バイオセンサとこれを用いた分析方法
【課題】短時間で正確な検出が可能なバイオセンサを提供することである。
【解決手段】ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、対極と、該ターゲット物質を含む試料液を溜める反応部と、を備えており、該作用極および該対極は、該反応部の底面に配置されており、該反応部の底面において該作用極が占める割合が０．７以上であることを特徴とするバイオセンサである。
【解決手段】ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、対極と、該ターゲット物質を含む試料液を溜める反応部と、を備えており、該作用極および該対極は、該反応部の底面に配置されており、該反応部の底面において該作用極が占める割合が０．７以上であることを特徴とするバイオセンサである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体、環境、医療、食品などの分析に用いるのに好適なバイオセンサとこれを用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中の電気化学反応を利用した電気化学測定法は、生体、環境、医療、食品などの分析においてよく用いられている。たとえば、生体試料中の物質（糖、中性脂肪など）の測定には、酵素電極を用いた電気化学測定法がある。
【０００３】
また、生体試料中の微量物質（タンパク質、ホルモンなど）の分析には、電気化学検出型の免疫分析法がよく用いられている。これらの分析に用いられる電気化学測定用電極は、基板上に導電性材料である所定の電極（作用極、対極、参照極等）が形成された構成になっており、電極上に反応物質（酵素、抗体、ペプチドなど）が固定されている。電極上や電極近傍において、ＥＬＩＳＡ反応または酵素基質反応を用いて電気化学的にターゲット物質を検出する。
【０００４】
上記測定法を用いた発明については、下記の特許文献に記載されている。
【０００５】
特許文献１には、絶縁性基板上に形成された作用極（測定極）と対極と、これらの電極系に接触している酵素などとを含む反応層を備えたバイオセンサが記載されている。
【０００６】
特許文献２には、絶縁性基板上に形成された作用極と対極と、これらの電極系の上部または近傍に酵素などを含むポリマー層と、さらにその上部に、中性脂肪分解酵素が担持された濾紙層とを備えたバイオセンサが記載されている。
【０００７】
特許文献３には、絶縁性基板上に、導電性材料をパターニングすることにより、作用極、対極および参照極を形成した平板型の電極が記載されており、この平板型電極内に形成されている作用極上に酵素を固定化した電気化学検出センサーが例示されている。
【０００８】
特許文献４には、絶縁性基板上にある金属電極に抗体が共有結合により固定化されたイムノアッセイ用の電気化学センサーが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−１７４４３２号公報（２００１年６月２９日公開）
【特許文献２】特開２００９−１３９１１４号公報（２００９年６月２５日公開）
【特許文献３】特開２００７−２７８９８１号公報（２００７年１０月２５日公開）
【特許文献４】特開２００９−２４４０１３号公報（２００９年１０月２２日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
より正確な検出が可能なバイオセンサを提供することは望ましい。特に、短時間でも正確な検出が可能なバイオセンサを提供することはより望ましい。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、短時間で正確な検出が可能なバイオセンサ、およびこれを用いた分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討の結果、シミュレーションにより、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が、分析の精度に影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
シミュレーションにより、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が大きくなるほど、理論から求める初速度と真の初速度との値の差が小さくなることが判明した。また上記作用極の面積の比が、０．７以上になった場合には理論から求める初速度と真の初速度がほぼ等しくなることもシミュレーションの結果から判明した。なお、シミュレーションの詳細については後述する。
【００１４】
本発明に係るバイオセンサは、ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、対極と、該ターゲット物質を含む試料液を溜める反応部と、を備えており、該作用極および該対極は、該反応部の底面に配置されており、該反応部の底面において該作用極が占める割合が０．７以上であることを特徴としている。
【００１５】
上記の構成により、生成物を生成する反応の反応初期において、ある時間の生成物量と原点を結ぶ直線の傾きから求めた反応の初速度と真の初速度との差異を、従来技術に係るバイオセンサに比べて小さくすることが出来るので、反応が飽和するのを待つことなく、短時間の反応時間であってもより正確な検出を実現することができる。
【００１６】
これを詳細に説明すれば、まず、従来技術に係るバイオセンサ（特許文献１〜４）は、基板内において試料液および測定液の触れる領域に対して、作用極（測定極）の占める割合は小さい。これは作用極において発生した電流を流すための電極である対極は、通常、電流が流れにくくなるのを防ぐために、作用極と同程度の若しくは作用極以上の面積比率となるように形成されるからである。そのため、従来技術に係るバイオセンサにおいては、液の触れる面積に対して、作用極の占める割合を０．５以下としている。
【００１７】
ここで、通常、作用極上で生成した生成物は、拡散によって作用極上から徐々に移動する。そして、電気化学検出は、作用極近傍の生成物しか検出することができない。それゆえ、従来技術に係るバイオセンサのように、反応部の底面積に対する作用極の面積比が０．５であると、すなわち作用極以外の領域が多いということなので、拡散によって検出範囲外へ移動する生成物量も多くなる。それゆえに、反応初期で反応時間と生成物量（作用極上の生成物量）との間の線形性の程度が小さい。
【００１８】
これに対し、上記のように作用極の面積比を反応部の底面積に対して０．７以上と大きくしたバイオセンサでは、作用極以外の領域が少ないので、検出範囲外へ移動する生成物量も少なくなる。そのため、生成物の拡散が無視できるような状況を擬似的に作り出すことができ、反応初期でも反応時間と生成物量（作用極上の生成物量）との関係がより線形性の程度が大きくなる、つまり、直線に近くなると考えられる。これにより、上記の構成によれば、生成物を生成する反応の反応初期において、ある時間の生成物量と原点を結ぶ直線の傾きから求めた反応の初速度と真の初速度との差異を小さくして、短時間の反応時間であってもより正確な検出を実現することができる。
【００１９】
本発明に係るバイオセンサでは、上記作用極を複数備えていることが好ましい。
【００２０】
上記の構成により、個々の作用極の面積が小さくなるので、微小電極の効果により、電流値が大きくなり、高感度な測定が可能である。
【００２１】
本発明に係るバイオセンサでは、さらに参照極を備えていることが好ましい。
【００２２】
上記の構成により、作用極に所望の安定した電位を印加することができる。
【００２３】
本発明に係るバイオセンサでは、疎水性を有する疎水性部分を備えており、該疎水性部分が上記反応部を囲むように配置されていることが好ましい。
【００２４】
上記の構成により、疎水性部分によって、上記反応部を囲むことによって、上記反応部からの液の広がりを抑えることができる。これにより、例えば、液滴による測定が可能となる。
【００２５】
本発明に係るバイオセンサでは、上記反応部を囲む壁面を備えていることが好ましい。
【００２６】
上記の構成により、検出電極の周囲を囲む壁面によって液の広がりが抑えられる。これにより、微量の試料液を用いた場合も首尾よく測定することができる。
【００２７】
本発明に係るバイオセンサでは、上記反応部を格納する反応チャンバを備えており、該反応チャンバは、該反応チャンバ内に上記試料液を注入するための注入口と、上記反応チャンバ内の上記試料液を排出するための排出口とを備えていることが好ましい。
【００２８】
上記の構成により、反応チャンバにより反応部を格納することができ、試料液の微量化、測定時間の短縮化、分析操作の簡便化が可能となり、短時間で正確かつ効率的な測定を実現することができる。
【００２９】
本発明に係るバイオセンサでは、上記作用極の中心が、上記反応部の底面の中央部にあることが好ましい。
【００３０】
上記の構成により、反応部のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極を中心としておおよそ均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となる。なお中央部は、反応部の中心を基準に反応部全体に対して三分の一程度の領域を指す。
【００３１】
本発明に係るバイオセンサでは、上記作用極の底面の形状が、上記反応部の底面の形状と相似形であることが好ましい。
【００３２】
上記の構成により、反応部のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極を中心として均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となる。
【００３３】
本発明に係るバイオセンサでは、上記反応物質は、ターゲット物質と特異的に反応するものであることが好ましい。また、上記反応物質が、上記ターゲット物質の反応を触媒する酵素であることがより好ましい。
【００３４】
上記の構成により、酵素に反応する基質をターゲット物質として検出することができる。
【００３５】
本発明に係るバイオセンサでは、上記結合物質は、ターゲット物質と特異的に結合するものであることが好ましい。また、上記結合物質が、上記ターゲット物質に対する抗体、または、上記ターゲット物質に特異的に結合するペプチドがより好ましい。
【００３６】
上記の構成により、ターゲット物質と反応する第二の結合物質をさらに反応させることで、イムノアッセイが可能となる。第二の結合物質とは、ターゲット物質と結合し、基質と反応して、生成物を生成する物質のことである。たとえば、酵素標識抗体などが該当する。
【００３７】
本発明に係る分析方法は、上記バイオセンサを用いた分析方法であって、ターゲット物質を含む試料液を、上記反応部に導入する導入工程、および上記作用極と上記対極との間に電圧を印加することで、反応または結合した上記ターゲット物質に応じた電流を得る工程とを含むことを特徴とする。
【００３８】
上記の構成により、導入工程にて、ターゲット物質を含む試料液を上記反応部へ導入することにより、作用極上に固定した反応物質とターゲット物質とが反応、または作用極上に固定した結合物質とターゲット物質とが結合する。そして、作用極と対極の間に電圧を印加することによって、反応または結合したターゲット物質に応じた電流値を得ることができる。このとき、生成物を生成する反応の反応初期において、反応時間と生成物の生成量の間の線形性の程度が大きい（より直線に近くなる）ので、ある短時間の反応時間における電流値と原点とを結ぶ直線の傾きから求めた初速度が、真の初速度とほぼ等しい値となる。よって、短時間の反応時間でも正確な分析が可能となる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明に係るバイオセンサは、ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、対極と、該ターゲット物質を含む試料液が導入される反応部と、を備えており、該ターゲット物質が、該反応物質と反応し、または、該結合物質と結合することにより生成される液が触れる領域である反応部を有し、該反応部の底面積に対する該作用極の面積の比が０．７以上であるため、反応が飽和するのを待つことなく、短時間で正確な検出を実現できるという効果を有する。
【００４０】
本発明の分析方法は、上記バイオセンサを用いた分析方法であって、ターゲット物質を含む試料液を、上記反応部に導入する導入工程と、上記反応物質と上記ターゲット物質との反応によって生成物が生成する工程または上記結合物質が上記ターゲット物質と結合する工程と、作用極に電圧を印加することで、反応または結合したターゲット物質に応じた電流値を得る工程とを含んでいるので、反応が飽和するのを待つことなく、短時間で、正確な分析を行うことができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】第１実施形態に係るバイオセンサ１００の概略構成を示す上面図である。
【図２】第２実施形態に係るバイオセンサ２００の概略構成を示す上面図である。
【図３】第３実施形態に係るバイオセンサ３００の概略構成を示す上面図である。
【図４】第４実施形態に係るバイオセンサ４００の概略構成を示す上面図である。
【図５】第５実施形態に係るバイオセンサ５００の概略構成を示す上面図である。
【図６】第５実施形態の変形体であるバイオセンサ５００´の概略構成を示す上面図である。
【図７】第６実施形態に係るバイオセンサ６００の概略構成を示す上面図である。
【図８】第６実施形態に係るバイオセンサ６００の概略構成を示す斜視図である。
【図９】第７実施形態に係るバイオセンサ７００の概略構成を示す上面図および断面図である。
【図１０】第７実施形態に係るバイオセンサ７００の概略構成を示す斜視図である。
【図１１】実施例に係るバイオセンサの概略構成を示す上面図である。
【図１２】一般的な酵素基質反応において、時間に対しての生成物量を表す図である。
【図１３】従来のバイオセンサにおける、作用極上の生成物と時間との関係図である。
【図１４】本発明のバイオセンサにおける、作用極上の生成物と時間との関係図である。
【図１５】作用極上の生成物量と時間との関係を示す曲線において、反応初期の一次近似直線の相関係数Ｒの二乗値を、作用極の面積比に対してプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
図１２は、ＥＬＩＳＡ法または酵素法によって起こる酵素基質反応における時間に対しての生成物量を表すグラフである。ＥＬＩＳＡ法または酵素法によって起こる酵素基質反応は、通常、反応初期では時間と反応総量との間に線形性がある。その直線の傾きは、酵素基質反応の初速度であり、反応初期の区間を初期速度区間という。
【００４３】
酵素が基質に対して過剰に存在する場合、初速度は基質濃度に比例する。ターゲット物質が基質の場合（たとえば、グルコースをターゲット物質とするグルコースセンサーなど）、初速度と基質濃度が比例する現象を利用し、初速度を求めることによって、基質濃度、つまりターゲット濃度を求めることができる。
【００４４】
また、基質が酵素に対して過剰に存在する場合、初速度は酵素濃度に比例する。ターゲット物質と結合する物質（例えば抗体など）を用いてターゲット物質を検出する場合（抗体を用いる場合はイムノアッセイ）、初速度と酵素濃度とが比例する現象を利用して、初速度を求めることで、酵素濃度を求めることができる。酵素濃度は、ターゲット物質に結合している酵素標識抗体濃度であり、すなわち、結合しているターゲット物質濃度として求められる。
【００４５】
このように、酵素基質反応の初速度は、測定系の、基質濃度および酵素濃度を求めるのに、非常に重要な因子である。
【００４６】
特に、上記のようなバイオセンサにおいて、免疫反応および酵素基質反応等の検出を電気化学的に行う場合は、検出された電流値（電流値は生成物量に比例する）と時間との関係において、反応初期において線形性を持たせることが必要である。しかし、電気化学的な手法では、生成物の全量ではなく、作用極上の限られた範囲に存在する生成物しか検出することが出来ないため、必ずしも線形性を持たせて反応させることが容易ではない。これは、拡散による物質移動によって、作用極上で生成した生成物が、その範囲外へと移動してしまうので、電気化学的な手法では生成物の総量を測定することができないためである。
【００４７】
ここで、検出電流値は生成物量に比例するため、この後は検出電流値を生成物量として説明する。
【００４８】
生成物量と時間との間に線形性がある場合、その初速度は、ある反応時間における生成物量を、反応時間で割った数値、すなわち、原点との２点を結ぶ直線の傾きとして求めることができる。しかし、上記のような一般的な（従来の）バイオセンサおよび電気検出センサーの場合、生成物量と時間との間の線形性の程度が小さいために、同様にして求めた直線の傾きは、真の初速度とはずれがある。したがって、近似直線から得た初速度を基に算出した生成物量は、真の生成物量との誤差が大きくなってしまう。したがって、正確な検出を行うためには、反応が飽和し、安定するまで反応させてから電気化学測定を行う必要がある。つまり、正確な検出を行うためには、検出に時間を要し、また、短時間で検出を行うと、正確な検出を行うことができない。
【００４９】
図１４は、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が０．５のバイオセンサ（従来のもの）において、時間と作用極上の検出可能な範囲における生成物量との関係を示した結果である。また、図１３は、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が０．７のバイオセンサ（本発明のもの）において、時間と作用極上の検出可能な範囲における生成物量との関係を示した結果である。図１３も図１４も反応初期である数１０秒程度までの結果を示した。
【００５０】
ここで、線形性の程度を一次近似直線の相関関数Ｒの二乗値のＲ２値によって評価する。Ｒ２値が１に近づくほど、時間と生成物量との間の線形性の程度が大きくなるということになる。従来型のバイオセンサでは、図１３のグラフの０〜１０秒における近似直線のＲ２値は、０．９９２８であった。一方、本発明のバイオセンサでは、図１４のグラフの０〜１０秒における近似直線のＲ２値は、０．９９９０であった。したがって、面積比０．５の電気化学検出用バイオセンサでは、時間と生成物量との間の線形性の程度が小さく、ある時間における点と原点とを結ぶ直線の傾きから求めた初速度と、真の初速度とにずれがある。一方、面積比率０．７のバイオセンサでは、時間と生成物量との間の線形性の程度が大きく、より直線に近くなる。
【００５１】
さらに、図１５は、反応初期（０〜１０秒）の一次近似直線の相関係数Ｒの二乗値Ｒ２を、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対する作用極の面積比ごとにプロットしたグラフである。図１５より、作用極の面積比が大きくなるほど、Ｒ２値が１に近づいており、作用極の面積比が０．７以上１未満では、Ｒ２値が０．９９９以上、つまりほぼ１となる。逆に、面積比が０．７より小さくなるにつれＲ２値は急激に小さくなり、面積比０．１ではＲ２値は０．９６まで悪くなる。したがって、作用極の面積比が０．７以上のバイオセンサは、短時間の反応時間で検出を行ったときに、その直線の傾きから求めた速度と、真の初速度との誤差が小さく、ほぼ等しい値となると言える。つまり、作用極の面積比を大きくすることによって短時間の反応時間でも、ターゲット物質の濃度をより正確に検出することが可能となる。
【００５２】
〔第１実施形態〕
図１は、本発明の一実施形態（第１実施形態）に係るバイオセンサ１００の概略構成を示す上面図である。図１に示すように、バイオセンサ１００は、作用極１、対極２、絶縁膜４、接続パットＡ１およびＡ２、リード電極部Ｂ１およびＢ２、反応部５、ならびに、基板２０を備えている。
【００５３】
図１に示すように、バイオセンサ１００では、基板２０上の一方の端部に接続パットＡ１およびＡ２が形成され、反対側に、並列して作用極１および対極２が形成されている構造になっている。作用極１と接続パッドＡ１とを接続するようにリード電極部Ｂ１が形成され、対極２とＡ２とを接続するようにリード電極部Ｂ２が形成されている。さらに、リード電極部Ｂ１およびＢ２が試料液と接触しないように、リード電極部Ｂ１およびＢ２を覆うための絶縁膜４が形成された構造になっている。詳しい構造については下記にて記載する。
【００５４】
作用極１は、試料液中にて生成した電気化学的活性物質である生成物を電気化学反応（酸化または還元）により検出する電極である。作用極１の材料としては、例えば、金属、カーボン、グラファイトなどの導電性材料が用いられる。
【００５５】
対極２は、作用極１にて生じた電流を流すための電極である。対極２の材料としては、作用極１と同様の導電性材料を用いることができる。また、作用極１と異なる導電性材料を用いてもよい。
【００５６】
絶縁膜４は、リード電極部Ｂ１およびＢ２と、試料液が接触しないために形成されている絶縁性を有する膜である。絶縁膜４の材料としては、例えば、ポリイミドなどの絶縁性材料を用いることができる。
【００５７】
接続パットＡ１およびＡ２は、電気化学検出用バイオセンサを電気化学測定装置（例えばポテンショスタット等）に接続するときに用いられ、作用極１と対極２と電気化学測定装置とを接続するために設けられている。接続パッドＡ１およびＡ２の材料としては、作用極１または対極２と同様の導電性材料を用いることができる。また、作用極１または対極２と異なる導電性材料を用いてもよい。
【００５８】
リード電極部Ｂ１およびＢ２は、作用極１と対極２とを、それぞれ接続パッドＡ１およびＡ２とつなぐために形成されている。リード電極部Ｂ１およびＢ２の大きさ（寸法）についても、任意の大きさを設定することができる。リード電極部Ｂ１およびＢ２の材料としては、作用極１および対極２と同様の材料を用いることができる。
【００５９】
基板２０は、電子部品等を表面に固定し、何らかの機能を実現するための板状またはフィルム上の部品をいう。例えば、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックなどの絶縁性材料が用いられる。
【００６０】
反応部５は、電気化学測定の際に、試料液を溜める（試料液が触れる）領域のことをいい、作用極１および対極２を含む電極系を含むように形成される。反応部５では、作用極１上に固定化された反応物質または結合物質とターゲット物質が直接または段階的に反応して、電気化学活性のある生成物を生成する反応が生じる。バイオセンサ１００は、上記電極系（作用極１および対極２）を用いて、反応部５における上記反応を電気化学的に検出する。なお、反応物質および結合物質については後述する。
【００６１】
バイオセンサ１００は、例えば、以下のように製造することができる。まず、基板２０上にパターニングすることにより、作用極１、対極２、接続パットＡ１およびＡ２ならびにリード電極部Ｂ１およびＢ２をそれぞれ形成する。基板２０の表面に作用極１を形成する方法としては、例えば、スパッタ法、蒸着法または印刷法等を用いることができる。対極２、接続パットＡ１およびＡ２、ならびに、リード電極部Ｂ１およびＢ２を形成させる場合についても、作用極１と同様の方法を用いることができる。また、バイオセンサ１００を大量生産する場合には、バイオセンサ１００が備える部材を複数パターニングした基板を分割してもよい。
【００６２】
つぎに、絶縁膜４を、リード電極部Ｂ１およびＢ２を完全に覆うようにして形成させる。これは、リード電極部Ｂ１およびＢ２と試料液とが接触してバイオセンサ１００が誤動作することを防止することが目的である。これにより、試料液を反応部５にのみに接触させることができる。基板２０の表面に、リード電極部Ｂ１およびＢ２を覆うようにして絶縁膜４を形成する方法は、例えば、フォトリソグラフィー、スクリーン印刷などの方法を用いることができる。
【００６３】
絶縁膜４の形成により、試料液が接触する反応部５が規定される。絶縁膜４の大きさは、絶縁膜４によって規定される反応部５の大きさ（底面積）と、作用極１との面積比率が０．７以上となるように、絶縁膜４の大きさを調整して生成する。これにより、反応部５の大きさを、反応部５に対する作用極１の面積比率が０．７以上となるように設定することができる。
【００６４】
なお、本実施形態では、反応部５の外縁は絶縁膜４によって規定されているが、この方法に制限されるものではなく、後述するような様々な方法を用いて形成することができる。
【００６５】
対極２の大きさは、反応部５のうち、作用極が占める領域の残りの部分から、任意の大きさを選択できる。前述のように、対極２は作用極１から生じた電流を流すための電極であるので、対極２が作用極１に対して余りにも小さい場合、電流が流れにくくなり、正確な電気化学測定を行うことができなくなる。したがって、対極２は、作用極１から生じる電流を流すのに必要な大きさを選択することが望ましい。
【００６６】
接続パッドＡ１およびＡ２それぞれの位置は、電気化学測定装置との接続位置に応じて適宜設定可能であり、接続可能な位置であれば特に限定されない。また、接続パッドＡ１およびＡ２の大きさは、電気化学測定装置側の接続パッドと充分に接触する大きさであればよい。
【００６７】
作用極１上に、ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質またはターゲット物質と結合する結合物質を固定化させる。
【００６８】
反応物質は、ターゲット物質と直接反応して生成物を生成する。結合物質は、ターゲット物質と反応後、さらなる反応によって生成物を生成する。
【００６９】
反応物質あるいは結合物質は、検出したいターゲット物質によって酵素、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、レクチン、レセプター、糖など任意の生体材料を選択する。例えば、試料液中の糖を検出する場合には、グルコースオキシダーゼなどの酵素が選択される。
【００７０】
試料液中のターゲット物質がイムノアッセイにより検出される場合は、ターゲットの物質を特異的に結合する抗体もしくはペプチドなどが選択される。反応物質あるいは結合物質は、作用極１の全面に固定化されていることが好ましい。
【００７１】
上記固定化に関しては、作用極１の全面に隙間無く行う必要はなく、離散的に固定化されていてもよい。ただし、その固定化された面積は反応部の面積に対して０．７以上であることが好ましい。
【００７２】
反応物質あるいは結合物質を作用極１に固定化する方法としては、例えば、物理吸着、作用極１の表面に形成した官能基と反応物質との共有結合、または３次元網目構造を有する高分子材料によるタンパク質の取り込み（包括）等を利用した、公知の方法を採用することができる。離散的に固定化する場合、スポッターなどを用いてもよい。
【００７３】
なお、本実施形態に係るバイオセンサ１００は、基板２０上に、作用極１および対極２が集約して形成されているので、検出に必要な試料液の量を少なくすることができるという利点も有している。
【００７４】
なお、作用極１、対極２、絶縁膜４、接続パットＡ１およびＡ２、リード電極部Ｂ１およびＢ２、反応部５ならびに基板２０の形状は図１に示されたものである必要はなく、特に限定されるものではなく、矩形、円形、楕円形またはその他任意の形状とすることができる。
【００７５】
〔バイオセンサを用いた分析方法〕
この分析方法は、ターゲット物質を含む試料溶液を、上記反応部５に導入する導入工程と、上記反応物質と上記ターゲット物質との反応によって生成された電気化学活性物質を測定する測定工程からなる。
【００７６】
上記バイオセンサ１００の構成により、ターゲット物質を含む試料液を反応部５に導入すれば、作用極１上に固定した反応物質と反応し生成物を生成、または作用極１上に固定した結合物質と結合する。上記反応または結合をさせた後、電気化学測定を行うことにより、検出された電流値から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができる。
【００７７】
まず、電気化学検出用バイオセンサの接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３を、電気化学測定装置（例えばポテンショスタット）に接続する。接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３の接続方法としては、例えば両端にワニ口クリップが設けられたコードを用意し、一方のクリップにより接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３を挟み、他方のクリップによりポテンショスタットの端子を挟む方法が挙げられるが、この方法に制限されるものではない。
【００７８】
以下、バイオセンサ１００を用いた分析方法の一例として、試料液中の糖（グルコース）を測定する方法について説明するが、本実施形態はこれに限定されず、その他のターゲット物質の測定にも適用可能である。
【００７９】
試料液中の糖を測定する場合、バイオセンサ１００の作用極１には、反応物質として、酵素（グルコースオキシダーゼ）を固定化する。前記反応物質を作用極１に固定化する方法としては、上述のように、物理吸着、作用極１の表面に形成した官能基と反応物質との共有結合、または３次元網目構造を有する高分子材料によるタンパク質の取り込み（包括）等を利用した、公知の方法を採用することができる。また、作用極１における反応物質の固定化箇所は、特に限定されないが、作用極１の全面に固定ることが好ましい。
【００８０】
次に、グルコースを含む試料液を反応部５に導入する。具体的には、バイオセンサ１００の反応部５に試料液を滴下する。グルコースと作用極１に固定化された酵素とが反応して、生成物（過酸化水素）が生成する。作用極１と対極２との間にに電圧を印加することにより、グルコース量に応じた電流が得られ、その結果から試料液中のグルコースの濃度を測定することができる。
【００８１】
試料液には、電子移動を仲介するためのメディエーターを加えてもよい。メディエーターとしては、フェロシアン化カリウム／フェリシアン化カリウム、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシニウム／フェロセンなどの系を用いることができる。グルコースを測定する系の場合、酵素とグルコースとが反応し、メディエーターを介在した電子の移動にともなって生ずる電流をシグナルとして測定する。そうすることで、検出された電流値から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができる。
【００８２】
次に、バイオセンサ１００を用いた分析方法の他の例として、試料液中の微量物質をイムノアッセイにて測定する方法について説明する。
【００８３】
試料液中の微量物質をイムノアッセイにて測定する場合、バイオセンサ１００の作用極１には、結合物質としてターゲット物質を特異的に捕捉することのできる抗体またはペプチドを固定する（以下、抗体を固定した場合について説明するが、ペプチドを固定した場合も分析方法は同様である）。固定する方法としては、酵素を固定する場合と同様の方法を採用することができる。また、結合物質は、作用極１の全面に固定することが好ましい。また、試料液を滴下する前に、作用極１の表面をアルブミン水溶液により処理して、非特異吸着防止膜を形成した後、バッファー液を用いて洗浄しておいてもよい。これにより、作用極１の表面へのターゲット物質の非特異的な吸着を防ぐことができる。
【００８４】
ターゲット物質を含む試料液を反応部５に滴下することによって、抗原抗体反応が進行する。続いて、反応部５を、バッファー液を用いて洗浄した後、第二の結合物質である酵素標識抗体を含む液を滴下して反応させる。ここで、作用極１の表面には、抗体−ターゲット物質−酵素標識抗体のサンドイッチ複合体が形成される。続いて、反応部５を、バッファー液を用いて洗浄する。次いで、酵素に対する基質を含む試料液を反応部５に滴下する。作用極１の表面に形成されたサンドイッチ複合体の中において、酵素基質反応が進行し、電気化学活性のある生成物が生成する。作用極１に電圧を印加することによって、ターゲット物質量に応じた電流が得られる。その結果から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができる。
【００８５】
また、基質を含む試料液には、上述と同様に、電子移動を仲介するためのメディエーターを加えてもよい。
【００８６】
〔第２実施形態〕
図２は、本発明の一実施形態（第２実施形態）に係るバイオセンサ２００の概略構成を示す上面図である。
【００８７】
なお、説明の便宜上、前記第１実施形態にて説明した図面と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。またバイオセンサを用いた分析方法に関しても上述した方法と同様のため、その説明も省略する。
【００８８】
図２に示すように、バイオセンサ２００は、作用極１、対極２、参照極３、絶縁膜４、接続パットＡ１、Ａ２およびＡ３、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３、反応部５ならびに基板２０を備えている。
【００８９】
基板２０における一方の端部に、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３が形成されている。また、作用極１、対極２および参照極３が、基板２０上の、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３が形成されている側とは反対側に形成されている。また、作用極１と接続パッドＡ１とを、対極２と接続パッドＡ２とをおよび参照極３と接続パッドＡ３とを接続するように、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３がそれぞれ形成されている。さらに、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３が試料液と接触しないように、リード電極部を覆うように絶縁膜４が形成されている。それゆえに試料液は図２に示す反応部５にのみ接触するようになっている。
【００９０】
上記構造を有し、作用極１を反応部５に対して面積比率０．７以上で形成するという条件を満たしていれば、各部材の大きさおよび形状は限定されない。第２実施形態は、参照極３を含むという点が、第１実施形態とは異なる。
【００９１】
参照極３は、作用極１に所望の安定した電位を印加するための電極である。図２に示されるバイオセンサ２００では、参照極３は、作用極１の中に埋め込まれるようにして形成されている。参照極３の位置はこの位置に制限されるものではないが、参照極３は、溶液抵抗によりＩＲドロップが生じることを考慮すると、できる限り作用極１の近傍に配置されていることが望ましい。また参照極３の大きさ（寸法）は、特に限定されないが、作用極１を反応部５に対して面積比率０．７以上で形成するため、参照極３は小さいことが好ましい。
【００９２】
参照極３の材料は、導電性材料であり、かつ、電流が流れた際にも電位が安定している材料が望ましい。例えば、銀塩化銀電極はよく用いられる参照極の一つである。
【００９３】
基板２０の表面に参照極３を形成する方法としては、例えば、スパッタ法、蒸着法、印刷法等を用いることができる。
【００９４】
参照極３によって、作用極１に安定した電位を印加することができるので、より正確な検出が可能となるという特徴を有する。
【００９５】
また、作用極１の中心が、反応部５の底面の中央部にあることが望ましい。
【００９６】
上記の構成により、反応部５のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極５を中心としておおよそ均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となるからである。なお中央部は、反応部の中心を基準に反応部全体に対して三分の一程度の領域を指すものとし、作用極の中心が反応部の底面の中央部にあればいいので、図２の形状には限定されない。
【００９７】
さらに、作用極１の底面の形状が、反応部５の底面の形状と相似形であることが望ましい。
【００９８】
上記の構成により、反応部５のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極を中心として均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となるからである。作用極の底面の形状が、反応部の底面の形状と相似形であればいいので、図２の形状には限定されない。
【００９９】
〔第３実施形態〕
図３は、本発明の一実施形態（第３実施形態）に係るバイオセンサ３００の概略構成を示す上面図である。
【０１００】
図３に示されるバイオセンサ３００は、絶縁膜４の代替として、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３ならびに反応部５以外の部分を、疎水性膜（疎水性部分）６を用いて被覆させている点で図２のバイオセンサ２００と異なる。したがって、反応部５は、疎水性膜６によって規定される。それ以外の点においては、第２実施形態と同様である。
【０１０１】
疎水性膜６は、反応部５を規定し、それ以外の領域に試料液の液滴を広がらせないためのものである。バイオセンサ３００では、反応部５以外の部分を覆うように形成されている。
【０１０２】
疎水性膜６の材料は、その表面が疎水性を有し、かつ、絶縁性の材料が望ましい。疎水性膜６の形成方法は、例えば、疎水性ポリマーをコートしたり、オクタドデシルトリクロロシランのトルエン溶液によって化学修飾したりするなどの方法を採用することができる。
【０１０３】
疎水性膜６によって、反応部５が首尾よく規定されるので、最小限の液量により測定することが可能であるという効果を有する。
【０１０４】
〔第４実施形態〕
図４は、本発明の一実施形態（第４実施形態）に係るバイオセンサ４００の概略構成を示す上面図である。
【０１０５】
図４に示される電気化学検出用バイオセンサは、作用極１が複数個から成り、それぞれの作用極１において、接続パットＡ１と接続させるためにリード電極部Ｂ１が形成されている以外は、第３実施形態と同様である。
【０１０６】
複数の作用極の総面積は、反応部５の底面積の０．７以上を占めるように形成されている。
【０１０７】
作用極が複数になることより、個々の作用極の面積が小さくなるが、微小電極の効果により電流値が増幅され、高感度の検出が可能であるという効果を有する。
【０１０８】
〔第５実施形態〕
図５は、本発明の一実施形態（第５実施形態）に係るバイオセンサ５００の概略構成を示す上面図である。
【０１０９】
図５に示されるバイオセンサ５００は、作用極１の大きさが反応部５の大きさよりも大きいこと以外は、第３実施形態と同様である。疎水性膜６によって、反応部５内の作用極の有効面積が規定される。バイオセンサ５００では、作用極の有効面積が、反応部５の０．７以上となっている。
【０１１０】
図５に示されたバイオセンサ５００のように、作用極１の全部分が反応部５からはみ出して形成されていてもよいし、図６に示されたバイオセンサ５００´ように、作用極１の一部分が反応部５からはみ出して形成されてもよい。
【０１１１】
〔第６実施形態〕
図７は、本発明の一実施形態（第６実施形態）に係るバイオセンサ６００の概略構成を示す上面図である。図８は第６実施形態のバイオセンサ６００の概略構造を示す斜視図である。図８においては、作用極１等の詳細な構造は省略してある。
【０１１２】
バイオセンサ６００は、反応部５がその周囲を囲む壁面７によって規定されている点および疎水性膜６によって被覆されていない点以外は、第５実施形態と同様である。
【０１１３】
壁面７は、反応部６を規定し、それ以外の領域に試料液の液滴を広がらせないためのものである。バイオセンサ６００では、壁面７は、平面視において円形の反応部６を取り囲むように円周状に形成されている。しかしながら、この形状に制限されるものではなく、反応部６の形状に応じて任意に形成することができる。また壁面７は、液が広がっていかない高さがあればよい。壁面７の材料は、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックなどを用いることができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を材料として用いることによって、加工および量産が容易となる。
【０１１４】
壁面７を形成する方法は、例えば、機械的に加工する方法、エッチングなどの化学処理により形成する方法などが挙げられ、特に限定されない。また各部パターンを形成した型に光硬化性樹脂または熱硬化性樹脂を流し込んで固めて作成する方法もある。またポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸系樹脂、またはポリカーボネイト樹脂からなる材料を、各部パターンを形成した型を用いて、ホットエンボス法により形成してもよい。
【０１１５】
作成した壁面７を基板２０と貼り合わせることによって、反応部６が規定される。
【０１１６】
壁面７を導入することにより、反応部５以外に試料液が広がることを確実に抑制することができる。
【０１１７】
〔第７実施形態〕
図９は、本発明の一実施形態（第７実施形態）に係るバイオセンサ７００の概略構成を示す上面図およびＸ−Ｙ断面図である。図１０は第７実施形態のバイオセンサの概略構造を示す斜視図である。図１０においては、作用極１等の詳細構造は省略してある。
【０１１８】
反応チャンバ８は、反応部５を囲む壁面および天井部分からなっており、反応部５を空間として規定している。さらに反応チャンバ８には、液を入れるための導入部９および液を排出するための排出部１０が形成されている。
【０１１９】
バイオセンサ７００は、基板２０上に導入部９および排出部１０を有する反応チャンバ８が形成されている点ならびに絶縁膜４が被覆されていない点以外は、実施の形態２と同様である。
【０１２０】
反応チャンバ８は、円柱状の空間として形成されているが、この形状に制限されるものではなく、反応部６の形状に応じて任意に形成することが可能である。反応チャンバ８の材料は、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックなどを用いることができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を材料として用いることよって、加工および量産が容易となる。
【０１２１】
反応チャンバ８を形成する方法は、上記壁面７を形成する方法と同様のものを用いてもよく、特に限定されない。
【０１２２】
反応チャンバ８により、空間として反応部５を規定することによって、反応部５以外へ試薬液が広がることを確実に抑制することができる。
【０１２３】
反応チャンバ８は、反応部５を空間として規定するためのものである。
【０１２４】
導入部９は、反応部５へ試料液などを導入するためのものである。
【０１２５】
排出部１０は、反応部５に導入された試料液を排出するためのものである。また、導入時には、空気穴としての役割も果たすことができる。
【０１２６】
バイオセンサ７００では、導入部９および排出部１０は、反応部５から接続して開口した円形の穴として形成されているが、液を導入できる形状であれば他の形状でもよい。
【０１２７】
また液の排出は、導入部９から行ってもよく、この場合は、排出部１０は空気穴として使用する。
【０１２８】
以下、第７実施形態に示された電気化学検出用バイオセンサを用いた分析方法について説明する。この分析方法は、実施の形態１〜６に示された電気化学検出用バイオセンサを用いた分析方法とは、試料液またはバッファー液等を反応部５へ滴下していた部分が、導入部９から液を導入し、排出部１０から排出するという点で異なるが、後は同様である。
【０１２９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲において種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３０】
〔実施例１〕
図１１は実施例１に係るバイオセンサ８００の概略構成を示す上面図である。図１１を用いて実施例１を説明する。
【０１３１】
まず、１０ｃｍ×１０ｃｍ×厚さ０．５ｍｍのガラスウェハ（コーニング社製 ＥａｇｌｅＸＧ）に作用極１、対極２、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３を、フォトリソグラフィを用いて形成した。これらは全て金をスパッタすることによって形成した。作用極１は、直径２ｍｍの円形とし、対極２は作用極１を囲むような円弧状の形状に形成した。
【０１３２】
次に、同様にフォトリソグラフィを用いて、銀電極を形成した。そして極の一部を化学的に塩化銀に変化させ、銀および塩化銀からなる参照極３を形成した。
【０１３３】
ガラスウェハには図１１に示す電極基板（１ｃｍ×２ｃｍ）を複数枚形成し、ガラスカッターを用いて1枚1枚切断した。
【０１３４】
続いて、反応チャンバを作製するための型を作製した。シリコンウェハに、底面の形状が直径２．３ｍｍの円形であって、高さ４０ｕｍの型を作製した。ここにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流しこみ、焼き固めて反応チャンバを作製した。反応チャンバの両端に直径０．５ｍｍの穴をあけて、導入部９および排出部１０とした。
【０１３５】
電極基板の作用極上に形成したチオール分子による自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を介して、グルコースオキシダーゼを固定化した。
【０１３６】
反応チャンバを、グルコースオキシダーゼを固定化した基板に貼り合わせ、実施例１のバイオセンサ８００とした。
【０１３７】
この実施例１における反応チャンバによって形成される反応部の底面積と、作用極との面積比率は、０．７６となった。
【０１３８】
〔比較例１〕
反応チャンバを作製するための型において、底面の形状が直径２．８ｍｍの円形であって、高さ４０ｕｍの型を作製した。ここにＰＤＭＳを流し込み、焼き固めて反応チャンバを作製した。
【０１３９】
グルコースオキシダーゼを固定化した基板に、反応チャンバを貼り合わせ、比較例１のバイオセンサとした。
【０１４０】
この比較例１における、反応チャンバによって形成される反応部の底面積と、作用極との面積比率は、０．５１となった。
【０１４１】
（グルコースの検出）
実施例１および比較例１のバイオセンサを用いて、グルコースの検出を行った。グルコース溶液は、５０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２５０ｍｇ／ｄＬのものを調製した。
【０１４２】
反応部にグルコース溶液を入れ、１０秒後の電流値を測定した。バックグラウンド電流を補正後、時間に対して電流値をプロットし、原点との２点を結ぶ直線の傾きから初速度を求めた。
【０１４３】
面積比率０．５１の比較例１の場合、グルコース濃度と初速度とは比例しなかったが、面積比率０．７６の実施例１の場合、グルコース濃度は初速度に比例した。直線の傾きから求めた初速度が、真の初速度とほぼ等しく求めることができた。
【０１４４】
以上のことから、本発明に係るバイオセンサによれば、短時間の反応時間でも、未知濃度のグルコース測定の初速度を正確に求めることができ、ある既知濃度のグルコース測定の初速度と比較することによって、グルコースの濃度を求めることができる。
【０１４５】
〔実施例２〕
実施例１と同様に作製した電極基板の作用極上に、チオール分子による自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を介して、抗ＣＲＰ抗体を固定化した。実施例１と同様の反応チャンバを貼り合わせて、実施例２のバイオセンサとした。
【０１４６】
〔比較例２〕
実施例１と同様に作製した電極基板の作用極上に、実施例２と同様に抗ＣＲＰ抗体を固定化した。比較例１と同様の反応チャンバを貼り合わせて、比較例２のバイオセンサとした。
【０１４７】
（ＣＲＰの検出）
実施例２および比較例２のバイオセンサを用いて、ＣＲＰの検出を行った。まず、実施例２および比較例２のバイオセンサの反応部に、カゼイン溶液を入れ、３０分室温にて静置し、非特異吸着防止膜を形成した。カゼイン溶液を排出し、ＰＢＳ溶液を用いて反応部内を洗浄した。次に、反応部にＣＲＰ溶液を入れ、３分室温にて静置し、作用極上に固定化された抗体とＣＲＰとの複合体を形成した。ＣＲＰ溶液は、０．２ｍｇ／ｄＬ、２ｍｇ／ｄＬ、１０ｍｇ／ｄＬのものを使用した。ＣＲＰ溶液を排出し、反応部内を洗浄した。次に、反応部に第二の結合物質として、ＡＬＰ標識抗ＣＲＰ抗体溶液を入れ、３分室温にて静置し、固定化抗体−ＣＲＰ−ＡＬＰ標識抗体のサンドイッチ複合体を形成した。ＡＬＰとは、アルカリフォスファターゼという酵素のことである。ＡＬＰ標識抗体を排出し、反応部内を洗浄した。反応部に、ｐ−アミノフェニルリン酸塩（ｐＡＰＰ）溶液を入れ、１０秒後の電流値を測定した。バックグラウンド電流を補正後、時間に対して電流値をプロットし、原点との２点を結ぶ直線の傾きから初速度を求めた。
【０１４８】
面積比率０．５１の比較例２の場合、ＣＲＰ濃度と初速度とは比例しなかったが、面積比率０．７６の実施例２の場合、ＣＲＰ濃度は初速度に比例した。直線の傾きより求めた初速度を、真の初速度とほぼ等しく求めることができた。
【０１４９】
以上のことから、本発明を用いると、短時間の反応時間によって、未知濃度のＣＲＰ測定の初速度を正確に求めることができ、ある既知濃度のＣＲＰ測定の初速度と比較することにより、グルコースの濃度を求めることができる。
【０１５０】
なお、ＣＲＰに限ったものではなく、本発明はイムノアッセイ一般に用いることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明にかかるバイオセンサは、電気化学測定を行うことにより、検出された電流値から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができるため、生体、環境、医療、食品などに関する試料の分析に利用することができる。
【符号の説明】
【０１５２】
１ 作用極
２ 対極
３ 参照極
Ａ１〜Ａ３ 接続パッド
Ｂ１〜Ｂ３ リード電極部
４ 絶縁膜
５ 反応部
６ 疎水性膜
７ 壁面
８ 反応チャンバ
９ 導入部
１０ 排出部
２０ 基板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体、環境、医療、食品などの分析に用いるのに好適なバイオセンサとこれを用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中の電気化学反応を利用した電気化学測定法は、生体、環境、医療、食品などの分析においてよく用いられている。たとえば、生体試料中の物質（糖、中性脂肪など）の測定には、酵素電極を用いた電気化学測定法がある。
【０００３】
また、生体試料中の微量物質（タンパク質、ホルモンなど）の分析には、電気化学検出型の免疫分析法がよく用いられている。これらの分析に用いられる電気化学測定用電極は、基板上に導電性材料である所定の電極（作用極、対極、参照極等）が形成された構成になっており、電極上に反応物質（酵素、抗体、ペプチドなど）が固定されている。電極上や電極近傍において、ＥＬＩＳＡ反応または酵素基質反応を用いて電気化学的にターゲット物質を検出する。
【０００４】
上記測定法を用いた発明については、下記の特許文献に記載されている。
【０００５】
特許文献１には、絶縁性基板上に形成された作用極（測定極）と対極と、これらの電極系に接触している酵素などとを含む反応層を備えたバイオセンサが記載されている。
【０００６】
特許文献２には、絶縁性基板上に形成された作用極と対極と、これらの電極系の上部または近傍に酵素などを含むポリマー層と、さらにその上部に、中性脂肪分解酵素が担持された濾紙層とを備えたバイオセンサが記載されている。
【０００７】
特許文献３には、絶縁性基板上に、導電性材料をパターニングすることにより、作用極、対極および参照極を形成した平板型の電極が記載されており、この平板型電極内に形成されている作用極上に酵素を固定化した電気化学検出センサーが例示されている。
【０００８】
特許文献４には、絶縁性基板上にある金属電極に抗体が共有結合により固定化されたイムノアッセイ用の電気化学センサーが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−１７４４３２号公報（２００１年６月２９日公開）
【特許文献２】特開２００９−１３９１１４号公報（２００９年６月２５日公開）
【特許文献３】特開２００７−２７８９８１号公報（２００７年１０月２５日公開）
【特許文献４】特開２００９−２４４０１３号公報（２００９年１０月２２日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
より正確な検出が可能なバイオセンサを提供することは望ましい。特に、短時間でも正確な検出が可能なバイオセンサを提供することはより望ましい。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、短時間で正確な検出が可能なバイオセンサ、およびこれを用いた分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討の結果、シミュレーションにより、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が、分析の精度に影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
シミュレーションにより、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が大きくなるほど、理論から求める初速度と真の初速度との値の差が小さくなることが判明した。また上記作用極の面積の比が、０．７以上になった場合には理論から求める初速度と真の初速度がほぼ等しくなることもシミュレーションの結果から判明した。なお、シミュレーションの詳細については後述する。
【００１４】
本発明に係るバイオセンサは、ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、対極と、該ターゲット物質を含む試料液を溜める反応部と、を備えており、該作用極および該対極は、該反応部の底面に配置されており、該反応部の底面において該作用極が占める割合が０．７以上であることを特徴としている。
【００１５】
上記の構成により、生成物を生成する反応の反応初期において、ある時間の生成物量と原点を結ぶ直線の傾きから求めた反応の初速度と真の初速度との差異を、従来技術に係るバイオセンサに比べて小さくすることが出来るので、反応が飽和するのを待つことなく、短時間の反応時間であってもより正確な検出を実現することができる。
【００１６】
これを詳細に説明すれば、まず、従来技術に係るバイオセンサ（特許文献１〜４）は、基板内において試料液および測定液の触れる領域に対して、作用極（測定極）の占める割合は小さい。これは作用極において発生した電流を流すための電極である対極は、通常、電流が流れにくくなるのを防ぐために、作用極と同程度の若しくは作用極以上の面積比率となるように形成されるからである。そのため、従来技術に係るバイオセンサにおいては、液の触れる面積に対して、作用極の占める割合を０．５以下としている。
【００１７】
ここで、通常、作用極上で生成した生成物は、拡散によって作用極上から徐々に移動する。そして、電気化学検出は、作用極近傍の生成物しか検出することができない。それゆえ、従来技術に係るバイオセンサのように、反応部の底面積に対する作用極の面積比が０．５であると、すなわち作用極以外の領域が多いということなので、拡散によって検出範囲外へ移動する生成物量も多くなる。それゆえに、反応初期で反応時間と生成物量（作用極上の生成物量）との間の線形性の程度が小さい。
【００１８】
これに対し、上記のように作用極の面積比を反応部の底面積に対して０．７以上と大きくしたバイオセンサでは、作用極以外の領域が少ないので、検出範囲外へ移動する生成物量も少なくなる。そのため、生成物の拡散が無視できるような状況を擬似的に作り出すことができ、反応初期でも反応時間と生成物量（作用極上の生成物量）との関係がより線形性の程度が大きくなる、つまり、直線に近くなると考えられる。これにより、上記の構成によれば、生成物を生成する反応の反応初期において、ある時間の生成物量と原点を結ぶ直線の傾きから求めた反応の初速度と真の初速度との差異を小さくして、短時間の反応時間であってもより正確な検出を実現することができる。
【００１９】
本発明に係るバイオセンサでは、上記作用極を複数備えていることが好ましい。
【００２０】
上記の構成により、個々の作用極の面積が小さくなるので、微小電極の効果により、電流値が大きくなり、高感度な測定が可能である。
【００２１】
本発明に係るバイオセンサでは、さらに参照極を備えていることが好ましい。
【００２２】
上記の構成により、作用極に所望の安定した電位を印加することができる。
【００２３】
本発明に係るバイオセンサでは、疎水性を有する疎水性部分を備えており、該疎水性部分が上記反応部を囲むように配置されていることが好ましい。
【００２４】
上記の構成により、疎水性部分によって、上記反応部を囲むことによって、上記反応部からの液の広がりを抑えることができる。これにより、例えば、液滴による測定が可能となる。
【００２５】
本発明に係るバイオセンサでは、上記反応部を囲む壁面を備えていることが好ましい。
【００２６】
上記の構成により、検出電極の周囲を囲む壁面によって液の広がりが抑えられる。これにより、微量の試料液を用いた場合も首尾よく測定することができる。
【００２７】
本発明に係るバイオセンサでは、上記反応部を格納する反応チャンバを備えており、該反応チャンバは、該反応チャンバ内に上記試料液を注入するための注入口と、上記反応チャンバ内の上記試料液を排出するための排出口とを備えていることが好ましい。
【００２８】
上記の構成により、反応チャンバにより反応部を格納することができ、試料液の微量化、測定時間の短縮化、分析操作の簡便化が可能となり、短時間で正確かつ効率的な測定を実現することができる。
【００２９】
本発明に係るバイオセンサでは、上記作用極の中心が、上記反応部の底面の中央部にあることが好ましい。
【００３０】
上記の構成により、反応部のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極を中心としておおよそ均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となる。なお中央部は、反応部の中心を基準に反応部全体に対して三分の一程度の領域を指す。
【００３１】
本発明に係るバイオセンサでは、上記作用極の底面の形状が、上記反応部の底面の形状と相似形であることが好ましい。
【００３２】
上記の構成により、反応部のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極を中心として均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となる。
【００３３】
本発明に係るバイオセンサでは、上記反応物質は、ターゲット物質と特異的に反応するものであることが好ましい。また、上記反応物質が、上記ターゲット物質の反応を触媒する酵素であることがより好ましい。
【００３４】
上記の構成により、酵素に反応する基質をターゲット物質として検出することができる。
【００３５】
本発明に係るバイオセンサでは、上記結合物質は、ターゲット物質と特異的に結合するものであることが好ましい。また、上記結合物質が、上記ターゲット物質に対する抗体、または、上記ターゲット物質に特異的に結合するペプチドがより好ましい。
【００３６】
上記の構成により、ターゲット物質と反応する第二の結合物質をさらに反応させることで、イムノアッセイが可能となる。第二の結合物質とは、ターゲット物質と結合し、基質と反応して、生成物を生成する物質のことである。たとえば、酵素標識抗体などが該当する。
【００３７】
本発明に係る分析方法は、上記バイオセンサを用いた分析方法であって、ターゲット物質を含む試料液を、上記反応部に導入する導入工程、および上記作用極と上記対極との間に電圧を印加することで、反応または結合した上記ターゲット物質に応じた電流を得る工程とを含むことを特徴とする。
【００３８】
上記の構成により、導入工程にて、ターゲット物質を含む試料液を上記反応部へ導入することにより、作用極上に固定した反応物質とターゲット物質とが反応、または作用極上に固定した結合物質とターゲット物質とが結合する。そして、作用極と対極の間に電圧を印加することによって、反応または結合したターゲット物質に応じた電流値を得ることができる。このとき、生成物を生成する反応の反応初期において、反応時間と生成物の生成量の間の線形性の程度が大きい（より直線に近くなる）ので、ある短時間の反応時間における電流値と原点とを結ぶ直線の傾きから求めた初速度が、真の初速度とほぼ等しい値となる。よって、短時間の反応時間でも正確な分析が可能となる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明に係るバイオセンサは、ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、対極と、該ターゲット物質を含む試料液が導入される反応部と、を備えており、該ターゲット物質が、該反応物質と反応し、または、該結合物質と結合することにより生成される液が触れる領域である反応部を有し、該反応部の底面積に対する該作用極の面積の比が０．７以上であるため、反応が飽和するのを待つことなく、短時間で正確な検出を実現できるという効果を有する。
【００４０】
本発明の分析方法は、上記バイオセンサを用いた分析方法であって、ターゲット物質を含む試料液を、上記反応部に導入する導入工程と、上記反応物質と上記ターゲット物質との反応によって生成物が生成する工程または上記結合物質が上記ターゲット物質と結合する工程と、作用極に電圧を印加することで、反応または結合したターゲット物質に応じた電流値を得る工程とを含んでいるので、反応が飽和するのを待つことなく、短時間で、正確な分析を行うことができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】第１実施形態に係るバイオセンサ１００の概略構成を示す上面図である。
【図２】第２実施形態に係るバイオセンサ２００の概略構成を示す上面図である。
【図３】第３実施形態に係るバイオセンサ３００の概略構成を示す上面図である。
【図４】第４実施形態に係るバイオセンサ４００の概略構成を示す上面図である。
【図５】第５実施形態に係るバイオセンサ５００の概略構成を示す上面図である。
【図６】第５実施形態の変形体であるバイオセンサ５００´の概略構成を示す上面図である。
【図７】第６実施形態に係るバイオセンサ６００の概略構成を示す上面図である。
【図８】第６実施形態に係るバイオセンサ６００の概略構成を示す斜視図である。
【図９】第７実施形態に係るバイオセンサ７００の概略構成を示す上面図および断面図である。
【図１０】第７実施形態に係るバイオセンサ７００の概略構成を示す斜視図である。
【図１１】実施例に係るバイオセンサの概略構成を示す上面図である。
【図１２】一般的な酵素基質反応において、時間に対しての生成物量を表す図である。
【図１３】従来のバイオセンサにおける、作用極上の生成物と時間との関係図である。
【図１４】本発明のバイオセンサにおける、作用極上の生成物と時間との関係図である。
【図１５】作用極上の生成物量と時間との関係を示す曲線において、反応初期の一次近似直線の相関係数Ｒの二乗値を、作用極の面積比に対してプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
図１２は、ＥＬＩＳＡ法または酵素法によって起こる酵素基質反応における時間に対しての生成物量を表すグラフである。ＥＬＩＳＡ法または酵素法によって起こる酵素基質反応は、通常、反応初期では時間と反応総量との間に線形性がある。その直線の傾きは、酵素基質反応の初速度であり、反応初期の区間を初期速度区間という。
【００４３】
酵素が基質に対して過剰に存在する場合、初速度は基質濃度に比例する。ターゲット物質が基質の場合（たとえば、グルコースをターゲット物質とするグルコースセンサーなど）、初速度と基質濃度が比例する現象を利用し、初速度を求めることによって、基質濃度、つまりターゲット濃度を求めることができる。
【００４４】
また、基質が酵素に対して過剰に存在する場合、初速度は酵素濃度に比例する。ターゲット物質と結合する物質（例えば抗体など）を用いてターゲット物質を検出する場合（抗体を用いる場合はイムノアッセイ）、初速度と酵素濃度とが比例する現象を利用して、初速度を求めることで、酵素濃度を求めることができる。酵素濃度は、ターゲット物質に結合している酵素標識抗体濃度であり、すなわち、結合しているターゲット物質濃度として求められる。
【００４５】
このように、酵素基質反応の初速度は、測定系の、基質濃度および酵素濃度を求めるのに、非常に重要な因子である。
【００４６】
特に、上記のようなバイオセンサにおいて、免疫反応および酵素基質反応等の検出を電気化学的に行う場合は、検出された電流値（電流値は生成物量に比例する）と時間との関係において、反応初期において線形性を持たせることが必要である。しかし、電気化学的な手法では、生成物の全量ではなく、作用極上の限られた範囲に存在する生成物しか検出することが出来ないため、必ずしも線形性を持たせて反応させることが容易ではない。これは、拡散による物質移動によって、作用極上で生成した生成物が、その範囲外へと移動してしまうので、電気化学的な手法では生成物の総量を測定することができないためである。
【００４７】
ここで、検出電流値は生成物量に比例するため、この後は検出電流値を生成物量として説明する。
【００４８】
生成物量と時間との間に線形性がある場合、その初速度は、ある反応時間における生成物量を、反応時間で割った数値、すなわち、原点との２点を結ぶ直線の傾きとして求めることができる。しかし、上記のような一般的な（従来の）バイオセンサおよび電気検出センサーの場合、生成物量と時間との間の線形性の程度が小さいために、同様にして求めた直線の傾きは、真の初速度とはずれがある。したがって、近似直線から得た初速度を基に算出した生成物量は、真の生成物量との誤差が大きくなってしまう。したがって、正確な検出を行うためには、反応が飽和し、安定するまで反応させてから電気化学測定を行う必要がある。つまり、正確な検出を行うためには、検出に時間を要し、また、短時間で検出を行うと、正確な検出を行うことができない。
【００４９】
図１４は、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が０．５のバイオセンサ（従来のもの）において、時間と作用極上の検出可能な範囲における生成物量との関係を示した結果である。また、図１３は、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対し、作用極の面積の比が０．７のバイオセンサ（本発明のもの）において、時間と作用極上の検出可能な範囲における生成物量との関係を示した結果である。図１３も図１４も反応初期である数１０秒程度までの結果を示した。
【００５０】
ここで、線形性の程度を一次近似直線の相関関数Ｒの二乗値のＲ２値によって評価する。Ｒ２値が１に近づくほど、時間と生成物量との間の線形性の程度が大きくなるということになる。従来型のバイオセンサでは、図１３のグラフの０〜１０秒における近似直線のＲ２値は、０．９９２８であった。一方、本発明のバイオセンサでは、図１４のグラフの０〜１０秒における近似直線のＲ２値は、０．９９９０であった。したがって、面積比０．５の電気化学検出用バイオセンサでは、時間と生成物量との間の線形性の程度が小さく、ある時間における点と原点とを結ぶ直線の傾きから求めた初速度と、真の初速度とにずれがある。一方、面積比率０．７のバイオセンサでは、時間と生成物量との間の線形性の程度が大きく、より直線に近くなる。
【００５１】
さらに、図１５は、反応初期（０〜１０秒）の一次近似直線の相関係数Ｒの二乗値Ｒ２を、電気化学測定時に液の触れる領域の底面積に対する作用極の面積比ごとにプロットしたグラフである。図１５より、作用極の面積比が大きくなるほど、Ｒ２値が１に近づいており、作用極の面積比が０．７以上１未満では、Ｒ２値が０．９９９以上、つまりほぼ１となる。逆に、面積比が０．７より小さくなるにつれＲ２値は急激に小さくなり、面積比０．１ではＲ２値は０．９６まで悪くなる。したがって、作用極の面積比が０．７以上のバイオセンサは、短時間の反応時間で検出を行ったときに、その直線の傾きから求めた速度と、真の初速度との誤差が小さく、ほぼ等しい値となると言える。つまり、作用極の面積比を大きくすることによって短時間の反応時間でも、ターゲット物質の濃度をより正確に検出することが可能となる。
【００５２】
〔第１実施形態〕
図１は、本発明の一実施形態（第１実施形態）に係るバイオセンサ１００の概略構成を示す上面図である。図１に示すように、バイオセンサ１００は、作用極１、対極２、絶縁膜４、接続パットＡ１およびＡ２、リード電極部Ｂ１およびＢ２、反応部５、ならびに、基板２０を備えている。
【００５３】
図１に示すように、バイオセンサ１００では、基板２０上の一方の端部に接続パットＡ１およびＡ２が形成され、反対側に、並列して作用極１および対極２が形成されている構造になっている。作用極１と接続パッドＡ１とを接続するようにリード電極部Ｂ１が形成され、対極２とＡ２とを接続するようにリード電極部Ｂ２が形成されている。さらに、リード電極部Ｂ１およびＢ２が試料液と接触しないように、リード電極部Ｂ１およびＢ２を覆うための絶縁膜４が形成された構造になっている。詳しい構造については下記にて記載する。
【００５４】
作用極１は、試料液中にて生成した電気化学的活性物質である生成物を電気化学反応（酸化または還元）により検出する電極である。作用極１の材料としては、例えば、金属、カーボン、グラファイトなどの導電性材料が用いられる。
【００５５】
対極２は、作用極１にて生じた電流を流すための電極である。対極２の材料としては、作用極１と同様の導電性材料を用いることができる。また、作用極１と異なる導電性材料を用いてもよい。
【００５６】
絶縁膜４は、リード電極部Ｂ１およびＢ２と、試料液が接触しないために形成されている絶縁性を有する膜である。絶縁膜４の材料としては、例えば、ポリイミドなどの絶縁性材料を用いることができる。
【００５７】
接続パットＡ１およびＡ２は、電気化学検出用バイオセンサを電気化学測定装置（例えばポテンショスタット等）に接続するときに用いられ、作用極１と対極２と電気化学測定装置とを接続するために設けられている。接続パッドＡ１およびＡ２の材料としては、作用極１または対極２と同様の導電性材料を用いることができる。また、作用極１または対極２と異なる導電性材料を用いてもよい。
【００５８】
リード電極部Ｂ１およびＢ２は、作用極１と対極２とを、それぞれ接続パッドＡ１およびＡ２とつなぐために形成されている。リード電極部Ｂ１およびＢ２の大きさ（寸法）についても、任意の大きさを設定することができる。リード電極部Ｂ１およびＢ２の材料としては、作用極１および対極２と同様の材料を用いることができる。
【００５９】
基板２０は、電子部品等を表面に固定し、何らかの機能を実現するための板状またはフィルム上の部品をいう。例えば、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックなどの絶縁性材料が用いられる。
【００６０】
反応部５は、電気化学測定の際に、試料液を溜める（試料液が触れる）領域のことをいい、作用極１および対極２を含む電極系を含むように形成される。反応部５では、作用極１上に固定化された反応物質または結合物質とターゲット物質が直接または段階的に反応して、電気化学活性のある生成物を生成する反応が生じる。バイオセンサ１００は、上記電極系（作用極１および対極２）を用いて、反応部５における上記反応を電気化学的に検出する。なお、反応物質および結合物質については後述する。
【００６１】
バイオセンサ１００は、例えば、以下のように製造することができる。まず、基板２０上にパターニングすることにより、作用極１、対極２、接続パットＡ１およびＡ２ならびにリード電極部Ｂ１およびＢ２をそれぞれ形成する。基板２０の表面に作用極１を形成する方法としては、例えば、スパッタ法、蒸着法または印刷法等を用いることができる。対極２、接続パットＡ１およびＡ２、ならびに、リード電極部Ｂ１およびＢ２を形成させる場合についても、作用極１と同様の方法を用いることができる。また、バイオセンサ１００を大量生産する場合には、バイオセンサ１００が備える部材を複数パターニングした基板を分割してもよい。
【００６２】
つぎに、絶縁膜４を、リード電極部Ｂ１およびＢ２を完全に覆うようにして形成させる。これは、リード電極部Ｂ１およびＢ２と試料液とが接触してバイオセンサ１００が誤動作することを防止することが目的である。これにより、試料液を反応部５にのみに接触させることができる。基板２０の表面に、リード電極部Ｂ１およびＢ２を覆うようにして絶縁膜４を形成する方法は、例えば、フォトリソグラフィー、スクリーン印刷などの方法を用いることができる。
【００６３】
絶縁膜４の形成により、試料液が接触する反応部５が規定される。絶縁膜４の大きさは、絶縁膜４によって規定される反応部５の大きさ（底面積）と、作用極１との面積比率が０．７以上となるように、絶縁膜４の大きさを調整して生成する。これにより、反応部５の大きさを、反応部５に対する作用極１の面積比率が０．７以上となるように設定することができる。
【００６４】
なお、本実施形態では、反応部５の外縁は絶縁膜４によって規定されているが、この方法に制限されるものではなく、後述するような様々な方法を用いて形成することができる。
【００６５】
対極２の大きさは、反応部５のうち、作用極が占める領域の残りの部分から、任意の大きさを選択できる。前述のように、対極２は作用極１から生じた電流を流すための電極であるので、対極２が作用極１に対して余りにも小さい場合、電流が流れにくくなり、正確な電気化学測定を行うことができなくなる。したがって、対極２は、作用極１から生じる電流を流すのに必要な大きさを選択することが望ましい。
【００６６】
接続パッドＡ１およびＡ２それぞれの位置は、電気化学測定装置との接続位置に応じて適宜設定可能であり、接続可能な位置であれば特に限定されない。また、接続パッドＡ１およびＡ２の大きさは、電気化学測定装置側の接続パッドと充分に接触する大きさであればよい。
【００６７】
作用極１上に、ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質またはターゲット物質と結合する結合物質を固定化させる。
【００６８】
反応物質は、ターゲット物質と直接反応して生成物を生成する。結合物質は、ターゲット物質と反応後、さらなる反応によって生成物を生成する。
【００６９】
反応物質あるいは結合物質は、検出したいターゲット物質によって酵素、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、レクチン、レセプター、糖など任意の生体材料を選択する。例えば、試料液中の糖を検出する場合には、グルコースオキシダーゼなどの酵素が選択される。
【００７０】
試料液中のターゲット物質がイムノアッセイにより検出される場合は、ターゲットの物質を特異的に結合する抗体もしくはペプチドなどが選択される。反応物質あるいは結合物質は、作用極１の全面に固定化されていることが好ましい。
【００７１】
上記固定化に関しては、作用極１の全面に隙間無く行う必要はなく、離散的に固定化されていてもよい。ただし、その固定化された面積は反応部の面積に対して０．７以上であることが好ましい。
【００７２】
反応物質あるいは結合物質を作用極１に固定化する方法としては、例えば、物理吸着、作用極１の表面に形成した官能基と反応物質との共有結合、または３次元網目構造を有する高分子材料によるタンパク質の取り込み（包括）等を利用した、公知の方法を採用することができる。離散的に固定化する場合、スポッターなどを用いてもよい。
【００７３】
なお、本実施形態に係るバイオセンサ１００は、基板２０上に、作用極１および対極２が集約して形成されているので、検出に必要な試料液の量を少なくすることができるという利点も有している。
【００７４】
なお、作用極１、対極２、絶縁膜４、接続パットＡ１およびＡ２、リード電極部Ｂ１およびＢ２、反応部５ならびに基板２０の形状は図１に示されたものである必要はなく、特に限定されるものではなく、矩形、円形、楕円形またはその他任意の形状とすることができる。
【００７５】
〔バイオセンサを用いた分析方法〕
この分析方法は、ターゲット物質を含む試料溶液を、上記反応部５に導入する導入工程と、上記反応物質と上記ターゲット物質との反応によって生成された電気化学活性物質を測定する測定工程からなる。
【００７６】
上記バイオセンサ１００の構成により、ターゲット物質を含む試料液を反応部５に導入すれば、作用極１上に固定した反応物質と反応し生成物を生成、または作用極１上に固定した結合物質と結合する。上記反応または結合をさせた後、電気化学測定を行うことにより、検出された電流値から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができる。
【００７７】
まず、電気化学検出用バイオセンサの接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３を、電気化学測定装置（例えばポテンショスタット）に接続する。接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３の接続方法としては、例えば両端にワニ口クリップが設けられたコードを用意し、一方のクリップにより接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３を挟み、他方のクリップによりポテンショスタットの端子を挟む方法が挙げられるが、この方法に制限されるものではない。
【００７８】
以下、バイオセンサ１００を用いた分析方法の一例として、試料液中の糖（グルコース）を測定する方法について説明するが、本実施形態はこれに限定されず、その他のターゲット物質の測定にも適用可能である。
【００７９】
試料液中の糖を測定する場合、バイオセンサ１００の作用極１には、反応物質として、酵素（グルコースオキシダーゼ）を固定化する。前記反応物質を作用極１に固定化する方法としては、上述のように、物理吸着、作用極１の表面に形成した官能基と反応物質との共有結合、または３次元網目構造を有する高分子材料によるタンパク質の取り込み（包括）等を利用した、公知の方法を採用することができる。また、作用極１における反応物質の固定化箇所は、特に限定されないが、作用極１の全面に固定ることが好ましい。
【００８０】
次に、グルコースを含む試料液を反応部５に導入する。具体的には、バイオセンサ１００の反応部５に試料液を滴下する。グルコースと作用極１に固定化された酵素とが反応して、生成物（過酸化水素）が生成する。作用極１と対極２との間にに電圧を印加することにより、グルコース量に応じた電流が得られ、その結果から試料液中のグルコースの濃度を測定することができる。
【００８１】
試料液には、電子移動を仲介するためのメディエーターを加えてもよい。メディエーターとしては、フェロシアン化カリウム／フェリシアン化カリウム、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシニウム／フェロセンなどの系を用いることができる。グルコースを測定する系の場合、酵素とグルコースとが反応し、メディエーターを介在した電子の移動にともなって生ずる電流をシグナルとして測定する。そうすることで、検出された電流値から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができる。
【００８２】
次に、バイオセンサ１００を用いた分析方法の他の例として、試料液中の微量物質をイムノアッセイにて測定する方法について説明する。
【００８３】
試料液中の微量物質をイムノアッセイにて測定する場合、バイオセンサ１００の作用極１には、結合物質としてターゲット物質を特異的に捕捉することのできる抗体またはペプチドを固定する（以下、抗体を固定した場合について説明するが、ペプチドを固定した場合も分析方法は同様である）。固定する方法としては、酵素を固定する場合と同様の方法を採用することができる。また、結合物質は、作用極１の全面に固定することが好ましい。また、試料液を滴下する前に、作用極１の表面をアルブミン水溶液により処理して、非特異吸着防止膜を形成した後、バッファー液を用いて洗浄しておいてもよい。これにより、作用極１の表面へのターゲット物質の非特異的な吸着を防ぐことができる。
【００８４】
ターゲット物質を含む試料液を反応部５に滴下することによって、抗原抗体反応が進行する。続いて、反応部５を、バッファー液を用いて洗浄した後、第二の結合物質である酵素標識抗体を含む液を滴下して反応させる。ここで、作用極１の表面には、抗体−ターゲット物質−酵素標識抗体のサンドイッチ複合体が形成される。続いて、反応部５を、バッファー液を用いて洗浄する。次いで、酵素に対する基質を含む試料液を反応部５に滴下する。作用極１の表面に形成されたサンドイッチ複合体の中において、酵素基質反応が進行し、電気化学活性のある生成物が生成する。作用極１に電圧を印加することによって、ターゲット物質量に応じた電流が得られる。その結果から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができる。
【００８５】
また、基質を含む試料液には、上述と同様に、電子移動を仲介するためのメディエーターを加えてもよい。
【００８６】
〔第２実施形態〕
図２は、本発明の一実施形態（第２実施形態）に係るバイオセンサ２００の概略構成を示す上面図である。
【００８７】
なお、説明の便宜上、前記第１実施形態にて説明した図面と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。またバイオセンサを用いた分析方法に関しても上述した方法と同様のため、その説明も省略する。
【００８８】
図２に示すように、バイオセンサ２００は、作用極１、対極２、参照極３、絶縁膜４、接続パットＡ１、Ａ２およびＡ３、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３、反応部５ならびに基板２０を備えている。
【００８９】
基板２０における一方の端部に、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３が形成されている。また、作用極１、対極２および参照極３が、基板２０上の、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３が形成されている側とは反対側に形成されている。また、作用極１と接続パッドＡ１とを、対極２と接続パッドＡ２とをおよび参照極３と接続パッドＡ３とを接続するように、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３がそれぞれ形成されている。さらに、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３が試料液と接触しないように、リード電極部を覆うように絶縁膜４が形成されている。それゆえに試料液は図２に示す反応部５にのみ接触するようになっている。
【００９０】
上記構造を有し、作用極１を反応部５に対して面積比率０．７以上で形成するという条件を満たしていれば、各部材の大きさおよび形状は限定されない。第２実施形態は、参照極３を含むという点が、第１実施形態とは異なる。
【００９１】
参照極３は、作用極１に所望の安定した電位を印加するための電極である。図２に示されるバイオセンサ２００では、参照極３は、作用極１の中に埋め込まれるようにして形成されている。参照極３の位置はこの位置に制限されるものではないが、参照極３は、溶液抵抗によりＩＲドロップが生じることを考慮すると、できる限り作用極１の近傍に配置されていることが望ましい。また参照極３の大きさ（寸法）は、特に限定されないが、作用極１を反応部５に対して面積比率０．７以上で形成するため、参照極３は小さいことが好ましい。
【００９２】
参照極３の材料は、導電性材料であり、かつ、電流が流れた際にも電位が安定している材料が望ましい。例えば、銀塩化銀電極はよく用いられる参照極の一つである。
【００９３】
基板２０の表面に参照極３を形成する方法としては、例えば、スパッタ法、蒸着法、印刷法等を用いることができる。
【００９４】
参照極３によって、作用極１に安定した電位を印加することができるので、より正確な検出が可能となるという特徴を有する。
【００９５】
また、作用極１の中心が、反応部５の底面の中央部にあることが望ましい。
【００９６】
上記の構成により、反応部５のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極５を中心としておおよそ均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となるからである。なお中央部は、反応部の中心を基準に反応部全体に対して三分の一程度の領域を指すものとし、作用極の中心が反応部の底面の中央部にあればいいので、図２の形状には限定されない。
【００９７】
さらに、作用極１の底面の形状が、反応部５の底面の形状と相似形であることが望ましい。
【００９８】
上記の構成により、反応部５のうち、電気化学測定に関与する拡散層の濃度勾配が作用極を中心として均等となるため、電気化学反応が均一に起こり、より短時間の反応時間での検出が可能となるからである。作用極の底面の形状が、反応部の底面の形状と相似形であればいいので、図２の形状には限定されない。
【００９９】
〔第３実施形態〕
図３は、本発明の一実施形態（第３実施形態）に係るバイオセンサ３００の概略構成を示す上面図である。
【０１００】
図３に示されるバイオセンサ３００は、絶縁膜４の代替として、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３ならびに反応部５以外の部分を、疎水性膜（疎水性部分）６を用いて被覆させている点で図２のバイオセンサ２００と異なる。したがって、反応部５は、疎水性膜６によって規定される。それ以外の点においては、第２実施形態と同様である。
【０１０１】
疎水性膜６は、反応部５を規定し、それ以外の領域に試料液の液滴を広がらせないためのものである。バイオセンサ３００では、反応部５以外の部分を覆うように形成されている。
【０１０２】
疎水性膜６の材料は、その表面が疎水性を有し、かつ、絶縁性の材料が望ましい。疎水性膜６の形成方法は、例えば、疎水性ポリマーをコートしたり、オクタドデシルトリクロロシランのトルエン溶液によって化学修飾したりするなどの方法を採用することができる。
【０１０３】
疎水性膜６によって、反応部５が首尾よく規定されるので、最小限の液量により測定することが可能であるという効果を有する。
【０１０４】
〔第４実施形態〕
図４は、本発明の一実施形態（第４実施形態）に係るバイオセンサ４００の概略構成を示す上面図である。
【０１０５】
図４に示される電気化学検出用バイオセンサは、作用極１が複数個から成り、それぞれの作用極１において、接続パットＡ１と接続させるためにリード電極部Ｂ１が形成されている以外は、第３実施形態と同様である。
【０１０６】
複数の作用極の総面積は、反応部５の底面積の０．７以上を占めるように形成されている。
【０１０７】
作用極が複数になることより、個々の作用極の面積が小さくなるが、微小電極の効果により電流値が増幅され、高感度の検出が可能であるという効果を有する。
【０１０８】
〔第５実施形態〕
図５は、本発明の一実施形態（第５実施形態）に係るバイオセンサ５００の概略構成を示す上面図である。
【０１０９】
図５に示されるバイオセンサ５００は、作用極１の大きさが反応部５の大きさよりも大きいこと以外は、第３実施形態と同様である。疎水性膜６によって、反応部５内の作用極の有効面積が規定される。バイオセンサ５００では、作用極の有効面積が、反応部５の０．７以上となっている。
【０１１０】
図５に示されたバイオセンサ５００のように、作用極１の全部分が反応部５からはみ出して形成されていてもよいし、図６に示されたバイオセンサ５００´ように、作用極１の一部分が反応部５からはみ出して形成されてもよい。
【０１１１】
〔第６実施形態〕
図７は、本発明の一実施形態（第６実施形態）に係るバイオセンサ６００の概略構成を示す上面図である。図８は第６実施形態のバイオセンサ６００の概略構造を示す斜視図である。図８においては、作用極１等の詳細な構造は省略してある。
【０１１２】
バイオセンサ６００は、反応部５がその周囲を囲む壁面７によって規定されている点および疎水性膜６によって被覆されていない点以外は、第５実施形態と同様である。
【０１１３】
壁面７は、反応部６を規定し、それ以外の領域に試料液の液滴を広がらせないためのものである。バイオセンサ６００では、壁面７は、平面視において円形の反応部６を取り囲むように円周状に形成されている。しかしながら、この形状に制限されるものではなく、反応部６の形状に応じて任意に形成することができる。また壁面７は、液が広がっていかない高さがあればよい。壁面７の材料は、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックなどを用いることができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を材料として用いることによって、加工および量産が容易となる。
【０１１４】
壁面７を形成する方法は、例えば、機械的に加工する方法、エッチングなどの化学処理により形成する方法などが挙げられ、特に限定されない。また各部パターンを形成した型に光硬化性樹脂または熱硬化性樹脂を流し込んで固めて作成する方法もある。またポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸系樹脂、またはポリカーボネイト樹脂からなる材料を、各部パターンを形成した型を用いて、ホットエンボス法により形成してもよい。
【０１１５】
作成した壁面７を基板２０と貼り合わせることによって、反応部６が規定される。
【０１１６】
壁面７を導入することにより、反応部５以外に試料液が広がることを確実に抑制することができる。
【０１１７】
〔第７実施形態〕
図９は、本発明の一実施形態（第７実施形態）に係るバイオセンサ７００の概略構成を示す上面図およびＸ−Ｙ断面図である。図１０は第７実施形態のバイオセンサの概略構造を示す斜視図である。図１０においては、作用極１等の詳細構造は省略してある。
【０１１８】
反応チャンバ８は、反応部５を囲む壁面および天井部分からなっており、反応部５を空間として規定している。さらに反応チャンバ８には、液を入れるための導入部９および液を排出するための排出部１０が形成されている。
【０１１９】
バイオセンサ７００は、基板２０上に導入部９および排出部１０を有する反応チャンバ８が形成されている点ならびに絶縁膜４が被覆されていない点以外は、実施の形態２と同様である。
【０１２０】
反応チャンバ８は、円柱状の空間として形成されているが、この形状に制限されるものではなく、反応部６の形状に応じて任意に形成することが可能である。反応チャンバ８の材料は、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックなどを用いることができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を材料として用いることよって、加工および量産が容易となる。
【０１２１】
反応チャンバ８を形成する方法は、上記壁面７を形成する方法と同様のものを用いてもよく、特に限定されない。
【０１２２】
反応チャンバ８により、空間として反応部５を規定することによって、反応部５以外へ試薬液が広がることを確実に抑制することができる。
【０１２３】
反応チャンバ８は、反応部５を空間として規定するためのものである。
【０１２４】
導入部９は、反応部５へ試料液などを導入するためのものである。
【０１２５】
排出部１０は、反応部５に導入された試料液を排出するためのものである。また、導入時には、空気穴としての役割も果たすことができる。
【０１２６】
バイオセンサ７００では、導入部９および排出部１０は、反応部５から接続して開口した円形の穴として形成されているが、液を導入できる形状であれば他の形状でもよい。
【０１２７】
また液の排出は、導入部９から行ってもよく、この場合は、排出部１０は空気穴として使用する。
【０１２８】
以下、第７実施形態に示された電気化学検出用バイオセンサを用いた分析方法について説明する。この分析方法は、実施の形態１〜６に示された電気化学検出用バイオセンサを用いた分析方法とは、試料液またはバッファー液等を反応部５へ滴下していた部分が、導入部９から液を導入し、排出部１０から排出するという点で異なるが、後は同様である。
【０１２９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲において種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３０】
〔実施例１〕
図１１は実施例１に係るバイオセンサ８００の概略構成を示す上面図である。図１１を用いて実施例１を説明する。
【０１３１】
まず、１０ｃｍ×１０ｃｍ×厚さ０．５ｍｍのガラスウェハ（コーニング社製 ＥａｇｌｅＸＧ）に作用極１、対極２、接続パッドＡ１、Ａ２およびＡ３、リード電極部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３を、フォトリソグラフィを用いて形成した。これらは全て金をスパッタすることによって形成した。作用極１は、直径２ｍｍの円形とし、対極２は作用極１を囲むような円弧状の形状に形成した。
【０１３２】
次に、同様にフォトリソグラフィを用いて、銀電極を形成した。そして極の一部を化学的に塩化銀に変化させ、銀および塩化銀からなる参照極３を形成した。
【０１３３】
ガラスウェハには図１１に示す電極基板（１ｃｍ×２ｃｍ）を複数枚形成し、ガラスカッターを用いて1枚1枚切断した。
【０１３４】
続いて、反応チャンバを作製するための型を作製した。シリコンウェハに、底面の形状が直径２．３ｍｍの円形であって、高さ４０ｕｍの型を作製した。ここにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流しこみ、焼き固めて反応チャンバを作製した。反応チャンバの両端に直径０．５ｍｍの穴をあけて、導入部９および排出部１０とした。
【０１３５】
電極基板の作用極上に形成したチオール分子による自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を介して、グルコースオキシダーゼを固定化した。
【０１３６】
反応チャンバを、グルコースオキシダーゼを固定化した基板に貼り合わせ、実施例１のバイオセンサ８００とした。
【０１３７】
この実施例１における反応チャンバによって形成される反応部の底面積と、作用極との面積比率は、０．７６となった。
【０１３８】
〔比較例１〕
反応チャンバを作製するための型において、底面の形状が直径２．８ｍｍの円形であって、高さ４０ｕｍの型を作製した。ここにＰＤＭＳを流し込み、焼き固めて反応チャンバを作製した。
【０１３９】
グルコースオキシダーゼを固定化した基板に、反応チャンバを貼り合わせ、比較例１のバイオセンサとした。
【０１４０】
この比較例１における、反応チャンバによって形成される反応部の底面積と、作用極との面積比率は、０．５１となった。
【０１４１】
（グルコースの検出）
実施例１および比較例１のバイオセンサを用いて、グルコースの検出を行った。グルコース溶液は、５０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２５０ｍｇ／ｄＬのものを調製した。
【０１４２】
反応部にグルコース溶液を入れ、１０秒後の電流値を測定した。バックグラウンド電流を補正後、時間に対して電流値をプロットし、原点との２点を結ぶ直線の傾きから初速度を求めた。
【０１４３】
面積比率０．５１の比較例１の場合、グルコース濃度と初速度とは比例しなかったが、面積比率０．７６の実施例１の場合、グルコース濃度は初速度に比例した。直線の傾きから求めた初速度が、真の初速度とほぼ等しく求めることができた。
【０１４４】
以上のことから、本発明に係るバイオセンサによれば、短時間の反応時間でも、未知濃度のグルコース測定の初速度を正確に求めることができ、ある既知濃度のグルコース測定の初速度と比較することによって、グルコースの濃度を求めることができる。
【０１４５】
〔実施例２〕
実施例１と同様に作製した電極基板の作用極上に、チオール分子による自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を介して、抗ＣＲＰ抗体を固定化した。実施例１と同様の反応チャンバを貼り合わせて、実施例２のバイオセンサとした。
【０１４６】
〔比較例２〕
実施例１と同様に作製した電極基板の作用極上に、実施例２と同様に抗ＣＲＰ抗体を固定化した。比較例１と同様の反応チャンバを貼り合わせて、比較例２のバイオセンサとした。
【０１４７】
（ＣＲＰの検出）
実施例２および比較例２のバイオセンサを用いて、ＣＲＰの検出を行った。まず、実施例２および比較例２のバイオセンサの反応部に、カゼイン溶液を入れ、３０分室温にて静置し、非特異吸着防止膜を形成した。カゼイン溶液を排出し、ＰＢＳ溶液を用いて反応部内を洗浄した。次に、反応部にＣＲＰ溶液を入れ、３分室温にて静置し、作用極上に固定化された抗体とＣＲＰとの複合体を形成した。ＣＲＰ溶液は、０．２ｍｇ／ｄＬ、２ｍｇ／ｄＬ、１０ｍｇ／ｄＬのものを使用した。ＣＲＰ溶液を排出し、反応部内を洗浄した。次に、反応部に第二の結合物質として、ＡＬＰ標識抗ＣＲＰ抗体溶液を入れ、３分室温にて静置し、固定化抗体−ＣＲＰ−ＡＬＰ標識抗体のサンドイッチ複合体を形成した。ＡＬＰとは、アルカリフォスファターゼという酵素のことである。ＡＬＰ標識抗体を排出し、反応部内を洗浄した。反応部に、ｐ−アミノフェニルリン酸塩（ｐＡＰＰ）溶液を入れ、１０秒後の電流値を測定した。バックグラウンド電流を補正後、時間に対して電流値をプロットし、原点との２点を結ぶ直線の傾きから初速度を求めた。
【０１４８】
面積比率０．５１の比較例２の場合、ＣＲＰ濃度と初速度とは比例しなかったが、面積比率０．７６の実施例２の場合、ＣＲＰ濃度は初速度に比例した。直線の傾きより求めた初速度を、真の初速度とほぼ等しく求めることができた。
【０１４９】
以上のことから、本発明を用いると、短時間の反応時間によって、未知濃度のＣＲＰ測定の初速度を正確に求めることができ、ある既知濃度のＣＲＰ測定の初速度と比較することにより、グルコースの濃度を求めることができる。
【０１５０】
なお、ＣＲＰに限ったものではなく、本発明はイムノアッセイ一般に用いることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明にかかるバイオセンサは、電気化学測定を行うことにより、検出された電流値から試料液中のターゲット物質の濃度を求めることができるため、生体、環境、医療、食品などに関する試料の分析に利用することができる。
【符号の説明】
【０１５２】
１ 作用極
２ 対極
３ 参照極
Ａ１〜Ａ３ 接続パッド
Ｂ１〜Ｂ３ リード電極部
４ 絶縁膜
５ 反応部
６ 疎水性膜
７ 壁面
８ 反応チャンバ
９ 導入部
１０ 排出部
２０ 基板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、
対極と、
該ターゲット物質を含む試料液を溜める反応部と、を備えており、
該作用極および該対極は、該反応部の底面に配置されており、
該反応部の底面において該作用極が占める割合が０．７以上であることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
上記作用極を複数備えていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
参照極をさらに備えていることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
疎水性を有する疎水性部分を備えており、
該疎水性部分が上記反応部を囲むように配置されていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
上記反応部を囲む壁面を備えていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
上記反応部を格納する反応チャンバを備えており、
該反応チャンバは、該反応チャンバ内に上記試料液を注入するための注入口と、上記反応チャンバ内の上記試料液を排出するための排出口とを備えていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
上記作用極の中心が、上記反応部の底面の中央部にあることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
上記作用極の底面の形状が、上記反応部の底面の形状と相似形であることを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
上記反応物質は、上記ターゲット物質と特異的に反応するものであることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
上記反応物質が、上記ターゲット物質の反応を触媒する酵素であることを特徴とする請求項９に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
上記結合物質は、上記ターゲット物質と特異的に結合するものであることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
上記結合物質が、上記ターゲット物質に対する抗体、または、上記ターゲット物質に特異的に結合するペプチドであることを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のバイオセンサを用いた分析方法であって、
ターゲット物質を含む試料液を、上記反応部に導入する導入工程、および
上記作用極と上記対極との間に電圧を印加することで、反応または結合した上記ターゲット物質に応じた電流値を測定する工程、を含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１】
ターゲット物質と反応し生成物を生成する反応物質、または、ターゲット物質と結合する結合物質が固定されている作用極と、
対極と、
該ターゲット物質を含む試料液を溜める反応部と、を備えており、
該作用極および該対極は、該反応部の底面に配置されており、
該反応部の底面において該作用極が占める割合が０．７以上であることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
上記作用極を複数備えていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
参照極をさらに備えていることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
疎水性を有する疎水性部分を備えており、
該疎水性部分が上記反応部を囲むように配置されていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
上記反応部を囲む壁面を備えていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
上記反応部を格納する反応チャンバを備えており、
該反応チャンバは、該反応チャンバ内に上記試料液を注入するための注入口と、上記反応チャンバ内の上記試料液を排出するための排出口とを備えていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
上記作用極の中心が、上記反応部の底面の中央部にあることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
上記作用極の底面の形状が、上記反応部の底面の形状と相似形であることを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
上記反応物質は、上記ターゲット物質と特異的に反応するものであることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
上記反応物質が、上記ターゲット物質の反応を触媒する酵素であることを特徴とする請求項９に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
上記結合物質は、上記ターゲット物質と特異的に結合するものであることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
上記結合物質が、上記ターゲット物質に対する抗体、または、上記ターゲット物質に特異的に結合するペプチドであることを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のバイオセンサを用いた分析方法であって、
ターゲット物質を含む試料液を、上記反応部に導入する導入工程、および
上記作用極と上記対極との間に電圧を印加することで、反応または結合した上記ターゲット物質に応じた電流値を測定する工程、を含むことを特徴とする分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−２４２３６６（Ｐ２０１２−２４２３６６Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１６２１１（Ｐ２０１１−１１６２１１）
【出願日】平成２３年５月２４日（２０１１．５．２４）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２４日（２０１１．５．２４）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
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