｇｔｇｇｃａａｇａｇｇｔｃｔａｃｃａｔｃｔ）及びＳＴＭｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃａｃｔａｇｔａｔｔ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＭｆｅＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０及びｐＩＣＨ１４７８０（ＥｃｏＲＩ ＳａｃＩで消化）にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００を得た（図１５）。２つのプラスミドのプロモーター領域を配列決定した。ｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００は、ＳＴＭプロモーターの制御下にあるＣ末端及びＮ末端バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８１】
シロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を、ＡＴＨＢ５Ｆｗｄプライマー（ｃｇ ｇａａｔｔ ｃｃａｇｃｔｃａｔｃａａｃｃａａａｃｔｃｔｇｔ）及びＡＴＨＢ５ｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｔｇｃｔｃｔｇｔｇｔｃｔａｇａｃｔａｔｃｃ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４８１０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０から増幅した断片を配列決定し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７８０にサブクローニングし、ｐＩＣＨ１４８２０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０及びｐＩＣＨ１４８２０は、発芽特異的プロモーターの制御下にある５’及び３’バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８２】
４つのプラスミド全てをアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に導入し、シロイヌナズナの形質転換に用いた。全てのトランスジェニック植物は表現型が正常である。トランスジェニック植物を、同一のプロモーター又は異なるプロモーターを有する相補的バルナーゼ構築体を含有する植物と交雑させた。異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を用いたプロモーターの重複領域まで制限することが可能である。Ｆ１種子を乾燥させて種を蒔いた後に収穫した。これらは発芽したが、成長点の欠失により拘束された。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ａ−本発明の一般的原理。第１親植物株Ａを第２親植物株ＢとハイブリダイズさせてＦ１種子を産生する。親株の種子は目的産物を産生しないが、生育可能である。Ｆ１種子では遺伝子供与が生じ、目的産物の産生を可能にする。この場合はその蛍光によって観察されるＧＦＰである（写真中の光の点）。場合により目的産物をコードするウイルスベクターの強力な複製と組み合わせた、目的産物の強力な発現の結果、Ｆ１種子は生育不可能である。
【図１Ｂ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ｂ−植物発育期（フレーム内）。精細胞と雌性配偶体とのハイブリダイゼーション後、目的産物（左の囲み）を発現する種子（Ｆ１種子）が産生される。Ｆ１種子からの植物の発育はブロックされている。右の囲みは、Ｆ１種子が稔性植物に生長できないことを示す。
【図２】図２は、プラスミドｐＩＣＨ４３００のＴ−ＤＮＡ領域、及びハイブリッド種子におけるＢＧＭＶ（Ｂｅａｎ Ｇｏｌｄｅｎ モザイクウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。
【図３】図３は、プラスミドｐＩＣＨ１５００のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼ活性の存在下におけるＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。ｐＩＣＨ１５００の遺伝要素は、第１の部分的遺伝子供与によって種子に提供することができる。インテグラーゼＰｈｉＣ３１はコードされ、第２の部分的遺伝子供与によって種子に提供されることができる。
【図４】図４は、プラスミドｐＩＣＨ５１８４を照射した、インゲンマメの未成熟胚（Ａ、左の大きな写真）、及びマングビーン Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａの発芽種子からの子葉（Ｂ、右の小さな写真）を示す。ＧＦＰを目的産物として発現するマメの胚が円で囲まれている。
【図５】図５は、ｐＩＣＨ５１８４ベクターを照射したマングビーンの発芽種子の苗条を日光下（左）及びＵＶ光下（右）で示す。
【図６】図６は、構築体ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１４５３０、及び構築体ｐＩＣ０１のＴ−ＤＮＡ領域のスキームを示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＩＣＨ１０８３０のＴ−ＤＮＡ領域、及びＷＤＶ（コムギＤｗａｒｆウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成のスキームを示す（実施例２を参照されたい）。
【図８】図８は、コムギ胚（Ａ）及びトウモロコシ種子組織（Ｂ）においてコムギｄｗａｒｆウイルス（ＷＤＶ）−ＧＦＰ発現カセットを含有するプラスミドｐＩＨ１０８３０を照射し、形質転換後４日の結果を示す。
【図９】図９は、プラスミドｐＩＣＨ１４５２０のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼＰｈｉＣ３１活性の存在下におけるレプリコン形成のスキームを示す。ＬＩＲ及びＳＩＲはコムギｄｗａｒｆウイルスの長い及び短い遺伝子間領域である；ＭＰ−移行タンパク質；Ｒｅｐ−ウイルスレプリカーゼ；ＲｅｐＡ−ウイルスレプリカーゼＡ。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＩＣＨ４３５１のＴ−ＤＮＡ領域及びＲＮＡレプリコンの形成を示す。ＧＦＰに隣接するグレーのドット領域はＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列を示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＩＣＨ１０９２１のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼＰｈｉＣ３１活性の存在下におけるＲＮＡレプリコンの形成を示す。
【図１２】図１２はプラスミドｐＩＣＨ１６００の略図を示す。
【図１３】図１３は構築体ｐＩＣＨ１０６８０の略図を示す。
【図１４】図１４は、構築体ｐＩＣＨ１２７８４、ｐＩＣＨ１２８２０、ｐＩＣＨ１４７８０及びｐＩＣＨ１４７７０の略図を示す。
【図１５】図１５は、構築体ｐＩＣＨ１４８００、ｐＩＣＨ１４７９０、ｐＩＣＨ１４８２０及びｐＩＣＨ１４８１０の略図を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド種子（Ｆ１種子）における高収率で安全な目的産物の産生方法に関する。また、本発明は、それにより産生される種子及び前記種子から単離される目的産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の最近の遺伝子工学的方法における主な問題は、以下のように要約することができる：
１． 通常、目的産物の収率が低い。例は薬用タンパク質、酵素、他のタンパク質、ポリマー、糖、多糖類などである。低収率とは、精製／後処理費用が高いことを意味する。
２． 遺伝子改変植物と非トランスジェニック亜種又は野生型相対物との自由な交雑、及び収穫後の農場における「自生」植物の存在による遺伝子汚染。植物は自己複製生物であるため、又はヒトの過ち若しくは故意の行動のため、そのようなイベントは自然発生的に容易に起こる。
【０００３】
２つの問題は同一問題の全く反対の側面である：低収率は、通常、完全な発育及び生殖サイクルを経由する能力も同時に保持する産生体である植物を構築したいという欲求の結果である。発育及び生殖の工程と導入遺伝子発現工程との組み合わせは解決策を与えない。誘導性システム（ＵＳ０５１８７２８７号；ＵＳ０５８４７１０２号；Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０．４５６７−４５７１；Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号；Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号；Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）も器官特異的導入遺伝子発現システム（ＵＳ０５９５５３６１号；ＷＯ０９８２８４３１号；Ｄｅ Ｊａｅｇｅｒら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、１２６５−１２６８）も遺伝子汚染の問題に対する解決策を提供せず、高収率の目的産物も提供しない。上記システムに用いる誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターは全て、例えば「漏出性」の定常活性を有し、これは発生の過程で導入遺伝子サイレンシングを引き起こし、必然的に目的産物の収率が減少する。更に、そのような誘導性システムの制御下にある組換え遺伝子を有するトランスジェニック植物は、例えば組換え生物医薬品を産生する場合に、厳格な生物安全性の基準を満たさないため、収率が唯一の問題ではない。
【０００４】
植物ウイルス配列に基づいた増幅ベクターの使用は、上記問題、特にそのようなベクターを一過性の発現に用いた場合の部分的解決策を潜在的に提供することができる（ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２２９０６８号）。しかしながら、一過性発現実験用ベクターの多くは、選択された植物種、大部分はタバコ科のために開発されている（ＵＳ５４６６７８８号；ＵＳ５６７０３５３号；ＵＳ５８６６７８５号；ＷＯ０２０８８３６９号）。目的の組換えタンパク質／ＲＮＡを産生するためのウイルスベクターの効率性は、効率的な細胞間移行及び全体移行の能力によっても決定される。後者のパラメータは、種及び亜種依存的であり、したがって、一過性発現のために宿主を選択する自由を厳しく制限する。この問題の潜在的解決策は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクターを有するトランスジェニック植物を設計することである。形質移入又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組み込みを介して外来配列を植物で発現させるために設計されたウイルスベクターの使用について多くの総説に記載されている（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．１９９３、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．、３、９１−９６；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．１９９５、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１５５−１６５；Ｐｏｒｔａ，Ｃ．＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，Ｇ．２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．＆Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１９、２４５−２９１；Ａｗｒａｍら、２００２、Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、５８、８１−１２４）。しかしながら、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたアンプリコンベクターを有するトランスジェニック植物を設計する試みは、通常、導入遺伝子サイレンシングの問題に直面し、このアプローチを役に立たないものにしている。最良の場合、ＧＵＳ遺伝子及びＮＰＴ遺伝子に関してＨａｙｅｓと同僚によって８０年代後半に示されたように、強力な構成的プロモーターによって提供されるよりもわずかに高い収率を提供する（Ｈａｙｅｓら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７．２３９１−２４０３）。それ以来、ウイルスレプリコンに基づいたトランスジェニック植物における高収率で生物学的に安全な組換えタンパク質の産生を達成する上で特筆すべき突破口は無かった。
【０００５】
ハイブリッド植物が転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のサプレッサーを提供する、ハイブリッド植物のアンプリコンに関するＭａｌｌｏｒｙと同僚の研究（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）は、問題の部分的解決策を与える。しかしながら、このアプローチは目的産物の収率が高くなく、正常な植物の発育とは両立しなかった。更に、バイオセイフティ問題に対処していなかった。Ｇｏｏｄｉｎｇと同僚（１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８）は、科学的研究で単離コムギ胚におけるジェミニウイルスベクターの複製について報告している。可能な技術応用に取り組んでいなかった。更に、この方法は規模を大きくすることができず、したがって、技術応用に使用されていない。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を、特に高収率で産生するための新規方法を提供することである。本発明の他の目的は、植物産生システムにおいて目的産物、特に目的タンパク質を産生するための生物学的に安全な方法を提供することであり、この方法に関与するトランスジェニック遺伝物質の環境への分布は厳しく制御され、発生する可能性が低い。本発明の更なる目的は、植物産生システムにおいて目的タンパク質のような目的産物を産生する方法を提供することであり、目的産物の収率又は品質を損なうことなく、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概説
これらの目的は、Ｆ１種子において目的産物を産生する方法によって達成され、この方法は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによってＦ１種子を得ることを含み、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生ずる。次に目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔くことができる。
【０００８】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【０００９】
更に、本発明は、第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法を提供し、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く。
【００１０】
更に、上記方法によって産生されるか又は産生可能な種子、及び前記種子から単離される目的産物が提供される。好ましくは、前記種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、より好ましくは前記植物は性的に不稔である。
【００１１】
発明者らは、植物種子（Ｆ１種子）において目的産物を産生する方法を見出した。前記方法に必要な遺伝子供与は、親植物をハイブリダイズすることによって前記種子で生ずる。即ち、いずれの親植物も前記方法に必要な完全な遺伝子供与物を有していない。目的産物を産生する種子は、目的産物をそこから単離するときに破壊される。その結果として、本発明の方法は、前記方法に必要な遺伝子供与物が環境に分布する可能性が非常に低いため、生物学的安全性が高い。更に、前記種子から生長する植物は生殖できないため、生物学的安全性を更に高めるためにＦ１種子は不稔であり得る。更に、本発明の方法は、目的産物を産生する上で遺伝子サイレンシングは問題ではないという驚くべき利点を有する。これは、種子における親植物の部分的遺伝子供与物の共存が短いことによるかもしれない。特に、目的産物の産生が基本的に親植物では起こらないため、導入遺伝子サイレンシングを種子に伝達することができない。導入遺伝子サイレンシングがほとんど起こらないため、目的産物を高収率で産生することができる。通常、目的産物は他の植物組織におけるよりも種子においてより安定であるため、植物の生長と目的産物の単離とを空間的且つ時間的に切り離すことができることが本発明の更なる利点である。これは、本発明の方法全体に柔軟性を与える。
【００１２】
第１及び第２のトランスジェニック親植物は、それぞれ第１及び第２の部分的遺伝子供与物を含有する。部分的遺伝子供与物はトランスジェニックであることが好ましい。第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において遺伝子供与を生ずる。種子において遺伝子供与が生ずると、種子における目的産物の産生が誘発される。ハイブリダイズとは、第１及び第２のトランスジェニック親植物の人工受粉を意味することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２の部分的遺伝子供与物を組み合わせ、Ｆ１種子に遺伝子供与物を供与する。第１及び第２の遺伝子供与物はともに種子における目的産物の産生に必要である。したがって、目的産物は第１及び第２の親植物では発現しない。例えば第１又は第２の部分的供与物からの漏出性発現により、親植物において微量レベルの目的産物の産生が起こり得る。そのような漏出性の発現は、目的産物の経済的産生に対して非常に弱い。しかしながら、第１及び第２の親植物のいずれにおいても目的産物の産生は起こらないことが好ましい。
【００１３】
前記方法によって産生される目的産物は、目的タンパク質、例えば薬用タンパク質であることが好ましい。本発明にしたがい、２、３以上の目的タンパク質を種子で産生することもできる。目的タンパク質は、種子の植物に対して異種タンパク質であることが好ましい。目的タンパク質は酵素でもよい。種子で酵素を産生する場合、産物は、とりわけ前記酵素の作用によって種子で産生される化学化合物でもよい。化学化合物の産生には２、３以上の酵素が必要とされるかもしれない。本発明を用いて産生し得る化学化合物の例としては、ビタミン、ポリマー（例えばポリヒドロキシブチル酸及び他の生分解性ポリエステル）、脂肪酸、脂肪、油、炭水化物、高級イソプレノイドなどが挙げられる。公知の手順にしたがい、目的産物を含有する種子を親植物から収穫し、目的タンパク質又は化学化合物を種子から単離することができる。目的産物が単離される種子は発芽していてもよい。目的産物は発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子に蓄積し得る。
【００１４】
遺伝子供与が生ずることによる目的産物又はタンパク質の産生は、多くのさまざまな方法で達成することができる。タンパク質が産生される場合、それぞれの部分的遺伝子供与物はタンパク質のコード配列の一部を提供することができ、前記部分は例えばＤＮＡレベルでの組換え、ＲＮＡレベルでのＲＮＡトランススプライシング、又はタンパク質レベルでのタンパク質トランススプライシングによって種子で組み合わせられることができる。他の一般的なアプローチは、目的タンパク質のコード配列に、タンパク質が発現不可能な形態で第１の部分的供与物を提供し、遺伝子成分に、タンパク質の発現を誘発する第２の部分的供与物を提供することである。例えば、植物に固有のポリメラーゼには認識されない異種プロモーターからのコード配列の転写を可能にするＲＮＡポリメラーゼに第２の部分的供与物を提供することによって、又は例えばコード配列をプロモーターの制御下に置くことによってコード配列を発現可能にするリコンビナーゼに第２の部分的供与物を提供することによって、発現を誘発することができる。種子における目的産物の産生に対する制御を更に増加させるために、産生を誘発するリコンビナーゼ又は他の酵素のコード配列を２つの断片に分割することができる。一方の断片を第１親植物によって種子に提供し、他方の断片を第２親植物によって種子に提供することができる。２つの断片は、２つの異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下で発現させ、Ｆ１種子においてインテイン介在性トランススプライシングによって活性リコンビナーゼ又は酵素に組み立てることができる。このようにして、目的産物の産生開始を制御することができ、例えば種子発育の後期にシフトさせることができる。インテイン介在性トランススプライシングについての詳細は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に見出すことができる。
【００１５】
重要な態様では、遺伝子供与物は、ハイブリダイゼーションによって生ずる複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む。複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは目的産物の産生に関与する。目的タンパク質が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡから発現することが好ましい。複製ＤＮＡはレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有することができる。レプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ＤＮＡウイルスレプリカーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＤＮＡウイルス成分を有し得る。同様に、複製ＲＮＡはＲＮＡレプリコンであり得る。即ち、種子において機能性の複製起点を有し得る。ＲＮＡレプリコンはウイルスレプリコンであることが好ましい。即ち、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はウイルスレプリコンの細胞間伝播に関与するタンパク質をコードする配列のようなＲＮＡウイルス成分を有し得る。最も好ましくは、ＤＮＡウイルスレプリコン又はＲＮＡウイルスレプリコンは目的タンパク質をコードすることができる。
【００１６】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは植物ウイルスを起源とすることができる。複製ＤＮＡはジェミニウイルスに基づくことができる。複製ＲＮＡの場合、複製ＲＮＡは１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づくことが好ましい。好ましい１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスはトバモウイルスである。複製ＲＮＡはタバコモザイクウイルスに基づくことが最も好ましい。
【００１７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡは、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分から生ずることができる。ＤＮＡレプリコンは、第１の部分的遺伝子供与物としてそのゲノムにレプリコンの前駆体を組み込ませた第１親植物を、前駆体からレプリコンを生じさせること（又は複製をもたらすこと）が可能な成分を含有するか又はコードすることができる第２親植物とハイブリダイズさせることによって種子において生ずることができる。第２親植物によって提供される成分は、レプリコンの前駆体を再構築することによってレプリコンを生じさせることが可能な酵素（部位特異的リコンビナーゼ、フリッパーゼ又はインテグラーゼのような）であり得る。この態様の例を図３、図７及び図９に示す。
【００１８】
複製ＲＮＡは、第１の部分的遺伝子供与成分及び第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずることができる。あるいは、第１の部分的遺伝子供与は、複製ＲＮＡの前駆体を含むことができる。前駆体は、第１親植物のゲノムに組み込まれた複製ＲＮＡのＤＮＡコピーであり得る。次に、複製ＲＮＡは、第２の部分的遺伝子供与物にコードされる成分、特にＲＮＡポリメラーゼによる複製ＲＮＡのＤＮＡコピーの転写によって種子において生ずることができる。ＲＮＡポリメラーゼを前記成分として用いる場合、ＲＮＡポリメラーゼは、複製ＲＮＡのＤＮＡコピーを転写するために用いるプロモーターに適応させる必要がある。
【００１９】
目的産物、特に目的タンパク質が第１の部分的遺伝子供与物にコードされ、第２の部分的遺伝子供与物が例えば産生のための調節機能を提供する場合、雌性親植物によってハイブリダイゼーションに第１の部分的遺伝子供与物を提供することが好ましい。より好ましくは、雌性親植物は雄性不稔である。このようにして、第１（雌性）トランスジェニック親植物由来の花粉は環境に分布せず、第２（雄性）親植物由来の花粉は目的産物をコードしないため、生物学的安全性を更に高めることができる。同様に、遺伝子供与物が複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む場合は、複製ＤＮＡ又はＲＮＡは雌性親植物の部分的遺伝子供与によって提供されることが好ましい。
【００２０】
第１の部分的遺伝子供与物及び第２の部分的遺伝子供与物は、種子に伝達できるようにそれぞれの親植物に組み込まれていることが好ましい。この目的のため、これらは親植物のゲノムに安定に組み込まれていることが好ましい。親植物は、植物バイオテクノロジーの公知の方法にしたがって、所望の部分的遺伝子供与物を含有するベクターで植物を形質転換することによって産生することができる。親植物は、部分的遺伝子供与物に関して同型であることが好ましい。親植物株は維持されて、自殖によって繁殖することができる。
【００２１】
本発明の種子（Ｆ１種子）を収穫して目的産物の単離に用いることができる。したがって、種子に含有される遺伝子供与物を含めたトランスジェニック材料は環境に分布せず、種子の子孫への移行による繁殖はしない。トランスジェニック材料が種子の子孫へ移行するのを妨げるため、好ましくは、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除され、より好ましくはＦ１種子は不稔である。好ましい態様では、目的産物の強力な発現のために、あるいは複製ＤＮＡ又はＲＮＡの強力な複製のために、種子から生長する植物の有性生殖は損なわれているか又は種子は不稔である。あるいは又は更に、種子から生長する植物の発育は遺伝子操作によって生殖生長期に達する前にブロックされており、これは正常な植物の発育を妨げる毒性物質又は毒性タンパク質の組織特異的発現によって達成することができる。そのような毒性タンパク質は、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択することができる。好ましくは、植物発育は開花期前にブロックされ、より好ましくは第１葉形成前にブロックされる。
【００２２】
毒性タンパク質（バルナーゼなど、実施例５を参照されたい）はタンパク質断片として発現させることができ、タンパク質断片のタンパク質トランススプライシングによって毒性タンパク質の融合物を生じ、機能性毒性タンパク質を形成する。毒性タンパク質を２つの断片として発現させる場合、これら２つの断片は、２つの異なるプロモーター、特に２つの異なる組織特異的プロモーター又は２つの異なる発生学的に活性なプロモーターの制御下で転写させることができる。したがって、機能性毒性タンパク質の形成は、組織特異性が異なる２つのプロモーターに依存し得る。即ち、毒性タンパク質は、２つのプロモーターが活性な組織において活性型で形成される。このアプローチは、しばしば漏出性発現をする１つの組織特異的プロモーターによって達成されるよりも、機能性毒性タンパク質の発現に対してより厳格な制御を可能にする。更に、このアプローチは、新規発現パターン、例えば公知の組織特異的プロモーターでは達成できない発現パターンの達成を可能にする；２つの断片のために異なる組織特異的プロモーターを組み合わせることにより、可能な発現パターンの組み合わせの多様性が広がる。
【００２３】
本発明の方法は、大規模適用に完全な可能性を示す。大規模とは、多くの植物を同時に、例えば温室で適用することを意味する。最も好ましくは、大規模とは農場での適用を意味する。大規模適用では、第１親植物株の多くの植物と第２親植物株の多くの植物は、第１親植物株の植物と第２親植物株の植物との効率的な人工受粉を可能にするために、互いに近接して蒔かれるか又は植えられる。自家受粉を避けるために、例えば第１又は第２の親植物のいずれかの雄性不稔を用いる公知のハイブリッド種子産生方法を本発明の方法と組み合わせることができる。そのような方法の１例は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に記載のものである。
【００２４】
本特許出願の優先権証明書ＤＥ １０３ ２５ ８１４号は、本明細書中にその全体が援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の最良の形態及び詳細な説明
本発明の発明者らは、驚くべきことに、高率細胞分裂は、少なくとも双子葉植物の胚におけるウイルス複製を提供するのに単独では十分でなく、その上、胚発育期に依存し、通常、種子発育のより後期にシフトするすることを発見した。他の驚くべき発見は、染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスに基づくレプリコン前駆体がトランスジェニック種子（Ｆ１種子）における活性化によって複製する能力である。我々の知る限りでは、この現象について記載する先行技術ない。
【００２６】
本発明の方法では、植物の生殖と植物に基づいた目的産物の産生とは厳密に分離しており、産物の収率が大幅に向上する。目的産物を産生するために植物の発育及び生殖に通常必要とされる資源を、例えば、好ましくは特定の最も好適な発育期又は初期発芽期に、種子において目的産物を産生することによって利用することは、遺伝子汚染を制御することに役立つ。
【００２７】
発育期、より詳細には配偶子融合及び受精期を、種子生長期を産生期に変換する遺伝子スイッチとして用いることを提唱する。遺伝子供与の異なる成分を異なる親植物へ操作した。前記成分（部分的遺伝子供与物）は、親植物内では不活性であるが、ハイブリダイゼーション行程後に遺伝子供与を生じ、それにより目的産物の産生を誘発する。好ましい態様では、複製ＤＮＡ又はＲＮＡ（増幅工程）を産生に使用し、それにより胚及び／又は胚乳産生を支配する高収率産生システムが作製され、発育種子に目的産物の蓄積をもたらし、一方で、種子をその後の有性生殖ができないようにすることが好ましい。目的産物が蓄積し、発育種子、成熟種子、又は発芽種子から単離することができる。
【００２８】
本発明の基礎は、以下の驚くべき発見にある：
（ａ） ウイルスベクターは、種子発育のより後期及び種子発芽の初期に植物種子において複製可能であるが、特に双子葉植物では、種子形成の初期段階には全く又はほとんど不可能である；
（ｂ） 染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスベクター前駆体は、アクチベーター配列を提供する植物との交雑によって、ハイブリッド種子内で効率的に活性化されることができる。
【００２９】
植物発育の費用で染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたレプリコンを種子において活性化することはこれまでに示されていない。これは本発明の方法を厳重に制御することを可能にし、導入遺伝子サイレンシングを誘発するか又は種子発育を極初期に妨げる、漏出性の複製を妨げる。
【００３０】
インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）に基づいたレプリコンの設計は、実施例１に記載され、図２及び図３に示されている。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をレポーター遺伝子として有するベクターｐＩＣＨ４３００を用いて、ジェミニウイルスを複製するために胚のさまざまな発育期の能力を試験した。これらの実験の結果を図４に示す。照射した若いマメの胚の表面に可視化したウイルス複製の兆候はない（ＧＦＰ発現なし）が、多くの進行した発育後期の細胞に明瞭なＧＦＰ発現が検出されたことは明らかである（図４）。種子発芽のあいだにも効率的複製が起こる（図５）。コムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）に基づいたベクターの設計は実施例２に記載されている。図７は、一過性発現実験のためのＷＤＶベクターを概略的に示す。コムギ及びトウモロコシの種子を用いた実験結果を図８に示す。ＷＤＶベクターはコムギ及びトウモロコシの胚において効率的に複製するが、トウモロコシの胚乳ではより効率が低いことが明らかである。種子発育の望ましくない段階（極初期）での漏出性の複製は、種子生長及びこのアプローチの技術適用性を危うくするため、これらのデータは本発明の実行可能性を確立する上で重要である。また、部位特異的組換えによる複製行程を誘発するための種子特異的プロモーターの幅広い選択を可能にする。胚発育初期段階においてウイルスベクターをその部分の組換え介在反転によって活性化することは（図３及び図９）、レプリコン前駆体を複製適格期にし得るが、胚が発育のより進行した段階（「複製適格期」）に達するまで複製は起こらないことが好ましい。
【００３１】
プロモーターの選択はこの技術の効率に影響する。誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーターを用いて、種子における高収率産生を誘発することができる。誘導性プロモーターは、誘導条件によって２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるもの、及び生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるもの。第１カテゴリーの例は、とりわけ熱誘導性プロモーター（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性プロモーター（ＵＳ０５８４７１０２号）、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４号）、及びテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学的に誘導可能なシステムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的に誘導可能なシステムの総説としては：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、１４６−１５１）を参照されたい。しかしながら、本発明を実施する上で最も好適なプロモーターは種子特異的プロモーターである。
【００３２】
本発明の実施に有用であり得る種子特異的プロモーターには幅広い選択肢がある。そのようなプロモーターには、とりわけ、エンドウマメ レクチン（Ｐｓｌ１）遺伝子のプロモーター（ｄｅ Ｐａｔｅｒら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、５１５−５２３）、ＵＳＰと呼ばれるソラマメ非貯蔵性種子タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、オーツムギ グロブリン遺伝子ａｓｇｌｏ５の胚乳特異的プロモーター（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６、２０３−２１０）、トウモロコシ Ｏ２遺伝子のプロモーター（Ｇａｌｌｕｓｃｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１５、３９１−４００）、後期胚形成において豊富な遺伝子（ｌｅａ）、具体的にはシロイヌナズナ胚のいたるところに発現するＡｔＥｍ６のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、β−ファセオリン及びβ−コングリシニンのプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６、４４７−４５８）、インゲンマメのアルセリン−５遺伝子のプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎｓら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２０、１０９５−１１０４）、Ｄ−ホルデイン遺伝子プロモーター（Ｈｏｒｗａｔｈら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１９１４−１９１９）、オオムギ リポキシゲナーゼ１（Ｌｏｘ１）遺伝子のプロモーター（Ｒｏｕｓｔｅｒら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５．４３５−４４０）などが含まれる。
【００３３】
目的タンパク質の発現を駆動するために選択したプロモーターの適用性を予備的に評価するため、ｐＩＣ０１由来の構築体（図６）を用いた一過性発現実験に、ＧＵＳレポーター遺伝子を使用した。ここで、３４Ｓプロモーターは種子特異的プロモーターに置換されている。インテグラーゼφＣ３１の発現を駆動するため、ソラマメ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシ ｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）、並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びイネ アクチン１遺伝子の構成的プロモーター（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐＩＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）を含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した。他の部位特異的リコンビナーゼの多くは本発明に用いることができる。そのようなシステムの例としては、とりわけ、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−Ｌｏｘシステム（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２５、７２９−７３６）、サッカロミセス・セレビジエ由来のＦｌｐ−Ｆｒｔシステム（Ｂｒｏａｃｈら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２９、２２７−２３４）、チゴサッカロミセス・ルキシー由来のＲ−ＲＳシステム（Ａｒａｋｉら、１９８５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８２、１９１−２０３）が挙げられる。
【００３４】
天然宿主及び非宿主植物種の胚におけるウイルスレプリコンに関する先行技術文献がある（Ｗａｎｇ＆Ｍａｕｌｅ、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、６、７７７−７８７；Ｇｏｏｄｉｎｇら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、１７０９−１７１８；Ｅｓｃａｌｅｒら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、３１８−３２５；Ｕｇａｋｉら、１９９１、１９、３７１−３７７）。細胞間移行及び全体移行などの宿主特異性を決定するウイルスレプリコンの特定の特性を犠牲にすれば、宿主範囲が著しく増加すると思われる。そのようなウイルスレプリコンは、種子細胞を含めた広範な植物種の細胞で効率的に複製することができると思われる。ここで、前記植物種はウイルスレプリコンに対する天然宿主ではない。そのような場合、ウイルスレプリコンの全体移行及び細胞間移行は影響を受けるが、複製能は影響を受けない。実際に、本発明の原理にしたがって、ウイルスに基づいたベクターを構築するために、さまざまな分類群に属するウイルスを用いることができる。これは、ＲＮＡ含有ウイルス及びＤＮＡ含有ウイルスの両方にあてはまる。それらの例を以下に示す（本明細書にわたり、それぞれの基準種名はそれが属する目、科及び属の名称によって先行される。目、科及び属の名称は、ＩＣＴＶに承認されている場合はイタリック体である。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（俗名）は標準体で示す。属又は科について正式命名のないウイルスが示されている）：
ＤＮＡウイルス：
環状２本鎖ＤＮＡウイルス：科：カリモウイルス科、属：バドナウイルス属、基準種：ツユクサ黄斑ウイルス、属：カリモウイルス属、基準種：カリフラワーモザイクウイルス、属：“ＳｂＣＭＶ様ウイルス”、基準種：ダイズｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：“ＣｓＶＭＶ様ウイルス”、基準種：キャッサバ葉脈モザイクウイルス、属：“ＲＴＢＶ様ウイルス”、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ、属：“ペユニア葉脈ｃｌｅａｒｉｎｇ様ウイルス”、基準種：ペチュニア葉脈ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス；
環状１本鎖ＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス科、属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ（サブグループＩ ジェミニウイルス）、基準種：トウモロコシ条斑ウイルス、属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ（サブグループＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ビートカーリートップウイルス、属：ベゴモウイルス属（サブグループＩＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：インゲンマメモザイクウイルス；
ＲＮＡウイルス：
１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグラスモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアントウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス、
属が未分類の１本鎖ＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス科、基準種：リンゴｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：カーラウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス；属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ ｄｗａｒｆウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス；属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス；属：ポテクスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス；属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス；属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジンｍｏｔｔｌｅウイルス；マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：サイトラブドウイルス属、基準種：レタス壊死性黄変病ウイルス、属：ヌクレオラブドウイルス属、基準種：ジャガイモ黄萎病ウイルス；
マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科、属：トスポウイルス属、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
２本鎖ＲＮＡウイルス：科：パーティティウイルス科、属：アルファクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス１、属：ベータクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサｃｒｙｐｔｉｃウイルス２、科：レオウイルス科、属：フィジーウイルス属、基準種：フィジー病ウイルス、属：ファイトレオウイルス属、基準種：創傷 腫瘍ウイルス、属：オリザウイルス属、基準種：イネｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未分類ウイルス：ゲノム１本鎖ＤＮＡ：種：バナナｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐウイルス、種：ココナッツｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙウイルス、種：サブタレニアン・クローバー矮化ウイルス、
ゲノム：２本鎖ＤＮＡ、種：キュウリ葉脈黄化ウイルス；ゲノム：２本鎖ＲＮＡ、種：タバコ矮化ウイルス、
ゲノム：１本鎖ＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅモザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ｏｕｒｍｉａ メロンウイルス、種：ペラルゴニウムｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス；
サテライト及びウイロイド：サテライト：１本鎖ＲＮＡサテライトウイルス：サブグループ２ サテライトウイルス、基準種：タバコ壊死サテライト、
サテライトＲＮＡ、サブグループ２ Ｂ型ｍＲＮＡサテライト、サブグループ３ Ｃ型線状ＲＮＡサテライト、サブグループ４ Ｄ型環状ＲＮＡサテライト、
ウイロイド、基準種：ジャガイモやせいも病ウイロイド。
【００３５】
多くの場合、植物ウイルス起源のベクターは、植物において自律複製可能なプラスミド（レプリコン）として本発明に用いられる。しかしながら、非ウイルス配列を用いるそのようなプラスミドの操作に必要な原理は公知である。例えば、植物細胞に由来する多くの推定複製起点が記載されている（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１６１−１６２；Ｈｅｒｎａｎｄｅｓら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、４１３−４２２；Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、１７３−１８２；Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。高等植物ゲノム由来の自律複製配列（ＡＲＳ配列）は、酵母及び高等動物のＡＲＳ配列と共通した構造的特長及び配列的特徴を有することが示されている（Ｅｃｋｄａｈｌら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２、５０７−５１６）。植物ＡＲＳ配列はサッカロミセス・セレビジエ中のプラスミドに自律複製能を付与可能である。酵母においてプラスミドの自律複製を促進可能なトウモロコシの核ＤＮＡ配列の研究により、トウモロコシゲノム内に２つのファミリーの高度反復配列を表すことが示された。それらの配列は特徴的なゲノムハイブリダイゼーションパターンを有する。典型的には、それぞれの１２〜１５ｋｂのゲノム断片上にＡＲＳ相同配列のコピーがたった１つ存在した（Ｂｅｒｌａｎｉら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：１６１−１６２）。植物起源のレプリコンの他の供給源は、植物において異種遺伝子の増幅及び発現を刺激することができる植物リボソームＤＮＡスペーサー配列である（Ｂｏｒｉｓｊｕｋら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１８、１３０３−１３０６）。高率増幅による所望の効果は、強力なプロモーターを用いることによって達成することもできる。そのようなプロモーターは高コピー数の目的転写物を提供することができ、複製ベクターに類似の最終結果を生ずる。
【００３６】
したがって、本発明で意図するレプリコン又は前駆体ベクターは必ずしも植物ウイルスに由来する必要はない。植物ＤＮＡウイルスは、標的ＤＮＡの形質転換に特に有用なレプリコン（ベクター）を操作する容易な方法を提供するが、植物ＲＮＡウイルス又は非植物ウイルスであっても、全体的に又は部分的にこれに由来する配列で作製されるベクターは可能である。植物ウイルスに基づいたレプリコンは明らかに有益である。そのようなレプリコンは、複製に加えて、例えば細胞間移行及び長距離移行のための更なる有用な機能を提供することができる。更に、それらは、感染植物からウイルスを根絶するための公知の方法を用いることによって、しばしば植物細胞から帰納的に、より容易に除去することができる。
【００３７】
本発明では、ウイルスベクターの特定部分の部位特異的組換え（反転）によって活性化することができるウイルスレプリコンを用いることが好ましい（図３、図９及び図１１を参照されたい）。これらのレプリコンはＤＮＡウイルス（ＢＧＭＶ、ＷＤＶ）及びＲＮＡウイルス（ＴＭＶ）に基づくことができる。部位特異的組換えによるＤＮＡウイルスベクターの再構築は、ウイルスＤＮＡの複製開始に十分であることは図面から明らかである。ＴＭＶに基づくベクターの場合、ＤＮＡの再構築のみでは複製開始に通常十分でないため、状況が異なる。そのようなＲＮＡレプリコンの増幅を誘発するためには転写が必要とされる。転写を駆動する構成的プロモーター（図１１を参照されたい）は誘導性プロモーター又は種子特異的プロモーターに置換し得るため、こうした必要性は、ＲＮＡに基づいたアンプリコン発現のための更なる制御工程の使用を可能にし、増幅の空間的及び一時的制限方法を厳重に制御し、より柔軟性を与える。
【００３８】
発明を効率的に実施するには、可能な最高収率を提供する最良の可能な組み合わせを見出すために、それぞれのウイルスレプリコンのタイプについて種子特異的プロモーターの多くの異なる組み合わせを解析することが好ましい。
【００３９】
本発明の重要な要素は、ハイブリッド種子が子孫を作れないということである。即ち、例えば稔性植物への発育が不可能であることにより、種子は不稔であることが好ましい。多くの場合、ウイルスベクターの複製はこの所望の効果を提供し、したがって更なる種子の発育を損なうことが期待される。しかしながら、目的産物を提供するベクターの複製が十分でない場合、所望の効果を達成するために追加の技術を適用することができる。実施例５には、ハイブリッド種子においてインテイン介在性トランススプライシングによって組み立てられる細胞毒性遺伝子（バルナーゼ）の使用について記載されている。インテインが融合したバルナーゼ断片は異なる親植物中に局在し、異なる発生学的に調節されたプロモーターの制御下にあることができる。断片はともにハイブリダイゼーションによってもたらされ、インテイン介在性トランススプライシングの結果として細胞毒性産物を形成することができる。異なるが部分的に重複する発現パターンを有する異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を、バルナーゼ断片の発現をともに駆動する同一の組織特異的プロモーターを用いるよりも、必要とする組織に正確な方法で制限することができる。シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）とシロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を実施例５で使用し、２つのバルナーゼ断片の発現を駆動させた（図１５を参照されたい）。これらのプロモーターは、活性が発芽種子の頂端分裂組織に重なるため、好適なバルナーゼ活性パターンを提供する。多くの他の発生学的に調節されたプロモーター及び組織特異的プロモーターを本態様の実施に用いることができるため、本発明はこれら２つのプロモーターの使用に限定されない。本態様に有用なプロモーターの例としては、光合成の活性な組織で発現されるシロイヌナズナＨＢＰ−１ａ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｋａｍｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２４８、５７３−５８２）、種子特異的ナピン遺伝子プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１０１９−１０２７）、発生学的に調節されたｒｂｃＳ遺伝子のプロモーター（Ｍａｎｚａｒａら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３、１３０５−１３１６）、などが挙げられる。
【００４０】
実施例では、主に植物細胞におけるアグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ送達を使用し、Ｔ−ＤＮＡは第１及び／又は第２の部分的遺伝子供与物をベクターとして含有する。植物細胞にベクターを送達するために、微粒子銃、エレクトロポーレーション又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換による細胞へのベクターの直接導入のような異なる方法を用いてもよい。アグロバクテリウム介在植物形質転換が好ましい。したがって、アグロバクテリウムによって運搬されるＴｉ−プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、粒子又は微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）などのさまざまな好適な技術によってＤＮＡで植物細胞を形質転換することができる。原理上、例えばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６号；ＷＯ０９４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポーレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１号）などの他の植物形質転換法を用いることもできる。形質転換法の選択は、形質転換すべき植物種に依存する。例えば、単子葉植物の形質転換には微粒子銃が好ましく、双子葉植物には通常アグロバクテリウム介在形質転換がより良い結果与えることができる。
【００４１】
本発明は、高等多細胞植物を用いて実施することが好ましい。本発明での使用に好ましい植物には、農学的及び園芸学的に重要な種に関連した植物種が含まれる。本発明に使用するための一般的な作物には、アルファルファ、オオ麦、インゲン豆、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズ豆、ルピナス、キビ、オート麦、エンドウ豆、落花生、イネ、ライ麦、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、大豆、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウ豆、ソラ豆、コムギ、フジ、及び堅果植物が含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、限定されるものではないが、イネ科、キク科、ナス科及びバラ科の代表的なものが挙げられる。
【００４２】
本発明での使用に更に好ましい種は、以下の属に由来する植物である：シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、ライムギ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ、及びＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ並びにその他多くのもの。
【００４３】
好ましいのは、ハイブリッド種子産生システムが存在する植物である。第１及び第２の親植物のハイブリッドである種子を高率で産生するためには、これらのシステムを、本発明とともに使用することが好ましい。最も好ましいのは、トウモロコシ、コムギ、チカラシバ、ダイズ、ナタネ種子、カノーラ、タバコ、及びイネである。
【００４４】
本発明を用いてセンス方向又はアンチセンス方向に発現させることができる目的タンパク質、又はその断片には以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ヘルビコラ リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ（ketohydrolase）、アセトアセチルＣｏＡ レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、カリホルニアウンベルラリア Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、６−不飽和化酵素、植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームでの酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインから成るタンパク質融合物、オレオシンタンパク質と融合タンパク質を脂質相に標的化可能な目的タンパク質との翻訳融合物、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、プラスチドの内側エンベロープ膜にある成熟リン酸輸送体タンパク質のアミノ末端疎水性領域と前記膜に標的化された目的タンパク質との融合物など。
【００４５】
ヒト又は動物のいかなるタンパク質も、特に本発明のシステムを用いたハイブリッド種子において発現させることができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、以下のタンパク質（薬用タンパク質）が挙げられる：免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカイン及びその受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、線維素溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、並びに上記タンパク質の融合体、変異体型及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質。
【００４６】
本発明の方法は、トランスジェニックコード配列の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を抑制するために、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質又はその機能保存的変異体若しくは断片をコードする遺伝子を植物において発現させることを更に含むことができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質遺伝子又はその機能保存的変異体若しくは断片を、トランスジェニックコード配列を有する同一ベクター上で又は余分のベクター上で植物に提供することができる。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質は、ウイルス又は植物起源であることが好ましい。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質の例は、ジャガイモウイルスＸ ｐ２５タンパク質、アフリカ キャッサバモザイクウイルス ＡＣ２タンパク質、イネｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅウイルスＰ１タンパク質、トマトｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔウイルス １９Ｋタンパク質、ｒｇｓ ＣＡＭ、又はこれらのタンパク質のうちの１つの機能保存的変異体若しくは断片である。機能保存的変異体又は断片は、上記タンパク質の１つに対し、７５％の配列同一性を有することが好ましく、好ましくは少なくとも７５％同一である。ＰＴＧＳサプレッサータンパク質及びその使用に関する詳細は、ＷＯ０１３８５１２号に見出すことができる。
【実施例１】
【００４７】
ＢＧＭＶベクター
ＧＦＰを有するジェミニウイルス複製ベクターのクローニング：
ｐＵＣ１９ ＤＮＡを、ｄｎａａｐｒ７プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇｔ ｃｔａ ｇａｃ ｔｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ｔｔｔ ｔａｃ ａａｃ）及びｄｎａａｐｒ８プライマー（ａａｃ ｔｇｃ ａｇａ ａｃａ ａｔｔ ｇｃｔ ｃｇａ ｇｇｃ ｇｔａ ａｔｃ ａｔｇ ｇｔｃ ａ）を用いて増幅し、増幅断片をＰｓｔＩで消化し、再連結した。得られたプラスミドｐＩＣＨ１１４４は、ｐＵＣ１９に類似するが、ポリリンカーがＸｈｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＰｓｔＩで置換されている。ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したインゲンゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）単離物ＤＳＭＺ ＰＶ−００９４を感染させたインゲンマメ組織から、ＤＮＡを抽出した。ＢＧＭＶ共通領域を包含するゲノムの断片（ＣＲ；ＢＧＭＶの複製起点を含有）を、ｄｎａａｐｒ３プライマー（ｇｇｇ ａａｔ ｔｃａ ｃｔａ ｇｔａ ａａｇ ａｔｃ ｔｇｃ ｃｇｔ ｃｇａ ｃｔｔ ｇｇａ ａｔｔ ｇ）及びｄｎａａｐｒ４プライマー（ｃａａ ｔｇｃ ａｔｃ ａｔｇ ｇｃｇ ｃａｔ ｃａｃ ｇｃｔ ｔａｇ ｇ）を用いてＰＣＲで増幅し、ＭｆｅＩ及びＰｓｔＩで消化したｐＩＣＨ１１４４中にＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１１５６を得た。ｐＩＣＨ１１５６中のＢＧＭＶ挿入物を配列決定した。他の２つのＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノム断片を、ＢＧＭＶを感染させたインゲンマメＤＮＡから、ｄｎａａｐｒ９プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａａｇ ｇａｔ ｃｃｔ ｃｔｇ ｇａｃ ｔｔａ ｃａｃ ｇｔｇ ｇａａ ｔｇｇ）／ｄｎａａｐｒ１３プライマー（ｃｇｃ ｔｃｇ ａｇｇ ｃｃｇ ｔｃｇ ａｃｔ ｔｇｇ ａａｔ ｔｇｔ ｃ）ペア、及びｄｎａａｐｒ５プライマー（ｇａａ ｇａｔ ｃｔｇ ｃａａ ｇａｇ ｇａｇ ｇｔｃ ａｇｃ ａ）／ｄｎａａｐｒ１０プライマー（ａａｇ ｃｔｇ ｃａｇ ａｔｃ ｔａｔ ｔｔｃ ｔａｔ ｇａｔ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｃ）ペアを用いて増幅させた。これらの断片の合計は、コートタンパク質のない完全長ＢＧＭＶゲノムになる。これらの断片をそれぞれＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ及びＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩで消化したｐＩＣＨ１１５６に、３通りの連結法でクローニングした。得られたプラスミドは、重複したＢＧＭＶ ＤＮＡＡ共通領域に隣接するコートタンパク質遺伝子のない１つの完全長ＢＧＭＶ ＤＮＡＡゲノムを含有する。試験のために３つのクローン：ｐＩＣＨ１６６３、１６６４及び１６６７を保存した。コートタンパク質遺伝子がＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを含有するマルチクローニング部位に置換されている。ｐＩＣ０１１（ｐＵＣ１８内にＨｂｔプロモーター−合成ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーター）由来の合成ＧＦＰ（ＳＧＦＰ）コード配列を、ｐＩＣＨ１６６３、ｐＩＣＨ１６６４及びｐＩＣＨ１６６７のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位にＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７を得た。ＧＦＰをコートタンパク質プロモーターの制御下に置く。クローンｐＩＣＨ１６９３、ｐＩＣＨ１６９４及びｐＩＣＨ１６９７の機能性に関して試験するために、ベンサミアナタバコ及びインゲンマメの切除葉に、遺伝子銃粒子送達システム１０００／ＨＥ（バイオラッド）を用いて照射した。翌日、３つの構築体全てに関し、両方の種の葉においてＧＦＰ発現上皮細胞が検出されるであろう。
【００４８】
バイナリーベクターでのクローニング
ｐＩＣＨ１６９４のＸｈｏＩ−ＮａｒＩ断片を、ＸｈｏＩ及びＣｌａＩで消化したｐＩＣＢＶ１１にサブクローニングすることによって、ｐＩＣＨ１６９４のプロレプリコン部分を含有するバイナリーベクターを作製した。得られたクローンｐＩＣＨ４３００（図２）は、ＢＧＭＶコートタンパク質プロモーターの制御下にあるＧＦＰ遺伝子、及び重複ＣＲ間にＡＬ１／２／３遺伝子を含有する。
【００４９】
「反転した」ジェミニウイルスプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ７３００はｐＩＣＨ４３００に類似するが、いくつかの制限酵素部位（ＳａｌＩ、ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、及びＢｇｌＩＩ）が、制限部位が重複する変異プライマーを用いたＰＣＲで除去されている。レプリカーゼの部分と共通領域うちの１つを含有する断片の転置によって複製不可能なクローンｐＩＣＨ１５００（図３）を作製するための開始点としてｐＩＣＨ７３００を用いた。ＡｔｔＰ及びＡｔｔＢ組換え部位を転置の先端に置き、インテグラーゼを提供することによって転置領域の反転を可能にし、それにより機能性ベクターを得る。ＡｔｔＢ及びＡｔｔＢ部位は人工イントロン配列に隣接しており、インテグラーゼ介在性組換えによって生ずるＡｔｔＲ配列の、ＡＬ１転写物からのスプライシングを可能にする。
【００５０】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適格性を試験する：
ｐＩＣＨ４３００プラスミドＤＮＡを一連の植物組織に照射した。インゲンマメの葉、成熟種子、水分補給したマメの子葉及び発芽苗、並びに未成熟胚において明るい蛍光細胞が検出されるであろう。ＧＦＰ蛍光によってアッセイしたように、胚発育期の全てにおいてジェミニウイルスの複製を起こしやすいわけではない。長さ４〜５ｍｍまでの子葉がある小さな白い胚にはＧＦＰ発現細胞がなかった。逆に、より緑色したより大きな子葉はジェミニウイルスの複製に非常に適していた。
【００５１】
タバコ、ベンサミアナタバコ、シロイヌナズナ、ショカツサイ及びマングビーンを含めた他の種も、少なくとも葉において、ジェミニウイルスの複製を起こしやすかった。
【００５２】
φＣ３１インテグラーゼクローンのクローニング
ｐＩＣＰ１０１０は、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（プロモーター、第１エクソン、第１イントロン、及びアクチン２遺伝子の第１エクソンの１０ヌクレオチドを含有する１３４４ヌクレオチド断片）に融合したストレプトミセスファージＣ３１インテグラーゼ（Ｄａｖｉｄ Ｏｗより、植物遺伝子発現センター、米国農務省−農業研究サービス、アルバニー、ＣＡ９４７１０、ＵＳＡ）を含有するバイナリーベクターである。核へのインテグラーゼの輸送を増加させるために、ＳＶ４０ Ｔ抗原由来の核局在シグナル（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｎｄｒｅａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０、２２９９−２３０６）を、φＣ３１インテグラーゼのＣ末端に融合させた。ｃ３１ｐｒ１プライマー（ｇｃａ ｃｇｃ ｃｇａ ａｇｇ ｃｇａ ｃｇａ ａｇ）及びＮＬＳ配列を含有する伸長部を含有するＰＣＲプライマー（３１ｎｌｓ１：ｇｇａ ｔｃｃ ｔａａ ａｃｃ ｔｔｃ ｃｔｃ ｔｔｃ ｔｔｃ ｔｔａ ｇｇｃ ｇｃｃ ｇｃｔ ａｃｇ ｔｃｔ ｔｃｃ ｇｔｇ）を用いたｐＩＣＰ１０１０からのＰＣＲ増幅によってＮＬＳ配列をインテグラーゼ配列に付加し、ＢｓｐＥＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣＰ１０１０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１０８８１（図６）を得た。異なるプロモーターを容易にサブクローニングするために、ｐＩＣＨ１０８８１からインテグラーゼ及びＮｏｓターミネーターをＰｓｔＩ／ＡｐａＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１へサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１３９０１（示していない）を得た。このベクターは、Ｎｏｓプロモーター−ＮｐｔＩＩコード配列−Ｎｏｓターミネーター 選択カセット及びポリリンカーＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ−ＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。適当な種のゲノムＤＮＡから、遺伝子特異的プライマーを用いていくつかのプロモーターを増幅し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣＨ１３９０１にクローニングした。前記プロモーターを更にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてｐＩＣ０１にサブクローニングし（図６）、発育種子への微粒子銃によってＧＵＳレポーター遺伝子との融合物としてそれらの活性について試験した（示していない）。
【００５３】
インテグラーゼφＣ３１の発現を駆動するために、ソラマメ由来のＵＳＰ遺伝子のプロモーター（Ｆｉｅｄｌｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、６６９−６７９）、ＡｔＥｍ６遺伝子のプロモーター（Ｖｉｃｉｅｎｔら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ、５１、１２１１−１２２０）、トウモロコシｒａｂ１７遺伝子のプロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、１２８５−１２９５）並びにシロイヌナズナ アクチン２遺伝子及びイネ アクチン１遺伝子の構成的プロモーターを含めたいくつかの単子葉植物及び双子葉植物の種子特異的プロモーターを選択した（それぞれ構築体ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐIＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１０８８１及びｐIＣＨ１４５３０、図６を参照されたい）。
【００５４】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ベンサミアナタバコの葉ディスクを、構築体ｐIＣＨ１５００、ｐＩＣＨ４５５０及びｐＩＣＨ４５４０（インテグラーゼ）で形質転換し、各構築体について独立した形質転換体を得た。ｐＩＣＨ１５００の１０個の形質転換体を、各インテグラーゼ構築体の少なくとも５つの形質転換体と交雑させた。未成熟発育種子を切開し、ＧＦＰ蛍光を顕微鏡を用いて青色光下で観察した。
【実施例２】
【００５５】
ＷＤＶベクター
ドイツ微生物・培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）から入手したコムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）を感染させたコムギ葉サンプルからＤＮＡを抽出した。互いに逆向きでゲノムのユニークＥｃｏＲＩ部位が重複するプライマーを用いて、ＷＤＶの完全長ゲノム（ｃａ．２．８ｋｂ）をＰＣＲで増幅させた：
ＦｗｄｖＥ１ ａＧＡＡＴＴＣａｃａｃｃｇａｔｇｇｇｃｔｃ
ＲｅｗｄｖＥ１ ｔＧＡＡＴＴＣｔｇｃａｃａｃｔｃｃｃａｃｇ
増幅断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にクローニングした。２つのクローンについて塩基配列を決定した。ＢＬＡＳＴ解析は、増幅配列が、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに存在する完全に配列決定した４つのＷＤＶ株（ＧＥＷＤＶＸＸ、ＷＤＶＧＮＳ、ＷＤＷ３１１０３１、ＮＣ ００３３２６）とは著しく異なるが、ハンガリーで単離された部分的に配列決定した（１．２ｋｂ）ウイルス（ＡＪ３１１０３８；Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４７（１）：２０５−２１６、２００２）とは密接に適合することを示した。
【００５６】
コートタンパク質遺伝子を除いた完全長ゲノムを増幅するために、得られた配列データに基づいて２つのプライマーを設計した（ｔｔＣ ＣＡＴ Ｇｇａ ｇｔｔ ａｃｃ ｔｃｇ ｇｇ ａｇｔ ｃｃｔ ｔｇｔ ｔｇ 及び ｔｔＧ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ Ｇｃａ ａａａ ｔａｇ ｔａｔ ｔｔｔ ａｔｔ ｃａｔ ｃｔｃ ａｔｇ ｔｃ）。上記感染葉ＤＮＡからＰＣＲを行った。
【００５７】
ＰＣＲ増幅産物を、ＳｐｈＩ及びＮｃｏＩで消化したＧＦＰの変異型（Ｓ６５ＴＧＦＰ）を含有するｐＵＣ１９ベクターにＳｐｈＩ−ＮｃｏＩ断片としてクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１０６８０は、ＣＰをＧＦＰで置換した唯一のＷＤＶゲノムを含有する（図１３）。
【００５８】
重複ＬＩＲを有する完全長ゲノムを２工程でバイナリーベクターにクローニングした。第１に、ｐＩＣＨ１０６８０のＢａｍＨＩ−ＡｐａI断片を、ＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで消化したバイナリーベクターにサブクローニングした。この中間体クローンは、ＣＰのかわりにＧＦＰを有する部分ＷＤＶゲノムを含有するが、ＰｓｐｏＭＩ及びＰｃｉＩで消化し（Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化）、ｐIＣＨ１０６８０のＳｍａI−ＮｏｔＩ断片をクローニングする第２工程に用いた。得られたクローンｐIＣＨ１０８３０（図７）は、ＣＰをＧＦＰで置換した完全長ＷＤＶゲノムを含有し、重複ＬＩＲに隣接し、ＷＤＶ−ＧＦＰレプリコンの切り出し及び増幅を可能にする。
【００５９】
ジェミニウイルスを複製するために胚の適合性を試験する：
ｐＩＣＨ１０８３０をコムギ及びトウモロコシの発育胚に照射した。胚に強力なＧＦＰ蛍光を発する細胞が観察されたが、胚乳でも検出されるであろう（図８）。
【００６０】
「反転した」ＷＤＶプロベクターのクローニング
ＢＧＭＶベクターに関して記載したのと同一のストラテジーを用いて、「反転した」ＷＤＶベクターｐＩＣＨ１４５２０を作製した（図９）。このクローンが複製開始可能になるのは、φＣ３１インテグラーゼに曝露して反転させた後のみである。このクローンの機能性を試験するため、トウモロコシの胚に単独で、又はインテグラーゼクローンｐＩＣＨ１４５３０若しくはｐＩＣＨ１４５６０とともに照射した。ｐＩＣＨ１４５２０をインテグラーゼとともに照射したときのみＧＦＰ蛍光細胞が検出されるであろう。
【００６１】
安定な形質転換実験及びハイブリダイゼーション実験
ｐＩＣＨ１４５２０及びインテグラーゼクローンでトウモロコシを形質転換した。
両方の構築体に由来する選択した形質転換体を両方向で交雑させ、さまざまな発育期で未成熟種子を切開し、顕微鏡又は携帯ＵＶランプを用いて青色光下で観察した。
【実施例３】
【００６２】
ＣＲ−ＴＭＶベクター
ＧＦＰを有するｃｒ−ＴＭＶ複製ベクターのクローニング：
ｐＩＣＨ４３５１（図１０）はｃｒ−ＴＭＶ、アブラナ感染トバモウイルス（Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５０、５−８）に基づいたウイルスベクターである。ｐＩＣＨ４３５１は、Ｃｒ−ＴＭＶの５’非翻訳配列、続いてＲｄＲｐ及びＭＰを含有し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド１〜５６２９、ＭＰの最後の１６アミノ酸を、ＭＰ機能を喪失することなく切断し、Ｚ２９３７０中の５６０５位のＴをＣに変異させた）、シロイヌナズナ アクチン２プロモーター（７８７ヌクレオチド断片、転写開始の５’側、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ４１９９８、Ａｎら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０、１０７−１２１）に融合している。ＭＰの後にＬｏｘＰ部位が続く。この部位は、この構築体の使用に関して機能的に意味がなく、それを構築するために用いたプラスミドにも存在しているために存在している。ＬｏｘＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ由来のＩＲＥＳ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド４８０４〜４８７３）、及びＧＦＰ ＯＲＦが続く。ＧＦＰ発現を増加させるための翻訳エンハンサーとしてＩｒｅｓをこの位置にクローニングした。ＧＦＰの後にはｃｒ−ＴＭＶ ３’非翻訳配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｚ２９３７０のヌクレオチド６０８３〜６３１２）、アグロバクテリウム Ｎｏｓターミネーターが続く。この構築体を、植物でカナマイシン選択するためのカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターｐＩＣＢＶ１０にクローニングする（Ｎｏｓプロモーター−ＮＰＴＩＩコード配列ｓ−Ｎｏｓターミネーター）。この構築体では、ＧＦＰはＭＰの末端に局在するＣＰサブゲノムプロモーターから発現される。照射又はアグロインフィルトレーション（agroinfiltration）による核への送達後、核においてアクチン２プロモーターから作製された第１転写物は、複製が起こる細胞質へ輸送される。
【００６３】
「反転した」ｃｒ−ＴＭＶプロベクターのクローニング
ｐＩＣＨ１０９２１はｐＩＣＨ４３５１から作製したウイルスプロベクターである（図１１）。これは、ＩｒｅｓからＮｏｓターミネーターまで伸びたＤＮＡ断片が逆方向に反転して構築体を複製不可能にしているという事実によってｐＩＣＨ４３５１とは異なっている。この断片の反転を可能にするために、φＣ３１のＡｔｔＰ部位（ｇｔａ ｇｔｇ ｃｃｃ ｃａａ ｃｔｇ ｇｇｇ ｔａａ ｃｃｔ ｔｔｇ ａｇｔ ｔｃｔ ｃｔｃ ａｇｔ ｔｇｇ ｇｇｇ ｃｇｔ ａｇａ）及びＡｔｔＢ部位（ｔｃｇ ａａｇ ｃｃｇ ｃｇｇ ｔｇｃ ｇｇｇ ｔｇｃ ｃａｇ ｇｇｃ ｇｔｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｇｇｃ ｔｃｃ ｃｃｇ ｇｇｃ ｇｃｇ ｔａｃ ｔｃｃ ａｃｃ ｔｃａ ｃｃｃ ａｔｃ）を転置の末端に位置付ける。
【００６４】
転置部分の反転が機能性ベクターをもたらすかどうかを試験するため、ｐＩＣＨ１０９２１でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉のａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎに用いた。ｐＩＣＨ１０９２１を単独で浸潤させたときはＧＦＰスポットが検出されなかったが、ｐＩＣＨ１０９２１をｐＩＣＨ１０８８１（インテグラーゼ発現ベクターを含有）で形質転換したアグロバクテリウムとともに共浸潤させたときは非常に多くのＧＦＰ複製フォーカスが見られるであろう。
【００６５】
安定な形質転換及びハイブリダイゼーション実験
ｐＩＣＨ１０９２１、ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０及びｐｌＣＨ１４５５０で、ベンサミアナタバコを葉ディスク形質転換によって個別に形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを形質転換体の選択に用いた（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）。両構築体に由来する選択した形質転換体を両方向で交雑させ、未成熟種子を切開し、顕微鏡を用いて青色光下で観察した。ハイブリッド種子においてＧＦＰ発現が検出された。
【実施例４】
【００６６】
トランスジェニックトウモロコシ植物の作製
トウモロコシのユビキチンプロモーターの制御下で、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）を単子葉植物形質転換のための選択可能マーカーとして用いた（図１２）。選択薬剤としてハイグロマイシンＢを２５〜１００ｍｇ／ｌの濃度で適用した。
【００６７】
トランスジェニックトウモロコシ植物を作製するために以下の方法を用いた：
Ａ１８８株、Ｈｉｌｌ株などの成熟及び未成熟胚からカルス培養を誘導した。培地はＣｈｕ（Ｎ６）塩及びビタミンに基づいている（Ｃｈｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ、１８（５）：６５９−６８，１９７５）。
カルス誘導培地及び繁殖培地には３０ｇ／ｌのショ糖、６００ｍｇ／ｌのＬ−プロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ及び０．３％ゲルライトが添加されている。
プレ再生培地は使用しなかった。再生培地は、Ｎ６塩及びビタミン、３０ｇ／ｌのショ糖、２ｍｇ／ｌのゼアチン及び０．０５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含有する。再生培地にはチオ硫酸銀が０．０１〜０．０６ｍＭの濃度で含まれている。
【００６８】
微粒子銃
遺伝子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム（バイオラッド）を用いて微粒子銃を実施した。細胞を、９００〜１１００ｐｓｉで、マクロキャリアー発射点から停止スクリーンまで１５ｍｍの距離で、及び停止スクリーンから標的組織まで６０ｍｍの距離で照射した。破裂ディスクとマクロキャリアーの発射点との距離は１２ｍｍであった。細胞を、４時間の浸透圧前処理後に照射した。
【００６９】
ＤＮＡ−金コーティングを、バイオラッドのオリジナルプロトコール（Ｓａｎｆｏｒｄら、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｗｕ編、２１７、４８３−５０９）にしたがって以下のように行なった：２５μｌの金粉末（０．６、１．０ｍｍ）を５０％グリセロール（６０ｍｇ／ｍｌ）中で、０．２μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ５μｌ、２５μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）及び１０μｌの０．１Ｍ スペルミジンと混合した。混合物を２分間ボルテックスし、続いて室温で３０分間インキュベーションし、遠心（２０００ｒｐｍ、１分）し、７０％及び９９．５％のエタノールで洗浄した。最後に、沈殿を３０μｌの９９．５％エタノール（６μｌ／ショット）に再懸濁した。
【００７０】
新規のＤＮＡ−金コーティング法（ＰＥＧ／Ｍｇ）を以下のように行った：２５μｌの金懸濁液（５０％グリセロル中に６０ｍｇ／ｍｌ）をエッペンドルフチューブ中で５μｌのプラスミドＤＮＡと混合し、次に３０μｌの４０％ＰＥＧ（１．０Ｍ ＭｇＣｌ２中）を添加する。混合物を２分間ボルテックスし、室温で３０分間、混合せずにインキュベートした。遠心（２０００ｒｐｍ、１分）後、沈殿を１ｍｌの７０％エタノールで２回、１ｍｌの９９．５％エタノールで１回洗浄し、最後に３０μｌの９９．５％エタノール中に分散させた。ＤＮＡ−金 エタノール懸濁液のアリコート（６μｌ）をマクロキャリアーディスクにロードし、５〜１０分間乾燥した。
【００７１】
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドで大腸菌株ＤＨ１０Ｂを形質転換し、ＬＢ培地中でｍａｘｉ ｐｒｅｐを増殖させ、キアゲンキットを用いてＤＮＡを精製した。
【００７２】
選択
安定な形質転換実験のために、処置細胞を有するフィルターを、ろ過滅菌した適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ））、３％ショ糖を有する固形ＭＳ２培地上に移して遮光した。７日毎に材料を新鮮な選択培地に移した。プレートを暗所保存し、およそ６週間後、植物材料を再生培地及び適当な選択薬剤（１５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシンＢ）の入ったペトリ皿に移した。ペトリ皿を強い光度でインキュベートした。日照時間１６時間。
【実施例５】
【００７３】
ハイブリッド種子の発育を制御するためのバルナーゼに基づいたシステム
バルナーゼ遺伝子を、ラン藻ＰＣＣ６８０３ ＤｎａＢ インテインを用いて分割した。適当な制限部位に隣接したバルナーゼのＮ端部分及びＣ端部分のＤＮＡ断片を営利なＤＮＡ合成会社で化学的に合成した。
【００７４】
Ｎ末端の配列は以下の通りである：
５’ｇｃａａｔｃｇａｔｇ ｇｃａｃａｇｇｔｔａ ｔｃａａｃａｃｇｔｔ ｔｇａｃｇｇｇｇｔｔ ｇｃｇｇａｔｔａｔｃ ｔｔｃａｇａｃａｔａ ｔｃａｔａａｇｃｔａ ｃｃｔｇａｔａａｔｔ ａｃａｔｔａｃａａａ ａｔｃａｇａａｇｃａ ｃａａｇｃｃｃｔｃｇ ｇｃｔｇｇｇａｃｇｔ ｃｃｇｃ３’。
【００７５】
Ｃ末端の配列は以下の通りである：
５’ｃｇｃｃａｔｇｇｇｇ ｔｇｇｃａｔｃａａａ ａｇｇｇａａｃｃｔｔ ｇｃａｇａｃｇｔｃｇ ｃｔｃｃｇｇｇｇａａ ａａｇｃａｔｃｇｇｃ ｇｇａｇａｃａｔｃｔ ｔｃｔｃａａａｃａｇ ｇｇａａｇｇｃａａａ ｃｔｃｃｃｇｇｇｃａ ａａａｇｃｇｇａｃｇ ａａｃａｔｇｇｃｇｔ ｇａａｇｃｇｇａｔａ ｔｔａａｃｔａｔａｃ ａｔｃａｇｇｃｔｔｃ ａｇａａａｔｔｃａｇ ａｃｃｇｇａｔｔｃｔ ｔｔａｃｔｃａａｇｃ ｇａｃｔｇｇｃｔｇａ ｔｔｔａｃａａａａｃ ａａｃｇｇａｃｃａｔ ｔａｔｃａｇａｃｃｔ ｔｔａｃａａａａａｔ ｃａｇａｔａａｇｇａ ｔｃｃｇｃ３’。
【００７６】
バルナーゼのＮ末端をＤｎａＢインテインのＮ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｎ断片をラン藻ＤＮＡから、ＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ１プライマー（５’ｇｔＡＡＧＣＴＴＧＡ ＣＧＴｃａｇａｇａｇ ａｇｔｇｇａｔｇｃａ ｔｃａｇｔｇｇａｇａ ｔａｇ３’）及びＤｎａＢｉｎｔＮｐｒ２プライマー（５’ｃａＣＴＧＣＡＧｃｔ ａｔａａｔｔｇｔａａ ａｇａｇｇａｇｃｔｔ ｔｃｔａｇ３’）を用いて増幅した。バルナーゼ断片（ＣｌａＩ／ＡａｔＩＩ断片）及びインテイン断片（ＡａｔＩＩ／ＰｓｔＩ断片）をアイコン・ジェネティクス バイナリーベクターにクローングし、ｐＩＣＨ１２７９４クローンを得た（図１４）。
【００７７】
バルナーゼのＣ末端をＤｎａＢインテインのＣ端部分に融合させた。ＤｎａＢインテイン−Ｃ断片を、ラン藻ＤＮＡから、ｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ１プライマー（ｇｔ ＧＡＧ ＣＴＣ Ｇ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＡ ｇｃｃ ｃａｇ ａａａ ｔａｇ ａａａ ａｇｔ ｔｇｔ ｃｔｃ）及びｄｎａＢｉｎｔＣｐｒ２プライマー（ｔｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ｔｃｔ ｔｇｃ ｔｃｔ ｔｃａ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｇ ａｃａ ａｔｇ ａｔｇ ｔｃａ ｔ）を用いて増幅した。インテイン断片（ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ断片）及びバルナーゼ断片（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片）をアイコン・ジェネティクス バイナリーベクターにクローニングし、クローンｐＩＣＨ１２８２０を得た（図１４）。
【００７８】
ベンサミアナタバコの葉のアグロインフィルトレーションによって、Ｎ端及びＣ端 バルナーゼ−インテイン融合クローンの機能性を試験した。予想通り、両構築体をともに浸潤させた葉領域は壊死したが、いずれかの構築体を単独で浸潤させた領域は健常のままであった。
【００７９】
ｐＩＣＨ１２７９４及びｐＩＣＨ１２８２０をｐＩＣＢＶ１６にサブクローニングした。これは植物形質転換体をカナマイシンで選択するためのＮｐｔＩＩカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。得られたプラスミドはｐＩＣＨ１４７８０及びｐｌＣＨ１４７７０である（図１４）。
【００８０】
シロイヌナズナ遺伝子ＳＴＭの茎頂分裂組織特異的プロモーター（Ｌｏｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、６６−６９）を、ＳＴＭｆｗｄプライマー（ｃｇ ｃａａｔｔｇ ｇｔｇｇｃａａｇａｇｇｔｃｔａｃｃａｔｃｔ）及びＳＴＭｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｃａｃｔａｇｔａｔｔ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＭｆｅＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０及びｐＩＣＨ１４７８０（ＥｃｏＲＩ ＳａｃＩで消化）にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００を得た（図１５）。２つのプラスミドのプロモーター領域を配列決定した。ｐＩＣＨ１４７９０及びｐＩＣＨ１４８００は、ＳＴＭプロモーターの制御下にあるＣ末端及びＮ末端バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８１】
シロイヌナズナ遺伝子ＡＴＨＢ５の発芽特異的プロモーター（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５１、７１９−７２９）を、ＡＴＨＢ５Ｆｗｄプライマー（ｃｇ ｇａａｔｔ ｃｃａｇｃｔｃａｔｃａａｃｃａａａｃｔｃｔｇｔ）及びＡＴＨＢ５ｒｅｖプライマー（ｇｃ ｇａｇｃｔｃｔｔｔｇｃｔｃｔｇｔｇｔｃｔａｇａｃｔａｔｃｃ）を用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７７０にサブクローニングし、プラスミドｐＩＣＨ１４８１０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０から増幅した断片を配列決定し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＩＣＨ１４７８０にサブクローニングし、ｐＩＣＨ１４８２０を得た（図１５）。ｐＩＣＨ１４８１０及びｐＩＣＨ１４８２０は、発芽特異的プロモーターの制御下にある５’及び３’バルナーゼ−インテイン融合体から成る。
【００８２】
４つのプラスミド全てをアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に導入し、シロイヌナズナの形質転換に用いた。全てのトランスジェニック植物は表現型が正常である。トランスジェニック植物を、同一のプロモーター又は異なるプロモーターを有する相補的バルナーゼ構築体を含有する植物と交雑させた。異なるプロモーターの使用により、バルナーゼ活性を用いたプロモーターの重複領域まで制限することが可能である。Ｆ１種子を乾燥させて種を蒔いた後に収穫した。これらは発芽したが、成長点の欠失により拘束された。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ａ−本発明の一般的原理。第１親植物株Ａを第２親植物株ＢとハイブリダイズさせてＦ１種子を産生する。親株の種子は目的産物を産生しないが、生育可能である。Ｆ１種子では遺伝子供与が生じ、目的産物の産生を可能にする。この場合はその蛍光によって観察されるＧＦＰである（写真中の光の点）。場合により目的産物をコードするウイルスベクターの強力な複製と組み合わせた、目的産物の強力な発現の結果、Ｆ１種子は生育不可能である。
【図１Ｂ】図１は、ハイブリッド種子（本発明のＦ１種子）において目的産物を高収率で産生する本発明の方法の一般的スキームを示す。図１Ｂ−植物発育期（フレーム内）。精細胞と雌性配偶体とのハイブリダイゼーション後、目的産物（左の囲み）を発現する種子（Ｆ１種子）が産生される。Ｆ１種子からの植物の発育はブロックされている。右の囲みは、Ｆ１種子が稔性植物に生長できないことを示す。
【図２】図２は、プラスミドｐＩＣＨ４３００のＴ−ＤＮＡ領域、及びハイブリッド種子におけるＢＧＭＶ（インゲンマメモザイクウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。
【図３】図３は、プラスミドｐＩＣＨ１５００のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼ活性の存在下におけるＤＮＡレプリコンの形成を示すスキームである（実施例１を参照されたい）。ｐＩＣＨ１５００の遺伝要素は、第１の部分的遺伝子供与によって種子に提供することができる。インテグラーゼφＣ３１はコードされ、第２の部分的遺伝子供与によって種子に提供されることができる。
【図４】図４は、プラスミドｐＩＣＨ５１８４を照射した、インゲンマメの未成熟胚（Ａ、左の大きな写真）、及びマングビーン リョウトクの発芽種子からの子葉（Ｂ、右の小さな写真）を示す。ＧＦＰを目的産物として発現するマメの胚が円で囲まれている。
【図５】図５は、ｐＩＣＨ５１８４ベクターを照射したマングビーンの発芽種子の苗条を日光下（左）及びＵＶ光下（右）で示す。
【図６】図６は、構築体ｐＩＣＨ１０８８１、ｐＩＣＨ１４５４０、ｐＩＣＨ１４５５０、ｐＩＣＨ１４５６０、ｐＩＣＨ１４５３０、及び構築体ｐＩＣ０１のＴ−ＤＮＡ領域のスキームを示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＩＣＨ１０８３０のＴ−ＤＮＡ領域、及びＷＤＶ（コムギ萎縮ウイルス）に基づいたＤＮＡレプリコンの形成のスキームを示す（実施例２を参照されたい）。
【図８】図８は、コムギ胚（Ａ）及びトウモロコシ種子組織（Ｂ）においてコムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）−ＧＦＰ発現カセットを含有するプラスミドｐＩＨ１０８３０を照射し、形質転換後４日の結果を示す。
【図９】図９は、プラスミドｐＩＣＨ１４５２０のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼφＣ３１活性の存在下におけるレプリコン形成のスキームを示す。ＬＩＲ及びＳＩＲはコムギ萎縮ウイルスの長い及び短い遺伝子間領域である；ＭＰ−移行タンパク質；Ｒｅｐ−ウイルスレプリカーゼ；ＲｅｐＡ−ウイルスレプリカーゼＡ。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＩＣＨ４３５１のＴ−ＤＮＡ領域及びＲＮＡレプリコンの形成を示す。ＧＦＰに隣接するグレーのドット領域はＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列を示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＩＣＨ１０９２１のＴ−ＤＮＡ領域、及びインテグラーゼφＣ３１活性の存在下におけるＲＮＡレプリコンの形成を示す。
【図１２】図１２はプラスミドｐＩＣＨ１６００の略図を示す。
【図１３】図１３は構築体ｐＩＣＨ１０６８０の略図を示す。
【図１４】図１４は、構築体ｐＩＣＨ１２７８４、ｐＩＣＨ１２８２０、ｐＩＣＨ１４７８０及びｐＩＣＨ１４７７０の略図を示す。
【図１５】図１５は、構築体ｐＩＣＨ１４８００、ｐＩＣＨ１４７９０、ｐＩＣＨ１４８２０及びｐＩＣＨ１４８１０の略図を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項３】
目的産物がＲＮＡ、タンパク質、酵素、又は前記酵素がその合成に関与しているポリマーのような化学化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項５】
遺伝子供与物が、目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、遺伝子供与物は目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含み、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが目的産物をコードする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分から生ずる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複製ＤＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＤＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複製ＤＮＡがＤＮＡ部位特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ部位特異的組換えが、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はフリッパーゼによって触媒される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複製ＤＮＡが、Ｆ１種子において、第１親植物由来の部位特異的リコンビナーゼと第２親植物由来の複製ＤＮＡの前駆体とを組み合わせることによって生ずる、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
複製ＤＮＡが自律的プラスミドである、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
複製ＲＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＲＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複製ＲＮＡが、第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８又は１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
複製ＲＮＡが第１の部分的遺伝子供与のＤＮＡの転写によって生じ、転写は第２の部分的遺伝子供与の成分又は発現産物によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複製ＲＮＡがハイブリダイゼーションに関与する雌性親植物によってコードされている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの形成に必要なＲＮＡ又はタンパク質の転写が、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、又は化学的に調節されるプロモーターによって制御される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが植物ウイルスを起源とする、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
複製ＤＮＡがジェミニウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
複製ＲＮＡが１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
複製ＲＮＡがトバモウイルスに基づいている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの複製が、有性生殖不可能なＦ１種子の植物生長をもたらす、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆ１種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除されており、より好ましくはＦ１種子は不稔である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、Ｆ１種子は有性生殖不可能であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２７】
Ｆ１種子から生長した植物が、生殖生長期に達する前に植物の発育をブロックするために有性生殖不可能である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
植物発育のブロックは、正常な植物の発育を妨げる毒性物質又はタンパク質の組織特異的発現によって達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質が、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的産物が、発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子の中に蓄積する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーションの雌性親植物が雄性不稔である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
目的産物が、ハイブリダイゼーションの雌性親植物によって提供される部分的遺伝子供与物によってコードされ、目的産物は好ましくは目的タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
種子における目的産物の産生が、遺伝子供与を生ずることによって誘発される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られる又は得ることが可能な産物。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって産生される又は産生可能な種子。
【請求項３７】
種子から生長した植物の有性生殖が損なわれており、好ましくは植物は性的に不稔である、請求項３６に記載の種子。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項３】
目的産物がＲＮＡ、タンパク質、酵素、又は前記酵素がその合成に関与しているポリマーのような化学化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項５】
遺伝子供与物が、目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、遺伝子供与物は目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含み、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが目的産物をコードする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分から生ずる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複製ＤＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＤＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複製ＤＮＡがＤＮＡ部位特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ部位特異的組換えが、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はフリッパーゼによって触媒される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複製ＤＮＡが、Ｆ１種子において、第１親植物由来の部位特異的リコンビナーゼと第２親植物由来の複製ＤＮＡの前駆体とを組み合わせることによって生ずる、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
複製ＤＮＡが自律的プラスミドである、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
複製ＲＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＲＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複製ＲＮＡが、第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８又は１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
複製ＲＮＡが第１の部分的遺伝子供与のＤＮＡの転写によって生じ、転写は第２の部分的遺伝子供与の成分又は発現産物によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複製ＲＮＡがハイブリダイゼーションに関与する雌性親植物によってコードされている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの形成に必要なＲＮＡ又はタンパク質の転写が、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、又は化学的に調節されるプロモーターによって制御される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが植物ウイルスを起源とする、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
複製ＤＮＡがジェミニウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
複製ＲＮＡが１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
複製ＲＮＡがトバモウイルスに基づいている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの複製が、有性生殖不可能なＦ１種子の植物生長をもたらす、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆ１種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除されており、より好ましくはＦ１種子は不稔である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、Ｆ１種子は有性生殖不可能であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２７】
Ｆ１種子から生長した植物が、生殖生長期に達する前に植物の発育をブロックするために有性生殖不可能である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
植物発育のブロックは、正常な植物の発育を妨げる毒性物質又はタンパク質の組織特異的発現によって達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質が、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的産物が、発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子の中に蓄積する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーションの雌性親植物が雄性不稔である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
目的産物が、ハイブリダイゼーションの雌性親植物によって提供される部分的遺伝子供与物によってコードされ、目的産物は好ましくは目的タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
種子における目的産物の産生が、遺伝子供与を生ずることによって誘発される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られる又は得ることが可能な産物。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって産生される又は産生可能な種子。
【請求項３７】
種子から生長した植物の有性生殖が損なわれており、好ましくは植物は性的に不稔である、請求項３６に記載の種子。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項１】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項３】
目的産物がＲＮＡ、タンパク質、酵素、又は前記酵素がその合成に関与しているポリマーのような化学化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１又は第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項５】
遺伝子供与物が、目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、遺伝子供与物は目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含み、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが目的産物をコードする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分から生ずる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複製ＤＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＤＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複製ＤＮＡがＤＮＡ部位特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ部位特異的組換えが、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はフリッパーゼによって触媒される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複製ＤＮＡが、Ｆ１種子において、第１親植物由来の部位特異的リコンビナーゼと第２親植物由来の複製ＤＮＡの前駆体とを組み合わせることによって生ずる、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
複製ＤＮＡが自律的プラスミドである、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
複製ＲＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＲＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複製ＲＮＡが、第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８又は１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
複製ＲＮＡが第１の部分的遺伝子供与のＤＮＡの転写によって生じ、転写は第２の部分的遺伝子供与の成分又は発現産物によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複製ＲＮＡがハイブリダイゼーションに関与する雌性親植物によってコードされている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの形成に必要なＲＮＡ又はタンパク質の転写が、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、又は化学的に調節されるプロモーターによって制御される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが植物ウイルスを起源とする、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
複製ＤＮＡがジェミニウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
複製ＲＮＡが１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
複製ＲＮＡがトバモウイルスに基づいている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの複製が、有性生殖不可能なＦ１種子の植物生長をもたらす、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆ１種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除されており、より好ましくはＦ１種子は不稔である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、Ｆ１種子は有性生殖不可能であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２７】
Ｆ１種子から生長した植物が、生殖生長期に達する前に植物の発育をブロックするために有性生殖不可能である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
植物発育のブロックは、正常な植物の発育を妨げる毒性物質又はタンパク質の組織特異的発現によって達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質が、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的産物が、発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子の中に蓄積する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーションの雌性親植物が雄性不稔である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
目的産物が、ハイブリダイゼーションの雌性親植物によって提供される部分的遺伝子供与物によってコードされ、目的産物は好ましくは目的タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
種子における目的産物の産生が、遺伝子供与を生ずることによって誘発される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られる又は得ることが可能な産物。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって産生される又は産生可能な種子。
【請求項３７】
種子から生長した植物の有性生殖が損なわれており、好ましくは植物は性的に不稔である、請求項３６に記載の種子。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項３】
目的産物がＲＮＡ、タンパク質、酵素、又は前記酵素がその合成に関与しているポリマーのような化学化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第１及び第２の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項５】
遺伝子供与物が、目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１と第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、遺伝子供与物は目的産物の産生に関与する複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡを含み、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項７】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが目的産物をコードする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが、Ｆ１種子において第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分から生ずる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複製ＤＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＤＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複製ＤＮＡがＤＮＡ部位特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ部位特異的組換えが、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はフリッパーゼによって触媒される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複製ＤＮＡが、Ｆ１種子において、第１親植物由来の部位特異的リコンビナーゼと第２親植物由来の複製ＤＮＡの前駆体とを組み合わせることによって生ずる、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
複製ＤＮＡが自律的プラスミドである、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
複製ＲＮＡが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすＲＮＡウイルスレプリコンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複製ＲＮＡが、第１の部分的遺伝子供与成分と第２の部分的遺伝子供与成分からＲＮＡ特異的組換えによって生ずる、請求項５〜８又は１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
複製ＲＮＡが第１の部分的遺伝子供与のＤＮＡの転写によって生じ、転写は第２の部分的遺伝子供与の成分又は発現産物によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複製ＲＮＡがハイブリダイゼーションに関与する雌性親植物によってコードされている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの形成に必要なＲＮＡ又はタンパク質の転写が、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、又は化学的に調節されるプロモーターによって制御される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
複製ＤＮＡ又は複製ＲＮＡが植物ウイルスを起源とする、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
複製ＤＮＡがジェミニウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
複製ＲＮＡが１本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスに基づいている、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
複製ＲＮＡがトバモウイルスに基づいている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複製ＤＮＡ又はＲＮＡの複製が、有性生殖不可能なＦ１種子の植物生長をもたらす、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆ１種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除されており、より好ましくはＦ１種子は不稔である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第１及び第２のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるＦ１種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、Ｆ１種子において第１及び第２のトランスジェニック親植物の第１及び第２の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、Ｆ１種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、Ｆ１種子は有性生殖不可能であり、続いて目的産物をＦ１種子から単離するか又はＦ１種子を蒔く、前記方法。
【請求項２７】
Ｆ１種子から生長した植物が、生殖生長期に達する前に植物の発育をブロックするために有性生殖不可能である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
植物発育のブロックは、正常な植物の発育を妨げる毒性物質又はタンパク質の組織特異的発現によって達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質が、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的産物が、発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子の中に蓄積する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーションの雌性親植物が雄性不稔である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
目的産物が、ハイブリダイゼーションの雌性親植物によって提供される部分的遺伝子供与物によってコードされ、目的産物は好ましくは目的タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
種子における目的産物の産生が、遺伝子供与を生ずることによって誘発される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られる又は得ることが可能な産物。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法にしたがって産生される又は産生可能な種子。
【請求項３７】
種子から生長した植物の有性生殖が損なわれており、好ましくは植物は性的に不稔である、請求項３６に記載の種子。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年3月31日(2006.3.31)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年3月31日(2006.3.31)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【公表番号】特表２００６−５２６９８４（Ｐ２００６−５２６９８４Ａ）
【公表日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８２８１（Ｐ２００６−５０８２８１）
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６０６９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８９３４
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０３１２８０４３）アイコン ジェネティクス アクチェンゲゼルシャフト (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６０６９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８９３４
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０３１２８０４３）アイコン ジェネティクス アクチェンゲゼルシャフト (6)
【Ｆターム（参考）】
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