バイオリアクター内で増殖した細胞を採取する時の予測器
本発明は細胞増殖システムおよび細胞増殖システムからいつ細胞を採取するかを決定する方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２００８年８月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／０８８，２２３号および２００９年３月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／１６０，０８２号の利点を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
少量のドナー細胞から培養されて増殖されたヒト幹細胞は損傷したまたは欠陥のある組織を修復または置き換えるのに使用することができ、また広範囲の病気の治療に対する広範な臨床応用を有する。再生医療の分野における最近の進歩はヒト幹細胞が自己複製能力、特殊化されない状態を維持する能力、および特定の条件の元で特殊化された細胞へ分化する能力等のユニークな特性を有することを示している。
【０００３】
再生医療の重要なコンポーネントとして、バイオリアクターすなわち細胞増殖システムは細胞成長および増殖のための最適化された環境を提供する役割を果たしている。バイオリアクターはクローズド滅菌システム内での細胞成長を助長する物理化学的環境を提供するだけでなく、細胞に栄養を与え代謝物を除去する。細胞増殖システムは幹細胞だけでなく他のタイプの細胞を増殖させるのにも使用することができる。
【０００４】
多くの種類のバイオリアクターを現在入手することができる。最も一般的な２つは平板型バイオリアクターおよび中空糸型バイオリアクターである。平板型バイオリアクターは大きな平面上で細胞を増殖させることができ、中空糸型バイオリアクターは中空糸の内側または外側で細胞を増殖させることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオリアクターの内側を見てクローズド・システムの無菌性を破壊することなくいつ増殖された細胞を採取するかを決定するのは現在の慣行ではない。無菌性を維持しながらいつ細胞を採取するかを決定する方法が必要とされている。本発明はこのような方法に向けられている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は細胞増殖システムの細胞増殖室からいつ細胞を採取するかを決定する方法に関連している。細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数を測定するステップと、細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間に生成される乳酸塩の濃度を測定するステップと、測定値を使用して細胞増殖サイクルの終りに細胞増殖室からいつ細胞を採取するかを決定するステップとを含んでいる。
【０００７】
本発明は細胞を含む細胞増殖室、少なくとも１台のポンプおよびデジタル・コンピュータを含む細胞増殖システムにも関連している。デジタル・コンピュータは、さらに、少なくとも１つのプロセッサと、メモリと、ユーザ・インターフェイスと、コントローラ・インターフェイスとを含んでいる。ユーザ・インターフェイスは細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数および細胞増殖サイクル中のさまざまな時間において測定された乳酸塩の濃度をオペレータが入力できるように構成される。メモリは細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数および細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間に測定された乳酸塩の濃度を取得して細胞増殖室内の細胞をいつ採取すべきかを決定する。次に、メモリはプロセッサを介してコントローラ・インターフェイスへ信号を送り、少なくとも１台のポンプが細胞増殖室を介して流体を汲み上げて細胞増殖室から細胞を除去するよう命令する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞増殖室の実施例の正面図である。
【図２】細胞増殖システムの実施例の略図である。
【図３】採取手順をいつ開始するかを示すグラフである。
【図４】採取手順をいつ開始するかを決定する方法の実施例のステップのフロー図である。
【図５】細胞増殖システムのデジタル・コンピュータ側面を例示するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（詳細な説明）
前記したように、いくつかのバイオリアクターすなわち細胞増殖室構成が細胞培養のために存在している。本発明に対して特定の構成は必要とされない。しかしながら、限定はしないが、一例として中空糸型バイオリアクターが図１に示されている。
【００１０】
図１に細胞増殖室１００の例が正面図で示されている。細胞増殖室１００は縦軸ＬＡ−ＬＡを有し、細胞増殖室ハウジング１０４を含んでいる。少なくとも１つの実施例では、細胞増殖室ハウジング１０４は４つの開口すなわちポート、ＩＣ入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、ＥＣ入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を含んでいる。
【００１１】
第１の循環経路内の流体は細胞増殖室１００の第１の長手方向端部１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を介して細胞増殖室１００へ入り、複数の中空糸１１６（中空糸は一般的に膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）とも呼ばれる）の毛細血管内側（さまざまな実施例において、中空糸膜の毛細血管内（ｉｎｔｒａｃａｐｉｌｌａｒｙ）（「ＩＣ」）側または「ＩＣスペース」と呼ばれる）を通過し、細胞増殖室１００の第２の長手方向端部１２４にあるＩＣ出口ポート１２０を介して細胞増殖室１００から出てゆく。ＩＣ入口ポート１０８およびＩＣ出口ポート１２０間の流体経路は細胞増殖室１００のＩＣ部１２６を画定する。第２の循環経路内の流体はＥＣ入口ポート１２８を介して細胞増殖室１００へ流入し、毛細血管外側すなわち中空糸１１６の外側（膜の「ＥＣ側」または「ＥＣスペース」と呼ばれる）と接触し、ＥＣ出口ポート１３２を経て細胞増殖室１００を出る。ＥＣ入口ポート１２８およびＥＣ出口ポート１３２間の流体経路は細胞増殖室１００のＥＣ部１３６を含んでいる。ＥＣ入口ポート１２８を経て細胞増殖室に入る流体は中空糸１１６の外側と接触する。小分子（たとえば、水、酸素、乳酸塩、等）が中空糸中をその内部すなわちＩＣスペースからＥＣスペースへ、またはＥＣスペースからＩＣスペースへ拡散することができる。増殖因子等の高分子量の分子は典型的に中空糸膜中を通過するには大き過ぎ、中空糸のＩＣスペース内に留まる。媒体は必要に応じて交換することができる。また、必要に応じて媒体は人工肺中を循環してガスを交換することができる。細胞は第１の循環経路および／または第２の循環経路内に収納することができ、膜のＩＣ側および／またはＥＣ側とすることができる。
【００１２】
細胞増殖室ハウジング１０４は円筒形として示されているが、長方形キューブ等のさまざまな形を有することができる。細胞増殖室ハウジング１０４は任意タイプの生体適合性高分子材料で作ることができる。
【００１３】
次に、図２には細胞増殖システム（ＣＥＳ）の１つの可能な実施例の概略が示されている。ＣＥＳ２００は第１の流体循環経路２０２（「毛細血管内ループ」または「ＩＣループ」とも呼ばれる）および第２の流体循環経路２０４（「毛細血管外ループ」または「ＥＣループ」とも呼ばれる）を含んでいる。第１の流体流路２０６が細胞増殖室１００と流体的に連結されて第１の流体循環経路２０２を形成する。流体はＩＣ入口ポート１０８を通って細胞増殖室１００へ流入し、細胞増殖室１００内の中空糸中を流れ、ＩＣ出口ポートを経て出てゆく。圧力計２１０が細胞増殖室１００を離れる媒体の圧力を測定する。媒体はその流量を制御するのに使用できるＩＣ循環ポンプ２１２中を流れる。次に、媒体は弁２１４中を流れる。当業者ならばお判りのように、追加弁および／または他の装置をさまざまな場所に配置して、流体経路の一部に沿って媒体を分離しかつ／またはその特性を測定することができる。したがって、図示した略図はＣＥＳのさまざまなエレメントに対する１つの可能な構成を表し、図示した略図の修正は１つ以上の本発明の範囲内である。
【００１４】
ＩＣループに関して、操作中にサンプル・ポート２１６またはサンプル・コイル２１８から媒体のサンプルを得ることができる。第１の流体循環経路２０２内に配置された圧力／温度計２２０により操作中の媒体圧力および温度を検出することができる。また、バイオセンサ（図示せず）を第１の流体循環経路２０２内に流体的に配置して流体流路内の代謝レベルを測定することができる。次に、媒体はＩＣ入口ポート１０８へ戻って流体循環経路２０２を完了する。細胞増殖室１００内で成長／増殖された細胞はライン２９６および弁２９８を経て細胞増殖室１００から流し出すか、あるいはさらに増殖させるために中空糸内で再配分することができる。
【００１５】
第２の流体循環経路２０４はループ内の細胞増殖室１００と流体的に連結される第２の流体流路２２２を含んでいる。第２の流体循環経路２０４はＥＣ入口ポート１２８を経て細胞増殖室１００に入り、ＥＣ出口ポート１３２を経て細胞増殖室１００を離れる。媒体は細胞増殖室１００内の中空糸の外側に接触するため、小分子は中空糸内外で拡散することができる。
【００１６】
第２の流体循環経路２０４内に配置された圧力／温度計２２４により、媒体の圧力および温度は媒体が細胞増殖室１００のＥＣスペースへ入る前に測定することができる。圧力計２２６により第２の流体循環経路２０４内の媒体の圧力は媒体が細胞増殖室１００を離れた後で測定することができる。ＥＣループに関して、媒体のサンプルは操作中にサンプル・ポート２３０から得ることができる。ＩＣループ内で見つかるようなサンプル・コイル２１８はＥＣ媒体のサンプルを除去するＥＣループ内でも見つけることができる。
【００１７】
細胞増殖室１００のＥＣ出口ポート１３２を離れた後で、第２の流体循環経路２０４内の流体はＥＣ循環ポンプ２２８を介して人工肺２３２へ通過する。第２の流体流路２２２は人工肺入口ポート２３４および人工肺出口ポート２３６を経て人工肺２３２と流体的に連結されている。操作において、流体媒体は人工肺入口ポート２３４を経て人工肺２３２へ流入し、人工肺出口ポート２３６を経て人工肺２３２を出る。人工肺２３２はＣＥＳ内の媒体へ酸素を加えそこから気泡を除去する。さまざまな実施例において、第２の流体循環経路２０４内の媒体は人工肺２３２へ入る気体と平衡状態にある。人工肺２３２は当技術分野で知られている適切なサイズの人工肺とすることができる。空気または気体がフィルタ２３８を経て人工肺２３２へ流入し、フィルタ２４０を経て人工肺２３２から流出する。フィルタ２３８および２４０は人工肺２３２および関連する媒体の汚染を低減または防止する。
【００１８】
ＣＥＳ２００に対して示す構成において、第１の流体循環経路２０２および第２の流体循環経路２０４内の流体媒体は細胞増殖室１００中を同方向に流れる（並流構成（ｃｏ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ））。当業者ならば、ＣＥＳ２００は流体を逆流構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で流すようにも構成できることを認識するであろう。当業者ならば、各入口および出口ポートは細胞増殖室内の任意の場所に配置できることも認識するであろう。
【００１９】
少なくとも１つの実施例では、細胞および流体媒体は第１の流体入口経路２４２を経て流体循環経路２０２へ導入される。流量容器２４４（たとえば、溶剤）および流量容器２４６（たとえば、ＩＣ媒体）は、それぞれ、弁２４８および２５０を経て第１の流体入口経路２４２と流体的に連結されている。さまざまな入口経路のプライミングの目的で、第１および第２のシール可能な無菌プライミング経路２０８および２０９が設けられる。細胞および流体は熱交換機２５２（使用される場合）、ＩＣ入口ポンプ２５４中を進んで空気除去室２５６内に入る。空気除去室２５６は第１の循環経路２０２と流体的に連結されている。空気除去室２５６はその中の特定の測定位置における空気または流体の欠如を検出するための１つ以上の超音波センサを含むことができる。たとえば、超音波センサは空気除去室２５６の底部付近および／または頂部付近で使用してこれらの場所における空気または流体を検出することができる。プライミング・シーケンスの部分中にＣＥＳ２００から追い出された空気や気体は空気除去室２５６と流体的に関連付けられているライン２５８を経て大気排気空気弁（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ｏｕｔ ａｉｒ ｖａｌｖｅ）２６０へ放出することができる。
【００２０】
流体容器２６２（たとえば、細胞入口バッグ（または塩類液プライミング流体））が弁２６４を経て第１の循環経路２０２と流体的に連結されている。追加流体を流体容器２６６（たとえば、洗浄液）および流体容器２６８（たとえば、ＥＣ媒体）から第１または第２の流体循環経路２０２および２０４へ加えることができる。流体容器２６６は弁２７０と流体的に連結されており、それは分配弁２７２および第１の流体入口経路２４２を経て第１の流体循環経路２０２と流体的に連結されている。あるいは、流体容器２６６は弁２７０を開き分配弁２７２を閉じることにより第２の流体入口経路２７４と流体的に連結することができる。同様に、流体容器２６８は弁２７６と流体的に連結されており、それは第１の流体入口経路２４２を経て第１の流体循環経路２０２と流体的に連結されている。あるいは、流体容器２６８は弁２７６を開き分配弁２７２を閉じることにより第２の流体入口経路２７４と流体的に連結される。
【００２１】
ＩＣループ内で、流体は最初にＩＣ入力ポンプ２５４により進められる。ＥＣループ内で、流体は最初にＥＣ入力ポンプ２７８により進められる。超音波センサ等の空気検出器２８０をＥＣ入口経路２８４と連結することができる。
【００２２】
少なくとも１つの実施例では、第１および第２の流体循環経路２０２および２０４が廃棄ライン２８８と接続される。弁２９０が開かれると、ＩＣ媒体は熱交換機２５２に繋がれ次に廃棄バッグ２８６に繋がれる廃棄ライン２８８中を流れることができる。同様に、弁２９２が開かれると、ＥＣ媒体は熱交換機２５２に繋がれ次に廃棄バッグ２８６に繋がれる廃棄ライン２８８中を流れることができる。熱交換機２５２は廃棄ライン２８８から熱を回収して、それぞれ、第１または第２の流体入口経路２４２および２７４を経て入ってくる流体を加熱するのに利用できるようにする。
【００２３】
細胞は細胞採取経路２９６を経て採取することができる。ここで、細胞増殖室１００からの細胞は細胞採取経路２９６および弁２９８を介して細胞採取バッグ２９９へ細胞を含む媒体を汲みあげて採取することができる。細胞を採取する時、または他の所望する時に、分配ポンプ２９４は第１および第２の流体循環経路２０２および２０４間に配置されたコネクタ経路２８２を介して媒体を汲みあげることができる。
【００２４】
ＣＥＳのさまざまなコンポーネントをインキュベータ（図示せず）内に収納することができ、インキュベータは細胞および媒体を所望温度に維持する。
【００２５】
当業者ならばお判りのように、任意数の流体容器（たとえば、媒体バッグ）を任意の組合せでＣＥＳと流体的に連結することができる。さらに、空気除去室、または空気除去室から独立したセンサ、の場所はＩＣ入口ポート１０８の前のＣＥＳ内の任意の場所とすることができる。
【００２６】
図５に示すように、デジタル・コンピュータ１６００がＣＥＳ２００と有効に関連付けられている。デジタル・コンピュータ１６００はメモリ１６０４、少なくとも１つのプロセッサ１６０８、およびユーザ入力装置（マウス、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、光センサまたは言葉による指示）を経てユーザから命令を受信するユーザ・インターフェイス１６１２を含んでいる。さらに、デジタル・コンピュータ１６００はセンサ（圧力、温度、およびバイオセンサ）等のＣＥＳエレメント１６２４に対して情報を中継し、ポンプおよび弁等のＣＥＳ２００のさまざまな機械的システムを命令するＣＥＳコントローラ・インターフェイス１６２０を含んでいる。デジタル・コンピュータ１６００は、１つ以上の流体バッグがローおよび／または空であるかどうか等の、ＣＥＳ２００の他の側面を監視するための追加センサと通信することができる。デジタル・コンピュータ１６００により利用されるプログラミングは、限定はしない例として、ソフトウエアまたはファームウェアを含むことができる。
【００２７】
増殖サイクル中に、ある量の流体が細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間に流体循環経路（ＩＣおよび／またはＥＣ回路）から典型的に除去され、流体内の代謝産物および細胞増殖の他の副産物の量について解析される。流体流回路から除去された流体は任意の市販されている血液ガス分析装置（ここで使用された血液ガス分析装置はシーメンス８００シリーズであった）へ通されて流体内に含まれる代謝産物の量を測定することができる。血液ガス分析装置を使用して、乳酸塩（またはグルコース）の濃度をｍＭ／Ｌで測定することができる。直接化学等の他の測定方法も使用することができる。
【００２８】
代謝産物はバイオセンサを使用して測定することもできる。任意の市販されているバイオセンサを使用することができる。バイオセンサが滅菌されているか、あるいは酸化エチレンやガンマ線照射により滅菌できる材料で作られておれば、それを直接流体ライン内に流体的に接続することができる（インライン）。バイオセンサを滅菌できない場合、それは無菌バリア・フィルタを経て間接的に流体ライン内に接続することができる。
【００２９】
グルコースおよび乳酸塩分子は十分小さく膜を横切って均等に拡散し、平衡している。したがって、ＩＣ２０２またはＥＣ２０４側、あるいは廃棄ライン２８８内で任意の手段により正確な測定を行うことができる。流体はサンプリング・ポート２１６またはサンプル・コイル２１８を介してＩＣループ２０２から、さらに／またはサンプリング・ポート２３０を介してＥＣループ２０４から除去することができる。
【００３０】
好気的に増殖する細胞はグルコースおよび酸素を消費して乳酸塩を作り出す。細胞増殖室内に存在する細胞が多いほど、多くのグルコースおよび酸素が消費されて多くの乳酸塩が作り出される。細胞が高密度で、特に粘着性の細胞であれば、コロニー間の増加した細胞間相互作用により細胞増殖は減速する。細胞凝集も高い細胞密度において生じる。細胞増殖室の内側を直接見て細胞がシステムの無菌性を破壊することなく互いに増殖しているかを確かめることは現在慣例的に行われてはいない。したがって、乳酸塩等の細胞増殖の代謝産物、またはグルコースおよび酸素等の細胞増殖中に消費される産物を間接測量として使用し、細胞が合流点に達していて採取されなければならないかを決定できれば有利である。
【００３１】
細胞倍増数を決定し、次に、それは細胞増殖が鈍化する前に細胞を再播種または採取するための最善の時間を決定するようなアルゴリズムを発生することができる。倍増数は生成された乳酸塩の質量および細胞増殖システム内に最初に装填された細胞の数を使用して決定することができる。
再播種または採取は倍増数＝ｄ’の時に行われるべきであり、
Ｎ＝システム内の細胞数
Ｎ０＝細胞増殖室内に装填された開始細胞数
乳酸塩の質量ｍＬの変化率はＮに比例する
【数１】
倍増数を決定し、次に、それが再播種または採取する最善の時間を決定するようなアルゴリズムが使用される。倍増数は乳酸塩質量ｍＬおよびシステム内の初期細胞数Ｎから決定することができる。
【数２】
【００３２】
作り出される乳酸塩の割合は任意の時点におけるシステム内の細胞の数に比例する。細胞の数が増加すると細胞増殖率が減少するため、乳酸塩生成率も減少すると予期される。アルゴリズムに最初に入れられる数はｃおよびラインが平坦化するポイントの両方を変える。
【００３３】
細胞増殖室内に最初に装填される細胞の数、採取された細胞の数、および採取時の乳酸塩生成率を使用して、細胞増殖が鈍化し細胞が凝集を開始する前にいつ細胞を採取するか決定することができる。これは図４に示されている。
【００３４】
このアルゴリズムは図３に示すようにグラフ表示することができる。予期されるように、またグラフに示すように、曲線はコロニーがお互いの中に増殖するのに十分大きくなる時に指数関数的であることをやめ平坦化する。
【００３５】
限定はしないが１つの例として、１千万個の細胞が最初に細胞増殖室内に装填されており、オペレータは採取時に１億４千万個の細胞を望んでおれば、乳酸塩生成率がおよそ２．２ｍＭ／日の時に細胞を採取しなければならない。
【００３６】
オペレータはアルゴリズムの物理的発現（図３）を使用していつ細胞を採取するか決定することができ、あるいはアルゴリズムをデジタル・コンピュータ１６００で使用するためにコンピュータ・プログラム内に埋め込むことができる。
【００３７】
少なくとも１つの実施例では、図４に示すように、デジタル・コンピュータ１６００はアルゴリズムを含むメモリを有するプロセッサに接続される。細胞増殖サイクル中に、特定量の乳酸塩が増殖する細胞により生成されておれば、プロセッサは細胞を採取する時であることをオペレータに通知する。もう１つの実施例では、特定量の乳酸塩が生成されておればプロセッサは採取プロトコルを開始することができる。
【００３８】
このアルゴリズムを使用して、任意タイプのバイオリアクターに対して付着細胞を採取するのに最適の時はいつであるかを決定することができる。
【００３９】
当業者ならば、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本発明の構造および方法論をさまざまに修正および変更できることは自明である。本発明は特許請求の範囲および同等のものの範囲内に入る修正および変更を包含するものとする。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２００８年８月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／０８８，２２３号および２００９年３月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／１６０，０８２号の利点を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
少量のドナー細胞から培養されて増殖されたヒト幹細胞は損傷したまたは欠陥のある組織を修復または置き換えるのに使用することができ、また広範囲の病気の治療に対する広範な臨床応用を有する。再生医療の分野における最近の進歩はヒト幹細胞が自己複製能力、特殊化されない状態を維持する能力、および特定の条件の元で特殊化された細胞へ分化する能力等のユニークな特性を有することを示している。
【０００３】
再生医療の重要なコンポーネントとして、バイオリアクターすなわち細胞増殖システムは細胞成長および増殖のための最適化された環境を提供する役割を果たしている。バイオリアクターはクローズド滅菌システム内での細胞成長を助長する物理化学的環境を提供するだけでなく、細胞に栄養を与え代謝物を除去する。細胞増殖システムは幹細胞だけでなく他のタイプの細胞を増殖させるのにも使用することができる。
【０００４】
多くの種類のバイオリアクターを現在入手することができる。最も一般的な２つは平板型バイオリアクターおよび中空糸型バイオリアクターである。平板型バイオリアクターは大きな平面上で細胞を増殖させることができ、中空糸型バイオリアクターは中空糸の内側または外側で細胞を増殖させることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオリアクターの内側を見てクローズド・システムの無菌性を破壊することなくいつ増殖された細胞を採取するかを決定するのは現在の慣行ではない。無菌性を維持しながらいつ細胞を採取するかを決定する方法が必要とされている。本発明はこのような方法に向けられている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は細胞増殖システムの細胞増殖室からいつ細胞を採取するかを決定する方法に関連している。細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数を測定するステップと、細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間に生成される乳酸塩の濃度を測定するステップと、測定値を使用して細胞増殖サイクルの終りに細胞増殖室からいつ細胞を採取するかを決定するステップとを含んでいる。
【０００７】
本発明は細胞を含む細胞増殖室、少なくとも１台のポンプおよびデジタル・コンピュータを含む細胞増殖システムにも関連している。デジタル・コンピュータは、さらに、少なくとも１つのプロセッサと、メモリと、ユーザ・インターフェイスと、コントローラ・インターフェイスとを含んでいる。ユーザ・インターフェイスは細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数および細胞増殖サイクル中のさまざまな時間において測定された乳酸塩の濃度をオペレータが入力できるように構成される。メモリは細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数および細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間に測定された乳酸塩の濃度を取得して細胞増殖室内の細胞をいつ採取すべきかを決定する。次に、メモリはプロセッサを介してコントローラ・インターフェイスへ信号を送り、少なくとも１台のポンプが細胞増殖室を介して流体を汲み上げて細胞増殖室から細胞を除去するよう命令する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞増殖室の実施例の正面図である。
【図２】細胞増殖システムの実施例の略図である。
【図３】採取手順をいつ開始するかを示すグラフである。
【図４】採取手順をいつ開始するかを決定する方法の実施例のステップのフロー図である。
【図５】細胞増殖システムのデジタル・コンピュータ側面を例示するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（詳細な説明）
前記したように、いくつかのバイオリアクターすなわち細胞増殖室構成が細胞培養のために存在している。本発明に対して特定の構成は必要とされない。しかしながら、限定はしないが、一例として中空糸型バイオリアクターが図１に示されている。
【００１０】
図１に細胞増殖室１００の例が正面図で示されている。細胞増殖室１００は縦軸ＬＡ−ＬＡを有し、細胞増殖室ハウジング１０４を含んでいる。少なくとも１つの実施例では、細胞増殖室ハウジング１０４は４つの開口すなわちポート、ＩＣ入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、ＥＣ入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を含んでいる。
【００１１】
第１の循環経路内の流体は細胞増殖室１００の第１の長手方向端部１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を介して細胞増殖室１００へ入り、複数の中空糸１１６（中空糸は一般的に膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）とも呼ばれる）の毛細血管内側（さまざまな実施例において、中空糸膜の毛細血管内（ｉｎｔｒａｃａｐｉｌｌａｒｙ）（「ＩＣ」）側または「ＩＣスペース」と呼ばれる）を通過し、細胞増殖室１００の第２の長手方向端部１２４にあるＩＣ出口ポート１２０を介して細胞増殖室１００から出てゆく。ＩＣ入口ポート１０８およびＩＣ出口ポート１２０間の流体経路は細胞増殖室１００のＩＣ部１２６を画定する。第２の循環経路内の流体はＥＣ入口ポート１２８を介して細胞増殖室１００へ流入し、毛細血管外側すなわち中空糸１１６の外側（膜の「ＥＣ側」または「ＥＣスペース」と呼ばれる）と接触し、ＥＣ出口ポート１３２を経て細胞増殖室１００を出る。ＥＣ入口ポート１２８およびＥＣ出口ポート１３２間の流体経路は細胞増殖室１００のＥＣ部１３６を含んでいる。ＥＣ入口ポート１２８を経て細胞増殖室に入る流体は中空糸１１６の外側と接触する。小分子（たとえば、水、酸素、乳酸塩、等）が中空糸中をその内部すなわちＩＣスペースからＥＣスペースへ、またはＥＣスペースからＩＣスペースへ拡散することができる。増殖因子等の高分子量の分子は典型的に中空糸膜中を通過するには大き過ぎ、中空糸のＩＣスペース内に留まる。媒体は必要に応じて交換することができる。また、必要に応じて媒体は人工肺中を循環してガスを交換することができる。細胞は第１の循環経路および／または第２の循環経路内に収納することができ、膜のＩＣ側および／またはＥＣ側とすることができる。
【００１２】
細胞増殖室ハウジング１０４は円筒形として示されているが、長方形キューブ等のさまざまな形を有することができる。細胞増殖室ハウジング１０４は任意タイプの生体適合性高分子材料で作ることができる。
【００１３】
次に、図２には細胞増殖システム（ＣＥＳ）の１つの可能な実施例の概略が示されている。ＣＥＳ２００は第１の流体循環経路２０２（「毛細血管内ループ」または「ＩＣループ」とも呼ばれる）および第２の流体循環経路２０４（「毛細血管外ループ」または「ＥＣループ」とも呼ばれる）を含んでいる。第１の流体流路２０６が細胞増殖室１００と流体的に連結されて第１の流体循環経路２０２を形成する。流体はＩＣ入口ポート１０８を通って細胞増殖室１００へ流入し、細胞増殖室１００内の中空糸中を流れ、ＩＣ出口ポートを経て出てゆく。圧力計２１０が細胞増殖室１００を離れる媒体の圧力を測定する。媒体はその流量を制御するのに使用できるＩＣ循環ポンプ２１２中を流れる。次に、媒体は弁２１４中を流れる。当業者ならばお判りのように、追加弁および／または他の装置をさまざまな場所に配置して、流体経路の一部に沿って媒体を分離しかつ／またはその特性を測定することができる。したがって、図示した略図はＣＥＳのさまざまなエレメントに対する１つの可能な構成を表し、図示した略図の修正は１つ以上の本発明の範囲内である。
【００１４】
ＩＣループに関して、操作中にサンプル・ポート２１６またはサンプル・コイル２１８から媒体のサンプルを得ることができる。第１の流体循環経路２０２内に配置された圧力／温度計２２０により操作中の媒体圧力および温度を検出することができる。また、バイオセンサ（図示せず）を第１の流体循環経路２０２内に流体的に配置して流体流路内の代謝レベルを測定することができる。次に、媒体はＩＣ入口ポート１０８へ戻って流体循環経路２０２を完了する。細胞増殖室１００内で成長／増殖された細胞はライン２９６および弁２９８を経て細胞増殖室１００から流し出すか、あるいはさらに増殖させるために中空糸内で再配分することができる。
【００１５】
第２の流体循環経路２０４はループ内の細胞増殖室１００と流体的に連結される第２の流体流路２２２を含んでいる。第２の流体循環経路２０４はＥＣ入口ポート１２８を経て細胞増殖室１００に入り、ＥＣ出口ポート１３２を経て細胞増殖室１００を離れる。媒体は細胞増殖室１００内の中空糸の外側に接触するため、小分子は中空糸内外で拡散することができる。
【００１６】
第２の流体循環経路２０４内に配置された圧力／温度計２２４により、媒体の圧力および温度は媒体が細胞増殖室１００のＥＣスペースへ入る前に測定することができる。圧力計２２６により第２の流体循環経路２０４内の媒体の圧力は媒体が細胞増殖室１００を離れた後で測定することができる。ＥＣループに関して、媒体のサンプルは操作中にサンプル・ポート２３０から得ることができる。ＩＣループ内で見つかるようなサンプル・コイル２１８はＥＣ媒体のサンプルを除去するＥＣループ内でも見つけることができる。
【００１７】
細胞増殖室１００のＥＣ出口ポート１３２を離れた後で、第２の流体循環経路２０４内の流体はＥＣ循環ポンプ２２８を介して人工肺２３２へ通過する。第２の流体流路２２２は人工肺入口ポート２３４および人工肺出口ポート２３６を経て人工肺２３２と流体的に連結されている。操作において、流体媒体は人工肺入口ポート２３４を経て人工肺２３２へ流入し、人工肺出口ポート２３６を経て人工肺２３２を出る。人工肺２３２はＣＥＳ内の媒体へ酸素を加えそこから気泡を除去する。さまざまな実施例において、第２の流体循環経路２０４内の媒体は人工肺２３２へ入る気体と平衡状態にある。人工肺２３２は当技術分野で知られている適切なサイズの人工肺とすることができる。空気または気体がフィルタ２３８を経て人工肺２３２へ流入し、フィルタ２４０を経て人工肺２３２から流出する。フィルタ２３８および２４０は人工肺２３２および関連する媒体の汚染を低減または防止する。
【００１８】
ＣＥＳ２００に対して示す構成において、第１の流体循環経路２０２および第２の流体循環経路２０４内の流体媒体は細胞増殖室１００中を同方向に流れる（並流構成（ｃｏ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ））。当業者ならば、ＣＥＳ２００は流体を逆流構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で流すようにも構成できることを認識するであろう。当業者ならば、各入口および出口ポートは細胞増殖室内の任意の場所に配置できることも認識するであろう。
【００１９】
少なくとも１つの実施例では、細胞および流体媒体は第１の流体入口経路２４２を経て流体循環経路２０２へ導入される。流量容器２４４（たとえば、溶剤）および流量容器２４６（たとえば、ＩＣ媒体）は、それぞれ、弁２４８および２５０を経て第１の流体入口経路２４２と流体的に連結されている。さまざまな入口経路のプライミングの目的で、第１および第２のシール可能な無菌プライミング経路２０８および２０９が設けられる。細胞および流体は熱交換機２５２（使用される場合）、ＩＣ入口ポンプ２５４中を進んで空気除去室２５６内に入る。空気除去室２５６は第１の循環経路２０２と流体的に連結されている。空気除去室２５６はその中の特定の測定位置における空気または流体の欠如を検出するための１つ以上の超音波センサを含むことができる。たとえば、超音波センサは空気除去室２５６の底部付近および／または頂部付近で使用してこれらの場所における空気または流体を検出することができる。プライミング・シーケンスの部分中にＣＥＳ２００から追い出された空気や気体は空気除去室２５６と流体的に関連付けられているライン２５８を経て大気排気空気弁（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ｏｕｔ ａｉｒ ｖａｌｖｅ）２６０へ放出することができる。
【００２０】
流体容器２６２（たとえば、細胞入口バッグ（または塩類液プライミング流体））が弁２６４を経て第１の循環経路２０２と流体的に連結されている。追加流体を流体容器２６６（たとえば、洗浄液）および流体容器２６８（たとえば、ＥＣ媒体）から第１または第２の流体循環経路２０２および２０４へ加えることができる。流体容器２６６は弁２７０と流体的に連結されており、それは分配弁２７２および第１の流体入口経路２４２を経て第１の流体循環経路２０２と流体的に連結されている。あるいは、流体容器２６６は弁２７０を開き分配弁２７２を閉じることにより第２の流体入口経路２７４と流体的に連結することができる。同様に、流体容器２６８は弁２７６と流体的に連結されており、それは第１の流体入口経路２４２を経て第１の流体循環経路２０２と流体的に連結されている。あるいは、流体容器２６８は弁２７６を開き分配弁２７２を閉じることにより第２の流体入口経路２７４と流体的に連結される。
【００２１】
ＩＣループ内で、流体は最初にＩＣ入力ポンプ２５４により進められる。ＥＣループ内で、流体は最初にＥＣ入力ポンプ２７８により進められる。超音波センサ等の空気検出器２８０をＥＣ入口経路２８４と連結することができる。
【００２２】
少なくとも１つの実施例では、第１および第２の流体循環経路２０２および２０４が廃棄ライン２８８と接続される。弁２９０が開かれると、ＩＣ媒体は熱交換機２５２に繋がれ次に廃棄バッグ２８６に繋がれる廃棄ライン２８８中を流れることができる。同様に、弁２９２が開かれると、ＥＣ媒体は熱交換機２５２に繋がれ次に廃棄バッグ２８６に繋がれる廃棄ライン２８８中を流れることができる。熱交換機２５２は廃棄ライン２８８から熱を回収して、それぞれ、第１または第２の流体入口経路２４２および２７４を経て入ってくる流体を加熱するのに利用できるようにする。
【００２３】
細胞は細胞採取経路２９６を経て採取することができる。ここで、細胞増殖室１００からの細胞は細胞採取経路２９６および弁２９８を介して細胞採取バッグ２９９へ細胞を含む媒体を汲みあげて採取することができる。細胞を採取する時、または他の所望する時に、分配ポンプ２９４は第１および第２の流体循環経路２０２および２０４間に配置されたコネクタ経路２８２を介して媒体を汲みあげることができる。
【００２４】
ＣＥＳのさまざまなコンポーネントをインキュベータ（図示せず）内に収納することができ、インキュベータは細胞および媒体を所望温度に維持する。
【００２５】
当業者ならばお判りのように、任意数の流体容器（たとえば、媒体バッグ）を任意の組合せでＣＥＳと流体的に連結することができる。さらに、空気除去室、または空気除去室から独立したセンサ、の場所はＩＣ入口ポート１０８の前のＣＥＳ内の任意の場所とすることができる。
【００２６】
図５に示すように、デジタル・コンピュータ１６００がＣＥＳ２００と有効に関連付けられている。デジタル・コンピュータ１６００はメモリ１６０４、少なくとも１つのプロセッサ１６０８、およびユーザ入力装置（マウス、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、光センサまたは言葉による指示）を経てユーザから命令を受信するユーザ・インターフェイス１６１２を含んでいる。さらに、デジタル・コンピュータ１６００はセンサ（圧力、温度、およびバイオセンサ）等のＣＥＳエレメント１６２４に対して情報を中継し、ポンプおよび弁等のＣＥＳ２００のさまざまな機械的システムを命令するＣＥＳコントローラ・インターフェイス１６２０を含んでいる。デジタル・コンピュータ１６００は、１つ以上の流体バッグがローおよび／または空であるかどうか等の、ＣＥＳ２００の他の側面を監視するための追加センサと通信することができる。デジタル・コンピュータ１６００により利用されるプログラミングは、限定はしない例として、ソフトウエアまたはファームウェアを含むことができる。
【００２７】
増殖サイクル中に、ある量の流体が細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間に流体循環経路（ＩＣおよび／またはＥＣ回路）から典型的に除去され、流体内の代謝産物および細胞増殖の他の副産物の量について解析される。流体流回路から除去された流体は任意の市販されている血液ガス分析装置（ここで使用された血液ガス分析装置はシーメンス８００シリーズであった）へ通されて流体内に含まれる代謝産物の量を測定することができる。血液ガス分析装置を使用して、乳酸塩（またはグルコース）の濃度をｍＭ／Ｌで測定することができる。直接化学等の他の測定方法も使用することができる。
【００２８】
代謝産物はバイオセンサを使用して測定することもできる。任意の市販されているバイオセンサを使用することができる。バイオセンサが滅菌されているか、あるいは酸化エチレンやガンマ線照射により滅菌できる材料で作られておれば、それを直接流体ライン内に流体的に接続することができる（インライン）。バイオセンサを滅菌できない場合、それは無菌バリア・フィルタを経て間接的に流体ライン内に接続することができる。
【００２９】
グルコースおよび乳酸塩分子は十分小さく膜を横切って均等に拡散し、平衡している。したがって、ＩＣ２０２またはＥＣ２０４側、あるいは廃棄ライン２８８内で任意の手段により正確な測定を行うことができる。流体はサンプリング・ポート２１６またはサンプル・コイル２１８を介してＩＣループ２０２から、さらに／またはサンプリング・ポート２３０を介してＥＣループ２０４から除去することができる。
【００３０】
好気的に増殖する細胞はグルコースおよび酸素を消費して乳酸塩を作り出す。細胞増殖室内に存在する細胞が多いほど、多くのグルコースおよび酸素が消費されて多くの乳酸塩が作り出される。細胞が高密度で、特に粘着性の細胞であれば、コロニー間の増加した細胞間相互作用により細胞増殖は減速する。細胞凝集も高い細胞密度において生じる。細胞増殖室の内側を直接見て細胞がシステムの無菌性を破壊することなく互いに増殖しているかを確かめることは現在慣例的に行われてはいない。したがって、乳酸塩等の細胞増殖の代謝産物、またはグルコースおよび酸素等の細胞増殖中に消費される産物を間接測量として使用し、細胞が合流点に達していて採取されなければならないかを決定できれば有利である。
【００３１】
細胞倍増数を決定し、次に、それは細胞増殖が鈍化する前に細胞を再播種または採取するための最善の時間を決定するようなアルゴリズムを発生することができる。倍増数は生成された乳酸塩の質量および細胞増殖システム内に最初に装填された細胞の数を使用して決定することができる。
再播種または採取は倍増数＝ｄ’の時に行われるべきであり、
Ｎ＝システム内の細胞数
Ｎ０＝細胞増殖室内に装填された開始細胞数
乳酸塩の質量ｍＬの変化率はＮに比例する
【数１】
倍増数を決定し、次に、それが再播種または採取する最善の時間を決定するようなアルゴリズムが使用される。倍増数は乳酸塩質量ｍＬおよびシステム内の初期細胞数Ｎから決定することができる。
【数２】
【００３２】
作り出される乳酸塩の割合は任意の時点におけるシステム内の細胞の数に比例する。細胞の数が増加すると細胞増殖率が減少するため、乳酸塩生成率も減少すると予期される。アルゴリズムに最初に入れられる数はｃおよびラインが平坦化するポイントの両方を変える。
【００３３】
細胞増殖室内に最初に装填される細胞の数、採取された細胞の数、および採取時の乳酸塩生成率を使用して、細胞増殖が鈍化し細胞が凝集を開始する前にいつ細胞を採取するか決定することができる。これは図４に示されている。
【００３４】
このアルゴリズムは図３に示すようにグラフ表示することができる。予期されるように、またグラフに示すように、曲線はコロニーがお互いの中に増殖するのに十分大きくなる時に指数関数的であることをやめ平坦化する。
【００３５】
限定はしないが１つの例として、１千万個の細胞が最初に細胞増殖室内に装填されており、オペレータは採取時に１億４千万個の細胞を望んでおれば、乳酸塩生成率がおよそ２．２ｍＭ／日の時に細胞を採取しなければならない。
【００３６】
オペレータはアルゴリズムの物理的発現（図３）を使用していつ細胞を採取するか決定することができ、あるいはアルゴリズムをデジタル・コンピュータ１６００で使用するためにコンピュータ・プログラム内に埋め込むことができる。
【００３７】
少なくとも１つの実施例では、図４に示すように、デジタル・コンピュータ１６００はアルゴリズムを含むメモリを有するプロセッサに接続される。細胞増殖サイクル中に、特定量の乳酸塩が増殖する細胞により生成されておれば、プロセッサは細胞を採取する時であることをオペレータに通知する。もう１つの実施例では、特定量の乳酸塩が生成されておればプロセッサは採取プロトコルを開始することができる。
【００３８】
このアルゴリズムを使用して、任意タイプのバイオリアクターに対して付着細胞を採取するのに最適の時はいつであるかを決定することができる。
【００３９】
当業者ならば、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本発明の構造および方法論をさまざまに修正および変更できることは自明である。本発明は特許請求の範囲および同等のものの範囲内に入る修正および変更を包含するものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖システムの細胞増殖室からいつ細胞を採取するかを決定する方法であって、
前記細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数を測定するステップと、
細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において生成された乳酸塩の濃度を測定するステップと、
測定値を使用して細胞増殖サイクルの終りに前記細胞増殖室から増殖された細胞をいつ採取するかを決定するステップと、
を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、細胞増殖サイクルの終りに前記細胞増殖室から前記細胞を採取する時はいつであるかを決定する前記ステップはｌｎｍＬ＝ｃ＋ｌｎＮ０である前記方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法であって、細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において生成された乳酸塩の前記濃度を測定する前記ステップは、さらに、前記細胞増殖システムの廃棄ラインの乳酸塩を測定するステップを含む前記方法。
【請求項４】
細胞増殖システムと動作可能に結合されたデジタル・コンピュータであって、
少なくとも１つのプロセッサと、
前記細胞増殖システム内に最初に装填された細胞の数、および、
細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の濃度を、
オペレータが入力できるように構成されたユーザ・インターフェイスと、
コントローラ・インターフェイスと、
細胞増殖室内に最初に装填された細胞の前記数および前記細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の前記濃度を取得して前記細胞をいつ採取すべきか決定するアルゴリズムを含むメモリと、
を含む前記デジタル・コンピュータ。
【請求項５】
細胞を含む細胞増殖室と、
少なくとも１台のポンプと、
細胞増殖システムと動作可能に結合されたデジタル・コンピュータと、
を含む細胞増殖システムであって、前記デジタル・コンピュータは、
少なくとも１つのプロセッサと、
メモリと、
前記細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数、および
細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の濃度を、オペレータが入力できるように構成された
ユーザ・インターフェイスと、
コントローラ・インターフェイスと、を含み、
前記メモリは前記細胞増殖室内に最初に装填された細胞の前記数および前記細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の前記濃度を取得して前記細胞増殖室内の前記細胞をいつ採取すべきかを決定し、さらに、少なくとも１つのプロセッサを介して前記コントローラ・インターフェイスへ信号を送って前記少なくとも１台のポンプに前記細胞増殖室を介して流体を汲み上げ前記細胞増殖室から前記細胞を除去するよう命令する細胞増殖システム。
【請求項１】
細胞増殖システムの細胞増殖室からいつ細胞を採取するかを決定する方法であって、
前記細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数を測定するステップと、
細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において生成された乳酸塩の濃度を測定するステップと、
測定値を使用して細胞増殖サイクルの終りに前記細胞増殖室から増殖された細胞をいつ採取するかを決定するステップと、
を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、細胞増殖サイクルの終りに前記細胞増殖室から前記細胞を採取する時はいつであるかを決定する前記ステップはｌｎｍＬ＝ｃ＋ｌｎＮ０である前記方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法であって、細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において生成された乳酸塩の前記濃度を測定する前記ステップは、さらに、前記細胞増殖システムの廃棄ラインの乳酸塩を測定するステップを含む前記方法。
【請求項４】
細胞増殖システムと動作可能に結合されたデジタル・コンピュータであって、
少なくとも１つのプロセッサと、
前記細胞増殖システム内に最初に装填された細胞の数、および、
細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の濃度を、
オペレータが入力できるように構成されたユーザ・インターフェイスと、
コントローラ・インターフェイスと、
細胞増殖室内に最初に装填された細胞の前記数および前記細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の前記濃度を取得して前記細胞をいつ採取すべきか決定するアルゴリズムを含むメモリと、
を含む前記デジタル・コンピュータ。
【請求項５】
細胞を含む細胞増殖室と、
少なくとも１台のポンプと、
細胞増殖システムと動作可能に結合されたデジタル・コンピュータと、
を含む細胞増殖システムであって、前記デジタル・コンピュータは、
少なくとも１つのプロセッサと、
メモリと、
前記細胞増殖室内に最初に装填された細胞の数、および
細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の濃度を、オペレータが入力できるように構成された
ユーザ・インターフェイスと、
コントローラ・インターフェイスと、を含み、
前記メモリは前記細胞増殖室内に最初に装填された細胞の前記数および前記細胞増殖サイクル全体を通してさまざまな時間において測定された乳酸塩の前記濃度を取得して前記細胞増殖室内の前記細胞をいつ採取すべきかを決定し、さらに、少なくとも１つのプロセッサを介して前記コントローラ・インターフェイスへ信号を送って前記少なくとも１台のポンプに前記細胞増殖室を介して流体を汲み上げ前記細胞増殖室から前記細胞を除去するよう命令する細胞増殖システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５３０３１０（Ｐ２０１１−５３０３１０Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３０４９（Ｐ２０１１−５２３０４９）
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２９７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９４３９
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５０７１４５５１４）カリディアンビーシーティ、インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２９７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９４３９
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５０７１４５５１４）カリディアンビーシーティ、インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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