ハイブリドーマの作成方法、ハイブリドーマおよび抗体の生産方法
【課題】新規なヘモグロビンＡ１ｃに反応性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作成方法、ハイブリドーマ、および抗体生産方法に関する。免疫原性の高い抗原を使用したハイブリドーマ作成方法を提供する。
【解決手段】多価抗原ペプチドを糖化して免疫原に使用することを特徴とする、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法。糖化に用いる多価抗原ペプチドとして、例えば式（Ｉ）に示すような構造を含む多価抗原ペプチドを使用する。
【解決手段】多価抗原ペプチドを糖化して免疫原に使用することを特徴とする、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法。糖化に用いる多価抗原ペプチドとして、例えば式（Ｉ）に示すような構造を含む多価抗原ペプチドを使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化した多抗原性ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ：以下 ＭＡＰ）を免疫原に用いたハイブリドーマの作成方法、ハイブリドーマおよび抗体に関する。更に詳しくは、糖化ヘモグロビンに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法、ハイブリドーマおよび抗体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、糖化蛋白、特に糖化ヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得方法について、糖化されたヒトヘモグロビンＡ１ｃを免疫原とする技術が知られていた（例えば、特許文献１参照）。
しかし、かかる従来技術ではヒトヘモグロビンＡ１ｃの特徴である糖化されたベータ鎖Ｎ末端側以外に反応性を有する抗体も得られる。非常に数多くのクローンの中から所望の抗体を分泌する細胞を選抜しなければならず、スクリーニングに労力がかかるという問題点があった。
一方、かかる特異的な抗体が得られにくい、作業が労働集約的であるという問題点を解消すべく、ペプチド合成によりヒトヘモグロビンベータ鎖のＮ末端側の配列を有するペプチドを得たのち、グルコースと反応させて糖化し、その後キャリア蛋白質に結合させた合成抗原を免疫原に用いるという発明がなされた（例えば、特許文献２参照）。
しかし、かかる発明は特異性という点では改良されたものの、実際に下記参考例で示すようにペプチド抗原を合成しキャリア蛋白に結合させ免疫するも、免疫動物の抗体価の上昇が認められず、ハイブリドーマを得るための次のステップである細胞融合作業に進むことができなかった。依然として抗体が得られにくいという問題点があった。
また、キャリア蛋白に結合させることなく、抗原部位を含む多価抗原ペプチドを合成し、免疫原として使用する技術が知られていたが、糖化したペプチドに対する抗体作成に使用した例は知られていなかった。（例えば、非特許文献１参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６１−２８０５７１
【特許文献２】特許３８０１１３３号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ Ｐ． Ｔａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５、 ｐ５４０９−５４１３， １９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、抗体価上昇に優れた免疫原を用いてヘモグロビンＡ１ｃに反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマの取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）多価抗原ペプチドを糖化して免疫原に使用することを特徴とする、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
（２）糖化に用いる多価抗原ペプチドとして、式Ｉ（式中のＸは配列番号１のペプチドを示す）で示される構造を含むペプチドを合成して使用することを特徴とする、（１）記載の抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
【０００７】
【化１】
【０００８】
（３）（１）記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
（４）（２）記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
（５）ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９で寄託されている（３）記載のハイブリドーマ。
（６）（５）記載のハイブリドーマを使用することを特徴とする抗体生産方法
（７）（５）記載のハイブリドーマによって生産される、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、抗原免疫で抗体価上昇が認められ、最終的にヘモグロビンＡ１ｃに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができた。得られたハイブリドーマは寄託されており、同ハイブリドーマからヘモグロビンＡ１ｃに対する抗体を容易に得ることもできる。またＭＡＰを使用するため、従来法で必要であったペプチド糖化反応後のキャリア蛋白結合作業を省略でき、抗原調製ステップの簡略化も図れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は実施例６で示した本願発明のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体を用いた免疫比濁反応で、ヘモグロビンＡ１ｃ添加量それぞれでの６２０ｎｍ吸光度タイムコースを１５秒間隔の測定ポイントで記録した測定したグラフである。測定ポイント１０ポイント目に第二試薬を加えている。
【図２】図２は実施例７で示した本願発明のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体を用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定エライザを行なったときの検量線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳述する。
【００１２】
本発明のハイブリドーマの作成方法では、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドとリジンを使った架橋体を含む多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）を糖化して用いる。
【００１３】
多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）の合成は、公知のペプチド合成法で行なうことができ、例えばＴａｍの方法が挙げられる（Ｊａｍｅｓ Ｐ． Ｔａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５、 ｐ５４０９−５４１３， １９８８ ）。架橋体は、例えばβアラニンを固定した樹脂にリジン（Ｌｙｓｉｎｅ）をステップワイズに反応結合させることにより目的とする架橋体を調製することができる。すなわち、βアラニンにリジンひとつの結合体は２量体の架橋体として、さらにリジンを反応させて得られるリジン３個結合体は４量体の架橋体として、さらにリジンを反応させて得られるリジン７個の結合体は８量体の架橋体として使用することができる。架橋体の分岐数は２以上であればとくに制限されないが、実用性の点から２〜８が好ましく、さらに好ましくは８である。これら架橋体に目的とするヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドの構成アミノ酸を通常の方法により順次反応結合させることによりＭＡＰを合成することができる。
本発明記載のヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドとは、Ｎ末端にバリンを有しかつ該バリンから連続する３つ以上の公知のヒトヘモグロビンβ鎖部分アミノ酸配列を含む。好ましくはＮ末端のバリン以外にはアミノ基が含まない配列を選択する。例えばＮ末端のバリンから７アミノ酸を含む配列番号１が挙げられる。またヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドと架橋体の間にスペーサーとなる分子を結合させてもよい。スペーサーに関して特に限定しないが例えば６−アミノカプロン酸やグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）などが挙げられる。このような多価抗原ペプチド（以下、ＭＡＰ）の例として例えば式Ｉ（式中のＸは配列番号１のペプチドを示す）に示した構造を含むペプチドが挙げられる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）の糖化は、グルコースとＭＡＰとを溶液中で接触・反応させ、グルコースとＭＡＰとの間の反応生成物のアマドリ転移により行なわれる。糖化は多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）上の未反応のアミノ基が検出されない程度まで行なうことが望ましいが、免疫原として使用するには部分的な糖化が確認できれば使用することができる。糖化反応後の糖化ＭＡＰは精製してもよい。精製方法として、公知の方法を使用することができる。例えば電荷の違いを利用して陽イオン交換樹脂を使用して未反応のペプチドと糖化ＭＡＰを分離する方法や分子サイズの違いを利用してゲル濾過や限外濾過膜を使用して未反応のグルコースと糖化ＭＡＰを分離する方法が挙げられる。
【００１６】
本発明におけるハイブリドーマ抗体の作成方法は、糖化した多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）を使って公知の方法により免疫動物に免疫を行い、公知の方法により免疫細胞を取得した後、公知の方法によりミエローマと細胞融合実施し、公知の方法により融合細胞と非融合細胞との選択実施し、公知の方法により目的の抗体を産生する細胞のスクリーニング・クローニングを実施する。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは上述の免疫原で免疫を行った後、公知のモノクローナル抗体作成法で作成することができる。例えば、単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年、特開２００８−９２８０２記載内容に従い、作製することができる。抗体はＩｇＭ，ＩｇＧのいずれでもよいが、公知の蛋白分解酵素や遺伝子組み換え技術を用いて低分子化、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ‘）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントなどにして使用することもできる。
【００１８】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。例えばマウスの場合には、ＢＡＬＢ／ｃ メス ４〜１２週令を用いることができる。
【００１９】
動物の免疫は、上述の免疫原を動物の皮内、腹腔内、筋肉内または投与することによって行うことができる。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。
【００２０】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３），ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１），Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１），Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３），ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０），Ｆ０等などである。
【００２２】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００２３】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃でおこなうことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％（ｖ／ｖ）で培養するのが好ましい。
【００２４】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の抗体スクリーニング方法が使用でき、例えば酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、凝集法、セルソーター等により行うことができる。ヘモグロビンＡ１ｃに対する抗体をＥＩＡでスクリーニングするのであれば例えばヘモグロビンＡ１ｃを含むヘモグロビン試料、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端部分をグルコースで糖化した合成ペプチドや、免疫に使用した糖化ＭＡＰを固定化した担体を用いて、得られた細胞培養上清に含まれるヘモグロビンＡ１ｃ結合活性を有する抗体の有無を検知することにより、所望の抗体を産生する細胞をスクリーングすることができる。スクリーニングの際は１種類の固定化物質から得られた反応性データで判断してもよいが、好ましくは各種固定化物質での反応性データを複数取得して、ヘモグロビンＡ１ｃ特異的な抗体の有無を総合的に判断することが望ましい。例えば、ウマヘモグロビンはヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端側部分配列と異なっていることが知られており、ヒトヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有していてもウマヘモグロビンと反応性ある場合はヒトヘモグロビンＡ１ｃ特異的な抗体ではないと考えて除外することができる。また例えば、ペプチド合成により得られたヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端側部分配列の糖化有無による結合性の違いを比較することによって、糖化されたペプチドに特異的に反応する抗体の有無を検知することもできる。
【００２５】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００２６】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよいし、市販の細胞凍結保存剤を用いて凍結保存してもよい。
【００２７】
本発明のハイブリドーマは上記方法により得られたハイブリドーマである。本発明により得られたハイブリドーマの例として例えばヘモグロビンＡ１ｃに反応する抗体を産生するクローン００３１は独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９で寄託されている。
【００２８】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を給源として用いる。公知の方法、例えば 動物細胞大量培養と有用物質生産 大石道夫監修 株式会社シーエムシー １９８６年 記載の方法を用いて培養・精製することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。特に限定されないが、例えばＢＡＬＢ／ｃＡマウスに免疫しＢＡＬＢ／ｃＡ由来のミエローマと細胞融合したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与した同系統マウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。培養時に使用する培地は血清を含まない市販の無血清培地、無血清無蛋白培地を使用するとさらに純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２９】
細胞培養は培地中で細胞増殖に適した温度、炭酸ガス濃度、溶存酸素濃度環境下で行なう。特に限定されないが、例えば３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス濃度に設定されたインキュベーター内でのＴフラスコで静置培養させる。また例えば滅菌されたポリエチレン製バッグ内に無菌的に５％（ｖ／ｖ）炭酸ガスを通気しながら３７℃揺動培養させることもできる。培地には必要により公知の抗生物質・抗真菌剤、糖質、脂質やアミノ酸を追加することができる。抗生物質・抗真菌剤であれば例えば、硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを細胞生育に影響しない程度添加することができる。糖質であれば例えば、グルコース、マルトースを添加することができる。アミノ酸であれば、例えばＬ−グルタミンを添加することができる。Ｌ−グルタミンは培養液中で不安定であるため例えば初期値として８ｍＭ添加しておくこともできるが、溶液中で安定なグルタミン誘導体であるＬ−グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを代替あるいは追加で添加してもよい。添加のタイミングは培養開始する前でもよいが、例えばＬ−グルタミンやグルコースのように培養途中に分解・消費される成分などは培養途中に添加することもできるし、これら栄養源の混合物である培地自体を培養途中で添加してもよい。結果としてハイブリドーマ培養環境の良好化、培養期間の長期化、さらには培養液中の抗体分泌量を高めることが期待できる。ハイブリドーマ作成時と異なる培地を適用して細胞培養抗体生産を行う場合は、同培地に予め馴化させたハイブリドーマを使用することが好ましい。例えば同培地に直接ハイブリドーマをけん濁し、遠心分離操作により細胞と培地を分離、次いで同培地で比較的高い細胞濃度０．５乃至１ｘ１０６／ｍｌとなるよう再けん濁し、倍加速度と生存率など細胞の状況を観察しながら培養を繰り返す。直接同培地に馴化できない場合は従来の培地から混合比を段階的に上げながら行うこともできる。
【００３０】
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは結合活性を有する蛋白部分をコードする遺伝子断片を公知の技術で取得し、公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを組み込んだ形質転換体を培養することにより所望の抗体を得ることができる。また免疫後の脾臓細胞やリンパ細胞に含まれるヘモグロビンＡ１ｃ特異的抗体産生細胞から得られる抗体遺伝子または遺伝子断片を利用してもよい。抗体生産により抗体が形質転換体内に蓄積される場合は公知の方法により形質転換体を回収し破砕することにより抗体を含んだ破砕液が得られる。抗体生産により形質転換体を培養した培地中に抗体が分泌される場合には形質転換体培養により該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ破砕液や培養上清は公知の抗体精製方法でより純度の高い抗体を得ることができる。
【００３１】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、限外濾過膜濃縮、カラムクロマトグラフィーが挙げられる。カラムクロマトグラフィーに使用できる樹脂担体として、例えば陰イオン交換樹脂、プロテインＡやプロテインＧ、プロテインＬ、糖化ペプチド化合物が結合されたアフィニティクロマトグラフィー樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、リガンドとして例えば４−メルカプト−エチル−ピリジン、フェニル基などの結合した疎水クロマトグラフィー樹脂、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体などが挙げられる。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。例えば分泌されるモノクローナル抗体がＩｇＭであれば、プロテインＡクロマトグラフィーの適用難しいことから、限外濾過膜濃縮、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などの精製方法の中から要求品質と経済性とを勘案し手法選択して精製を行う。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性でかつ適切な塩濃度を有する緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐＨは５．５〜８．５、塩濃度として５０ｍＭから３００ｍＭの間が好ましい。
【００３２】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌メンブランフィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤は特に限定されないが、例えば０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコール、アミノ酸を添加することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下にヘモグロビンＡ１ｃに対する抗体を産生するハイブリドーマの作成実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ 糖化ＭＡＰの合成
βアラニンからリジン７個で作製される８量体架橋体骨格に６−アミノカプロン酸を介しヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列７アミノ酸（配列番号１）からなるペプチド７個を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成導入し、ＭＡＰを得た。
ＭＡＰ １５ｍｇ、Ｄ−グルコース５ｍｇをピリジンと酢酸を１：１混合液２．２ｍｌに溶解し、遮光密栓した容器に入れ、室温で１週間糖化反応させた。薄層クロマトグラフィー分析を行い、糖化反応前のＭＡＰで認められたニンヒドリン反応が糖化反応後はほとんど認められず、また硫酸加熱により同スポット位置着色することから、ＭＡＰのアミノ基が糖化されたと判断し、反応を終了させた。反応液を減圧乾燥後、ＰＢＳで再溶解し、同緩衝液で平衡化されたＰＤ１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）で脱塩を行い、糖化ＭＡＰを得た。
【００３５】
実施例２ 糖化ＭＡＰを免疫原とした免疫
糖化ＭＡＰを１ｍｇ／ｍｌとなるよう注射用生理食塩水にて希釈し抗原液を調製した。抗原液０．２ｍｌ分を等量のコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ 、５週令、メス、日本クレア）の腹腔に１匹あたりエマルジョン１００μＬ注入し、初回免疫を行った。さらにおよそ２週間間隔で４回、糖化ＭＡＰを同様に希釈して抗原液を調製し、インコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と抗原液を等量混合・エマルジョン化し、同様に同マウスに再度免疫を施した。５回目の免疫翌週に採血を行い、抗体価測定試料とした。
【００３６】
比較例１ 糖化ペプチドの合成および糖化ペプチド結合ＫＬＨの調製
ペプチド合成によりヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列７アミノ酸のＣ末端にシステインを付加した配列番号２記載のペプチドを得た。同ペプチド１０ｍｇ、Ｄ−グルコース１０ｍｇをピリジンと酢酸を１：１混合液２．２ｍｌに溶解し、遮光密栓した容器に入れ、室温で１週間糖化反応させた。薄層クロマトグラフィー分析によりペプチドの糖化を確認した後、反応液を減圧乾燥させ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で再溶解した。Ｒｅｄｕｃｅ−Ｉｍｍ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｒｅｄｕｃｔａｎｔ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、ペプチドのシステイン残基に含まれるＳＨ基を還元したのち、活性化マレイミド基を有するキャリア蛋白である Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社）６ｍｇと混合し室温で２時間反応させ、次いでＰＢＳ緩衝液で平衡化されたＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）で脱塩を行い、糖化ペプチド結合ＫＬＨを得た。
【００３７】
比較例２ 糖化ペプチド結合ＫＬＨを免疫原とした免疫
糖化ペプチド結合ＫＬＨを１ｍｇ／ｍｌとなるよう注射用生理食塩水にて希釈し抗原液を調製した。抗原液０．２ｍｌ分を等量のコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ 、５週令、メス、日本クレア）の腹腔に１匹あたりエマルジョン１００μＬ注入し、初回免疫を行った。さらにおよそ２週間間隔で４回、糖化ペプチド結合ＫＬＨを同様に希釈して抗原液を調製し、インコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と抗原液を等量混合・エマルジョン化し、同様に同マウスに再度免疫を施した。５回目の免疫翌週に採血を行い、抗体価測定試料とした。
【００３８】
実施例３ 抗血清反応性の比較
実施例２に示した糖化ＭＡＰで免疫を行ったマウス４個体と、比較例２に示した糖化ペプチド結合ＫＬＨで免疫を行ったマウス４個体、計８個体の抗血清での抗体価測定を行った。
ヒトヘモグロビンＡ１ｃを１０％含むヘモグロビン試料（シスメックス社製）を１０μｇ／ｍｌになるようＰＢＳで希釈し、９６穴エライザプレート（住友ベークライト社製）に室温１時間接触させ固定化した（ヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有試料固相）。次いで固定化溶液を廃棄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行った。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した抗血清希釈サンプル５０ｕＬと室温で１時間反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコサイトメーション社製）と室温で１時間反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、テトラメチルベンジジンを含む発色液（ダコサイトメーション社製）５０μＬを室温１０分反応させた後１Ｎ硫酸５０μＬと混合して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。対照としてヒトヘモグロビン（シグマアルドリッチ社製）を同様に固定化したエライザプレート（ヒトヘモグロビン固相）でも同様に測定を行った。
糖化ペプチド結合ＫＬＨで免疫したマウス個体ではほとんど抗体価上昇見られなかったが、糖化ＭＡＰを抗原として免疫したマウス個体でヘモグロビンＡ１ｃ特異的シグナルが高く、比較例に比べ免疫応答が高い結果が得られた。抗血清４０００倍希釈試料を測定したときのヒトヘモグロビン固相で得られた吸光度に対するヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有試料固相での吸光度の比（ＯＤ比）を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例４ 抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体産生ハイブリドーマの作成
（１）細胞融合
実施例３の結果からもっとも反応性の高かったマウス個体１を選択し、細胞融合を実施した。最終免疫の４日後、同マウスに麻酔処置を行い、ひきつづき同マウス頚椎脱臼後、脾臓を無菌的に摘出して脾臓細胞を調製（３．８ｘ１０８個）した。一方、骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃５％炭酸ガス濃度下拡大培養を行い、次いで血清成分を含まないｅ−ＲＤＦ培地に細胞けん濁した。このようにして得られたＳｐ２／０−Ａｇ１４ ７．５×１０７個と上述の脾臓細胞とを５０ｍｌ容量の遠心管中にて混合し、２００×ｇ １０分遠心分離を行い、上清廃棄、チューブごとタッピングして細胞塊をほぐし、３７℃環境下で５０％ポリエチレングリコール１５００液（ロシュ社）を１ｍｌ添加し細胞と混合、次いでｅ−ＲＤＦ培地を１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌの順に添加した。２００×ｇ １０分遠心分離後、そのまま３７℃で５分間放置し、その後上清を廃棄した。パスツールピペットを使って牛胎児血清７．５ｍｌに融合細胞を縣濁し、うち４ｍｌ分を選択培養培地（１００×ＨＡＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ社）１／１００容とＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２４０ｍｌに縣濁、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）２０枚に１２０μｌづつ各ウェルに無菌的に分注した。３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス条件下でＨＡＴ選択培養を行った。融合から１０日後目視でコロニーが認められ、ハイブリドーマの出現を確認した。
（２）抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニング
選択培養後の各ウェル培養上清３０μｌに０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液１５０μｌを加えた希釈液を試料として用い、ヘモグロビンＡ１ｃ固定化エライザプレートに対する反応性を指標とした一次スクリーニングを実施した。
ヘモグロビンＡ１ｃ固定化エライザプレートは以下のようにして作成した。ヘモグロビンＡ１ｃ１０％含有するヘモグロビン試料（シスメックス社製）をＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈後、１ウェルあたりヘモグロビン希釈液５０μｌを９６穴エライザプレート（住友ベークライト社製）に分注した後２５℃２時間放置して固定化した。次いで液を廃棄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液を各ウェルに０．３ｍｌ分注・廃棄を３回繰り返して洗浄を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注して１時間２５℃で放置しブロッキングを行った。
次いで液を除去し洗浄後、選択培養上清５０μＬを分注し、２５℃でヘモグロビンＡ１ｃ固定化プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液にて２０００倍に希釈して調整したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコサイトメーション社製）５０μｌを分注し２５℃１時間プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む発色液（ダコサイトメーション社製）を各ウェル５０μＬ分注し２５℃で１０分酵素反応させ、１Ｎ硫酸５０μＬ分注して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ウェル番号００３１で着色が確認され強い反応性が認められた。さらに上記１次スクリーニングと同様の方法で、免疫原として使用した糖化ＭＡＰを固定化した９６穴エライザプレートと、糖化を行なっていないＭＡＰを固定化した９６穴エライザプレート、さらにウマヘモグロビンを固定化した９６穴エライザプレートとでそれぞれウェル番号００３１の培養上清希釈試料の反応性を調べたところ、糖化ＭＡＰで反応性を示すがＭＡＰやウマヘモグロビンで反応性を示さなかった。これらの結果から、本ウェルを選抜し、引き続きクローニングを実施することにした。
（３）ハイブリドーマのクローニング
限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわちスクリーニングで選抜した各選択培養ウェルの細胞を１００個となるよう無菌的にサンプリングし、それぞれクローニング培地（ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２０ｍｌに対し、最終３個／ｍｌになるよう縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）各１枚９６ウェルに２００μｌづつ無菌的に分注した。３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス条件下で１０日間培養を行った。各ウェルのクローニング培養後上清３０μｌをサンプリングし、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液１５０μｌで希釈してＥＬＩＳＡ試料とし、１次スクリーニングと同様にＥＬＩＳＡを実施し、反応性が認められた培養上清をサンプリングしたウェルから１ウェル選抜し１次クローニング後のハイブリドーマ００３１を得た。本細胞を牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地にて拡大培養したのち、セルバンカー（十慈フィールド社製）に生細胞密度５ｘ１０６個／ｍｌとなるよう細胞を十分けん濁し、ガンマ線滅菌された１．８ｍｌ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に該細胞けん濁液を１ｍｌづつ分注し、密栓後−８０℃フリーザーにて凍結保存した。なお、ハイブリドーマ００３１は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成２１年６月１８日 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９として寄託されている。
【００４１】
実施例５ クローン００３１から得られる抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体の精製
（１）００３１培養上清の調製
液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００３１の入ったチューブを−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０×ｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種し３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス濃度下で培養した。２継代同培地で培養後、４ｍＭ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、０．１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ−６８を添加した、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）とｅ−ＲＤＦ培地との等量混合培地で馴化を行い、馴化後さらに３継代同培地で培養した。その後培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、次いで培地４５ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代培養した。その後２５０ｍｌエリンマイヤーフラスコ（コーニング社製）１本に培地８０ｍｌになるよう拡大し、２０ｍｌ／分で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２ガス通気を行いながら３７℃１２０ｒｐｍで旋回培養を開始した。最終２５０ｍｌエリンマイヤーフラスコ６本まで培養スケールを拡大した後、１週間培養を維持し、培地中に抗体を十分分泌させた。なお培養途中で各フラスコにＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ２０ｍｌ追加１回、次いで８０ｍＭグルタミンを追加で添加したｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌ追加２回を行った。得られた細胞培養液を７００×ｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清６３５ｍｌを得た。
（２）モノクローナル抗体のサブタイピング
市販のイムノクロマトグラフィー法を使ったサブタイピング試薬（イソストリップ：ロシュ社）を使い、得られた培養上清をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈した希釈液１５０μｌを試料として分析した。ハイブリドーマ００３１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＭ κであった。
（３）００３１精製抗体の調製
得られた培養上清は０．２２μｍフィルターでろ過を実施したのち、限外濾過膜ペリコンＸＬフィルター（分子量分画５０Ｋダルトン用：日本ミリポア社製）にて濃縮を実施した。得られた抗体を含む濃縮液を一旦２０％飽和度での硫酸アンモニウム塩析により不溶物を除去したのち、５０％飽和度で硫酸アンモニウム塩析を行い、２段階目の塩析で得られた不溶物を遠心分離にて沈殿として回収した。得られた沈殿をＰＢＳ緩衝液９ｍｌで再溶解し、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液１Ｌに対して透析を３回実施した。次いでガンマ線滅菌された０．２２μｍの低蛋白吸着メンブランフィルター（日本ミリポア社製）で００３１精製抗体を濾過し、ガンマ線滅菌済プロピレン製１５ｍｌチューブ内で４℃保管した。
ＯＤ２８０ｎｍの吸収により蛋白量を算出した結果、得られた００３１精製抗体は７０．２ｍｇであった。またＤＴＴ還元処理した００３１精製抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動しＣＢＢ染色後分析したところ、２つのバンドが検出された。分子量マーカー位置との比較から分子量２．５万と７．１万であり、それぞれκ鎖とμ鎖に対応する抗体由来の染色像と考えられた。
【００４２】
実施例６ クローン００３１から得られた抗ヘモグロビンＡ１ｃ精製抗体を使った免疫比濁反応
（１）試薬調製
以下の試薬を調製した。
クローン００３１から得られた精製抗体を１ｍｇ／ｍｌになるよう、以下に示す組成の反応液で希釈し、第一試薬とした。また免疫原として使用した糖化ＭＡＰを６０μｇ／ｍｌになるよう反応液で希釈し、第二試薬とした。
反応液：２０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ−３５、３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム ｐＨ６．５
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料の測定
７６ｍｇ／ｄｌ ヘモグロビンＡ１ｃを含む市販ＨｂＡ１ｃキャリブレータ（シスメックス社製）０，２，４，６，８μＬを試料として、それぞれ第一試薬２５０μＬと混合し、３５℃５分放置した。９６穴プレート（住友ベークライト社製）を用意し、第一試薬試料混合液を全量をそれぞれのウェルに移し、次いで第二試薬５０μＬを加えた。第二試薬添加前後での６２０ｎｍ吸光度経時変化をプレートリーダーで１５秒間隔でモニターした。
第二試薬添加前と添加１０分後との吸光度変化量を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
試料として添加したヘモグロビンＡ１ｃ量増加に応じて、００３１精製抗体と糖化ＭＡＰとの凝集が阻止され、６２０ｎｍの吸光度変化（濁度）が小さくなった。本抗体は、既知濃度のヘモグロビンＡ１ｃ試料を用いて検量線を作成することにより、ヘモグロビンＡ１ｃホモジニアス測定系適用可能と考えられた。
【００４５】
実施例７ クローン００３１から得られた抗ヘモグロビンＡ１ｃ精製抗体を用いたエライザ法によるヘモグロビンＡ１ｃ測定
（１）００３１精製抗体のアルカリフォスファターゼ標識、標識抗体液の調製
クローン００３１から得られた精製抗体０．２ｍｇをアルカリフォスファターゼ標識キットＮＨ２（同仁化学社製）にてアルカリフォスファターゼ標識を行い、２００μｌのアルカリフォスファターゼ標識抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を得た。０．７ｍｇ／ｍｌブロッキングペプチドフラグメント（東洋紡製：ＢＦＰ−３０１）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス緩衝液で３００倍希釈し、標識抗体液として使用した。
（２）試料前処理
希釈液として０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ５．３を用いた。標準試料として、ウマヘモグロビン（シグマアルドリッチ社：ＨｂＡ１ｃ陰性試料として使用）、ＨｂＡ１ｃ５．０％キャリブレータと同１０．７％キャリブレータ（シスメックス社製）をそれぞれを０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、標準試料前処理液とした。また被験試料としてヘモグロビンＡ１ｃ濃度未知のヒトヘモグロビン試料も同様に希釈し被験試料前処理液とした。
（３）エライザプレートを用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定
９６穴エライザプレート（住友ベークライト製）各ウェルに５０μｌ 各試料前処理液を分注し、室温で１５分放置してエライザプレートに固定化した。液を廃棄後、０．１％（ｗ／ｖ）ツイーン２０と０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（以下 洗浄液）を各ウェル３００μｌ分注３回洗浄を行い、次いで０．７ｍｇ／ｍｌブロッキングペプチドフラグメント（東洋紡製：ＢＦＰ−３０１）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（以下 ブロッキング液）３００μｌを分注して室温１５分放置しブロッキングを行なった。ブロッキング液を廃棄後、各ウェル洗浄液３００μｌ分注３回の洗浄を行い、次いで標識抗体液５０μｌを分注し、室温１５分放置して反応させた。標識抗体液を廃棄後、各ウェル洗浄液３００μｌ分注３回の洗浄を行い、次いでアルカリフォスファターゼ基質液（ＢｌｕｅＰｈｏｓ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ：ＫＰＬ社製）５０μｌを分注し室温で１５分反応させ、２．５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液５０μｌで反応停止させて、プレートリーダーにて主波長６２０ｎｍ副波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を表３に示す。標準試料を検量線として被験試料中ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求めたところ、４．５％と計算された。
【００４６】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、今までマウスでは免疫原性低く得られにくかったヘモグロビンＡ１ｃに対するハイブリドーマを効率よく取得する方法が提供される。そのため免疫に使用するマウス匹数をより少なくできると考えられる。また確立したハイブリドーマから得られる抗体はエライザ法や免疫比濁法への適用も可能であることから種々抗体を利用したセンサー開発にも利用可能と考えられ、本発明は産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化した多抗原性ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ：以下 ＭＡＰ）を免疫原に用いたハイブリドーマの作成方法、ハイブリドーマおよび抗体に関する。更に詳しくは、糖化ヘモグロビンに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法、ハイブリドーマおよび抗体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、糖化蛋白、特に糖化ヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得方法について、糖化されたヒトヘモグロビンＡ１ｃを免疫原とする技術が知られていた（例えば、特許文献１参照）。
しかし、かかる従来技術ではヒトヘモグロビンＡ１ｃの特徴である糖化されたベータ鎖Ｎ末端側以外に反応性を有する抗体も得られる。非常に数多くのクローンの中から所望の抗体を分泌する細胞を選抜しなければならず、スクリーニングに労力がかかるという問題点があった。
一方、かかる特異的な抗体が得られにくい、作業が労働集約的であるという問題点を解消すべく、ペプチド合成によりヒトヘモグロビンベータ鎖のＮ末端側の配列を有するペプチドを得たのち、グルコースと反応させて糖化し、その後キャリア蛋白質に結合させた合成抗原を免疫原に用いるという発明がなされた（例えば、特許文献２参照）。
しかし、かかる発明は特異性という点では改良されたものの、実際に下記参考例で示すようにペプチド抗原を合成しキャリア蛋白に結合させ免疫するも、免疫動物の抗体価の上昇が認められず、ハイブリドーマを得るための次のステップである細胞融合作業に進むことができなかった。依然として抗体が得られにくいという問題点があった。
また、キャリア蛋白に結合させることなく、抗原部位を含む多価抗原ペプチドを合成し、免疫原として使用する技術が知られていたが、糖化したペプチドに対する抗体作成に使用した例は知られていなかった。（例えば、非特許文献１参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６１−２８０５７１
【特許文献２】特許３８０１１３３号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ Ｐ． Ｔａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５、 ｐ５４０９−５４１３， １９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、抗体価上昇に優れた免疫原を用いてヘモグロビンＡ１ｃに反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマの取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）多価抗原ペプチドを糖化して免疫原に使用することを特徴とする、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
（２）糖化に用いる多価抗原ペプチドとして、式Ｉ（式中のＸは配列番号１のペプチドを示す）で示される構造を含むペプチドを合成して使用することを特徴とする、（１）記載の抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
【０００７】
【化１】
【０００８】
（３）（１）記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
（４）（２）記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
（５）ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９で寄託されている（３）記載のハイブリドーマ。
（６）（５）記載のハイブリドーマを使用することを特徴とする抗体生産方法
（７）（５）記載のハイブリドーマによって生産される、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、抗原免疫で抗体価上昇が認められ、最終的にヘモグロビンＡ１ｃに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができた。得られたハイブリドーマは寄託されており、同ハイブリドーマからヘモグロビンＡ１ｃに対する抗体を容易に得ることもできる。またＭＡＰを使用するため、従来法で必要であったペプチド糖化反応後のキャリア蛋白結合作業を省略でき、抗原調製ステップの簡略化も図れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は実施例６で示した本願発明のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体を用いた免疫比濁反応で、ヘモグロビンＡ１ｃ添加量それぞれでの６２０ｎｍ吸光度タイムコースを１５秒間隔の測定ポイントで記録した測定したグラフである。測定ポイント１０ポイント目に第二試薬を加えている。
【図２】図２は実施例７で示した本願発明のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体を用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定エライザを行なったときの検量線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳述する。
【００１２】
本発明のハイブリドーマの作成方法では、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドとリジンを使った架橋体を含む多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）を糖化して用いる。
【００１３】
多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）の合成は、公知のペプチド合成法で行なうことができ、例えばＴａｍの方法が挙げられる（Ｊａｍｅｓ Ｐ． Ｔａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５、 ｐ５４０９−５４１３， １９８８ ）。架橋体は、例えばβアラニンを固定した樹脂にリジン（Ｌｙｓｉｎｅ）をステップワイズに反応結合させることにより目的とする架橋体を調製することができる。すなわち、βアラニンにリジンひとつの結合体は２量体の架橋体として、さらにリジンを反応させて得られるリジン３個結合体は４量体の架橋体として、さらにリジンを反応させて得られるリジン７個の結合体は８量体の架橋体として使用することができる。架橋体の分岐数は２以上であればとくに制限されないが、実用性の点から２〜８が好ましく、さらに好ましくは８である。これら架橋体に目的とするヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドの構成アミノ酸を通常の方法により順次反応結合させることによりＭＡＰを合成することができる。
本発明記載のヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドとは、Ｎ末端にバリンを有しかつ該バリンから連続する３つ以上の公知のヒトヘモグロビンβ鎖部分アミノ酸配列を含む。好ましくはＮ末端のバリン以外にはアミノ基が含まない配列を選択する。例えばＮ末端のバリンから７アミノ酸を含む配列番号１が挙げられる。またヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列部分ペプチドと架橋体の間にスペーサーとなる分子を結合させてもよい。スペーサーに関して特に限定しないが例えば６−アミノカプロン酸やグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）などが挙げられる。このような多価抗原ペプチド（以下、ＭＡＰ）の例として例えば式Ｉ（式中のＸは配列番号１のペプチドを示す）に示した構造を含むペプチドが挙げられる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）の糖化は、グルコースとＭＡＰとを溶液中で接触・反応させ、グルコースとＭＡＰとの間の反応生成物のアマドリ転移により行なわれる。糖化は多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）上の未反応のアミノ基が検出されない程度まで行なうことが望ましいが、免疫原として使用するには部分的な糖化が確認できれば使用することができる。糖化反応後の糖化ＭＡＰは精製してもよい。精製方法として、公知の方法を使用することができる。例えば電荷の違いを利用して陽イオン交換樹脂を使用して未反応のペプチドと糖化ＭＡＰを分離する方法や分子サイズの違いを利用してゲル濾過や限外濾過膜を使用して未反応のグルコースと糖化ＭＡＰを分離する方法が挙げられる。
【００１６】
本発明におけるハイブリドーマ抗体の作成方法は、糖化した多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）を使って公知の方法により免疫動物に免疫を行い、公知の方法により免疫細胞を取得した後、公知の方法によりミエローマと細胞融合実施し、公知の方法により融合細胞と非融合細胞との選択実施し、公知の方法により目的の抗体を産生する細胞のスクリーニング・クローニングを実施する。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは上述の免疫原で免疫を行った後、公知のモノクローナル抗体作成法で作成することができる。例えば、単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年、特開２００８−９２８０２記載内容に従い、作製することができる。抗体はＩｇＭ，ＩｇＧのいずれでもよいが、公知の蛋白分解酵素や遺伝子組み換え技術を用いて低分子化、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ‘）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントなどにして使用することもできる。
【００１８】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。例えばマウスの場合には、ＢＡＬＢ／ｃ メス ４〜１２週令を用いることができる。
【００１９】
動物の免疫は、上述の免疫原を動物の皮内、腹腔内、筋肉内または投与することによって行うことができる。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。
【００２０】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３），ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１），Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１），Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３），ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０），Ｆ０等などである。
【００２２】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００２３】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃でおこなうことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％（ｖ／ｖ）で培養するのが好ましい。
【００２４】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の抗体スクリーニング方法が使用でき、例えば酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、凝集法、セルソーター等により行うことができる。ヘモグロビンＡ１ｃに対する抗体をＥＩＡでスクリーニングするのであれば例えばヘモグロビンＡ１ｃを含むヘモグロビン試料、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端部分をグルコースで糖化した合成ペプチドや、免疫に使用した糖化ＭＡＰを固定化した担体を用いて、得られた細胞培養上清に含まれるヘモグロビンＡ１ｃ結合活性を有する抗体の有無を検知することにより、所望の抗体を産生する細胞をスクリーングすることができる。スクリーニングの際は１種類の固定化物質から得られた反応性データで判断してもよいが、好ましくは各種固定化物質での反応性データを複数取得して、ヘモグロビンＡ１ｃ特異的な抗体の有無を総合的に判断することが望ましい。例えば、ウマヘモグロビンはヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端側部分配列と異なっていることが知られており、ヒトヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有していてもウマヘモグロビンと反応性ある場合はヒトヘモグロビンＡ１ｃ特異的な抗体ではないと考えて除外することができる。また例えば、ペプチド合成により得られたヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端側部分配列の糖化有無による結合性の違いを比較することによって、糖化されたペプチドに特異的に反応する抗体の有無を検知することもできる。
【００２５】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００２６】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよいし、市販の細胞凍結保存剤を用いて凍結保存してもよい。
【００２７】
本発明のハイブリドーマは上記方法により得られたハイブリドーマである。本発明により得られたハイブリドーマの例として例えばヘモグロビンＡ１ｃに反応する抗体を産生するクローン００３１は独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９で寄託されている。
【００２８】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を給源として用いる。公知の方法、例えば 動物細胞大量培養と有用物質生産 大石道夫監修 株式会社シーエムシー １９８６年 記載の方法を用いて培養・精製することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。特に限定されないが、例えばＢＡＬＢ／ｃＡマウスに免疫しＢＡＬＢ／ｃＡ由来のミエローマと細胞融合したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与した同系統マウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。培養時に使用する培地は血清を含まない市販の無血清培地、無血清無蛋白培地を使用するとさらに純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２９】
細胞培養は培地中で細胞増殖に適した温度、炭酸ガス濃度、溶存酸素濃度環境下で行なう。特に限定されないが、例えば３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス濃度に設定されたインキュベーター内でのＴフラスコで静置培養させる。また例えば滅菌されたポリエチレン製バッグ内に無菌的に５％（ｖ／ｖ）炭酸ガスを通気しながら３７℃揺動培養させることもできる。培地には必要により公知の抗生物質・抗真菌剤、糖質、脂質やアミノ酸を追加することができる。抗生物質・抗真菌剤であれば例えば、硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを細胞生育に影響しない程度添加することができる。糖質であれば例えば、グルコース、マルトースを添加することができる。アミノ酸であれば、例えばＬ−グルタミンを添加することができる。Ｌ−グルタミンは培養液中で不安定であるため例えば初期値として８ｍＭ添加しておくこともできるが、溶液中で安定なグルタミン誘導体であるＬ−グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを代替あるいは追加で添加してもよい。添加のタイミングは培養開始する前でもよいが、例えばＬ−グルタミンやグルコースのように培養途中に分解・消費される成分などは培養途中に添加することもできるし、これら栄養源の混合物である培地自体を培養途中で添加してもよい。結果としてハイブリドーマ培養環境の良好化、培養期間の長期化、さらには培養液中の抗体分泌量を高めることが期待できる。ハイブリドーマ作成時と異なる培地を適用して細胞培養抗体生産を行う場合は、同培地に予め馴化させたハイブリドーマを使用することが好ましい。例えば同培地に直接ハイブリドーマをけん濁し、遠心分離操作により細胞と培地を分離、次いで同培地で比較的高い細胞濃度０．５乃至１ｘ１０６／ｍｌとなるよう再けん濁し、倍加速度と生存率など細胞の状況を観察しながら培養を繰り返す。直接同培地に馴化できない場合は従来の培地から混合比を段階的に上げながら行うこともできる。
【００３０】
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは結合活性を有する蛋白部分をコードする遺伝子断片を公知の技術で取得し、公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを組み込んだ形質転換体を培養することにより所望の抗体を得ることができる。また免疫後の脾臓細胞やリンパ細胞に含まれるヘモグロビンＡ１ｃ特異的抗体産生細胞から得られる抗体遺伝子または遺伝子断片を利用してもよい。抗体生産により抗体が形質転換体内に蓄積される場合は公知の方法により形質転換体を回収し破砕することにより抗体を含んだ破砕液が得られる。抗体生産により形質転換体を培養した培地中に抗体が分泌される場合には形質転換体培養により該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ破砕液や培養上清は公知の抗体精製方法でより純度の高い抗体を得ることができる。
【００３１】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、限外濾過膜濃縮、カラムクロマトグラフィーが挙げられる。カラムクロマトグラフィーに使用できる樹脂担体として、例えば陰イオン交換樹脂、プロテインＡやプロテインＧ、プロテインＬ、糖化ペプチド化合物が結合されたアフィニティクロマトグラフィー樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、リガンドとして例えば４−メルカプト−エチル−ピリジン、フェニル基などの結合した疎水クロマトグラフィー樹脂、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体などが挙げられる。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。例えば分泌されるモノクローナル抗体がＩｇＭであれば、プロテインＡクロマトグラフィーの適用難しいことから、限外濾過膜濃縮、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などの精製方法の中から要求品質と経済性とを勘案し手法選択して精製を行う。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性でかつ適切な塩濃度を有する緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐＨは５．５〜８．５、塩濃度として５０ｍＭから３００ｍＭの間が好ましい。
【００３２】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌メンブランフィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤は特に限定されないが、例えば０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコール、アミノ酸を添加することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下にヘモグロビンＡ１ｃに対する抗体を産生するハイブリドーマの作成実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ 糖化ＭＡＰの合成
βアラニンからリジン７個で作製される８量体架橋体骨格に６−アミノカプロン酸を介しヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列７アミノ酸（配列番号１）からなるペプチド７個を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成導入し、ＭＡＰを得た。
ＭＡＰ １５ｍｇ、Ｄ−グルコース５ｍｇをピリジンと酢酸を１：１混合液２．２ｍｌに溶解し、遮光密栓した容器に入れ、室温で１週間糖化反応させた。薄層クロマトグラフィー分析を行い、糖化反応前のＭＡＰで認められたニンヒドリン反応が糖化反応後はほとんど認められず、また硫酸加熱により同スポット位置着色することから、ＭＡＰのアミノ基が糖化されたと判断し、反応を終了させた。反応液を減圧乾燥後、ＰＢＳで再溶解し、同緩衝液で平衡化されたＰＤ１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）で脱塩を行い、糖化ＭＡＰを得た。
【００３５】
実施例２ 糖化ＭＡＰを免疫原とした免疫
糖化ＭＡＰを１ｍｇ／ｍｌとなるよう注射用生理食塩水にて希釈し抗原液を調製した。抗原液０．２ｍｌ分を等量のコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ 、５週令、メス、日本クレア）の腹腔に１匹あたりエマルジョン１００μＬ注入し、初回免疫を行った。さらにおよそ２週間間隔で４回、糖化ＭＡＰを同様に希釈して抗原液を調製し、インコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と抗原液を等量混合・エマルジョン化し、同様に同マウスに再度免疫を施した。５回目の免疫翌週に採血を行い、抗体価測定試料とした。
【００３６】
比較例１ 糖化ペプチドの合成および糖化ペプチド結合ＫＬＨの調製
ペプチド合成によりヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列７アミノ酸のＣ末端にシステインを付加した配列番号２記載のペプチドを得た。同ペプチド１０ｍｇ、Ｄ−グルコース１０ｍｇをピリジンと酢酸を１：１混合液２．２ｍｌに溶解し、遮光密栓した容器に入れ、室温で１週間糖化反応させた。薄層クロマトグラフィー分析によりペプチドの糖化を確認した後、反応液を減圧乾燥させ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で再溶解した。Ｒｅｄｕｃｅ−Ｉｍｍ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｒｅｄｕｃｔａｎｔ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、ペプチドのシステイン残基に含まれるＳＨ基を還元したのち、活性化マレイミド基を有するキャリア蛋白である Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社）６ｍｇと混合し室温で２時間反応させ、次いでＰＢＳ緩衝液で平衡化されたＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）で脱塩を行い、糖化ペプチド結合ＫＬＨを得た。
【００３７】
比較例２ 糖化ペプチド結合ＫＬＨを免疫原とした免疫
糖化ペプチド結合ＫＬＨを１ｍｇ／ｍｌとなるよう注射用生理食塩水にて希釈し抗原液を調製した。抗原液０．２ｍｌ分を等量のコンプリートフロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と混合してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ 、５週令、メス、日本クレア）の腹腔に１匹あたりエマルジョン１００μＬ注入し、初回免疫を行った。さらにおよそ２週間間隔で４回、糖化ペプチド結合ＫＬＨを同様に希釈して抗原液を調製し、インコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と抗原液を等量混合・エマルジョン化し、同様に同マウスに再度免疫を施した。５回目の免疫翌週に採血を行い、抗体価測定試料とした。
【００３８】
実施例３ 抗血清反応性の比較
実施例２に示した糖化ＭＡＰで免疫を行ったマウス４個体と、比較例２に示した糖化ペプチド結合ＫＬＨで免疫を行ったマウス４個体、計８個体の抗血清での抗体価測定を行った。
ヒトヘモグロビンＡ１ｃを１０％含むヘモグロビン試料（シスメックス社製）を１０μｇ／ｍｌになるようＰＢＳで希釈し、９６穴エライザプレート（住友ベークライト社製）に室温１時間接触させ固定化した（ヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有試料固相）。次いで固定化溶液を廃棄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングを行った。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した抗血清希釈サンプル５０ｕＬと室温で１時間反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコサイトメーション社製）と室温で１時間反応させた。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、テトラメチルベンジジンを含む発色液（ダコサイトメーション社製）５０μＬを室温１０分反応させた後１Ｎ硫酸５０μＬと混合して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。対照としてヒトヘモグロビン（シグマアルドリッチ社製）を同様に固定化したエライザプレート（ヒトヘモグロビン固相）でも同様に測定を行った。
糖化ペプチド結合ＫＬＨで免疫したマウス個体ではほとんど抗体価上昇見られなかったが、糖化ＭＡＰを抗原として免疫したマウス個体でヘモグロビンＡ１ｃ特異的シグナルが高く、比較例に比べ免疫応答が高い結果が得られた。抗血清４０００倍希釈試料を測定したときのヒトヘモグロビン固相で得られた吸光度に対するヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有試料固相での吸光度の比（ＯＤ比）を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例４ 抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体産生ハイブリドーマの作成
（１）細胞融合
実施例３の結果からもっとも反応性の高かったマウス個体１を選択し、細胞融合を実施した。最終免疫の４日後、同マウスに麻酔処置を行い、ひきつづき同マウス頚椎脱臼後、脾臓を無菌的に摘出して脾臓細胞を調製（３．８ｘ１０８個）した。一方、骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃５％炭酸ガス濃度下拡大培養を行い、次いで血清成分を含まないｅ−ＲＤＦ培地に細胞けん濁した。このようにして得られたＳｐ２／０−Ａｇ１４ ７．５×１０７個と上述の脾臓細胞とを５０ｍｌ容量の遠心管中にて混合し、２００×ｇ １０分遠心分離を行い、上清廃棄、チューブごとタッピングして細胞塊をほぐし、３７℃環境下で５０％ポリエチレングリコール１５００液（ロシュ社）を１ｍｌ添加し細胞と混合、次いでｅ−ＲＤＦ培地を１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌの順に添加した。２００×ｇ １０分遠心分離後、そのまま３７℃で５分間放置し、その後上清を廃棄した。パスツールピペットを使って牛胎児血清７．５ｍｌに融合細胞を縣濁し、うち４ｍｌ分を選択培養培地（１００×ＨＡＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ社）１／１００容とＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２４０ｍｌに縣濁、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）２０枚に１２０μｌづつ各ウェルに無菌的に分注した。３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス条件下でＨＡＴ選択培養を行った。融合から１０日後目視でコロニーが認められ、ハイブリドーマの出現を確認した。
（２）抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニング
選択培養後の各ウェル培養上清３０μｌに０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液１５０μｌを加えた希釈液を試料として用い、ヘモグロビンＡ１ｃ固定化エライザプレートに対する反応性を指標とした一次スクリーニングを実施した。
ヘモグロビンＡ１ｃ固定化エライザプレートは以下のようにして作成した。ヘモグロビンＡ１ｃ１０％含有するヘモグロビン試料（シスメックス社製）をＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈後、１ウェルあたりヘモグロビン希釈液５０μｌを９６穴エライザプレート（住友ベークライト社製）に分注した後２５℃２時間放置して固定化した。次いで液を廃棄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳ緩衝液を各ウェルに０．３ｍｌ分注・廃棄を３回繰り返して洗浄を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌを各ウェルに分注して１時間２５℃で放置しブロッキングを行った。
次いで液を除去し洗浄後、選択培養上清５０μＬを分注し、２５℃でヘモグロビンＡ１ｃ固定化プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液にて２０００倍に希釈して調整したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコサイトメーション社製）５０μｌを分注し２５℃１時間プレートと反応させた。液を除去し洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む発色液（ダコサイトメーション社製）を各ウェル５０μＬ分注し２５℃で１０分酵素反応させ、１Ｎ硫酸５０μＬ分注して反応停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ウェル番号００３１で着色が確認され強い反応性が認められた。さらに上記１次スクリーニングと同様の方法で、免疫原として使用した糖化ＭＡＰを固定化した９６穴エライザプレートと、糖化を行なっていないＭＡＰを固定化した９６穴エライザプレート、さらにウマヘモグロビンを固定化した９６穴エライザプレートとでそれぞれウェル番号００３１の培養上清希釈試料の反応性を調べたところ、糖化ＭＡＰで反応性を示すがＭＡＰやウマヘモグロビンで反応性を示さなかった。これらの結果から、本ウェルを選抜し、引き続きクローニングを実施することにした。
（３）ハイブリドーマのクローニング
限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわちスクリーニングで選抜した各選択培養ウェルの細胞を１００個となるよう無菌的にサンプリングし、それぞれクローニング培地（ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２０ｍｌに対し、最終３個／ｍｌになるよう縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）各１枚９６ウェルに２００μｌづつ無菌的に分注した。３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス条件下で１０日間培養を行った。各ウェルのクローニング培養後上清３０μｌをサンプリングし、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液１５０μｌで希釈してＥＬＩＳＡ試料とし、１次スクリーニングと同様にＥＬＩＳＡを実施し、反応性が認められた培養上清をサンプリングしたウェルから１ウェル選抜し１次クローニング後のハイブリドーマ００３１を得た。本細胞を牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地にて拡大培養したのち、セルバンカー（十慈フィールド社製）に生細胞密度５ｘ１０６個／ｍｌとなるよう細胞を十分けん濁し、ガンマ線滅菌された１．８ｍｌ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に該細胞けん濁液を１ｍｌづつ分注し、密栓後−８０℃フリーザーにて凍結保存した。なお、ハイブリドーマ００３１は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成２１年６月１８日 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９として寄託されている。
【００４１】
実施例５ クローン００３１から得られる抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体の精製
（１）００３１培養上清の調製
液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００３１の入ったチューブを−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０×ｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種し３７℃５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス濃度下で培養した。２継代同培地で培養後、４ｍＭ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、０．１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ−６８を添加した、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）とｅ−ＲＤＦ培地との等量混合培地で馴化を行い、馴化後さらに３継代同培地で培養した。その後培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、次いで培地４５ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ２浮遊細胞培養用フラスコに継代培養した。その後２５０ｍｌエリンマイヤーフラスコ（コーニング社製）１本に培地８０ｍｌになるよう拡大し、２０ｍｌ／分で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２ガス通気を行いながら３７℃１２０ｒｐｍで旋回培養を開始した。最終２５０ｍｌエリンマイヤーフラスコ６本まで培養スケールを拡大した後、１週間培養を維持し、培地中に抗体を十分分泌させた。なお培養途中で各フラスコにＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ２０ｍｌ追加１回、次いで８０ｍＭグルタミンを追加で添加したｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌ追加２回を行った。得られた細胞培養液を７００×ｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清６３５ｍｌを得た。
（２）モノクローナル抗体のサブタイピング
市販のイムノクロマトグラフィー法を使ったサブタイピング試薬（イソストリップ：ロシュ社）を使い、得られた培養上清をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈した希釈液１５０μｌを試料として分析した。ハイブリドーマ００３１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＭ κであった。
（３）００３１精製抗体の調製
得られた培養上清は０．２２μｍフィルターでろ過を実施したのち、限外濾過膜ペリコンＸＬフィルター（分子量分画５０Ｋダルトン用：日本ミリポア社製）にて濃縮を実施した。得られた抗体を含む濃縮液を一旦２０％飽和度での硫酸アンモニウム塩析により不溶物を除去したのち、５０％飽和度で硫酸アンモニウム塩析を行い、２段階目の塩析で得られた不溶物を遠心分離にて沈殿として回収した。得られた沈殿をＰＢＳ緩衝液９ｍｌで再溶解し、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液１Ｌに対して透析を３回実施した。次いでガンマ線滅菌された０．２２μｍの低蛋白吸着メンブランフィルター（日本ミリポア社製）で００３１精製抗体を濾過し、ガンマ線滅菌済プロピレン製１５ｍｌチューブ内で４℃保管した。
ＯＤ２８０ｎｍの吸収により蛋白量を算出した結果、得られた００３１精製抗体は７０．２ｍｇであった。またＤＴＴ還元処理した００３１精製抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動しＣＢＢ染色後分析したところ、２つのバンドが検出された。分子量マーカー位置との比較から分子量２．５万と７．１万であり、それぞれκ鎖とμ鎖に対応する抗体由来の染色像と考えられた。
【００４２】
実施例６ クローン００３１から得られた抗ヘモグロビンＡ１ｃ精製抗体を使った免疫比濁反応
（１）試薬調製
以下の試薬を調製した。
クローン００３１から得られた精製抗体を１ｍｇ／ｍｌになるよう、以下に示す組成の反応液で希釈し、第一試薬とした。また免疫原として使用した糖化ＭＡＰを６０μｇ／ｍｌになるよう反応液で希釈し、第二試薬とした。
反応液：２０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ−３５、３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム ｐＨ６．５
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料の測定
７６ｍｇ／ｄｌ ヘモグロビンＡ１ｃを含む市販ＨｂＡ１ｃキャリブレータ（シスメックス社製）０，２，４，６，８μＬを試料として、それぞれ第一試薬２５０μＬと混合し、３５℃５分放置した。９６穴プレート（住友ベークライト社製）を用意し、第一試薬試料混合液を全量をそれぞれのウェルに移し、次いで第二試薬５０μＬを加えた。第二試薬添加前後での６２０ｎｍ吸光度経時変化をプレートリーダーで１５秒間隔でモニターした。
第二試薬添加前と添加１０分後との吸光度変化量を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
試料として添加したヘモグロビンＡ１ｃ量増加に応じて、００３１精製抗体と糖化ＭＡＰとの凝集が阻止され、６２０ｎｍの吸光度変化（濁度）が小さくなった。本抗体は、既知濃度のヘモグロビンＡ１ｃ試料を用いて検量線を作成することにより、ヘモグロビンＡ１ｃホモジニアス測定系適用可能と考えられた。
【００４５】
実施例７ クローン００３１から得られた抗ヘモグロビンＡ１ｃ精製抗体を用いたエライザ法によるヘモグロビンＡ１ｃ測定
（１）００３１精製抗体のアルカリフォスファターゼ標識、標識抗体液の調製
クローン００３１から得られた精製抗体０．２ｍｇをアルカリフォスファターゼ標識キットＮＨ２（同仁化学社製）にてアルカリフォスファターゼ標識を行い、２００μｌのアルカリフォスファターゼ標識抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を得た。０．７ｍｇ／ｍｌブロッキングペプチドフラグメント（東洋紡製：ＢＦＰ−３０１）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス緩衝液で３００倍希釈し、標識抗体液として使用した。
（２）試料前処理
希釈液として０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ５．３を用いた。標準試料として、ウマヘモグロビン（シグマアルドリッチ社：ＨｂＡ１ｃ陰性試料として使用）、ＨｂＡ１ｃ５．０％キャリブレータと同１０．７％キャリブレータ（シスメックス社製）をそれぞれを０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、標準試料前処理液とした。また被験試料としてヘモグロビンＡ１ｃ濃度未知のヒトヘモグロビン試料も同様に希釈し被験試料前処理液とした。
（３）エライザプレートを用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定
９６穴エライザプレート（住友ベークライト製）各ウェルに５０μｌ 各試料前処理液を分注し、室温で１５分放置してエライザプレートに固定化した。液を廃棄後、０．１％（ｗ／ｖ）ツイーン２０と０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（以下 洗浄液）を各ウェル３００μｌ分注３回洗浄を行い、次いで０．７ｍｇ／ｍｌブロッキングペプチドフラグメント（東洋紡製：ＢＦＰ−３０１）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（以下 ブロッキング液）３００μｌを分注して室温１５分放置しブロッキングを行なった。ブロッキング液を廃棄後、各ウェル洗浄液３００μｌ分注３回の洗浄を行い、次いで標識抗体液５０μｌを分注し、室温１５分放置して反応させた。標識抗体液を廃棄後、各ウェル洗浄液３００μｌ分注３回の洗浄を行い、次いでアルカリフォスファターゼ基質液（ＢｌｕｅＰｈｏｓ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ：ＫＰＬ社製）５０μｌを分注し室温で１５分反応させ、２．５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液５０μｌで反応停止させて、プレートリーダーにて主波長６２０ｎｍ副波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を表３に示す。標準試料を検量線として被験試料中ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求めたところ、４．５％と計算された。
【００４６】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、今までマウスでは免疫原性低く得られにくかったヘモグロビンＡ１ｃに対するハイブリドーマを効率よく取得する方法が提供される。そのため免疫に使用するマウス匹数をより少なくできると考えられる。また確立したハイブリドーマから得られる抗体はエライザ法や免疫比濁法への適用も可能であることから種々抗体を利用したセンサー開発にも利用可能と考えられ、本発明は産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価抗原ペプチドを糖化して免疫原に使用することを特徴とする、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
【請求項２】
糖化に用いる多価抗原ペプチドとして、式Ｉ（式中のＸは配列番号１のペプチドを示す）で示される構造を含むペプチドを合成して使用することを特徴とする、請求項１記載の抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
【化１】
【請求項３】
請求項１記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項２記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
【請求項５】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９で寄託されている請求項３記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項５記載のハイブリドーマを使用することを特徴とする抗体生産方法。
【請求項７】
請求項５記載のハイブリドーマによって生産される、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体。
【請求項１】
多価抗原ペプチドを糖化して免疫原に使用することを特徴とする、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
【請求項２】
糖化に用いる多価抗原ペプチドとして、式Ｉ（式中のＸは配列番号１のペプチドを示す）で示される構造を含むペプチドを合成して使用することを特徴とする、請求項１記載の抗体産生ハイブリドーマの作成方法。
【化１】
【請求項３】
請求項１記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項２記載の方法で作成されたハイブリドーマ。
【請求項５】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１９で寄託されている請求項３記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項５記載のハイブリドーマを使用することを特徴とする抗体生産方法。
【請求項７】
請求項５記載のハイブリドーマによって生産される、ヘモグロビンＡ１ｃに結合性を有する抗体。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−５０２７４（Ｐ２０１１−５０２７４Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２００２１７（Ｐ２００９−２００２１７）
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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