ヒアルロン酸の製造法
【課題】各種飲食品へも配合可能なヒアルロン酸を高収率で製造する方法の提供。
【解決手段】ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法、及び該方法により得られるヒアルロン酸。
【解決手段】ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法、及び該方法により得られるヒアルロン酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌によるヒアルロン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸やヘパリン等とともに高価なグルコサミノグルカンであり、哺乳動物の結合組織中に微量であるが広く分布し、また微生物にも存在することが知られている。そして、これらから抽出、精製された高純度のヒアルロン酸は、高い保湿性、高粘性、創傷治癒性等の性質を有することから、その機能に着目して、化粧品配合素材、眼科手術の際の保護剤、関節炎治療剤等として広く使用されている。
また、近年では、食品分野においても、保健効果や機能性等、付加価値に対する消費者の関心が高まっており、ヒアルロン酸は、それが持つ機能性により種々の効果が期待できることから、食品素材の一つとしても注目されている。
【０００３】
従来、ヒアルロン酸の製造は、鶏冠、牛の関節もしくは鯨の軟骨からの抽出による工業的な製法で行われてきたが、生体内にはヒアルロン酸が微量にしか存在せず、しかも、組織中でタンパク質や他のムコ多糖類と複合体を形成しているため、当該タンパク質やムコ多糖との分離精製に複雑な工程を必要とするため大量に生産することは難しく、微生物を用いた培養法によるヒアルロン酸の製造方法が一般的に実施されている（特許文献1−4参照）。
【０００４】
ヒアルロン酸を産生する微生物としては、ストレプトコッカス属細菌のうち、ランスフィールド（Lancefield）血清群のA、C及びD型菌、具体的には、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、そして、パスツレラ・マルトシダ（Passteurella multocida）が古くから良く知られている（非特許文献１−８参照）。
【０００５】
しかしながら、これらの微生物のうちランスフィールド（Lancefield）血清群のA型菌やパスツレラは、ヒトに対する病原菌として知られており、また、これら何れの菌もストレプトリジン（可溶性溶血素）を生成し、β−溶血性を示すことから、これらの微生物を利用した工業的なヒアルロン酸の製造方法に関しては、安全性を確保するため、無毒化した菌株を利用する他、当該微生物が産生したヒアルロン酸から有害物を除去する工程により精製するなどの別途の手段を講じる必要が生じ、製造面でも作業性はあまりよいとはいえない。
また、一般的に微生物を用いた培養法によるヒアルロン酸の製造法は、生産性が低いことが指摘されていることから、生産性の改善又は向上させるための手段が重要であり、そのため生産収率の向上を目的とした多くの報告がなされている（特許文献５−９参照）。
このなかで、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を用いたヒアルロン酸の製造方法が報告されている(特許文献９参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平４−５５６７５号公報
【特許文献２】特公平４−４８６８号公報
【特許文献３】特公平４−４３６３７号公報
【特許文献４】特公平４−３９９９８号公報
【特許文献５】特公平４−１２９６０号公報
【特許文献６】特公平４−１８８３９号公報
【特許文献７】特公平７−２１１７号公報
【特許文献８】特開２０００−１８９１８５号公報
【特許文献９】特開２００９−１１２２６０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】F.E. Kendall et al., J.Biol.chem.,118,61,1937
【非特許文献２】W.A. Pierce et al., J.Baact, 63,301,1952
【非特許文献３】A.P. MacLennan, J.Gen.Microbiol., 14,134-142,1956
【非特許文献４】B. Holmstrom et al., Appl.Microbiol., 15,1409-1413,1967
【非特許文献５】J.B. Woolcock., J.Gen.Microbiol., 85,372-375,1974
【非特許文献６】E. kjems et al., Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B, 84,162-164,1976
【非特許文献７】T. Bergan et al., Acta Path.Microbiol.Scand,75,97-103,1969
【非特許文献８】J.A. Cifonelli., Carbohyd.Res., 14,272-276,1970
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、美容等の効果が期待できる機能性を有し、各種飲食品へも配合が可能なヒアルロン酸をより安価でかつ簡便に効率よく製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ヨーグルトの製造にも使用可能なストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を用いた安全なヒアルロン酸の製造方法、特に乳成分を含有する培地に大豆ペプチドを加えることによってヒアルロン酸の生産性が更に向上することを既に報告している(特許文献９参照)。
しかし、この大豆ペプチドを培地に加える方法では、培地作製の工程において、大豆ペプチドを培地に添加するための工程が増えること；ヒアルロン酸の精製工程において、添加した大豆ペプチドが沈殿するので、粘性のあるヒアルロン酸からこれを除去するための時間や工程を要すること等によって、簡便に効率よくヒアルロン酸を生産することが難しい。このため、この方法では、特に工業的レベルにおいて、作業効率の向上が図りにくく、また大豆原料価格が不安定であることから、ヒアルロン酸の生産コストが上がってしまうというデメリットがあり、大豆ペプチドを使用しない方法又はこの使用量の低減が求められていた。
また、乳酸菌の培養にあたっては、乳酸菌の主要なエネルギー源の１つであるラクトースを培地組成に含むことが好ましいが、培養終了後の培養液中にラクトースが多く残存すると、目的とするヒアルロン酸中にラクトースが混入することとなる。このため、通常、ヒアルロン酸の精製工程において透析等でラクトースを除去しているが、ヒアルロン酸の生産性を維持しつつ、予め培養終了時の培養液中のラクトース濃度を低下させることが、作業効率の向上やヒアルロン酸の品質向上の点から求められている。
【００１０】
そこで、本発明者が、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を、培養液をｐＨ６〜８に調整しつつ、３７℃〜４０℃と云う特定の温度帯で培養することにより効率よくヒアルロン酸の生産量を増加できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法、及び該方法により得られるヒアルロン酸を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することにより、より安価でかつ簡便に効率よくヒアルロン酸を製造することが可能となる。そして、同乳酸菌はヨーグルト等の製造に利用できる細菌であるので、同乳酸菌を用いて得られたヒアルロン酸は、安全性も高く、各種飲食品、化粧品や医薬品へ配合可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の培養温度とヒアルロン酸収量およびμmaxの関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種し、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃の温度で培養を行う。これによって、より安価でかつ簡便に効率よく飲食品等に配合可能なヒアルロン酸が得られる。
【００１５】
本発明の方法で使用するストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌（以下、「本発明の乳酸菌」とも云う）としては、ヒアルロン酸産生能を有するものであればよく、特に制限されることなく適用することが可能であり、具体的にはストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を挙げることができる。
【００１６】
本発明の方法において、ヒアルロン酸の産生は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、培養液をｐＨ６〜８に調整しつつ、３７℃から４０℃の温度で培養することにより行う。
この３７〜４０℃と云う特定の温度帯になるように調整して培養することにより、ヒアルロン酸の生産量を簡便に増加させることが可能となる。
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の、培養温度の変化によるヒアルロン酸の生産量の違いはこれまで知られていないが、一般的にストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の最適な培養温度は４２℃程度といわれており（L. De Vuyst et al., J. Appl. Microbiol., 84:1059-1068,1998；B. Zisu and N. P. Shah, J. Dairy Sci.,86:3405-3415,2003参照）、この４２℃の温度で最大比増殖速度（μmax）は最も高くなる。また生成する代謝物の量は、対数増殖期のμmaxが高いほど増加するという報告がなされている（L. De Vuyst et al., J. Appl. Microbiol., 84:1059-1068,1998）。しかしながら、後記実施例３で示すように、ヒアルロン酸産生において、対数増殖期のμmaxとヒアルロン酸の生成量に正の相関は見られなかった。すなわち、図１から明らかなように、３７〜４０℃の条件下では、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖速度は、４２℃に比べて増加していない。それにもかかわらず、ヒアルロン酸の生産量は４２℃に比べて顕著に増大している。このことは、３７〜４０℃の範囲では増殖速度と関係なく、ヒアルロン酸の生産能力が向上していることを示しており、かかる生産性向上は全く予想外であった。しかも、３７〜４０℃の範囲では、培養終了の際、培養液中にラクトースが全く又はほとんど認められなかったことから、効率よく品質の良いヒアルロン酸を得ることができる。
また、後記実施例１に示すように、ｐＨ６未満の酸性領域に調整して培養した場合には、ヒアルロン酸の生産量が低下する。このため、培養液のｐＨは本発明の乳酸菌の発育と共に低下するので、培養中の培養液は、苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア等の各種ｐＨ調整剤を用いて、ｐＨ６〜８にコントロールすることが必要である。当該ｐＨは、６．０〜７．５、より６．３〜７．３、更に６．８〜７．３であるのが、ヒアルロン酸の生産量が増加することから、好ましい。
【００１７】
本発明の方法において、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養は、培養液をｐＨ６〜８に調整し、かつ培養温度を３７℃〜４０℃に調整する以外は、攪拌培養や通気攪拌培養等の公知の方法で行えばよい。
【００１８】
本発明の方法において、上記本発明の乳酸菌の培養に用いる培地は、特に制限されることなく、通常の培地を用いることができる。
例えば、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース等の炭素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ、チオ硫酸ソーダ、リン酸アンモニウム等の無機塩類、大豆ペプチド、ポリペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー等の有機栄養源の他、必要に応じて各種アミノ酸、ビタミン類が添加されてなる乳酸菌の増殖用として通常用いられる栄養培地の他、獣又は植物由来の乳を含む培地、すなわち乳培地を用いることができる。
【００１９】
特に、本発明の乳酸菌により産生されたヒアルロン酸を飲食可能な乳成分としてそのまま利用することができる点で、乳成分を含有する培地を用いて発酵乳を製造することが好ましい。
なお、本明細書中において、乳成分とは、牛乳・山羊乳等の獣乳の生乳、加熱乳、脱脂粉乳、全脂粉乳或いは生クリーム等；又は豆乳、アーモンド乳、ココナッツミルク等の植物乳の各種乳蛋白質を少なくとも含有する物を意味する。
【００２０】
本発明の乳酸菌が産生したヒアルロン酸（以下、「本発明のヒアルロン酸」とも云う）は、通常の多糖類の分離・採取方法に従って、培養液から分離・採取すればよい。例えば、培養液中の菌体などの不溶物をろ過または遠心分離により分別後、この溶液から、例えばエタノール等の溶媒沈殿剤を用いて精製ヒアルロン酸を分取することができる。
なお、乳培地を用いた場合には、本発明の乳酸菌が産生したヒアルロン酸を含有する乳成分としてそのまま使用すればよいが、常法に従って、ヒアルロン酸を分取して使用することも可能である。
【００２１】
このようにして得られる本発明のヒアルロン酸は、従来の一般的なヒアルロン酸とは異なる分子量分布を示す。具体的には、本発明のヒアルロン酸の平均分子量は、３０万〜１５０万、さらに５０万〜１００万程度である。また、その分子量分布は１０万〜３００万程度の範囲であり、その最大ピークは１００万あたりにある。従来の一般的なヒアルロン酸の最大ピークが２００万〜３００万あたりであることから、本発明のヒアルロン酸は、従来の一般的なヒアルロン酸に比べて分子量が小さく、皮膚への浸透性が向上していると考えられる。
【００２２】
本発明の方法で得られる本発明のヒアルロン酸は、従来と同様に、医薬品や化粧品等の形態で使用することができる他、ヨーグルト等の製造に利用できるストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌が産生するものであるため、食品の形態として投与することも可能である。例えば、美容や老化防止などの効果を訴求する医薬品や栄養補助食品等の形態で用いる場合であれば、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、散剤等の固形製剤、或いはシロップ剤等の液状製剤として経口投与することができる。
【００２３】
これらの製剤の製造時には、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤；白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、モノグリセリド、蔗糖脂肪酸エステル等の滑沢剤や、その他、医薬・食品等として許容され得る成分を適宜配合することができる。
【００２４】
また、同様の生理効果を期待して一般食品形態とする場合には、本発明の方法により得られたヒアルロン酸をそのまま或いは適宜精製処理したものを油脂、錠菓、発酵乳、飴、調味料、ふりかけ等の飲食品に添加し、常法により製造すればよい。
【００２５】
発酵食品、特に発酵乳とする場合には、発酵原料中で、前記したストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌により発酵（培養）させることにより製造することができる。
このとき、培養液のｐＨは６〜８に、かつ培養温度は３７℃〜４０℃に、常に保持していなくてもよい。これらを保持しない場合は、発酵製品の製造において、生成するヒアルロン酸量が所望の濃度となるように、本発明のｐＨ条件及び培養温度条件を確保する以外は適宜、乳酸菌の至適培養温度・ｐＨや冷蔵温度等の温度に設定することができる。
なお、発酵乳とは、乳等省令により定められている発酵乳、乳製品乳酸菌飲料等の生菌含有タイプの飲料や殺菌処理の施された発酵乳を含有する乳性飲料、更には、ケフィア等をいう。
発酵に際しては、前記本発明の乳酸菌のヒアルロン酸産生能を損わない範囲で、その他の菌、例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ・ブルガリカス、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ・デルブルッキィ等のラクトバチルス属細菌やラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ・ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス等のラクトコッカス属細菌、ロイコノストック・メセンテロイテス、ロイコノストック・ラクチス等のロイコノストック属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム等のエンテロコッカス属細菌等を使用することができる。
【００２６】
また、これ以外に、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アニマリス等のビフィドバクテリウム属細菌や酵母その他の微生物を使用しても良い。これらは、１種または２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２７】
また、これらの食品には、その他の食品素材、すなわち、各種糖質や乳化剤、増粘剤、甘味料、酸味料、果汁等を適宜配合してもよい。具体的には、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤等が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類等の各種ビタミン類やカルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類を配合することができる。
【００２８】
また、本発明の方法で得られるヒアルロン酸は、乳液、化粧液、ファンデーション、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンスなど、化粧品等の外用剤の形態とすることもできる。これらの外用剤は、常法に従って製造すればよく、本発明の方法で得られるヒアルロン酸も、培地から単離・精製したものとして、或いはヒアルロン酸を含む乳成分として前記製造の任意の段階で適宜配合すればよい。なお、これらの外用剤には、必要に応じて、化粧品製造に通常使用される成分、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、ビタミン類、アミノ酸などを配合することができる。
【００２９】
上記医薬品や化粧品又は、食品中の本発明の方法で得られるヒアルロン酸の配合量は、その効果が得られ、かつ過剰摂取等の問題が生じない程度の量を適宜決定すればよい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例、試験例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に何ら制約されるものではない。
【００３１】
実施例１ （ｐＨ調整による効果）
（１）菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を下記方法に従って培養した。
１０％(w/v)スキムミルク（以下、「１０％スキムミルク」とする）溶液培地（１Ｌ）をオートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）のスターターを０．１％(v/v)接種し、培養温度３５℃で２４時間培養した。このときの培養は、培地のｐＨを８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．８、７．３、６．８、６．３、５．８又は５．３付近に調整しながら、回転数１００rpmの条件で攪拌して行った。
なお、１０％スキムミルク溶液培地の組成は、培地１Ｌ中、スキムミルク１００ｇであった。また、スターターの培地として、１０％スキムミルク溶液培地を用いた。
【００３２】
（２）ヒアルロン酸の抽出、調製
前記により得た各培養液（１Ｌ）を氷中で冷却し、終濃度が１０％（w/v）になるようにトリクロロ酢酸（以下「ＴＣＡ」という）を加え、４℃で２時間静置した。これを１８，７００Ｇの条件で３０分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに９９％冷エタノールを等量加えて、４℃で一晩静置した。静置後、１８，７００Ｇの条件で３０分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane（ＭＷＣＯ３５００）を用いて透析を行い、ｐＨ７に調整後、凍結乾燥してヒアルロン酸を得た。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１に示したとおり、ヒアルロン酸の生成量は、ｐＨの範囲を酸性やアルカリ性の条件よりも中性条件に調整する方が高いことが明らかとなった。
【００３５】
実施例２
（１）菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を下記方法に従って培養した。
１０％スキムミルク溶液培地（１Ｌ）をオートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）のスターターを０．１％(v/v)接種し、培養温度３７℃で２８時間培養した。このときの培養は、培地のｐＨを８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて６．８付近に調整しながら、回転数１００rpmの条件で攪拌して行った。また、培養温度「３７℃」を「４０℃」に代えて同様に培養を行った。
なお、１０％スキムミルク溶液培地の組成は、培地１Ｌ中、スキムミルク１００ｇであった。また、スターターの培地として、１０％スキムミルク溶液培地を用いた。
【００３６】
（２）ヒアルロン酸の検出
ヒアルロン酸の検出は、ビオチン化ヒアルロン酸バインディングプロテイン(b-HABP、生化学工業)を用いて、以下の方法によって行った。
アッセイには９６ウェルイムノプレート（Nunc）を用いた。２０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー(ｐＨ９．６)にStreptococcus zooepidemicus由来ヒアルロン酸ナトリウム (Ｗａｋｏ)を１００μｇ/ｍＬになるように溶解し、ウェルに２００μＬアプライした。３７℃で４時間インキュベートすることにより、ウェル内部をヒアルロン酸でコーティングした。
インキュベート後、０．０５％(v/v)のＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）を含むＰＢＳ(PBST)で3回洗浄した。洗浄はすべてこの操作で行った。さらに、PBSTに溶解したウシ由来血清アルブミン(Boehringer Mannheim)(１％(v/v))を２００μＬアプライし、４℃で１８時間ブロッキングした。洗浄後、適宜PBSTで希釈した培養上清、およびb-HABP (0.5 μg/ml in PBST)を１００μＬずつ同時にアプライし、３７℃、１時間インキュベートした。
これを洗浄後、ExtraAvidin alkaline phosphatase conjugate (Sigma)をPBSTで１／７００００希釈したものを２００μＬアプライし、３７℃で３０分インキュベートした。洗浄後、4-nitrophenyl phosphate disium salt hexahydrate (Sigma) を１ｍＭ MgCl2と２ｍＭ ZnCl2を含む０．１Ｍグリシンバッファー (ｐＨ１０．４)に溶解したものを(１tablet/２０ｍＬ)、２００ｍＬアプライした。
３７℃で１時間インキュベートした後の吸光度(４０５ｎｍ)からアプライ直後の吸光度(４０５ｎｍ)を引いて、培養上清中に含まれるヒアルロン酸濃度を計算した。検量線にはコーティングに用いたヒアルロン酸を用いた。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２に示した通り、ビオチン化ヒアルロン酸バインディングプロテインによって培養上清中の多糖類がヒアルロン酸であることを確認することが出来た。
【００３９】
実施例３ （培養温度調整による効果）
（１）菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を下記方法に従って培養した。
培養温度「３５℃、３７℃、４０℃又は４２℃」で行った以外は、実施例２（ｐＨ６．８付近）と同様の方法により、各培養を行った。
（２）ヒアルロン酸の抽出、調製
前記実施例１と同様の方法にて、培養終了後の各培養液から、それぞれのヒアルロン酸を得た。
【００４０】
図１及び表３で示したように３７℃〜４０℃で培養した場合ヒアルロン酸の生成量が顕著に増加した。また対数増殖期のμmaxは３７℃と４０℃で低い値を示し、ヒアルロン酸収量との正の相関は認められなかった。
【００４１】
【表３】
【００４２】
また、培養温度「３７℃」及び「４０℃」の培養条件において、実施例２のヒアルロン酸検出量と、上記ヒアルロン酸の収量とが、それぞれほぼ一致していたので、３７℃〜４０℃で培養した場合のヒアルロン酸は高純度と思われる。
また、培養終了時の培養液のラクトース濃度をＦキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて測定した。表４で示したように、４０℃、４２℃ではラクトース濃度が非常に低くなっていることが分かった。ラクトース濃度が低いと、ラクトースが精製後のヒアルロン酸に残留する可能性がなくなるため、品質の良いヒアルロン酸を得ることができると考えられる。よって、培養温度を、特に４０℃とすることは、高収量であるだけでなく、品質の良いヒアルロン酸を得るためにも非常に有用である。
【００４３】
【表４】
【００４４】
（３）分子量分析
上記のヒアルロン酸を５mg／mLとなるように５０mM塩化ナトリウム溶液で溶解し、以下の通りHPLCに供した。また、同条件でヒアルロン酸標準品（ヒアルロン酸ナトリウム；和光純薬工業（株）社製）についてもHPLCを測定した。
ＨＰＬＣ分析
分析機器 Waters 600
検出器 示差屈折率計 RI-980
カラム Shodex Sugar KS-804
カラム温度 80℃
溶出Buffer 50mM塩化ナトリウム
溶出速度 1.0mL/min
上記のヒアルロン酸は、ヒアルロン酸標準品に比べ、幅広い分子量を有しており、その分子量分布は１０万〜３００万程度の範囲のものであり、その最大ピークは１００万付近のものであった。また、この平均分子量は５０万〜１００万程度のものであった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌によるヒアルロン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸やヘパリン等とともに高価なグルコサミノグルカンであり、哺乳動物の結合組織中に微量であるが広く分布し、また微生物にも存在することが知られている。そして、これらから抽出、精製された高純度のヒアルロン酸は、高い保湿性、高粘性、創傷治癒性等の性質を有することから、その機能に着目して、化粧品配合素材、眼科手術の際の保護剤、関節炎治療剤等として広く使用されている。
また、近年では、食品分野においても、保健効果や機能性等、付加価値に対する消費者の関心が高まっており、ヒアルロン酸は、それが持つ機能性により種々の効果が期待できることから、食品素材の一つとしても注目されている。
【０００３】
従来、ヒアルロン酸の製造は、鶏冠、牛の関節もしくは鯨の軟骨からの抽出による工業的な製法で行われてきたが、生体内にはヒアルロン酸が微量にしか存在せず、しかも、組織中でタンパク質や他のムコ多糖類と複合体を形成しているため、当該タンパク質やムコ多糖との分離精製に複雑な工程を必要とするため大量に生産することは難しく、微生物を用いた培養法によるヒアルロン酸の製造方法が一般的に実施されている（特許文献1−4参照）。
【０００４】
ヒアルロン酸を産生する微生物としては、ストレプトコッカス属細菌のうち、ランスフィールド（Lancefield）血清群のA、C及びD型菌、具体的には、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、そして、パスツレラ・マルトシダ（Passteurella multocida）が古くから良く知られている（非特許文献１−８参照）。
【０００５】
しかしながら、これらの微生物のうちランスフィールド（Lancefield）血清群のA型菌やパスツレラは、ヒトに対する病原菌として知られており、また、これら何れの菌もストレプトリジン（可溶性溶血素）を生成し、β−溶血性を示すことから、これらの微生物を利用した工業的なヒアルロン酸の製造方法に関しては、安全性を確保するため、無毒化した菌株を利用する他、当該微生物が産生したヒアルロン酸から有害物を除去する工程により精製するなどの別途の手段を講じる必要が生じ、製造面でも作業性はあまりよいとはいえない。
また、一般的に微生物を用いた培養法によるヒアルロン酸の製造法は、生産性が低いことが指摘されていることから、生産性の改善又は向上させるための手段が重要であり、そのため生産収率の向上を目的とした多くの報告がなされている（特許文献５−９参照）。
このなかで、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を用いたヒアルロン酸の製造方法が報告されている(特許文献９参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平４−５５６７５号公報
【特許文献２】特公平４−４８６８号公報
【特許文献３】特公平４−４３６３７号公報
【特許文献４】特公平４−３９９９８号公報
【特許文献５】特公平４−１２９６０号公報
【特許文献６】特公平４−１８８３９号公報
【特許文献７】特公平７−２１１７号公報
【特許文献８】特開２０００−１８９１８５号公報
【特許文献９】特開２００９−１１２２６０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】F.E. Kendall et al., J.Biol.chem.,118,61,1937
【非特許文献２】W.A. Pierce et al., J.Baact, 63,301,1952
【非特許文献３】A.P. MacLennan, J.Gen.Microbiol., 14,134-142,1956
【非特許文献４】B. Holmstrom et al., Appl.Microbiol., 15,1409-1413,1967
【非特許文献５】J.B. Woolcock., J.Gen.Microbiol., 85,372-375,1974
【非特許文献６】E. kjems et al., Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B, 84,162-164,1976
【非特許文献７】T. Bergan et al., Acta Path.Microbiol.Scand,75,97-103,1969
【非特許文献８】J.A. Cifonelli., Carbohyd.Res., 14,272-276,1970
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、美容等の効果が期待できる機能性を有し、各種飲食品へも配合が可能なヒアルロン酸をより安価でかつ簡便に効率よく製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ヨーグルトの製造にも使用可能なストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を用いた安全なヒアルロン酸の製造方法、特に乳成分を含有する培地に大豆ペプチドを加えることによってヒアルロン酸の生産性が更に向上することを既に報告している(特許文献９参照)。
しかし、この大豆ペプチドを培地に加える方法では、培地作製の工程において、大豆ペプチドを培地に添加するための工程が増えること；ヒアルロン酸の精製工程において、添加した大豆ペプチドが沈殿するので、粘性のあるヒアルロン酸からこれを除去するための時間や工程を要すること等によって、簡便に効率よくヒアルロン酸を生産することが難しい。このため、この方法では、特に工業的レベルにおいて、作業効率の向上が図りにくく、また大豆原料価格が不安定であることから、ヒアルロン酸の生産コストが上がってしまうというデメリットがあり、大豆ペプチドを使用しない方法又はこの使用量の低減が求められていた。
また、乳酸菌の培養にあたっては、乳酸菌の主要なエネルギー源の１つであるラクトースを培地組成に含むことが好ましいが、培養終了後の培養液中にラクトースが多く残存すると、目的とするヒアルロン酸中にラクトースが混入することとなる。このため、通常、ヒアルロン酸の精製工程において透析等でラクトースを除去しているが、ヒアルロン酸の生産性を維持しつつ、予め培養終了時の培養液中のラクトース濃度を低下させることが、作業効率の向上やヒアルロン酸の品質向上の点から求められている。
【００１０】
そこで、本発明者が、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を、培養液をｐＨ６〜８に調整しつつ、３７℃〜４０℃と云う特定の温度帯で培養することにより効率よくヒアルロン酸の生産量を増加できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法、及び該方法により得られるヒアルロン酸を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することにより、より安価でかつ簡便に効率よくヒアルロン酸を製造することが可能となる。そして、同乳酸菌はヨーグルト等の製造に利用できる細菌であるので、同乳酸菌を用いて得られたヒアルロン酸は、安全性も高く、各種飲食品、化粧品や医薬品へ配合可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の培養温度とヒアルロン酸収量およびμmaxの関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種し、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃の温度で培養を行う。これによって、より安価でかつ簡便に効率よく飲食品等に配合可能なヒアルロン酸が得られる。
【００１５】
本発明の方法で使用するストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌（以下、「本発明の乳酸菌」とも云う）としては、ヒアルロン酸産生能を有するものであればよく、特に制限されることなく適用することが可能であり、具体的にはストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を挙げることができる。
【００１６】
本発明の方法において、ヒアルロン酸の産生は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、培養液をｐＨ６〜８に調整しつつ、３７℃から４０℃の温度で培養することにより行う。
この３７〜４０℃と云う特定の温度帯になるように調整して培養することにより、ヒアルロン酸の生産量を簡便に増加させることが可能となる。
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の、培養温度の変化によるヒアルロン酸の生産量の違いはこれまで知られていないが、一般的にストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の最適な培養温度は４２℃程度といわれており（L. De Vuyst et al., J. Appl. Microbiol., 84:1059-1068,1998；B. Zisu and N. P. Shah, J. Dairy Sci.,86:3405-3415,2003参照）、この４２℃の温度で最大比増殖速度（μmax）は最も高くなる。また生成する代謝物の量は、対数増殖期のμmaxが高いほど増加するという報告がなされている（L. De Vuyst et al., J. Appl. Microbiol., 84:1059-1068,1998）。しかしながら、後記実施例３で示すように、ヒアルロン酸産生において、対数増殖期のμmaxとヒアルロン酸の生成量に正の相関は見られなかった。すなわち、図１から明らかなように、３７〜４０℃の条件下では、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖速度は、４２℃に比べて増加していない。それにもかかわらず、ヒアルロン酸の生産量は４２℃に比べて顕著に増大している。このことは、３７〜４０℃の範囲では増殖速度と関係なく、ヒアルロン酸の生産能力が向上していることを示しており、かかる生産性向上は全く予想外であった。しかも、３７〜４０℃の範囲では、培養終了の際、培養液中にラクトースが全く又はほとんど認められなかったことから、効率よく品質の良いヒアルロン酸を得ることができる。
また、後記実施例１に示すように、ｐＨ６未満の酸性領域に調整して培養した場合には、ヒアルロン酸の生産量が低下する。このため、培養液のｐＨは本発明の乳酸菌の発育と共に低下するので、培養中の培養液は、苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア等の各種ｐＨ調整剤を用いて、ｐＨ６〜８にコントロールすることが必要である。当該ｐＨは、６．０〜７．５、より６．３〜７．３、更に６．８〜７．３であるのが、ヒアルロン酸の生産量が増加することから、好ましい。
【００１７】
本発明の方法において、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養は、培養液をｐＨ６〜８に調整し、かつ培養温度を３７℃〜４０℃に調整する以外は、攪拌培養や通気攪拌培養等の公知の方法で行えばよい。
【００１８】
本発明の方法において、上記本発明の乳酸菌の培養に用いる培地は、特に制限されることなく、通常の培地を用いることができる。
例えば、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース等の炭素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ、チオ硫酸ソーダ、リン酸アンモニウム等の無機塩類、大豆ペプチド、ポリペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー等の有機栄養源の他、必要に応じて各種アミノ酸、ビタミン類が添加されてなる乳酸菌の増殖用として通常用いられる栄養培地の他、獣又は植物由来の乳を含む培地、すなわち乳培地を用いることができる。
【００１９】
特に、本発明の乳酸菌により産生されたヒアルロン酸を飲食可能な乳成分としてそのまま利用することができる点で、乳成分を含有する培地を用いて発酵乳を製造することが好ましい。
なお、本明細書中において、乳成分とは、牛乳・山羊乳等の獣乳の生乳、加熱乳、脱脂粉乳、全脂粉乳或いは生クリーム等；又は豆乳、アーモンド乳、ココナッツミルク等の植物乳の各種乳蛋白質を少なくとも含有する物を意味する。
【００２０】
本発明の乳酸菌が産生したヒアルロン酸（以下、「本発明のヒアルロン酸」とも云う）は、通常の多糖類の分離・採取方法に従って、培養液から分離・採取すればよい。例えば、培養液中の菌体などの不溶物をろ過または遠心分離により分別後、この溶液から、例えばエタノール等の溶媒沈殿剤を用いて精製ヒアルロン酸を分取することができる。
なお、乳培地を用いた場合には、本発明の乳酸菌が産生したヒアルロン酸を含有する乳成分としてそのまま使用すればよいが、常法に従って、ヒアルロン酸を分取して使用することも可能である。
【００２１】
このようにして得られる本発明のヒアルロン酸は、従来の一般的なヒアルロン酸とは異なる分子量分布を示す。具体的には、本発明のヒアルロン酸の平均分子量は、３０万〜１５０万、さらに５０万〜１００万程度である。また、その分子量分布は１０万〜３００万程度の範囲であり、その最大ピークは１００万あたりにある。従来の一般的なヒアルロン酸の最大ピークが２００万〜３００万あたりであることから、本発明のヒアルロン酸は、従来の一般的なヒアルロン酸に比べて分子量が小さく、皮膚への浸透性が向上していると考えられる。
【００２２】
本発明の方法で得られる本発明のヒアルロン酸は、従来と同様に、医薬品や化粧品等の形態で使用することができる他、ヨーグルト等の製造に利用できるストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌が産生するものであるため、食品の形態として投与することも可能である。例えば、美容や老化防止などの効果を訴求する医薬品や栄養補助食品等の形態で用いる場合であれば、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、散剤等の固形製剤、或いはシロップ剤等の液状製剤として経口投与することができる。
【００２３】
これらの製剤の製造時には、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤；白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、モノグリセリド、蔗糖脂肪酸エステル等の滑沢剤や、その他、医薬・食品等として許容され得る成分を適宜配合することができる。
【００２４】
また、同様の生理効果を期待して一般食品形態とする場合には、本発明の方法により得られたヒアルロン酸をそのまま或いは適宜精製処理したものを油脂、錠菓、発酵乳、飴、調味料、ふりかけ等の飲食品に添加し、常法により製造すればよい。
【００２５】
発酵食品、特に発酵乳とする場合には、発酵原料中で、前記したストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌により発酵（培養）させることにより製造することができる。
このとき、培養液のｐＨは６〜８に、かつ培養温度は３７℃〜４０℃に、常に保持していなくてもよい。これらを保持しない場合は、発酵製品の製造において、生成するヒアルロン酸量が所望の濃度となるように、本発明のｐＨ条件及び培養温度条件を確保する以外は適宜、乳酸菌の至適培養温度・ｐＨや冷蔵温度等の温度に設定することができる。
なお、発酵乳とは、乳等省令により定められている発酵乳、乳製品乳酸菌飲料等の生菌含有タイプの飲料や殺菌処理の施された発酵乳を含有する乳性飲料、更には、ケフィア等をいう。
発酵に際しては、前記本発明の乳酸菌のヒアルロン酸産生能を損わない範囲で、その他の菌、例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ・ブルガリカス、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ・デルブルッキィ等のラクトバチルス属細菌やラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ・ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス等のラクトコッカス属細菌、ロイコノストック・メセンテロイテス、ロイコノストック・ラクチス等のロイコノストック属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム等のエンテロコッカス属細菌等を使用することができる。
【００２６】
また、これ以外に、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アニマリス等のビフィドバクテリウム属細菌や酵母その他の微生物を使用しても良い。これらは、１種または２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２７】
また、これらの食品には、その他の食品素材、すなわち、各種糖質や乳化剤、増粘剤、甘味料、酸味料、果汁等を適宜配合してもよい。具体的には、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤等が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類等の各種ビタミン類やカルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類を配合することができる。
【００２８】
また、本発明の方法で得られるヒアルロン酸は、乳液、化粧液、ファンデーション、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンスなど、化粧品等の外用剤の形態とすることもできる。これらの外用剤は、常法に従って製造すればよく、本発明の方法で得られるヒアルロン酸も、培地から単離・精製したものとして、或いはヒアルロン酸を含む乳成分として前記製造の任意の段階で適宜配合すればよい。なお、これらの外用剤には、必要に応じて、化粧品製造に通常使用される成分、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、ビタミン類、アミノ酸などを配合することができる。
【００２９】
上記医薬品や化粧品又は、食品中の本発明の方法で得られるヒアルロン酸の配合量は、その効果が得られ、かつ過剰摂取等の問題が生じない程度の量を適宜決定すればよい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例、試験例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に何ら制約されるものではない。
【００３１】
実施例１ （ｐＨ調整による効果）
（１）菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を下記方法に従って培養した。
１０％(w/v)スキムミルク（以下、「１０％スキムミルク」とする）溶液培地（１Ｌ）をオートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）のスターターを０．１％(v/v)接種し、培養温度３５℃で２４時間培養した。このときの培養は、培地のｐＨを８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて７．８、７．３、６．８、６．３、５．８又は５．３付近に調整しながら、回転数１００rpmの条件で攪拌して行った。
なお、１０％スキムミルク溶液培地の組成は、培地１Ｌ中、スキムミルク１００ｇであった。また、スターターの培地として、１０％スキムミルク溶液培地を用いた。
【００３２】
（２）ヒアルロン酸の抽出、調製
前記により得た各培養液（１Ｌ）を氷中で冷却し、終濃度が１０％（w/v）になるようにトリクロロ酢酸（以下「ＴＣＡ」という）を加え、４℃で２時間静置した。これを１８，７００Ｇの条件で３０分遠心分離し、生じた沈殿を除去した後、上清にさらに９９％冷エタノールを等量加えて、４℃で一晩静置した。静置後、１８，７００Ｇの条件で３０分遠心分離して生じた沈殿を分離し、これに純水を加えて溶解し、Spectra/Por Membrane（ＭＷＣＯ３５００）を用いて透析を行い、ｐＨ７に調整後、凍結乾燥してヒアルロン酸を得た。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１に示したとおり、ヒアルロン酸の生成量は、ｐＨの範囲を酸性やアルカリ性の条件よりも中性条件に調整する方が高いことが明らかとなった。
【００３５】
実施例２
（１）菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を下記方法に従って培養した。
１０％スキムミルク溶液培地（１Ｌ）をオートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌し、これにストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）のスターターを０．１％(v/v)接種し、培養温度３７℃で２８時間培養した。このときの培養は、培地のｐＨを８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて６．８付近に調整しながら、回転数１００rpmの条件で攪拌して行った。また、培養温度「３７℃」を「４０℃」に代えて同様に培養を行った。
なお、１０％スキムミルク溶液培地の組成は、培地１Ｌ中、スキムミルク１００ｇであった。また、スターターの培地として、１０％スキムミルク溶液培地を用いた。
【００３６】
（２）ヒアルロン酸の検出
ヒアルロン酸の検出は、ビオチン化ヒアルロン酸バインディングプロテイン(b-HABP、生化学工業)を用いて、以下の方法によって行った。
アッセイには９６ウェルイムノプレート（Nunc）を用いた。２０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー(ｐＨ９．６)にStreptococcus zooepidemicus由来ヒアルロン酸ナトリウム (Ｗａｋｏ)を１００μｇ/ｍＬになるように溶解し、ウェルに２００μＬアプライした。３７℃で４時間インキュベートすることにより、ウェル内部をヒアルロン酸でコーティングした。
インキュベート後、０．０５％(v/v)のＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）を含むＰＢＳ(PBST)で3回洗浄した。洗浄はすべてこの操作で行った。さらに、PBSTに溶解したウシ由来血清アルブミン(Boehringer Mannheim)(１％(v/v))を２００μＬアプライし、４℃で１８時間ブロッキングした。洗浄後、適宜PBSTで希釈した培養上清、およびb-HABP (0.5 μg/ml in PBST)を１００μＬずつ同時にアプライし、３７℃、１時間インキュベートした。
これを洗浄後、ExtraAvidin alkaline phosphatase conjugate (Sigma)をPBSTで１／７００００希釈したものを２００μＬアプライし、３７℃で３０分インキュベートした。洗浄後、4-nitrophenyl phosphate disium salt hexahydrate (Sigma) を１ｍＭ MgCl2と２ｍＭ ZnCl2を含む０．１Ｍグリシンバッファー (ｐＨ１０．４)に溶解したものを(１tablet/２０ｍＬ)、２００ｍＬアプライした。
３７℃で１時間インキュベートした後の吸光度(４０５ｎｍ)からアプライ直後の吸光度(４０５ｎｍ)を引いて、培養上清中に含まれるヒアルロン酸濃度を計算した。検量線にはコーティングに用いたヒアルロン酸を用いた。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２に示した通り、ビオチン化ヒアルロン酸バインディングプロテインによって培養上清中の多糖類がヒアルロン酸であることを確認することが出来た。
【００３９】
実施例３ （培養温度調整による効果）
（１）菌株及び培養
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を下記方法に従って培養した。
培養温度「３５℃、３７℃、４０℃又は４２℃」で行った以外は、実施例２（ｐＨ６．８付近）と同様の方法により、各培養を行った。
（２）ヒアルロン酸の抽出、調製
前記実施例１と同様の方法にて、培養終了後の各培養液から、それぞれのヒアルロン酸を得た。
【００４０】
図１及び表３で示したように３７℃〜４０℃で培養した場合ヒアルロン酸の生成量が顕著に増加した。また対数増殖期のμmaxは３７℃と４０℃で低い値を示し、ヒアルロン酸収量との正の相関は認められなかった。
【００４１】
【表３】
【００４２】
また、培養温度「３７℃」及び「４０℃」の培養条件において、実施例２のヒアルロン酸検出量と、上記ヒアルロン酸の収量とが、それぞれほぼ一致していたので、３７℃〜４０℃で培養した場合のヒアルロン酸は高純度と思われる。
また、培養終了時の培養液のラクトース濃度をＦキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて測定した。表４で示したように、４０℃、４２℃ではラクトース濃度が非常に低くなっていることが分かった。ラクトース濃度が低いと、ラクトースが精製後のヒアルロン酸に残留する可能性がなくなるため、品質の良いヒアルロン酸を得ることができると考えられる。よって、培養温度を、特に４０℃とすることは、高収量であるだけでなく、品質の良いヒアルロン酸を得るためにも非常に有用である。
【００４３】
【表４】
【００４４】
（３）分子量分析
上記のヒアルロン酸を５mg／mLとなるように５０mM塩化ナトリウム溶液で溶解し、以下の通りHPLCに供した。また、同条件でヒアルロン酸標準品（ヒアルロン酸ナトリウム；和光純薬工業（株）社製）についてもHPLCを測定した。
ＨＰＬＣ分析
分析機器 Waters 600
検出器 示差屈折率計 RI-980
カラム Shodex Sugar KS-804
カラム温度 80℃
溶出Buffer 50mM塩化ナトリウム
溶出速度 1.0mL/min
上記のヒアルロン酸は、ヒアルロン酸標準品に比べ、幅広い分子量を有しており、その分子量分布は１０万〜３００万程度の範囲のものであり、その最大ピークは１００万付近のものであった。また、この平均分子量は５０万〜１００万程度のものであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）である請求項１記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項３】
培地が乳成分を含む培地であることを特徴とする請求項１又は２記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載の製造方法により得られるヒアルロン酸。
【請求項１】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培地に接種して、ｐＨ６〜８の条件下、３７〜４０℃で培養することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）である請求項１記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項３】
培地が乳成分を含む培地であることを特徴とする請求項１又は２記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載の製造方法により得られるヒアルロン酸。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−８３２２４（Ｐ２０１１−８３２２４Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８３０９（Ｐ２００９−２３８３０９）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（０００００６８８４）株式会社ヤクルト本社 (132)
【Ｆターム（参考）】
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