ヒアルロン酸の酸化誘導体，その調製方法及びその修飾方法
本発明は，多糖のグルコサミン部分の（６）位にアルデヒド基を有するヒアルロナン誘導体の調製方法及び修飾方法に関する。ヒアルロン酸はデス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）試薬を使用して酸化させることが可能である。調製したアルデヒドは，例えば水，又は水‐有機溶媒系中でのＮａＢＨ３ＣＮによる還元アミノ化を利用してアミン，ジアミン，アミノ酸，ペプチド及びアミノ基を含む他の化合物を結合させるために使用可能である。ジアミン又は３つ以上のアミノ基を含む化合物を使用する場合，架橋ヒアルロナン誘導体が調製可能である。架橋誘導体は，アミノ‐アルキル基であるＨＡ‐アルキル‐ＮＨ２で置換したヒアルロナンとアルデヒドとを反応させて調製することも可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，第一ヒドロキシル基‐ＣＨ２‐ＯＨの代わりにアルデヒド基‐ＣＨ＝Ｏを含む新規なヒアルロン酸誘導体の調製方法に関する。酸化は極性非プロトン性溶媒中でＤＭＰ（デス‐マーチンペリオジナン）試薬を使用して実行可能であり，
【化１】
前記溶媒は例えばジメチルスルホキシドを含む。
【背景技術】
【０００２】
２つの反復単位β‐（１，３）‐Ｄ‐グルクロン酸及びβ‐（１，４）‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンから成るヒアルロン酸は重要な多糖である。分子量は，単離方法及び原料物質に依存するが，５．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１である。ヒアルロン酸又はそのヒアルロナンナトリウム塩は結合組織，関節の滑液の必須成分であり，また水和，プロテオグリカン組織化，細胞分化，増殖及び血管形成などの生物学的プロセスに重要な役割を担う。ヒアルロン酸は親水性の高い多糖であり，塩の形態でｐＨの全範囲内において水溶性である。
【化２】
【０００３】
ヒアルロン酸の酸化
多糖類の酸化は多糖の官能基の酸化度が変化するプロセスである。多糖類の特性を劇的に変化させることができるカルボン酸又はアルデヒドが最も頻繁に形成される。大抵，酸化度が高めの原子を含有する試薬を使用して反応が行われる。
【０００４】
アンジェリーノ（Angelino）の欧州有機化学ジャーナル（European Journal of
Organic Chemistry） 2006年, 19, 4323-4326に記載された，第一ヒドロキシル基で糖類を選択的に酸化する方法では，温度０℃，ＤＭＦ中で２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカルであるＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系を使用し，相当分のアルデヒドが主生成物として得られた。
【０００５】
シクロデキストリンのモノアルデヒドへの酸化は，コーンウェル（Cornwell）により，テトラヘドロンレターズ誌（Tetrahedron Letters）1995年, 36(46), 8371-8374に記載されている。その酸化は，温度２０℃で，酸化剤としてＤＭＳＯ又はＤＭＦ中にデス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）を添加して行われた。
【０００６】
２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカル（ＴＥＭＰＯ）及びＮａＯＣｌを介して，温度０℃，ｐＨ１０．２でヒアルロナンの第一ヒドロキシル基をカルボン酸へと酸化した（反応式２）（カーボハイドレイトリサーチ（Carbohydr Res） 2000年, 327 (4), 455-61）。
【化３】
他の多糖類と同様に，前記ポリマーは位置選択性が高く，分解が少ないことが観察された。前記溶液中の塩（ＮａＢｒ，ＮａＣｌ，Ｎａ２ＳＯ４）の濃度が増加すると，酸化率が減少した。
【０００７】
ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系を使用したヒアルロナンの酸化は国際公開第０２／１８４４８ Ａ２号の特許出願に記載されている。発明者らは生物学的錯体を形成する一方で，過カルボキシ化した多糖類の相互作用も扱っている。
【化４】
過ヨウ素酸ナトリウムの使用によるＨＡ及び他の多糖類の酸化率は，スコットら（Scott et al）により研究されている（反応式３）（ヒストケミ（Histochemie） 1969年, 19 (2), 155-61）。鎖長，置換反応，ポリマーの立体配置及び温度などの因子を検討し，定量化した。ヒアルロナンを酸化するためにＮａＩＯ４を使用することも米国特許第６６８３０６４号及び第６９５３７８４号に開示された。
【０００８】
生理学的緩衝液中の低分子量ＨＡ類似体のモデル反応が研究された（カーボハイドレイトリサーチ 1999年, 321, (3-4), 228-34)。グルクロン部分及びグルコサミン部分の酸化生成物がＧＣ‐ＭＳ分析で同定された。この結果から，酸化がグルクロン部分で初めに生じ，メソ酒石酸が主生成物であり，ヒアルロナン酸化のバイオマーカーとして使用し得ることが示唆されている。
【０００９】
３．４．２ 架橋反応における酸化されたＨＡの使用
架橋ヒドロゲルを調製するための酸化されたＨＡの使用が，ウェンら（Weng et al）により，ジャーナルオブバイオメディカルマテリアルズリサーチＡ（J
Biomed Mater Res A）2008年, 85(2), 352-65に記載されている（反応式４）。この場合には，部分的に酸化されたヒアルロナン及びゼラチンの２つの先駆物質が使用された。
【化５】
得られたヒドロゲルの物理化学的特性は，機器分析ＦＴ‐ＩＲ，ＳＥＭ（走査電子顕微鏡法）及び流動度測定により解明されている。ヒアルロナンの酸化度が高まると，それに応じてヒドロゲルの相溶性が高まり，水分吸収能が低下する。細胞‐ヒドロゲル相互作用を研究するために，皮膚線維芽細胞を使用した。ヒドロゲル及びその分解生成物の双方が生体適合性を有することが，長期細胞生存率アッセイにより証明されている。細胞と共に培養されると，ヒドロゲルは４週間以内に分解し，接着性は明らかに失われる。良好な生体適合性及び生分解性が，マウス皮下移植で更に証明された。最終的に，ヒドロゲル中の細胞間マトリックスのin vitro及びin vivoでの沈積はＳＥＭ分析で証明された。
【００１０】
外部架橋剤が全く無い状態で３次元ヒドロゲルを形成する，油中水型エマルジョン法により，酸化されたヒアルロナン及びゼラチンから架橋ＨＡを調製する方法が，ウェンらの出版物，バイオマテリアルズ（Biomaterials），2008年, 29, (31), 4149-56に記載されている。この研究において，ヒドロゲル構造へのモデル薬物の取り込み（カプセル封入），及びマクロファージを介するそれらの放出をＨＰＬＣにより検証した。
【００１１】
過ヨウ素酸ナトリウムによりＨＡ‐アルデヒドに酸化したＨＡ，及びアジピン酸ジヒドラジドで修飾したＨＡをカップリングすることによる弾性ヒドロゲルの調製が，サヒナーら（Sahiner et al）により，バイオマテリアル学会会誌ポリマー編（J. Biomater. Sci. Polym. Ed）2008年, 19 (2), 223-43に記載されている（反応式５)。
【化６】
得られた誘導体は培養した線維芽細胞の増殖に対して際立った影響を何ら与えていなかったことがＭＴＴアッセイにより示された。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は，多糖のグルコサミン部分の６位にあるヒアルロン酸の第一ヒドロキシル基をアルデヒドへと選択的に酸化させる方法に関する。酸化剤としてデス‐マーチンペリオジナンＤＭＰを使用し，反応を非プロトン環境下で行う。ヒアルロナンのグルコサミン部分の６位にアルデヒド基を導入するという点で，提示された手法は独創的である（反応式６，構造３）。近年発表されているアプローチは，糖リングを開環しながらヒアルロナンのグルクロン部分の２位及び３位にアルデヒド基を導入するか（反応式６，構造２），或いはヒアルロナンのグルコサミン部分の６位にカルボキシル基を導入するか（反応式６，構造１）のいずれかである。
【化７】
【００１３】
それぞれの酸化生成物（構造３，反応式６）が共役した糖リングの構造を維持しているという点で，本発明の方法は更に有利である。ジアルデヒドへと酸化した生成物において環が開くと（構造２，反応式６），鎖の直線性が「切断」され，したがって，非修飾ヒアルロナンと比較して，多糖３次元構造は大幅に変化する。カルボン酸へ酸化した生成物（構造１，反応式６）内では，鎖の直線性は「切断」されないとはいえ，カルボキシル基はアルデヒド基のように，このような多様な修飾（結合）能を可能にすることはない。カルボキシル基は既に非修飾多糖の構成要素であることから，構造１（反応式６）への酸化は多糖極性を高めるだけで，新規な置換体の結合に利用可能な新規な性質を発展させることはない。
【００１４】
アルキル基が結合したアルデヒド基は，所謂ジェミナルジオール形態ＨＡ‐ＣＨ（ＯＨ）２で，水中に存在し，アルデヒドと同様に求核試薬と反応することが知られている。水溶液中では，グルコサミン部分の６位（生成物３，反応式６）で酸化したヒアルロナンの９５％以上がジェミナルジオールの形態で存在することが，ＮＭＲ分光法により証明されている。
【００１５】
本発明の方法では，ヒアルロン酸を極性非プロトン性溶媒，例えばＤＭＳＯに溶解し，その後，酸化剤を添加し，該混合物を温度１０〜５０℃，好ましくは２０℃で，少なくとも５分間，好ましくは１〜１５０時間，より好ましくは少なくとも１０時間，攪拌する。
【００１６】
調製した酸化されたヒアルロナンは，例えばアミノ基を含む化合物の結合に使用可能である。前記結合はイミン形態か，或いは還元後にアミン形態（還元的アミノ化）（反応式７）で実施することが可能である。
【化８】
【００１７】
この修飾の両段階は水溶液中で行い，還元はＮａＢＨ３ＣＮを使用して行う。反応式７に記載の反応の両段階は１工程で行うことが可能である。
【００１８】
ヒアルロン酸誘導体の修飾は，酸化誘導体と，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンとを反応させることで行うことが可能であり，式中，Ｒは，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む，直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである。このアミンはアルキルアミン，例えばブチルアミン又はヘキサンジアミン，アミノ酸，ペプチド又は遊離アミノ基を含む多糖とすることが可能である。ジアミン，又は３つ以上のアミノ基を含む化合物を使用する場合，架橋ヒアルロナン誘導体を調製することが可能である。架橋誘導体は，アルデヒドと，アミノアルキル基ＨＡ‐アルキル‐ＮＨ２で置換したヒアルロナンとを反応させることでも調製可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ＤＳ＝置換度＝１００％×結合した置換体の分子量／全多糖二量体の分子量。
本明細書で使用している用語「当量（ｅｑ）」は，特に指定がなければヒアルロン酸二量体を指す。本明細書で使用している百分率は，特に指定がなければ重量パーセントを意味する。
出発ヒアルロナン（starting hyaluronan）（ソース：シーピーエヌ エスピーオーエル．エス．アール．オー．（CPN spol. s r. o.), ドルニ ドブロチ, チェコ）の分子量はＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳアッセイで測定した。
【００２０】
実施例１ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（０．２ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定）
【００２１】
実施例２ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（０．２ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸ナトリウム塩（０．１ｇ，６００ｋＤａ）０．５％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２２】
実施例３ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ（１ｅｑ）溶液を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ５０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２３】
実施例４ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（１ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で１時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２４】
実施例５ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（０．２ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度５０℃で１時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２５】
実施例６ 酸化されたヒアルロナンとアミンとの反応
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をブチルアミン（０．４ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を２倍量のアセトン及び０．１ｍｌのＮａＣｌ飽和水溶液で沈殿させ，ろ過し，真空乾燥させた。その後，得られた黄色の材料を分析した。
ＵＶ‐ＶＩＳ ３２８ｎｍ，ｎ→π＊遷移 ‐ＣＨ＝Ｎ‐
【００２６】
実施例７ 酸化されたヒアルロナンとブチルアミンとの反応，及びそれに続く還元
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝５０％，実施例３）をブチルアミン（０．４ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３５％（ＮＭＲにより測定）
【００２７】
実施例８ 酸化されたヒアルロナンとジアミンとの反応，及びそれに続く還元
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝５０％，実施例３）をヘキサンジアミン（０．４ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３５％（ＮＭＲにより測定）
【００２８】
実施例９ 酸化されたヒアルロナンとアミノ‐ヒアルロナンとの反応
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）を，温度２０℃で，ヘキサンジアミン（１ｅｑ，ＤＳ＝３５％，実施例８）で置換したヒアルロナン誘導体の１％水溶液と混合した。数分後に得られた不溶性の凝縮したゴム状沈殿物を機械的に粉砕して小片にし，ろ過し，減圧下で乾燥させた。
ＦＴ‐ＩＲ（ＫＢｒ） １７００ｃｍ−１
【００２９】
実施例１０ リジンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をリジン（０．３ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２５％（ＮＭＲにより測定）
【００３０】
実施例１１ リジンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をリジン（２０ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（１０ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。その後，得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２８％（ＮＭＲにより測定，実施例１０）
【００３１】
実施例１２ セリンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をセリン（０．３ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で１分間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２６％（ＮＭＲにより測定）
【００３２】
実施例１３ アルギニンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をアルギニン（０．３ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で１００時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２３％（ＮＭＲにより測定）
【００３３】
実施例１４ ペンタペプチドＰＡＬ‐ＫＴＴＫＳ（パルミトイル‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｓｅｒ）による酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
水／イソプロパノール系２／１中の酸化されたヒアルロン酸の溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝１０％，実施例１）を，イソプロピルアルコール中の置換ペンタペプチドＰＡＬ‐ＫＴＴＫＳ（０．０５ｅｑ）１％溶液と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ８％（ＮＭＲにより測定）
【技術分野】
【０００１】
本発明は，第一ヒドロキシル基‐ＣＨ２‐ＯＨの代わりにアルデヒド基‐ＣＨ＝Ｏを含む新規なヒアルロン酸誘導体の調製方法に関する。酸化は極性非プロトン性溶媒中でＤＭＰ（デス‐マーチンペリオジナン）試薬を使用して実行可能であり，
【化１】
前記溶媒は例えばジメチルスルホキシドを含む。
【背景技術】
【０００２】
２つの反復単位β‐（１，３）‐Ｄ‐グルクロン酸及びβ‐（１，４）‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンから成るヒアルロン酸は重要な多糖である。分子量は，単離方法及び原料物質に依存するが，５．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１である。ヒアルロン酸又はそのヒアルロナンナトリウム塩は結合組織，関節の滑液の必須成分であり，また水和，プロテオグリカン組織化，細胞分化，増殖及び血管形成などの生物学的プロセスに重要な役割を担う。ヒアルロン酸は親水性の高い多糖であり，塩の形態でｐＨの全範囲内において水溶性である。
【化２】
【０００３】
ヒアルロン酸の酸化
多糖類の酸化は多糖の官能基の酸化度が変化するプロセスである。多糖類の特性を劇的に変化させることができるカルボン酸又はアルデヒドが最も頻繁に形成される。大抵，酸化度が高めの原子を含有する試薬を使用して反応が行われる。
【０００４】
アンジェリーノ（Angelino）の欧州有機化学ジャーナル（European Journal of
Organic Chemistry） 2006年, 19, 4323-4326に記載された，第一ヒドロキシル基で糖類を選択的に酸化する方法では，温度０℃，ＤＭＦ中で２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカルであるＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系を使用し，相当分のアルデヒドが主生成物として得られた。
【０００５】
シクロデキストリンのモノアルデヒドへの酸化は，コーンウェル（Cornwell）により，テトラヘドロンレターズ誌（Tetrahedron Letters）1995年, 36(46), 8371-8374に記載されている。その酸化は，温度２０℃で，酸化剤としてＤＭＳＯ又はＤＭＦ中にデス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）を添加して行われた。
【０００６】
２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカル（ＴＥＭＰＯ）及びＮａＯＣｌを介して，温度０℃，ｐＨ１０．２でヒアルロナンの第一ヒドロキシル基をカルボン酸へと酸化した（反応式２）（カーボハイドレイトリサーチ（Carbohydr Res） 2000年, 327 (4), 455-61）。
【化３】
他の多糖類と同様に，前記ポリマーは位置選択性が高く，分解が少ないことが観察された。前記溶液中の塩（ＮａＢｒ，ＮａＣｌ，Ｎａ２ＳＯ４）の濃度が増加すると，酸化率が減少した。
【０００７】
ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系を使用したヒアルロナンの酸化は国際公開第０２／１８４４８ Ａ２号の特許出願に記載されている。発明者らは生物学的錯体を形成する一方で，過カルボキシ化した多糖類の相互作用も扱っている。
【化４】
過ヨウ素酸ナトリウムの使用によるＨＡ及び他の多糖類の酸化率は，スコットら（Scott et al）により研究されている（反応式３）（ヒストケミ（Histochemie） 1969年, 19 (2), 155-61）。鎖長，置換反応，ポリマーの立体配置及び温度などの因子を検討し，定量化した。ヒアルロナンを酸化するためにＮａＩＯ４を使用することも米国特許第６６８３０６４号及び第６９５３７８４号に開示された。
【０００８】
生理学的緩衝液中の低分子量ＨＡ類似体のモデル反応が研究された（カーボハイドレイトリサーチ 1999年, 321, (3-4), 228-34)。グルクロン部分及びグルコサミン部分の酸化生成物がＧＣ‐ＭＳ分析で同定された。この結果から，酸化がグルクロン部分で初めに生じ，メソ酒石酸が主生成物であり，ヒアルロナン酸化のバイオマーカーとして使用し得ることが示唆されている。
【０００９】
３．４．２ 架橋反応における酸化されたＨＡの使用
架橋ヒドロゲルを調製するための酸化されたＨＡの使用が，ウェンら（Weng et al）により，ジャーナルオブバイオメディカルマテリアルズリサーチＡ（J
Biomed Mater Res A）2008年, 85(2), 352-65に記載されている（反応式４）。この場合には，部分的に酸化されたヒアルロナン及びゼラチンの２つの先駆物質が使用された。
【化５】
得られたヒドロゲルの物理化学的特性は，機器分析ＦＴ‐ＩＲ，ＳＥＭ（走査電子顕微鏡法）及び流動度測定により解明されている。ヒアルロナンの酸化度が高まると，それに応じてヒドロゲルの相溶性が高まり，水分吸収能が低下する。細胞‐ヒドロゲル相互作用を研究するために，皮膚線維芽細胞を使用した。ヒドロゲル及びその分解生成物の双方が生体適合性を有することが，長期細胞生存率アッセイにより証明されている。細胞と共に培養されると，ヒドロゲルは４週間以内に分解し，接着性は明らかに失われる。良好な生体適合性及び生分解性が，マウス皮下移植で更に証明された。最終的に，ヒドロゲル中の細胞間マトリックスのin vitro及びin vivoでの沈積はＳＥＭ分析で証明された。
【００１０】
外部架橋剤が全く無い状態で３次元ヒドロゲルを形成する，油中水型エマルジョン法により，酸化されたヒアルロナン及びゼラチンから架橋ＨＡを調製する方法が，ウェンらの出版物，バイオマテリアルズ（Biomaterials），2008年, 29, (31), 4149-56に記載されている。この研究において，ヒドロゲル構造へのモデル薬物の取り込み（カプセル封入），及びマクロファージを介するそれらの放出をＨＰＬＣにより検証した。
【００１１】
過ヨウ素酸ナトリウムによりＨＡ‐アルデヒドに酸化したＨＡ，及びアジピン酸ジヒドラジドで修飾したＨＡをカップリングすることによる弾性ヒドロゲルの調製が，サヒナーら（Sahiner et al）により，バイオマテリアル学会会誌ポリマー編（J. Biomater. Sci. Polym. Ed）2008年, 19 (2), 223-43に記載されている（反応式５)。
【化６】
得られた誘導体は培養した線維芽細胞の増殖に対して際立った影響を何ら与えていなかったことがＭＴＴアッセイにより示された。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は，多糖のグルコサミン部分の６位にあるヒアルロン酸の第一ヒドロキシル基をアルデヒドへと選択的に酸化させる方法に関する。酸化剤としてデス‐マーチンペリオジナンＤＭＰを使用し，反応を非プロトン環境下で行う。ヒアルロナンのグルコサミン部分の６位にアルデヒド基を導入するという点で，提示された手法は独創的である（反応式６，構造３）。近年発表されているアプローチは，糖リングを開環しながらヒアルロナンのグルクロン部分の２位及び３位にアルデヒド基を導入するか（反応式６，構造２），或いはヒアルロナンのグルコサミン部分の６位にカルボキシル基を導入するか（反応式６，構造１）のいずれかである。
【化７】
【００１３】
それぞれの酸化生成物（構造３，反応式６）が共役した糖リングの構造を維持しているという点で，本発明の方法は更に有利である。ジアルデヒドへと酸化した生成物において環が開くと（構造２，反応式６），鎖の直線性が「切断」され，したがって，非修飾ヒアルロナンと比較して，多糖３次元構造は大幅に変化する。カルボン酸へ酸化した生成物（構造１，反応式６）内では，鎖の直線性は「切断」されないとはいえ，カルボキシル基はアルデヒド基のように，このような多様な修飾（結合）能を可能にすることはない。カルボキシル基は既に非修飾多糖の構成要素であることから，構造１（反応式６）への酸化は多糖極性を高めるだけで，新規な置換体の結合に利用可能な新規な性質を発展させることはない。
【００１４】
アルキル基が結合したアルデヒド基は，所謂ジェミナルジオール形態ＨＡ‐ＣＨ（ＯＨ）２で，水中に存在し，アルデヒドと同様に求核試薬と反応することが知られている。水溶液中では，グルコサミン部分の６位（生成物３，反応式６）で酸化したヒアルロナンの９５％以上がジェミナルジオールの形態で存在することが，ＮＭＲ分光法により証明されている。
【００１５】
本発明の方法では，ヒアルロン酸を極性非プロトン性溶媒，例えばＤＭＳＯに溶解し，その後，酸化剤を添加し，該混合物を温度１０〜５０℃，好ましくは２０℃で，少なくとも５分間，好ましくは１〜１５０時間，より好ましくは少なくとも１０時間，攪拌する。
【００１６】
調製した酸化されたヒアルロナンは，例えばアミノ基を含む化合物の結合に使用可能である。前記結合はイミン形態か，或いは還元後にアミン形態（還元的アミノ化）（反応式７）で実施することが可能である。
【化８】
【００１７】
この修飾の両段階は水溶液中で行い，還元はＮａＢＨ３ＣＮを使用して行う。反応式７に記載の反応の両段階は１工程で行うことが可能である。
【００１８】
ヒアルロン酸誘導体の修飾は，酸化誘導体と，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンとを反応させることで行うことが可能であり，式中，Ｒは，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む，直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである。このアミンはアルキルアミン，例えばブチルアミン又はヘキサンジアミン，アミノ酸，ペプチド又は遊離アミノ基を含む多糖とすることが可能である。ジアミン，又は３つ以上のアミノ基を含む化合物を使用する場合，架橋ヒアルロナン誘導体を調製することが可能である。架橋誘導体は，アルデヒドと，アミノアルキル基ＨＡ‐アルキル‐ＮＨ２で置換したヒアルロナンとを反応させることでも調製可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ＤＳ＝置換度＝１００％×結合した置換体の分子量／全多糖二量体の分子量。
本明細書で使用している用語「当量（ｅｑ）」は，特に指定がなければヒアルロン酸二量体を指す。本明細書で使用している百分率は，特に指定がなければ重量パーセントを意味する。
出発ヒアルロナン（starting hyaluronan）（ソース：シーピーエヌ エスピーオーエル．エス．アール．オー．（CPN spol. s r. o.), ドルニ ドブロチ, チェコ）の分子量はＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳアッセイで測定した。
【００２０】
実施例１ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（０．２ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定）
【００２１】
実施例２ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（０．２ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸ナトリウム塩（０．１ｇ，６００ｋＤａ）０．５％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２２】
実施例３ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ（１ｅｑ）溶液を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ５０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２３】
実施例４ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（１ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度２０℃で１時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２４】
実施例５ ＤＭＰによるヒアルロン酸の酸化
ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中のＤＭＰ溶液（０．２ｅｑ）を，ＤＭＳＯ中のヒアルロン酸（０．１ｇ，２０ｋＤａ）１％溶液に添加した。該混合液を温度５０℃で１時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２５】
実施例６ 酸化されたヒアルロナンとアミンとの反応
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をブチルアミン（０．４ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を２倍量のアセトン及び０．１ｍｌのＮａＣｌ飽和水溶液で沈殿させ，ろ過し，真空乾燥させた。その後，得られた黄色の材料を分析した。
ＵＶ‐ＶＩＳ ３２８ｎｍ，ｎ→π＊遷移 ‐ＣＨ＝Ｎ‐
【００２６】
実施例７ 酸化されたヒアルロナンとブチルアミンとの反応，及びそれに続く還元
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝５０％，実施例３）をブチルアミン（０．４ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３５％（ＮＭＲにより測定）
【００２７】
実施例８ 酸化されたヒアルロナンとジアミンとの反応，及びそれに続く還元
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝５０％，実施例３）をヘキサンジアミン（０．４ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３５％（ＮＭＲにより測定）
【００２８】
実施例９ 酸化されたヒアルロナンとアミノ‐ヒアルロナンとの反応
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）を，温度２０℃で，ヘキサンジアミン（１ｅｑ，ＤＳ＝３５％，実施例８）で置換したヒアルロナン誘導体の１％水溶液と混合した。数分後に得られた不溶性の凝縮したゴム状沈殿物を機械的に粉砕して小片にし，ろ過し，減圧下で乾燥させた。
ＦＴ‐ＩＲ（ＫＢｒ） １７００ｃｍ−１
【００２９】
実施例１０ リジンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をリジン（０．３ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２５％（ＮＭＲにより測定）
【００３０】
実施例１１ リジンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をリジン（２０ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（１０ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。その後，得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２８％（ＮＭＲにより測定，実施例１０）
【００３１】
実施例１２ セリンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をセリン（０．３ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で１分間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２６％（ＮＭＲにより測定）
【００３２】
実施例１３ アルギニンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝３０％，実施例４）をアルギニン（０．３ｅｑ）と混合した。該混合液を温度２０℃で１００時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ２３％（ＮＭＲにより測定）
【００３３】
実施例１４ ペンタペプチドＰＡＬ‐ＫＴＴＫＳ（パルミトイル‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｓｅｒ）による酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
水／イソプロパノール系２／１中の酸化されたヒアルロン酸の溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度 ＤＳ＝１０％，実施例１）を，イソプロピルアルコール中の置換ペンタペプチドＰＡＬ‐ＫＴＴＫＳ（０．０５ｅｑ）１％溶液と混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ８％（ＮＭＲにより測定）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミン部分の６位で，式Ｘによるアルデヒド，及び，その水和形態であり，式Ｙによる所謂ジェミナルジオール：
へと酸化されたヒアルロン酸誘導体。
【請求項２】
極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシド中で，ヒアルロン酸がデス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）と反応する請求項１記載のヒアルロン酸誘導体の調製方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸が，遊離酸又は塩の形態である請求項２記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の分子量が，１．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内にある請求項２又は３記載の調製方法。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸が前記デス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）と，温度１０〜５０℃の範囲内，好ましくは２０℃で，５分〜１５０時間，好ましくは少なくとも１０時間反応する請求項２〜４いずれか１項記載の調製方法。
【請求項６】
前記ＤＭＰが前記ヒアルロン酸の二量体に対して０．０５〜１当量の範囲内の量で存在する請求項２〜５いずれか１項記載の調製方法。
【請求項７】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンと反応し，式中，Ｒは，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである請求項２〜６いずれか１項記載の方法を使用して調製した前記ヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項８】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がアミノ酸と反応する請求項７記載の修飾方法。
【請求項９】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がペプチドと反応する請求項７記載の修飾方法。
【請求項１０】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が遊離アミノ基を含む多糖と反応する請求項７記載の修飾方法。
【請求項１１】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖の量が，前記ヒアルロナンの二量体に対して０．０５〜１０当量の範囲内である請求項７〜１０いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１２】
水又は水‐有機溶媒系中で，前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が，前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と温度０〜８０℃の範囲内，好ましくは２０℃で，１分〜２４時間，好ましくは１時間反応する請求項７〜１１いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１３】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖を添加した０〜１００時間後に請求項１２記載の反応混合液に添加される還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの存在下で，前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と反応する修飾方法。
【請求項１４】
前記還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの量が，前記アルデヒド又はジェミナルジオールの分子量に対して０〜２０モル当量の範囲内である請求項１３記載の修飾方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒が，水混和性アルコール，特にイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシドから成る群より選択される請求項１２〜１４いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１６】
水の量が溶液全体の体積に対して少なくとも５０％（ｖ／ｖ）である請求項１２〜１５いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１】
グルコサミン部分の６位で，式Ｘによるアルデヒド，及び，その水和形態であり，式Ｙによる所謂ジェミナルジオール：
へと酸化されたヒアルロン酸誘導体。
【請求項２】
極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシド中で，ヒアルロン酸がデス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）と反応する請求項１記載のヒアルロン酸誘導体の調製方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸が，遊離酸又は塩の形態である請求項２記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の分子量が，１．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内にある請求項２又は３記載の調製方法。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸が前記デス‐マーチンペリオジナン（ＤＭＰ）と，温度１０〜５０℃の範囲内，好ましくは２０℃で，５分〜１５０時間，好ましくは少なくとも１０時間反応する請求項２〜４いずれか１項記載の調製方法。
【請求項６】
前記ＤＭＰが前記ヒアルロン酸の二量体に対して０．０５〜１当量の範囲内の量で存在する請求項２〜５いずれか１項記載の調製方法。
【請求項７】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンと反応し，式中，Ｒは，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである請求項２〜６いずれか１項記載の方法を使用して調製した前記ヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項８】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がアミノ酸と反応する請求項７記載の修飾方法。
【請求項９】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がペプチドと反応する請求項７記載の修飾方法。
【請求項１０】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が遊離アミノ基を含む多糖と反応する請求項７記載の修飾方法。
【請求項１１】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖の量が，前記ヒアルロナンの二量体に対して０．０５〜１０当量の範囲内である請求項７〜１０いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１２】
水又は水‐有機溶媒系中で，前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が，前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と温度０〜８０℃の範囲内，好ましくは２０℃で，１分〜２４時間，好ましくは１時間反応する請求項７〜１１いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１３】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖を添加した０〜１００時間後に請求項１２記載の反応混合液に添加される還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの存在下で，前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と反応する修飾方法。
【請求項１４】
前記還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの量が，前記アルデヒド又はジェミナルジオールの分子量に対して０〜２０モル当量の範囲内である請求項１３記載の修飾方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒が，水混和性アルコール，特にイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシドから成る群より選択される請求項１２〜１４いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１６】
水の量が溶液全体の体積に対して少なくとも５０％（ｖ／ｖ）である請求項１２〜１５いずれか１項記載の修飾方法。
【公表番号】特表２０１３−５１３６７１（Ｐ２０１３−５１３６７１Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２３５５（Ｐ２０１２−５４２３５５）
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＺ２０１０／０００１２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９４７４
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５０７２１１８９７）コンティプロ ファーマ アクチオヴァ スポレチノスト (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＺ２０１０／０００１２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６９４７４
【国際公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５０７２１１８９７）コンティプロ ファーマ アクチオヴァ スポレチノスト (3)
【Ｆターム（参考）】
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