ハイブリドーマ、ハイブリドーマの取得方法および該ハイブリドーマを用いた抗体生産方法
【課題】本発明は、免疫測定等に使用されるビオチン標識物捕捉に有用な抗体の取得を目的とする。
【解決手段】化学式Ｉ記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として免疫細胞を取得後、ミエローマと細胞融合して得ることを特徴とするハイブリドーマの取得方法。
【解決手段】化学式Ｉ記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として免疫細胞を取得後、ミエローマと細胞融合して得ることを特徴とするハイブリドーマの取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原−抗体反応、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション等の生物学的特異反応に基づき、特異反応に関与する物質の測定方法および該測定方法において用いられるリガンド捕捉剤および該捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
固相免疫測定法においては、測定対象とする核酸、抗原あるいは抗体に応じて、あらかじめ該当する核酸に対応する固定化プローブ、該当する抗原に対応する固定化抗体固相あるいは該当する抗体に対する固定化抗原固相を調製し、測定の都度、対象とする物質に対応した当該固相を選択する方法が従来では一般的であった。このような方法では、測定対象物質ごとに必要とされる固相の種類は無数となるため、固相の調製が煩雑を極め、かつ、測定操作も機械的あるいは用手法に関わらず、測定対象物質に応じて適当な固相ごとに選択しなければならないという煩雑さが重なっていた。
【０００３】
上記の問題を解決しようとする試みはすでになされている。例えば、一種類のリガンド捕捉剤固定化固相を用い、測定対象物質に応じたリガンド標識生理活性物質を選択して、リガンド捕捉剤固定化固相上で測定時に必要とするリガンド標識生理活性物質、即ち、リガンド標識プローブ、抗原あるいは抗体を固相に捕捉することに基づく方法が知られている。また、必要な固相を調製するか、あるいは、試料中の測定対象の核酸、抗原あるいは測定対象抗体とリガンド標識抗体もしくはリガンド標識抗原をリガンド捕捉剤固定化固相上に添加し、捕捉することにより、免疫的に測定される任意の測定対象物質の測定を可能にする方法も知られている。（たとえば、特許文献１、特許文献２参照）さらに極めて短い時間で、１ｍｌ当たりナノグラム量のレベルでの測定感度を得る方法も知られている。（例えば特許文献３参照）またリガンド捕捉剤と生理活性物質を同一の第一の結合用粒子担体上に固定化して検出試薬と免疫学的な反応を行わせ、第二の担体上に固定化したリガンドで結合用粒子担体自体を捕捉させることで従来イムノクロマト法よりも高感度とする方法も知られている。（例えば、特許文献４参照）
【０００４】
また、ビオチンに対する抗体についてポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が知られている。（例えばモノクローナル抗体であれば 非特許文献１、非特許文献２参照。これら文献には免疫原はビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステルをウシ血清アルブミンあるいはキーホールリンペットヘモシアニンに結合させて調製した記述がある。） ビオチンに対する結合性を有するものとして、アビジン、ストレプトアビジンなどが知られており、特にアビジンとビオチンの複合体は極めて安定で、その解離定数は１０−１５Ｍと非常に高いことが知られている。
【特許文献１】特公平４−４９６５７号公報
【特許文献２】特開平２−１４５９６７号公報
【特許文献３】特開２００１−２３５４７１号公報
【特許文献４】特開２００４−２１９２４１号公報
【非特許文献１】Ｄａｋｓｈｉｎａｍｕｒｔｉら Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １９８６年，２３７巻，ｐ４７７
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９７年、２７９巻，ｐ４５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高感度が必要とされる免疫測定でリガンド標識にビオチンを用いる場合、リガンド捕捉剤にビオチンに対して高い結合性を有するアビジンやストレプトアビジンを使用しても、測定に十分な感度が得られない場合があった。市販されている既存のビオチンに対するモノクローナル抗体でも十分な感度が得られず、リガンド捕捉剤として高い反応性を有する抗体の取得が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、キャリア蛋白と結合させる化合物としてビオチン部分と活性基との間のスペーサー部分が従来用いられていた化合物よりも長い化学式I記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として免疫しハイブリドーマを作製したところ、ビオチンを結合させた抗体に対する反応性が高く、かつ遊離のビオチンに対する反応性の低いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るに至り、本発明に到達した。
【０００７】
即ち本発明は、以下の（１）から（６）に関する。
（１）化学式I
【０００８】
【化２】
【０００９】
記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として動物を免疫して得られた免疫細胞を細胞融合に用いることを特徴とするハイブリドーマの取得方法
（２）（１）記載の方法で得られたハイブリドーマ
（３）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９７９として寄託されている（２）記載のハイブリドーマ
（４）（３）記載のハイブリドーマを利用して抗体あるいは抗体断片を得ることを特徴とする抗体生産方法
【発明の効果】
【００１０】
本発明記載のハイブリドーマの取得方法により得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体はビオチンで標識化した物質に対する高い捕捉能力を有している。本特性は生物学的特異反応に基づき、特異反応に関与する物質の測定方法および該測定方法において用いられるリガンド捕捉剤に有用で、リガンド捕捉試薬に適用すれば診断・鑑別を迅速・簡易・高感度することが可能と考える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のハイブリドーマの取得方法では、免疫原として化学式Ｉ
【００１２】
【化３】
【００１３】
に示されるビオチン部分と活性基との間にスペーサー部分を有する化合物（ビオチン化試薬）をキャリア蛋白に結合させた抗原を使って公知の方法により免疫動物に免疫を行い、公知の方法により免疫細胞を取得した後、公知の方法によりミエローマと細胞融合実施し、公知の方法により融合細胞と非融合細胞との選択実施し、公知の方法により目的の抗体を産生する細胞のスクリーニング・クローニングを実施する。
キャリア蛋白としてビオチン化試薬が反応できる官能基を有していて免疫原性があれば特に限定しないが、高純度品か精製により高純度化できるものが望ましく、例えば牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｍｉｎ 以下 ＢＳＡと略）、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ 以下 ＫＬＨと略）、ヤギイムノグロブリンＧなどを用いることができる。
ビオチン化試薬は化学式Ｉ
【００１４】
【化４】
【００１５】
に示される市販のビオチン化試薬が使用できる。キャリア蛋白のアミノ基と反応するスルホスクシイミジル基に換えてスルホン酸基がないスクシイミジル基を有する化学式ＩＩ
【００１６】
【化５】
【００１７】
で示される化合物でもキャリア蛋白との結合した構造は変わらないことから同様な効果が得られると考える。抗原ビオチン化手順は公知の方法でビオチン化することができ、例えば予め５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ８で透析したキャリア蛋白を用意し、ビオチン化試薬を適当な溶媒で溶解後、キャリア蛋白モル比として過剰となる量、例えば２０倍量をキャリア蛋白溶液に添加・攪拌の後２５℃２時間反応させ、その後未反応のビオチン化試薬を１０ｍＭ燐酸生理緩衝液で透析することにより除去し、ビオチン化抗原を得ることができる。抗原ビオチン化に際しては市販のビオチン標識化キットを使用することもできる。従来技術とは異なっている点であるビオチンとアミノ基とのスペーサー距離が、免疫細胞への抗原提示に重要と考えられ、マレイミド基やヒドラジド基を有する同様な構造をもつ化合物であってもキャリア蛋白と結合させて免疫に使用すれば、本発明と同様な効果が得られると考えられる。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは上述の免疫原で免疫を行った後、公知のモノクローナル抗体作成法例えば単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年記載内容に従い、作製することができる。抗体はＩｇＭ，ＩｇＧのいずれでもよいが、公知の蛋白分解酵素や遺伝子組み換え技術を用いて低分子化、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ‘）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントなどにして使用することもできる。
【００１９】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマなどである。ただし摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性などの観点からは、マウスおよびラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はないが、マウスの場合には、例えばＢＡＬＢ／ｃ メス ４〜１２週令を用いることができる。
【００２０】
動物の免疫は、上述の免疫原を動物の皮内、腹腔内、筋肉内または投与することによって行うことができる。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。
【００２１】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２２】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３），ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１），Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１），Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３），ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０），Ｆ０等などである。
【００２３】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００２４】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。動物血清であれば例えばウシ胎児血清を０．１乃至２０％添加してもよい。ＩｇＧ含量を予め低減させた血清を使用してもよい。増殖因子であれば例えばＩＬ−６、インシュリン、エタノールアミン、セレン、２メルカプトエタノール、ピルビン酸、非必須アミノ酸類を添加してもよいし、コンデションメディウムであれば例えば胸腺細胞培養後の培養上清５％乃至２０％を添加してもよいし、抗生物質であれば例えばゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンを添加してもよいし、蛋白であれば例えばウシ血清アルブミン、カゼイン、トランスフェリンを添加してもよい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃でおこなうことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％で培養するのが好ましい。
【００２５】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の抗体スクリーニング方法が使用でき、例えば酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、凝集法、セルソーター等により行うことができる。ＥＩＡであればビオチンを固定化した担体を用いて得られた細胞培養上清に含まれるビオチン結合活性を有する抗体の有無を検知することにより、また例えば凝集法であれば、ビオチンを固定化した粒子、例えば羊赤血球をビオチン化試薬と反応させて得られたビオチン化羊血球と細胞培養液を丸底プレートで反応させて観察される凝集阻止像の有無によりビオチン結合活性を有する抗体の有無を検知することにより、セルソーターであれば蛍光標識したビオチン試薬をハイブリドーマと混合し細胞表面の蛍光有無により識別分離することにより、所望の抗体を産生する細胞をスクリーングすることができる。
【００２６】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法などの公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００２７】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよいし、市販の細胞凍結保存剤を用いて凍結保存してもよい。
【００２８】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法、例えば 動物細胞大量培養と有用物質生産 大石道夫監修 株式会社シーエムシー １９８６年 記載の方法を用いて培養・精製することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。例えばＢＡＬＢ／ｃＡマウスに免疫しＢＡＬＢ／ｃＡ由来のミエローマと細胞融合したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与した同系統マウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。培養時に使用する培地は血清を含まない市販の無血清培地、無血清無蛋白培地を使用するとさらに純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。必要により培地に公知の抗生物質・抗真菌剤、糖質、脂質やアミノ酸を追加することができる。抗生物質・抗真菌剤であれば例えば、硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを細胞生育に影響しない程度添加することができる。糖質であれば例えば、グルコース、マルトース、キシロースを添加することができる。アミノ酸であれば、例えばＬ−グルタミンを添加することができる。Ｌ−グルタミンは培養液中で不安定であるため８ｍＭ程度まで添加することもできるが、溶液中で安定なグルタミン誘導体であるＬ−グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを添加してもよい。これらの結果としてハイブリドーマ培養環境の良好化、培養液中の抗体分泌量を高めることができる。ハイブリドーマ作成時と異なる培地を適用して細胞培養抗体生産を行う場合は、同培地に予め馴化させたハイブリドーマを使用することが好ましい。例えば同培地に直接ハイブリドーマをけん濁し、遠心分離操作により細胞と培地を分離、次いで同培地で比較的高い細胞濃度０．５乃至１ｘ１０６／ｍｌとなるよう再けん濁し、倍化速度と生存率など細胞の状況を観察しながら培養を繰り返す。直接同培地に馴化できない場合は従来の培地から混合比を段階的に上げながら行うこともできる。
【００２９】
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを組み込んだ形質転換体を培養することにより所望の抗体を得ることができる。抗体生産により抗体が形質転換体内に蓄積される場合は公知の方法により形質転換体を回収し破砕することにより抗体を含んだ破砕液が得られる。抗体生産により形質転換体を培養した培地中に抗体が分泌される場合には形質転換体培養により該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ破砕液や培養上清は公知の抗体精製方法でより純度の高い抗体を得ることができる。
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、該抗体遺伝子あるいは遺伝子断片から結合活性を有する蛋白部分をコードするメッセンジャーＲＮＡを公知の方法で合成し公知の無細胞蛋白合成方法により抗体生産することもできる。抗体生産により該抗体を含んだ蛋白合成反応液が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ蛋白合成反応液は公知の抗体精製方法でより純度の高い抗体を得ることができる。
【００３０】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、ＵＦ膜濃縮、カラムクロマトが挙げられる。カラムクロマトに使用できる樹脂担体として例えば陰イオン交換樹脂やプロテインＡやプロテインＧ、ＰｒｏｔｅｉｎＬ、ビオチン化合物が結合されたアフィニティクロマト樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、疎水クロマト樹脂などの抗体吸着性のあるものや、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体が挙げられる。特にアフィニティクロマト樹脂を使用する際、樹脂に抗体吸着させてから抗体溶出までのプロセスにおけるカラム洗浄操作が重要であり、カラムサイズに対して５倍量以上の緩衝液を通液することが望ましく、より好ましくは１０倍乃至２０倍通液することが望ましい。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性の緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐＨは５．５〜８．５の間が好ましい。
【００３１】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌メンブランフィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤として例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコールを添加することもできる。安定化蛋白質の例としてウシ血清アルブミンやゼラチンなどが挙げられ、保存中沈殿が生じない濃度で添加することができる。濃度範囲としてより好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。
【００３２】
モノクローナル抗体の等電点は公知の分析手段で分析することができ、例えばポリアクリリアミドゲル等電点電気泳動によって分析することができる。またモノクローナル抗体のアイソタイプは、公知の分析手段で分析することができ、例えばマウスであればＩｇＧ１ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、カッパー鎖、ラムダ鎖各アイソタイプに特異的に結合する抗体の結合性有無により確認することができ、市販の抗体アイソタイピングキットを使用してもよい。
【００３３】
本発明の抗体はリガンド捕捉試薬として担体に結合された形態で使用することができる。担体は公知の素材が使用でき、例えばポリスチレン、ガラス、シリカ、セルロース、ポリビニル、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、マグネタイト、金、白金、水晶、脂質、蛋白質、ラテックスなどが挙げられる。抗体の固定化方法は、一旦固定化された抗体の脱離が使用上問題ないレベルであれば適用することができ、公知の方法が適用できる。固定化に使用する抗体液に使用する緩衝液は特に限定しないが、調製工程で抗体が失活することなく、固定化反応を阻害しないものであれば使用することができ、例えばｐＨであれば３乃至１０の範囲、濃度であれば１ｍＭ乃至２００ｍＭの範囲のものを使用することができる。例えばポリスチレン製エライザプレートであればダルベッコのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ（−））、燐酸緩衝液 ｐＨ７、炭酸緩衝液 ｐＨ９．６で適当な濃度に希釈した抗体液を２〜４０℃の範囲で３０分乃至一晩固相と接触させて固定化することができる。また例えばガラス繊維上に固定化するのであればクエン酸緩衝液 ｐＨ３にて適当な濃度に希釈した抗体液を２〜４０℃の範囲で０．５分乃至一晩、より好ましくは５分乃至３０分固相と接触させて固定化することができる。またグルタルアルデヒドやカルボジイミドといった架橋試薬を使用し共有結合的に担体表面の官能基と抗体を結合させてもよいし、また本発明の抗体を捕捉しうる物質、例えば、第二の抗体、プロテインＡ，プロテインＧ，プロテインＬ、ビオチン化物質を予め担体に固定化しておき、その親和性により捕捉させ固定化してもよい。形状は公知の形状が使用でき、例えば９６穴エライザプレート、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、イムノクロマトストリップ用膜、ガラス繊維、多孔性膜、磁性ビーズ、ラテックス粒子、デキストラン粒子、アガロース粒子、金コロイド、血球、細胞、ウイルス、リポソーム、水晶振動子、金薄膜などが挙げられる。これらの担体は必要により着色されていてもよい。
これら担体に抗体を結合させた後、非特異的な蛋白吸着を抑える目的で他の蛋白・界面活性剤やポリマー・血清などの含む溶液を固相に接触させるブロッキング工程を実施してもよい。ブロッキングに使用する蛋白としてブロッキング蛋白として公知の蛋白が使用でき、例えば牛血清アルブミン、無脂乳蛋白、カゼイン、ゼラチン、セリシンが挙げられ、０．１乃至１０％溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する界面活性剤やポリマーとして、ブロッキング剤として公知の界面活性剤・ポリマーが使用でき、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンが挙げられる。これらは使用する担体に応じて選択し、０．１乃至０．５％濃度溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する血清として、ビオチンを多量に含まない血清であれば使用することができ、例えば牛胎児血清、新生牛血清、ウマ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清、ブタ血清、マウス血清が挙げられ、０．５％乃至１００％溶液を使用することができ、好ましくは使用する前に血清ロットチェックを行い、リガンド捕捉能に影響しないか確認して使用することが望ましい。
本発明の抗体を使用したリガンド捕捉試薬は、調製後保存液中で乾燥させることなく保管しても、乾燥状態で保管してもよい。保存液中で保管する場合には実使用に問題のない捕捉活性を維持できるよう、必要に応じ保存液中に蛋白、高分子ポリマー、緩衝剤、塩類、防腐剤から選択される成分を添加することが望ましく、それぞれの使用担体や抗体との結合様式を勘案しこれら組み合わせの保存安定化効果を検討し、添加物質や量について設定することが望ましい。また乾燥状態で保管する場合には乾燥により捕捉活性が低下せず、かつ使用時捕捉性能が容易に復元するよう、公知の糖類、糖アルコール、アミノ酸、蛋白、高分子ポリマー、緩衝剤、塩類から選択される成分を添加した安定化液に接触させ、乾燥させることができる。添加する蛋白は例えば牛血清アルブミン、カゼインが挙げられる。糖類・糖アルコールでは、公知の安定化効果ある糖類・糖アルコールが使用でき、例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、グリセロールが挙げられ、アミノ酸では公知の安定効果あるアミノ酸、例えばグリシン、リジン、アルギニンが挙げられる。これら濃度については０．１乃至１０％溶液で調製し使用することができる。乾燥方法は、公知の乾燥方法でリガンド捕捉能が低下しない方法であれば適用することができ、例えば自然乾燥、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結真空乾燥、赤外線や遠赤外線による乾燥、またマイクロウェーブなどの高周波を利用した乾燥等が挙げられる。乾燥後は、吸湿しない条件で保管することが好ましく、シリカゲルなど乾燥剤とともに密封保管することが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１：抗ビオチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）免疫原として使用するビオチン化ＫＬＨの調製
ガンマ線滅菌されたふた付きポリプロピレン製サンプルチューブに、１０ｍＭ燐酸生理緩衝液ｐＨ７．２（以下 ＰＢＳ緩衝液と略）で溶解されたＫＬＨ（ＥＭＤバイオサイエンス社製 濃度２５．２ｍｇ／ｍｌ エンドドキシンフリー）２００μＬ、１Ｍ 炭酸水素ナトリウム溶液 ５０μＬ、オートクレーブ滅菌蒸留水（以下 滅菌水と略） ２０５μＬの順に加えて混合し、ＫＬＨ溶液を調製した。次いでＢｉｏｔｉｎ−（ＡＣ５）２−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ(同仁化学社製)１０ｍｇを滅菌水３００μＬで溶解し、速やかに溶解したうちの４５μｌを上述のＫＬＨ溶液に添加混合し、２５℃にて２時間反応させた。未反応のビオチン試薬を除くため、滅菌済みＰＢＳ緩衝液でセファデックスＧ２５担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を平衡化し、同担体を３ｍｌ充填したミニカラムを予め準備した。ビオチン化反応後のＫＬＨ溶液を同カラムに添加、次いでＰＢＳ緩衝液１ｍｌにて溶出させ、溶出全量をビオチン化ＫＬＨとして回収した。
（２）マウスの免疫および細胞融合
ビオチン化ＫＬＨを１ｍｇ／ｍｌとなるよう注射用生理食塩水にて希釈し抗原液を調製した。抗原液０．２ｍｌ分を等量のコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ 、５週令、メス、日本クレア）の腹腔に１匹あたりエマルジョン１００μＬ注入し、初回免疫を行った。さらに２週間、４週間、７週間後、ビオチン化ＫＬＨを０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう同様に希釈して抗原液を調製し、インコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と抗原液を等量混合・エマルジョン化し、同様に同マウスに再度免疫を施した。初回免疫から１０週間後に１回、以降１ヶ月間隔で４回、ついで２週間間隔で２回、抗原液５０μｇ／ｍｌ濃度になるよう注射用生理食塩水で希釈後、腹腔に１００μｌ注入し、最終免疫の４日後、同マウスの脾臓を無菌的に摘出して脾臓細胞を調製（２．９ｘ１０8個）した。一方、骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃５％炭酸ガス濃度下拡大培養を行い、次いで血清成分を含まないｅ−ＲＤＦ培地に細胞けん濁した。このようにして得られたＳｐ２／０−Ａｇ１４ ５．７ｘ１０７個と上述の脾臓細胞とを５０ｍｌ容量の遠心管中にて混合し、２００ｘｇ １０分遠心分離を行い、上清廃棄、チューブごとタッピングして細胞塊をほぐし、３７℃環境下で５０％ポリエチレングリコール１５００液（ロシュ社）を１ｍｌ添加し細胞と混合、次いでｅ−ＲＤＦ培地を１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌの順に添加した。２００ｘｇ １０分遠心分離後、そのまま３７℃で５分間放置し、その後上清を廃棄した。パスツールピペットを使って牛胎児血清５．８ｍｌに融合細胞を縣濁し、うち２ｍｌ分を選択培養培地（１００ｘＨＡＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ社）１／１００容とＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２４０ｍｌに縣濁、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）２０枚に１２０μＬづつ各ウェルに無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下でＨＡＴ選択培養を行った。融合から１０日後目視でコロニーが認められ、ハイブリドーマの出現を確認した。
（３）抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング：選択培養後の各ウェル培養上清５０μＬをＰＢＳ緩衝液２００μｌで希釈し、試料として用い、ビオチン化ＫＬＨを固定化したエライザプレートに対する反応性を指標としてスクリーニングを実施した。すなわち、ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌになるよう希釈したビオチン化ＫＬＨ溶液５０μｌを９６穴エライザプレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに分注・均一になるよう攪拌した後２５℃２時間放置してビオチン化ＫＬＨをプレートに固定化した。次いでビオチン化ＫＬＨ溶液をエライザプレートから除去し、０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液を各ウェルに０．３ｍｌ分注・廃棄を３回繰り返して洗浄を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注して１時間２５℃で放置しブロッキングを行った。次いで液を除去し洗浄後、選択培養上清５０μＬを分注し、２５℃でビオチン化ＫＬＨ固定化プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液にて４０００倍に希釈して調整したペルオキシダーゼ標識羊抗マウスイムノグロブリン抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）５０μｌを分注し２５℃１時間プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む発色液ＴＭＢ＋（ダコサイトメーション社製）を各ウェル５０μＬ分注し２５℃で１０分酵素反応させ、１Ｎ硫酸５０μＬ分注して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。対照としてビオチン化ＫＬＨを固定化していないエライザプレートでも同様に作業を行った。
ウェル番号００２１で着色が確認されビオチン化ＫＬＨと強い反応性が認められた。１次スクリーニングとして本ウェルを選抜し、引き続きクローニングを実施した。
（４）ハイブリドーマのクローニング：限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわちスクリーニングで選抜した各選択培養ウェルの細胞を１００個となるよう無菌的にサンプリングし、それぞれクローニング培地（ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２０ｍｌに対し、最終５個／ｍｌになるよう縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）各１枚９６ウェルに２００μｌづつ無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下で１０日間培養を行った。各ウェルのクローニング培養後上清５０μｌをサンプリングし、ＰＢＳ緩衝液２００μｌで希釈しＥＬＩＳＡ試料とし、１次スクリーニングと同様にＥＬＩＳＡを実施し、反応性が認められた培養上清をサンプリングしたウェルから１ウェル選抜し１次クローニング後のハイブリドーマ００２１を得た。本細胞を拡大培養し、セルバンカー（十慈フィールド社製）に生細胞密度５ｘ１０６個／ｍｌとなるよう細胞を十分けん濁し、ガンマ線滅菌された１．８ｍｌ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に該細胞けん濁液を１ｍｌづつ分注し、密栓後−８０℃フリーザーにて凍結保存した。なお、ハイブリドーマ００２１は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１８年８月２日 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９７９として寄託されている。
【００３５】
実施例２：００２１精製抗体の調製
（１）００２１培養上清の調製：液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００２１の入ったチューブを−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０ｘｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種し３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養した。２継代同培地で培養後、６０μｇ／Ｌ 硫酸ゲンタマイシン、２ｍＭ Ｌ―グルタミン、６ｍＭ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）に培地を代えて馴化を行い、さらに３継代同培地で培養した。その後培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、次いで培地４５ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代し、７日間培養を行い、抗体を培地中に十分分泌させた。培養により得られた細胞培養液を５０ｍｌ遠心管に移し７００ｘｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清４３．９ｍｌを得た。
（２）モノクローナル抗体のサブタイピング：市販のイムノクロマト法を使ったサブタイピング試薬（イソストリップ：ロシュ社）を使い、得られた培養上清をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈した希釈液１５０μｌを試料として分析した。ハイブリドーマ００２１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＧ１ κであった。
（３）００２１精製抗体の調製：得られた培養上清はＮａＣｌ ７．９ｇと１Ｍ ホウ酸緩衝液 ｐＨ９ ２．３ｍｌとを加えて溶解混合し、０．８μｍのフィルターろ過を行った。あらかじめ３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９：以下 結合緩衝液）で平衡化されたｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をカラムに１ｍｌ充填し、培養上清全量を流速１ｍｌ／分でカラムに通液した。次いで１５ｍｌの結合緩衝液でカラム洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３）を同流速で通液してカラムより抗体を溶出させ、抗体を含む溶出液２ｍｌを得た。ただちに１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ９） ０．４ｍｌを加え、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液 １ｌに対して透析を３回実施した。ＯＤ２８０ｎｍの吸収により蛋白量を算出した結果、得られた００２１精製抗体は５．８ｍｇであった。次いでガンマ線滅菌された０．２２μｍの低蛋白吸着メンブランフィルター（日本ミリポア社製）で００２１精製抗体を濾過し、ガンマ線滅菌済プロピレン製１５ｍｌチューブ内で４℃保管した。
（４）００２１精製抗体のゲル濾過分析：ＦＰＬＣ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＴＳＫＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷ（カラム長３０ｃｍ 東ソー社製）、溶離液０．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．０を用いた流速０．５ｍｌ／分のゲル濾過分析システムを用い、００２１精製抗体１ｍｇ／ｍｌ ０．１ｍｌ 注入後の分離パターンを２８０ｎｍの吸光度変化でモニターした。溶出１６．７分を主ピークとするパターンが得られ、ベースラインを基準とした吸光度積算値に対する主ピークの割合は９５％であった。
（５）００２１精製抗体の電気泳動分析：ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、精製抗体１ｍｇ／ｍｌ １μｌをＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ３−９（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加しメーカー指定のプログラムにて電気泳動した。同時にｐＩ ＫＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を試料として泳動した。電気泳動後のゲルはクマジー染色を行ってゲル中の蛋白を可視化し、既知のｐＩマーカー蛋白の等電点と移動度から精製抗体００２１のバンド移動度を測定した。その結果、００２１精製抗体ではｐＩ６．６を中心に６．４〜６．８の範囲で複数バンドが観察された。
【００３６】
実施例３：００２１精製抗体固定化エライザプレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌに００２１精製抗体を希釈し、００２１精製抗体希釈液を調製した。
（２）９６穴エライザプレート（ＮＵＮＣ社 マキシソープ）の各ウェルに５０μｌづつ００２１精製抗体希釈液を分注・均一になるよう攪拌した後２５℃２時間放置してウェルに固定化した。次いで液をエライザプレートから除去し、０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液を各ウェルに０．３ｍｌ分注・廃棄を３回繰り返して洗浄を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注して１時間２５℃で放置しブロッキングを行った。液廃棄した後同様に洗浄を行い、０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムと０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００３７】
比較例１：アビジン固定化プレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるよう卵白由来アビジン（ナカライテスク社）を溶解し、アビジン希釈液を調製した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液をアビジン希釈液に換えて作業を実施しアビジン固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００３８】
比較例２：ストレプトアビジン固定化エライザプレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるようストレプトアビジン（ナカライテスク社）を溶解し、ストレプトアビジン希釈液を調製した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液をストレプトアビジン希釈液に換えて作業を実施しストレプトアビジン固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００３９】
比較例３：ニュートラアビジン固定化エライザプレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるようニュートラアビジン（ピアス社）を溶解し、ニュートラアビジン希釈液を調製した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液をニュートラアビジン希釈液に換えて作業を実施しニュートラアビジン固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００４０】
比較例４：市販ビオチン抗体固定化エライザプレートの調製
（１）凍結乾燥された抗ビオチンモノクローナル抗体クローン３３（ロシュ社）をメーカー指定の蒸留水を添加して復元し、次いで０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるよう希釈した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液を抗ビオチンモノクローナル抗体希釈液に換えて作業を実施し市販抗ビオチン抗体固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００４１】
実施例４：ＣＥＡ測定における感度比較
（１）抗ＣＥＡモノクローナル抗体のビオチン化：抗ＣＥＡモノクローナル抗体クローン５９０９（メディックスバイオケミカ社）０．３７ｍｇを含む０．５ｍｌの抗体液に１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を５０μｌ添加した。次いでＢｉｏｔｉｎ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ(同仁化学社製)１０ｍｇを滅菌水１ｍｌで溶解し、溶解した内の５．５μｌを速やかに上述の抗体液に添加混合し、２５℃にて２時間反応させた。未反応のビオチン試薬を除くため、滅菌済みＰＢＳ緩衝液で脱塩用カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を平衡化し、ビオチン化反応後の抗体液全量を同カラムに添加、次いでＰＢＳ緩衝液にて溶出させた。溶出液のＯＤ２８０ｎｍ吸光度をモニターし、最初に溶出したピークをビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体として回収し、次いで限外濾過膜による濃縮を行った。濃度１ｍｇ／ｍｌあたりのＯＤ２８０ｎｍを１．４として抗体濃度を算出したところ、０．６７ｍｇ／ｍｌであった。
（２）抗ＣＥＡモノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識化：抗ＣＥＡモノクローナル抗体クローン５９０５（メディックスバイオケミカ社）０．２ｍｇをペルオキシダーゼ標識キットＮＨ２（同仁化学社製）にてペルオキシダーゼ標識を行い、２００μｌのペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を得た。
（３）ビオチン化抗ＣＥＡ抗体捕捉 サンドイッチＥＩＡによる各ビオチン捕捉試薬捕捉能の比較：試料としてＣＥＡ標準品３０ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌを用いた。試料 ２５μｌを実施例３、比較例１〜４記載のビオチン捕捉試薬に分注後、０．２、０．４，０．８μｇ／ｍｌとなるよう０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で希釈したビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体を各２５μＬづつ分注・混合を行い、３７℃１時間ビオチン捕捉能とＣＥＡとの抗原抗体反応を同時に反応させた。０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液にて洗浄を行い、残った水分をプレートごとペーパータオルで叩きながら出来る限り除いた。０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体液を各５０μｌづつ分注し、さらに３７℃１時間反応させた。０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液にて洗浄を行い、残った水分をプレートごとペーパータオルで叩きながら出来る限り除いた。テトラメチルベンチジンを含む発色液ＴＭＢ＋（ダコサイトメーション社製）を各ウェル５０μｌ分注し２５℃で１０分酵素反応させ、１Ｎ 硫酸５０μｌ分注して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＣＥＡ０ｎｇ／ｍｌ試料では吸光度０．０３以下のシグナルしか認められなかった。一方ＣＥＡ３０ｎｇ／ｍｌ試料では表１に示すようにビオチン捕捉試薬ごとにシグナル強度が異なり、００２１精製抗体を固定化した実施例３のビオチン捕捉試薬でも最も高いシグナルが得られ、検討した中でビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体捕捉能が最も高いことがわかった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（４）ビオチン共存下でのビオチン化抗ＣＥＡ抗体捕捉 サンドイッチＥＩＡによる各ビオチン捕捉試薬捕捉能の比較：試料として２μｇ／ｍｌ Ｄ−ビオチンを終濃度に含むＣＥＡ標準品３０ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌを用いた。それ以外は上述の（３）記載の手順に従い測定を行った。
ＣＥＡ０ｎｇ／ｍｌ試料では吸光度０．０３以下のシグナルしか認められなかった。一方ＣＥＡ３０ｎｇ／ｍｌ試料では表２に示すようにビオチン捕捉試薬ごとにシグナル強度が異なり、００２１精製抗体を固定化した実施例３のビオチン捕捉試薬でも最も高いシグナルが得られ、検討した中でビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体捕捉能が最も高いことがわかった。
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例５：００２１精製抗体固定化ガラス繊維を含むリガンド捕捉試薬の調製
（１）吸収要素の作製：タバコフィルターを１１．５ｍｍづつ切断した。
（２）リガンド捕捉試薬に用いる容器の作製：直径９．０ｍｍ、厚さ１．０ｍｍのガラス繊維濾紙（アドバンテック東洋社製）を円形にくりぬき、上記（１）で作製した吸収要素に積層し、図２に示すような、ポリエチレン製の液体不透過性容器内に収納した。今回使用した液体不透過性容器は内径９．０ｍｍ、測定容器の長さが１５ｍｍのものを使用した。
（３）抗体の固定化：上記（２）で作製した容器の開口部より（ａ）マウス抗ビオチンモノクローナル抗体 ００２１精製抗体 ４７μｇ／ｍｌ（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０）を５０μｌ、（ｂ）５％グリセロール・１％カゼイン溶液（１０ｍＭリン酸塩―生理食塩水緩衝液ｐＨ７．４）を１００μｌ、直前に供給された液が吸引されるのを待って順次供給した後、凍結乾燥した。乾燥後はシリカゲル乾燥剤とともにガスバリア能を有する気密ポリ袋に入れ、使用まで４℃で保管した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
同一操作での分析単位の構築は分析工数省力化に向けた自動分析システム化に必須なプロセスであり、リガンド捕捉試薬は共通の分析プラットホーム構築に利用されている。本発明記載のハイブリドーマの取得方法によれば、ビオチン標識物質捕捉性能にすぐれた抗体産生ハイブリドーマの取得が可能になる。該ハイブリドーマが産生する抗体は、生物学的特異反応に基づく特異反応に関与する物質の測定方法および該測定方法において、リガンド捕捉試薬性能向上寄与や優れたリガンド捕捉試薬開発の可能性を広げると期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は実施例３、比較例１、比較例２、比較例３、比較例４で調製したビオチン捕捉試薬でビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体を捕捉させてＣＥＡ測定を行ったときのビオチン化抗体濃度依存的なシグナル感度変動を示したグラフである。
【図２】図２は本願発明の一実施例として調製したリガンド捕捉試薬容器の斜視図。
【図３】図３は図２記載のリガンド捕捉試薬容器の断面図。
【符号の説明】
【００４８】
１：外郭部
２：開口部
３：ガラス繊維濾紙
４：吸収要素
５：カップ
６：つば
７：キャップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原−抗体反応、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション等の生物学的特異反応に基づき、特異反応に関与する物質の測定方法および該測定方法において用いられるリガンド捕捉剤および該捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
固相免疫測定法においては、測定対象とする核酸、抗原あるいは抗体に応じて、あらかじめ該当する核酸に対応する固定化プローブ、該当する抗原に対応する固定化抗体固相あるいは該当する抗体に対する固定化抗原固相を調製し、測定の都度、対象とする物質に対応した当該固相を選択する方法が従来では一般的であった。このような方法では、測定対象物質ごとに必要とされる固相の種類は無数となるため、固相の調製が煩雑を極め、かつ、測定操作も機械的あるいは用手法に関わらず、測定対象物質に応じて適当な固相ごとに選択しなければならないという煩雑さが重なっていた。
【０００３】
上記の問題を解決しようとする試みはすでになされている。例えば、一種類のリガンド捕捉剤固定化固相を用い、測定対象物質に応じたリガンド標識生理活性物質を選択して、リガンド捕捉剤固定化固相上で測定時に必要とするリガンド標識生理活性物質、即ち、リガンド標識プローブ、抗原あるいは抗体を固相に捕捉することに基づく方法が知られている。また、必要な固相を調製するか、あるいは、試料中の測定対象の核酸、抗原あるいは測定対象抗体とリガンド標識抗体もしくはリガンド標識抗原をリガンド捕捉剤固定化固相上に添加し、捕捉することにより、免疫的に測定される任意の測定対象物質の測定を可能にする方法も知られている。（たとえば、特許文献１、特許文献２参照）さらに極めて短い時間で、１ｍｌ当たりナノグラム量のレベルでの測定感度を得る方法も知られている。（例えば特許文献３参照）またリガンド捕捉剤と生理活性物質を同一の第一の結合用粒子担体上に固定化して検出試薬と免疫学的な反応を行わせ、第二の担体上に固定化したリガンドで結合用粒子担体自体を捕捉させることで従来イムノクロマト法よりも高感度とする方法も知られている。（例えば、特許文献４参照）
【０００４】
また、ビオチンに対する抗体についてポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が知られている。（例えばモノクローナル抗体であれば 非特許文献１、非特許文献２参照。これら文献には免疫原はビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステルをウシ血清アルブミンあるいはキーホールリンペットヘモシアニンに結合させて調製した記述がある。） ビオチンに対する結合性を有するものとして、アビジン、ストレプトアビジンなどが知られており、特にアビジンとビオチンの複合体は極めて安定で、その解離定数は１０−１５Ｍと非常に高いことが知られている。
【特許文献１】特公平４−４９６５７号公報
【特許文献２】特開平２−１４５９６７号公報
【特許文献３】特開２００１−２３５４７１号公報
【特許文献４】特開２００４−２１９２４１号公報
【非特許文献１】Ｄａｋｓｈｉｎａｍｕｒｔｉら Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １９８６年，２３７巻，ｐ４７７
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９７年、２７９巻，ｐ４５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高感度が必要とされる免疫測定でリガンド標識にビオチンを用いる場合、リガンド捕捉剤にビオチンに対して高い結合性を有するアビジンやストレプトアビジンを使用しても、測定に十分な感度が得られない場合があった。市販されている既存のビオチンに対するモノクローナル抗体でも十分な感度が得られず、リガンド捕捉剤として高い反応性を有する抗体の取得が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、キャリア蛋白と結合させる化合物としてビオチン部分と活性基との間のスペーサー部分が従来用いられていた化合物よりも長い化学式I記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として免疫しハイブリドーマを作製したところ、ビオチンを結合させた抗体に対する反応性が高く、かつ遊離のビオチンに対する反応性の低いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るに至り、本発明に到達した。
【０００７】
即ち本発明は、以下の（１）から（６）に関する。
（１）化学式I
【０００８】
【化２】
【０００９】
記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として動物を免疫して得られた免疫細胞を細胞融合に用いることを特徴とするハイブリドーマの取得方法
（２）（１）記載の方法で得られたハイブリドーマ
（３）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９７９として寄託されている（２）記載のハイブリドーマ
（４）（３）記載のハイブリドーマを利用して抗体あるいは抗体断片を得ることを特徴とする抗体生産方法
【発明の効果】
【００１０】
本発明記載のハイブリドーマの取得方法により得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体はビオチンで標識化した物質に対する高い捕捉能力を有している。本特性は生物学的特異反応に基づき、特異反応に関与する物質の測定方法および該測定方法において用いられるリガンド捕捉剤に有用で、リガンド捕捉試薬に適用すれば診断・鑑別を迅速・簡易・高感度することが可能と考える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のハイブリドーマの取得方法では、免疫原として化学式Ｉ
【００１２】
【化３】
【００１３】
に示されるビオチン部分と活性基との間にスペーサー部分を有する化合物（ビオチン化試薬）をキャリア蛋白に結合させた抗原を使って公知の方法により免疫動物に免疫を行い、公知の方法により免疫細胞を取得した後、公知の方法によりミエローマと細胞融合実施し、公知の方法により融合細胞と非融合細胞との選択実施し、公知の方法により目的の抗体を産生する細胞のスクリーニング・クローニングを実施する。
キャリア蛋白としてビオチン化試薬が反応できる官能基を有していて免疫原性があれば特に限定しないが、高純度品か精製により高純度化できるものが望ましく、例えば牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｍｉｎ 以下 ＢＳＡと略）、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ 以下 ＫＬＨと略）、ヤギイムノグロブリンＧなどを用いることができる。
ビオチン化試薬は化学式Ｉ
【００１４】
【化４】
【００１５】
に示される市販のビオチン化試薬が使用できる。キャリア蛋白のアミノ基と反応するスルホスクシイミジル基に換えてスルホン酸基がないスクシイミジル基を有する化学式ＩＩ
【００１６】
【化５】
【００１７】
で示される化合物でもキャリア蛋白との結合した構造は変わらないことから同様な効果が得られると考える。抗原ビオチン化手順は公知の方法でビオチン化することができ、例えば予め５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ８で透析したキャリア蛋白を用意し、ビオチン化試薬を適当な溶媒で溶解後、キャリア蛋白モル比として過剰となる量、例えば２０倍量をキャリア蛋白溶液に添加・攪拌の後２５℃２時間反応させ、その後未反応のビオチン化試薬を１０ｍＭ燐酸生理緩衝液で透析することにより除去し、ビオチン化抗原を得ることができる。抗原ビオチン化に際しては市販のビオチン標識化キットを使用することもできる。従来技術とは異なっている点であるビオチンとアミノ基とのスペーサー距離が、免疫細胞への抗原提示に重要と考えられ、マレイミド基やヒドラジド基を有する同様な構造をもつ化合物であってもキャリア蛋白と結合させて免疫に使用すれば、本発明と同様な効果が得られると考えられる。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは上述の免疫原で免疫を行った後、公知のモノクローナル抗体作成法例えば単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年記載内容に従い、作製することができる。抗体はＩｇＭ，ＩｇＧのいずれでもよいが、公知の蛋白分解酵素や遺伝子組み換え技術を用いて低分子化、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ‘）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントなどにして使用することもできる。
【００１９】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマなどである。ただし摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性などの観点からは、マウスおよびラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はないが、マウスの場合には、例えばＢＡＬＢ／ｃ メス ４〜１２週令を用いることができる。
【００２０】
動物の免疫は、上述の免疫原を動物の皮内、腹腔内、筋肉内または投与することによって行うことができる。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。
【００２１】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２２】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３），ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１），Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１），Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３），ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０），Ｆ０等などである。
【００２３】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００２４】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。動物血清であれば例えばウシ胎児血清を０．１乃至２０％添加してもよい。ＩｇＧ含量を予め低減させた血清を使用してもよい。増殖因子であれば例えばＩＬ−６、インシュリン、エタノールアミン、セレン、２メルカプトエタノール、ピルビン酸、非必須アミノ酸類を添加してもよいし、コンデションメディウムであれば例えば胸腺細胞培養後の培養上清５％乃至２０％を添加してもよいし、抗生物質であれば例えばゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンを添加してもよいし、蛋白であれば例えばウシ血清アルブミン、カゼイン、トランスフェリンを添加してもよい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃でおこなうことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％で培養するのが好ましい。
【００２５】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の抗体スクリーニング方法が使用でき、例えば酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、凝集法、セルソーター等により行うことができる。ＥＩＡであればビオチンを固定化した担体を用いて得られた細胞培養上清に含まれるビオチン結合活性を有する抗体の有無を検知することにより、また例えば凝集法であれば、ビオチンを固定化した粒子、例えば羊赤血球をビオチン化試薬と反応させて得られたビオチン化羊血球と細胞培養液を丸底プレートで反応させて観察される凝集阻止像の有無によりビオチン結合活性を有する抗体の有無を検知することにより、セルソーターであれば蛍光標識したビオチン試薬をハイブリドーマと混合し細胞表面の蛍光有無により識別分離することにより、所望の抗体を産生する細胞をスクリーングすることができる。
【００２６】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法などの公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００２７】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよいし、市販の細胞凍結保存剤を用いて凍結保存してもよい。
【００２８】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法、例えば 動物細胞大量培養と有用物質生産 大石道夫監修 株式会社シーエムシー １９８６年 記載の方法を用いて培養・精製することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。例えばＢＡＬＢ／ｃＡマウスに免疫しＢＡＬＢ／ｃＡ由来のミエローマと細胞融合したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与した同系統マウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。培養時に使用する培地は血清を含まない市販の無血清培地、無血清無蛋白培地を使用するとさらに純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。必要により培地に公知の抗生物質・抗真菌剤、糖質、脂質やアミノ酸を追加することができる。抗生物質・抗真菌剤であれば例えば、硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを細胞生育に影響しない程度添加することができる。糖質であれば例えば、グルコース、マルトース、キシロースを添加することができる。アミノ酸であれば、例えばＬ−グルタミンを添加することができる。Ｌ−グルタミンは培養液中で不安定であるため８ｍＭ程度まで添加することもできるが、溶液中で安定なグルタミン誘導体であるＬ−グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを添加してもよい。これらの結果としてハイブリドーマ培養環境の良好化、培養液中の抗体分泌量を高めることができる。ハイブリドーマ作成時と異なる培地を適用して細胞培養抗体生産を行う場合は、同培地に予め馴化させたハイブリドーマを使用することが好ましい。例えば同培地に直接ハイブリドーマをけん濁し、遠心分離操作により細胞と培地を分離、次いで同培地で比較的高い細胞濃度０．５乃至１ｘ１０６／ｍｌとなるよう再けん濁し、倍化速度と生存率など細胞の状況を観察しながら培養を繰り返す。直接同培地に馴化できない場合は従来の培地から混合比を段階的に上げながら行うこともできる。
【００２９】
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを組み込んだ形質転換体を培養することにより所望の抗体を得ることができる。抗体生産により抗体が形質転換体内に蓄積される場合は公知の方法により形質転換体を回収し破砕することにより抗体を含んだ破砕液が得られる。抗体生産により形質転換体を培養した培地中に抗体が分泌される場合には形質転換体培養により該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ破砕液や培養上清は公知の抗体精製方法でより純度の高い抗体を得ることができる。
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、該抗体遺伝子あるいは遺伝子断片から結合活性を有する蛋白部分をコードするメッセンジャーＲＮＡを公知の方法で合成し公知の無細胞蛋白合成方法により抗体生産することもできる。抗体生産により該抗体を含んだ蛋白合成反応液が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ蛋白合成反応液は公知の抗体精製方法でより純度の高い抗体を得ることができる。
【００３０】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、ＵＦ膜濃縮、カラムクロマトが挙げられる。カラムクロマトに使用できる樹脂担体として例えば陰イオン交換樹脂やプロテインＡやプロテインＧ、ＰｒｏｔｅｉｎＬ、ビオチン化合物が結合されたアフィニティクロマト樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、疎水クロマト樹脂などの抗体吸着性のあるものや、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体が挙げられる。特にアフィニティクロマト樹脂を使用する際、樹脂に抗体吸着させてから抗体溶出までのプロセスにおけるカラム洗浄操作が重要であり、カラムサイズに対して５倍量以上の緩衝液を通液することが望ましく、より好ましくは１０倍乃至２０倍通液することが望ましい。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性の緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐＨは５．５〜８．５の間が好ましい。
【００３１】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌メンブランフィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤として例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコールを添加することもできる。安定化蛋白質の例としてウシ血清アルブミンやゼラチンなどが挙げられ、保存中沈殿が生じない濃度で添加することができる。濃度範囲としてより好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。
【００３２】
モノクローナル抗体の等電点は公知の分析手段で分析することができ、例えばポリアクリリアミドゲル等電点電気泳動によって分析することができる。またモノクローナル抗体のアイソタイプは、公知の分析手段で分析することができ、例えばマウスであればＩｇＧ１ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、カッパー鎖、ラムダ鎖各アイソタイプに特異的に結合する抗体の結合性有無により確認することができ、市販の抗体アイソタイピングキットを使用してもよい。
【００３３】
本発明の抗体はリガンド捕捉試薬として担体に結合された形態で使用することができる。担体は公知の素材が使用でき、例えばポリスチレン、ガラス、シリカ、セルロース、ポリビニル、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、マグネタイト、金、白金、水晶、脂質、蛋白質、ラテックスなどが挙げられる。抗体の固定化方法は、一旦固定化された抗体の脱離が使用上問題ないレベルであれば適用することができ、公知の方法が適用できる。固定化に使用する抗体液に使用する緩衝液は特に限定しないが、調製工程で抗体が失活することなく、固定化反応を阻害しないものであれば使用することができ、例えばｐＨであれば３乃至１０の範囲、濃度であれば１ｍＭ乃至２００ｍＭの範囲のものを使用することができる。例えばポリスチレン製エライザプレートであればダルベッコのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ（−））、燐酸緩衝液 ｐＨ７、炭酸緩衝液 ｐＨ９．６で適当な濃度に希釈した抗体液を２〜４０℃の範囲で３０分乃至一晩固相と接触させて固定化することができる。また例えばガラス繊維上に固定化するのであればクエン酸緩衝液 ｐＨ３にて適当な濃度に希釈した抗体液を２〜４０℃の範囲で０．５分乃至一晩、より好ましくは５分乃至３０分固相と接触させて固定化することができる。またグルタルアルデヒドやカルボジイミドといった架橋試薬を使用し共有結合的に担体表面の官能基と抗体を結合させてもよいし、また本発明の抗体を捕捉しうる物質、例えば、第二の抗体、プロテインＡ，プロテインＧ，プロテインＬ、ビオチン化物質を予め担体に固定化しておき、その親和性により捕捉させ固定化してもよい。形状は公知の形状が使用でき、例えば９６穴エライザプレート、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、イムノクロマトストリップ用膜、ガラス繊維、多孔性膜、磁性ビーズ、ラテックス粒子、デキストラン粒子、アガロース粒子、金コロイド、血球、細胞、ウイルス、リポソーム、水晶振動子、金薄膜などが挙げられる。これらの担体は必要により着色されていてもよい。
これら担体に抗体を結合させた後、非特異的な蛋白吸着を抑える目的で他の蛋白・界面活性剤やポリマー・血清などの含む溶液を固相に接触させるブロッキング工程を実施してもよい。ブロッキングに使用する蛋白としてブロッキング蛋白として公知の蛋白が使用でき、例えば牛血清アルブミン、無脂乳蛋白、カゼイン、ゼラチン、セリシンが挙げられ、０．１乃至１０％溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する界面活性剤やポリマーとして、ブロッキング剤として公知の界面活性剤・ポリマーが使用でき、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンが挙げられる。これらは使用する担体に応じて選択し、０．１乃至０．５％濃度溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する血清として、ビオチンを多量に含まない血清であれば使用することができ、例えば牛胎児血清、新生牛血清、ウマ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清、ブタ血清、マウス血清が挙げられ、０．５％乃至１００％溶液を使用することができ、好ましくは使用する前に血清ロットチェックを行い、リガンド捕捉能に影響しないか確認して使用することが望ましい。
本発明の抗体を使用したリガンド捕捉試薬は、調製後保存液中で乾燥させることなく保管しても、乾燥状態で保管してもよい。保存液中で保管する場合には実使用に問題のない捕捉活性を維持できるよう、必要に応じ保存液中に蛋白、高分子ポリマー、緩衝剤、塩類、防腐剤から選択される成分を添加することが望ましく、それぞれの使用担体や抗体との結合様式を勘案しこれら組み合わせの保存安定化効果を検討し、添加物質や量について設定することが望ましい。また乾燥状態で保管する場合には乾燥により捕捉活性が低下せず、かつ使用時捕捉性能が容易に復元するよう、公知の糖類、糖アルコール、アミノ酸、蛋白、高分子ポリマー、緩衝剤、塩類から選択される成分を添加した安定化液に接触させ、乾燥させることができる。添加する蛋白は例えば牛血清アルブミン、カゼインが挙げられる。糖類・糖アルコールでは、公知の安定化効果ある糖類・糖アルコールが使用でき、例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、グリセロールが挙げられ、アミノ酸では公知の安定効果あるアミノ酸、例えばグリシン、リジン、アルギニンが挙げられる。これら濃度については０．１乃至１０％溶液で調製し使用することができる。乾燥方法は、公知の乾燥方法でリガンド捕捉能が低下しない方法であれば適用することができ、例えば自然乾燥、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結真空乾燥、赤外線や遠赤外線による乾燥、またマイクロウェーブなどの高周波を利用した乾燥等が挙げられる。乾燥後は、吸湿しない条件で保管することが好ましく、シリカゲルなど乾燥剤とともに密封保管することが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１：抗ビオチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）免疫原として使用するビオチン化ＫＬＨの調製
ガンマ線滅菌されたふた付きポリプロピレン製サンプルチューブに、１０ｍＭ燐酸生理緩衝液ｐＨ７．２（以下 ＰＢＳ緩衝液と略）で溶解されたＫＬＨ（ＥＭＤバイオサイエンス社製 濃度２５．２ｍｇ／ｍｌ エンドドキシンフリー）２００μＬ、１Ｍ 炭酸水素ナトリウム溶液 ５０μＬ、オートクレーブ滅菌蒸留水（以下 滅菌水と略） ２０５μＬの順に加えて混合し、ＫＬＨ溶液を調製した。次いでＢｉｏｔｉｎ−（ＡＣ５）２−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ(同仁化学社製)１０ｍｇを滅菌水３００μＬで溶解し、速やかに溶解したうちの４５μｌを上述のＫＬＨ溶液に添加混合し、２５℃にて２時間反応させた。未反応のビオチン試薬を除くため、滅菌済みＰＢＳ緩衝液でセファデックスＧ２５担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を平衡化し、同担体を３ｍｌ充填したミニカラムを予め準備した。ビオチン化反応後のＫＬＨ溶液を同カラムに添加、次いでＰＢＳ緩衝液１ｍｌにて溶出させ、溶出全量をビオチン化ＫＬＨとして回収した。
（２）マウスの免疫および細胞融合
ビオチン化ＫＬＨを１ｍｇ／ｍｌとなるよう注射用生理食塩水にて希釈し抗原液を調製した。抗原液０．２ｍｌ分を等量のコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ 、５週令、メス、日本クレア）の腹腔に１匹あたりエマルジョン１００μＬ注入し、初回免疫を行った。さらに２週間、４週間、７週間後、ビオチン化ＫＬＨを０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう同様に希釈して抗原液を調製し、インコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と抗原液を等量混合・エマルジョン化し、同様に同マウスに再度免疫を施した。初回免疫から１０週間後に１回、以降１ヶ月間隔で４回、ついで２週間間隔で２回、抗原液５０μｇ／ｍｌ濃度になるよう注射用生理食塩水で希釈後、腹腔に１００μｌ注入し、最終免疫の４日後、同マウスの脾臓を無菌的に摘出して脾臓細胞を調製（２．９ｘ１０8個）した。一方、骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃５％炭酸ガス濃度下拡大培養を行い、次いで血清成分を含まないｅ−ＲＤＦ培地に細胞けん濁した。このようにして得られたＳｐ２／０−Ａｇ１４ ５．７ｘ１０７個と上述の脾臓細胞とを５０ｍｌ容量の遠心管中にて混合し、２００ｘｇ １０分遠心分離を行い、上清廃棄、チューブごとタッピングして細胞塊をほぐし、３７℃環境下で５０％ポリエチレングリコール１５００液（ロシュ社）を１ｍｌ添加し細胞と混合、次いでｅ−ＲＤＦ培地を１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌの順に添加した。２００ｘｇ １０分遠心分離後、そのまま３７℃で５分間放置し、その後上清を廃棄した。パスツールピペットを使って牛胎児血清５．８ｍｌに融合細胞を縣濁し、うち２ｍｌ分を選択培養培地（１００ｘＨＡＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ社）１／１００容とＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２４０ｍｌに縣濁、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）２０枚に１２０μＬづつ各ウェルに無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下でＨＡＴ選択培養を行った。融合から１０日後目視でコロニーが認められ、ハイブリドーマの出現を確認した。
（３）抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング：選択培養後の各ウェル培養上清５０μＬをＰＢＳ緩衝液２００μｌで希釈し、試料として用い、ビオチン化ＫＬＨを固定化したエライザプレートに対する反応性を指標としてスクリーニングを実施した。すなわち、ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌになるよう希釈したビオチン化ＫＬＨ溶液５０μｌを９６穴エライザプレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに分注・均一になるよう攪拌した後２５℃２時間放置してビオチン化ＫＬＨをプレートに固定化した。次いでビオチン化ＫＬＨ溶液をエライザプレートから除去し、０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液を各ウェルに０．３ｍｌ分注・廃棄を３回繰り返して洗浄を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注して１時間２５℃で放置しブロッキングを行った。次いで液を除去し洗浄後、選択培養上清５０μＬを分注し、２５℃でビオチン化ＫＬＨ固定化プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液にて４０００倍に希釈して調整したペルオキシダーゼ標識羊抗マウスイムノグロブリン抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）５０μｌを分注し２５℃１時間プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む発色液ＴＭＢ＋（ダコサイトメーション社製）を各ウェル５０μＬ分注し２５℃で１０分酵素反応させ、１Ｎ硫酸５０μＬ分注して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。対照としてビオチン化ＫＬＨを固定化していないエライザプレートでも同様に作業を行った。
ウェル番号００２１で着色が確認されビオチン化ＫＬＨと強い反応性が認められた。１次スクリーニングとして本ウェルを選抜し、引き続きクローニングを実施した。
（４）ハイブリドーマのクローニング：限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわちスクリーニングで選抜した各選択培養ウェルの細胞を１００個となるよう無菌的にサンプリングし、それぞれクローニング培地（ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２０ｍｌに対し、最終５個／ｍｌになるよう縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）各１枚９６ウェルに２００μｌづつ無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下で１０日間培養を行った。各ウェルのクローニング培養後上清５０μｌをサンプリングし、ＰＢＳ緩衝液２００μｌで希釈しＥＬＩＳＡ試料とし、１次スクリーニングと同様にＥＬＩＳＡを実施し、反応性が認められた培養上清をサンプリングしたウェルから１ウェル選抜し１次クローニング後のハイブリドーマ００２１を得た。本細胞を拡大培養し、セルバンカー（十慈フィールド社製）に生細胞密度５ｘ１０６個／ｍｌとなるよう細胞を十分けん濁し、ガンマ線滅菌された１．８ｍｌ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に該細胞けん濁液を１ｍｌづつ分注し、密栓後−８０℃フリーザーにて凍結保存した。なお、ハイブリドーマ００２１は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１８年８月２日 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９７９として寄託されている。
【００３５】
実施例２：００２１精製抗体の調製
（１）００２１培養上清の調製：液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００２１の入ったチューブを−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０ｘｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種し３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養した。２継代同培地で培養後、６０μｇ／Ｌ 硫酸ゲンタマイシン、２ｍＭ Ｌ―グルタミン、６ｍＭ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含むＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）に培地を代えて馴化を行い、さらに３継代同培地で培養した。その後培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、次いで培地４５ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代し、７日間培養を行い、抗体を培地中に十分分泌させた。培養により得られた細胞培養液を５０ｍｌ遠心管に移し７００ｘｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清４３．９ｍｌを得た。
（２）モノクローナル抗体のサブタイピング：市販のイムノクロマト法を使ったサブタイピング試薬（イソストリップ：ロシュ社）を使い、得られた培養上清をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈した希釈液１５０μｌを試料として分析した。ハイブリドーマ００２１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＧ１ κであった。
（３）００２１精製抗体の調製：得られた培養上清はＮａＣｌ ７．９ｇと１Ｍ ホウ酸緩衝液 ｐＨ９ ２．３ｍｌとを加えて溶解混合し、０．８μｍのフィルターろ過を行った。あらかじめ３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９：以下 結合緩衝液）で平衡化されたｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をカラムに１ｍｌ充填し、培養上清全量を流速１ｍｌ／分でカラムに通液した。次いで１５ｍｌの結合緩衝液でカラム洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３）を同流速で通液してカラムより抗体を溶出させ、抗体を含む溶出液２ｍｌを得た。ただちに１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ９） ０．４ｍｌを加え、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液 １ｌに対して透析を３回実施した。ＯＤ２８０ｎｍの吸収により蛋白量を算出した結果、得られた００２１精製抗体は５．８ｍｇであった。次いでガンマ線滅菌された０．２２μｍの低蛋白吸着メンブランフィルター（日本ミリポア社製）で００２１精製抗体を濾過し、ガンマ線滅菌済プロピレン製１５ｍｌチューブ内で４℃保管した。
（４）００２１精製抗体のゲル濾過分析：ＦＰＬＣ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＴＳＫＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷ（カラム長３０ｃｍ 東ソー社製）、溶離液０．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．０を用いた流速０．５ｍｌ／分のゲル濾過分析システムを用い、００２１精製抗体１ｍｇ／ｍｌ ０．１ｍｌ 注入後の分離パターンを２８０ｎｍの吸光度変化でモニターした。溶出１６．７分を主ピークとするパターンが得られ、ベースラインを基準とした吸光度積算値に対する主ピークの割合は９５％であった。
（５）００２１精製抗体の電気泳動分析：ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、精製抗体１ｍｇ／ｍｌ １μｌをＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ３−９（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加しメーカー指定のプログラムにて電気泳動した。同時にｐＩ ＫＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を試料として泳動した。電気泳動後のゲルはクマジー染色を行ってゲル中の蛋白を可視化し、既知のｐＩマーカー蛋白の等電点と移動度から精製抗体００２１のバンド移動度を測定した。その結果、００２１精製抗体ではｐＩ６．６を中心に６．４〜６．８の範囲で複数バンドが観察された。
【００３６】
実施例３：００２１精製抗体固定化エライザプレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌに００２１精製抗体を希釈し、００２１精製抗体希釈液を調製した。
（２）９６穴エライザプレート（ＮＵＮＣ社 マキシソープ）の各ウェルに５０μｌづつ００２１精製抗体希釈液を分注・均一になるよう攪拌した後２５℃２時間放置してウェルに固定化した。次いで液をエライザプレートから除去し、０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液を各ウェルに０．３ｍｌ分注・廃棄を３回繰り返して洗浄を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注して１時間２５℃で放置しブロッキングを行った。液廃棄した後同様に洗浄を行い、０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムと０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００３７】
比較例１：アビジン固定化プレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるよう卵白由来アビジン（ナカライテスク社）を溶解し、アビジン希釈液を調製した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液をアビジン希釈液に換えて作業を実施しアビジン固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００３８】
比較例２：ストレプトアビジン固定化エライザプレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるようストレプトアビジン（ナカライテスク社）を溶解し、ストレプトアビジン希釈液を調製した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液をストレプトアビジン希釈液に換えて作業を実施しストレプトアビジン固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００３９】
比較例３：ニュートラアビジン固定化エライザプレートの調製
（１）０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるようニュートラアビジン（ピアス社）を溶解し、ニュートラアビジン希釈液を調製した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液をニュートラアビジン希釈液に換えて作業を実施しニュートラアビジン固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００４０】
比較例４：市販ビオチン抗体固定化エライザプレートの調製
（１）凍結乾燥された抗ビオチンモノクローナル抗体クローン３３（ロシュ社）をメーカー指定の蒸留水を添加して復元し、次いで０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０にて１０μｇ／ｍｌになるよう希釈した。
（２）実施例１（２）記載手順のうち００２１精製抗体希釈液を抗ビオチンモノクローナル抗体希釈液に換えて作業を実施し市販抗ビオチン抗体固定化エライザプレートを調製した。液の乾燥を防ぐためウェル上部を粘着性プレートシールにてシールし、４℃で保管した。使用直前に液を廃棄し、ペーパータオルで叩きながら出来るだけウェルに残った液を除いた後、ビオチン捕捉試薬として使用した。
【００４１】
実施例４：ＣＥＡ測定における感度比較
（１）抗ＣＥＡモノクローナル抗体のビオチン化：抗ＣＥＡモノクローナル抗体クローン５９０９（メディックスバイオケミカ社）０．３７ｍｇを含む０．５ｍｌの抗体液に１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を５０μｌ添加した。次いでＢｉｏｔｉｎ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ(同仁化学社製)１０ｍｇを滅菌水１ｍｌで溶解し、溶解した内の５．５μｌを速やかに上述の抗体液に添加混合し、２５℃にて２時間反応させた。未反応のビオチン試薬を除くため、滅菌済みＰＢＳ緩衝液で脱塩用カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を平衡化し、ビオチン化反応後の抗体液全量を同カラムに添加、次いでＰＢＳ緩衝液にて溶出させた。溶出液のＯＤ２８０ｎｍ吸光度をモニターし、最初に溶出したピークをビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体として回収し、次いで限外濾過膜による濃縮を行った。濃度１ｍｇ／ｍｌあたりのＯＤ２８０ｎｍを１．４として抗体濃度を算出したところ、０．６７ｍｇ／ｍｌであった。
（２）抗ＣＥＡモノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識化：抗ＣＥＡモノクローナル抗体クローン５９０５（メディックスバイオケミカ社）０．２ｍｇをペルオキシダーゼ標識キットＮＨ２（同仁化学社製）にてペルオキシダーゼ標識を行い、２００μｌのペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を得た。
（３）ビオチン化抗ＣＥＡ抗体捕捉 サンドイッチＥＩＡによる各ビオチン捕捉試薬捕捉能の比較：試料としてＣＥＡ標準品３０ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌを用いた。試料 ２５μｌを実施例３、比較例１〜４記載のビオチン捕捉試薬に分注後、０．２、０．４，０．８μｇ／ｍｌとなるよう０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で希釈したビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体を各２５μＬづつ分注・混合を行い、３７℃１時間ビオチン捕捉能とＣＥＡとの抗原抗体反応を同時に反応させた。０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液にて洗浄を行い、残った水分をプレートごとペーパータオルで叩きながら出来る限り除いた。０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体液を各５０μｌづつ分注し、さらに３７℃１時間反応させた。０．０５％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液にて洗浄を行い、残った水分をプレートごとペーパータオルで叩きながら出来る限り除いた。テトラメチルベンチジンを含む発色液ＴＭＢ＋（ダコサイトメーション社製）を各ウェル５０μｌ分注し２５℃で１０分酵素反応させ、１Ｎ 硫酸５０μｌ分注して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＣＥＡ０ｎｇ／ｍｌ試料では吸光度０．０３以下のシグナルしか認められなかった。一方ＣＥＡ３０ｎｇ／ｍｌ試料では表１に示すようにビオチン捕捉試薬ごとにシグナル強度が異なり、００２１精製抗体を固定化した実施例３のビオチン捕捉試薬でも最も高いシグナルが得られ、検討した中でビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体捕捉能が最も高いことがわかった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（４）ビオチン共存下でのビオチン化抗ＣＥＡ抗体捕捉 サンドイッチＥＩＡによる各ビオチン捕捉試薬捕捉能の比較：試料として２μｇ／ｍｌ Ｄ−ビオチンを終濃度に含むＣＥＡ標準品３０ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌを用いた。それ以外は上述の（３）記載の手順に従い測定を行った。
ＣＥＡ０ｎｇ／ｍｌ試料では吸光度０．０３以下のシグナルしか認められなかった。一方ＣＥＡ３０ｎｇ／ｍｌ試料では表２に示すようにビオチン捕捉試薬ごとにシグナル強度が異なり、００２１精製抗体を固定化した実施例３のビオチン捕捉試薬でも最も高いシグナルが得られ、検討した中でビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体捕捉能が最も高いことがわかった。
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例５：００２１精製抗体固定化ガラス繊維を含むリガンド捕捉試薬の調製
（１）吸収要素の作製：タバコフィルターを１１．５ｍｍづつ切断した。
（２）リガンド捕捉試薬に用いる容器の作製：直径９．０ｍｍ、厚さ１．０ｍｍのガラス繊維濾紙（アドバンテック東洋社製）を円形にくりぬき、上記（１）で作製した吸収要素に積層し、図２に示すような、ポリエチレン製の液体不透過性容器内に収納した。今回使用した液体不透過性容器は内径９．０ｍｍ、測定容器の長さが１５ｍｍのものを使用した。
（３）抗体の固定化：上記（２）で作製した容器の開口部より（ａ）マウス抗ビオチンモノクローナル抗体 ００２１精製抗体 ４７μｇ／ｍｌ（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０）を５０μｌ、（ｂ）５％グリセロール・１％カゼイン溶液（１０ｍＭリン酸塩―生理食塩水緩衝液ｐＨ７．４）を１００μｌ、直前に供給された液が吸引されるのを待って順次供給した後、凍結乾燥した。乾燥後はシリカゲル乾燥剤とともにガスバリア能を有する気密ポリ袋に入れ、使用まで４℃で保管した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
同一操作での分析単位の構築は分析工数省力化に向けた自動分析システム化に必須なプロセスであり、リガンド捕捉試薬は共通の分析プラットホーム構築に利用されている。本発明記載のハイブリドーマの取得方法によれば、ビオチン標識物質捕捉性能にすぐれた抗体産生ハイブリドーマの取得が可能になる。該ハイブリドーマが産生する抗体は、生物学的特異反応に基づく特異反応に関与する物質の測定方法および該測定方法において、リガンド捕捉試薬性能向上寄与や優れたリガンド捕捉試薬開発の可能性を広げると期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は実施例３、比較例１、比較例２、比較例３、比較例４で調製したビオチン捕捉試薬でビオチン化抗ＣＥＡモノクローナル抗体を捕捉させてＣＥＡ測定を行ったときのビオチン化抗体濃度依存的なシグナル感度変動を示したグラフである。
【図２】図２は本願発明の一実施例として調製したリガンド捕捉試薬容器の斜視図。
【図３】図３は図２記載のリガンド捕捉試薬容器の断面図。
【符号の説明】
【００４８】
１：外郭部
２：開口部
３：ガラス繊維濾紙
４：吸収要素
５：カップ
６：つば
７：キャップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Ｉ
【化１】
記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として動物を免疫して得られた免疫細胞を細胞融合に用いることを特徴とするハイブリドーマの取得方法
【請求項２】
請求項１記載の方法で得られたハイブリドーマ
【請求項３】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９７９として寄託されている請求項２記載のハイブリドーマ
【請求項４】
請求項３記載のハイブリドーマを利用して抗体あるいは抗体断片を得ることを特徴とする抗体生産方法
【請求項１】
化学式Ｉ
【化１】
記載の化合物を結合させたキャリア蛋白を免疫原として動物を免疫して得られた免疫細胞を細胞融合に用いることを特徴とするハイブリドーマの取得方法
【請求項２】
請求項１記載の方法で得られたハイブリドーマ
【請求項３】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９７９として寄託されている請求項２記載のハイブリドーマ
【請求項４】
請求項３記載のハイブリドーマを利用して抗体あるいは抗体断片を得ることを特徴とする抗体生産方法
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−９２８０２（Ｐ２００８−９２８０２Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７４２７５（Ｐ２００６−２７４２７５）
【出願日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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