バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの製造方法、並びに当該方法を行なうためのキット
【課題】 本発明の目的は、バイオディーゼル廃液の有効利用方法として、バイオディ−ゼル廃液から簡便かつ効率的に水素およびエタノールを生産する方法、並びに当該方法を行なうためのキットを提供することにある。
【解決手段】 バイオディーゼル廃液を含む原料液は、原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。発酵槽２内の原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵され水素およびエタノールを生産する。エタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。発酵槽２内の温度は発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内を循環する恒温水によって、一定に保たれている。
【解決手段】 バイオディーゼル廃液を含む原料液は、原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。発酵槽２内の原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵され水素およびエタノールを生産する。エタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。発酵槽２内の温度は発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内を循環する恒温水によって、一定に保たれている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性油脂、動物性油脂、廃油等の油脂をメチルエステル化してバイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られる、いわゆるバイオディーゼル廃液の有効利用方法として、当該バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造する方法、並びに当該方法を行なうために用いられるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物性油脂、動物性油脂、および廃油等の油脂をリパーゼの存在下でメタノールと反応（メタノリシス反応）させることにより得られる脂肪酸メチルエステルは、バイオディーゼル燃料と呼ばれ、軽油の代替燃料として注目されている。かかるバイオディーゼル燃料中には、(1)ほとんど硫黄分が含まれていないために酸性雨の原因となる硫黄酸化物（ＳＯｘ）が発生しないこと、(2)炭素および水素以外に酸素が含まれているため軽油に比べて黒煙発生が少なく排気ガスが清浄化すること等の理由から、環境負荷の少ない燃料として特に期待されている。かかるバイオディーゼル燃料は軽油に比べると若干発熱量が低いという物性を有しているが、自動車に適用した場合においてその走行にはほとんど影響が無いということが確認されている。さらには、動粘度が５．６ｍ２/ｓec、引火点が１３５〜１４５℃であり、その性状も軽油と類似しているため、軽油の強制規格基準をほぼ満足している（非特許文献１参照）。かかるバイオディーゼル燃料の製造方法については、各所において開発研究が進められており、種々報告されている（例えば非特許文献２〜５、特許文献１参照）。
【０００３】
一方、上記バイオディーゼル燃料を生産する際には、以下の反応式（式Ｉ）に示すように副生成物としてグリセロールが生成される。
【０００４】
【化１】
【０００５】
（式中Ｒ１〜Ｒ３はアルキル基を示す）
上記反応式に示す生成物のうち、脂肪酸メチルエステルについては、既述のごとくバイオディーゼル燃料として有効に利用可能であるが、その残渣のグリセロールについては特に用途が無く、廃棄されているのが現状である。
【０００６】
上記現状に鑑みて、廃棄物であるグリセロールを含む廃液の有効利用を行なうべく、上記廃液から水素を回収する方法の開発が試みられている。例えば、特許文献２においては副生成物であるグリセロールを加熱気化させて水素ガスを発生させ回収する装置について記載されている。
【０００７】
一方、通性嫌気性細菌エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）は、グルコース等から水素を発酵生産することが知られている（非特許文献６参照）。本発明者らは、独自に分離したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株の各種炭化水素に対する水素生産量について検討したところ、グリセロールを基質として発酵させた時に、最大の水素生産量が得られることを確認した（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】福田 秀樹、「クリーンエネルギー（バイオディーゼル燃料）」日本農芸化学会シンポジウム：２００２.３、ｐ３５８
【非特許文献２】吉川 浩ら、「超臨界メタノールによる植物油からのバイオディーゼル燃料の製造」高圧討論会講演要旨集、ＶＯＬ．４２ｎｄ、ｐ１０９（２００１）
【非特許文献３】渡辺 嘉ら、「固定相型バイオリアクターを用いた廃食用油のバイオディーゼル燃料への連続変換」、酵素工学研究会講演会講演要旨集、ＶＯＬ．４６ｔｈ、ｐ４２（２００１）
【非特許文献４】FUKUDA H, KONDO A, NODA H,”Biodiesel Fuel Production by Transesterification of Oils” J Biosci Bioeng, VOL. 92, NO.5, p405-416(2001)
【非特許文献５】SAKA S, KUSDIANA D,「超臨界メタノールを利用した植物油廃棄物からバイオディーゼル燃料の生産」、資源処理技術、ＶＯＬ．４７、ＮＯ．２、ｐ９５−１０２
【非特許文献６】谷生 重晴ら、「Enterobacter aerogenes の発酵水素発生と利用基質について」、醗酵工学会誌、第６７巻、第１号、ｐ２９−３４、１９８９
【非特許文献７】Y.Nakashimada, M.A.Racman, T. kakizono, N. Nishio,”Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states” International Jounal of Hydorogen Energy 27(2002),1399-1405
【特許文献１】特開２００２−２３３９３号公報（公開日：平成１４年８月２０日）
【特許文献２】特開２００４−２０９４１５号公報（公開日：平成１６年７月２９日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のごとく、バイオディーゼル燃料の製造の副生成物であるグリセロールを含む廃液（以下、バイオディーゼル廃液という）の有効利用法の開発が求められている。しかしながら現在バイオディーゼル廃液の有効な利用方法が開発されていないのが現状である。上記例示した特許文献２に開示されている方法はバイオディーゼル廃液を加熱気化させて水素を回収しているが、加熱気化させるためには相当量の熱量を必要とし、設備面、コスト面、技術面において多くの課題を有している。
【０００９】
そこで本発明の目的は、バイオディーゼル廃液の有効利用方法として、バイオディ−ゼル廃液から簡便かつ効率的に水素およびエタノールを生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記非特許文献７に記載されている通り、Enterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)で、グリセロールを発酵させることによって水素を生産できるということは知られている。本発明者らの検討によれば、カラム型リアクターを用い、Enterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)による市販グリセロール１０（g/l）を使用した連続培養においては、多孔質担体を使用しない場合であっても、菌体はフロック状となりリアクター底部に高密度に堆積し、水素生産速度は８０（mmol/l/h）に達した（後述する図６参照）。一方、バイオディーゼル廃液をグリセロール濃度が１０（g/l）になるように希釈し、同条件で連続培養を行った場合、菌体のリアクター内での堆積量が市販グリセロールの場合と比較して明らかに少なく、最大水素生産速度は３０（mmol/l/h）と極端に低くなった（後述する図５参照）。これは、市販グリセロール（純グリセロール）を原料とした場合Enterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)は水素を効率良く生産することができるが、バイオディーゼル廃液を原料とした場合は、水素を効率良く生産することができないということを示している。よって、バイオディーゼル廃液を原料としてEnterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)で発酵し、水素を生産することは、バイオディーゼル廃液の有効利用法とはいえない。
【００１１】
鋭意検討の結果、本発明者等は、バイオディーゼル廃液を原料とした場合であっても、微生物を固定可能な多孔質担体を用いることにより、リアクター内の菌体堆積量が著しく上昇し、水素生産速度が６０（mmol/l/h）に著しく向上するという新規知見を得た（後述する図４参照）。このことから、担体（より好ましくは、多孔質担体）の利用が、バイオディーゼル廃液利用の効率化において必要不可欠であることがわかった。
【００１２】
本発明は、上記新規知見に基づきを完成されたものである。すなわち本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、少なくとも表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴としている。
【００１３】
上記バイオディーゼル廃液は、その大部分がグリセロールである。エンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、そのグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。また本発明の構成に含まれる上記担体は、少なくともその表面に微生物を固定可能である。よって当該担体が存在する条件下、バイオディーゼル廃液を含む原料液中でエンテロバクター（Enterobacter）属細菌を培養すれば、該担体に固定化される。担体に固定化されたエンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、前記原料液中に浮遊することなく生育することができる。よって、発酵槽内の菌体密度を著しく向上させるとともに、原料液中に含まれるグリセロールとエンテロバクター（Enterobacter）属細菌との接触頻度も向上する。さらには、増殖したエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が発酵槽からオーバーフローすることを効果的に防止することができる。それゆえ本発明の上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を従来法に比して格段に向上させることが可能となるという効果を奏する。
【００１４】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）からなる細菌群から選ばれる少なくとも１つ以上の細菌であってもよい。
【００１５】
上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）は、グリセロールまたはグルコースからの水素生産能が高い種である。それゆえ、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法において、さらに水素生産量を向上させることができるという効果を奏する。
【００１６】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１であってもよい。
【００１７】
上記、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１は、本発明者らが自然界からグルコースからの水素生産菌として独自に分離してきた株であり、検討の結果、特にグリセロールからの水素生産能が高い株である。それゆえ、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法において、さらに水素生産量を向上させることができるという効果を奏する。
【００１８】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体が、多孔質であってもよい。
【００１９】
上記のごとく担体が多孔質であることによって、当該担体上に固定化される微生物の量を増加させることができ、水素およびエタノールの生産量をさらに向上させることが可能となる。
【００２０】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体が、粒子状であってもよい。
【００２１】
上記担体は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるために、上記担体は、表面積が大きく、さらに発酵槽への充填率を高くできる粒子状であることが好ましいといえる。
【００２２】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体の平均粒子径が、３ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であってもよい。
【００２３】
上記担体は、既述の通り少なくともその表面に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体の粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上、２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００２４】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体が、貫通孔を有する多孔質担体であってもよい。
【００２５】
エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が多孔質担体と接触する際に、当該多孔質担体の貫通孔を通過することができ、多孔質担体のさらに内部までエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が入り込むことができる。それゆえ、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００２６】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記発酵工程が、連続培養により行なわれる構成であってもよい。
【００２７】
連続培養は、連続培養は原料液の流入と、発酵液の流出を連続的に行なう培養法であるため、水素およびエタノールの生産を連続的に行なうことができるという効果を奏する。また新しい原料液を流入するために発酵液中に生産されるエタノールが希釈されることとなる。エタノールは微生物を死滅させるものであるため、発酵液中にこれが蓄積するとエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が死滅し、水素およびエタノールの生産が継続できなくなる。上記構成によれば、エタノールを原料液によって希釈することができるため、エタノールによるエンテロバクター（Enterobacter）属細菌の死滅を防止し、水素およびエタノールの生産を長期間継続して行なうことができるという効果を奏する。
【００２８】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記原料液が、酵母抽出物およびカゼイン酵素分解物を含むものであってもよい。
【００２９】
上記酵母抽出物およびカゼイン酵素分解物は、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育、増殖を向上させることができる。それゆえ、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の発酵力がさらに増加し、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００３０】
一方、本発明にかかるキットは、上記課題を解決するために、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行なうためのキットであって、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体、およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が含まれることを特徴としている。
【００３１】
上記本発明にかかるキットによれば、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く、且つ簡便に生産することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００３２】
上記のごとく本発明によれば、グリセロールを多量に含んでいるにも関わらず、これまで有効な処理方法が無かったために、廃棄物としていたバイオディーゼル廃液から、水素およびエタノールを微生物による発酵技術によって簡便かつ効率的に回収する方法を提供すことが可能となった。水素は燃料電池用の燃料としてその利用が期待されており、またエタノールも燃料、溶媒として広範囲に利用されているものである。よって本発明は、植物製油脂、動物性油脂を始めとするバイオマスを無駄にすることなく、有効に利用することができる方法および手段を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞
本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法（以下「本発明の製造方法」という。）は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、少なくとも表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴としている。以下、構成ごとに分けて具体的に説明する。
【００３５】
（バイオディーゼル廃液）
本発明の製造方法の原料液を構成するバイオディーゼル廃液は、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られるグリセロールを多量に含むものである。バイオディーゼル燃料の製造原理は、既述の式Ｉに示す反応式に示すようにして行なわれる。より具体的には、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステルおよびグリセロールが生成する。この生成したメチルエステルがバイオディーゼル燃料であり、この反応液からメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去したものがバイオディーゼル廃液である。
【００３６】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法（非特許文献２、５参照）等を用いて行なうことができる。
【００３７】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂またはその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。試薬グレードの油脂を用いた場合には、メチルエステル化後の反応液中に含まれる不純物が少なく、バイオディーゼル燃料の回収が容易であること、バイオディーゼル廃液をエンテロバクター(Enterobacter)属細菌によって発酵させる際の効率が高いという理由から、純度の高い油脂を用いることが好ましいといえる。
【００３８】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。上記のようにしてメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を反応液中から除去した残渣、本発明の製造方法において利用するバイオディーゼル廃液である。
【００３９】
かかるバイオディーゼル廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。バイオディーゼル燃料の製造に用いる油脂に含まれる成分によって異なるが、バイオディーゼル廃液にはその他、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。
【００４０】
（原料液）
本発明の製造方法に用いる上記原料液は、上記バイオディーゼル廃液が含まれていれば特に限定されるものではなく、バイオディーゼル廃液そのものを原料液として用いても良く、また適宜、水等の溶媒を添加し原料液として用いてもよい。上記溶媒の添加率（換言すれば希釈率）は特に限定されるものではなく、後に行なうエンテロバクター(Enterobacter)属細菌による発酵工程に用いる原料液として好適なものとなるように適宜検討の上、決定すればよい。
【００４１】
本発明者らは、原料液中に含まれるグリセロール濃度が高くなれば、目的とする水素およびエタノールの生産量が下がり、副生成物（乳酸、酢酸量、１，３−プロパンジオール等）が増加することを確かめている。なお原料液中に含まれるグリセロール濃度として好ましい範囲は、１．７(g/l)以上５０(g/l)以下が好ましく、５(g/l)以上１０(g/l)以下がさらに好ましい。したがって、上記のバイオディーゼル廃液の希釈率は、原料液中に含まれるグリセロール濃度が上記好ましい範囲になることを指標に決定すればよい。
【００４２】
またその他、微生物（エンテロバクター(Enterobacter)属細菌）の生育に必要な培地成分が含まれていてもよい。当該培地成分が含まれることによって、微生物（エンテロバクター(Enterobacter)属細菌）の生育・増殖が活発になり、バイオディーゼル廃液からの水素・およびエタノールの発酵生産効率がさらに向上する。
【００４３】
上記培地成分としては、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌の培養に好適なものを適宜選択の上、添加すればよい。特に、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物は、一般に微生物用培地に用いられている成分であり、本発明に用いる培地成分としては好適である。後述する実施例において示すように、本発明者らは、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物をバイオディーゼル廃液に添加した場合において、水素およびエタノールの生産量が向上することを確認している。
【００４４】
なお、酵母抽出液（別名：イーストエキス、酵母エキス）とは、ビール酵母（Saccharomyces Cerevisiae ）等の酵母の内容物を抽出したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、粉末酵母エキスＳ（日本製薬株式会社製）、Yeast Extract, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記酵母抽出物の添加量としては、原料液に０．０５重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．５重量％以下がさらに好ましい。
【００４５】
また、上記カゼイン酵素分解物とは、牛乳カゼイン等のカゼインをペプシン、トリプシン等のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、Trypton, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記カゼイン酵素分解物の添加量としては、原料液に０．１重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．０５重量％以下がさらに好ましい。
【００４６】
その他の培地成分としては、（ＮＨ４）２ＳＯ４，ＭｇＳＯ４、Ｃｏ（ＮＯ３）２、Ｆｅ（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４，ＣａＣｌ２，Ｎａ２ＳｅＯ３，ニコチン酸、ＮｉＣｌ２、その他ビタミン類等をミネラルとして添加してもよい。また、バッファー成分として、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等が含まれていてもよい。また微量元素としてＭｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＡｌＫ（ＳＯ４）、ＣｕＣｌ２、ＥＤＴＡ等が含まれていてもよい。上記化合物は市販されているものを使用することができる。
【００４７】
（微生物）
本発明の製造方法における発酵工程に用いる微生物は、通性嫌気性細菌のエンテロバクター(Enterobacter)属細菌である。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路について図１に示す。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、ブドウ糖などの解糖系で得られた余剰なＮＡＤＨを２,３−ブタンジオール、エタノール、乳酸および酢酸などに配分することにより還元当量のバランスを保つ、いわゆる混合有機酸発酵を行なって生育する。この中で水素（図１中、Ｈ２）は、以下の経路によって生成される。(1)エタノール（図１中、Ethanol）および酢酸（図１中、Acetate）生成の中間生成物であるピルビン酸（図１中、Pyruvate）がアセチルＣｏＡ（図１中、Acetyl-CoA）へと代謝される際に、ピルビン酸−ギ酸リアーゼによりギ酸（図１中、Formate）が生成される。(2)当該ギ酸（図１中、Formate）からヒドロゲナーゼの作用により水素（図１中、Ｈ２）が生成される。
【００４８】
よって、本発明の製造方法にエンテロバクター(Enterobacter)属細菌を用いることによって、バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。
【００４９】
本発明者らは、このエンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロール代謝経路に着目し、上記各種エンテロバクター(Enterobacter)属細菌について、グルコースからの水素生産能を検討した。その結果、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）等が水素生産能を有していることを確認した。エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）としては、例えば、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＩＦＯ８０２）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＪＣＭ１２３５）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０）が利用可能である。
【００５０】
なお、上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）は、本発明者らがグルコースからの水素生産菌として独自に分離した新菌株であり、独立行政法人 製品評価技術基盤機構において、ＮＢＲＣ１０００４８、Enterobacter aerogenes （ＨＵ１０１）として寄託されている（寄託日：平成１５年３月２４日）。
【００５１】
またエンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）としては、例えばエンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４）が利用可能である。
【００５２】
またエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）としては、例えばエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae ＪＣＭ１２３２）が利用可能である。
【００５３】
またエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）としては、例えばエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ＪＣＭ１２３３）が利用可能である。
【００５４】
なお上記エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、上記に掲げた菌株に限られるものではなく、グリセロールまたはグルコースから水素生産能を有する菌株であれば全て利用可能である。また、本発明における発酵工程では、上記で掲げた種々のエンテロバクター(Enterobacter)属細菌からなる細菌群から選ばれる１菌株を用いて発酵工程を行なってもよいし、２菌株以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
（発酵工程）
本発明にかかる製造方法は、既述の原料液を、少なくとも表面に微生物を固定可能な担体、より好ましくは多孔質担体の存在下で、上記エンテロバクター(Enterobacter)属細菌によって発酵させる発酵工程を含んでいる。かかる発酵工程は、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌が原料液から水素およびエタノールを発酵生産する工程である。その発酵条件としては、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌が水素およびエタノールを発酵生産する条件として好ましい条件であれば特に限定されるものではなく、その発酵方法は連続培養であっても回分培養（バッチ培養）であってもよい。回分培養は、発酵槽に原料と微生物を仕込み発酵終了後に発酵液を抜き出すという培養方法であり、連続培養は微生物を固定化等により発酵槽の中に閉じ込め、原料の流入と発酵液の流出を連続的に行なう培養方法である。連続培養は、長期間連続的に発酵することにより、発酵槽の単位体積あたりの生産性が回分培養に比して高いというメリットがあるためにより好ましいといえる。
【００５６】
また本発明における発酵工程は、通気培養であっても、静置培養であってもよい。ただし、通気培養では増殖にエネルギーを使うために目的とする水素およびエタノールの発酵生産の効率が下がる。よって、静置培養の方が好ましいといえる。
【００５７】
また培養温度についてはエンテロバクター(Enterobacter)属細菌の生育に好適な条件を採用すれば良く、２８℃〜４０℃が好ましく、３０℃〜３７℃がさらに好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００５８】
原料の流入と発酵液の流出を行なう連続培養では、その発酵液の流出の際に微生物が一緒に流出することを防止する必要がある。このために微生物の固定化等を行なって、発酵槽からの流出を防いでいる。上記微生物の流出を防ぐ方法としては、固定化担体を用いて発酵槽内に微生物を固定化してもよいし、特に固定化担体を用いることなく増殖した微生物同士が自己凝集体（フロック）を形成して発酵槽内に留まるという方法であってもよい。ただし、固定化担体の自重により固定化担体に固定化された微生物が発酵液の表層に浮遊することがなく、確実に発酵槽内に留まることができるということ、浮遊することが無いために原料液と微生物が接触する頻度が高まり発酵生産効率が向上すること、および発酵槽内の微生物の菌体密度を向上させることができる等の理由から、固定化担体を用いる方法が好ましいといえる。
【００５９】
本発明の製造方法においても、上記の理由から発酵工程において、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体を用いている。上記担体としては、少なくともその表面に、（より好ましくは、その表面および内部に）微生物を固定することが可能な担体であれば限定されるものではない。ただし、微生物が固定化しやすく、その微生物の固定量が増加するという理由から、上記担体は多孔質であることが好ましい。上記多孔質である担体（以下、「多孔質担体」という）は、文字通りその表面に多数の孔があり、その孔内部および表面に微生物、すなわちエンテロバクター(Enterobacter)属細菌が吸着し、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌を固定化することができる。
【００６０】
担体（より好ましくは多孔質担体）にエンテロバクター(Enterobacter)属細菌を固定化する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば発酵槽内に原料液と担体（より好ましくは多孔質担体）を仕込み、そこにエンテロバクター(Enterobacter)属細菌を接種し培養する方法が挙げられる。すなわち特に、固定化操作を別途行なうのではなく、発酵工程によって増殖してきたエンテロバクター(Enterobacter)属細菌の培養液が担体（より好ましくは多孔質担体）と接触することにより、その表面および内部に固定化されるという方法である。なお、本発明の製造方法の発酵工程とは別に、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌を培養し、担体（より好ましくは多孔質担体）に固定化するという操作を行ない、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌が固定化された担体（より好ましくは多孔質担体）を発酵工程に導入するというものであってもよい。
【００６１】
本発明の製造方法において使用する上記多孔質担体は、特に限定されるものではなく、連続培養用に市販されている固定化担体を適宜利用可能である。例えば、ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【００６２】
なお本発明に使用する担体（より好ましくは多孔質担体）は、粒子状であることが好ましく、その平均粒子径が３ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることが好ましい。上記担体（より好ましくは多孔質担体）は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体（より好ましくは多孔質担体）は粒子状であり、その粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体（より好ましくは多孔質担体）の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえ、３ｍｍ以上１０ｍｍ以下にすることがさらに好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体（より好ましくは多孔質担体）を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００６３】
また本発明の製造方法は、上記多孔質担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることが好ましい。多孔質担体に貫通孔がない場合、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の培養液が、多孔質体の孔の内部まで入り込むことができないのに対し、多孔質担体に貫通孔がある場合は、当該多孔質担体の貫通孔をエンテロバクター（Enterobacter）属細菌の培養液が通過することができ、多孔質担体のさらに内部までエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が入り込むことができる。それゆえ、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。上記貫通孔を有する多孔質担体は、既述のナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【００６４】
なお使用する担体の材質は、特に限定されるものではなく、例えばレンガ様の素焼き材；セラミックス、ポリビニルアルコール等の高分子材料；木材チップ、セルロース等の生体高分子化合物が利用可能である。
【００６５】
本発明の製造方法に使用する培養装置は、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図２に連続培養を行なうための連続培養装置の模式図を示す。連続培養装置１は、発酵槽２、恒温ジャケット３、恒温水流出孔３ａ、恒温水流入孔３ｂ、恒温水槽３ｃ、細菌固定化多孔質担体４、原料液流入孔５、発酵液流出孔６、原料液タンク７、ポンプ８、排気口９、ガス回収槽１０とからなっている。
【００６６】
原料液は原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵する。発酵後のエタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。なお発酵槽２内の温度は、発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内に恒温水槽３ｃから供給される恒温水によって、一定に保たれている。恒温水は、恒温水槽３ｃから恒温水流入孔３ｂを通って恒温ジャケット３内に供給され、恒温水流出孔３ａから再び恒温水槽３ｃに戻るという要領により循環している。
【００６７】
上記の連続培養において、発酵槽２内への原料液の供給量（以下、原料液希釈率という）の好適な条件は、用いる原料液の組成，多孔質担体の種類，エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の状態，培養条件等によって異なるために、限定されるものではないが、０．６ｈ−１以上１．２ｈ−１以下が好ましく、０．７ｈ−１以上１．２ｈ−１以下がさらに好ましい。上記好ましい範囲以上の希釈率で原料液を供給すると、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の発酵能力を原料供給量が上まり、十分発酵していないにもかかわらず発酵槽２外へ流出してしまう状態となり、発酵効率が下がり、水素およびエタノールの回収量が少なくなってしまう。一方、上記好ましい範囲以下の希釈率で原料液を供給すると、発酵は十分に進むが生成物であるエタノール等によって菌体が死滅したり、雑菌の汚染の危険性が高くなるために好ましくない。なお「希釈率」とは、１時間当たりに供給される原料液量の全原料液量に対する割合のことである。
【００６８】
（その他の工程）
本発明にかかる製造方法は、上記発酵工程のほかに、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌を予め増殖させておく前培養工程、多孔質担体に予めエンテロバクター（Enterobacter）属細菌を固定化しておく固定化工程、生成した水素またはエタノールを精製する精製工程、生成した水素またはエタノールをガスクロマトグラフィー等で分析する工程、バイオディーゼル燃料の製造工程等の工程が含まれていてもよい。
【００６９】
＜２.本発明にかかるキット＞
本発明にかかるキットは、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行なうためのキットであって、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体、およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が含まれることを特徴としている。
【００７０】
本発明にかかるキットに含まれる担体は、特に限定されるものではなく、上記＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞の項において説明した種々の担体を適宜選択の上、適用すればよい。
【００７１】
また本発明にかかるキットに含まれるエンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、特に限定されるものではなく、上記＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞の項において説明した各種細菌を適宜選択の上、適用すればよい。
【００７２】
上記のほか、本発明にかかるキットには、上記＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞の項において説明した説示したバイオリアクター（培養装置）が含まれていてもよく、さらにエンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育・増殖に利用される成分として酵母抽出液、カゼイン酵素分解物、ビタミン類、バッファー成分、および微量元素等が含まれていてもよい。
【００７３】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７４】
〔実施例１〕エンテロバクター(Enterobacter)属細菌の水素生産能の検討
各種エンテロバクター(Enterobacter)属細菌についてグルコースからの水素生産能を比較検討することにした。
【００７５】
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＩＦＯ８０２）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＪＣＭ１２３５）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）
エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４）
エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae ＪＣＭ１２３２）
エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ＪＣＭ１２３３）
エンテロバクター・アスブリエ（Enterobacter asburiae ＪＣＭ６０５１）
エンテロバクター・カンセロゲヌス（Enterobacter cancerogenus ＪＣＭ３９４３）
エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans ＪＣＭ１２３６）
エンテロバクター・アムンルゲヌス（Enterobacter amnlgenus ＪＣＭ１２３７）
エンテロバクター・インテルメドラス（Enterobacter intermedlus ＪＣＭ１２３８）
（培地・培養方法）
表１に示す培地を用いた。表1に示す培地成分は全て和光純薬工業株式会社から購入したものを使用した。
【００７６】
【表１】
【００７７】
なお培養は、初発ｐＨ６．８、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【００７８】
（水素測定法）
水素の生産量の測定は、ガスクロマトグラフィー（株式会社島津製作所製、ＧＣ８Ａ）にて行なった。具体的には、『Nishio N, Eguchi SY, Kawashima H, Nagai S. “Mutual conversion between H2 plus CO2 and formate by a formate-utilizing methanogen.”J Ferment Technol, 1983; 61(6):557-61』の記載に準じて行なった。
【００７９】
（結果）
表２に結果を示す。なお表２には、グルコースの消費量(mM)、水素生成量（Ｈ２（mM））、および水素収率（Ｈ２収率（mol/mol-glucose））を示した。水素収率（Ｈ２収率（mol/mol-glucose））とは、グルコース１モルから得られる水素のモル数である。
【００８０】
【表２】
【００８１】
上記表２によれば、Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素生産量が０．６８（mol/mol-glucose）、Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４の水素生産量が０．７１（mol/mol-glucose）であり、本実施例において検討したエンテロバクター(Enterobacter)属細菌の中で、最も水素生産能が高い株であるということが分かった。
【００８２】
またエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＩＦＯ８０２）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＪＣＭ１２３５）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae ＪＣＭ１２３２）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ＪＣＭ１２３３）については、約０.４〜０．５（mol/mol-glucose）と比較的水素生産量の高いものであった。
【００８３】
上記検討では、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に属する細菌は、いずれも水素生産量が比較的高く（０．４〜０．７（mol/mol-glucose））、水素生産菌として好適な属であるということが分かった。
【００８４】
〔実施例２〕各種炭素源に対するEnterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産量
（培地・培養方法）
表１におけるグルコースを各種炭素源（フルクトース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール）に置き換えた各培地を作製した。
【００８５】
培養方法は実施例１に準じて行なった。
【００８６】
（菌株）
上記実施例１において、高い水素生産能を示したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【００８７】
（分析方法）
エタノールの測定は、ＨＰＬＣを用いて行なった。なお測定方法は、Fukuzaki S, Chang Y-J, Nishio N, Nagai S.”Characteristics of granular metanogenic sludge grown on lactate in a UASB reactor” J Ferment Bioeng, 1991;72(6):465-72 の記載に準じた。
【００８８】
水素の測定は実施例１に準じて行なった。
【００８９】
（結果）
各発酵液から回収した水素およびエタノールの収率を表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表３の結果によれば、Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１は、グリセロールを炭素源として用いた場合において、最も高い水素収率（６．６９mmol/g-substrate）およびエタノール収率（７．０５mmol/g-substrate）を示した。よって、Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１による水素およびエタノールの発酵生産の炭素源としては、グリセロールが最適であるということが分かった。
【００９２】
〔実施例３〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討１：グリセロール濃度の検討
（菌株）
上記実施例１において、高い水素生産能を示したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【００９３】
（培地）
表１に示す培地のグルコースをグリセロールに置き換えた培地を用いた。なお、グリセロール濃度は、５．０(g/l)、１０(g/l)、２５(g/l)、５０(g/l)となるように調整した。
【００９４】
（培養方法）
３７℃、静置条件で回分培養を行なった。
【００９５】
（分析方法）
水素の測定は実施例１に記載の方法と同様にした。
【００９６】
エタノール、１，３−プロパンジオール、乳酸、酢酸、ギ酸は、ＨＰＬＣにより測定した（Fukuzaki S, Chang Y-J, Nishio N, Nagai S.”Characteristics of granular metanogenic sludge grown on lactate in a UASB reactor” J Ferment Bioeng, 1991;72(6):465-72 参照）。
【００９７】
（結果）
表４には、各種グリセロール濃度の培地を用いた場合の、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでに生産した全水素（Ｈ２）量、全エタノール（Ethanol）量、全乳酸(Lactate)量、全酢酸(Acetate)量、全１，３−プロパンジオール(1,3-Propanediol)量、全ギ酸(Formate)量から計算した炭素源（グリセロール）当りの収率を示した。なお表４中の「Consumption time(hr)」は、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでの時間を示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
表４の結果より、グリセロール濃度が高くなるにつれて、水素およびエタノール生産量が減少していた。一方、グリセロール濃度が高くなるにつれて、副生成物である乳酸、酢酸量、１，３−プロパンジオールが増加していた。よって、培地（原料液）中に含まれるグリセロール濃度は、１０(g/l)以下であることが好ましいということが分かった。
【０１００】
〔実施例４〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討２：塩濃度の検討
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１０１】
（培地・培養方法）
表１に示す培地からYeast extract（酵母抽出物）およびTrypton（カゼイン酵素分解物）を除き、グルコースをグリセロールに置き換え、さらにＮａＣｌを０（％）、０．５（％）、１（％）、３（％）となるように調整した培地をそれぞれ用いた。
【０１０２】
培養方法は、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【０１０３】
（結果）
表５に結果を示す。表５には水素生産量（Ｈ２ (mM)）、および残存グリセロール濃度（(Residual Glycerol(mM))を示した。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
表５によればＮａＣｌ濃度が、高くなるにつれて、残存グリセロール濃度が高くなるとともに水素生産量が減少しているということが分かった。したがって原料液中に含まれるＮａＣｌ濃度は低いほどよいということがいえる。
【０１０６】
〔実施例５〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討３：窒素源濃度の検討
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１０７】
（培地・培養方法）
表１に示す培地からYeast extract（酵母抽出物）およびTrypton（カゼイン酵素分解物）を除き、グルコースをグリセロールに置き換え、さらに（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．１（g/l）、１(g/l)、５(g/l)、１０(g/l)となるように調整した培地をそれぞれ用いた。
【０１０８】
培養方法は、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【０１０９】
（結果）
表６に結果を示す。表６には水素生産量（Ｈ２ (mM)）、および残存グリセロール濃度（(Residual Glycerol(mM))を示した。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
表６によれば（ＮＨ４）２ＳＯ４が１(g/l)の濃度の時に水素生産量が最大となり、残存グリセロール濃度が最小となった。よって、窒素源として原料液中に含まれる（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は１(g/l)含まれていることが好ましいということが分かった。
【０１１２】
〔実施例６〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討３：マグネシウムイオン濃度の検討
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１１３】
（培地・培養方法）
表１に示す培地からYeast extract（酵母抽出物）およびTrypton（カゼイン酵素分解物）を除き、グルコースをグリセロールに置き換え、さらにＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．２５（g/l）、０．５(g/l)、１(g/l)となるように調整した培地をそれぞれ用いた。
【０１１４】
培養方法は、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【０１１５】
（結果）
表７に結果を示す。表７には水素生産量（Ｈ２ (mM)）、および残存グリセロール濃度（(Residual Glycerol(mM))を示した。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
表７によればＭｇＳＯ４が０．２５(g/l)の濃度の時に水素生産量が最大となり、残存グリセロール濃度が最小となった。よって、Ｍｇイオン供給源として原料液中に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は０．２５(g/l)含まれていることが好ましいということが分かった。
【０１１８】
〔実施例７〕バイオディーゼル廃液を用いたEnterobacter aerogenes ＨＵ１０１による水素およびエタノールの発酵生産
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１１９】
（原料液（培地））
以下表８に示す組成のバイオディーゼル廃液に、表１に示す成分のうちグルコースを除く成分を加えて調製した原料液（以下、「複合原料液」という）、または表１に示す成分のうちグルコース、Trypton（カゼイン酵素消化物）、およびYeast extract（酵母抽出物）を除く成分を加えて調製した原料液（以下、「合成原料液」という）を培地として用いた。
【０１２０】
なお、バイオディーゼル廃液の希釈率の違いによって、原料液に含まれるグリセロール濃度が、それぞれ１．７(g/l)、３．３(g/l)、１０(g/l)となった原料液を用いて試験を行なった。
【０１２１】
【表８】
【０１２２】
（培養方法）
３７℃、静置条件で回分培養を行なった。
【０１２３】
（分析方法）
上記実施例に準じて行なった。
【０１２４】
（結果）
表９には、各種グリセロール濃度の培地を用いた場合の、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでに生産した全水素（Ｈ２）量、全エタノール（Ethanol）量、全乳酸(Lactate)量、全酢酸(Acetate)量、全１，３−プロパンジオール(1,3-Propanediol)量、全ギ酸(Formate)量から計算した炭素源（グリセロール）当りの収率を示した。なお表８中の「Consumption time(hr)」は、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでの時間を示す。
【０１２５】
【表９】
【０１２６】
また表９中「with medium」は「複合原料液」の結果を示し、「without medium」は、「合成原料液」の結果を示す。
【０１２７】
表９によれば、グリセロール濃度が最も低い１．７（g/l）の場合が、最大の水素およびエタノールの収率を示し、またこの時、副生成物である乳酸(Lactate)、酢酸(Acetate)、１，３−プロパンジオール(1,3-Propanediol)、ギ酸(Formate)の収率が最も低いということが分かった。さらにはグリセロールを消費するまでの時間が早いということが分かった。これは実施例３を再現する結果であり、バイオディーゼル廃液を含む原料液を用いた場合であってもグリセロール濃度が低いほど、効率良くかつ高純度に水素およびエタノールを生産することができるということがわかった。
【０１２８】
また、図３にグリセロール濃度が１０（g/l）の複合原料液（図３（ａ）に示す）、および合成原料液（図３（ｂ）に示す）の場合の各種成分の経時変化を示した。図３中黒丸のシンボルはグリセロールの消費率を示す結果を示し、黒ひし形のシンボルはエタノールの生産量を示し、白丸のシンボルは水素の生産量を示し、白ひし形のシンボルは１，３−プロパンジオールの生産量を示し、白三角のシンボルは乳酸の生産量を示し、アスタリスクのシンボルがギ酸の生産量を示し、黒三角のシンボルは酢酸の生産量を示している。
【０１２９】
図３および上記表８の結果から、合成原料液に比べて複合原料が明らかに、水素およびエタノールの収率が高く、また発酵速度が速いということが分かった。したがって、原料液にはYeast extract（酵母抽出物）、Tripton（カゼイン酵素分解物）が含まれていることが好ましいということがいえる。
【０１３０】
〔実施例８〕連続培養による水素およびエタノール発酵生産
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１３１】
（装置）
連続培養装置は、自作のガラス製カラム型リアクター（直径２．７ｃｍ×高さ１７ｃｍ、容量６０ｍｌ）。その概略は図２に示すとおりである。
【０１３２】
（原料液（培地））
実施例７において調製した複合原料液（グリセロール濃度１０g/l）、または表１に示す培地のグルコースをグリセロール（グリセロール濃度１０g/l）に置き換えた培地（以下、「グリセロール原料液」という）を用いた。
【０１３３】
（培養方法）
培養温度３７℃で連続培養を行なった。また培養液の希釈率は０．１ｈ−１〜１．６ｈ−１の間で適宜変更して各々試験を行なった。
【０１３４】
発酵槽内には、多孔質担体として発泡錬石（ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP3平均粒子径１０ｍｍ）を導入して培養を行なった。なお比較として上記発泡錬石を導入せずに培養を行なった場合についても検討した。
【０１３５】
（分析方法）
上記実施例に準じて行なった。
【０１３６】
（結果）
図４に複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入して培養を行なった場合の結果を示した。図４（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示し、図４（ｂ）は各種成分の濃度(mM)を示した。
【０１３７】
また図５には比較例として、複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに培養を行なった場合の結果を示した。図５（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示し、図５（ｂ）は各種成分の濃度(mM)を示した。
【０１３８】
また図６には比較例として、グリセロール原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに培養を行なった場合の結果を示した。図６（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示し、図６（ｂ）は各種成分の濃度(mM)を示した。
【０１３９】
なお図４（ｂ）、図５（ｂ）、図６（ｂ）における各シンボルは、黒ひし形はエタノール、黒丸がグリセロール、白三角が乳酸、黒三角が酢酸、白ひし形が１，３−プロパンジオール、アスタリスクがギ酸の結果をそれぞれ示している。
【０１４０】
図４と図５の結果を比較すると、発泡錬石を使用せずに培養を行った場合は、希釈率０．７ｈ−１の時に最良の結果を示し、水素生産速度３０（mmol/l/h）、エタノール生産量８０（ｍM）であった（図５（ａ）（ｂ））。一方発泡錬石を使用して培養を行った場合は、希釈率１．２ｈ−１の時に最良の結果を示し、水素生産速度６３（mmol/l/h）、エタノール生産量８８（mM）であった（図４（ａ）（ｂ））。したがって発泡錬石を使用することで、水素生産速度が２．２倍に増加し、エタノール生産量が１．２倍に増加するという顕著な効果が得られるということが分かった。この図４に示す結果は、グリセロール原料液（発泡錬石使用せず）の場合の結果（希釈率１．３ｈ−１の時、水素生産速度８０（mmol/l/h）、エタノール生産量８４（mM）、図６（ａ）（ｂ））と遜色の無いものであり、本発明にかかる水素およびエタノールの生産方法が、水素およびエタノールの生産量、廃棄物の有効利用の観点、コスト面等において極めて優れているということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
上記説示したように、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法のよれば、バイオディーゼル燃料製造時の副生成物として廃棄されていたバイオディーゼル廃液から、燃料電池用燃料、燃料等に有効な水素およびエタノールを効率的かつ簡便に回収することが可能となる。また自然界に存在する微生物の発酵によって製造することから、環境負荷の少ないエネルギー製造手段であるといえる。よって本発明は、バイオマスの有効利用を行なうための極めて優れた手段を提供することができる。
【０１４２】
本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、本発明者らが開発した高速メタン発酵プロセス（特開２００１−１４９９８３号公報参照）と連結されることにより、さらに有効な発酵プロセスを実現することができる。ＵＡＳＢリアクターに代表される高速メタン発酵法は、ビール工場廃液を始めとする食品廃水処理方法として、近年広範囲に利用されている。本発明者らは、上記高速メタン発酵法は、有機酸はもちろんエタノール、フェノールなどの廃水も良好に処理可能であり、この時メタンが回収されることを報告している。よって、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行なうための連続発酵槽を１槽目とし、上記高速メタン発酵槽を２槽目とした発酵プロセスを構築すれば、１槽目で得られた水素およびエタノール、並びに２槽目で得られるメタンを燃料電池等の燃料として利用し、当該発酵プロセスの運転に必要な電力を供給することができるようになる。さらには燃料電池からの廃熱を利用して発酵プロセスの温度制御に利用することができる。したがって、バイオマス資源の限りなく有効に利用することができる廃水、廃液処理システムを構築することができる。
【０１４３】
よって本発明は、食品工業、化学工業、エネルギー産業等広範な産業において廃水、廃液処理の工程として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路を示す模式図である。
【図２】本発明の水素およびエタノールの製造方法に利用可能な連続培養装置（一例）の概略図である。
【図３】図３（ａ）は実施例７において複合原料液を用いて水素およびエタノールを生産した際の、グリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の各濃度の経時変化を示す折れ線図であり、図３（ｂ）は合成原料液を用いて水素およびエタノールを生産した際の、グリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の各濃度の経時変化を示す折れ線図である。
【図４】図４は実施例８において、複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入して連続培養を行なった結果を示しており、図４（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示す折れ線図であり、図４（ｂ）はグリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の濃度(mM)を示す折れ線図である。
【図５】図５は実施例８における比較例として、複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに連続培養を行なった結果を示しており、図５（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示す折れ線図であり、図５（ｂ）はグリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の濃度(mM)を示す折れ線図である。
【図６】図６は実施例８における比較例として、グリセロール原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに連続培養を行なった結果を示しており、図６（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示す折れ線図であり、図６（ｂ）はグリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の濃度(mM)を示す折れ線図である。
【符号の説明】
【０１４５】
１ 連続培養装置
２ 発酵槽
３ 恒温ジャケット
３ａ 恒温水流出孔
３ｂ 恒温水流入孔
３ｃ 恒温水槽
４ 細菌固定化多孔質担体
５ 原料液流入孔
６ 発酵液流出孔
７ 原料液タンク
８ ポンプ
９ 排気口
１０ ガス回収槽
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性油脂、動物性油脂、廃油等の油脂をメチルエステル化してバイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られる、いわゆるバイオディーゼル廃液の有効利用方法として、当該バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造する方法、並びに当該方法を行なうために用いられるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物性油脂、動物性油脂、および廃油等の油脂をリパーゼの存在下でメタノールと反応（メタノリシス反応）させることにより得られる脂肪酸メチルエステルは、バイオディーゼル燃料と呼ばれ、軽油の代替燃料として注目されている。かかるバイオディーゼル燃料中には、(1)ほとんど硫黄分が含まれていないために酸性雨の原因となる硫黄酸化物（ＳＯｘ）が発生しないこと、(2)炭素および水素以外に酸素が含まれているため軽油に比べて黒煙発生が少なく排気ガスが清浄化すること等の理由から、環境負荷の少ない燃料として特に期待されている。かかるバイオディーゼル燃料は軽油に比べると若干発熱量が低いという物性を有しているが、自動車に適用した場合においてその走行にはほとんど影響が無いということが確認されている。さらには、動粘度が５．６ｍ２/ｓec、引火点が１３５〜１４５℃であり、その性状も軽油と類似しているため、軽油の強制規格基準をほぼ満足している（非特許文献１参照）。かかるバイオディーゼル燃料の製造方法については、各所において開発研究が進められており、種々報告されている（例えば非特許文献２〜５、特許文献１参照）。
【０００３】
一方、上記バイオディーゼル燃料を生産する際には、以下の反応式（式Ｉ）に示すように副生成物としてグリセロールが生成される。
【０００４】
【化１】
【０００５】
（式中Ｒ１〜Ｒ３はアルキル基を示す）
上記反応式に示す生成物のうち、脂肪酸メチルエステルについては、既述のごとくバイオディーゼル燃料として有効に利用可能であるが、その残渣のグリセロールについては特に用途が無く、廃棄されているのが現状である。
【０００６】
上記現状に鑑みて、廃棄物であるグリセロールを含む廃液の有効利用を行なうべく、上記廃液から水素を回収する方法の開発が試みられている。例えば、特許文献２においては副生成物であるグリセロールを加熱気化させて水素ガスを発生させ回収する装置について記載されている。
【０００７】
一方、通性嫌気性細菌エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）は、グルコース等から水素を発酵生産することが知られている（非特許文献６参照）。本発明者らは、独自に分離したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株の各種炭化水素に対する水素生産量について検討したところ、グリセロールを基質として発酵させた時に、最大の水素生産量が得られることを確認した（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】福田 秀樹、「クリーンエネルギー（バイオディーゼル燃料）」日本農芸化学会シンポジウム：２００２.３、ｐ３５８
【非特許文献２】吉川 浩ら、「超臨界メタノールによる植物油からのバイオディーゼル燃料の製造」高圧討論会講演要旨集、ＶＯＬ．４２ｎｄ、ｐ１０９（２００１）
【非特許文献３】渡辺 嘉ら、「固定相型バイオリアクターを用いた廃食用油のバイオディーゼル燃料への連続変換」、酵素工学研究会講演会講演要旨集、ＶＯＬ．４６ｔｈ、ｐ４２（２００１）
【非特許文献４】FUKUDA H, KONDO A, NODA H,”Biodiesel Fuel Production by Transesterification of Oils” J Biosci Bioeng, VOL. 92, NO.5, p405-416(2001)
【非特許文献５】SAKA S, KUSDIANA D,「超臨界メタノールを利用した植物油廃棄物からバイオディーゼル燃料の生産」、資源処理技術、ＶＯＬ．４７、ＮＯ．２、ｐ９５−１０２
【非特許文献６】谷生 重晴ら、「Enterobacter aerogenes の発酵水素発生と利用基質について」、醗酵工学会誌、第６７巻、第１号、ｐ２９−３４、１９８９
【非特許文献７】Y.Nakashimada, M.A.Racman, T. kakizono, N. Nishio,”Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states” International Jounal of Hydorogen Energy 27(2002),1399-1405
【特許文献１】特開２００２−２３３９３号公報（公開日：平成１４年８月２０日）
【特許文献２】特開２００４−２０９４１５号公報（公開日：平成１６年７月２９日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のごとく、バイオディーゼル燃料の製造の副生成物であるグリセロールを含む廃液（以下、バイオディーゼル廃液という）の有効利用法の開発が求められている。しかしながら現在バイオディーゼル廃液の有効な利用方法が開発されていないのが現状である。上記例示した特許文献２に開示されている方法はバイオディーゼル廃液を加熱気化させて水素を回収しているが、加熱気化させるためには相当量の熱量を必要とし、設備面、コスト面、技術面において多くの課題を有している。
【０００９】
そこで本発明の目的は、バイオディーゼル廃液の有効利用方法として、バイオディ−ゼル廃液から簡便かつ効率的に水素およびエタノールを生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記非特許文献７に記載されている通り、Enterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)で、グリセロールを発酵させることによって水素を生産できるということは知られている。本発明者らの検討によれば、カラム型リアクターを用い、Enterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)による市販グリセロール１０（g/l）を使用した連続培養においては、多孔質担体を使用しない場合であっても、菌体はフロック状となりリアクター底部に高密度に堆積し、水素生産速度は８０（mmol/l/h）に達した（後述する図６参照）。一方、バイオディーゼル廃液をグリセロール濃度が１０（g/l）になるように希釈し、同条件で連続培養を行った場合、菌体のリアクター内での堆積量が市販グリセロールの場合と比較して明らかに少なく、最大水素生産速度は３０（mmol/l/h）と極端に低くなった（後述する図５参照）。これは、市販グリセロール（純グリセロール）を原料とした場合Enterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)は水素を効率良く生産することができるが、バイオディーゼル廃液を原料とした場合は、水素を効率良く生産することができないということを示している。よって、バイオディーゼル廃液を原料としてEnterobacter aerogenes (ＨＵ１０１)で発酵し、水素を生産することは、バイオディーゼル廃液の有効利用法とはいえない。
【００１１】
鋭意検討の結果、本発明者等は、バイオディーゼル廃液を原料とした場合であっても、微生物を固定可能な多孔質担体を用いることにより、リアクター内の菌体堆積量が著しく上昇し、水素生産速度が６０（mmol/l/h）に著しく向上するという新規知見を得た（後述する図４参照）。このことから、担体（より好ましくは、多孔質担体）の利用が、バイオディーゼル廃液利用の効率化において必要不可欠であることがわかった。
【００１２】
本発明は、上記新規知見に基づきを完成されたものである。すなわち本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、少なくとも表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴としている。
【００１３】
上記バイオディーゼル廃液は、その大部分がグリセロールである。エンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、そのグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。また本発明の構成に含まれる上記担体は、少なくともその表面に微生物を固定可能である。よって当該担体が存在する条件下、バイオディーゼル廃液を含む原料液中でエンテロバクター（Enterobacter）属細菌を培養すれば、該担体に固定化される。担体に固定化されたエンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、前記原料液中に浮遊することなく生育することができる。よって、発酵槽内の菌体密度を著しく向上させるとともに、原料液中に含まれるグリセロールとエンテロバクター（Enterobacter）属細菌との接触頻度も向上する。さらには、増殖したエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が発酵槽からオーバーフローすることを効果的に防止することができる。それゆえ本発明の上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を従来法に比して格段に向上させることが可能となるという効果を奏する。
【００１４】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）からなる細菌群から選ばれる少なくとも１つ以上の細菌であってもよい。
【００１５】
上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）は、グリセロールまたはグルコースからの水素生産能が高い種である。それゆえ、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法において、さらに水素生産量を向上させることができるという効果を奏する。
【００１６】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１であってもよい。
【００１７】
上記、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１は、本発明者らが自然界からグルコースからの水素生産菌として独自に分離してきた株であり、検討の結果、特にグリセロールからの水素生産能が高い株である。それゆえ、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法において、さらに水素生産量を向上させることができるという効果を奏する。
【００１８】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体が、多孔質であってもよい。
【００１９】
上記のごとく担体が多孔質であることによって、当該担体上に固定化される微生物の量を増加させることができ、水素およびエタノールの生産量をさらに向上させることが可能となる。
【００２０】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体が、粒子状であってもよい。
【００２１】
上記担体は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるために、上記担体は、表面積が大きく、さらに発酵槽への充填率を高くできる粒子状であることが好ましいといえる。
【００２２】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体の平均粒子径が、３ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であってもよい。
【００２３】
上記担体は、既述の通り少なくともその表面に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体の粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上、２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００２４】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記担体が、貫通孔を有する多孔質担体であってもよい。
【００２５】
エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が多孔質担体と接触する際に、当該多孔質担体の貫通孔を通過することができ、多孔質担体のさらに内部までエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が入り込むことができる。それゆえ、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００２６】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記発酵工程が、連続培養により行なわれる構成であってもよい。
【００２７】
連続培養は、連続培養は原料液の流入と、発酵液の流出を連続的に行なう培養法であるため、水素およびエタノールの生産を連続的に行なうことができるという効果を奏する。また新しい原料液を流入するために発酵液中に生産されるエタノールが希釈されることとなる。エタノールは微生物を死滅させるものであるため、発酵液中にこれが蓄積するとエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が死滅し、水素およびエタノールの生産が継続できなくなる。上記構成によれば、エタノールを原料液によって希釈することができるため、エタノールによるエンテロバクター（Enterobacter）属細菌の死滅を防止し、水素およびエタノールの生産を長期間継続して行なうことができるという効果を奏する。
【００２８】
また本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、上記課題を解決するために、上記原料液が、酵母抽出物およびカゼイン酵素分解物を含むものであってもよい。
【００２９】
上記酵母抽出物およびカゼイン酵素分解物は、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育、増殖を向上させることができる。それゆえ、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の発酵力がさらに増加し、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００３０】
一方、本発明にかかるキットは、上記課題を解決するために、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行なうためのキットであって、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体、およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が含まれることを特徴としている。
【００３１】
上記本発明にかかるキットによれば、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く、且つ簡便に生産することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００３２】
上記のごとく本発明によれば、グリセロールを多量に含んでいるにも関わらず、これまで有効な処理方法が無かったために、廃棄物としていたバイオディーゼル廃液から、水素およびエタノールを微生物による発酵技術によって簡便かつ効率的に回収する方法を提供すことが可能となった。水素は燃料電池用の燃料としてその利用が期待されており、またエタノールも燃料、溶媒として広範囲に利用されているものである。よって本発明は、植物製油脂、動物性油脂を始めとするバイオマスを無駄にすることなく、有効に利用することができる方法および手段を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞
本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法（以下「本発明の製造方法」という。）は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、少なくとも表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴としている。以下、構成ごとに分けて具体的に説明する。
【００３５】
（バイオディーゼル廃液）
本発明の製造方法の原料液を構成するバイオディーゼル廃液は、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られるグリセロールを多量に含むものである。バイオディーゼル燃料の製造原理は、既述の式Ｉに示す反応式に示すようにして行なわれる。より具体的には、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステルおよびグリセロールが生成する。この生成したメチルエステルがバイオディーゼル燃料であり、この反応液からメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去したものがバイオディーゼル廃液である。
【００３６】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法（非特許文献２、５参照）等を用いて行なうことができる。
【００３７】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂またはその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。試薬グレードの油脂を用いた場合には、メチルエステル化後の反応液中に含まれる不純物が少なく、バイオディーゼル燃料の回収が容易であること、バイオディーゼル廃液をエンテロバクター(Enterobacter)属細菌によって発酵させる際の効率が高いという理由から、純度の高い油脂を用いることが好ましいといえる。
【００３８】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。上記のようにしてメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を反応液中から除去した残渣、本発明の製造方法において利用するバイオディーゼル廃液である。
【００３９】
かかるバイオディーゼル廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。バイオディーゼル燃料の製造に用いる油脂に含まれる成分によって異なるが、バイオディーゼル廃液にはその他、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。
【００４０】
（原料液）
本発明の製造方法に用いる上記原料液は、上記バイオディーゼル廃液が含まれていれば特に限定されるものではなく、バイオディーゼル廃液そのものを原料液として用いても良く、また適宜、水等の溶媒を添加し原料液として用いてもよい。上記溶媒の添加率（換言すれば希釈率）は特に限定されるものではなく、後に行なうエンテロバクター(Enterobacter)属細菌による発酵工程に用いる原料液として好適なものとなるように適宜検討の上、決定すればよい。
【００４１】
本発明者らは、原料液中に含まれるグリセロール濃度が高くなれば、目的とする水素およびエタノールの生産量が下がり、副生成物（乳酸、酢酸量、１，３−プロパンジオール等）が増加することを確かめている。なお原料液中に含まれるグリセロール濃度として好ましい範囲は、１．７(g/l)以上５０(g/l)以下が好ましく、５(g/l)以上１０(g/l)以下がさらに好ましい。したがって、上記のバイオディーゼル廃液の希釈率は、原料液中に含まれるグリセロール濃度が上記好ましい範囲になることを指標に決定すればよい。
【００４２】
またその他、微生物（エンテロバクター(Enterobacter)属細菌）の生育に必要な培地成分が含まれていてもよい。当該培地成分が含まれることによって、微生物（エンテロバクター(Enterobacter)属細菌）の生育・増殖が活発になり、バイオディーゼル廃液からの水素・およびエタノールの発酵生産効率がさらに向上する。
【００４３】
上記培地成分としては、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌の培養に好適なものを適宜選択の上、添加すればよい。特に、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物は、一般に微生物用培地に用いられている成分であり、本発明に用いる培地成分としては好適である。後述する実施例において示すように、本発明者らは、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物をバイオディーゼル廃液に添加した場合において、水素およびエタノールの生産量が向上することを確認している。
【００４４】
なお、酵母抽出液（別名：イーストエキス、酵母エキス）とは、ビール酵母（Saccharomyces Cerevisiae ）等の酵母の内容物を抽出したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、粉末酵母エキスＳ（日本製薬株式会社製）、Yeast Extract, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記酵母抽出物の添加量としては、原料液に０．０５重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．５重量％以下がさらに好ましい。
【００４５】
また、上記カゼイン酵素分解物とは、牛乳カゼイン等のカゼインをペプシン、トリプシン等のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、Trypton, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記カゼイン酵素分解物の添加量としては、原料液に０．１重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．０５重量％以下がさらに好ましい。
【００４６】
その他の培地成分としては、（ＮＨ４）２ＳＯ４，ＭｇＳＯ４、Ｃｏ（ＮＯ３）２、Ｆｅ（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４，ＣａＣｌ２，Ｎａ２ＳｅＯ３，ニコチン酸、ＮｉＣｌ２、その他ビタミン類等をミネラルとして添加してもよい。また、バッファー成分として、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等が含まれていてもよい。また微量元素としてＭｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＡｌＫ（ＳＯ４）、ＣｕＣｌ２、ＥＤＴＡ等が含まれていてもよい。上記化合物は市販されているものを使用することができる。
【００４７】
（微生物）
本発明の製造方法における発酵工程に用いる微生物は、通性嫌気性細菌のエンテロバクター(Enterobacter)属細菌である。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路について図１に示す。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、ブドウ糖などの解糖系で得られた余剰なＮＡＤＨを２,３−ブタンジオール、エタノール、乳酸および酢酸などに配分することにより還元当量のバランスを保つ、いわゆる混合有機酸発酵を行なって生育する。この中で水素（図１中、Ｈ２）は、以下の経路によって生成される。(1)エタノール（図１中、Ethanol）および酢酸（図１中、Acetate）生成の中間生成物であるピルビン酸（図１中、Pyruvate）がアセチルＣｏＡ（図１中、Acetyl-CoA）へと代謝される際に、ピルビン酸−ギ酸リアーゼによりギ酸（図１中、Formate）が生成される。(2)当該ギ酸（図１中、Formate）からヒドロゲナーゼの作用により水素（図１中、Ｈ２）が生成される。
【００４８】
よって、本発明の製造方法にエンテロバクター(Enterobacter)属細菌を用いることによって、バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。
【００４９】
本発明者らは、このエンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロール代謝経路に着目し、上記各種エンテロバクター(Enterobacter)属細菌について、グルコースからの水素生産能を検討した。その結果、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）等が水素生産能を有していることを確認した。エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）としては、例えば、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＩＦＯ８０２）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＪＣＭ１２３５）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０）が利用可能である。
【００５０】
なお、上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）は、本発明者らがグルコースからの水素生産菌として独自に分離した新菌株であり、独立行政法人 製品評価技術基盤機構において、ＮＢＲＣ１０００４８、Enterobacter aerogenes （ＨＵ１０１）として寄託されている（寄託日：平成１５年３月２４日）。
【００５１】
またエンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）としては、例えばエンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４）が利用可能である。
【００５２】
またエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）としては、例えばエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae ＪＣＭ１２３２）が利用可能である。
【００５３】
またエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）としては、例えばエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ＪＣＭ１２３３）が利用可能である。
【００５４】
なお上記エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、上記に掲げた菌株に限られるものではなく、グリセロールまたはグルコースから水素生産能を有する菌株であれば全て利用可能である。また、本発明における発酵工程では、上記で掲げた種々のエンテロバクター(Enterobacter)属細菌からなる細菌群から選ばれる１菌株を用いて発酵工程を行なってもよいし、２菌株以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
（発酵工程）
本発明にかかる製造方法は、既述の原料液を、少なくとも表面に微生物を固定可能な担体、より好ましくは多孔質担体の存在下で、上記エンテロバクター(Enterobacter)属細菌によって発酵させる発酵工程を含んでいる。かかる発酵工程は、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌が原料液から水素およびエタノールを発酵生産する工程である。その発酵条件としては、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌が水素およびエタノールを発酵生産する条件として好ましい条件であれば特に限定されるものではなく、その発酵方法は連続培養であっても回分培養（バッチ培養）であってもよい。回分培養は、発酵槽に原料と微生物を仕込み発酵終了後に発酵液を抜き出すという培養方法であり、連続培養は微生物を固定化等により発酵槽の中に閉じ込め、原料の流入と発酵液の流出を連続的に行なう培養方法である。連続培養は、長期間連続的に発酵することにより、発酵槽の単位体積あたりの生産性が回分培養に比して高いというメリットがあるためにより好ましいといえる。
【００５６】
また本発明における発酵工程は、通気培養であっても、静置培養であってもよい。ただし、通気培養では増殖にエネルギーを使うために目的とする水素およびエタノールの発酵生産の効率が下がる。よって、静置培養の方が好ましいといえる。
【００５７】
また培養温度についてはエンテロバクター(Enterobacter)属細菌の生育に好適な条件を採用すれば良く、２８℃〜４０℃が好ましく、３０℃〜３７℃がさらに好ましく、３７℃が最も好ましい。
【００５８】
原料の流入と発酵液の流出を行なう連続培養では、その発酵液の流出の際に微生物が一緒に流出することを防止する必要がある。このために微生物の固定化等を行なって、発酵槽からの流出を防いでいる。上記微生物の流出を防ぐ方法としては、固定化担体を用いて発酵槽内に微生物を固定化してもよいし、特に固定化担体を用いることなく増殖した微生物同士が自己凝集体（フロック）を形成して発酵槽内に留まるという方法であってもよい。ただし、固定化担体の自重により固定化担体に固定化された微生物が発酵液の表層に浮遊することがなく、確実に発酵槽内に留まることができるということ、浮遊することが無いために原料液と微生物が接触する頻度が高まり発酵生産効率が向上すること、および発酵槽内の微生物の菌体密度を向上させることができる等の理由から、固定化担体を用いる方法が好ましいといえる。
【００５９】
本発明の製造方法においても、上記の理由から発酵工程において、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体を用いている。上記担体としては、少なくともその表面に、（より好ましくは、その表面および内部に）微生物を固定することが可能な担体であれば限定されるものではない。ただし、微生物が固定化しやすく、その微生物の固定量が増加するという理由から、上記担体は多孔質であることが好ましい。上記多孔質である担体（以下、「多孔質担体」という）は、文字通りその表面に多数の孔があり、その孔内部および表面に微生物、すなわちエンテロバクター(Enterobacter)属細菌が吸着し、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌を固定化することができる。
【００６０】
担体（より好ましくは多孔質担体）にエンテロバクター(Enterobacter)属細菌を固定化する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば発酵槽内に原料液と担体（より好ましくは多孔質担体）を仕込み、そこにエンテロバクター(Enterobacter)属細菌を接種し培養する方法が挙げられる。すなわち特に、固定化操作を別途行なうのではなく、発酵工程によって増殖してきたエンテロバクター(Enterobacter)属細菌の培養液が担体（より好ましくは多孔質担体）と接触することにより、その表面および内部に固定化されるという方法である。なお、本発明の製造方法の発酵工程とは別に、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌を培養し、担体（より好ましくは多孔質担体）に固定化するという操作を行ない、エンテロバクター(Enterobacter)属細菌が固定化された担体（より好ましくは多孔質担体）を発酵工程に導入するというものであってもよい。
【００６１】
本発明の製造方法において使用する上記多孔質担体は、特に限定されるものではなく、連続培養用に市販されている固定化担体を適宜利用可能である。例えば、ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【００６２】
なお本発明に使用する担体（より好ましくは多孔質担体）は、粒子状であることが好ましく、その平均粒子径が３ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることが好ましい。上記担体（より好ましくは多孔質担体）は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体（より好ましくは多孔質担体）は粒子状であり、その粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体（より好ましくは多孔質担体）の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえ、３ｍｍ以上１０ｍｍ以下にすることがさらに好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体（より好ましくは多孔質担体）を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。
【００６３】
また本発明の製造方法は、上記多孔質担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることが好ましい。多孔質担体に貫通孔がない場合、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の培養液が、多孔質体の孔の内部まで入り込むことができないのに対し、多孔質担体に貫通孔がある場合は、当該多孔質担体の貫通孔をエンテロバクター（Enterobacter）属細菌の培養液が通過することができ、多孔質担体のさらに内部までエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が入り込むことができる。それゆえ、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。上記貫通孔を有する多孔質担体は、既述のナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。
【００６４】
なお使用する担体の材質は、特に限定されるものではなく、例えばレンガ様の素焼き材；セラミックス、ポリビニルアルコール等の高分子材料；木材チップ、セルロース等の生体高分子化合物が利用可能である。
【００６５】
本発明の製造方法に使用する培養装置は、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図２に連続培養を行なうための連続培養装置の模式図を示す。連続培養装置１は、発酵槽２、恒温ジャケット３、恒温水流出孔３ａ、恒温水流入孔３ｂ、恒温水槽３ｃ、細菌固定化多孔質担体４、原料液流入孔５、発酵液流出孔６、原料液タンク７、ポンプ８、排気口９、ガス回収槽１０とからなっている。
【００６６】
原料液は原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵する。発酵後のエタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。なお発酵槽２内の温度は、発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内に恒温水槽３ｃから供給される恒温水によって、一定に保たれている。恒温水は、恒温水槽３ｃから恒温水流入孔３ｂを通って恒温ジャケット３内に供給され、恒温水流出孔３ａから再び恒温水槽３ｃに戻るという要領により循環している。
【００６７】
上記の連続培養において、発酵槽２内への原料液の供給量（以下、原料液希釈率という）の好適な条件は、用いる原料液の組成，多孔質担体の種類，エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の状態，培養条件等によって異なるために、限定されるものではないが、０．６ｈ−１以上１．２ｈ−１以下が好ましく、０．７ｈ−１以上１．２ｈ−１以下がさらに好ましい。上記好ましい範囲以上の希釈率で原料液を供給すると、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の発酵能力を原料供給量が上まり、十分発酵していないにもかかわらず発酵槽２外へ流出してしまう状態となり、発酵効率が下がり、水素およびエタノールの回収量が少なくなってしまう。一方、上記好ましい範囲以下の希釈率で原料液を供給すると、発酵は十分に進むが生成物であるエタノール等によって菌体が死滅したり、雑菌の汚染の危険性が高くなるために好ましくない。なお「希釈率」とは、１時間当たりに供給される原料液量の全原料液量に対する割合のことである。
【００６８】
（その他の工程）
本発明にかかる製造方法は、上記発酵工程のほかに、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌を予め増殖させておく前培養工程、多孔質担体に予めエンテロバクター（Enterobacter）属細菌を固定化しておく固定化工程、生成した水素またはエタノールを精製する精製工程、生成した水素またはエタノールをガスクロマトグラフィー等で分析する工程、バイオディーゼル燃料の製造工程等の工程が含まれていてもよい。
【００６９】
＜２.本発明にかかるキット＞
本発明にかかるキットは、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行なうためのキットであって、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体、およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が含まれることを特徴としている。
【００７０】
本発明にかかるキットに含まれる担体は、特に限定されるものではなく、上記＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞の項において説明した種々の担体を適宜選択の上、適用すればよい。
【００７１】
また本発明にかかるキットに含まれるエンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、特に限定されるものではなく、上記＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞の項において説明した各種細菌を適宜選択の上、適用すればよい。
【００７２】
上記のほか、本発明にかかるキットには、上記＜１．本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法＞の項において説明した説示したバイオリアクター（培養装置）が含まれていてもよく、さらにエンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育・増殖に利用される成分として酵母抽出液、カゼイン酵素分解物、ビタミン類、バッファー成分、および微量元素等が含まれていてもよい。
【００７３】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７４】
〔実施例１〕エンテロバクター(Enterobacter)属細菌の水素生産能の検討
各種エンテロバクター(Enterobacter)属細菌についてグルコースからの水素生産能を比較検討することにした。
【００７５】
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＩＦＯ８０２）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＪＣＭ１２３５）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）
エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４）
エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae ＪＣＭ１２３２）
エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ＪＣＭ１２３３）
エンテロバクター・アスブリエ（Enterobacter asburiae ＪＣＭ６０５１）
エンテロバクター・カンセロゲヌス（Enterobacter cancerogenus ＪＣＭ３９４３）
エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans ＪＣＭ１２３６）
エンテロバクター・アムンルゲヌス（Enterobacter amnlgenus ＪＣＭ１２３７）
エンテロバクター・インテルメドラス（Enterobacter intermedlus ＪＣＭ１２３８）
（培地・培養方法）
表１に示す培地を用いた。表1に示す培地成分は全て和光純薬工業株式会社から購入したものを使用した。
【００７６】
【表１】
【００７７】
なお培養は、初発ｐＨ６．８、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【００７８】
（水素測定法）
水素の生産量の測定は、ガスクロマトグラフィー（株式会社島津製作所製、ＧＣ８Ａ）にて行なった。具体的には、『Nishio N, Eguchi SY, Kawashima H, Nagai S. “Mutual conversion between H2 plus CO2 and formate by a formate-utilizing methanogen.”J Ferment Technol, 1983; 61(6):557-61』の記載に準じて行なった。
【００７９】
（結果）
表２に結果を示す。なお表２には、グルコースの消費量(mM)、水素生成量（Ｈ２（mM））、および水素収率（Ｈ２収率（mol/mol-glucose））を示した。水素収率（Ｈ２収率（mol/mol-glucose））とは、グルコース１モルから得られる水素のモル数である。
【００８０】
【表２】
【００８１】
上記表２によれば、Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素生産量が０．６８（mol/mol-glucose）、Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４の水素生産量が０．７１（mol/mol-glucose）であり、本実施例において検討したエンテロバクター(Enterobacter)属細菌の中で、最も水素生産能が高い株であるということが分かった。
【００８２】
またエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＩＦＯ８０２）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＪＣＭ１２３５）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae ＪＣＭ１２３４）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae ＪＣＭ１２３２）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ＪＣＭ１２３３）については、約０.４〜０．５（mol/mol-glucose）と比較的水素生産量の高いものであった。
【００８３】
上記検討では、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）に属する細菌は、いずれも水素生産量が比較的高く（０．４〜０．７（mol/mol-glucose））、水素生産菌として好適な属であるということが分かった。
【００８４】
〔実施例２〕各種炭素源に対するEnterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産量
（培地・培養方法）
表１におけるグルコースを各種炭素源（フルクトース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール）に置き換えた各培地を作製した。
【００８５】
培養方法は実施例１に準じて行なった。
【００８６】
（菌株）
上記実施例１において、高い水素生産能を示したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【００８７】
（分析方法）
エタノールの測定は、ＨＰＬＣを用いて行なった。なお測定方法は、Fukuzaki S, Chang Y-J, Nishio N, Nagai S.”Characteristics of granular metanogenic sludge grown on lactate in a UASB reactor” J Ferment Bioeng, 1991;72(6):465-72 の記載に準じた。
【００８８】
水素の測定は実施例１に準じて行なった。
【００８９】
（結果）
各発酵液から回収した水素およびエタノールの収率を表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表３の結果によれば、Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１は、グリセロールを炭素源として用いた場合において、最も高い水素収率（６．６９mmol/g-substrate）およびエタノール収率（７．０５mmol/g-substrate）を示した。よって、Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１による水素およびエタノールの発酵生産の炭素源としては、グリセロールが最適であるということが分かった。
【００９２】
〔実施例３〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討１：グリセロール濃度の検討
（菌株）
上記実施例１において、高い水素生産能を示したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【００９３】
（培地）
表１に示す培地のグルコースをグリセロールに置き換えた培地を用いた。なお、グリセロール濃度は、５．０(g/l)、１０(g/l)、２５(g/l)、５０(g/l)となるように調整した。
【００９４】
（培養方法）
３７℃、静置条件で回分培養を行なった。
【００９５】
（分析方法）
水素の測定は実施例１に記載の方法と同様にした。
【００９６】
エタノール、１，３−プロパンジオール、乳酸、酢酸、ギ酸は、ＨＰＬＣにより測定した（Fukuzaki S, Chang Y-J, Nishio N, Nagai S.”Characteristics of granular metanogenic sludge grown on lactate in a UASB reactor” J Ferment Bioeng, 1991;72(6):465-72 参照）。
【００９７】
（結果）
表４には、各種グリセロール濃度の培地を用いた場合の、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでに生産した全水素（Ｈ２）量、全エタノール（Ethanol）量、全乳酸(Lactate)量、全酢酸(Acetate)量、全１，３−プロパンジオール(1,3-Propanediol)量、全ギ酸(Formate)量から計算した炭素源（グリセロール）当りの収率を示した。なお表４中の「Consumption time(hr)」は、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでの時間を示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
表４の結果より、グリセロール濃度が高くなるにつれて、水素およびエタノール生産量が減少していた。一方、グリセロール濃度が高くなるにつれて、副生成物である乳酸、酢酸量、１，３−プロパンジオールが増加していた。よって、培地（原料液）中に含まれるグリセロール濃度は、１０(g/l)以下であることが好ましいということが分かった。
【０１００】
〔実施例４〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討２：塩濃度の検討
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１０１】
（培地・培養方法）
表１に示す培地からYeast extract（酵母抽出物）およびTrypton（カゼイン酵素分解物）を除き、グルコースをグリセロールに置き換え、さらにＮａＣｌを０（％）、０．５（％）、１（％）、３（％）となるように調整した培地をそれぞれ用いた。
【０１０２】
培養方法は、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【０１０３】
（結果）
表５に結果を示す。表５には水素生産量（Ｈ２ (mM)）、および残存グリセロール濃度（(Residual Glycerol(mM))を示した。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
表５によればＮａＣｌ濃度が、高くなるにつれて、残存グリセロール濃度が高くなるとともに水素生産量が減少しているということが分かった。したがって原料液中に含まれるＮａＣｌ濃度は低いほどよいということがいえる。
【０１０６】
〔実施例５〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討３：窒素源濃度の検討
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１０７】
（培地・培養方法）
表１に示す培地からYeast extract（酵母抽出物）およびTrypton（カゼイン酵素分解物）を除き、グルコースをグリセロールに置き換え、さらに（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．１（g/l）、１(g/l)、５(g/l)、１０(g/l)となるように調整した培地をそれぞれ用いた。
【０１０８】
培養方法は、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【０１０９】
（結果）
表６に結果を示す。表６には水素生産量（Ｈ２ (mM)）、および残存グリセロール濃度（(Residual Glycerol(mM))を示した。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
表６によれば（ＮＨ４）２ＳＯ４が１(g/l)の濃度の時に水素生産量が最大となり、残存グリセロール濃度が最小となった。よって、窒素源として原料液中に含まれる（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は１(g/l)含まれていることが好ましいということが分かった。
【０１１２】
〔実施例６〕Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１の水素およびエタノールの生産条件の検討３：マグネシウムイオン濃度の検討
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１１３】
（培地・培養方法）
表１に示す培地からYeast extract（酵母抽出物）およびTrypton（カゼイン酵素分解物）を除き、グルコースをグリセロールに置き換え、さらにＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．２５（g/l）、０．５(g/l)、１(g/l)となるように調整した培地をそれぞれ用いた。
【０１１４】
培養方法は、３７℃、２４時間静置培養を行なった。
【０１１５】
（結果）
表７に結果を示す。表７には水素生産量（Ｈ２ (mM)）、および残存グリセロール濃度（(Residual Glycerol(mM))を示した。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
表７によればＭｇＳＯ４が０．２５(g/l)の濃度の時に水素生産量が最大となり、残存グリセロール濃度が最小となった。よって、Ｍｇイオン供給源として原料液中に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は０．２５(g/l)含まれていることが好ましいということが分かった。
【０１１８】
〔実施例７〕バイオディーゼル廃液を用いたEnterobacter aerogenes ＨＵ１０１による水素およびエタノールの発酵生産
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１１９】
（原料液（培地））
以下表８に示す組成のバイオディーゼル廃液に、表１に示す成分のうちグルコースを除く成分を加えて調製した原料液（以下、「複合原料液」という）、または表１に示す成分のうちグルコース、Trypton（カゼイン酵素消化物）、およびYeast extract（酵母抽出物）を除く成分を加えて調製した原料液（以下、「合成原料液」という）を培地として用いた。
【０１２０】
なお、バイオディーゼル廃液の希釈率の違いによって、原料液に含まれるグリセロール濃度が、それぞれ１．７(g/l)、３．３(g/l)、１０(g/l)となった原料液を用いて試験を行なった。
【０１２１】
【表８】
【０１２２】
（培養方法）
３７℃、静置条件で回分培養を行なった。
【０１２３】
（分析方法）
上記実施例に準じて行なった。
【０１２４】
（結果）
表９には、各種グリセロール濃度の培地を用いた場合の、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでに生産した全水素（Ｈ２）量、全エタノール（Ethanol）量、全乳酸(Lactate)量、全酢酸(Acetate)量、全１，３−プロパンジオール(1,3-Propanediol)量、全ギ酸(Formate)量から計算した炭素源（グリセロール）当りの収率を示した。なお表８中の「Consumption time(hr)」は、炭素源であるグリセロールが完全に消費されるまでの時間を示す。
【０１２５】
【表９】
【０１２６】
また表９中「with medium」は「複合原料液」の結果を示し、「without medium」は、「合成原料液」の結果を示す。
【０１２７】
表９によれば、グリセロール濃度が最も低い１．７（g/l）の場合が、最大の水素およびエタノールの収率を示し、またこの時、副生成物である乳酸(Lactate)、酢酸(Acetate)、１，３−プロパンジオール(1,3-Propanediol)、ギ酸(Formate)の収率が最も低いということが分かった。さらにはグリセロールを消費するまでの時間が早いということが分かった。これは実施例３を再現する結果であり、バイオディーゼル廃液を含む原料液を用いた場合であってもグリセロール濃度が低いほど、効率良くかつ高純度に水素およびエタノールを生産することができるということがわかった。
【０１２８】
また、図３にグリセロール濃度が１０（g/l）の複合原料液（図３（ａ）に示す）、および合成原料液（図３（ｂ）に示す）の場合の各種成分の経時変化を示した。図３中黒丸のシンボルはグリセロールの消費率を示す結果を示し、黒ひし形のシンボルはエタノールの生産量を示し、白丸のシンボルは水素の生産量を示し、白ひし形のシンボルは１，３−プロパンジオールの生産量を示し、白三角のシンボルは乳酸の生産量を示し、アスタリスクのシンボルがギ酸の生産量を示し、黒三角のシンボルは酢酸の生産量を示している。
【０１２９】
図３および上記表８の結果から、合成原料液に比べて複合原料が明らかに、水素およびエタノールの収率が高く、また発酵速度が速いということが分かった。したがって、原料液にはYeast extract（酵母抽出物）、Tripton（カゼイン酵素分解物）が含まれていることが好ましいということがいえる。
【０１３０】
〔実施例８〕連続培養による水素およびエタノール発酵生産
（菌株）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ＨＵ１０１）を用いた。
【０１３１】
（装置）
連続培養装置は、自作のガラス製カラム型リアクター（直径２．７ｃｍ×高さ１７ｃｍ、容量６０ｍｌ）。その概略は図２に示すとおりである。
【０１３２】
（原料液（培地））
実施例７において調製した複合原料液（グリセロール濃度１０g/l）、または表１に示す培地のグルコースをグリセロール（グリセロール濃度１０g/l）に置き換えた培地（以下、「グリセロール原料液」という）を用いた。
【０１３３】
（培養方法）
培養温度３７℃で連続培養を行なった。また培養液の希釈率は０．１ｈ−１〜１．６ｈ−１の間で適宜変更して各々試験を行なった。
【０１３４】
発酵槽内には、多孔質担体として発泡錬石（ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP3平均粒子径１０ｍｍ）を導入して培養を行なった。なお比較として上記発泡錬石を導入せずに培養を行なった場合についても検討した。
【０１３５】
（分析方法）
上記実施例に準じて行なった。
【０１３６】
（結果）
図４に複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入して培養を行なった場合の結果を示した。図４（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示し、図４（ｂ）は各種成分の濃度(mM)を示した。
【０１３７】
また図５には比較例として、複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに培養を行なった場合の結果を示した。図５（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示し、図５（ｂ）は各種成分の濃度(mM)を示した。
【０１３８】
また図６には比較例として、グリセロール原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに培養を行なった場合の結果を示した。図６（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示し、図６（ｂ）は各種成分の濃度(mM)を示した。
【０１３９】
なお図４（ｂ）、図５（ｂ）、図６（ｂ）における各シンボルは、黒ひし形はエタノール、黒丸がグリセロール、白三角が乳酸、黒三角が酢酸、白ひし形が１，３−プロパンジオール、アスタリスクがギ酸の結果をそれぞれ示している。
【０１４０】
図４と図５の結果を比較すると、発泡錬石を使用せずに培養を行った場合は、希釈率０．７ｈ−１の時に最良の結果を示し、水素生産速度３０（mmol/l/h）、エタノール生産量８０（ｍM）であった（図５（ａ）（ｂ））。一方発泡錬石を使用して培養を行った場合は、希釈率１．２ｈ−１の時に最良の結果を示し、水素生産速度６３（mmol/l/h）、エタノール生産量８８（mM）であった（図４（ａ）（ｂ））。したがって発泡錬石を使用することで、水素生産速度が２．２倍に増加し、エタノール生産量が１．２倍に増加するという顕著な効果が得られるということが分かった。この図４に示す結果は、グリセロール原料液（発泡錬石使用せず）の場合の結果（希釈率１．３ｈ−１の時、水素生産速度８０（mmol/l/h）、エタノール生産量８４（mM）、図６（ａ）（ｂ））と遜色の無いものであり、本発明にかかる水素およびエタノールの生産方法が、水素およびエタノールの生産量、廃棄物の有効利用の観点、コスト面等において極めて優れているということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
上記説示したように、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法のよれば、バイオディーゼル燃料製造時の副生成物として廃棄されていたバイオディーゼル廃液から、燃料電池用燃料、燃料等に有効な水素およびエタノールを効率的かつ簡便に回収することが可能となる。また自然界に存在する微生物の発酵によって製造することから、環境負荷の少ないエネルギー製造手段であるといえる。よって本発明は、バイオマスの有効利用を行なうための極めて優れた手段を提供することができる。
【０１４２】
本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法は、本発明者らが開発した高速メタン発酵プロセス（特開２００１−１４９９８３号公報参照）と連結されることにより、さらに有効な発酵プロセスを実現することができる。ＵＡＳＢリアクターに代表される高速メタン発酵法は、ビール工場廃液を始めとする食品廃水処理方法として、近年広範囲に利用されている。本発明者らは、上記高速メタン発酵法は、有機酸はもちろんエタノール、フェノールなどの廃水も良好に処理可能であり、この時メタンが回収されることを報告している。よって、本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行なうための連続発酵槽を１槽目とし、上記高速メタン発酵槽を２槽目とした発酵プロセスを構築すれば、１槽目で得られた水素およびエタノール、並びに２槽目で得られるメタンを燃料電池等の燃料として利用し、当該発酵プロセスの運転に必要な電力を供給することができるようになる。さらには燃料電池からの廃熱を利用して発酵プロセスの温度制御に利用することができる。したがって、バイオマス資源の限りなく有効に利用することができる廃水、廃液処理システムを構築することができる。
【０１４３】
よって本発明は、食品工業、化学工業、エネルギー産業等広範な産業において廃水、廃液処理の工程として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路を示す模式図である。
【図２】本発明の水素およびエタノールの製造方法に利用可能な連続培養装置（一例）の概略図である。
【図３】図３（ａ）は実施例７において複合原料液を用いて水素およびエタノールを生産した際の、グリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の各濃度の経時変化を示す折れ線図であり、図３（ｂ）は合成原料液を用いて水素およびエタノールを生産した際の、グリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の各濃度の経時変化を示す折れ線図である。
【図４】図４は実施例８において、複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入して連続培養を行なった結果を示しており、図４（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示す折れ線図であり、図４（ｂ）はグリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の濃度(mM)を示す折れ線図である。
【図５】図５は実施例８における比較例として、複合原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに連続培養を行なった結果を示しており、図５（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示す折れ線図であり、図５（ｂ）はグリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の濃度(mM)を示す折れ線図である。
【図６】図６は実施例８における比較例として、グリセロール原料液を原料とし、発泡錬石を導入せずに連続培養を行なった結果を示しており、図６（ａ）は水素生産速度(mmol/l/h)を示す折れ線図であり、図６（ｂ）はグリセロール、エタノール、水素、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸の濃度(mM)を示す折れ線図である。
【符号の説明】
【０１４５】
１ 連続培養装置
２ 発酵槽
３ 恒温ジャケット
３ａ 恒温水流出孔
３ｂ 恒温水流入孔
３ｃ 恒温水槽
４ 細菌固定化多孔質担体
５ 原料液流入孔
６ 発酵液流出孔
７ 原料液タンク
８ ポンプ
９ 排気口
１０ ガス回収槽
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、
少なくともその表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法。
【請求項２】
上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）からなる細菌群から選ばれる少なくとも１つ以上の細菌であることを特徴とする請求項１に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項３】
上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１であることを特徴とする請求項１または２に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項４】
上記担体が、多孔質であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項５】
上記担体が、粒子状であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記担体の平均粒子径が、３ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項８】
上記発酵工程が、連続培養により行なわれることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項９】
上記原料液が、酵母抽出物およびカゼイン酵素分解物を含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法を行なうためのキットであって、
少なくともその表面に微生物を固定可能な担体、
およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が含まれることを特徴とするキット。
【請求項１】
原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、
少なくともその表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法。
【請求項２】
上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Enterobacter gergoviae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、およびエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）からなる細菌群から選ばれる少なくとも１つ以上の細菌であることを特徴とする請求項１に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項３】
上記エンテロバクター（Enterobacter）属細菌が、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１であることを特徴とする請求項１または２に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項４】
上記担体が、多孔質であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項５】
上記担体が、粒子状であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記担体の平均粒子径が、３ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項８】
上記発酵工程が、連続培養により行なわれることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項９】
上記原料液が、酵母抽出物およびカゼイン酵素分解物を含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法を行なうためのキットであって、
少なくともその表面に微生物を固定可能な担体、
およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌が含まれることを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−１８０７８２（Ｐ２００６−１８０７８２Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３７８０４３（Ｐ２００４−３７８０４３）
【出願日】平成１６年１２月２７日（２００４．１２．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年８月２５日 社団法人日本生物工学会発行の「日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２７日（２００４．１２．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年８月２５日 社団法人日本生物工学会発行の「日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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