バイオマスからのエタノールの生産方法
【課題】糖化バイオマス中の発酵阻害物質であるギ酸の存在下でも、効率的にエタノールを生産する方法を提供すること。
【解決手段】本発明のバイオマスからのエタノールの生産方法は、ギ酸脱水素酵素を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。
【解決手段】本発明のバイオマスからのエタノールの生産方法は、ギ酸脱水素酵素を過剰発現するように形質転換されたキシロース資化性酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与できるからである。
【０００３】
しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成される。このうちセルロースは、グルコースまで糖化されると、グルコースを資化できる酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などによるエタノール発酵に利用できる。これに対して、ヘミセルロースは、キシロース、アラビノースなどのペントースまで糖化されても、天然の酵母はキシロース、アラビノースなどの資化能力が極めて低いため、発酵によるエタノール生産への利用が困難である。
【０００５】
そこで、キシロースを資化するために、遺伝子組換え技術を用いて、酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のキシルロキナーゼ（ＸＫ）の遺伝子を酵母に導入し、これらの酵素を過剰発現する酵母が作製されている（非特許文献１および２）。他にも、嫌気性真菌ピロミセス（Piromyces）属またはオルピノマイセス（Orpinomyces）属由来のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）および酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＸＫ遺伝子を酵母に導入して発現させることで、キシロースからのエタノール発酵が可能になった（非特許文献３）。
【０００６】
キシロースからのエタノール発酵が可能になったとはいえ、これを工業化するには種々の問題がある。例えば、キシロースはグルコースと比較して消費速度が遅いこと、エタノール生産速度が遅いこと、エタノール収率が低いことなどの問題がある。さらに、セルロース系バイオマスからのエタノール生産の実用化における最大の問題は、糖化液中の発酵阻害物質の存在である。
【０００７】
セルロース系バイオマスをＣ６糖のグルコースまたはＣ５糖のキシロースやアラビノースなどへと分解（糖化）するには、酵素法、希硫酸法、水熱分解法などが用いられる。酵素法は、多種類、多量の酵素が必要であり、工業化にはコスト的に問題がある。一方、希硫酸法や水熱分解法は、酢酸、ギ酸などの弱酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン化合物、バニリンなどのフェノール類など、種々の過分解物（副生成物）を生じ、これらの副生成物がキシロースからのエタノール発酵を大きく阻害する発酵阻害物質であることが知られている（非特許文献４〜６）。したがって、コスト的に有利な硫酸法や水熱分解法を用いてバイオマスからのエタノール発酵を実用化するには、バイオマスの過分解物に耐性を有する酵母、またはこれらの発酵阻害物質の存在下でも効率的なエタノール発酵が可能な酵母が求められる。
【０００８】
これまでに発酵阻害物質が酵母に及ぼす影響が調べられてきた（非特許文献４〜６）。フルフラールは、酵母の生存、成長速度、出芽、エタノール収率、バイオマス収率、酵素活性などに大きな影響を及ぼすことがわかった。ＨＭＦは、酵母の細胞内で、脂質の蓄積を引き起こし、タンパク質含有量を減少させ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素およびピルビン酸脱水素酵素を阻害することがわかった。フルフラールやＨＭＦに対する耐性遺伝子を探索するため、破壊株のスクリーニング、転写分析などの方法を用いて研究が行われている（非特許文献７および８）。
【０００９】
一方、酢酸やギ酸などの弱酸は、酵母の細胞内のｐＨに影響を及ぼすと考えられている。すなわち、培地中の弱酸は解離してない状態で存在しており、この非解離状態の弱酸が酵母の細胞膜を透過し、ｐＨが中性付近の酵母の細胞質ゾルに侵入すると、アニオンとプロトンとに解離して酵母の細胞内のｐＨを減少させると考えられている（非特許文献４）。細胞内のｐＨが減少すると、ホメオスタシスを維持するためにＡＴＰａｓｅが働き、この結果ＡＴＰが必要になる。嫌気条件下ではエタノール発酵によりＡＴＰが再生される。一般に、グルコースからのエタノール発酵では、酢酸存在下でもあまり発酵能が影響を受けることなくＡＴＰが再生されると考えられる。しかし、キシロースからのエタノール発酵では酢酸存在下では発酵能が低下するため、ＡＴＰの再生効率が低いと考えられる。
【００１０】
ところで、ギ酸が酵母のエタノール発酵に及ぼす影響を調べた報告例は皆無である。ギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＦＤＨ）についての研究が酵母においても行われているにすぎない。ＦＤＨは、ギ酸とＮＡＤ＋とから二酸化炭素とＮＡＤＨとを生成する。例えば、ＦＤＨを過剰発現するように形質転換された酵母サッカロマイセス・セレビシエを用いたグリセロール発酵において、ＮＡＤＨが過剰に供給されたため、ＮＡＤＨを補酵素とするグリセロール生合成系に関与する酵素の働きが強まり、グリセロール生産量が増加したことが報告されている（非特許文献９および１０）。エタノール発酵については、ＦＤＨを過剰発現するように形質転換された好熱性のバチルス（Bacillus）属細菌を用いる方法において、ＮＡＤＨが過剰に供給されたため、ＮＡＤＨを補酵素とするエタノール生合成系に関与する酵素の働きが強まり、エタノール生産量が増加したことが報告されている（特許文献１）。このように、これまでは、ＮＡＤＨの供給の観点からＦＤＨについて研究されているのみで、バイオマスを糖源とする発酵において、発酵阻害物質であるギ酸に対する対処法は研究されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００９−５２９９０５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】B. C. H. ChuおよびH. Lee、「Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fermentation」、Biotechnology Advances、2007年、第25巻、p. 425-441
【非特許文献２】C. LuおよびT. Jeffries、「Shuffling of promoters for multiple genes to optimize xylose fermentation in an engineered Saccharomyces cerevisiae strain」、Appl. Environ. Microbiol.、2007年、第73巻、p. 6072-6077
【非特許文献３】M. Kuyperら、「Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation」、FEMS Yeast Res.、2005年、第5巻、p. 399-409
【非特許文献４】J. R. M. Almeidaら、「Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae」、J. Chem. Technol. Biotechnol.、2007年、第82巻、p. 340-349
【非特許文献５】A. J. A. van Marisら、「Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status」、Antonie van Leeusenhoek、2006年、第90巻、p. 391-418
【非特許文献６】E. PalmqvistおよびB. Hahn-Hagerdal、「Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition」、Bioresource Technology、2000年、第74巻、p. 25-33
【非特許文献７】S. W. Gorsichら、「Tolerance to furfural-induced stress is associated with pentose phosphate pathway genes ZWF1, GND1, RPE1, and TKL1 in Saccharomyces cerevisiae」、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第71巻、p. 339-349
【非特許文献８】A. Peterssonら、「A 5-hydroxymethyl furfural reducing enzyme encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 gene conveys HMF tolerance」、Yeast、2006年、第23巻、p. 455-464
【非特許文献９】J.-M. A. Geertmanら、「Engineering NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae: formate as an electron donor for glycerol production by anaerobic, glucose-limited chemostat cultures」、FEMS Yeast Res.、2006年、第6巻、p. 1193-1203
【非特許文献１０】J.-M. A. Geertmanら、「Physiological and genetic engineering of cytosolic redox metabolism in Saccharomyces cerevisiae for improved glycerol production」、Metabolic Engineering、2006年、第8巻、p. 532-542
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、糖化バイオマス中に発酵阻害物質であるギ酸が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ギ酸脱水素酵素の遺伝子をキシロース資化性酵母に導入して得られた、該酵素を過剰発現する形質転換酵母が、糖化バイオマス中に存在するギ酸に耐性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、ギ酸脱水素酵素を過剰発現するように形質転換された酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。
【００１６】
１つの実施態様では、上記形質転換された酵母は、キシロース資化性酵母である。
【００１７】
１つの実施態様では、上記糖化バイオマスは、発酵阻害物質であるギ酸を含む。
【００１８】
１つの実施態様では、上記ギ酸脱水素酵素は、酵母由来である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、糖化バイオマス中に発酵阻害物質であるギ酸が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産できる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの効率的な生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】キシロース資化性酵母ＭＴ８−１ＸＮ株をギ酸不在下（０ｍＭギ酸；（ａ））、ならびに１０ｍＭ（ｂ）および２０ｍＭ（ｃ）のギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中のキシロース濃度およびエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】プラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１の構造を示す模式図である。
【図３】ＦＤＨ１過剰発現株（（ｄ）〜（ｆ））またはコントロール株（（ａ）〜（ｃ））をギ酸不在下（０ｍＭギ酸；（ａ）および（ｄ））、１０ｍＭ（（ｂ）および（ｅ））および２０ｍＭ（（ｃ）および（ｆ））のギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中のキシロース濃度および生産物（エタノール、グリセロールおよびキシリトール）濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜（廃糖蜜）が挙げられる。また、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材（パルプ）などの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などのリグノセルロース系バイオマスが挙げられる。本発明では、食糧と競合しない点で、好ましくはリグノセルロース系バイオマスを用いる。リグノセルロース系バイオマスとしては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、廃材が挙げられる。
【００２２】
バイオマスの糖化とは、多糖体からなるバイオマスを単糖レベルまで分解することをいい、単糖がさらに過分解（酢酸やギ酸などの副生物が生成する）を受けることも含む。本発明で用いる糖化方法としては、例えば、酵素法、希硫酸法、水熱分解法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。
【００２３】
糖化バイオマスとは、バイオマスを糖化処理して得られた組成物をいい、多糖類の分解により生成した単糖を主成分とし、ほかに、分解を受けずに残ったオリゴ糖や多糖、および過分解により生成した副生物（酢酸やギ酸など）を含む。
【００２４】
ギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＦＤＨ）は、ギ酸とＮＡＤ＋とから二酸化炭素とＮＡＤＨとを生成する化学反応を触媒する酵素である。ギ酸脱水素酵素としては、酵母由来のＦＤＨが挙げられるが、由来は特に制限されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＤＨ１または２が挙げられる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエのＦＤＨ１の遺伝子の塩基配列は配列番号１で示され、ＦＤＨ１のアミノ酸配列は配列番号２で示される。
【００２５】
本発明で用いる酵母は、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を導入した形質転換キシロース資化性酵母である。形質転換に用いるキシロース資化性酵母としては、キシロースからエタノール発酵によりエタノールを生産できる酵母であれば、特に制限されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエにキシロース資化能を付与するプラスミドを導入して得られるキシロース資化性酵母が挙げられる。キシロース資化能を付与するプラスミドとしては、例えば、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製することができる。
【００２６】
酵母に遺伝子を導入する方法は特に制限されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法が挙げられる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
【００２７】
ギ酸脱水素酵素の遺伝子を、キシロース資化性酵母に導入するために、好ましくはこの酵素の遺伝子をプラスミドに挿入する。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に制限されない。酵母用の複製遺伝子は必ずしも必要ない。プラスミドは、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターが挙げられるが、特に制限されない。プラスミドは、相同組換えに必要な遺伝子を有することが好ましい。相同組換えに必要な遺伝子としては、Ｔｒｐ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３が挙げられるが、特に制限されない。プラスミドは、必要に応じて分泌シグナル配列を有することが好ましい。以上のようなプラスミドとしては、例えば、R. Yamadaら、Enzyme Microb. Technol.、2009年、第44巻、p. 344-349に記載のｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡ、ｐＩＨ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡが挙げられる。これらのプラスミドのプロモーターとターミネーターとの間にギ酸脱水素酵素の遺伝子を挿入する。
【００２８】
キシロース資化性酵母に、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドを導入する際は、これらの遺伝子を相同組換えにより染色体に組み込むために、プラスミドを１ヶ所で切断して線状にすることが好ましい。
【００２９】
このようにして、ギ酸脱水素酵素を過剰発現する形質転換酵母を作製することができる。ギ酸脱水素酵素が過剰発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法など、当業者に周知の方法により確認できる。「過剰発現」とは、当業者に周知の範囲内の過剰発現量をいうが、通常、遺伝子が導入されていない酵母と比較して２倍程度以上の発現量をいい、好ましくは５倍程度以上、より好ましくは１０倍程度以上の発現量をいう。
【００３０】
本発明の方法では、糖化バイオマスとギ酸脱水素酵素を過剰発現する形質転換酵母とを混合し、形質転換酵母を培養する。糖化バイオマス中には、バイオマスの過分解により生じる発酵阻害物質であるギ酸が存在し得るが、本発明で用いる形質転換酵母は、ギ酸に耐性を有するため、エタノール発酵が阻害されることなく進行し、エタノールが培地中に生産される。
【００３１】
本発明の方法では、Ｃ５糖のキシロースのみでなく、Ｃ６糖のグルコースなどを糖源として発酵を行う場合にも、ギ酸の存在下においてエタノール発酵が阻害されることなく進行する。
【００３２】
形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地のｐＨは、好ましくは約４〜約６、最も好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約０．５〜約６ｐｐｍ、より好ましくは約１〜約４ｐｐｍ、最も好ましくは約２ｐｐｍである。培養温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約３５℃、最も好ましくは約３０℃である。酵母菌体量が１０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは２５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、より好ましくは３７．５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上になるまで培養することが好ましく、培養時間は約２０〜約５０時間程度である。形質転換酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その菌体量を増加させ得る。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（参考例１：酵母ＭＴ８−１ＸＮ株の発酵試験とＤＮＡマイクロアレイ）
（発酵試験）
酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１株（ＭＡＴａ）（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）に、キシロース資化能力を付与するプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫＮ（酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクダーゼ（ＸＲ）およびキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ（ＸＫ）を共発現するプラスミドとして、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製）を酢酸リチウム法により導入することで、形質転換酵母ＭＴ８−１ＸＮ株を作製した。このキシロース資化性酵母ＭＴ８−１ＸＮ株を用いて、キシロースを糖源としてエタノール発酵を行い、ギ酸の影響を調べた。発酵に用いた酵母は、３０℃および好気条件下で前培養（酵母エキス（Yeast Extract）１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン（Bacto-Peptone）２０ｇ／ＬおよびＤ−グルコース２０ｇ／Ｌを含む培地を使用、２４時間培養）した後、本培養（酵母エキス（Yeast Extract）１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン（Bacto-Peptone）２０ｇ／ＬおよびＤ−グルコース２０ｇ／Ｌを含む培地を使用、４８時間培養）により増殖させて調製した。初発キシロース濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量５０ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ，バクトペプトン２０ｇ／Ｌ）に、ギ酸を添加しないもの（０ｍＭギ酸）、およびギ酸濃度が１０ｍＭまたは２０ｍＭとなるようにギ酸を添加したものを調製し、発酵を開始した。
【００３５】
培地中のキシロースおよび生産されたエタノールを、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所製）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはShim-pack SPR-Pb（株式会社島津製作所製）を用い、移動層には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、流速０．６ｍＬ／分および温度８０℃とした。結果を図１に示す。
【００３６】
図１から明らかなように、ギ酸濃度の増加とともに、キシロース消費速度が減少し、それに伴ってエタノール生産速度および生産量ともに減少した。このことから、ギ酸の存在によってキシロースからのエタノール発酵が大きく阻害されることがわかる。
【００３７】
（ＤＮＡマイクロアレイ）
ギ酸不在下（０ｍＭギ酸）および２０ｍＭギ酸存在下について、それぞれ培養開始後２４時間に酵母菌体（培地１ｍＬ）を回収し、４℃にて１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除いた。沈殿中の菌体を蒸留水１ｍＬに再懸濁し、１０００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清を除いた。次いで、沈殿中の菌体をソルビトール／ＥＤＴＡ緩衝液（１Ｍソルビトール，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）２ｍＬに再懸濁し、この懸濁液にβ−メルカプトエタノール２μＬおよび５００ユニット／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ（生化学工業株式会社製）５００μＬを添加し、混合した。さらに、３０℃にて１００ｒｐｍで１５分間振とうした懸濁液を、室温にて３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除いた。
【００３８】
このようにして得られた酵母スフェロプラストのギ酸不在下（０ｍＭギ酸）および２０ｍＭギ酸存在下の各サンプルから、Total RNA Isolation mini Kit（アジレント・テクノロジー社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次いで、トータルＲＮＡから、Agilent RNA Spike-In Kit（アジレント・テクノロジー社製）およびQuick Amp Labeling Kit, one-color（アジレント・テクノロジー社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００３９】
得られたｃＤＮＡを基質として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼおよびＣｙａｎｉｎｅ３（アジレント・テクノロジー社製）を用いてラベル化ｃＲＮＡを合成した。次いで、Qiagen RNeasy mini Kit（キアゲン社製）を用いてラベル化ｃＲＮＡを精製した。
【００４０】
Agilent Gene Expression Hybridizaton Kit（アジレント・テクノロジー社製）を用いて、精製したラベル化ｃＲＮＡをランダムに切断し、アレイスライド（Microarray; S. cerevisiae, 4×44k；アジレント・テクノロジー社製）にハイブリダイゼーションさせた。次いで、Agilent Gene Expression Wash Pack（アジレント・テクノロジー社製）を用いてアレイスライドを洗浄し、Agilent DNA Microarray Scanner（アジレント・テクノロジー社製）によりアレイスライドをスキャニングした。Agilent DNA Microarray Scannerに付属のソフトウェア（Feature Extraction Ver. 9.5）で取り込んだデータをGenespring GX（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）に移し、解析した。データ解析では、Workflow typeの設定はAdvanced Analysisにし、Flag Import、Normalization algorithmおよびBaseline Transformationの設定はアジレント・テクノロジー社の推奨に従った。統計処理はＴ−テストにより行い、発現量、Ｆｌａｇ情報および再現性に基づくフィルタリングを行った。
【００４１】
ギ酸不在下（０ｍＭギ酸）および２０ｍＭギ酸存在下の各サンプルについて得られた最終データに対して、Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅによるフィルタリングを行い、各サンプル間の遺伝子発現量の比を求めた。
【００４２】
ＤＮＡマイクロアレイにより得られた代表的な酵母遺伝子についての結果を表１に示す。表１は、キシロース資化性酵母ＭＴ８−１ＸＮ株をギ酸不在下（０ｍＭギ酸）でエタノール発酵させた場合に対する、２０ｍＭのギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の遺伝子発現比を表す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１から、ギ酸不在下（０ｍＭギ酸）と比べると、２０ｍＭのギ酸存在下では、ギ酸脱水素酵素ＦＤＨ１およびＦＤＨ２の遺伝子の発現が、顕著に増加していることがわかる。
【００４５】
（実施例１：ＦＤＨ１過剰発現用プラスミドの作製）
ギ酸脱水素酵素ＦＤＨ１を酵母で過剰に発現させるためのプラスミドを構築した。ＰＧＫプロモーターおよびＰＧＫターミネーターを有するプラスミドｐＰＧＫ４２３（J. Ishiiら、J. Biochem.、2006年、第145巻、p. 701-708）のプロモーターとターミネーターとの間に、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来ＦＤＨ１遺伝子（配列番号１）を挿入して、プラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１を作製した（図２）。挿入に用いたＦＤＨ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＫｙｏｋａｉ−７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＳａｃＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１は、形質転換体にアンピシリン耐性を付与するＡｍｐｒ遺伝子および相同組換えに必要な酵母由来ＨＩＳ３遺伝子を有する。
【００４６】
（実施例２：ＦＤＨ１過剰発現株の作製）
キシロース資化性酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１ＸＮ株に実施例１で作製したプラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１を酢酸リチウム法により導入し、ＦＤＨ１を過剰に発現する形質転換酵母ＭＴ８−１ＸＮＰＧＫ４２３ＦＤＨ１株（ＦＤＨ１過剰発現株）を得た。同様にして、プラスミドｐＰＧＫ４２３を酢酸リチウム法により導入し、形質転換酵母ＭＴ８−１ＸＮＰＧＫ４２３株（コントロール株）を得た。
【００４７】
（実施例３：ＦＤＨ１過剰発現株の発酵試験）
実施例２で得たＦＤＨ１過剰発現株およびコントロール株を用いてキシロースからのエタノール発酵を行い、ギ酸の影響を検討した。初発Ｄ−キシロース濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量２．５ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地に、ギ酸を添加しないもの（０ｍＭギ酸）、およびギ酸濃度が１０ｍＭまたは２０ｍＭとなるようにギ酸を添加したものを調製し、発酵を開始した。培地中のキシロースおよび生産されたエタノール、グリセロールおよびキシリトールを、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所製）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはShim-pack SPR-Pb（株式会社島津製作所製）を用い、移動層には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、流速０．６ｍＬ／分および温度８０℃とした。結果を図３に示す。
【００４８】
図３から明らかなように、ギ酸不在下では、ＦＤＨ１過剰発現株（ｄ）とコントロール株（ａ）とは、キシロース消費速度、エタノール生産速度および最終エタノール生産量のいずれについても大きな差がなかった。１０ｍＭのギ酸存在下では、ＦＤＨ１過剰発現株（ｅ）は、ギ酸不在下と同様のキシロース消費速度、エタノール生産速度および最終エタノール生産量を示した。これに対して、コントロール株（ｂ）は、発酵開始後２４時間頃からややキシロース消費速度が減少したが、発酵開始後９６時間においてはキシロースが完全に消費され、エタノール生産速度および最終エタノール生産量もギ酸不在下と大きな差がなかった。キシリトール生産速度および最終キシリトール生産量はギ酸不在下と比べると減少した。２０ｍＭのギ酸存在下でも、ＦＤＨ１過剰発現株（ｆ）は、ギ酸不在下と同様のキシロース消費速度、エタノール生産速度および最終エタノール生産量を示した。これに対して、コントロール株（ｃ）は、発酵開始直後からキシロース消費速度およびエタノール生産速度が顕著に減少し、発酵開始後９６時間においてもキシロースが完全に消費されず、最終エタノール生産量はギ酸不在下および１０ｍＭギ酸存在下と比べると顕著に減少した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の方法によれば、糖化バイオマス中に発酵阻害物質であるギ酸が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産できる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの効率的な生産が可能となり、化石燃料の代替燃料を提供するとともに地球温暖化防止や食糧問題の解決に寄与できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与できるからである。
【０００３】
しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成される。このうちセルロースは、グルコースまで糖化されると、グルコースを資化できる酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などによるエタノール発酵に利用できる。これに対して、ヘミセルロースは、キシロース、アラビノースなどのペントースまで糖化されても、天然の酵母はキシロース、アラビノースなどの資化能力が極めて低いため、発酵によるエタノール生産への利用が困難である。
【０００５】
そこで、キシロースを資化するために、遺伝子組換え技術を用いて、酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のキシルロキナーゼ（ＸＫ）の遺伝子を酵母に導入し、これらの酵素を過剰発現する酵母が作製されている（非特許文献１および２）。他にも、嫌気性真菌ピロミセス（Piromyces）属またはオルピノマイセス（Orpinomyces）属由来のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）および酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＸＫ遺伝子を酵母に導入して発現させることで、キシロースからのエタノール発酵が可能になった（非特許文献３）。
【０００６】
キシロースからのエタノール発酵が可能になったとはいえ、これを工業化するには種々の問題がある。例えば、キシロースはグルコースと比較して消費速度が遅いこと、エタノール生産速度が遅いこと、エタノール収率が低いことなどの問題がある。さらに、セルロース系バイオマスからのエタノール生産の実用化における最大の問題は、糖化液中の発酵阻害物質の存在である。
【０００７】
セルロース系バイオマスをＣ６糖のグルコースまたはＣ５糖のキシロースやアラビノースなどへと分解（糖化）するには、酵素法、希硫酸法、水熱分解法などが用いられる。酵素法は、多種類、多量の酵素が必要であり、工業化にはコスト的に問題がある。一方、希硫酸法や水熱分解法は、酢酸、ギ酸などの弱酸、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などのフラン化合物、バニリンなどのフェノール類など、種々の過分解物（副生成物）を生じ、これらの副生成物がキシロースからのエタノール発酵を大きく阻害する発酵阻害物質であることが知られている（非特許文献４〜６）。したがって、コスト的に有利な硫酸法や水熱分解法を用いてバイオマスからのエタノール発酵を実用化するには、バイオマスの過分解物に耐性を有する酵母、またはこれらの発酵阻害物質の存在下でも効率的なエタノール発酵が可能な酵母が求められる。
【０００８】
これまでに発酵阻害物質が酵母に及ぼす影響が調べられてきた（非特許文献４〜６）。フルフラールは、酵母の生存、成長速度、出芽、エタノール収率、バイオマス収率、酵素活性などに大きな影響を及ぼすことがわかった。ＨＭＦは、酵母の細胞内で、脂質の蓄積を引き起こし、タンパク質含有量を減少させ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素およびピルビン酸脱水素酵素を阻害することがわかった。フルフラールやＨＭＦに対する耐性遺伝子を探索するため、破壊株のスクリーニング、転写分析などの方法を用いて研究が行われている（非特許文献７および８）。
【０００９】
一方、酢酸やギ酸などの弱酸は、酵母の細胞内のｐＨに影響を及ぼすと考えられている。すなわち、培地中の弱酸は解離してない状態で存在しており、この非解離状態の弱酸が酵母の細胞膜を透過し、ｐＨが中性付近の酵母の細胞質ゾルに侵入すると、アニオンとプロトンとに解離して酵母の細胞内のｐＨを減少させると考えられている（非特許文献４）。細胞内のｐＨが減少すると、ホメオスタシスを維持するためにＡＴＰａｓｅが働き、この結果ＡＴＰが必要になる。嫌気条件下ではエタノール発酵によりＡＴＰが再生される。一般に、グルコースからのエタノール発酵では、酢酸存在下でもあまり発酵能が影響を受けることなくＡＴＰが再生されると考えられる。しかし、キシロースからのエタノール発酵では酢酸存在下では発酵能が低下するため、ＡＴＰの再生効率が低いと考えられる。
【００１０】
ところで、ギ酸が酵母のエタノール発酵に及ぼす影響を調べた報告例は皆無である。ギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＦＤＨ）についての研究が酵母においても行われているにすぎない。ＦＤＨは、ギ酸とＮＡＤ＋とから二酸化炭素とＮＡＤＨとを生成する。例えば、ＦＤＨを過剰発現するように形質転換された酵母サッカロマイセス・セレビシエを用いたグリセロール発酵において、ＮＡＤＨが過剰に供給されたため、ＮＡＤＨを補酵素とするグリセロール生合成系に関与する酵素の働きが強まり、グリセロール生産量が増加したことが報告されている（非特許文献９および１０）。エタノール発酵については、ＦＤＨを過剰発現するように形質転換された好熱性のバチルス（Bacillus）属細菌を用いる方法において、ＮＡＤＨが過剰に供給されたため、ＮＡＤＨを補酵素とするエタノール生合成系に関与する酵素の働きが強まり、エタノール生産量が増加したことが報告されている（特許文献１）。このように、これまでは、ＮＡＤＨの供給の観点からＦＤＨについて研究されているのみで、バイオマスを糖源とする発酵において、発酵阻害物質であるギ酸に対する対処法は研究されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００９−５２９９０５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】B. C. H. ChuおよびH. Lee、「Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fermentation」、Biotechnology Advances、2007年、第25巻、p. 425-441
【非特許文献２】C. LuおよびT. Jeffries、「Shuffling of promoters for multiple genes to optimize xylose fermentation in an engineered Saccharomyces cerevisiae strain」、Appl. Environ. Microbiol.、2007年、第73巻、p. 6072-6077
【非特許文献３】M. Kuyperら、「Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation」、FEMS Yeast Res.、2005年、第5巻、p. 399-409
【非特許文献４】J. R. M. Almeidaら、「Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae」、J. Chem. Technol. Biotechnol.、2007年、第82巻、p. 340-349
【非特許文献５】A. J. A. van Marisら、「Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status」、Antonie van Leeusenhoek、2006年、第90巻、p. 391-418
【非特許文献６】E. PalmqvistおよびB. Hahn-Hagerdal、「Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition」、Bioresource Technology、2000年、第74巻、p. 25-33
【非特許文献７】S. W. Gorsichら、「Tolerance to furfural-induced stress is associated with pentose phosphate pathway genes ZWF1, GND1, RPE1, and TKL1 in Saccharomyces cerevisiae」、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第71巻、p. 339-349
【非特許文献８】A. Peterssonら、「A 5-hydroxymethyl furfural reducing enzyme encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 gene conveys HMF tolerance」、Yeast、2006年、第23巻、p. 455-464
【非特許文献９】J.-M. A. Geertmanら、「Engineering NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae: formate as an electron donor for glycerol production by anaerobic, glucose-limited chemostat cultures」、FEMS Yeast Res.、2006年、第6巻、p. 1193-1203
【非特許文献１０】J.-M. A. Geertmanら、「Physiological and genetic engineering of cytosolic redox metabolism in Saccharomyces cerevisiae for improved glycerol production」、Metabolic Engineering、2006年、第8巻、p. 532-542
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、糖化バイオマス中に発酵阻害物質であるギ酸が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ギ酸脱水素酵素の遺伝子をキシロース資化性酵母に導入して得られた、該酵素を過剰発現する形質転換酵母が、糖化バイオマス中に存在するギ酸に耐性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明は、バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、ギ酸脱水素酵素を過剰発現するように形質転換された酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程を含む。
【００１６】
１つの実施態様では、上記形質転換された酵母は、キシロース資化性酵母である。
【００１７】
１つの実施態様では、上記糖化バイオマスは、発酵阻害物質であるギ酸を含む。
【００１８】
１つの実施態様では、上記ギ酸脱水素酵素は、酵母由来である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、糖化バイオマス中に発酵阻害物質であるギ酸が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産できる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの効率的な生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】キシロース資化性酵母ＭＴ８−１ＸＮ株をギ酸不在下（０ｍＭギ酸；（ａ））、ならびに１０ｍＭ（ｂ）および２０ｍＭ（ｃ）のギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中のキシロース濃度およびエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】プラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１の構造を示す模式図である。
【図３】ＦＤＨ１過剰発現株（（ｄ）〜（ｆ））またはコントロール株（（ａ）〜（ｃ））をギ酸不在下（０ｍＭギ酸；（ａ）および（ｄ））、１０ｍＭ（（ｂ）および（ｅ））および２０ｍＭ（（ｃ）および（ｆ））のギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の、発酵液中のキシロース濃度および生産物（エタノール、グリセロールおよびキシリトール）濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜（廃糖蜜）が挙げられる。また、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材（パルプ）などの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などのリグノセルロース系バイオマスが挙げられる。本発明では、食糧と競合しない点で、好ましくはリグノセルロース系バイオマスを用いる。リグノセルロース系バイオマスとしては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、廃材が挙げられる。
【００２２】
バイオマスの糖化とは、多糖体からなるバイオマスを単糖レベルまで分解することをいい、単糖がさらに過分解（酢酸やギ酸などの副生物が生成する）を受けることも含む。本発明で用いる糖化方法としては、例えば、酵素法、希硫酸法、水熱分解法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。
【００２３】
糖化バイオマスとは、バイオマスを糖化処理して得られた組成物をいい、多糖類の分解により生成した単糖を主成分とし、ほかに、分解を受けずに残ったオリゴ糖や多糖、および過分解により生成した副生物（酢酸やギ酸など）を含む。
【００２４】
ギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＦＤＨ）は、ギ酸とＮＡＤ＋とから二酸化炭素とＮＡＤＨとを生成する化学反応を触媒する酵素である。ギ酸脱水素酵素としては、酵母由来のＦＤＨが挙げられるが、由来は特に制限されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＤＨ１または２が挙げられる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエのＦＤＨ１の遺伝子の塩基配列は配列番号１で示され、ＦＤＨ１のアミノ酸配列は配列番号２で示される。
【００２５】
本発明で用いる酵母は、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を導入した形質転換キシロース資化性酵母である。形質転換に用いるキシロース資化性酵母としては、キシロースからエタノール発酵によりエタノールを生産できる酵母であれば、特に制限されない。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエにキシロース資化能を付与するプラスミドを導入して得られるキシロース資化性酵母が挙げられる。キシロース資化能を付与するプラスミドとしては、例えば、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製することができる。
【００２６】
酵母に遺伝子を導入する方法は特に制限されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法が挙げられる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
【００２７】
ギ酸脱水素酵素の遺伝子を、キシロース資化性酵母に導入するために、好ましくはこの酵素の遺伝子をプラスミドに挿入する。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に制限されない。酵母用の複製遺伝子は必ずしも必要ない。プラスミドは、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターが挙げられるが、特に制限されない。プラスミドは、相同組換えに必要な遺伝子を有することが好ましい。相同組換えに必要な遺伝子としては、Ｔｒｐ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３が挙げられるが、特に制限されない。プラスミドは、必要に応じて分泌シグナル配列を有することが好ましい。以上のようなプラスミドとしては、例えば、R. Yamadaら、Enzyme Microb. Technol.、2009年、第44巻、p. 344-349に記載のｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡ、ｐＩＨ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡが挙げられる。これらのプラスミドのプロモーターとターミネーターとの間にギ酸脱水素酵素の遺伝子を挿入する。
【００２８】
キシロース資化性酵母に、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドを導入する際は、これらの遺伝子を相同組換えにより染色体に組み込むために、プラスミドを１ヶ所で切断して線状にすることが好ましい。
【００２９】
このようにして、ギ酸脱水素酵素を過剰発現する形質転換酵母を作製することができる。ギ酸脱水素酵素が過剰発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法など、当業者に周知の方法により確認できる。「過剰発現」とは、当業者に周知の範囲内の過剰発現量をいうが、通常、遺伝子が導入されていない酵母と比較して２倍程度以上の発現量をいい、好ましくは５倍程度以上、より好ましくは１０倍程度以上の発現量をいう。
【００３０】
本発明の方法では、糖化バイオマスとギ酸脱水素酵素を過剰発現する形質転換酵母とを混合し、形質転換酵母を培養する。糖化バイオマス中には、バイオマスの過分解により生じる発酵阻害物質であるギ酸が存在し得るが、本発明で用いる形質転換酵母は、ギ酸に耐性を有するため、エタノール発酵が阻害されることなく進行し、エタノールが培地中に生産される。
【００３１】
本発明の方法では、Ｃ５糖のキシロースのみでなく、Ｃ６糖のグルコースなどを糖源として発酵を行う場合にも、ギ酸の存在下においてエタノール発酵が阻害されることなく進行する。
【００３２】
形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地のｐＨは、好ましくは約４〜約６、最も好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約０．５〜約６ｐｐｍ、より好ましくは約１〜約４ｐｐｍ、最も好ましくは約２ｐｐｍである。培養温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約３５℃、最も好ましくは約３０℃である。酵母菌体量が１０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは２５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、より好ましくは３７．５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上になるまで培養することが好ましく、培養時間は約２０〜約５０時間程度である。形質転換酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その菌体量を増加させ得る。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（参考例１：酵母ＭＴ８−１ＸＮ株の発酵試験とＤＮＡマイクロアレイ）
（発酵試験）
酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１株（ＭＡＴａ）（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）に、キシロース資化能力を付与するプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫＮ（酵母ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクダーゼ（ＸＲ）およびキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）、ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ（ＸＫ）を共発現するプラスミドとして、S. Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2006年、第72巻、p. 1136-1143の記載に準じて調製）を酢酸リチウム法により導入することで、形質転換酵母ＭＴ８−１ＸＮ株を作製した。このキシロース資化性酵母ＭＴ８−１ＸＮ株を用いて、キシロースを糖源としてエタノール発酵を行い、ギ酸の影響を調べた。発酵に用いた酵母は、３０℃および好気条件下で前培養（酵母エキス（Yeast Extract）１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン（Bacto-Peptone）２０ｇ／ＬおよびＤ−グルコース２０ｇ／Ｌを含む培地を使用、２４時間培養）した後、本培養（酵母エキス（Yeast Extract）１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン（Bacto-Peptone）２０ｇ／ＬおよびＤ−グルコース２０ｇ／Ｌを含む培地を使用、４８時間培養）により増殖させて調製した。初発キシロース濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量５０ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ，バクトペプトン２０ｇ／Ｌ）に、ギ酸を添加しないもの（０ｍＭギ酸）、およびギ酸濃度が１０ｍＭまたは２０ｍＭとなるようにギ酸を添加したものを調製し、発酵を開始した。
【００３５】
培地中のキシロースおよび生産されたエタノールを、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所製）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはShim-pack SPR-Pb（株式会社島津製作所製）を用い、移動層には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、流速０．６ｍＬ／分および温度８０℃とした。結果を図１に示す。
【００３６】
図１から明らかなように、ギ酸濃度の増加とともに、キシロース消費速度が減少し、それに伴ってエタノール生産速度および生産量ともに減少した。このことから、ギ酸の存在によってキシロースからのエタノール発酵が大きく阻害されることがわかる。
【００３７】
（ＤＮＡマイクロアレイ）
ギ酸不在下（０ｍＭギ酸）および２０ｍＭギ酸存在下について、それぞれ培養開始後２４時間に酵母菌体（培地１ｍＬ）を回収し、４℃にて１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除いた。沈殿中の菌体を蒸留水１ｍＬに再懸濁し、１０００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清を除いた。次いで、沈殿中の菌体をソルビトール／ＥＤＴＡ緩衝液（１Ｍソルビトール，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）２ｍＬに再懸濁し、この懸濁液にβ−メルカプトエタノール２μＬおよび５００ユニット／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ（生化学工業株式会社製）５００μＬを添加し、混合した。さらに、３０℃にて１００ｒｐｍで１５分間振とうした懸濁液を、室温にて３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除いた。
【００３８】
このようにして得られた酵母スフェロプラストのギ酸不在下（０ｍＭギ酸）および２０ｍＭギ酸存在下の各サンプルから、Total RNA Isolation mini Kit（アジレント・テクノロジー社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次いで、トータルＲＮＡから、Agilent RNA Spike-In Kit（アジレント・テクノロジー社製）およびQuick Amp Labeling Kit, one-color（アジレント・テクノロジー社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００３９】
得られたｃＤＮＡを基質として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼおよびＣｙａｎｉｎｅ３（アジレント・テクノロジー社製）を用いてラベル化ｃＲＮＡを合成した。次いで、Qiagen RNeasy mini Kit（キアゲン社製）を用いてラベル化ｃＲＮＡを精製した。
【００４０】
Agilent Gene Expression Hybridizaton Kit（アジレント・テクノロジー社製）を用いて、精製したラベル化ｃＲＮＡをランダムに切断し、アレイスライド（Microarray; S. cerevisiae, 4×44k；アジレント・テクノロジー社製）にハイブリダイゼーションさせた。次いで、Agilent Gene Expression Wash Pack（アジレント・テクノロジー社製）を用いてアレイスライドを洗浄し、Agilent DNA Microarray Scanner（アジレント・テクノロジー社製）によりアレイスライドをスキャニングした。Agilent DNA Microarray Scannerに付属のソフトウェア（Feature Extraction Ver. 9.5）で取り込んだデータをGenespring GX（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）に移し、解析した。データ解析では、Workflow typeの設定はAdvanced Analysisにし、Flag Import、Normalization algorithmおよびBaseline Transformationの設定はアジレント・テクノロジー社の推奨に従った。統計処理はＴ−テストにより行い、発現量、Ｆｌａｇ情報および再現性に基づくフィルタリングを行った。
【００４１】
ギ酸不在下（０ｍＭギ酸）および２０ｍＭギ酸存在下の各サンプルについて得られた最終データに対して、Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅによるフィルタリングを行い、各サンプル間の遺伝子発現量の比を求めた。
【００４２】
ＤＮＡマイクロアレイにより得られた代表的な酵母遺伝子についての結果を表１に示す。表１は、キシロース資化性酵母ＭＴ８−１ＸＮ株をギ酸不在下（０ｍＭギ酸）でエタノール発酵させた場合に対する、２０ｍＭのギ酸存在下でエタノール発酵させた場合の遺伝子発現比を表す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１から、ギ酸不在下（０ｍＭギ酸）と比べると、２０ｍＭのギ酸存在下では、ギ酸脱水素酵素ＦＤＨ１およびＦＤＨ２の遺伝子の発現が、顕著に増加していることがわかる。
【００４５】
（実施例１：ＦＤＨ１過剰発現用プラスミドの作製）
ギ酸脱水素酵素ＦＤＨ１を酵母で過剰に発現させるためのプラスミドを構築した。ＰＧＫプロモーターおよびＰＧＫターミネーターを有するプラスミドｐＰＧＫ４２３（J. Ishiiら、J. Biochem.、2006年、第145巻、p. 701-708）のプロモーターとターミネーターとの間に、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来ＦＤＨ１遺伝子（配列番号１）を挿入して、プラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１を作製した（図２）。挿入に用いたＦＤＨ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＫｙｏｋａｉ−７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＳａｃＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１は、形質転換体にアンピシリン耐性を付与するＡｍｐｒ遺伝子および相同組換えに必要な酵母由来ＨＩＳ３遺伝子を有する。
【００４６】
（実施例２：ＦＤＨ１過剰発現株の作製）
キシロース資化性酵母サッカロマイセス・セレビシエのＭＴ８−１ＸＮ株に実施例１で作製したプラスミドｐＰＧＫ４２３ＦＤＨ１を酢酸リチウム法により導入し、ＦＤＨ１を過剰に発現する形質転換酵母ＭＴ８−１ＸＮＰＧＫ４２３ＦＤＨ１株（ＦＤＨ１過剰発現株）を得た。同様にして、プラスミドｐＰＧＫ４２３を酢酸リチウム法により導入し、形質転換酵母ＭＴ８−１ＸＮＰＧＫ４２３株（コントロール株）を得た。
【００４７】
（実施例３：ＦＤＨ１過剰発現株の発酵試験）
実施例２で得たＦＤＨ１過剰発現株およびコントロール株を用いてキシロースからのエタノール発酵を行い、ギ酸の影響を検討した。初発Ｄ−キシロース濃度４０ｇ／Ｌおよび酵母菌体量２．５ｇ／Ｌ（湿重量）を含むＹＰ培地に、ギ酸を添加しないもの（０ｍＭギ酸）、およびギ酸濃度が１０ｍＭまたは２０ｍＭとなるようにギ酸を添加したものを調製し、発酵を開始した。培地中のキシロースおよび生産されたエタノール、グリセロールおよびキシリトールを、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所製）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはShim-pack SPR-Pb（株式会社島津製作所製）を用い、移動層には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、流速０．６ｍＬ／分および温度８０℃とした。結果を図３に示す。
【００４８】
図３から明らかなように、ギ酸不在下では、ＦＤＨ１過剰発現株（ｄ）とコントロール株（ａ）とは、キシロース消費速度、エタノール生産速度および最終エタノール生産量のいずれについても大きな差がなかった。１０ｍＭのギ酸存在下では、ＦＤＨ１過剰発現株（ｅ）は、ギ酸不在下と同様のキシロース消費速度、エタノール生産速度および最終エタノール生産量を示した。これに対して、コントロール株（ｂ）は、発酵開始後２４時間頃からややキシロース消費速度が減少したが、発酵開始後９６時間においてはキシロースが完全に消費され、エタノール生産速度および最終エタノール生産量もギ酸不在下と大きな差がなかった。キシリトール生産速度および最終キシリトール生産量はギ酸不在下と比べると減少した。２０ｍＭのギ酸存在下でも、ＦＤＨ１過剰発現株（ｆ）は、ギ酸不在下と同様のキシロース消費速度、エタノール生産速度および最終エタノール生産量を示した。これに対して、コントロール株（ｃ）は、発酵開始直後からキシロース消費速度およびエタノール生産速度が顕著に減少し、発酵開始後９６時間においてもキシロースが完全に消費されず、最終エタノール生産量はギ酸不在下および１０ｍＭギ酸存在下と比べると顕著に減少した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の方法によれば、糖化バイオマス中に発酵阻害物質であるギ酸が存在する場合であっても、効率的にエタノールを生産できる。このため、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの効率的な生産が可能となり、化石燃料の代替燃料を提供するとともに地球温暖化防止や食糧問題の解決に寄与できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスからのエタノールの生産方法であって、
ギ酸脱水素酵素を過剰発現するように形質転換された酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換された酵母が、キシロース資化性酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖化バイオマスが、発酵阻害物質であるギ酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ギ酸脱水素酵素が、酵母由来である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１】
バイオマスからのエタノールの生産方法であって、
ギ酸脱水素酵素を過剰発現するように形質転換された酵母を糖化バイオマスと混合し、培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換された酵母が、キシロース資化性酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖化バイオマスが、発酵阻害物質であるギ酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ギ酸脱水素酵素が、酵母由来である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１６７０９６（Ｐ２０１１−１６７０９６Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３２０５６（Ｐ２０１０−３２０５６）
【出願日】平成２２年２月１７日（２０１０．２．１７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１７日（２０１０．２．１７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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