バイオアッセイ及び該アッセイに使用されるペプチド
この発明は、結核菌Ａｇ８５ＢのＴ細胞エピトープ由来の人工的に変更したペプチド配列を含む、結核菌感染を検出するためのバイオアッセイを提供するものである。特に好ましいペプチドは、Ｘがメチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）であるＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）及びＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１４）である。また、この発明は、かかるアッセイにて使用されるペプチドを提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を検出するアッセイにて使用されるペプチド、及びアッセイそのものに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核症は、細菌である結核菌の感染により発症する。結核症は多くの国、特に発展途上国世界において大きな問題であり、また、多くの先進国においても増加の一途を辿っている。多くの場合、結核症は肺から感染するが、リンパ節、皮膚及び骨などの体のその他の部分をも侵し得るものである。
【０００３】
治療を可能とする結核症の診断は、疾患の蔓延に対抗する主たる対抗手段である。診断は、臨床徴候、痰培養組織、胸部Ｘ線、組織の組織構造及び気管支の洗浄液流体、並びに、ツベルクリン反応及びヒーフ試験などのツベルクリン皮膚試験（別名、精製ツベルクリンタンパク質スタンダード（Purified Protein Derivative Standard）すなわちＰＰＤ皮膚試験）の組合せにより実施される。かかる試験は、患者の血液内に結核菌の抗体が存在しているかを明らかにする、結核菌タンパク質に対する免疫反応に基づいて行われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらテストは、患者に対し免疫学的な課題となる投与と、それに次ぐテスト結果を判定する追跡実験を必要とするものである。これらのステップが、試験を集団検診操作に適用することを困難としている。
【０００５】
従って、この発明は、これらの問題のいくつかに解決策を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
広義の第一の実施態様において、この発明は、ＮＳＰＡＸを含み、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である１８個未満のアミノ酸のペプチドであって、かかるペプチドは、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）のペプチドから作成された抗体に結合し得るペプチドである。特に好ましい実施形態において、かかるペプチドは、そのような抗体に結合する。
【０００７】
実際的な言い方をするならば、そのような抗体は、Ｃ末端にＣアミノ酸を付加したペプチド（配列ＩＤ１１）、すなわちＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶＣから作成される。
【０００８】
したがって、第二の実施態様において、かかるペプチドは、ＮＳＰＡＸ配列のＣ末端及び／又はＮ末端に、付加的なアミノ酸を６個まで含むものである。
【０００９】
そのことから、かかるペプチドは、ＮＮＳＰＡＸ配列を含むことが好ましく、より好ましくは、ＮＮＳＰＡＶ配列（配列ＩＤ１４）を含む。
【００１０】
更に好ましい実施態様では、ペプチドは、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）であるＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）を含む。
【００１１】
この発明の全て実施態様において、ペプチドが、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）でないことが好ましい。
【００１２】
また、この発明の全て実施態様において、ペプチドはＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）からなり、Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）であることが好ましい。
【００１３】
更に、この発明に従う全てのペプチドにおいて、Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）又はアラニン（配列ＩＤ１５）であることが好ましい。更にまた、ペプチドのＸは、メチオニン（配列ＩＤ１８）又はアラニン（配列ＩＤ１５）であることがより好ましい。これら特定の置換により、ロイシンが熱的安定性を付与するので、暑い国の現場での使用に適することとなり好ましい。
【００１４】
この発明に従う全ての実施態様において、ペプチドは、ラベルを含むことが特に好ましい。ラベルされたペプチドの使用は、結核菌を検出するためのアッセイの使用を促進するものである。適当なラベルは、（放射性種を付加したもの、すなわちペプチドにおける一つ以上の原子をその放射性同等物と置換したものなどの）放射性ラベルを含み、シンチレーション計数やそれに類似するものにより、ペプチド又はペプチドを含む複合体の存在又は濃度を即座に検出することを可能とするものである。酵素を介した発色性のラベル等のその他のラベルを使用することも可能である。特に好ましいラベルは、ペプチドの蛍光タンパク質への結合を含む、蛍光ラベルである。このとき、（アレクサフルーア６３３などの）アレクサフルーアを蛍光ラベルとすることが特に好ましい。
【００１５】
また、上述の全てのペプチドは、単離された形態、すなわち、実質的に（細菌、菌類又は哺乳類などの）ネイティブなものに由来するタンパク質を含まないものであることが好ましい。
【００１６】
上述のペプチドは、マイコバクテリウム（Mycobacterium）を検出するアッセイに適用することができる。
【００１７】
この発明の範囲には、上述のペプチドをコードする塩基配列が含まれる。かかる配列は、この発明のペプチドの生合成に適用される。
【００１８】
また、この発明の範囲には、配列ＩＤ１１のペプチドから作成された抗体が含まれる。この発明の抗体は、相補的な判定領域のみが例えばネズミ由来であり、軽鎖及び重鎖上のネズミの定常領域が、人間の配列に置換、すなわちＣＤＲグラフトされた抗体である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体とすることができる。また、この発明の抗体は、例えば、人間の抗体を生産し得る形質転換動物に免疫付与することにより準備した人間の抗体とすることもできる（例えば、国際公開第９３／１２２２７号パンフレットを参照）。
【００１９】
更に、この発明の範囲には、上述したペプチドを含む結核菌の存在を判定する置換ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）アッセイが含まれる。かかるアッセイを実行するための適当な手順を以下に記載する。そのような移動アッセイは、配列ＩＤ１１から作成された抗体、又は配列ＩＤ１１と親和性を有するような抗体の断片を含むことが好ましい。
【００２０】
更にまた、この発明の範囲は、結核菌の有無を判定する、配列ＩＤ１１から作成された抗体、又は配列ＩＤ１１と親和性を有するような抗体の断片を含むＥＬＩＺＡアッセイが含まれる。
【００２１】
加えて、この発明の範囲には、結核菌の有無を判定する、この発明に従うペプチド及び配列ＩＤ１１に従うペプチドを含んだ置換アッセイが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
試験は、配列がＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）として、１８個のペプチドｐ３（Ｐ７７９に記載の、アミノ酸１９〜３６）で示される、同定された結核菌Ａｇ８５Ｂ（非特許文献１）由来のＴ細胞エピトープに基づくものである。
【非特許文献１】Mustafa, A.S. et al, "Identification and HL Restriction of Nuturally Derived ThI -Cell Epitopes from the Secreted 1-Cell Epitopes from the Secreted Mycobacterium tuberculosis Antigen 85B Recognised by Antigen-Specific Human CD4+ T-CeIl Lines", Infection and Immunity, 68(7), 3933-3940, 2000
【００２３】
この発明の実施態様は、競合的な置換ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）アッセイ、実際上はリガンド置換アッセイを提供する。
【００２４】
結核菌に対する抗体、特にＡｇ８５Ｂのエピトープを対象とする抗体は、試験プレート上に結合している。抗体に結合し得るペプチドであって、結核菌の抗原よりも低い親和性を有するペプチドは、好ましくは蛍光マーカー等によりラベルされた抗体に結合する。（有機体などの）結核菌の抗原を含む試料が、抗体−ペプチド複合体と接触すると、抗原がペプチドを置換し、そのことは蛍光の変化により検出される。この発明のその他の実施態様では、以下に記載の、適当な合成ペプチドが提供される。
【００２５】
アナログライブラリーに代々使用し得るターゲットとなる抗原を同定するために、ｐ３の１８個のペプチド（すなわち、配列ＩＤ１１の、１〜９番目のアミノ酸、２〜１０番目のアミノ酸、３〜１１番目のアミノ酸など）をマッピングして、重複する１０種×９個のペプチドを合成した。
【００２６】
１文字で示す標準的なアミノ酸の符号を使用して、１０種×９個のペプチドの配列を以下に示す。
配列ＩＤ１：ＧＲＤＩＫＶＱＦＱ（１〜９番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−１に記載
配列ＩＤ２：ＲＤＩＫＶＱＦＱＳ（２〜１０番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−２に記載
配列ＩＤ３：ＤＩＫＶＱＦＱＳＧ（３〜１１番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−３に記載
配列ＩＤ４：ＩＫＶＱＦＱＳＧＧ（４〜１２番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−４に記載
配列ＩＤ５：ＫＶＱＦＱＳＧＧＮ（５〜１３番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−５に記載
配列ＩＤ６：ＶＱＦＱＳＧＧＮＮ（６〜１４番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−６に記載
配列ＩＤ７：ＱＦＱＳＧＧＮＮＳ（７〜１５番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−７に記載
配列ＩＤ８：ＦＱＳＧＧＮＮＳＰ（８〜１６番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−８に記載
配列ＩＤ９：ＱＳＧＧＮＮＳＰＡ（９〜１７番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−９に記載
配列ＩＤ１０：ＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（１０〜１８番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−１０に記載
【００２７】
１８個のｐ３（配列ＩＤ１１）に沿ったこれらのペプチドは、１８個のｐ３（配列ＩＤ１１）に対する（ウサギ由来の）抗血清からスクリーニングされる。かかるスクリーニングは、９個〜１８個のペプチドの相対的な結合能の評価に用いられる、競合的なＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）技術を利用する。
【００２８】
簡単に説明すると、かかるアッセイは、ｐ３の１８個のペプチド（Ｐ７７９、配列ＩＤ１１）をＥＬＩＳＡプレートに結合させて（コーティングして）、次いで、様々な分量の競合的なリガント（９個のペプチド、配列ＩＤ１１）及び抗血清を（それらを１：２５０にて希釈して）培養することに関するものである。光血清のｐ３の１８個のペプチドに対する結合レベルは、ヤギの抗ウサギペルオキシダーゼ結合抗体による処理を施し、次いで、発色性基質であるＡＢＴＳ（2,2-アジゾ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリン スルホネート]、2,2-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]）及び過酸化水素を添加して、プレートリーダ上にて緑色の発色を光学濃度（吸光度）として記録することにより示される。発色は、プレートにおける主たる光血清に対する結合レベルに比例する。
【００２９】
試験ＥＬＩＳＡは、コートしているペプチドの濃度、及び、ＥＬＩＳＡ実験において、Ｐ７８２−１の９個のペプチド（ＧＲＤＩＫＶＱＦＱ）―配列ＩＤ１のＰ７７９の１８個のペプチド（ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＢＢＳＰＡＶ）―配列ＩＤ１１(Mustafa, A.S. et al, supra)に対する競合的ＥＬＩＳＡを含む、競合的なペプチドを確認するために実施される。この９個のペプチドは、ｐ２の１８個のペプチド（ＹＬＱＶＰＳＰＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱ）−配列ＩＤ１２と重複するよう選択されている。その結果から、発明者は、ＥＬＩＳＡ研究に適当なペプチドの濃度を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、２μＭ溶液のｐ３の１８個のペプチド（ｐ７７９）−配列ＩＤ１１によりコートし、その後、４倍まで段階希釈される５００μＭの競合的なペプチドの溶液が使用される。試験ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。
【００３０】
次いで、エピトープマッピングＥＬＩＳＡを実施して、１０種×９個（Ｐ７８２−１〜Ｐ７８２−１０）―配列ＩＤ１〜１０と、ｐ３の１８個のペプチド（Ｐ７７９）―配列ＩＤ１１との間の相対的な結合の親和性を判定した。選択されるペプチドの濃度範囲（競合曲線の線形部分）は、競合的なエピトープの相対的な結合の親和性の品質評価のために重要である。その結果、この濃度範囲では、Ｐ７８２−１〜Ｐ７８２−９の９個のペプチド（すなわち、配列ＩＤ１〜９）は、抗血清に充分量結合しなかったが、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド―配列ＩＤ１０は、ｐ３の１８個のペプチド（配列ＩＤ１１）と同様、抗血清に強く結合した。この結果は大変重要であり、Ｐ７８２−１０ペプチド、配列ＩＤ１０と８残基重複している、前述のＰ７８２−９の９個のペプチド（配列ＩＤ９）が、充分な結合を示さなかったことから、発明者はＣ末端のバリン残基が重要である可能性に気付いた。このエピトープマッピングＥＬＩＳＡの結果は、図２（ａ）及び２（ｂ）に示す。
【００３１】
ターゲットとなるエピトープＥＬＩＳＡは、抗血清に結合するエピトープのＣ末端領域の重要性を試験するよう設計された。対応する９個のペプチドから切り取った、Ｐ７８２−１１（ＧＮＮＳＰＡ）―配列ＩＤ１３及びＰ７８２−１２（ＮＮＳＰＡＶ）―配列ＩＤ１４の、６個のペプチドを２種類合成し、上述したようにそれらを競合的なＥＬＩＳＡに供し、エピトープマッピングＥＬＩＳＡにて重要なエピトープとして同定されているＰ７８２−１０の９個（配列ＩＤ１０）を再度試験した。ターゲットとされるエピトープＥＬＩＳＡの結果は図３に示す。データは明らかに再現性のある結果を示しており、以下のことを再度示している。
・Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（配列ＩＤ１０）は、Ｐ７７９のｐ３の１８個のペプチド（配列ＩＤ１１）と同様、抗血清に強く結合した。
・Ｐ７８２−１１の６個のペプチド（配列ＩＤ１３）は抗血清に結合しなかった。そして、
・Ｐ７８２−１２の６個のペプチド（ＮＮＳＰＡＶ）（配列ＩＤ１４）の抗血清への結合は、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（配列ＩＤ１０）又はＰ７７９の１８個のペプチド（配列ＩＤ１１）に比べ、２分の１倍（１／１．９９倍）強い。
【００３２】
この結果は、バリン残基を含むＣ末端領域の重要性を示している。この実験から、Ｎ末端領域を変更することは適当ではなく、異なる結合の親和性とするためには、Ｃ末端のバリン残基をターゲットとすることが適当であることがわかった。そのことから、この発明者らは、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（ＳＧＧＮＮＳＰＡＶ）、配列ＩＤ１０に基づくライブラリーに焦点を当て、Ｃ末端領域を変更し、Ｘが、その他の疎水性の荷電アミノ酸であり、多様なアミノ酸である、ＳＧＧＮＮＳＰＡ＋Ｘ配列を有するペプチドを合成した。
【００３３】
ライブラリーＥＬＩＳＡのために、発明者らは以下のペプチドを合成した。
配列ＩＤ１５：ＳＧＧＮＮＳＰＡＡ、Ｐ７８３−１に記載
配列ＩＤ１６：ＳＧＧＮＮＳＰＡＦ、Ｐ７８３−２に記載
配列ＩＤ１７：ＳＧＧＮＮＳＰＡＬ、Ｐ７８３−３に記載
配列ＩＤ１８：ＳＧＧＮＮＳＰＡＭ、Ｐ７８３−４に記載
配列ＩＤ１９：ＳＧＧＮＮＳＰＡＹ、Ｐ７８３−５に記載
配列ＩＤ２０：ＳＧＧＮＮＳＰＡＧ、Ｐ７８３−６に記載
配列ＩＤ２１：ＳＧＧＮＮＳＰＡＳ、Ｐ７８３−７に記載
配列ＩＤ２２：ＳＧＧＮＮＳＰＡＰ、Ｐ７８３−８に記載
配列ＩＤ２３：ＳＧＧＮＮＳＰＡＮ、Ｐ７８３−９に記載
配列ＩＤ２４：ＳＧＧＮＮＳＰＡＥ、Ｐ７８３−１０に記載
配列ＩＤ２５：ＳＧＧＮＮＳＰＡＲ、Ｐ７８３−１１に記載
【００３４】
発明者らは、単一のアッセイにて競合的なペプチドの相対的な結合の親和性を評価できなくならないよう、競合的なペプチドの濃度を前述の実験にて利用可能な範囲に制限した。ライブラリーの競合的なＥＬＩＳＡの結果（図４に示している）は、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（ＳＧＧＮＮＳＰＡＶ）、配列ＩＤ１０に対する結合の親和性の範囲を示している。エピトープにおいて特に重要なのは、特には１２５μＭ及び３１．３μＭのエピトープ濃度にあるアラニン、ロイシン及びメチオニンのバリアント（配列ＩＤ１５、１６及び１８）である。これらのうち、熱安定性が増大する観点から、アラニン及びメチオニンのバリアントが特に好ましく、それらは特に暑い国の現場にて有用なものとなる。
【００３５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
この発明に従うＥＬＩＳＡアッセイを実施するに適当な方法を以下に説明する。
【００３６】
結核菌の存在を判定するために、患者からの試料を配列ＩＤ１１から作成された抗体と接触させ、試料内のペプチドと抗体とで形成された複合体の有無を検出し、標準のコントロールに対する当該試料内にて形成された複合体の分量を検出し、このとき、コントロールに対する試料内の複合体の分量が増大していると、結核菌が存在することを示している。ＥＬＩＳＡアッセイを実施する一般的な方法は、当業者には公知である。患者からの試料は、血液、唾液、精液及び母乳などの体液、又は、例えば、ホモゲナイズによって適当に準備された生検材料などの組織サンプル等の形態で提供され得る。このとき、呼吸器官由来の試料が好ましい。特に好ましいのは、唾液或いは気管支又は肺の洗浄により得られる液体である。このとき、最も好ましいのは、患者の呼吸から伴出された物質の噴霧及び収集による患者の咳反射を含めることにより得られた試料であり、これらの試料は、気管由来の物質を含む。
【００３７】
置換ＥＬＩＳＡアッセイ
この発明に従う置換ＥＬＩＳＡアッセイを実施するに適当な方法を以下に説明する。
【００３８】
結核菌の存在を判定するために、ここに説明し、請求項に記載の所定のペプチドを含む組成物、及び患者からの試料を提供する。かかる組成物は、配列ＩＤ１１から作成された抗体と接触して、試料内のペプチドと抗体とで形成された複合体の有無を検出し、標準のコントロールに対する当該試料内にて形成された複合体の分量を検出し、このとき、コントロールに対する試料内の複合体の分量が増大していると結核菌が存在することを示している。
【００３９】
置換ＥＬＩＳＡアッセイを実施する一般的な方法は、当業者には公知である。また、患者からの試料は、血液、唾液、精液及び母乳などの体液、又は、例えば、ホモゲナイズによって適当に準備された生検材料などの組織サンプル等の形態で提供され得る。このとき、呼吸器官由来の試料が好ましい。特に好ましいのは、唾液或いは気管支又は肺の洗浄により得られる液体である。なお、最も好ましいのは、患者の呼吸から伴出された物質の噴霧及び収集による患者の咳反射を含めることにより得られた試料であり、これらの試料は、気管由来の物質を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】試験ＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図２ａ】（ａ）は、エピトープマッピングＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図２ｂ】（ｂ）は、エピトープマッピングＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図３】ターゲットされたエピトープＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図４】ライブラリーの競合的なＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を検出するアッセイにて使用されるペプチド、及びアッセイそのものに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核症は、細菌である結核菌の感染により発症する。結核症は多くの国、特に発展途上国世界において大きな問題であり、また、多くの先進国においても増加の一途を辿っている。多くの場合、結核症は肺から感染するが、リンパ節、皮膚及び骨などの体のその他の部分をも侵し得るものである。
【０００３】
治療を可能とする結核症の診断は、疾患の蔓延に対抗する主たる対抗手段である。診断は、臨床徴候、痰培養組織、胸部Ｘ線、組織の組織構造及び気管支の洗浄液流体、並びに、ツベルクリン反応及びヒーフ試験などのツベルクリン皮膚試験（別名、精製ツベルクリンタンパク質スタンダード（Purified Protein Derivative Standard）すなわちＰＰＤ皮膚試験）の組合せにより実施される。かかる試験は、患者の血液内に結核菌の抗体が存在しているかを明らかにする、結核菌タンパク質に対する免疫反応に基づいて行われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらテストは、患者に対し免疫学的な課題となる投与と、それに次ぐテスト結果を判定する追跡実験を必要とするものである。これらのステップが、試験を集団検診操作に適用することを困難としている。
【０００５】
従って、この発明は、これらの問題のいくつかに解決策を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
広義の第一の実施態様において、この発明は、ＮＳＰＡＸを含み、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である１８個未満のアミノ酸のペプチドであって、かかるペプチドは、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）のペプチドから作成された抗体に結合し得るペプチドである。特に好ましい実施形態において、かかるペプチドは、そのような抗体に結合する。
【０００７】
実際的な言い方をするならば、そのような抗体は、Ｃ末端にＣアミノ酸を付加したペプチド（配列ＩＤ１１）、すなわちＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶＣから作成される。
【０００８】
したがって、第二の実施態様において、かかるペプチドは、ＮＳＰＡＸ配列のＣ末端及び／又はＮ末端に、付加的なアミノ酸を６個まで含むものである。
【０００９】
そのことから、かかるペプチドは、ＮＮＳＰＡＸ配列を含むことが好ましく、より好ましくは、ＮＮＳＰＡＶ配列（配列ＩＤ１４）を含む。
【００１０】
更に好ましい実施態様では、ペプチドは、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）であるＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）を含む。
【００１１】
この発明の全て実施態様において、ペプチドが、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）でないことが好ましい。
【００１２】
また、この発明の全て実施態様において、ペプチドはＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）からなり、Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）であることが好ましい。
【００１３】
更に、この発明に従う全てのペプチドにおいて、Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）又はアラニン（配列ＩＤ１５）であることが好ましい。更にまた、ペプチドのＸは、メチオニン（配列ＩＤ１８）又はアラニン（配列ＩＤ１５）であることがより好ましい。これら特定の置換により、ロイシンが熱的安定性を付与するので、暑い国の現場での使用に適することとなり好ましい。
【００１４】
この発明に従う全ての実施態様において、ペプチドは、ラベルを含むことが特に好ましい。ラベルされたペプチドの使用は、結核菌を検出するためのアッセイの使用を促進するものである。適当なラベルは、（放射性種を付加したもの、すなわちペプチドにおける一つ以上の原子をその放射性同等物と置換したものなどの）放射性ラベルを含み、シンチレーション計数やそれに類似するものにより、ペプチド又はペプチドを含む複合体の存在又は濃度を即座に検出することを可能とするものである。酵素を介した発色性のラベル等のその他のラベルを使用することも可能である。特に好ましいラベルは、ペプチドの蛍光タンパク質への結合を含む、蛍光ラベルである。このとき、（アレクサフルーア６３３などの）アレクサフルーアを蛍光ラベルとすることが特に好ましい。
【００１５】
また、上述の全てのペプチドは、単離された形態、すなわち、実質的に（細菌、菌類又は哺乳類などの）ネイティブなものに由来するタンパク質を含まないものであることが好ましい。
【００１６】
上述のペプチドは、マイコバクテリウム（Mycobacterium）を検出するアッセイに適用することができる。
【００１７】
この発明の範囲には、上述のペプチドをコードする塩基配列が含まれる。かかる配列は、この発明のペプチドの生合成に適用される。
【００１８】
また、この発明の範囲には、配列ＩＤ１１のペプチドから作成された抗体が含まれる。この発明の抗体は、相補的な判定領域のみが例えばネズミ由来であり、軽鎖及び重鎖上のネズミの定常領域が、人間の配列に置換、すなわちＣＤＲグラフトされた抗体である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体とすることができる。また、この発明の抗体は、例えば、人間の抗体を生産し得る形質転換動物に免疫付与することにより準備した人間の抗体とすることもできる（例えば、国際公開第９３／１２２２７号パンフレットを参照）。
【００１９】
更に、この発明の範囲には、上述したペプチドを含む結核菌の存在を判定する置換ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）アッセイが含まれる。かかるアッセイを実行するための適当な手順を以下に記載する。そのような移動アッセイは、配列ＩＤ１１から作成された抗体、又は配列ＩＤ１１と親和性を有するような抗体の断片を含むことが好ましい。
【００２０】
更にまた、この発明の範囲は、結核菌の有無を判定する、配列ＩＤ１１から作成された抗体、又は配列ＩＤ１１と親和性を有するような抗体の断片を含むＥＬＩＺＡアッセイが含まれる。
【００２１】
加えて、この発明の範囲には、結核菌の有無を判定する、この発明に従うペプチド及び配列ＩＤ１１に従うペプチドを含んだ置換アッセイが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
試験は、配列がＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）として、１８個のペプチドｐ３（Ｐ７７９に記載の、アミノ酸１９〜３６）で示される、同定された結核菌Ａｇ８５Ｂ（非特許文献１）由来のＴ細胞エピトープに基づくものである。
【非特許文献１】Mustafa, A.S. et al, "Identification and HL Restriction of Nuturally Derived ThI -Cell Epitopes from the Secreted 1-Cell Epitopes from the Secreted Mycobacterium tuberculosis Antigen 85B Recognised by Antigen-Specific Human CD4+ T-CeIl Lines", Infection and Immunity, 68(7), 3933-3940, 2000
【００２３】
この発明の実施態様は、競合的な置換ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）アッセイ、実際上はリガンド置換アッセイを提供する。
【００２４】
結核菌に対する抗体、特にＡｇ８５Ｂのエピトープを対象とする抗体は、試験プレート上に結合している。抗体に結合し得るペプチドであって、結核菌の抗原よりも低い親和性を有するペプチドは、好ましくは蛍光マーカー等によりラベルされた抗体に結合する。（有機体などの）結核菌の抗原を含む試料が、抗体−ペプチド複合体と接触すると、抗原がペプチドを置換し、そのことは蛍光の変化により検出される。この発明のその他の実施態様では、以下に記載の、適当な合成ペプチドが提供される。
【００２５】
アナログライブラリーに代々使用し得るターゲットとなる抗原を同定するために、ｐ３の１８個のペプチド（すなわち、配列ＩＤ１１の、１〜９番目のアミノ酸、２〜１０番目のアミノ酸、３〜１１番目のアミノ酸など）をマッピングして、重複する１０種×９個のペプチドを合成した。
【００２６】
１文字で示す標準的なアミノ酸の符号を使用して、１０種×９個のペプチドの配列を以下に示す。
配列ＩＤ１：ＧＲＤＩＫＶＱＦＱ（１〜９番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−１に記載
配列ＩＤ２：ＲＤＩＫＶＱＦＱＳ（２〜１０番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−２に記載
配列ＩＤ３：ＤＩＫＶＱＦＱＳＧ（３〜１１番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−３に記載
配列ＩＤ４：ＩＫＶＱＦＱＳＧＧ（４〜１２番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−４に記載
配列ＩＤ５：ＫＶＱＦＱＳＧＧＮ（５〜１３番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−５に記載
配列ＩＤ６：ＶＱＦＱＳＧＧＮＮ（６〜１４番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−６に記載
配列ＩＤ７：ＱＦＱＳＧＧＮＮＳ（７〜１５番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−７に記載
配列ＩＤ８：ＦＱＳＧＧＮＮＳＰ（８〜１６番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−８に記載
配列ＩＤ９：ＱＳＧＧＮＮＳＰＡ（９〜１７番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−９に記載
配列ＩＤ１０：ＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（１０〜１８番目のアミノ酸）、Ｐ７８２−１０に記載
【００２７】
１８個のｐ３（配列ＩＤ１１）に沿ったこれらのペプチドは、１８個のｐ３（配列ＩＤ１１）に対する（ウサギ由来の）抗血清からスクリーニングされる。かかるスクリーニングは、９個〜１８個のペプチドの相対的な結合能の評価に用いられる、競合的なＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）技術を利用する。
【００２８】
簡単に説明すると、かかるアッセイは、ｐ３の１８個のペプチド（Ｐ７７９、配列ＩＤ１１）をＥＬＩＳＡプレートに結合させて（コーティングして）、次いで、様々な分量の競合的なリガント（９個のペプチド、配列ＩＤ１１）及び抗血清を（それらを１：２５０にて希釈して）培養することに関するものである。光血清のｐ３の１８個のペプチドに対する結合レベルは、ヤギの抗ウサギペルオキシダーゼ結合抗体による処理を施し、次いで、発色性基質であるＡＢＴＳ（2,2-アジゾ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリン スルホネート]、2,2-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]）及び過酸化水素を添加して、プレートリーダ上にて緑色の発色を光学濃度（吸光度）として記録することにより示される。発色は、プレートにおける主たる光血清に対する結合レベルに比例する。
【００２９】
試験ＥＬＩＳＡは、コートしているペプチドの濃度、及び、ＥＬＩＳＡ実験において、Ｐ７８２−１の９個のペプチド（ＧＲＤＩＫＶＱＦＱ）―配列ＩＤ１のＰ７７９の１８個のペプチド（ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＢＢＳＰＡＶ）―配列ＩＤ１１(Mustafa, A.S. et al, supra)に対する競合的ＥＬＩＳＡを含む、競合的なペプチドを確認するために実施される。この９個のペプチドは、ｐ２の１８個のペプチド（ＹＬＱＶＰＳＰＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱ）−配列ＩＤ１２と重複するよう選択されている。その結果から、発明者は、ＥＬＩＳＡ研究に適当なペプチドの濃度を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、２μＭ溶液のｐ３の１８個のペプチド（ｐ７７９）−配列ＩＤ１１によりコートし、その後、４倍まで段階希釈される５００μＭの競合的なペプチドの溶液が使用される。試験ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。
【００３０】
次いで、エピトープマッピングＥＬＩＳＡを実施して、１０種×９個（Ｐ７８２−１〜Ｐ７８２−１０）―配列ＩＤ１〜１０と、ｐ３の１８個のペプチド（Ｐ７７９）―配列ＩＤ１１との間の相対的な結合の親和性を判定した。選択されるペプチドの濃度範囲（競合曲線の線形部分）は、競合的なエピトープの相対的な結合の親和性の品質評価のために重要である。その結果、この濃度範囲では、Ｐ７８２−１〜Ｐ７８２−９の９個のペプチド（すなわち、配列ＩＤ１〜９）は、抗血清に充分量結合しなかったが、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド―配列ＩＤ１０は、ｐ３の１８個のペプチド（配列ＩＤ１１）と同様、抗血清に強く結合した。この結果は大変重要であり、Ｐ７８２−１０ペプチド、配列ＩＤ１０と８残基重複している、前述のＰ７８２−９の９個のペプチド（配列ＩＤ９）が、充分な結合を示さなかったことから、発明者はＣ末端のバリン残基が重要である可能性に気付いた。このエピトープマッピングＥＬＩＳＡの結果は、図２（ａ）及び２（ｂ）に示す。
【００３１】
ターゲットとなるエピトープＥＬＩＳＡは、抗血清に結合するエピトープのＣ末端領域の重要性を試験するよう設計された。対応する９個のペプチドから切り取った、Ｐ７８２−１１（ＧＮＮＳＰＡ）―配列ＩＤ１３及びＰ７８２−１２（ＮＮＳＰＡＶ）―配列ＩＤ１４の、６個のペプチドを２種類合成し、上述したようにそれらを競合的なＥＬＩＳＡに供し、エピトープマッピングＥＬＩＳＡにて重要なエピトープとして同定されているＰ７８２−１０の９個（配列ＩＤ１０）を再度試験した。ターゲットとされるエピトープＥＬＩＳＡの結果は図３に示す。データは明らかに再現性のある結果を示しており、以下のことを再度示している。
・Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（配列ＩＤ１０）は、Ｐ７７９のｐ３の１８個のペプチド（配列ＩＤ１１）と同様、抗血清に強く結合した。
・Ｐ７８２−１１の６個のペプチド（配列ＩＤ１３）は抗血清に結合しなかった。そして、
・Ｐ７８２−１２の６個のペプチド（ＮＮＳＰＡＶ）（配列ＩＤ１４）の抗血清への結合は、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（配列ＩＤ１０）又はＰ７７９の１８個のペプチド（配列ＩＤ１１）に比べ、２分の１倍（１／１．９９倍）強い。
【００３２】
この結果は、バリン残基を含むＣ末端領域の重要性を示している。この実験から、Ｎ末端領域を変更することは適当ではなく、異なる結合の親和性とするためには、Ｃ末端のバリン残基をターゲットとすることが適当であることがわかった。そのことから、この発明者らは、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（ＳＧＧＮＮＳＰＡＶ）、配列ＩＤ１０に基づくライブラリーに焦点を当て、Ｃ末端領域を変更し、Ｘが、その他の疎水性の荷電アミノ酸であり、多様なアミノ酸である、ＳＧＧＮＮＳＰＡ＋Ｘ配列を有するペプチドを合成した。
【００３３】
ライブラリーＥＬＩＳＡのために、発明者らは以下のペプチドを合成した。
配列ＩＤ１５：ＳＧＧＮＮＳＰＡＡ、Ｐ７８３−１に記載
配列ＩＤ１６：ＳＧＧＮＮＳＰＡＦ、Ｐ７８３−２に記載
配列ＩＤ１７：ＳＧＧＮＮＳＰＡＬ、Ｐ７８３−３に記載
配列ＩＤ１８：ＳＧＧＮＮＳＰＡＭ、Ｐ７８３−４に記載
配列ＩＤ１９：ＳＧＧＮＮＳＰＡＹ、Ｐ７８３−５に記載
配列ＩＤ２０：ＳＧＧＮＮＳＰＡＧ、Ｐ７８３−６に記載
配列ＩＤ２１：ＳＧＧＮＮＳＰＡＳ、Ｐ７８３−７に記載
配列ＩＤ２２：ＳＧＧＮＮＳＰＡＰ、Ｐ７８３−８に記載
配列ＩＤ２３：ＳＧＧＮＮＳＰＡＮ、Ｐ７８３−９に記載
配列ＩＤ２４：ＳＧＧＮＮＳＰＡＥ、Ｐ７８３−１０に記載
配列ＩＤ２５：ＳＧＧＮＮＳＰＡＲ、Ｐ７８３−１１に記載
【００３４】
発明者らは、単一のアッセイにて競合的なペプチドの相対的な結合の親和性を評価できなくならないよう、競合的なペプチドの濃度を前述の実験にて利用可能な範囲に制限した。ライブラリーの競合的なＥＬＩＳＡの結果（図４に示している）は、Ｐ７８２−１０の９個のペプチド（ＳＧＧＮＮＳＰＡＶ）、配列ＩＤ１０に対する結合の親和性の範囲を示している。エピトープにおいて特に重要なのは、特には１２５μＭ及び３１．３μＭのエピトープ濃度にあるアラニン、ロイシン及びメチオニンのバリアント（配列ＩＤ１５、１６及び１８）である。これらのうち、熱安定性が増大する観点から、アラニン及びメチオニンのバリアントが特に好ましく、それらは特に暑い国の現場にて有用なものとなる。
【００３５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
この発明に従うＥＬＩＳＡアッセイを実施するに適当な方法を以下に説明する。
【００３６】
結核菌の存在を判定するために、患者からの試料を配列ＩＤ１１から作成された抗体と接触させ、試料内のペプチドと抗体とで形成された複合体の有無を検出し、標準のコントロールに対する当該試料内にて形成された複合体の分量を検出し、このとき、コントロールに対する試料内の複合体の分量が増大していると、結核菌が存在することを示している。ＥＬＩＳＡアッセイを実施する一般的な方法は、当業者には公知である。患者からの試料は、血液、唾液、精液及び母乳などの体液、又は、例えば、ホモゲナイズによって適当に準備された生検材料などの組織サンプル等の形態で提供され得る。このとき、呼吸器官由来の試料が好ましい。特に好ましいのは、唾液或いは気管支又は肺の洗浄により得られる液体である。このとき、最も好ましいのは、患者の呼吸から伴出された物質の噴霧及び収集による患者の咳反射を含めることにより得られた試料であり、これらの試料は、気管由来の物質を含む。
【００３７】
置換ＥＬＩＳＡアッセイ
この発明に従う置換ＥＬＩＳＡアッセイを実施するに適当な方法を以下に説明する。
【００３８】
結核菌の存在を判定するために、ここに説明し、請求項に記載の所定のペプチドを含む組成物、及び患者からの試料を提供する。かかる組成物は、配列ＩＤ１１から作成された抗体と接触して、試料内のペプチドと抗体とで形成された複合体の有無を検出し、標準のコントロールに対する当該試料内にて形成された複合体の分量を検出し、このとき、コントロールに対する試料内の複合体の分量が増大していると結核菌が存在することを示している。
【００３９】
置換ＥＬＩＳＡアッセイを実施する一般的な方法は、当業者には公知である。また、患者からの試料は、血液、唾液、精液及び母乳などの体液、又は、例えば、ホモゲナイズによって適当に準備された生検材料などの組織サンプル等の形態で提供され得る。このとき、呼吸器官由来の試料が好ましい。特に好ましいのは、唾液或いは気管支又は肺の洗浄により得られる液体である。なお、最も好ましいのは、患者の呼吸から伴出された物質の噴霧及び収集による患者の咳反射を含めることにより得られた試料であり、これらの試料は、気管由来の物質を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】試験ＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図２ａ】（ａ）は、エピトープマッピングＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図２ｂ】（ｂ）は、エピトープマッピングＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図３】ターゲットされたエピトープＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【図４】ライブラリーの競合的なＥＬＩＳＡの結果を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＳＰＡＸを含み、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である１８個未満のアミノ酸のペプチドにおいて、
該ペプチドは、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）ペプチドから作成された抗体に結合し得ることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記ＮＳＰＡＸ配列のＣ末端及び／又はＮ末端に、付加的なアミノ酸を６個まで含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、ＮＮＳＰＡＸ配列を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＮＮＳＰＡＶ配列（配列ＩＤ１４）を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）を含み、Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）ではない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、ＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）からなり、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）又はアラニン（配列ＩＤ１５）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記Ｘは、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）又はアラニン（配列ＩＤ１５）である、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドは、ラベルを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドをコードしていることを特徴とする塩基配列。
【請求項１３】
配列ＩＤ１１と親和性を有する、配列ＩＤ１１から作成された抗体又はその断片であることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む結核菌の存在を判定することを特徴とする置換ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載の抗体を含む、請求項１２に記載の置換ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１６】
請求項１３に記載の抗体を含む結核菌の存在を検出することを特徴とするＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１７】
請求項１６に従う結核菌の有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）配列ＩＤ１１から作成された抗体と患者からの試料とを接触させるステップと、
（ｉｉ）試料内のペプチドと前記抗体間で形成された複合体の有無を検出するステップと、
（ｉｉｉ）前記試料内にて形成された複合体の分量を正常コントロールと比較して、該コントロールに対する試料内の複合体の分量が増加している場合に結核菌が存在していることを示すステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記患者からの試料は、肺由来の試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は酵素によりラベルされている、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のペプチド及び配列ＩＤ１１に従うペプチドを含むことを特徴とする結核菌の存在を判定する置換ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項２１】
結核菌の有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド及び患者からの試料を含む組成物を提供するステップと、
（ｉｉ）前記組成物と配列ＩＤ１１から作成された抗体とを接触させるステップと、
（ｉｉ）試料内のペプチドと前記抗体間で形成された複合体の有無を検出するステップと、
（ｉｉｉ）前記試料内にて形成された複合体の分量を通常のコントロールと比較し、該コントロールに対する試料内の複合体の分量が減少していると結核菌が存在することを示すステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記患者からの試料は、気管由来の試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
ＮＳＰＡＸを含み、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である１８個未満のアミノ酸のペプチドにおいて、
該ペプチドは、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）ペプチドから作成された抗体に結合し得ることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記ＮＳＰＡＸ配列のＣ末端及び／又はＮ末端に、付加的なアミノ酸を６個まで含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、ＮＮＳＰＡＸ配列を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＮＮＳＰＡＶ配列（配列ＩＤ１４）を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）を含み、Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ（配列ＩＤ１１）ではない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、ＳＧＧＮＮＳＰＡＸ（配列ＩＤ２６）からなり、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）、アラニン（配列ＩＤ１５）又はバリン（配列ＩＤ１０）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記Ｘは、メチオニン（配列ＩＤ１８）、ロイシン（配列ＩＤ１７）又はアラニン（配列ＩＤ１５）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記Ｘは、Ｘが、メチオニン（配列ＩＤ１８）又はアラニン（配列ＩＤ１５）である、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドは、ラベルを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドをコードしていることを特徴とする塩基配列。
【請求項１３】
配列ＩＤ１１と親和性を有する、配列ＩＤ１１から作成された抗体又はその断片であることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む結核菌の存在を判定することを特徴とする置換ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載の抗体を含む、請求項１２に記載の置換ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１６】
請求項１３に記載の抗体を含む結核菌の存在を検出することを特徴とするＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項１７】
請求項１６に従う結核菌の有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）配列ＩＤ１１から作成された抗体と患者からの試料とを接触させるステップと、
（ｉｉ）試料内のペプチドと前記抗体間で形成された複合体の有無を検出するステップと、
（ｉｉｉ）前記試料内にて形成された複合体の分量を正常コントロールと比較して、該コントロールに対する試料内の複合体の分量が増加している場合に結核菌が存在していることを示すステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記患者からの試料は、肺由来の試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は酵素によりラベルされている、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のペプチド及び配列ＩＤ１１に従うペプチドを含むことを特徴とする結核菌の存在を判定する置換ＥＬＩＳＡアッセイ。
【請求項２１】
結核菌の有無を判定する方法であって、該方法は、
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド及び患者からの試料を含む組成物を提供するステップと、
（ｉｉ）前記組成物と配列ＩＤ１１から作成された抗体とを接触させるステップと、
（ｉｉ）試料内のペプチドと前記抗体間で形成された複合体の有無を検出するステップと、
（ｉｉｉ）前記試料内にて形成された複合体の分量を通常のコントロールと比較し、該コントロールに対する試料内の複合体の分量が減少していると結核菌が存在することを示すステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記患者からの試料は、気管由来の試料である、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５２０７９８（Ｐ２００９−５２０７９８Ａ）
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４６６３８（Ｐ２００８−５４６６３８）
【出願日】平成１８年１２月２２日（２００６．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７２０６３
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０８１８７２５２）ラピッド バイオセンサー システムズ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２２日（２００６．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７２０６３
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０８１８７２５２）ラピッド バイオセンサー システムズ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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