ヒト化ＦｃγＲマウス
遺伝子改変が内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の欠失を含み、マウスが機能的ＦｃＲ γ鎖を発現することができる、遺伝子改変された非ヒト動物、ならびにそれらを作製および使用するための方法および組成物を提供する。内因性ＦｃγＲ遺伝子座由来の低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現するマウスを含めた、機能的ＦｃＲ γ鎖を含む、遺伝子改変されたマウスを記載する。宿主免疫系のアクセサリー細胞上に５つまでの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する、遺伝子改変されたマウスを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、内因性マウスＦｃγＲ遺伝子を欠く遺伝子改変された非ヒト動物であり、これには、内因性ＦｃγＲ遺伝子の、ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含む遺伝子改変された動物が含まれ、かつ少なくとも２、３、４、または５つの機能的ヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現することができるマウスが含まれ、かつ内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現しない免疫細胞を含む遺伝子改変されたマウスが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、哺乳動物において免疫系の様々な機能を実行する、免疫系の細胞の表面上に見出されるタンパク質である。ＦｃＲは、様々な細胞上に、様々なタイプで存在し、たとえば、感染細胞または侵入している病原体に付いている抗体への結合、抗体媒介性食作用または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって微生物または感染細胞を破壊するために、食作用性細胞または細胞傷害性細胞の刺激などのような、様々な免疫機能を媒介する。
【０００３】
ＡＤＣＣは、それによって、抗体が結合した標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が溶解するプロセスである。このプロセスは、外来抗原または外来細胞に対する事前の曝露に依存し、抗体応答をもたらす。ＡＤＣＣは、それ自体が外来抗原または外来細胞に結合した抗体のＦｃ部分への、エフェクター細胞の表面上に発現されたＦｃＲの結合によって、たとえばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのようなエフェクター細胞を通して媒介することができる。ＦｃＲが免疫応答において果たす中心的な役割のために、複数のヒト低親和性ＦｃＲを同時発現する非ヒト動物を含む、複数のヒトＦｃＲを同時発現する有用な非ヒト動物が必要とされる。ヒト疾患療法、特に、抗腫瘍療法および自己免疫疾患を治療するための療法に関する研究および解明ならびに特に、ヒト抗体医薬品の開発、設計、および試験における医薬開発のための、ヒトＦｃＲ機能およびＡＤＣＣのヒトプロセスの非ヒト動物モデルの必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、非ヒト動物、ならびにそれらを作製し、使用するための方法および組成物が提供される。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒトＦｃγＲ受容体、内因性低親和性ＦｃγＲ受容体の欠失、および／または内因性マウス低親和性ＦｃγＲの遺伝子座での、内因性ＦｃγＲ受容体の、ヒトＦｃγＲ受容体による置き換えを含む。
【０００５】
一態様では、機能的ＦｃＲ γ鎖を含む、遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、および非ヒト動物が提供され、細胞、胚、および動物は、低親和性内因性非ヒトＦｃγＲ遺伝子配列（たとえばＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ）の、１つまたは複数の低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子配列（たとえば、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびその組合せから選択される）による置き換えを含む、さらなる改変を含む。
【０００６】
一実施形態では、細胞、非ヒト胚、および非ヒト動物は、マウスである。一実施形態では、機能的ＦｃＲ γ鎖は、マウスＦｃＲ γ鎖である。一実施形態では、マウスＦｃＲ γ鎖は、マウス、細胞、または胚に対して内因性のＦｃＲ γ鎖である。
【０００７】
一実施形態では、細胞、胚、および動物は、マウスであり、マウスは、ヒト低親和性ＦｃγＲ受容体の機能的α鎖および機能的内因性マウスγ鎖を発現する。
【０００８】
一態様では、遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、ＦｃγＲＩＩＢ α鎖、ＦｃγＲＩＶ α鎖、ＦｃγＲＩＩＩ α鎖、およびその組合せから選択される内因性α鎖を発現せず、マウスは、機能的内因性マウスγ鎖を発現する。
【０００９】
特定の実施形態では、マウスは、機能的ＦｃγＲＩＩＢ α鎖を発現せず、機能的ＦｃγＲＩＶ α鎖を発現せず、かつ機能的ＦｃγＲＩＩＩ α鎖を発現しない。
【００１０】
一実施形態では、マウスゲノムは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ α鎖の欠失、内因性ＦｃγＲＩＶ α鎖の欠失、および内因性ＦｃγＲＩＩＩ α鎖の欠失を含む。
【００１１】
一実施形態では、マウスは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ α鎖の欠失、内因性ＦｃγＲＩＶ α鎖の欠失、および内因性ＦｃγＲＩＩＩ α鎖の欠失を含み、さらに、同じ抗原に関して、野生型マウスの能力と比較して、抗原に対する免疫応答を行う能力が低下している。一実施形態では、免疫応答の低下は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少を含む。一実施形態では、免疫応答の低下は、抗体依存性ＮＫ細胞殺傷を達成するための細胞殺傷アッセイにおける能力の低下を含む。特定の実施形態では、ＡＤＣＣまたは抗体依存性ＮＫ細胞殺傷における低下は、少なくとも５０％であり、一実施形態では少なくとも７５％、一実施形態では少なくとも９０％である。
【００１２】
一実施形態では、マウスは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ α鎖の欠失、内因性ＦｃγＲＩＶ α鎖の欠失、および内因性ＦｃγＲＩＩＩ α鎖の欠失を含み、野生型マウス、たとえば、欠失を含まない同じまたは類似する株のマウスと比較して、抗原を用いる免疫化に際しての体液性抗体応答の増加をさらに含む。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、２倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、３倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、５倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、７倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、１０倍である。特定の実施形態では、体液性抗体応答は、マウス由来の血清タンパク質の１マイクログラム当たりの、（マウスが免疫化される）抗原に特異的に結合する抗体のマイクログラムによって測定される。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスが耐性を示す抗原または野生型マウスにおいて弱いもしくは最小限の体液性免疫反応を示す抗原に関してのものである。特定の実施形態では、抗原は、マウス抗原である。特定の実施形態では、抗原は、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のマウスタンパク質との同一性を示すヒト抗原である。
【００１３】
一態様では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスが提供され、置き換えは、内因性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の遺伝子座でのものである。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子から選択される。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、内因性ＦｃＲ γ鎖を発現し、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖である。他の特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、ＮＫ細胞上に、内因性ＦｃＲ γ鎖および機能的ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を発現する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖の機能性は、ヒト抗体媒介性ＮＫ殺傷（たとえばヒト抗体によって媒介されるＡＤＣＣ）によって反映される。
【００１４】
一態様では、遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、または非ヒト動物が提供され、遺伝子改変は、少なくとも１つの内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の、ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含み、細胞、胚、または動物は、機能的ＦｃＲ γ鎖を発現する。一実施形態では、機能的ＦｃＲ γ鎖は、内因性ＦｃＲ γ鎖である。一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子は、多型を含み、多型は、１３１Ｈｉｓ低応答動物多型および１３１Ａｒｇ高応答動物多型から選択される。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ多型は、１３１Ｈｉｓ低応答動物多型である。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子は、特異的な対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）であり、対立遺伝子変異体は、１５８Ｖａｌ変異体および１５８Ｐｈｅ変異体から選択される。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡ対立遺伝子変異体は、１５８Ｖａｌ変異体である。
【００１５】
一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子、およびその組合せから選択される。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、アミノ酸置換を含み、置換は、２３２Ｉｌｅまたは２３２Ｔｈｒ置換から選択される。他の特定の実施形態では、アミノ酸置換は、２３２Ｉｌｅ置換である。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子は、特異的対立遺伝子変異体であり、対立遺伝子変異体は、ＮＡ１変異体およびＮＡ２変異体から選択される。他の特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＢ対立遺伝子変異体は、ＮＡ２変異体である。
【００１６】
一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。
【００１７】
一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子は、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子は、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子は、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。特定の実施形態では、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子によって置き換えられる。他の特定の実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子は、変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子は、１３１Ｈｉｓ変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子は、１５８Ｖａｌ変異体を含む。他の特定の実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、以下の低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子：ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢによって置き換えられる。他の特定の実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子は、変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子は、２３２Ｉｌｅ変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子は、ＮＡ２変異体を含む。
【００１８】
一実施形態では、遺伝子改変は、マウスおよびヒト染色体１のシンテニックゲノム配列の置き換えを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変は、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を含むゲノム断片の、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を含むゲノム断片による置き換えを含む。他の特定の実施形態では、染色体１：１７２，８８９，９８３〜染色体１：１７２，９８９，９１１のマウスゲノムは、ヒト染色体１：１６１，４７４，７２９〜染色体１：１６１，６２０，４５８を含むヒトゲノム断片によって置き換えられる。
【００１９】
一態様では、遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、または非ヒト動物が提供され、遺伝子改変は、１つまたは複数の内因性低親和性受容体α鎖遺伝子のノックアウトおよび１つまたは複数のヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子を含むエピソームの存在を含む。特定の実施形態では、細胞、胚、または動物は、機能的ＦｃＲ γ鎖を発現する。特定の実施形態では、エピソームは、ミニ染色体である。一実施形態では、機能的ＦｃＲ γ鎖は、細胞、胚、または動物に対して内因性である。
【００２０】
一態様では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を含み、マウスは、機能的ヒト低親和性ＦｃγＲ受容体を発現する。一実施形態では、機能的低親和性ＦｃγＲ受容体は、ヒトにおいて低親和性ＦｃγＲ受容体が発現される細胞型上に発現される。特定の実施形態では、機能的ヒト低親和性ＦｃγＲ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩＡであり、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞上に発現される。
【００２１】
一実施形態では、マウスは、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、マウスは、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の欠失を含む。
【００２２】
一実施形態では、マウスは、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。他の実施形態では、マウスは、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。特定の実施形態では、マウスは、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも２つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。他の特定の実施形態では、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、３つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。他の特定の実施形態では、マウスは、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも２つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。他の特定の実施形態では、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、少なくとも３つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。
【００２３】
一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、ＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。
【００２４】
一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。
【００２５】
一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子は、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子は、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子は、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。特定の実施形態では、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、マウスα鎖遺伝子は、以下のヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子：ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡによって置き換えられる。他の特定の実施形態では、マウスα鎖遺伝子は、以下のヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子：ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢによって置き換えられる。
【００２６】
一態様では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖およびマウスＦｃＲ γ鎖サブユニットを含む遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、血小板、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲ α鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、好中球、マクロファージ、好酸球、血小板、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖を通して開始または媒介される食作用、ＡＤＣＣ、および細胞性の活性化が可能である。一実施形態では、マウスは、マクロファージ、ＮＫ細胞、単球、肥満細胞、好酸球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、少なくとも１つのＴ細胞型、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、ＮＫ細胞上に発現されるヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を通して媒介されるＡＤＣＣが可能である。特定の実施形態では、マウスは、ヒトＦｃを含む抗体に応じて、ｈＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性のＡＤＣＣを示す。
【００２７】
一実施形態では、マウスは、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖の両方を発現する。一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖は、血小板上に発現され、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖は、ＮＫ細胞上に発現される。一実施形態では、マウスは、ヒトＦｃを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣが可能であり、媒介は、アクセサリー細胞の表面上に発現されるヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖を通してのまたはヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を通してのものである。一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖は、血小板上に発現されない。ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖が血小板上に発現されない特定の実施形態では、マウスは、ヒトゲノムにおいてヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖に作動可能に連結されるヒトプロモーター配列を欠くまたは実質的に欠く。
【００２８】
一実施形態では、マウスは、Ｂ細胞、肥満細胞、好塩基球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖を発現する。特定の実施形態では、マウスは、Ｂ細胞および肥満細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖を発現する。他の特定の実施形態では、マウスは、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖を通して媒介される免疫複合体のエンドサイトーシスが可能である。一実施形態では、マウスは、好中球、マクロファージ、好酸球、血小板、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＣ α鎖を発現する。特定の実施形態では、マウスは、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＣ α鎖を通して開始される食作用、ＡＤＣＣ、および細胞の活性化が可能である。
【００２９】
一実施形態では、マウスは、好中球および好酸球上にヒトＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖を発現する。特定の実施形態では、マウスは、細胞の活性化、食作用、ＡＤＣＣ、および脱顆粒が可能であり、活性化、食作用、ＡＤＣＣ、および脱顆粒は、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖を通して媒介される。
【００３０】
一態様では、内因性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＩＩＩ遺伝子の欠失ならびにヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子の挿入を含むマウスが提供され、マウスは、機能的マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を含む。
【００３１】
一実施形態では、マウスは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃｒＲＩＩＩ遺伝子によってコードされるα鎖の欠失ならびにヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子によってコードされるα鎖の挿入を含む。
【００３２】
一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子の挿入は、マウスゲノム内のランダムな位置にある。
【００３３】
一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子の挿入は、内因性マウス低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座にある。
【００３４】
一実施形態では、マウスは、ＮＫ細胞およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。特定の実施形態では、マウスの脾細胞試料由来のすべてまたは実質的にすべてのＮＫ細胞は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。特定の実施形態では、マウスの脾細胞試料由来のすべてまたは実質的にすべてのマクロファージは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。
【００３５】
一実施形態では、マウスは、好中球、マクロファージ、およびその組合せから選択される細胞型上に、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、およびその組合せから選択されるヒトＦｃγＲを発現する。特定の実施形態では、マウスは、マウス由来の脾細胞試料のすべてまたは実質的にすべての好中球およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＡおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。
【００３６】
一実施形態では、マウスは、このマウスからのＢ細胞ゲーティングされた脾細胞試料からのＢ細胞のうち、Ｂ細胞および好中球上にヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＢを発現する。特定の実施形態では、マウスは、このマウスからＢ細胞ゲーティングされた脾細胞試料からのすべてまたは実質的にすべてのＢ細胞および好中球上にＦｃγＲＩＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＢを発現する。
【００３７】
一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ２０遺伝子をさらに含む。一実施形態では、ヒト化ＣＤ２０遺伝子をさらに含むマウスは、Ｆｃを含む抗ＣＤ２０結合タンパク質を用いる処理に続いて、Ｂ細胞の枯渇（ｉｎ ｖｉｖｏにおいて）を示す。一実施形態では、枯渇は、骨髄、血液、リンパ節、脾臓、およびその組合せから選択されるコンパートメントにおけるものとする。一実施形態では、Ｆｃは、ヒトＦｃである。一実施形態では、Ｆｃは、マウスＦｃである。一実施形態では、抗ＣＤ２０結合タンパク質は、抗ＣＤ２０抗体である。
【００３８】
一態様では、本明細書において記載される遺伝子改変を含む細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、多能性細胞、誘導多能性細胞、および全能性細胞から選択される。一実施形態では、細胞は、マウス細胞およびラット細胞から選択される。特定の実施形態では、細胞は、ＥＳ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、マウスＥＳ細胞である。
【００３９】
一態様では、本明細書において記載される遺伝子改変を含む非ヒト胚が提供される。一実施形態では、非ヒト胚は、マウス胚およびラット胚から選択される。
【００４０】
一態様では、治療薬の効能を決定するための方法が提供される。一実施形態では、治療薬は、ヒトＦｃを含む抗体（たとえば単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性）である。一実施形態では、治療薬は、ヒト抗体である。一実施形態では、効能は、治療薬媒介性の細胞殺傷（たとえばＡＤＣＣ）の効能である。特定の実施形態では、ヒト治療薬は、ヒト免疫グロブリン重鎖のＦｃを含む融合タンパク質である。一実施形態では、治療薬は、本明細書において記載されるように、マウスに投与され、治療薬依存性のＡＤＣＣのレベルが測定される。一実施形態では、マウスは、治療薬をマウスに投与し、次いで、ＦｃγＲ発現細胞上のヒト低親和性ＦｃγＲへの治療薬の結合を検出することによって（たとえば、動物から採取された試料（たとえば血液）からｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて）、治療薬のＡＤＣＣ活性を評価するために使用される。特定の実施形態では、マウスのアクセサリー細胞は、マウスから単離され、治療薬依存性のＡＤＣＣを媒介するための、治療薬の存在下または非存在下における能力について試験される。
【００４１】
一態様では、低親和性ＦｃγＲがヒト疾患または障害と関連するかどうかを決定するための方法であって、本発明に従って、マウスにおいて、ヒト疾患または障害と関連する形質を決定するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、形質は、１つまたは複数の低親和性ＦｃγＲの機能の不在または損失と関連する表現型である。特定の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。特定の実施形態では、自己免疫疾患または障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、ギラン−バレー症候群、硬化症、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）から選択される。特定の実施形態では、マウスは、低親和性ＦｃγＲにおいて多型を含み、形質は、多型を有しない大多数のヒト集団と比較した、ＡＤＣＣを媒介するための能力の増強および多型を有しない大多数のヒト集団と比較した、ＡＤＣＣを媒介するための能力の低下から選択される。
【００４２】
一態様では、マウスにおいて抗ヒトＦｃＲ α鎖抗体を作製するための方法であって、本明細書において記載されるヒトＦｃＲに対して本発明によるマウスを曝露するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、ヒトＦｃＲを認識する抗体は、マウスから単離される。他の実施形態では、ヒトＦｃＲを認識する抗体の可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列は、同定され、クローニングされる。
【００４３】
一態様では、標的分子の食作用についての、ＦｃＲ発現細胞に対する標的分子に対する抗ヒトＦｃＲ抗体の能力を決定するための方法であって、抗ヒトＦｃＲ抗体を含む作用物質に対して本明細書において記載されるマウスを曝露するステップおよび標的分子の食作用を測定するステップを含む、方法が提供される。
【００４４】
一態様では、１つまたは複数のＦｃγＲに関して野生型であるマウスにおいて低免疫原性の抗原に対して、マウスにおいて抗体を作製するための方法であって、１つまたは複数のＦｃγＲに関して野生型であるマウスにおいて低免疫原性の抗原に対して、マウス低親和性ＦｃＲを欠くが、ＦｃγＲ γ鎖を発現する、本明細書において記載されるマウスを曝露するステップおよび低抗原性の抗原を認識する抗体を同定するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、方法は、マウスから抗体を単離するステップを含む。他の実施形態では、抗体の可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列は、同定され、クローニングされる。
【００４５】
一態様では、ヒト可変領域を含む抗体を作ることができるマウスを作製するための方法であって、本明細書において記載される第１のマウスを、（ａ）１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒト定常領域遺伝子または（ｂ）マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む第２のマウスと交配するステップを含み、ヒト遺伝子セグメントは、マウス可変領域遺伝子セグメントの遺伝子座で可変領域遺伝子セグメントに取って代わる、方法が提供される。
【００４６】
一実施形態では、第２のマウスは、（ａ）１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖定常遺伝子を含む導入遺伝子ならびに１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒト重鎖定常遺伝子を含む導入遺伝子を含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む導入遺伝子は、２つ以上の重鎖定常遺伝子を含み、クラススイッチが可能である。特定の実施形態では、マウスは、不活性化された内因性軽鎖遺伝子座および／または不活性化された内因性重鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、マウスは、内因性軽鎖遺伝子座の欠失および／または内因性重鎖遺伝子座の欠失を含む。
【００４７】
一実施形態では、第２のマウスは、（ｂ）それぞれ、重鎖および軽鎖のマウス遺伝子座に、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。
【００４８】
一態様では、抗腫瘍抗体を選択するための方法であって、ＡＤＣＣを媒介するための抗体の能力を決定するステップを含み、ＡＤＣＣを媒介するための抗体の能力は、本明細書において記載されるマウスの細胞によって媒介されるＡＤＣＣを決定することによって試験され、抗体は、それが本明細書において記載される遺伝子改変されたマウスの細胞を用いるＡＤＣＣを媒介する場合、選択される、方法が提供される。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスの細胞への抗体の結合が決定され、抗腫瘍抗体が、細胞上のヒトＦｃγＲに結合するその能力について選択される。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲは、低親和性ＦｃγＲである。
【００４９】
一実施形態では、抗腫瘍抗体は、野生型マウスの細胞を通してＡＤＣＣを媒介するための抗腫瘍抗体の能力と比較した、マウスの細胞を通してＡＤＣＣを媒介する能力の増強によって同定される。特定の実施形態では、抗腫瘍抗体は、ＮＫ細胞を通してＡＤＣＣを媒介するその能力によって同定される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。
【００５０】
一実施形態では、抗腫瘍作用物質を選択するための方法であって、ヒトＦｃまたは改変ヒトＦｃを含む作用物質を第１の非ヒト動物に投与するステップであって、第１の非ヒト動物は、本発明に従って遺伝子改変され、ヒト腫瘍を含む、ステップ、腫瘍を含む第２の非ヒト動物に作用物質を投与するステップ、および作用物質の投与に続いて、ヒト腫瘍の成長を遅延させるための、第１の非ヒト動物および第２の非ヒト動物の能力を決定するステップを含み、作用物質は、それが、第２の非ヒト動物においてではなく、第１の非ヒト動物においてヒト腫瘍の成長を遅延させる能力の増強を示す場合、抗腫瘍作用物質として選択される、方法が提供される。
【００５１】
一実施形態では、第１の非ヒト動物は、内因性ＦｃＲ αサブユニットの欠失を含むように改変され、ＦｃγＲＩＩＡ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＢ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＣ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＩＡ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＩＢ αサブユニット、およびその組合せから成る群から選択されるヒトＦｃＲ αサブユニットを含むように改変される。一実施形態では、第２の動物は、野生型動物である。一実施形態では、第１の非ヒト動物は、内因性ＦｃＲ γ鎖を発現する。
【００５２】
一実施形態では、第１の非ヒト動物は、機能的内因性ＦｃγＲＩを発現する。
【００５３】
一態様では、低親和性マウスＦｃγＲを欠き、機能的ＦｃＲ γ鎖を発現し、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢのα鎖をコードする遺伝子を含む、マウスを作製するための方法であって、マウスＦｃγＲ α鎖の遺伝子座で、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖をヒトＦｃγＲ α鎖と置き換えするステップを含む、方法が提供される。
【００５４】
一実施形態では、第１のステップは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子のα鎖を欠失させることならびにヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖を挿入することを含み、第２のステップは、第１のステップから結果として生じるマウスゲノムの中にヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子のα鎖を挿入することを含み、マウスは、機能的マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を含む。特定の実施形態では、第２のステップのヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子のα鎖は、第１のステップのヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖に対して５’側に挿入される。
【００５５】
一態様では、非霊長動物においてヒト治療薬による細胞殺傷を決定するための方法であって、ヒトＦｃを含むヒト治療薬に、細胞、非ヒト胚、または非ヒト動物を曝露するステップであって、細胞、胚、または動物は、機能的ＦｃＲ γ鎖を含み、１つまたは複数の内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の、１つまたは複数のヒトＦｃγＲ α鎖による置き換えを含む、ステップおよび細胞、胚、または動物の低親和性ヒトＦｃγＲを通して細胞殺傷を媒介するためのヒト治療薬の能力を決定するステップを含む、方法が提供される。
【００５６】
一実施形態では、非霊長動物は、マウスである。特定の実施形態では、内因性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢと置き換えされる。
【００５７】
一実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、肥満細胞、好塩基球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される。特定の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞であり、ヒト抗体またはヒト化抗体によるＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣが、決定される。特定の実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡである。
【００５８】
一態様では、治療薬依存性の血栓形成を決定するための方法であって、治療薬に、血小板上にヒトＦｃγＲＩＩＡを発現する第１の非ヒト動物を曝露するステップ、当該治療薬に、血小板上にヒトＦｃγＲＩＩＡを発現しない第２の非ヒト動物を曝露するステップ、第１の非ヒト動物および第２の非ヒト動物において、治療薬依存性の血栓形成の量を測定するステップ、ならびに治療薬依存性の血栓形成における差異を決定するステップを含む、方法が提供される。
【００５９】
一実施形態では、非ヒト動物は、マウスおよびラットから選択される。
【００６０】
一実施形態では、治療薬依存性の血栓形成における決定された差異は、ヒトへの治療薬の投与と関連する危険性を同定するために用いられる。一実施形態では、決定された差異は、その必要性のあるヒト患者への治療薬の投与の変化をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、マウスＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子を示す、マウスにおける野生型低親和性ＦｃγＲ遺伝子座、ならびにこれらの遺伝子の標的欠失のために使用される、部位特異的組換え部位に挟まれたネオマイシンカセットを含むマウスＦｃγＲターゲッティングベクターの略図である。
【図２】図２は、野生型ＦｃγＲおよび低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子欠損マウス（ｍＦｃγＲ ＫＯ）についての、内因性ｍＦｃγＲＩＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩ遺伝子の発現を含む、Ｂ細胞（抗ＣＤ１９）、ＮＫ細胞（抗ＮＫｐ４６）、およびマクロファージ（抗Ｆ４／８０）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図４】図４は、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の、ネオマイシンを標的にした欠失、ならびに欠失させたマウス遺伝子座内に２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子（ｈＦｃγＲＩＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＡ）を挿入するための、部位特異的組換え部位に挟まれたヒグロマイシンカセットを含む第２のターゲッティングベクターの略図である。血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現のために、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡターゲッティングベクターのｈＦｃγＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結した伸長プロモーター領域を用いる；血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現を防止するために、プロモーター領域が取り除かれているか、実質的に取り除かれている。
【図５Ａ】図５Ａは、野生型およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡホモ接合体マウス（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ ＨＯ）についての、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡの発現を含む、ＮＫ細胞（抗ＮＫｐ４６）およびマクロファージ（抗Ｆ４／８０）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、野生型およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡホモ接合体マウス（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ ＨＯ）についての、ヒトＦｃγＲＩＩＡの発現を含む、好中球（抗Ｌｙ６Ｇ）およびマクロファージ（抗Ｆ４／８０）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【図６】図６は、２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（ｈＦｃγＲＩＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＡ）の挿入を含む低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の、ヒグロマイシンを標的にした欠失、ならびに３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（ｈＦｃγＲＩＩＢ、ｈＦｃγＲＩＩＩＢ、およびｈＦｃγＲＩＩＣ）、および部位特異的組換え部位に挟まれたネオマイシンカセットを挿入するための第３のターゲッティングベクターの略図である。
【図７】図７は、野生型およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＩＢ−ＩＩＡ−ＩＩＢ−ＩＩＣホモ接合体マウス（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＣ ＨＯ）についての、ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＢの発現を含む、Ｂ細胞（抗ＣＤ１９）および好中球（抗Ｌｙ６Ｇ）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
本発明は、方法および条件が変更されてもよいので、記載される特定の方法および実験条件に限定されない。本明細書において使用される術語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲が請求項によってのみ限定されるので、限定を意図するものではない。
【００６３】
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者らによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、特定の方法および材料が記載される。本明細書において言及される刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００６４】
語句「標的構築物」は、標的領域を含むポリヌクレオチド分子を含む。標的領域は、標的細胞、組織、または動物における配列に実質的に相同な配列を含み、細胞、組織、または動物のゲノム内の位置への標的構築物の組み込みをもたらす。特定の実施形態では、標的構築物は、さらに特定の対象の核酸配列または遺伝子、選択マーカー、制御配列または調節配列、およびそのような配列を含む組換えを支援するまたは促進するタンパク質の外因性の追加を通して媒介される組換えを可能にする他の核酸配列を含む。他の特定の実施形態では、標的構築物は、対象の遺伝子をさらに含み、対象の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似する機能を有するタンパク質をコードする異種遺伝子である。
【００６５】
用語「置き換え」は、その他に示されない限り、ＤＮＡ配列が、ゲノム内の配列をそのゲノム配列の遺伝子座で異種配列によって置き換えるような方法で細胞のゲノムの中に配置されることを含む（たとえばマウスにおけるヒト配列）。そのように配置されたＤＮＡ配列は、そのように配置された配列を得るために使用される供給源のＤＮＡの一部である１つまたは複数の調節配列を含んでいてもよい（たとえばプロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域など）。たとえば、様々な実施形態では、置き換えは、内因性配列の発現ではなく、そのように配置されたＤＮＡ配列（異種配列を含む）由来の遺伝子産物の生産をもたらす、内因性配列の異種配列との置換であり、置き換えは、内因性ゲノム配列の、内因性ゲノム配列によってコードされるタンパク質に類似する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列とのものである。（たとえば、内因性ゲノム配列は、低親和性マウスＦｃγＲ受容体をコードし、ＤＮＡ断片は、たとえばヒトＦｃγＲＩＩＣおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＢなどのような、１つまたは複数のヒト低親和性ＦｃγＲ受容体をコードする）。
【００６６】
用語「ＦｃγＲ」は、Ｆｃ、たとえばＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分に対する受容体を含む。ＦｃγＲ遺伝子は、細胞の表面上に発現されるα鎖を含み、リガンド結合ドメインとして働き、ＦｃＲ γ鎖のホモ二量体またはＦｃＲ γ鎖およびδ鎖のヘテロ二量体を伴う。いくつかの異なるＦｃγＲ遺伝子があり、それらは、免疫複合体におけるＩｇＧへの優先的な結合に従って低親和性タイプおよび高親和性タイプに分類することができる。ヒトにおける低親和性ＦｃγＲ遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢを含み、ほとんどのこれらの遺伝子内に、天然に存在する遺伝子差異または多型が、自己免疫疾患を有するヒト対象において記載されている。本開示を読むに際して当業者らは、ゲノムにおける１つまたは複数の内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子（またはすべて）を、１つまたは複数の異種低親和性ＦｃγＲ遺伝子（たとえば、対立形質などのような変異体または多型、他の種由来の遺伝子、キメラ形態など）によって置き換えることができることを認識するであろう。
【００６７】
語句「対立遺伝子変異体」は、同じ遺伝子の一連の異なる形態をもたらす、遺伝子の通常の配列の変異を含む。異なる形態は、たとえば遺伝子由来のタンパク質の配列において２０までのアミノ酸の差異を含んでいてもよい。たとえば、対立遺伝子は、同じ物理的な遺伝子座での代替のＤＮＡ配列であることを理解することができ、対立遺伝子は、同じ遺伝子についての他の対立遺伝子において結果として生じないまたは他の対立遺伝子において様々な程度で結果として生じる、ある種の疾患または状態に対する感受性などのような異なる形質（たとえば遺伝的な表現型の特徴）をもたらしてもよいまたはもたらさなくてもよい。
【００６８】
「アクセサリー細胞」は、免疫応答のエフェクター機能に関与する免疫細胞を含んでいてもよい。例示的な免疫細胞は、リンパまたは骨髄起源の細胞、たとえば、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、肥満細胞などを含む。アクセサリー細胞は、それらの表面上に発現される受容体、たとえばＦｃＲを通して免疫系の特異的な機能を実行する。特定の実施形態では、アクセサリー細胞は、細胞表面上に発現されるＦｃＲ、たとえば低親和性ＦｃγＲを通して媒介されるＡＤＣＣを引き起こすことができる。たとえば、ＦｃＲを発現するマクロファージは、抗体被覆細菌の食作用および破壊に関与する。アクセサリー細胞はまた、他の免疫プロセスを媒介する作用物質を放出することができるかもしれない。たとえば、肥満細胞は、ＦｃＲに結合した抗体によって活性化され、感染の部位で、顆粒、たとえば炎症性分子（たとえばサイトカイン）を放出することができる。様々な他の実施形態では、アクセサリー細胞上のＦｃＲの発現は、他の因子（たとえばサイトカイン）によって調節することができる。たとえば、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ発現は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を用いる刺激によって誘導することができる。
【００６９】
マウスおよびヒトＦｃＲ
免疫グロブリンのＦｃ（つまり定常）領域に対する受容体（ＦｃＲ）は、免疫応答の調節において重要な役割を果たす。ＦｃＲは、抗体が結合した外来抗原を有効に処分するために、宿主の免疫系のアクセサリー細胞上に存在する。ＦｃＲはまた、免疫系のアクセサリー細胞の活性化および阻害性の応答の平衡を保つ際に重要な役割を果たす。ＦｃＲは、マクロファージによる食作用、肥満細胞の脱顆粒、抗体−抗原複合体の取り込み、および免疫応答の改変ならびに他の免疫系プロセスに関与する。
【００７０】
マウスおよびヒトでは、発現された抗体レパートリーにおいて存在する免疫グロブリンアイソタイプにそれぞれ特異的である別個のＦｃＲが、異なるアクセサリー細胞の表面上に異なって発現される。たとえば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲ）を通してエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲは、３つのグループに分類される：高親和性活性化ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、低親和性阻害性ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、および低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）。グループはそれぞれ、マウスおよびヒトの両方に存在するが、それらが存在する免疫細胞のアイソフォームおよびサブセットの数は異なる。たとえば、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢは、ヒトにおいてアクセサリー細胞上に発現されるが、報告によれば、マウスでは不在である。さらに、それぞれのＦｃγＲに対する異なるＩｇＧアイソタイプ（たとえばＩｇＧ１）の親和性は、マウスおよびヒトにおいて異なる。
【００７１】
ＦｃγＲを通しての細胞シグナル伝達の活性化または阻害およびＦｃγＲへの抗体結合と関連するエフェクター機能は、ＦｃγＲの細胞内ドメインのまたは共受容体のサブユニットの特異的配列モチーフによって媒介されると考えられる。受容体の活性化は、最も一般には、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する共通のγ鎖（ＦｃＲ γ鎖）と関連する。ＩＴＡＭは、ＦｃＲへの抗体結合に応じてリン酸化されるチロシン残基を含む、約９〜１２のアミノ酸の特異的配列を含有する。リン酸化は、シグナル伝達カスケードを導く。ＦｃＲ γ鎖をコードする遺伝子を欠くマウス（ＦｃＲ γ鎖 ＫＯ）が報告された（たとえばTakaiら（１９９４年） FcR γ Chain Depletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell ７６巻：５１９〜５２９頁；van Vugtら（１９９６年）FcR γ-Chain Is Essential for Both Surface Expression and Function of Human FcγRI (CD64) In Vivo, Blood ８７巻（９号）：３５９３〜３５９９頁；およびParkら（１９９８年）Resistance of Fc Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin. Invest. １０２巻（６号）：１２２９〜１２３８頁を参照されたい）。ＦｃＲ γ鎖は、報告によれば、ほとんどのＦｃＲの適切な表面発現および機能（たとえばシグナル伝達、食作用など）にとって不可欠であり、ＦｃＲ γ鎖 ＫＯマウスは、いくつかの報告書によれば、ＦｃγＲＩを欠く。しかしながら、他の報告は、ＦｃＲ γ鎖 ＫＯマウスが、実際は、ある種のアクセサリー細胞の表面上にＦｃγＲＩを発現し、発現されたＦｃγＲＩは、報告によれば、それが、発現されるＦｃＲ γ鎖の非存在下において、マウスにおいて、ＩｇＧに結合するという点で機能的に見えるということを明らかにする（Barnesら（２００２年） FcγRI-Deficient Mice Show Multiple Alterations to Inflammatory and Immune Responses, Immunity １６巻：３７９〜３８９頁）。
【００７２】
対照的に、ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する、阻害性の受容体である。ＩＴＡＭと同様に、ＩＴＩＭは、リン酸化することができるチロシン残基を含む配列モチーフである。しかしながら、ＩＴＭのリン酸化に続く下流の事象は、免疫細胞機能の、活性化ではなく阻害を導く。報告によれば、ＦｃγＲＩＩＢが欠損したマウスは、野生型マウスと比較して、Ｂ細胞抗体応答のダウンレギュレーターとしてＦｃγＲＩＩＢの役割を支持する観察である、抗体応答の増加を示す（Takaiら（１９９６年） Augmented humoral and anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature ３７９巻：３４６〜３４９頁）。
【００７３】
ヒトでは、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢは、古典的な低親和性ＦｃγＲ遺伝子と考えられ、同じ染色体上にともに位置する（Suら（２００２年） Genomic organization of classical human low-affinity Fcγ receptor genes, Genes and Immunity ３巻（補足１）：Ｓ５１〜Ｓ５６頁）。これらの遺伝子は、別個の表現型、たとえば、受容体のリガンド結合および機能の改変と関連するいくつかの多型を示す。いくつかの多型は、自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および多発性硬化症（ＭＳ）と関連する。様々なヒトＦｃγＲ（ｈＦｃγＲ）についてのトランスジェニックマウスが開発されており、高親和性抗体を生成し、特異的細胞応答を誘発する能力について治療用抗体を試験し、異常な免疫応答を回復させる化合物をスクリーニングするなどの疾患モデルとして使用されている（たとえばHeijnenら（１９９６年）A Human FcgRI/CD64 Transgenic Model for In Vivo Analysis of (Bispecific) Antibody Therapeutics, J. Hematother. ４巻：３５１〜３５６頁；Heijnenおよびvan de Winkel（１９９６年）Antigen Targeting to Myeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced Antibody Responses in Transgenic, J. Clin. Invest. ９７巻（２号）：３３１〜３３８頁；米国特許第６，１１１，１６６号、第６，６７６，９２７号、第７，３５１，８７５号、第７，４０２，７２８号、ならびに第７，４１６，７２６号を参照されたい）。
【００７４】
免疫系の抗体およびアクセサリー細胞の間のブリッジを提供する際のＦｃＲの重要な役割にもかかわらず、すべての低親和性ｈＦｃγＲが発現されるモデル系は、現在、存在しない。すべての低親和性ｈＦｃγＲが同時発現されるマウスは、内因性マウスＦｃγＲを欠くマウスを含めて、様々な実施形態において、ＡＤＣＣ媒介性の効果を含むヒト抗体治療薬の効果を正確に反映するために使用することができる。そのようなマウスは、ヒトにおいて、特に、ヒト抗体治療薬の試験との関連において、免疫学的プロセスのより正確な評価を達成することができる動物モデルを提供することによって、たとえばＲＡ、Ｉ型糖尿病、ＳＬＥ、および自己免疫病などのようなヒト疾患の治療のために、治療用抗体のエンジニアリング、分析、および評価において、重大なツールとして果たすであろう。マウスはまた、低親和性受容体に結合する治療薬について、治療薬依存性の細胞殺傷を評価するために、したがって、有用なヒト治療薬を同定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用することができる、低親和性受容体を有する細胞の有益な供給源となるであろう。
【００７５】
内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウス
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しないが、内因性マウスＦｃＲ γ鎖を発現する遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、ＦｃＲ γ鎖は、野生型マウスと同じまたは実質的に同じであるマウスにおける分布（つまり細胞型において）およびレベルで発現される。内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子は、免疫細胞の表面上にまたは動物の末梢において可溶性で発現することができる。内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しない非ヒト動物を作製するための遺伝子改変は、例証としてマウスを使用することによって好都合に説明される。本発明による遺伝子改変されたマウスは、様々な方法において作製することができ、これらの特定の実施形態は、本明細書において議論される。
【００７６】
内因性の遺伝子座でのＦｃγＲ遺伝子配置を示すために、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座の略図（正確な縮尺ではない）を図１（上）中に提供する。示されるように、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩは、１つの染色体上にすぐ近くにともに存在する。これらの遺伝子のそれぞれは、抗体分子のＦｃ部分への結合を担うα鎖またはリガンド結合ドメインを含む。
【００７７】
内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子のα鎖をコードするヌクレオチド配列を欠く遺伝子改変されたマウスは、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子を用いて低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子を欠失させるターゲッティングベクターを作製することができる。図１は、内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座の上流の配列を含有する５’相同性アーム、それに続く薬剤選択カセット（たとえばｌｏｘＰ配列に挟まれたネオマイシン抵抗性遺伝子）、および内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座の下流の配列を含有する３’相同性アームを有する標的構築物によってターゲッティングされたマウスゲノム（下）を示す。この遺伝子座での相同組換えに際して、内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座は、薬剤選択カセットによって置き換えられる（図１の下）。内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の遺伝子座は、それによって欠失させられ、内因性低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子を発現しない細胞または非ヒト動物がもたらされる。薬剤選択カセットは、レコンビナーゼ（たとえばＣｒｅ処理によって）の続く追加によって任意選択で除去されてもよい。
【００７８】
内因性低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子（複数可）を非機能性にするためのマウスの遺伝子改変は、様々な実施形態において、免疫応答において欠損を示すマウスをもたらし、正常および病気の免疫機能、ＩｇＧ媒介性のプロセス、ならびに自己免疫疾患における、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の協同的なならびに個々の役割を評価するのに有用なマウスを作製する。様々な実施形態では、ＦｃＲ γ鎖ではなく、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子のα鎖の改変は、表面発現および機能にＦｃＲ γ鎖を必要とする他の内因性ＦｃＲ遺伝子（たとえば高親和性ＦｃγＲＩ）の潜在的な低下を回避し、したがって、γ鎖依存性のプロセスを通して媒介される様々な他の免疫学的機能およびプロセスを維持する。
【００７９】
いくつかの報告によれば、ＦｃＲ γ鎖欠損マウスは、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩの表面発現を欠く。しかしながら、ＦｃγＲＩは、報告によれば、ＦｃＲ γ鎖欠損マウスにおいて細胞表面上に検出されており、報告によれば、部分的に機能的である。対照的に、本発明によるマウスは、非改変内因性ＦｃＲ γ鎖を含有し、これは、ＦｃＲ γ鎖を必要とする他のＦｃＲ遺伝子の天然細胞表面発現パターンおよび細胞機能を維持する。
【００８０】
様々な実施形態では、本発明のマウスは、それらが有する遺伝子改変が、低親和性ＦｃγＲ遺伝子に全体的に充てられるのではなく、他の免疫学的機能に必要な他の遺伝子の維持をもたらすという点で、他のＦｃγＲ遺伝子欠損マウスに対して利点を示す。たとえば、機能的ＦｃＲ γ鎖があれば、他のγ鎖依存性のタンパク質（たとえばＦｃγＲＩ）は、このＦｃＲ γ鎖と会合することができ、免疫応答におけるエフェクター細胞機能に参加するであろう。本発明に従う様々な遺伝子改変されたマウスでは、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子（１つまたは複数のαサブユニット）を欠失させながらの、そのような機能の維持（機能的ＦｃＲ γ鎖の存在による）は、自己免疫病におけるＦｃＲの役割のより正確な解明を可能にすると考えられる。
【００８１】
低親和性ＦｃγＲヒト化マウス
低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子は、動物の免疫系のアクセサリー細胞の表面上にまたは動物の末梢において可溶性で発現することができる。
【００８２】
遺伝子改変は、様々な実施形態において、１つまたは複数の低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の機能的α鎖の欠失を含み、いくつかの実施形態において、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、または５つの低親和性ヒトＦｃγＲ αサブユニット遺伝子による置き換えを含むさらなる改変を含み、非ヒト動物は、機能的マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を発現する。非ヒト動物、非ヒト胚、および細胞を作製するための遺伝子改変された非ヒト胚、細胞、および標的構築物もまた、提供される。
【００８３】
特異的多型形態または対立遺伝子変異体（たとえば単一アミノ酸差異）を含むヒトＦｃγＲ遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法が提供され、ヒトプロモーターおよびヒト調節配列からそのような遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法を含む。方法は、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を選択的に非機能性にするステップ（たとえばそのα鎖の欠失によって）およびマウスにおいて、低親和性ヒトＦｃγＲ αサブユニット遺伝子を発現させるために、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座に低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子のα鎖を用いるステップを含む。低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の欠失は、ＦｃＲ γ鎖遺伝子ではなく、１つまたは複数のα鎖遺伝子の欠失によって成される。このアプローチは、機能的内因性ＦｃＲ γ鎖遺伝子を保持しながら、１つまたは複数の内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖を選択的に非機能性にする。
【００８４】
内因性ＦｃγＲ α鎖置き換えアプローチは、ＦｃγＲ α鎖のゲノム配列が単一の断片によって置き換えられ、そのため、必要な調節配列を含むことによって正常な機能性を保持するので、様々な実施形態において、動物における天然ＦｃγＲ媒介性のシグナル伝達の比較的最小限の破壊を用いる。したがって、そのような実施形態では、ＦｃγＲ α鎖改変は、機能的ＦｃＲ γ鎖分子に依存する他の内因性ＦｃＲに影響しない。さらに、様々な実施形態では、改変は、細胞表面上の、いくつかのＦｃγＲ α鎖の適切な発現におよび活性化された受容体から結果として生じる下流のシグナル伝達に必要とされると考えられるＦｃγＲ α鎖および内因性ＦｃＲ γ鎖を含む機能的受容体複合体の構築に影響しない。ＦｃＲ γ鎖が欠失していないので、様々な実施形態では、内因性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の、ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含有する動物は、アクセサリー細胞の表面上に存在するヒトＦｃγＲ α鎖へのＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分の結合を通しての、抗体からの正常なエフェクター機能を処理することができるはずである。
【００８５】
欠失させた内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の略図（正確な縮尺ではない）を、図４（上）中に提供する。示されるように、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡは、ヒト低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含有するゲノム断片を有する標的構築物（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡターゲッティングベクター）によって、欠失させた内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座内に挿入される。これらの遺伝子のそれぞれは、抗体分子のＦｃ部分への結合を担う、ヒトＦｃγＲ遺伝子のα鎖またはリガンド結合ドメインを含む。
【００８６】
内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座で低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する遺伝子改変されたマウスは、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子と共に低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（たとえばＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）を導入するターゲッティングベクターを作製することができる。図４は、内因性低親和性ＦｃγＲの遺伝子座の欠失を含むマウスゲノムを示す（上）。示されるように、標的構築物は、内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座の上流の配列を含有する５’相同性アーム、それに続く薬剤選択カセット（たとえば、ｌｏｘＰ配列に両側で挟まれたヒグロマイシン抵抗性遺伝子）、ヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子、ヒトＨＳＰ７６遺伝子、およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含有するゲノム断片、ならびに内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座の下流の配列を含有する３’相同性アームを含有する。欠失させた遺伝子座での相同組換えに際して、薬剤選択カセットは、ターゲッティングベクター中に含有される配列によって置き換えられる（図４の下）。したがって、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座は、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子によって置き換えられ、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する細胞または動物がもたらされる。薬剤選択カセットは、レコンビナーゼ（たとえばＣｒｅ処理によって）の続く追加によって任意選択で除去されてもよい。
【００８７】
血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現については、標的構築物であるヒトｈＦｃγＲＩＩＡ−ＩＩＡターゲッティングベクターは、たとえば、ヒトゲノムにおいてｈＦｃｇＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結されたすべてまたは実質的にすべてのヒトプロモーター領域を含む伸長配列を含む。血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現を防止するために、標的構築物は、ヒトにおいてｈＦｃγＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結された、すべてまたは実質的にすべてのヒトプロモーター領域を欠く。
【００８８】
キメラの遺伝子座へのさらなる改変（図４の下）は、２つのヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えについて記載される類似する技術を使用して達成することができる。内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座を２つのヒトＦｃγＲ遺伝子によって置き換えるための改変は、他の低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子の組み込みのための出発点をさらに提供することができる。たとえば、２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子によって置き換える内因性低親和性ＦｃγＲの遺伝子座の略図（正確な縮尺ではない）を、図６（上）において提供する。示されるように、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子を含有するゲノム断片を有する他の標的構築物（ヒトＦｃγＲＩＩＢ−ＩＩＩＢ−ＩＩＣターゲッティングベクター）によって、改変内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座内に挿入される。これらの遺伝子のそれぞれは、抗体分子のＦｃ部分への結合を担う、ヒトＦｃγＲ遺伝子のα鎖またはリガンド結合ドメインを含む。
【００８９】
内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座に５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する遺伝子改変されたマウスは、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子と共に低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（たとえばＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ）を導入するターゲッティングベクターを作製することができる。図６は、内因性低親和性ＦｃγＲの遺伝子座の２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含むマウスゲノムを示す（上）。示されるように、標的構築物は、内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座の上流の配列を含有する５’相同性アーム、それに続く薬剤選択カセット（たとえば、ｌｏｘＰ配列に両側で挟まれたネオマイシン抵抗性遺伝子）、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ヒトＨＳＰ７７遺伝子、ヒトＦｃγＲＩＩＣ遺伝子を含有するゲノム断片、それに続く内因性の遺伝子座に存在する低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の上流の配列を含有する３’相同性アームを含有する。改変の遺伝子座での相同組換えに際して、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ遺伝子は、ターゲッティングベクター中に含有される配列によって、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座に先に存在するヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡ遺伝子の５’に挿入される（図６の下）。したがって、改変内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座は、３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を組み込むためにさらに改変され、５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する細胞または動物がもたらされる。薬剤選択カセットは、レコンビナーゼ（たとえばＣｒｅ処理によって）の続く追加によって任意選択で除去されてもよい。図６（下）は、結果として生じる遺伝子座の構造を示し、これは、動物の免疫系のアクセサリー細胞の表面上に検出することができる５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現し、適切に、内因性ＦｃＲ γ鎖と独立して会合するであろう。
【００９０】
ＦｃγＲ欠損マウスおよびＦｃγＲヒト化マウスの実験モデル
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しない遺伝子改変された非ヒト動物は、たとえば、免疫応答における個々の低親和性ＦｃγＲ遺伝子の様々な機能を解明するのに、細胞性免疫（たとえばＡＤＣＣ）を介してのヒト治療用抗体の効能を測定するのに、免疫疾患または障害におけるＦｃγＲの役割を決定するのに、免疫疾患または障害のモデルとして果たすのに、１つまたは複数のＦｃγＲタンパク質に対する抗体を生成するのに、および対象の他の遺伝子改変されたマウスを生成するために交配仲間として果たすのに有用である。
【００９１】
一実施形態では、本発明によるマウスは、そのようなマウスに作用物質を投与することによって、低親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現しないマウスによって、失われた細胞傷害性効果（野生型マウスと比較して）を決定するために使用することができ、作用物質は、野生型マウスにおいてＦｃγＲ依存性の細胞傷害性効果を引き起こすことが公知である。一実施形態では、本発明のマウスに腫瘍細胞が移植され、続く期間の後に、腫瘍細胞の表面上に発現される抗原に特異的な抗体が注射される。抗体のアイソタイプは、注射前に既知であり、動物は、野生型動物において観察されるＡＤＣＣとの比較によってＦｃγＲ依存性のＡＤＣＣの機能障害について分析される。
【００９２】
他の態様では、内因性低親和性受容体が欠損したマウスは、自己免疫疾患のｉｎ ｖｉｖｏモデルを開発するために、他の免疫欠損マウスと組み合わせることができる（たとえば交配によって）。たとえば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスは、免疫系を研究するためのモデル生物として当技術分野においてルーチン的に使用される。ＳＣＩＤマウスは、ＴもしくはＢリンパ球を作るまたは補体系のいくつかの成分を活性化する能力が損なわれており、効率的に感染と戦うことができず、腫瘍を拒絶することができず、移植を拒絶することができない。本発明の低親和性ＦｃγＲ αサブユニット遺伝子欠損マウスは、抗体治療薬（たとえば抗腫瘍抗体）の投与に応じて、宿主動物における細胞の枯渇を確認するためにＳＣＩＤマウスに交配されてもよく、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞の枯渇におけるＡＤＣＣおよび補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）の役割が決定されるであろう。
【００９３】
他の態様では、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含む遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。そのような動物は、完全ヒト抗体およびｈＦｃγＲ媒介性のＡＤＣＣの薬物動態を研究するのに有用である。さらに、ヒトＦｃγＲ遺伝子は、疾患（たとえばＳＬＥ、ＲＡ、ウェゲナー肉芽腫症、ギラン−バレー症候群、および多発性硬化症）と関連する多型または対立遺伝子変異体を示すことが示された。したがって、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、ヒトＦｃγＲ遺伝子の特異的対立遺伝子形態または多型形態による置き換えを含む遺伝子改変された非ヒト動物は、動物において、ヒト自己免疫疾患および多型と関連する形質を研究するために使用することができる。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲ遺伝子の対立形質は、ヒトＩｇＧに対する効能の増強と関連する。
【００９４】
他の特定の実施形態では、ヒト抗体治療薬の効能に対するヒト低親和性ＦｃγＲ多型の影響が、決定される。特定の実施形態では、抗腫瘍抗体は、ヒトＦｃγＲの第１の多型を含む第１のヒト化マウスに投与され、また、ヒトＦｃγＲの第２の多型を含む第２のヒト化マウスにも投与され、第１および第２のマウスはそれぞれ、ヒト腫瘍細胞を含み、抗腫瘍抗体の抗腫瘍活性は、第１のマウスおよび第２のマウスにおいて評価される。特定の実施形態では、治療オプションは、第１のマウスおよび第２のマウスにおける抗腫瘍抗体の効能の評価に基づいて、ヒト腫瘍細胞に対応する腫瘍を有する第１のまたは第２の多型を有するヒトの治療に関して医師によって選択される。
【００９５】
ヒトＦｃγＲ遺伝子の適した多型は、当技術分野において公知のすべてのものを含む。ヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子については、多型は、たとえば、Ｔ細胞がＩｇＧに応じて増殖する能力によって報告される高応答動物表現型および低応答動物表現型を含む。高応答動物多型は、１３１位のアルギニン残基（１３１Ａｒｇ）によって特徴付けられるが、低応答動物は、１３１位のヒスチジン残基（１３１Ｈｉｓ）によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ配列は、１３１Ｈｉｓ多型を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖の代表的なタンパク質配列は、配列番号３２において示される。
【００９６】
ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の単一ヌクレオチド置換は、リガンド結合ドメイン（α鎖）においてミスセンス置換をもたらし、推定上、ＩｇＧのＦｃ部分が、細胞表面上のＦｃγＲＩＩＢのα鎖に結合する結合能力に影響する。たとえば、マウスにおけるＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の膜貫通ドメイン内の２３２位のイソロイシンのトレオニン残基の置換（Ｉｌｅ２３２Ｔｈｒ）は、受容体のシグナル伝達能力を損なうことが示された。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、イソロイシン変異体（２３２Ｉｌｅ）を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖の代表的なタンパク質配列は、配列番号３３において示される。
【００９７】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の対立遺伝子変異体は、ＳＬＥおよびＲＡに対する感受性に関与することが提唱されている。この対立遺伝子変異体は、１５８位のバリンのフェニルアラニン置換（Ｖａｌ１５８Ｐｈｅ）を含む。バリン対立遺伝子変異体（１５８Ｖａｌ）は、フェニルアラニン対立遺伝子変異体（１５８Ｐｈｅ）よりも、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対してより高度な親和性を有することが特徴付けられている。１５８Ｐｈｅ対立遺伝子変異体は、免疫複合体の排除の低下を導くことが提唱された。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子は、１５８Ｖａｌ対立遺伝子変異体を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖の代表的なタンパク質配列鎖は、配列番号３５において示される。
【００９８】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子の対立遺伝子変異体は、好中球抗原１（ＮＡ１）および好中球抗原２（ＮＡ２）対立遺伝子を含む。これらの対立遺伝子変異体は、輸血副作用、自己免疫好中球減少症、ＳＬＥ、およびウェゲナー肉芽腫症に関与することが提唱された。ＮＡ２対立遺伝子変異体は、食作用を媒介する能力の減少によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子は、ＮＡ２対立遺伝子変異体を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖の代表的なタンパク質配列は、配列番号３６において示される。
【００９９】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物は、治療用抗体のＦｃ部分によって引き起こされる、ＦｃγＲ媒介性の機能を最適化するのに有用である。抗体のＦｃ領域は、当技術分野において公知の任意の方法によって改変することができる。たとえば、Ｆｃ部分（たとえばＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）内のアミノ酸残基は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合親和性を選択的に増強するために改変されてもよい。したがって、結果として生じる抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ依存性のＡＤＣＣの増強を有するはずである。特定の実施形態では、本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する動物は、改変ヒト抗体を動物に投与し、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現細胞に結合する抗体を検出し（たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて）、観察されたＡＤＣＣ活性を、野生型動物において決定されたものから観察されたＡＤＣＣ活性と比較することによって、改変ヒト抗体のＡＤＣＣ能力の増強を評価するために使用される。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスの生成
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の欠失を導入するための標的構築物（下記に記載）を構築した（図１）。
【０１０１】
標的構築物は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−３９５ｆ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製した（たとえば米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. ２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。ＲＰ２３−３９５ｆ６ ＢＡＣ ＤＮＡは、ＦｃγＲのそれぞれのα鎖を含む内因性低親和性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子を欠失させるために改変した。
【０１０２】
手短かに言えば、上流および下流の相同性アームは、それぞれ
【０１０３】
【化１】
【０１０４】
を用いて作製した。これらの相同性アームは、内因性低親和性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子のα鎖を欠失したカセットを作製するために使用した。標的構築物は、内因性の座に関しての５’および３’領域に対して相同な配列を含む相同性アームを含むｌｏｘネオマイシン抵抗性遺伝子を含んだ。内因性ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の上流のおよび内因性ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子の下流の遺伝子および／または配列（図１を参照されたい）は、標的構築物によって改変しなかった。
【０１０５】
標的欠失は、欠失させた領域の外側のおよび標的構築物内のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。欠失させた座の上流領域は、
【０１０６】
【化２】
【０１０７】
を使用し、ＰＣＲによって確認し、欠失させた座の下流領域は、
【０１０８】
【化３】
【０１０９】
を使用して確認した。上流の欠失ポイントの両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、これは、欠失ポイントに存在するカセット配列に隣接して連結されたＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の下流の内因性マウス配列（下記の括弧内に含有される）を示す：
【０１１０】
【化４】
【０１１１】
下流の欠失ポイントの両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、これは、ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子の上流の内因性マウス配列（下記の括弧内に含有される）と隣接しているカセット配列を示す：
【０１１２】
【化５】
【０１１３】
ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶが欠損したマウスは、マウスＥＳ細胞への標的ＢＡＣ ＤＮＡ（上記に記載）のエレクトロポレーションを通して生成した。ポジティブＥＳ細胞クローンは、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認する。次いで、ポジティブＥＳ細胞クローンをメスマウスに移植するために使用し、低親和性ＦｃγＲ遺伝子が欠損した同腹子の子を生じさせた。
【０１１４】
（実施例２）
低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスの特徴付け
脾臓を、ＦｃγＲ欠損マウスおよび野生型マウスから採取し、無菌の使い捨てのバッグ中で１０ｍＬコラゲナーゼＤを用いて灌流した。次いで、ただ１つの脾臓を含有するそれぞれのバッグを、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）（Ｓｅｗａｒｄ）の中に配置し、３０秒間、中程度の設定でホモジナイズした。ホモジナイズした脾臓は、１０ｃｍペトリ皿に移し、３７℃で２５分間インキュベートした。細胞は、０．５Ｍ ＥＤＴＡの１：５０希釈液を使用して、ピペットを用いて分離し、３７℃で５分間、さらにインキュベーションを続けた。次いで、細胞は、遠心分離機（１０分間、１０００ｒｐｍ）を用いてペレットにし、赤血球は、３分間、４ｍＬ ＡＣＫバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解した。脾細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）を用いて希釈し、再び遠心分離した。ペレットにした細胞は、１０ｍＬ ＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁し、０．２μｍ細胞ストレーナーを用いてろ過した。
【０１１５】
フローサイトメトリー。リンパ球集団は、以下の蛍光色素コンジュゲート細胞表面マーカーを用いてＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣによって同定した：抗ＣＤ１９（Ｂ細胞）、抗ＣＤ３（Ｔ細胞）、抗ＮＫｐ４６（ＮＫ細胞）、および抗Ｆ４／８０（マクロファージ）。リンパ球は、特定の細胞系列についてゲーティングされ、ラット抗マウスＦｃγＲＩＩＩ／ＩＩ抗体（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、内因性ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩＢの発現について分析した。クローン２．４Ｇ２は、マウスＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩの細胞外ドメイン上の共通の多型エピトープを認識する。結果は、検出可能なマウス低親和性ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩが、ｍＦｃγＲ ＫＯマウスにおけるＢ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージ上になかったことを示す（図２）。
【０１１６】
ＡＤＣＣアッセイ。ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスから単離した脾細胞は、細胞殺傷アッセイにおいて、ＡＤＣＣを実行するそれらの能力について分析した。細胞集団は、単離し、ＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分離した。手短かに言えば、Ｔ細胞は、磁気標識抗マウスＣＤ３ビーズを使用して、脾細胞から枯渇させた。次いで、Ｔ細胞を枯渇させた脾細胞は、磁気標識抗マウスＣＤ４９Ｂビーズを使用して、ＮＫ細胞について濃縮した。これとは別に、ラージ細胞（ヒトＣＤ２０を発現する）は、４℃で、３０分間、様々な濃度（０．１〜１０μｇ／ｍＬの範囲）のマウス抗ヒトＣＤ２０抗体（クローンＢ１；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて被覆した。抗体被覆ラージ細胞は、３７℃で４時間、１００：１および５０：１の比（ＮＫ：ラージ）で、濃縮したＮＫ細胞と共にインキュベートした。細胞死は、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。発光シグナルは、溶解した細胞に由来し、死細胞の数に比例する。対照（抗ＣＤ２０抗体なし）からの発光を、それぞれの比についてのバックグラウンド死細胞数について決定し、野生型マウスおよびＫＯマウスについての測定値から引いた。平均細胞死を計算し、細胞殺傷の減少パーセント（ＡＤＣＣ％）を、野生型に対する比較によって決定した。結果を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
（実施例３）
低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスにおけるＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇
ＡＤＣＣ経路を通してのＢ細胞枯渇に対するヒトまたはマウスＦｃアイソタイプの効果は、ヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を使用して、ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子操作した低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスにおける様々なＢ細胞コンパートメントについて決定した。ヒトＣＤ２０を発現するマウスは、当技術分野において公知の技術を使用して、これとは別に遺伝子操作した。Ｂ細胞上にヒトＣＤ２０を発現し、低親和性ＦｃγＲ遺伝子が欠損した（実施例１において記載）マウスは、２つの遺伝子操作株の標準的な交配技術によって作製した。
【０１１９】
ヒトＣＤ２０を発現し、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を有したマウスの別々のグループに、それぞれ、以下のうちの１つを投与した：（１）１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｎ＝４；マウスＩｇＧ２ａを有する、ヒトＣＤ２０に特異的でないヒト抗体）；（２）２ｍｇ／ｋｇ Ａｂ １６８（Ｎ＝３；マウスＩｇＧ２ａを有するヒト抗ｈＣＤ２０抗体；米国特許出願公開第２００９／００３５３２２号の、それぞれ配列番号３３９および３４７において見つけられる重配可変領域配列および軽鎖可変領域配列）；（３）１０ｍｇ／ｋｇ Ａｂ １６８；（４）２ｍｇ／ｋｇ Ａｂ ７３５（Ｎ＝３；ヒトＩｇＧ１を有するＡｂ １６８）；（５）１０ｍｇ／ｋｇ Ａｂ ７３５。実験の類似するセットにおいて、ヒトＣＤ２０を発現し、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の欠失を有したグループのマウスに、対照抗体およびヒト抗ｈＣＤ２０抗体（上記に記載）を投与した。
【０１２０】
それぞれのグループにおけるマウスに、腹腔内注射によって抗体を投与した。注射の７日後に、動物を安楽死させ、骨髄（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋）、末梢血（Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋）、リンパ節（Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋）、および脾臓（Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋）の残りのＢ細胞含有率を、ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーターで実行したマルチカラーＦＡＣＳによって同定し、Ｆｌｏｗ−Ｊｏソフトウェアを使用して分析した（上記に記載）。Ｂ細胞枯渇実験の結果を、図３Ａ〜３Ｄに示す。
【０１２１】
図３Ａ〜３Ｄに示されるように、Ａｂ ７３５は、低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を含有するマウスにおいてＡｂ １６８よりも低い効率でＢ細胞を枯渇させた。さらに、両方の抗体（マウスおよびヒトＦｃ）について、Ｂ細胞の枯渇は、低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を欠くマウスにおいて有意に低下した。本実施例は、ＡＤＣＣ経路を通してＢ細胞を枯渇させる能力が、低親和性ＦｃγＲを必要とすることを示し、マウスにおける、ヒト定常領域を含有する抗体についてのＡＤＣＣ効率の測定が、ヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を含有する、遺伝子的に操作されたマウスの使用によってより適したものとなることを実証する。
【０１２２】
（実施例４）
ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡヒト化マウスの生成
欠失させた内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座（下記に記載）の中に２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を導入するための標的構築物を構築した（図４）。
【０１２３】
ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含む標的構築物は、ＢＡＣ ＲＰ２３−３９５ｆ６およびＣＴＤ−２５１４ｊ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変を通して、類似する方法（実施例１を参照されたい）を使用して作製した。両方のＢＡＣのＢＡＣ ＤＮＡは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖の欠失を、欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の中に導入するために改変した。
【０１２４】
同様に、上流および下流の相同性アームは、それぞれ
【０１２５】
【化６】
【０１２６】
を用いて作製した。これらの相同性アームは、内因性マウス低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の中に低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖を導入するカセットを作製するために使用した。標的構築物は、欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座に対して５’の配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴヒグロマイシン抵抗性遺伝子、それに続く、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子を含む、ＢＡＣ ＣＴＤ−２５１４ｊ１２由来のヒトゲノム断片、ならびに欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座に対して３’のマウス配列を含む３’相同性アームを含む（図４の中央）。マウス血小板上にＦｃγＲＩＩＡを発現するマウスについては、標的構築物は、ｌｏｘ２３７２部位が両側の側面に位置するヒグロマイシンカセットを使用して、構築物が、たとえば約１８ｋｂまたはそれ以上までの、ヒトゲノムにおいてヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結される伸長プロモーター配列を含むという点を除いて、類似する方法で作製し（同じＢＡＣを使用して）、プロモーター領域と第１のｌｏｘ２３７２部位との接合部は、
【０１２７】
【化７】
【０１２８】
であり、第２のｌｏｘ２３７２部位とマウス配列との接合部は、
【０１２９】
【化８】
【０１３０】
である。適したプライマーは、プロモーター領域を含むヒト化の遺伝子型を同定するために使用した。
【０１３１】
ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子の標的挿入は、ＰＣＲによって確認した（上記に記載）。部分的にヒト化した座の上流領域は、
【０１３２】
【化９】
【０１３３】
を使用して、ＰＣＲによって確認したのに対して、部分的にヒト化した座の下流領域は、
【０１３４】
【化１０】
【０１３５】
を使用して、確認した。下流の接合部の両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、これは、欠失させた低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の３’の内因性マウス配列と隣接するｈＦｃγＲＩＩＡ遺伝子の上流の内因性ヒト配列の新規な挿入ポイントを示す（下記の括弧内に含有される）：
【０１３６】
【化１１】
【０１３７】
上流の接合部は、２つの新規な配列を含む。上流の接合部の一方のポイントは、以下を含み、これは、挿入されたｈＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の上流領域を含むヒトゲノム配列（下記の括弧内に含有される）と隣接するヒグロマイシンカセットのヌクレオチド配列を示す：
【０１３８】
【化１２】
【０１３９】
上流の接合部の第２のポイントは、以下を含み、これは、ヒグロマイシンカセット内のヌクレオチド配列と隣接する、欠失させた低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の上流領域由来の内因性マウス配列のヌクレオチド配列を示す（下記の括弧内に含有される）：
【０１４０】
【化１３】
【０１４１】
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の代わりに２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（伸長プロモーター領域を欠くｈＦｃγＲＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＩＡ）を含有するマウスは、マウスＥＳ細胞への標的ＢＡＣ ＤＮＡ（上記に記載）のエレクトロポレーションを通して生成した。ポジティブＥＳ細胞クローンは、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。次いで、ポジティブＥＳ細胞クローンは、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（下記に記載）を使用してメスマウスに移植するために使用し、２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子との内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の置き換えを含有する同腹子の子を生成した。
【０１４２】
上記に記載される標的ＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階のマウス胚の中に導入した（たとえば米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい。ｈＦｃγＲＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩｌＡを有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、ｈＦｃγＲ遺伝子の存在を検出した対立遺伝子アッセイの改良法を使用して遺伝子型を同定することによって同定した（Valenzuelaら、前掲）。
【０１４３】
ｈＦｃγＲ遺伝子を有するマウスは、たとえばＥＳ細胞段階でまたは胚中で除去されていない、標的構築物によって導入された、あらゆるｌｏｘ ｎｅｏカセットを除去するために、Ｃｒｅ ｄｅｌｅｔｅｒマウス株に交配することができる（たとえば、国際特許出願公開ＷＯ ２００９／１１４４００を参照されたい）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウス中に保持される。
【０１４４】
子は、遺伝子型を同定し、ｈＦｃγＲ遺伝子についてヘテロ接合性の子は、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡのヒト化を特徴付けるために選択する。
【０１４５】
（実施例５）
ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡヒト化マウスの特徴付け
脾臓は、ヒト化ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ（伸長ＦｃγＲＩＩＡプロモーター領域を欠くヘテロ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。
【０１４６】
フローサイトメトリー。リンパ球は、特定の細胞系列についてゲーティングされ、それぞれ、マウス抗ヒトＦｃγＲＩＩ抗体（クローンＦＬＩ８．２６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウス抗ヒトＦｃγＲＩＩＩ抗体（クローン３Ｇ８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｈＦｃγＲＩＩおよびｈＦｃγＲＩＩＩの発現について分析した。それぞれのリンパ球亜集団について観察された相対的な発現（＋＋、＋）または発現なし（−）を、表２に示す。
【０１４７】
【表２】
【０１４８】
類似する実験において、脾臓は、ヒト化ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ（伸長ＦｃγＲＩＩＡプロモーター領域を欠くホモ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡホモ接合体マウスにおいてヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、またはその両方を発現する別々のリンパ球集団のパーセントを、表３に示す。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
本実施例において示されるように、実施例３に従って生成した遺伝子改変されたマウス（ヘテロ接合体およびホモ接合体遺伝子型の両方）は、ＮＫ細胞およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、血小板ではなく好中球およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＡを発現した。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞上に高度に発現された。本実施例において示されるヒトＦｃγＲ遺伝子の発現パターンは、ヒトアクセサリー細胞におけるこれらの遺伝子の発現パターンと一致している。
【０１５１】
（実施例６）
低親和性ＦｃγＲヒト化マウスの生成
部分的にヒト化された内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座（下記に記載）の中に３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を導入するために標的構築物を構築した（図６）。
【０１５２】
ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ遺伝子を含む標的構築物は、ＢＡＣ ＲＰ−２３ ３９５ｆ６およびＲＰ−１１ ６９７ｅ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変を通して、類似する方法（実施例１を参照されたい）を使用して作製した。両方のＢＡＣのＢＡＣ ＤＮＡは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ遺伝子のα鎖を、２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子を含有する部分的にヒト化された内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の中に導入するために改変した。
【０１５３】
同様に、上流および下流の相同性アームは、それぞれ、
【０１５４】
【化１４】
【０１５５】
を用いて作製した。これらの相同性アームは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣのα鎖をコードするＤＮＡ配列を導入したカセットを作製するために使用した。標的構築物は、欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座に対して５’のマウス配列を含む５’相同性アーム、ｌｏｘネオマイシン抵抗性遺伝子、それに続く、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ α鎖遺伝子を含む、ＢＡＣ ＲＰ−１１ ６９７ｅ５由来のヒトゲノム断片、ならびに低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子に対して５’のヒト配列を含む３’相同性アームを含んだ（図６の中央）。
【０１５６】
３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子の標的挿入を、ＰＣＲによって確認した（上記に記載）。完全にヒト化した座の上流領域は、
【０１５７】
【化１５】
【０１５８】
を使用して、ＰＣＲによって確認したのに対して、完全にヒト化した座の下流領域は、
【０１５９】
【化１６】
【０１６０】
を使用して確認した。下流の接合部の両端のヌクレオチド配列は、ｈＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子の上流の同じヒトゲノム配列を含んだ（実施例３を参照されたい；配列番号１９）。上流の接合部の両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、挿入ポイントのマウス配列およびカセット配列ならびにカセット配列およびヒトゲノム配列の２つの新規な接合部を示す。ゲノムマウス配列（下記の括弧内に含有される）とｎｅｏカセット配列の上流領域との接合部は、
【０１６１】
【化１７】
【０１６２】
である。第２の新規な接合部は、ｎｅｏカセット（下記の括弧内に含有される）の３’末端とｈＦｃｇＲＩＩＢ α鎖遺伝子の下流のヒトゲノム配列との連結部を含む：
【０１６３】
【化１８】
【０１６４】
これらの接合部は、標的構築物内に、図６（中央）において示す。完全にヒト化した低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の結果として生じる改変ゲノムを、図６（下）に示す。
【０１６５】
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の代わりに５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を含有するマウスは、マウスＥＳ細胞への標的ＢＡＣ ＤＮＡ（上記に記載）のエレクトロポレーションを通して生成した。ポジティブＥＳ細胞クローンは、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。次いで、ポジティブＥＳ細胞クローンをメスマウスに移植するために使用し（上記に記載）、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、５つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含有する同腹子の子を生じさせた。
【０１６６】
（実施例７）
低親和性ＦｃγＲヒト化マウスの特徴付け
脾臓を、完全にヒト化したＦｃγＲ（ヘテロ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。
【０１６７】
フローサイトメトリー。リンパ球は、特定の細胞系列についてゲーティングされ、それぞれ、マウス抗ヒトＦｃγＲＩＩ抗体（クローンＦＬＩ８．２６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウス抗ヒトＦｃγＲＩＩＩ抗体（クローン３Ｇ８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの発現について分析した。それぞれのリンパ球亜集団について観察された相対的な発現（＋＋、＋）または発現なし（−）を、表４に示す。
【０１６８】
【表４】
【０１６９】
類似する実験において、脾臓を、完全にヒト化したＦｃγＲ（ホモ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。結果を図７に示す。完全にヒト化したＦｃγＲホモ接合体マウスにおける、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＣ、またはその組合せを発現する別々のリンパ球集団のパーセントを、表５に示す。
【０１７０】
【表５】
【０１７１】
本実施例において示されるように、実施例５に従って生成した遺伝子改変マウス（ヘテロ接合体およびホモ接合体遺伝子型の両方）は、ＮＫ細胞およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、好中球上にヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、好中球およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＡ、Ｂ細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＢ、ならびにＮＫ細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＣを発現した。本実施例において示されるヒトＦｃγＲ遺伝子の発現パターンは、ヒトアクセサリー細胞におけるこれらの遺伝子の発現パターンと一致している。
【０１７２】
（実施例８）
ヒト化ＦｃγＲマウスにおけるＡＤＣＣ
ＦｃγＲ遺伝子欠損（つまりノックアウト）マウス、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ（ホモ接合体）マウス、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＣ（ホモ接合体）マウス、および野生型マウスから単離した脾細胞を、細胞殺傷アッセイにおいて、ＡＤＣＣを実行するそれらの能力について分析した（実施例２において上記に記載）。
【０１７３】
手短かに言えば、細胞集団は、単離し、ＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分離した。手短かに言えば、Ｔ細胞およびＢ細胞を枯渇させた脾細胞を、マウスＩＬ−２（５００Ｕ／ｍＬ）の存在下において２週間、培養した。結果として生じる増殖させたＮＫ細胞を、５０：１（ＮＫ：ラージ）の比でＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ラージ細胞は、１０μｇ／ｍＬのＡｂ １６８またはＡｂ ７３５を用いて被覆した（実施例３において上記に記載）。結果を表６に示す。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書において記載されるものに加えての本発明の様々な改変は、先の記載および添付の図から当業者らに明白になるであろう。そのような改変は、添付した請求項の範囲内にあるように意図される。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、内因性マウスＦｃγＲ遺伝子を欠く遺伝子改変された非ヒト動物であり、これには、内因性ＦｃγＲ遺伝子の、ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含む遺伝子改変された動物が含まれ、かつ少なくとも２、３、４、または５つの機能的ヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現することができるマウスが含まれ、かつ内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現しない免疫細胞を含む遺伝子改変されたマウスが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、哺乳動物において免疫系の様々な機能を実行する、免疫系の細胞の表面上に見出されるタンパク質である。ＦｃＲは、様々な細胞上に、様々なタイプで存在し、たとえば、感染細胞または侵入している病原体に付いている抗体への結合、抗体媒介性食作用または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって微生物または感染細胞を破壊するために、食作用性細胞または細胞傷害性細胞の刺激などのような、様々な免疫機能を媒介する。
【０００３】
ＡＤＣＣは、それによって、抗体が結合した標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が溶解するプロセスである。このプロセスは、外来抗原または外来細胞に対する事前の曝露に依存し、抗体応答をもたらす。ＡＤＣＣは、それ自体が外来抗原または外来細胞に結合した抗体のＦｃ部分への、エフェクター細胞の表面上に発現されたＦｃＲの結合によって、たとえばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのようなエフェクター細胞を通して媒介することができる。ＦｃＲが免疫応答において果たす中心的な役割のために、複数のヒト低親和性ＦｃＲを同時発現する非ヒト動物を含む、複数のヒトＦｃＲを同時発現する有用な非ヒト動物が必要とされる。ヒト疾患療法、特に、抗腫瘍療法および自己免疫疾患を治療するための療法に関する研究および解明ならびに特に、ヒト抗体医薬品の開発、設計、および試験における医薬開発のための、ヒトＦｃＲ機能およびＡＤＣＣのヒトプロセスの非ヒト動物モデルの必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、非ヒト動物、ならびにそれらを作製し、使用するための方法および組成物が提供される。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒトＦｃγＲ受容体、内因性低親和性ＦｃγＲ受容体の欠失、および／または内因性マウス低親和性ＦｃγＲの遺伝子座での、内因性ＦｃγＲ受容体の、ヒトＦｃγＲ受容体による置き換えを含む。
【０００５】
一態様では、機能的ＦｃＲ γ鎖を含む、遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、および非ヒト動物が提供され、細胞、胚、および動物は、低親和性内因性非ヒトＦｃγＲ遺伝子配列（たとえばＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ）の、１つまたは複数の低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子配列（たとえば、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびその組合せから選択される）による置き換えを含む、さらなる改変を含む。
【０００６】
一実施形態では、細胞、非ヒト胚、および非ヒト動物は、マウスである。一実施形態では、機能的ＦｃＲ γ鎖は、マウスＦｃＲ γ鎖である。一実施形態では、マウスＦｃＲ γ鎖は、マウス、細胞、または胚に対して内因性のＦｃＲ γ鎖である。
【０００７】
一実施形態では、細胞、胚、および動物は、マウスであり、マウスは、ヒト低親和性ＦｃγＲ受容体の機能的α鎖および機能的内因性マウスγ鎖を発現する。
【０００８】
一態様では、遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、ＦｃγＲＩＩＢ α鎖、ＦｃγＲＩＶ α鎖、ＦｃγＲＩＩＩ α鎖、およびその組合せから選択される内因性α鎖を発現せず、マウスは、機能的内因性マウスγ鎖を発現する。
【０００９】
特定の実施形態では、マウスは、機能的ＦｃγＲＩＩＢ α鎖を発現せず、機能的ＦｃγＲＩＶ α鎖を発現せず、かつ機能的ＦｃγＲＩＩＩ α鎖を発現しない。
【００１０】
一実施形態では、マウスゲノムは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ α鎖の欠失、内因性ＦｃγＲＩＶ α鎖の欠失、および内因性ＦｃγＲＩＩＩ α鎖の欠失を含む。
【００１１】
一実施形態では、マウスは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ α鎖の欠失、内因性ＦｃγＲＩＶ α鎖の欠失、および内因性ＦｃγＲＩＩＩ α鎖の欠失を含み、さらに、同じ抗原に関して、野生型マウスの能力と比較して、抗原に対する免疫応答を行う能力が低下している。一実施形態では、免疫応答の低下は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少を含む。一実施形態では、免疫応答の低下は、抗体依存性ＮＫ細胞殺傷を達成するための細胞殺傷アッセイにおける能力の低下を含む。特定の実施形態では、ＡＤＣＣまたは抗体依存性ＮＫ細胞殺傷における低下は、少なくとも５０％であり、一実施形態では少なくとも７５％、一実施形態では少なくとも９０％である。
【００１２】
一実施形態では、マウスは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ α鎖の欠失、内因性ＦｃγＲＩＶ α鎖の欠失、および内因性ＦｃγＲＩＩＩ α鎖の欠失を含み、野生型マウス、たとえば、欠失を含まない同じまたは類似する株のマウスと比較して、抗原を用いる免疫化に際しての体液性抗体応答の増加をさらに含む。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、２倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、３倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、５倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、７倍である。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスと比較して、１０倍である。特定の実施形態では、体液性抗体応答は、マウス由来の血清タンパク質の１マイクログラム当たりの、（マウスが免疫化される）抗原に特異的に結合する抗体のマイクログラムによって測定される。一実施形態では、体液性抗体応答の増加は、野生型マウスが耐性を示す抗原または野生型マウスにおいて弱いもしくは最小限の体液性免疫反応を示す抗原に関してのものである。特定の実施形態では、抗原は、マウス抗原である。特定の実施形態では、抗原は、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のマウスタンパク質との同一性を示すヒト抗原である。
【００１３】
一態様では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスが提供され、置き換えは、内因性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の遺伝子座でのものである。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子から選択される。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、内因性ＦｃＲ γ鎖を発現し、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖である。他の特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、ＮＫ細胞上に、内因性ＦｃＲ γ鎖および機能的ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を発現する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖の機能性は、ヒト抗体媒介性ＮＫ殺傷（たとえばヒト抗体によって媒介されるＡＤＣＣ）によって反映される。
【００１４】
一態様では、遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、または非ヒト動物が提供され、遺伝子改変は、少なくとも１つの内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の、ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含み、細胞、胚、または動物は、機能的ＦｃＲ γ鎖を発現する。一実施形態では、機能的ＦｃＲ γ鎖は、内因性ＦｃＲ γ鎖である。一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子は、多型を含み、多型は、１３１Ｈｉｓ低応答動物多型および１３１Ａｒｇ高応答動物多型から選択される。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＡ多型は、１３１Ｈｉｓ低応答動物多型である。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子は、特異的な対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）であり、対立遺伝子変異体は、１５８Ｖａｌ変異体および１５８Ｐｈｅ変異体から選択される。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＡ対立遺伝子変異体は、１５８Ｖａｌ変異体である。
【００１５】
一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子、およびその組合せから選択される。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、アミノ酸置換を含み、置換は、２３２Ｉｌｅまたは２３２Ｔｈｒ置換から選択される。他の特定の実施形態では、アミノ酸置換は、２３２Ｉｌｅ置換である。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子は、特異的対立遺伝子変異体であり、対立遺伝子変異体は、ＮＡ１変異体およびＮＡ２変異体から選択される。他の特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩＢ対立遺伝子変異体は、ＮＡ２変異体である。
【００１６】
一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。
【００１７】
一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子は、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子は、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子は、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。特定の実施形態では、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つの低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子によって置き換えられる。他の特定の実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子は、変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子は、１３１Ｈｉｓ変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子は、１５８Ｖａｌ変異体を含む。他の特定の実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、以下の低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子：ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢによって置き換えられる。他の特定の実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子は、変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子は、２３２Ｉｌｅ変異体を含み、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子は、ＮＡ２変異体を含む。
【００１８】
一実施形態では、遺伝子改変は、マウスおよびヒト染色体１のシンテニックゲノム配列の置き換えを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変は、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を含むゲノム断片の、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を含むゲノム断片による置き換えを含む。他の特定の実施形態では、染色体１：１７２，８８９，９８３〜染色体１：１７２，９８９，９１１のマウスゲノムは、ヒト染色体１：１６１，４７４，７２９〜染色体１：１６１，６２０，４５８を含むヒトゲノム断片によって置き換えられる。
【００１９】
一態様では、遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、または非ヒト動物が提供され、遺伝子改変は、１つまたは複数の内因性低親和性受容体α鎖遺伝子のノックアウトおよび１つまたは複数のヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子を含むエピソームの存在を含む。特定の実施形態では、細胞、胚、または動物は、機能的ＦｃＲ γ鎖を発現する。特定の実施形態では、エピソームは、ミニ染色体である。一実施形態では、機能的ＦｃＲ γ鎖は、細胞、胚、または動物に対して内因性である。
【００２０】
一態様では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を含み、マウスは、機能的ヒト低親和性ＦｃγＲ受容体を発現する。一実施形態では、機能的低親和性ＦｃγＲ受容体は、ヒトにおいて低親和性ＦｃγＲ受容体が発現される細胞型上に発現される。特定の実施形態では、機能的ヒト低親和性ＦｃγＲ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩＡであり、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞上に発現される。
【００２１】
一実施形態では、マウスは、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、マウスは、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の欠失を含む。
【００２２】
一実施形態では、マウスは、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。他の実施形態では、マウスは、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。特定の実施形態では、マウスは、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも２つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。他の特定の実施形態では、３つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、３つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。他の特定の実施形態では、マウスは、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子の、少なくとも２つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含む。他の特定の実施形態では、２つのマウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、少なくとも３つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。
【００２３】
一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、ＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。
【００２４】
一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。一実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。
【００２５】
一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ α鎖遺伝子は、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＶ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子は、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。一実施形態では、低親和性マウスＦｃγＲＩＩＢ α鎖遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子は、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子によって置き換えられる。特定の実施形態では、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子、およびその組合せから選択される。他の特定の実施形態では、マウスα鎖遺伝子は、以下のヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子：ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡによって置き換えられる。他の特定の実施形態では、マウスα鎖遺伝子は、以下のヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子：ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢによって置き換えられる。
【００２６】
一態様では、低親和性ヒトＦｃγＲ α鎖およびマウスＦｃＲ γ鎖サブユニットを含む遺伝子改変されたマウスが提供され、マウスは、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、血小板、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲ α鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、好中球、マクロファージ、好酸球、血小板、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖を通して開始または媒介される食作用、ＡＤＣＣ、および細胞性の活性化が可能である。一実施形態では、マウスは、マクロファージ、ＮＫ細胞、単球、肥満細胞、好酸球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、少なくとも１つのＴ細胞型、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、ＮＫ細胞上に発現されるヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を通して媒介されるＡＤＣＣが可能である。特定の実施形態では、マウスは、ヒトＦｃを含む抗体に応じて、ｈＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性のＡＤＣＣを示す。
【００２７】
一実施形態では、マウスは、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖の両方を発現する。一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖は、血小板上に発現され、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖は、ＮＫ細胞上に発現される。一実施形態では、マウスは、ヒトＦｃを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣが可能であり、媒介は、アクセサリー細胞の表面上に発現されるヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖を通してのまたはヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖を通してのものである。一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖は、血小板上に発現されない。ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖が血小板上に発現されない特定の実施形態では、マウスは、ヒトゲノムにおいてヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖に作動可能に連結されるヒトプロモーター配列を欠くまたは実質的に欠く。
【００２８】
一実施形態では、マウスは、Ｂ細胞、肥満細胞、好塩基球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖を発現する。特定の実施形態では、マウスは、Ｂ細胞および肥満細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖を発現する。他の特定の実施形態では、マウスは、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖を通して媒介される免疫複合体のエンドサイトーシスが可能である。一実施形態では、マウスは、好中球、マクロファージ、好酸球、血小板、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＣ α鎖を発現する。特定の実施形態では、マウスは、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＣ α鎖を通して開始される食作用、ＡＤＣＣ、および細胞の活性化が可能である。
【００２９】
一実施形態では、マウスは、好中球および好酸球上にヒトＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖を発現する。特定の実施形態では、マウスは、細胞の活性化、食作用、ＡＤＣＣ、および脱顆粒が可能であり、活性化、食作用、ＡＤＣＣ、および脱顆粒は、発現されたヒトＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖を通して媒介される。
【００３０】
一態様では、内因性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＩＩＩ遺伝子の欠失ならびにヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子の挿入を含むマウスが提供され、マウスは、機能的マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を含む。
【００３１】
一実施形態では、マウスは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃｒＲＩＩＩ遺伝子によってコードされるα鎖の欠失ならびにヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子によってコードされるα鎖の挿入を含む。
【００３２】
一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子の挿入は、マウスゲノム内のランダムな位置にある。
【００３３】
一実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖遺伝子の挿入は、内因性マウス低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座にある。
【００３４】
一実施形態では、マウスは、ＮＫ細胞およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。特定の実施形態では、マウスの脾細胞試料由来のすべてまたは実質的にすべてのＮＫ細胞は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。特定の実施形態では、マウスの脾細胞試料由来のすべてまたは実質的にすべてのマクロファージは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。
【００３５】
一実施形態では、マウスは、好中球、マクロファージ、およびその組合せから選択される細胞型上に、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、およびその組合せから選択されるヒトＦｃγＲを発現する。特定の実施形態では、マウスは、マウス由来の脾細胞試料のすべてまたは実質的にすべての好中球およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＡおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。
【００３６】
一実施形態では、マウスは、このマウスからのＢ細胞ゲーティングされた脾細胞試料からのＢ細胞のうち、Ｂ細胞および好中球上にヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＢを発現する。特定の実施形態では、マウスは、このマウスからＢ細胞ゲーティングされた脾細胞試料からのすべてまたは実質的にすべてのＢ細胞および好中球上にＦｃγＲＩＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＢを発現する。
【００３７】
一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ２０遺伝子をさらに含む。一実施形態では、ヒト化ＣＤ２０遺伝子をさらに含むマウスは、Ｆｃを含む抗ＣＤ２０結合タンパク質を用いる処理に続いて、Ｂ細胞の枯渇（ｉｎ ｖｉｖｏにおいて）を示す。一実施形態では、枯渇は、骨髄、血液、リンパ節、脾臓、およびその組合せから選択されるコンパートメントにおけるものとする。一実施形態では、Ｆｃは、ヒトＦｃである。一実施形態では、Ｆｃは、マウスＦｃである。一実施形態では、抗ＣＤ２０結合タンパク質は、抗ＣＤ２０抗体である。
【００３８】
一態様では、本明細書において記載される遺伝子改変を含む細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、多能性細胞、誘導多能性細胞、および全能性細胞から選択される。一実施形態では、細胞は、マウス細胞およびラット細胞から選択される。特定の実施形態では、細胞は、ＥＳ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、マウスＥＳ細胞である。
【００３９】
一態様では、本明細書において記載される遺伝子改変を含む非ヒト胚が提供される。一実施形態では、非ヒト胚は、マウス胚およびラット胚から選択される。
【００４０】
一態様では、治療薬の効能を決定するための方法が提供される。一実施形態では、治療薬は、ヒトＦｃを含む抗体（たとえば単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性）である。一実施形態では、治療薬は、ヒト抗体である。一実施形態では、効能は、治療薬媒介性の細胞殺傷（たとえばＡＤＣＣ）の効能である。特定の実施形態では、ヒト治療薬は、ヒト免疫グロブリン重鎖のＦｃを含む融合タンパク質である。一実施形態では、治療薬は、本明細書において記載されるように、マウスに投与され、治療薬依存性のＡＤＣＣのレベルが測定される。一実施形態では、マウスは、治療薬をマウスに投与し、次いで、ＦｃγＲ発現細胞上のヒト低親和性ＦｃγＲへの治療薬の結合を検出することによって（たとえば、動物から採取された試料（たとえば血液）からｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて）、治療薬のＡＤＣＣ活性を評価するために使用される。特定の実施形態では、マウスのアクセサリー細胞は、マウスから単離され、治療薬依存性のＡＤＣＣを媒介するための、治療薬の存在下または非存在下における能力について試験される。
【００４１】
一態様では、低親和性ＦｃγＲがヒト疾患または障害と関連するかどうかを決定するための方法であって、本発明に従って、マウスにおいて、ヒト疾患または障害と関連する形質を決定するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、形質は、１つまたは複数の低親和性ＦｃγＲの機能の不在または損失と関連する表現型である。特定の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。特定の実施形態では、自己免疫疾患または障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、ギラン−バレー症候群、硬化症、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）から選択される。特定の実施形態では、マウスは、低親和性ＦｃγＲにおいて多型を含み、形質は、多型を有しない大多数のヒト集団と比較した、ＡＤＣＣを媒介するための能力の増強および多型を有しない大多数のヒト集団と比較した、ＡＤＣＣを媒介するための能力の低下から選択される。
【００４２】
一態様では、マウスにおいて抗ヒトＦｃＲ α鎖抗体を作製するための方法であって、本明細書において記載されるヒトＦｃＲに対して本発明によるマウスを曝露するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、ヒトＦｃＲを認識する抗体は、マウスから単離される。他の実施形態では、ヒトＦｃＲを認識する抗体の可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列は、同定され、クローニングされる。
【００４３】
一態様では、標的分子の食作用についての、ＦｃＲ発現細胞に対する標的分子に対する抗ヒトＦｃＲ抗体の能力を決定するための方法であって、抗ヒトＦｃＲ抗体を含む作用物質に対して本明細書において記載されるマウスを曝露するステップおよび標的分子の食作用を測定するステップを含む、方法が提供される。
【００４４】
一態様では、１つまたは複数のＦｃγＲに関して野生型であるマウスにおいて低免疫原性の抗原に対して、マウスにおいて抗体を作製するための方法であって、１つまたは複数のＦｃγＲに関して野生型であるマウスにおいて低免疫原性の抗原に対して、マウス低親和性ＦｃＲを欠くが、ＦｃγＲ γ鎖を発現する、本明細書において記載されるマウスを曝露するステップおよび低抗原性の抗原を認識する抗体を同定するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、方法は、マウスから抗体を単離するステップを含む。他の実施形態では、抗体の可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列は、同定され、クローニングされる。
【００４５】
一態様では、ヒト可変領域を含む抗体を作ることができるマウスを作製するための方法であって、本明細書において記載される第１のマウスを、（ａ）１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒト定常領域遺伝子または（ｂ）マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む第２のマウスと交配するステップを含み、ヒト遺伝子セグメントは、マウス可変領域遺伝子セグメントの遺伝子座で可変領域遺伝子セグメントに取って代わる、方法が提供される。
【００４６】
一実施形態では、第２のマウスは、（ａ）１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖定常遺伝子を含む導入遺伝子ならびに１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒト重鎖定常遺伝子を含む導入遺伝子を含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む導入遺伝子は、２つ以上の重鎖定常遺伝子を含み、クラススイッチが可能である。特定の実施形態では、マウスは、不活性化された内因性軽鎖遺伝子座および／または不活性化された内因性重鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、マウスは、内因性軽鎖遺伝子座の欠失および／または内因性重鎖遺伝子座の欠失を含む。
【００４７】
一実施形態では、第２のマウスは、（ｂ）それぞれ、重鎖および軽鎖のマウス遺伝子座に、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。
【００４８】
一態様では、抗腫瘍抗体を選択するための方法であって、ＡＤＣＣを媒介するための抗体の能力を決定するステップを含み、ＡＤＣＣを媒介するための抗体の能力は、本明細書において記載されるマウスの細胞によって媒介されるＡＤＣＣを決定することによって試験され、抗体は、それが本明細書において記載される遺伝子改変されたマウスの細胞を用いるＡＤＣＣを媒介する場合、選択される、方法が提供される。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスの細胞への抗体の結合が決定され、抗腫瘍抗体が、細胞上のヒトＦｃγＲに結合するその能力について選択される。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲは、低親和性ＦｃγＲである。
【００４９】
一実施形態では、抗腫瘍抗体は、野生型マウスの細胞を通してＡＤＣＣを媒介するための抗腫瘍抗体の能力と比較した、マウスの細胞を通してＡＤＣＣを媒介する能力の増強によって同定される。特定の実施形態では、抗腫瘍抗体は、ＮＫ細胞を通してＡＤＣＣを媒介するその能力によって同定される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する。
【００５０】
一実施形態では、抗腫瘍作用物質を選択するための方法であって、ヒトＦｃまたは改変ヒトＦｃを含む作用物質を第１の非ヒト動物に投与するステップであって、第１の非ヒト動物は、本発明に従って遺伝子改変され、ヒト腫瘍を含む、ステップ、腫瘍を含む第２の非ヒト動物に作用物質を投与するステップ、および作用物質の投与に続いて、ヒト腫瘍の成長を遅延させるための、第１の非ヒト動物および第２の非ヒト動物の能力を決定するステップを含み、作用物質は、それが、第２の非ヒト動物においてではなく、第１の非ヒト動物においてヒト腫瘍の成長を遅延させる能力の増強を示す場合、抗腫瘍作用物質として選択される、方法が提供される。
【００５１】
一実施形態では、第１の非ヒト動物は、内因性ＦｃＲ αサブユニットの欠失を含むように改変され、ＦｃγＲＩＩＡ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＢ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＣ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＩＡ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＩＢ αサブユニット、およびその組合せから成る群から選択されるヒトＦｃＲ αサブユニットを含むように改変される。一実施形態では、第２の動物は、野生型動物である。一実施形態では、第１の非ヒト動物は、内因性ＦｃＲ γ鎖を発現する。
【００５２】
一実施形態では、第１の非ヒト動物は、機能的内因性ＦｃγＲＩを発現する。
【００５３】
一態様では、低親和性マウスＦｃγＲを欠き、機能的ＦｃＲ γ鎖を発現し、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢのα鎖をコードする遺伝子を含む、マウスを作製するための方法であって、マウスＦｃγＲ α鎖の遺伝子座で、低親和性マウスＦｃγＲ α鎖をヒトＦｃγＲ α鎖と置き換えするステップを含む、方法が提供される。
【００５４】
一実施形態では、第１のステップは、内因性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子のα鎖を欠失させることならびにヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖を挿入することを含み、第２のステップは、第１のステップから結果として生じるマウスゲノムの中にヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子のα鎖を挿入することを含み、マウスは、機能的マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を含む。特定の実施形態では、第２のステップのヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子のα鎖は、第１のステップのヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖に対して５’側に挿入される。
【００５５】
一態様では、非霊長動物においてヒト治療薬による細胞殺傷を決定するための方法であって、ヒトＦｃを含むヒト治療薬に、細胞、非ヒト胚、または非ヒト動物を曝露するステップであって、細胞、胚、または動物は、機能的ＦｃＲ γ鎖を含み、１つまたは複数の内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の、１つまたは複数のヒトＦｃγＲ α鎖による置き換えを含む、ステップおよび細胞、胚、または動物の低親和性ヒトＦｃγＲを通して細胞殺傷を媒介するためのヒト治療薬の能力を決定するステップを含む、方法が提供される。
【００５６】
一実施形態では、非霊長動物は、マウスである。特定の実施形態では、内因性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢと置き換えされる。
【００５７】
一実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、肥満細胞、好塩基球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびその組合せから選択される。特定の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞であり、ヒト抗体またはヒト化抗体によるＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣが、決定される。特定の実施形態では、低親和性ヒトＦｃγＲは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡである。
【００５８】
一態様では、治療薬依存性の血栓形成を決定するための方法であって、治療薬に、血小板上にヒトＦｃγＲＩＩＡを発現する第１の非ヒト動物を曝露するステップ、当該治療薬に、血小板上にヒトＦｃγＲＩＩＡを発現しない第２の非ヒト動物を曝露するステップ、第１の非ヒト動物および第２の非ヒト動物において、治療薬依存性の血栓形成の量を測定するステップ、ならびに治療薬依存性の血栓形成における差異を決定するステップを含む、方法が提供される。
【００５９】
一実施形態では、非ヒト動物は、マウスおよびラットから選択される。
【００６０】
一実施形態では、治療薬依存性の血栓形成における決定された差異は、ヒトへの治療薬の投与と関連する危険性を同定するために用いられる。一実施形態では、決定された差異は、その必要性のあるヒト患者への治療薬の投与の変化をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、マウスＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子を示す、マウスにおける野生型低親和性ＦｃγＲ遺伝子座、ならびにこれらの遺伝子の標的欠失のために使用される、部位特異的組換え部位に挟まれたネオマイシンカセットを含むマウスＦｃγＲターゲッティングベクターの略図である。
【図２】図２は、野生型ＦｃγＲおよび低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子欠損マウス（ｍＦｃγＲ ＫＯ）についての、内因性ｍＦｃγＲＩＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩ遺伝子の発現を含む、Ｂ細胞（抗ＣＤ１９）、ＮＫ細胞（抗ＮＫｐ４６）、およびマクロファージ（抗Ｆ４／８０）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、いくつかのリンパ球コンパートメント：骨髄（図３Ａ）、血液（図３Ｂ）、リンパ節（図３Ｃ）、および脾臓（図３Ｄ）における、ヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０）およびＦｃγＲノックアウトマウスに交配したヒト化ＣＤ２０マウス（ｈＣＤ２０／ＦｃγＲ ＫＯ）における、マウスＦｃ（Ａｂ １６８）またはヒトＦｃ（Ａｂ ７３５）を有するヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を用いたＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。それぞれの図について、Ｙ軸は、ゲーティングされたＢ細胞（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋またはＢ２２０＋／ＣＤ１９＋）のパーセントを示し、Ｘ軸は、それぞれの動物グループについての抗体用量を示す：１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｃ）、２ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（２Ａｂ）、および１０ｍｇ／ｋｇヒト抗ヒトＣＤ２０抗体（１０Ａｂ）。
【図４】図４は、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の、ネオマイシンを標的にした欠失、ならびに欠失させたマウス遺伝子座内に２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子（ｈＦｃγＲＩＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＡ）を挿入するための、部位特異的組換え部位に挟まれたヒグロマイシンカセットを含む第２のターゲッティングベクターの略図である。血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現のために、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡターゲッティングベクターのｈＦｃγＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結した伸長プロモーター領域を用いる；血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現を防止するために、プロモーター領域が取り除かれているか、実質的に取り除かれている。
【図５Ａ】図５Ａは、野生型およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡホモ接合体マウス（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ ＨＯ）についての、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡの発現を含む、ＮＫ細胞（抗ＮＫｐ４６）およびマクロファージ（抗Ｆ４／８０）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、野生型およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡホモ接合体マウス（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ ＨＯ）についての、ヒトＦｃγＲＩＩＡの発現を含む、好中球（抗Ｌｙ６Ｇ）およびマクロファージ（抗Ｆ４／８０）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【図６】図６は、２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（ｈＦｃγＲＩＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＡ）の挿入を含む低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の、ヒグロマイシンを標的にした欠失、ならびに３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（ｈＦｃγＲＩＩＢ、ｈＦｃγＲＩＩＩＢ、およびｈＦｃγＲＩＩＣ）、および部位特異的組換え部位に挟まれたネオマイシンカセットを挿入するための第３のターゲッティングベクターの略図である。
【図７】図７は、野生型およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＩＢ−ＩＩＡ−ＩＩＢ−ＩＩＣホモ接合体マウス（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＣ ＨＯ）についての、ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＢの発現を含む、Ｂ細胞（抗ＣＤ１９）および好中球（抗Ｌｙ６Ｇ）についてゲーティングされた脾細胞のヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
本発明は、方法および条件が変更されてもよいので、記載される特定の方法および実験条件に限定されない。本明細書において使用される術語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲が請求項によってのみ限定されるので、限定を意図するものではない。
【００６３】
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者らによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、特定の方法および材料が記載される。本明細書において言及される刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００６４】
語句「標的構築物」は、標的領域を含むポリヌクレオチド分子を含む。標的領域は、標的細胞、組織、または動物における配列に実質的に相同な配列を含み、細胞、組織、または動物のゲノム内の位置への標的構築物の組み込みをもたらす。特定の実施形態では、標的構築物は、さらに特定の対象の核酸配列または遺伝子、選択マーカー、制御配列または調節配列、およびそのような配列を含む組換えを支援するまたは促進するタンパク質の外因性の追加を通して媒介される組換えを可能にする他の核酸配列を含む。他の特定の実施形態では、標的構築物は、対象の遺伝子をさらに含み、対象の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似する機能を有するタンパク質をコードする異種遺伝子である。
【００６５】
用語「置き換え」は、その他に示されない限り、ＤＮＡ配列が、ゲノム内の配列をそのゲノム配列の遺伝子座で異種配列によって置き換えるような方法で細胞のゲノムの中に配置されることを含む（たとえばマウスにおけるヒト配列）。そのように配置されたＤＮＡ配列は、そのように配置された配列を得るために使用される供給源のＤＮＡの一部である１つまたは複数の調節配列を含んでいてもよい（たとえばプロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域など）。たとえば、様々な実施形態では、置き換えは、内因性配列の発現ではなく、そのように配置されたＤＮＡ配列（異種配列を含む）由来の遺伝子産物の生産をもたらす、内因性配列の異種配列との置換であり、置き換えは、内因性ゲノム配列の、内因性ゲノム配列によってコードされるタンパク質に類似する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列とのものである。（たとえば、内因性ゲノム配列は、低親和性マウスＦｃγＲ受容体をコードし、ＤＮＡ断片は、たとえばヒトＦｃγＲＩＩＣおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＢなどのような、１つまたは複数のヒト低親和性ＦｃγＲ受容体をコードする）。
【００６６】
用語「ＦｃγＲ」は、Ｆｃ、たとえばＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分に対する受容体を含む。ＦｃγＲ遺伝子は、細胞の表面上に発現されるα鎖を含み、リガンド結合ドメインとして働き、ＦｃＲ γ鎖のホモ二量体またはＦｃＲ γ鎖およびδ鎖のヘテロ二量体を伴う。いくつかの異なるＦｃγＲ遺伝子があり、それらは、免疫複合体におけるＩｇＧへの優先的な結合に従って低親和性タイプおよび高親和性タイプに分類することができる。ヒトにおける低親和性ＦｃγＲ遺伝子は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢを含み、ほとんどのこれらの遺伝子内に、天然に存在する遺伝子差異または多型が、自己免疫疾患を有するヒト対象において記載されている。本開示を読むに際して当業者らは、ゲノムにおける１つまたは複数の内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子（またはすべて）を、１つまたは複数の異種低親和性ＦｃγＲ遺伝子（たとえば、対立形質などのような変異体または多型、他の種由来の遺伝子、キメラ形態など）によって置き換えることができることを認識するであろう。
【００６７】
語句「対立遺伝子変異体」は、同じ遺伝子の一連の異なる形態をもたらす、遺伝子の通常の配列の変異を含む。異なる形態は、たとえば遺伝子由来のタンパク質の配列において２０までのアミノ酸の差異を含んでいてもよい。たとえば、対立遺伝子は、同じ物理的な遺伝子座での代替のＤＮＡ配列であることを理解することができ、対立遺伝子は、同じ遺伝子についての他の対立遺伝子において結果として生じないまたは他の対立遺伝子において様々な程度で結果として生じる、ある種の疾患または状態に対する感受性などのような異なる形質（たとえば遺伝的な表現型の特徴）をもたらしてもよいまたはもたらさなくてもよい。
【００６８】
「アクセサリー細胞」は、免疫応答のエフェクター機能に関与する免疫細胞を含んでいてもよい。例示的な免疫細胞は、リンパまたは骨髄起源の細胞、たとえば、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、肥満細胞などを含む。アクセサリー細胞は、それらの表面上に発現される受容体、たとえばＦｃＲを通して免疫系の特異的な機能を実行する。特定の実施形態では、アクセサリー細胞は、細胞表面上に発現されるＦｃＲ、たとえば低親和性ＦｃγＲを通して媒介されるＡＤＣＣを引き起こすことができる。たとえば、ＦｃＲを発現するマクロファージは、抗体被覆細菌の食作用および破壊に関与する。アクセサリー細胞はまた、他の免疫プロセスを媒介する作用物質を放出することができるかもしれない。たとえば、肥満細胞は、ＦｃＲに結合した抗体によって活性化され、感染の部位で、顆粒、たとえば炎症性分子（たとえばサイトカイン）を放出することができる。様々な他の実施形態では、アクセサリー細胞上のＦｃＲの発現は、他の因子（たとえばサイトカイン）によって調節することができる。たとえば、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ発現は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を用いる刺激によって誘導することができる。
【００６９】
マウスおよびヒトＦｃＲ
免疫グロブリンのＦｃ（つまり定常）領域に対する受容体（ＦｃＲ）は、免疫応答の調節において重要な役割を果たす。ＦｃＲは、抗体が結合した外来抗原を有効に処分するために、宿主の免疫系のアクセサリー細胞上に存在する。ＦｃＲはまた、免疫系のアクセサリー細胞の活性化および阻害性の応答の平衡を保つ際に重要な役割を果たす。ＦｃＲは、マクロファージによる食作用、肥満細胞の脱顆粒、抗体−抗原複合体の取り込み、および免疫応答の改変ならびに他の免疫系プロセスに関与する。
【００７０】
マウスおよびヒトでは、発現された抗体レパートリーにおいて存在する免疫グロブリンアイソタイプにそれぞれ特異的である別個のＦｃＲが、異なるアクセサリー細胞の表面上に異なって発現される。たとえば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲ）を通してエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲは、３つのグループに分類される：高親和性活性化ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、低親和性阻害性ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、および低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）。グループはそれぞれ、マウスおよびヒトの両方に存在するが、それらが存在する免疫細胞のアイソフォームおよびサブセットの数は異なる。たとえば、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢは、ヒトにおいてアクセサリー細胞上に発現されるが、報告によれば、マウスでは不在である。さらに、それぞれのＦｃγＲに対する異なるＩｇＧアイソタイプ（たとえばＩｇＧ１）の親和性は、マウスおよびヒトにおいて異なる。
【００７１】
ＦｃγＲを通しての細胞シグナル伝達の活性化または阻害およびＦｃγＲへの抗体結合と関連するエフェクター機能は、ＦｃγＲの細胞内ドメインのまたは共受容体のサブユニットの特異的配列モチーフによって媒介されると考えられる。受容体の活性化は、最も一般には、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する共通のγ鎖（ＦｃＲ γ鎖）と関連する。ＩＴＡＭは、ＦｃＲへの抗体結合に応じてリン酸化されるチロシン残基を含む、約９〜１２のアミノ酸の特異的配列を含有する。リン酸化は、シグナル伝達カスケードを導く。ＦｃＲ γ鎖をコードする遺伝子を欠くマウス（ＦｃＲ γ鎖 ＫＯ）が報告された（たとえばTakaiら（１９９４年） FcR γ Chain Depletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell ７６巻：５１９〜５２９頁；van Vugtら（１９９６年）FcR γ-Chain Is Essential for Both Surface Expression and Function of Human FcγRI (CD64) In Vivo, Blood ８７巻（９号）：３５９３〜３５９９頁；およびParkら（１９９８年）Resistance of Fc Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin. Invest. １０２巻（６号）：１２２９〜１２３８頁を参照されたい）。ＦｃＲ γ鎖は、報告によれば、ほとんどのＦｃＲの適切な表面発現および機能（たとえばシグナル伝達、食作用など）にとって不可欠であり、ＦｃＲ γ鎖 ＫＯマウスは、いくつかの報告書によれば、ＦｃγＲＩを欠く。しかしながら、他の報告は、ＦｃＲ γ鎖 ＫＯマウスが、実際は、ある種のアクセサリー細胞の表面上にＦｃγＲＩを発現し、発現されたＦｃγＲＩは、報告によれば、それが、発現されるＦｃＲ γ鎖の非存在下において、マウスにおいて、ＩｇＧに結合するという点で機能的に見えるということを明らかにする（Barnesら（２００２年） FcγRI-Deficient Mice Show Multiple Alterations to Inflammatory and Immune Responses, Immunity １６巻：３７９〜３８９頁）。
【００７２】
対照的に、ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する、阻害性の受容体である。ＩＴＡＭと同様に、ＩＴＩＭは、リン酸化することができるチロシン残基を含む配列モチーフである。しかしながら、ＩＴＭのリン酸化に続く下流の事象は、免疫細胞機能の、活性化ではなく阻害を導く。報告によれば、ＦｃγＲＩＩＢが欠損したマウスは、野生型マウスと比較して、Ｂ細胞抗体応答のダウンレギュレーターとしてＦｃγＲＩＩＢの役割を支持する観察である、抗体応答の増加を示す（Takaiら（１９９６年） Augmented humoral and anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature ３７９巻：３４６〜３４９頁）。
【００７３】
ヒトでは、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢは、古典的な低親和性ＦｃγＲ遺伝子と考えられ、同じ染色体上にともに位置する（Suら（２００２年） Genomic organization of classical human low-affinity Fcγ receptor genes, Genes and Immunity ３巻（補足１）：Ｓ５１〜Ｓ５６頁）。これらの遺伝子は、別個の表現型、たとえば、受容体のリガンド結合および機能の改変と関連するいくつかの多型を示す。いくつかの多型は、自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および多発性硬化症（ＭＳ）と関連する。様々なヒトＦｃγＲ（ｈＦｃγＲ）についてのトランスジェニックマウスが開発されており、高親和性抗体を生成し、特異的細胞応答を誘発する能力について治療用抗体を試験し、異常な免疫応答を回復させる化合物をスクリーニングするなどの疾患モデルとして使用されている（たとえばHeijnenら（１９９６年）A Human FcgRI/CD64 Transgenic Model for In Vivo Analysis of (Bispecific) Antibody Therapeutics, J. Hematother. ４巻：３５１〜３５６頁；Heijnenおよびvan de Winkel（１９９６年）Antigen Targeting to Myeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced Antibody Responses in Transgenic, J. Clin. Invest. ９７巻（２号）：３３１〜３３８頁；米国特許第６，１１１，１６６号、第６，６７６，９２７号、第７，３５１，８７５号、第７，４０２，７２８号、ならびに第７，４１６，７２６号を参照されたい）。
【００７４】
免疫系の抗体およびアクセサリー細胞の間のブリッジを提供する際のＦｃＲの重要な役割にもかかわらず、すべての低親和性ｈＦｃγＲが発現されるモデル系は、現在、存在しない。すべての低親和性ｈＦｃγＲが同時発現されるマウスは、内因性マウスＦｃγＲを欠くマウスを含めて、様々な実施形態において、ＡＤＣＣ媒介性の効果を含むヒト抗体治療薬の効果を正確に反映するために使用することができる。そのようなマウスは、ヒトにおいて、特に、ヒト抗体治療薬の試験との関連において、免疫学的プロセスのより正確な評価を達成することができる動物モデルを提供することによって、たとえばＲＡ、Ｉ型糖尿病、ＳＬＥ、および自己免疫病などのようなヒト疾患の治療のために、治療用抗体のエンジニアリング、分析、および評価において、重大なツールとして果たすであろう。マウスはまた、低親和性受容体に結合する治療薬について、治療薬依存性の細胞殺傷を評価するために、したがって、有用なヒト治療薬を同定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用することができる、低親和性受容体を有する細胞の有益な供給源となるであろう。
【００７５】
内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウス
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しないが、内因性マウスＦｃＲ γ鎖を発現する遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、ＦｃＲ γ鎖は、野生型マウスと同じまたは実質的に同じであるマウスにおける分布（つまり細胞型において）およびレベルで発現される。内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子は、免疫細胞の表面上にまたは動物の末梢において可溶性で発現することができる。内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しない非ヒト動物を作製するための遺伝子改変は、例証としてマウスを使用することによって好都合に説明される。本発明による遺伝子改変されたマウスは、様々な方法において作製することができ、これらの特定の実施形態は、本明細書において議論される。
【００７６】
内因性の遺伝子座でのＦｃγＲ遺伝子配置を示すために、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座の略図（正確な縮尺ではない）を図１（上）中に提供する。示されるように、低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩは、１つの染色体上にすぐ近くにともに存在する。これらの遺伝子のそれぞれは、抗体分子のＦｃ部分への結合を担うα鎖またはリガンド結合ドメインを含む。
【００７７】
内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子のα鎖をコードするヌクレオチド配列を欠く遺伝子改変されたマウスは、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子を用いて低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子を欠失させるターゲッティングベクターを作製することができる。図１は、内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座の上流の配列を含有する５’相同性アーム、それに続く薬剤選択カセット（たとえばｌｏｘＰ配列に挟まれたネオマイシン抵抗性遺伝子）、および内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座の下流の配列を含有する３’相同性アームを有する標的構築物によってターゲッティングされたマウスゲノム（下）を示す。この遺伝子座での相同組換えに際して、内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖の遺伝子座は、薬剤選択カセットによって置き換えられる（図１の下）。内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の遺伝子座は、それによって欠失させられ、内因性低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子を発現しない細胞または非ヒト動物がもたらされる。薬剤選択カセットは、レコンビナーゼ（たとえばＣｒｅ処理によって）の続く追加によって任意選択で除去されてもよい。
【００７８】
内因性低親和性マウスＦｃγＲ α鎖遺伝子（複数可）を非機能性にするためのマウスの遺伝子改変は、様々な実施形態において、免疫応答において欠損を示すマウスをもたらし、正常および病気の免疫機能、ＩｇＧ媒介性のプロセス、ならびに自己免疫疾患における、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の協同的なならびに個々の役割を評価するのに有用なマウスを作製する。様々な実施形態では、ＦｃＲ γ鎖ではなく、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子のα鎖の改変は、表面発現および機能にＦｃＲ γ鎖を必要とする他の内因性ＦｃＲ遺伝子（たとえば高親和性ＦｃγＲＩ）の潜在的な低下を回避し、したがって、γ鎖依存性のプロセスを通して媒介される様々な他の免疫学的機能およびプロセスを維持する。
【００７９】
いくつかの報告によれば、ＦｃＲ γ鎖欠損マウスは、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩの表面発現を欠く。しかしながら、ＦｃγＲＩは、報告によれば、ＦｃＲ γ鎖欠損マウスにおいて細胞表面上に検出されており、報告によれば、部分的に機能的である。対照的に、本発明によるマウスは、非改変内因性ＦｃＲ γ鎖を含有し、これは、ＦｃＲ γ鎖を必要とする他のＦｃＲ遺伝子の天然細胞表面発現パターンおよび細胞機能を維持する。
【００８０】
様々な実施形態では、本発明のマウスは、それらが有する遺伝子改変が、低親和性ＦｃγＲ遺伝子に全体的に充てられるのではなく、他の免疫学的機能に必要な他の遺伝子の維持をもたらすという点で、他のＦｃγＲ遺伝子欠損マウスに対して利点を示す。たとえば、機能的ＦｃＲ γ鎖があれば、他のγ鎖依存性のタンパク質（たとえばＦｃγＲＩ）は、このＦｃＲ γ鎖と会合することができ、免疫応答におけるエフェクター細胞機能に参加するであろう。本発明に従う様々な遺伝子改変されたマウスでは、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子（１つまたは複数のαサブユニット）を欠失させながらの、そのような機能の維持（機能的ＦｃＲ γ鎖の存在による）は、自己免疫病におけるＦｃＲの役割のより正確な解明を可能にすると考えられる。
【００８１】
低親和性ＦｃγＲヒト化マウス
低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子は、動物の免疫系のアクセサリー細胞の表面上にまたは動物の末梢において可溶性で発現することができる。
【００８２】
遺伝子改変は、様々な実施形態において、１つまたは複数の低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の機能的α鎖の欠失を含み、いくつかの実施形態において、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、または５つの低親和性ヒトＦｃγＲ αサブユニット遺伝子による置き換えを含むさらなる改変を含み、非ヒト動物は、機能的マウスＦｃＲ γ鎖遺伝子を発現する。非ヒト動物、非ヒト胚、および細胞を作製するための遺伝子改変された非ヒト胚、細胞、および標的構築物もまた、提供される。
【００８３】
特異的多型形態または対立遺伝子変異体（たとえば単一アミノ酸差異）を含むヒトＦｃγＲ遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法が提供され、ヒトプロモーターおよびヒト調節配列からそのような遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法を含む。方法は、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を選択的に非機能性にするステップ（たとえばそのα鎖の欠失によって）およびマウスにおいて、低親和性ヒトＦｃγＲ αサブユニット遺伝子を発現させるために、内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座に低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子のα鎖を用いるステップを含む。低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の欠失は、ＦｃＲ γ鎖遺伝子ではなく、１つまたは複数のα鎖遺伝子の欠失によって成される。このアプローチは、機能的内因性ＦｃＲ γ鎖遺伝子を保持しながら、１つまたは複数の内因性低親和性ＦｃγＲ α鎖を選択的に非機能性にする。
【００８４】
内因性ＦｃγＲ α鎖置き換えアプローチは、ＦｃγＲ α鎖のゲノム配列が単一の断片によって置き換えられ、そのため、必要な調節配列を含むことによって正常な機能性を保持するので、様々な実施形態において、動物における天然ＦｃγＲ媒介性のシグナル伝達の比較的最小限の破壊を用いる。したがって、そのような実施形態では、ＦｃγＲ α鎖改変は、機能的ＦｃＲ γ鎖分子に依存する他の内因性ＦｃＲに影響しない。さらに、様々な実施形態では、改変は、細胞表面上の、いくつかのＦｃγＲ α鎖の適切な発現におよび活性化された受容体から結果として生じる下流のシグナル伝達に必要とされると考えられるＦｃγＲ α鎖および内因性ＦｃＲ γ鎖を含む機能的受容体複合体の構築に影響しない。ＦｃＲ γ鎖が欠失していないので、様々な実施形態では、内因性ＦｃγＲ α鎖遺伝子の、ヒトＦｃγＲ α鎖遺伝子による置き換えを含有する動物は、アクセサリー細胞の表面上に存在するヒトＦｃγＲ α鎖へのＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分の結合を通しての、抗体からの正常なエフェクター機能を処理することができるはずである。
【００８５】
欠失させた内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の略図（正確な縮尺ではない）を、図４（上）中に提供する。示されるように、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡは、ヒト低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含有するゲノム断片を有する標的構築物（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩＩＡターゲッティングベクター）によって、欠失させた内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座内に挿入される。これらの遺伝子のそれぞれは、抗体分子のＦｃ部分への結合を担う、ヒトＦｃγＲ遺伝子のα鎖またはリガンド結合ドメインを含む。
【００８６】
内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座で低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する遺伝子改変されたマウスは、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子と共に低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（たとえばＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）を導入するターゲッティングベクターを作製することができる。図４は、内因性低親和性ＦｃγＲの遺伝子座の欠失を含むマウスゲノムを示す（上）。示されるように、標的構築物は、内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座の上流の配列を含有する５’相同性アーム、それに続く薬剤選択カセット（たとえば、ｌｏｘＰ配列に両側で挟まれたヒグロマイシン抵抗性遺伝子）、ヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子、ヒトＨＳＰ７６遺伝子、およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含有するゲノム断片、ならびに内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座の下流の配列を含有する３’相同性アームを含有する。欠失させた遺伝子座での相同組換えに際して、薬剤選択カセットは、ターゲッティングベクター中に含有される配列によって置き換えられる（図４の下）。したがって、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座は、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子によって置き換えられ、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する細胞または動物がもたらされる。薬剤選択カセットは、レコンビナーゼ（たとえばＣｒｅ処理によって）の続く追加によって任意選択で除去されてもよい。
【００８７】
血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現については、標的構築物であるヒトｈＦｃγＲＩＩＡ−ＩＩＡターゲッティングベクターは、たとえば、ヒトゲノムにおいてｈＦｃｇＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結されたすべてまたは実質的にすべてのヒトプロモーター領域を含む伸長配列を含む。血小板上のｈＦｃγＲＩＩＡの発現を防止するために、標的構築物は、ヒトにおいてｈＦｃγＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結された、すべてまたは実質的にすべてのヒトプロモーター領域を欠く。
【００８８】
キメラの遺伝子座へのさらなる改変（図４の下）は、２つのヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えについて記載される類似する技術を使用して達成することができる。内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座を２つのヒトＦｃγＲ遺伝子によって置き換えるための改変は、他の低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子の組み込みのための出発点をさらに提供することができる。たとえば、２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子によって置き換える内因性低親和性ＦｃγＲの遺伝子座の略図（正確な縮尺ではない）を、図６（上）において提供する。示されるように、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子を含有するゲノム断片を有する他の標的構築物（ヒトＦｃγＲＩＩＢ−ＩＩＩＢ−ＩＩＣターゲッティングベクター）によって、改変内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座内に挿入される。これらの遺伝子のそれぞれは、抗体分子のＦｃ部分への結合を担う、ヒトＦｃγＲ遺伝子のα鎖またはリガンド結合ドメインを含む。
【００８９】
内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座に５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する遺伝子改変されたマウスは、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子と共に低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（たとえばＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢ）を導入するターゲッティングベクターを作製することができる。図６は、内因性低親和性ＦｃγＲの遺伝子座の２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含むマウスゲノムを示す（上）。示されるように、標的構築物は、内因性低親和性マウスＦｃγＲの遺伝子座の上流の配列を含有する５’相同性アーム、それに続く薬剤選択カセット（たとえば、ｌｏｘＰ配列に両側で挟まれたネオマイシン抵抗性遺伝子）、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ヒトＨＳＰ７７遺伝子、ヒトＦｃγＲＩＩＣ遺伝子を含有するゲノム断片、それに続く内因性の遺伝子座に存在する低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の上流の配列を含有する３’相同性アームを含有する。改変の遺伝子座での相同組換えに際して、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ遺伝子は、ターゲッティングベクター中に含有される配列によって、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座に先に存在するヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡ遺伝子の５’に挿入される（図６の下）。したがって、改変内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座は、３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を組み込むためにさらに改変され、５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現する細胞または動物がもたらされる。薬剤選択カセットは、レコンビナーゼ（たとえばＣｒｅ処理によって）の続く追加によって任意選択で除去されてもよい。図６（下）は、結果として生じる遺伝子座の構造を示し、これは、動物の免疫系のアクセサリー細胞の表面上に検出することができる５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を発現し、適切に、内因性ＦｃＲ γ鎖と独立して会合するであろう。
【００９０】
ＦｃγＲ欠損マウスおよびＦｃγＲヒト化マウスの実験モデル
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しない遺伝子改変された非ヒト動物は、たとえば、免疫応答における個々の低親和性ＦｃγＲ遺伝子の様々な機能を解明するのに、細胞性免疫（たとえばＡＤＣＣ）を介してのヒト治療用抗体の効能を測定するのに、免疫疾患または障害におけるＦｃγＲの役割を決定するのに、免疫疾患または障害のモデルとして果たすのに、１つまたは複数のＦｃγＲタンパク質に対する抗体を生成するのに、および対象の他の遺伝子改変されたマウスを生成するために交配仲間として果たすのに有用である。
【００９１】
一実施形態では、本発明によるマウスは、そのようなマウスに作用物質を投与することによって、低親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現しないマウスによって、失われた細胞傷害性効果（野生型マウスと比較して）を決定するために使用することができ、作用物質は、野生型マウスにおいてＦｃγＲ依存性の細胞傷害性効果を引き起こすことが公知である。一実施形態では、本発明のマウスに腫瘍細胞が移植され、続く期間の後に、腫瘍細胞の表面上に発現される抗原に特異的な抗体が注射される。抗体のアイソタイプは、注射前に既知であり、動物は、野生型動物において観察されるＡＤＣＣとの比較によってＦｃγＲ依存性のＡＤＣＣの機能障害について分析される。
【００９２】
他の態様では、内因性低親和性受容体が欠損したマウスは、自己免疫疾患のｉｎ ｖｉｖｏモデルを開発するために、他の免疫欠損マウスと組み合わせることができる（たとえば交配によって）。たとえば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスは、免疫系を研究するためのモデル生物として当技術分野においてルーチン的に使用される。ＳＣＩＤマウスは、ＴもしくはＢリンパ球を作るまたは補体系のいくつかの成分を活性化する能力が損なわれており、効率的に感染と戦うことができず、腫瘍を拒絶することができず、移植を拒絶することができない。本発明の低親和性ＦｃγＲ αサブユニット遺伝子欠損マウスは、抗体治療薬（たとえば抗腫瘍抗体）の投与に応じて、宿主動物における細胞の枯渇を確認するためにＳＣＩＤマウスに交配されてもよく、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞の枯渇におけるＡＤＣＣおよび補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）の役割が決定されるであろう。
【００９３】
他の態様では、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含む遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。そのような動物は、完全ヒト抗体およびｈＦｃγＲ媒介性のＡＤＣＣの薬物動態を研究するのに有用である。さらに、ヒトＦｃγＲ遺伝子は、疾患（たとえばＳＬＥ、ＲＡ、ウェゲナー肉芽腫症、ギラン−バレー症候群、および多発性硬化症）と関連する多型または対立遺伝子変異体を示すことが示された。したがって、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、ヒトＦｃγＲ遺伝子の特異的対立遺伝子形態または多型形態による置き換えを含む遺伝子改変された非ヒト動物は、動物において、ヒト自己免疫疾患および多型と関連する形質を研究するために使用することができる。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲ遺伝子の対立形質は、ヒトＩｇＧに対する効能の増強と関連する。
【００９４】
他の特定の実施形態では、ヒト抗体治療薬の効能に対するヒト低親和性ＦｃγＲ多型の影響が、決定される。特定の実施形態では、抗腫瘍抗体は、ヒトＦｃγＲの第１の多型を含む第１のヒト化マウスに投与され、また、ヒトＦｃγＲの第２の多型を含む第２のヒト化マウスにも投与され、第１および第２のマウスはそれぞれ、ヒト腫瘍細胞を含み、抗腫瘍抗体の抗腫瘍活性は、第１のマウスおよび第２のマウスにおいて評価される。特定の実施形態では、治療オプションは、第１のマウスおよび第２のマウスにおける抗腫瘍抗体の効能の評価に基づいて、ヒト腫瘍細胞に対応する腫瘍を有する第１のまたは第２の多型を有するヒトの治療に関して医師によって選択される。
【００９５】
ヒトＦｃγＲ遺伝子の適した多型は、当技術分野において公知のすべてのものを含む。ヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子については、多型は、たとえば、Ｔ細胞がＩｇＧに応じて増殖する能力によって報告される高応答動物表現型および低応答動物表現型を含む。高応答動物多型は、１３１位のアルギニン残基（１３１Ａｒｇ）によって特徴付けられるが、低応答動物は、１３１位のヒスチジン残基（１３１Ｈｉｓ）によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＡ配列は、１３１Ｈｉｓ多型を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＡ α鎖の代表的なタンパク質配列は、配列番号３２において示される。
【００９６】
ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の単一ヌクレオチド置換は、リガンド結合ドメイン（α鎖）においてミスセンス置換をもたらし、推定上、ＩｇＧのＦｃ部分が、細胞表面上のＦｃγＲＩＩＢのα鎖に結合する結合能力に影響する。たとえば、マウスにおけるＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の膜貫通ドメイン内の２３２位のイソロイシンのトレオニン残基の置換（Ｉｌｅ２３２Ｔｈｒ）は、受容体のシグナル伝達能力を損なうことが示された。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、イソロイシン変異体（２３２Ｉｌｅ）を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＢ α鎖の代表的なタンパク質配列は、配列番号３３において示される。
【００９７】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の対立遺伝子変異体は、ＳＬＥおよびＲＡに対する感受性に関与することが提唱されている。この対立遺伝子変異体は、１５８位のバリンのフェニルアラニン置換（Ｖａｌ１５８Ｐｈｅ）を含む。バリン対立遺伝子変異体（１５８Ｖａｌ）は、フェニルアラニン対立遺伝子変異体（１５８Ｐｈｅ）よりも、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対してより高度な親和性を有することが特徴付けられている。１５８Ｐｈｅ対立遺伝子変異体は、免疫複合体の排除の低下を導くことが提唱された。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子は、１５８Ｖａｌ対立遺伝子変異体を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖の代表的なタンパク質配列鎖は、配列番号３５において示される。
【００９８】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子の対立遺伝子変異体は、好中球抗原１（ＮＡ１）および好中球抗原２（ＮＡ２）対立遺伝子を含む。これらの対立遺伝子変異体は、輸血副作用、自己免疫好中球減少症、ＳＬＥ、およびウェゲナー肉芽腫症に関与することが提唱された。ＮＡ２対立遺伝子変異体は、食作用を媒介する能力の減少によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ遺伝子は、ＮＡ２対立遺伝子変異体を含む。ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ α鎖の代表的なタンパク質配列は、配列番号３６において示される。
【００９９】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物は、治療用抗体のＦｃ部分によって引き起こされる、ＦｃγＲ媒介性の機能を最適化するのに有用である。抗体のＦｃ領域は、当技術分野において公知の任意の方法によって改変することができる。たとえば、Ｆｃ部分（たとえばＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）内のアミノ酸残基は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合親和性を選択的に増強するために改変されてもよい。したがって、結果として生じる抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ依存性のＡＤＣＣの増強を有するはずである。特定の実施形態では、本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現する動物は、改変ヒト抗体を動物に投与し、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現細胞に結合する抗体を検出し（たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて）、観察されたＡＤＣＣ活性を、野生型動物において決定されたものから観察されたＡＤＣＣ活性と比較することによって、改変ヒト抗体のＡＤＣＣ能力の増強を評価するために使用される。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスの生成
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の欠失を導入するための標的構築物（下記に記載）を構築した（図１）。
【０１０１】
標的構築物は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−３９５ｆ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製した（たとえば米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. ２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。ＲＰ２３−３９５ｆ６ ＢＡＣ ＤＮＡは、ＦｃγＲのそれぞれのα鎖を含む内因性低親和性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子を欠失させるために改変した。
【０１０２】
手短かに言えば、上流および下流の相同性アームは、それぞれ
【０１０３】
【化１】
【０１０４】
を用いて作製した。これらの相同性アームは、内因性低親和性ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、およびＦｃγＲＩＩＩ遺伝子のα鎖を欠失したカセットを作製するために使用した。標的構築物は、内因性の座に関しての５’および３’領域に対して相同な配列を含む相同性アームを含むｌｏｘネオマイシン抵抗性遺伝子を含んだ。内因性ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の上流のおよび内因性ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子の下流の遺伝子および／または配列（図１を参照されたい）は、標的構築物によって改変しなかった。
【０１０５】
標的欠失は、欠失させた領域の外側のおよび標的構築物内のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認した。欠失させた座の上流領域は、
【０１０６】
【化２】
【０１０７】
を使用し、ＰＣＲによって確認し、欠失させた座の下流領域は、
【０１０８】
【化３】
【０１０９】
を使用して確認した。上流の欠失ポイントの両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、これは、欠失ポイントに存在するカセット配列に隣接して連結されたＦｃγＲＩＩＢ遺伝子の下流の内因性マウス配列（下記の括弧内に含有される）を示す：
【０１１０】
【化４】
【０１１１】
下流の欠失ポイントの両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、これは、ＦｃγＲＩＩＩ遺伝子の上流の内因性マウス配列（下記の括弧内に含有される）と隣接しているカセット配列を示す：
【０１１２】
【化５】
【０１１３】
ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶが欠損したマウスは、マウスＥＳ細胞への標的ＢＡＣ ＤＮＡ（上記に記載）のエレクトロポレーションを通して生成した。ポジティブＥＳ細胞クローンは、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認する。次いで、ポジティブＥＳ細胞クローンをメスマウスに移植するために使用し、低親和性ＦｃγＲ遺伝子が欠損した同腹子の子を生じさせた。
【０１１４】
（実施例２）
低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスの特徴付け
脾臓を、ＦｃγＲ欠損マウスおよび野生型マウスから採取し、無菌の使い捨てのバッグ中で１０ｍＬコラゲナーゼＤを用いて灌流した。次いで、ただ１つの脾臓を含有するそれぞれのバッグを、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）（Ｓｅｗａｒｄ）の中に配置し、３０秒間、中程度の設定でホモジナイズした。ホモジナイズした脾臓は、１０ｃｍペトリ皿に移し、３７℃で２５分間インキュベートした。細胞は、０．５Ｍ ＥＤＴＡの１：５０希釈液を使用して、ピペットを用いて分離し、３７℃で５分間、さらにインキュベーションを続けた。次いで、細胞は、遠心分離機（１０分間、１０００ｒｐｍ）を用いてペレットにし、赤血球は、３分間、４ｍＬ ＡＣＫバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解した。脾細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）を用いて希釈し、再び遠心分離した。ペレットにした細胞は、１０ｍＬ ＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁し、０．２μｍ細胞ストレーナーを用いてろ過した。
【０１１５】
フローサイトメトリー。リンパ球集団は、以下の蛍光色素コンジュゲート細胞表面マーカーを用いてＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣによって同定した：抗ＣＤ１９（Ｂ細胞）、抗ＣＤ３（Ｔ細胞）、抗ＮＫｐ４６（ＮＫ細胞）、および抗Ｆ４／８０（マクロファージ）。リンパ球は、特定の細胞系列についてゲーティングされ、ラット抗マウスＦｃγＲＩＩＩ／ＩＩ抗体（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、内因性ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩＢの発現について分析した。クローン２．４Ｇ２は、マウスＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩの細胞外ドメイン上の共通の多型エピトープを認識する。結果は、検出可能なマウス低親和性ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩが、ｍＦｃγＲ ＫＯマウスにおけるＢ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージ上になかったことを示す（図２）。
【０１１６】
ＡＤＣＣアッセイ。ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスから単離した脾細胞は、細胞殺傷アッセイにおいて、ＡＤＣＣを実行するそれらの能力について分析した。細胞集団は、単離し、ＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分離した。手短かに言えば、Ｔ細胞は、磁気標識抗マウスＣＤ３ビーズを使用して、脾細胞から枯渇させた。次いで、Ｔ細胞を枯渇させた脾細胞は、磁気標識抗マウスＣＤ４９Ｂビーズを使用して、ＮＫ細胞について濃縮した。これとは別に、ラージ細胞（ヒトＣＤ２０を発現する）は、４℃で、３０分間、様々な濃度（０．１〜１０μｇ／ｍＬの範囲）のマウス抗ヒトＣＤ２０抗体（クローンＢ１；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて被覆した。抗体被覆ラージ細胞は、３７℃で４時間、１００：１および５０：１の比（ＮＫ：ラージ）で、濃縮したＮＫ細胞と共にインキュベートした。細胞死は、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。発光シグナルは、溶解した細胞に由来し、死細胞の数に比例する。対照（抗ＣＤ２０抗体なし）からの発光を、それぞれの比についてのバックグラウンド死細胞数について決定し、野生型マウスおよびＫＯマウスについての測定値から引いた。平均細胞死を計算し、細胞殺傷の減少パーセント（ＡＤＣＣ％）を、野生型に対する比較によって決定した。結果を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
（実施例３）
低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスにおけるＢ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇
ＡＤＣＣ経路を通してのＢ細胞枯渇に対するヒトまたはマウスＦｃアイソタイプの効果は、ヒト抗ヒトＣＤ２０抗体を使用して、ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子操作した低親和性ＦｃγＲ遺伝子欠損マウスにおける様々なＢ細胞コンパートメントについて決定した。ヒトＣＤ２０を発現するマウスは、当技術分野において公知の技術を使用して、これとは別に遺伝子操作した。Ｂ細胞上にヒトＣＤ２０を発現し、低親和性ＦｃγＲ遺伝子が欠損した（実施例１において記載）マウスは、２つの遺伝子操作株の標準的な交配技術によって作製した。
【０１１９】
ヒトＣＤ２０を発現し、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を有したマウスの別々のグループに、それぞれ、以下のうちの１つを投与した：（１）１０ｍｇ／ｋｇ対照抗体（Ｎ＝４；マウスＩｇＧ２ａを有する、ヒトＣＤ２０に特異的でないヒト抗体）；（２）２ｍｇ／ｋｇ Ａｂ １６８（Ｎ＝３；マウスＩｇＧ２ａを有するヒト抗ｈＣＤ２０抗体；米国特許出願公開第２００９／００３５３２２号の、それぞれ配列番号３３９および３４７において見つけられる重配可変領域配列および軽鎖可変領域配列）；（３）１０ｍｇ／ｋｇ Ａｂ １６８；（４）２ｍｇ／ｋｇ Ａｂ ７３５（Ｎ＝３；ヒトＩｇＧ１を有するＡｂ １６８）；（５）１０ｍｇ／ｋｇ Ａｂ ７３５。実験の類似するセットにおいて、ヒトＣＤ２０を発現し、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の欠失を有したグループのマウスに、対照抗体およびヒト抗ｈＣＤ２０抗体（上記に記載）を投与した。
【０１２０】
それぞれのグループにおけるマウスに、腹腔内注射によって抗体を投与した。注射の７日後に、動物を安楽死させ、骨髄（Ｂ２２０＋／ＩｇＭ＋）、末梢血（Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋）、リンパ節（Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋）、および脾臓（Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋）の残りのＢ細胞含有率を、ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーターで実行したマルチカラーＦＡＣＳによって同定し、Ｆｌｏｗ−Ｊｏソフトウェアを使用して分析した（上記に記載）。Ｂ細胞枯渇実験の結果を、図３Ａ〜３Ｄに示す。
【０１２１】
図３Ａ〜３Ｄに示されるように、Ａｂ ７３５は、低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を含有するマウスにおいてＡｂ １６８よりも低い効率でＢ細胞を枯渇させた。さらに、両方の抗体（マウスおよびヒトＦｃ）について、Ｂ細胞の枯渇は、低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を欠くマウスにおいて有意に低下した。本実施例は、ＡＤＣＣ経路を通してＢ細胞を枯渇させる能力が、低親和性ＦｃγＲを必要とすることを示し、マウスにおける、ヒト定常領域を含有する抗体についてのＡＤＣＣ効率の測定が、ヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子の完全な補足物を含有する、遺伝子的に操作されたマウスの使用によってより適したものとなることを実証する。
【０１２２】
（実施例４）
ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡヒト化マウスの生成
欠失させた内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座（下記に記載）の中に２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を導入するための標的構築物を構築した（図４）。
【０１２３】
ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含む標的構築物は、ＢＡＣ ＲＰ２３−３９５ｆ６およびＣＴＤ−２５１４ｊ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変を通して、類似する方法（実施例１を参照されたい）を使用して作製した。両方のＢＡＣのＢＡＣ ＤＮＡは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖の欠失を、欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の中に導入するために改変した。
【０１２４】
同様に、上流および下流の相同性アームは、それぞれ
【０１２５】
【化６】
【０１２６】
を用いて作製した。これらの相同性アームは、内因性マウス低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の中に低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子のα鎖を導入するカセットを作製するために使用した。標的構築物は、欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座に対して５’の配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴヒグロマイシン抵抗性遺伝子、それに続く、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子を含む、ＢＡＣ ＣＴＤ−２５１４ｊ１２由来のヒトゲノム断片、ならびに欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座に対して３’のマウス配列を含む３’相同性アームを含む（図４の中央）。マウス血小板上にＦｃγＲＩＩＡを発現するマウスについては、標的構築物は、ｌｏｘ２３７２部位が両側の側面に位置するヒグロマイシンカセットを使用して、構築物が、たとえば約１８ｋｂまたはそれ以上までの、ヒトゲノムにおいてヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子に作動可能に連結される伸長プロモーター配列を含むという点を除いて、類似する方法で作製し（同じＢＡＣを使用して）、プロモーター領域と第１のｌｏｘ２３７２部位との接合部は、
【０１２７】
【化７】
【０１２８】
であり、第２のｌｏｘ２３７２部位とマウス配列との接合部は、
【０１２９】
【化８】
【０１３０】
である。適したプライマーは、プロモーター領域を含むヒト化の遺伝子型を同定するために使用した。
【０１３１】
ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子の標的挿入は、ＰＣＲによって確認した（上記に記載）。部分的にヒト化した座の上流領域は、
【０１３２】
【化９】
【０１３３】
を使用して、ＰＣＲによって確認したのに対して、部分的にヒト化した座の下流領域は、
【０１３４】
【化１０】
【０１３５】
を使用して、確認した。下流の接合部の両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、これは、欠失させた低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の３’の内因性マウス配列と隣接するｈＦｃγＲＩＩＡ遺伝子の上流の内因性ヒト配列の新規な挿入ポイントを示す（下記の括弧内に含有される）：
【０１３６】
【化１１】
【０１３７】
上流の接合部は、２つの新規な配列を含む。上流の接合部の一方のポイントは、以下を含み、これは、挿入されたｈＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の上流領域を含むヒトゲノム配列（下記の括弧内に含有される）と隣接するヒグロマイシンカセットのヌクレオチド配列を示す：
【０１３８】
【化１２】
【０１３９】
上流の接合部の第２のポイントは、以下を含み、これは、ヒグロマイシンカセット内のヌクレオチド配列と隣接する、欠失させた低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の上流領域由来の内因性マウス配列のヌクレオチド配列を示す（下記の括弧内に含有される）：
【０１４０】
【化１３】
【０１４１】
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の代わりに２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子（伸長プロモーター領域を欠くｈＦｃγＲＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩＩＡ）を含有するマウスは、マウスＥＳ細胞への標的ＢＡＣ ＤＮＡ（上記に記載）のエレクトロポレーションを通して生成した。ポジティブＥＳ細胞クローンは、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。次いで、ポジティブＥＳ細胞クローンは、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（下記に記載）を使用してメスマウスに移植するために使用し、２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子との内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の置き換えを含有する同腹子の子を生成した。
【０１４２】
上記に記載される標的ＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階のマウス胚の中に導入した（たとえば米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい。ｈＦｃγＲＩＩＡおよびｈＦｃγＲＩＩｌＡを有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、ｈＦｃγＲ遺伝子の存在を検出した対立遺伝子アッセイの改良法を使用して遺伝子型を同定することによって同定した（Valenzuelaら、前掲）。
【０１４３】
ｈＦｃγＲ遺伝子を有するマウスは、たとえばＥＳ細胞段階でまたは胚中で除去されていない、標的構築物によって導入された、あらゆるｌｏｘ ｎｅｏカセットを除去するために、Ｃｒｅ ｄｅｌｅｔｅｒマウス株に交配することができる（たとえば、国際特許出願公開ＷＯ ２００９／１１４４００を参照されたい）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウス中に保持される。
【０１４４】
子は、遺伝子型を同定し、ｈＦｃγＲ遺伝子についてヘテロ接合性の子は、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡのヒト化を特徴付けるために選択する。
【０１４５】
（実施例５）
ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡヒト化マウスの特徴付け
脾臓は、ヒト化ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ（伸長ＦｃγＲＩＩＡプロモーター領域を欠くヘテロ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。
【０１４６】
フローサイトメトリー。リンパ球は、特定の細胞系列についてゲーティングされ、それぞれ、マウス抗ヒトＦｃγＲＩＩ抗体（クローンＦＬＩ８．２６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウス抗ヒトＦｃγＲＩＩＩ抗体（クローン３Ｇ８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｈＦｃγＲＩＩおよびｈＦｃγＲＩＩＩの発現について分析した。それぞれのリンパ球亜集団について観察された相対的な発現（＋＋、＋）または発現なし（−）を、表２に示す。
【０１４７】
【表２】
【０１４８】
類似する実験において、脾臓は、ヒト化ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ（伸長ＦｃγＲＩＩＡプロモーター領域を欠くホモ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡホモ接合体マウスにおいてヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、またはその両方を発現する別々のリンパ球集団のパーセントを、表３に示す。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
本実施例において示されるように、実施例３に従って生成した遺伝子改変されたマウス（ヘテロ接合体およびホモ接合体遺伝子型の両方）は、ＮＫ細胞およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、血小板ではなく好中球およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＡを発現した。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞上に高度に発現された。本実施例において示されるヒトＦｃγＲ遺伝子の発現パターンは、ヒトアクセサリー細胞におけるこれらの遺伝子の発現パターンと一致している。
【０１５１】
（実施例６）
低親和性ＦｃγＲヒト化マウスの生成
部分的にヒト化された内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座（下記に記載）の中に３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を導入するために標的構築物を構築した（図６）。
【０１５２】
ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ遺伝子を含む標的構築物は、ＢＡＣ ＲＰ−２３ ３９５ｆ６およびＲＰ−１１ ６９７ｅ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変を通して、類似する方法（実施例１を参照されたい）を使用して作製した。両方のＢＡＣのＢＡＣ ＤＮＡは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ遺伝子のα鎖を、２つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子を含有する部分的にヒト化された内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の中に導入するために改変した。
【０１５３】
同様に、上流および下流の相同性アームは、それぞれ、
【０１５４】
【化１４】
【０１５５】
を用いて作製した。これらの相同性アームは、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣのα鎖をコードするＤＮＡ配列を導入したカセットを作製するために使用した。標的構築物は、欠失させた内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子座に対して５’のマウス配列を含む５’相同性アーム、ｌｏｘネオマイシン抵抗性遺伝子、それに続く、低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ α鎖遺伝子を含む、ＢＡＣ ＲＰ−１１ ６９７ｅ５由来のヒトゲノム断片、ならびに低親和性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ α鎖遺伝子に対して５’のヒト配列を含む３’相同性アームを含んだ（図６の中央）。
【０１５６】
３つのさらなる低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子の標的挿入を、ＰＣＲによって確認した（上記に記載）。完全にヒト化した座の上流領域は、
【０１５７】
【化１５】
【０１５８】
を使用して、ＰＣＲによって確認したのに対して、完全にヒト化した座の下流領域は、
【０１５９】
【化１６】
【０１６０】
を使用して確認した。下流の接合部の両端のヌクレオチド配列は、ｈＦｃγＲＩＩＡ α鎖遺伝子の上流の同じヒトゲノム配列を含んだ（実施例３を参照されたい；配列番号１９）。上流の接合部の両端のヌクレオチド配列は、以下を含み、挿入ポイントのマウス配列およびカセット配列ならびにカセット配列およびヒトゲノム配列の２つの新規な接合部を示す。ゲノムマウス配列（下記の括弧内に含有される）とｎｅｏカセット配列の上流領域との接合部は、
【０１６１】
【化１７】
【０１６２】
である。第２の新規な接合部は、ｎｅｏカセット（下記の括弧内に含有される）の３’末端とｈＦｃｇＲＩＩＢ α鎖遺伝子の下流のヒトゲノム配列との連結部を含む：
【０１６３】
【化１８】
【０１６４】
これらの接合部は、標的構築物内に、図６（中央）において示す。完全にヒト化した低親和性ＦｃγＲ遺伝子座の結果として生じる改変ゲノムを、図６（下）に示す。
【０１６５】
内因性低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子座の代わりに５つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子を含有するマウスは、マウスＥＳ細胞への標的ＢＡＣ ＤＮＡ（上記に記載）のエレクトロポレーションを通して生成した。ポジティブＥＳ細胞クローンは、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニングおよび核型分析によって確認した。次いで、ポジティブＥＳ細胞クローンをメスマウスに移植するために使用し（上記に記載）、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、５つのヒト低親和性ＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含有する同腹子の子を生じさせた。
【０１６６】
（実施例７）
低親和性ＦｃγＲヒト化マウスの特徴付け
脾臓を、完全にヒト化したＦｃγＲ（ヘテロ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。
【０１６７】
フローサイトメトリー。リンパ球は、特定の細胞系列についてゲーティングされ、それぞれ、マウス抗ヒトＦｃγＲＩＩ抗体（クローンＦＬＩ８．２６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウス抗ヒトＦｃγＲＩＩＩ抗体（クローン３Ｇ８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの発現について分析した。それぞれのリンパ球亜集団について観察された相対的な発現（＋＋、＋）または発現なし（−）を、表４に示す。
【０１６８】
【表４】
【０１６９】
類似する実験において、脾臓を、完全にヒト化したＦｃγＲ（ホモ接合体）および野生型マウスから採取し、ＦＡＣのために調製した（上記に記載）。結果を図７に示す。完全にヒト化したＦｃγＲホモ接合体マウスにおける、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＣ、またはその組合せを発現する別々のリンパ球集団のパーセントを、表５に示す。
【０１７０】
【表５】
【０１７１】
本実施例において示されるように、実施例５に従って生成した遺伝子改変マウス（ヘテロ接合体およびホモ接合体遺伝子型の両方）は、ＮＫ細胞およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、好中球上にヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、好中球およびマクロファージ上にヒトＦｃγＲＩＩＡ、Ｂ細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＢ、ならびにＮＫ細胞上にヒトＦｃγＲＩＩＣを発現した。本実施例において示されるヒトＦｃγＲ遺伝子の発現パターンは、ヒトアクセサリー細胞におけるこれらの遺伝子の発現パターンと一致している。
【０１７２】
（実施例８）
ヒト化ＦｃγＲマウスにおけるＡＤＣＣ
ＦｃγＲ遺伝子欠損（つまりノックアウト）マウス、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＡ（ホモ接合体）マウス、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ／ＦｃγＲＩＩＣ（ホモ接合体）マウス、および野生型マウスから単離した脾細胞を、細胞殺傷アッセイにおいて、ＡＤＣＣを実行するそれらの能力について分析した（実施例２において上記に記載）。
【０１７３】
手短かに言えば、細胞集団は、単離し、ＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分離した。手短かに言えば、Ｔ細胞およびＢ細胞を枯渇させた脾細胞を、マウスＩＬ−２（５００Ｕ／ｍＬ）の存在下において２週間、培養した。結果として生じる増殖させたＮＫ細胞を、５０：１（ＮＫ：ラージ）の比でＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ラージ細胞は、１０μｇ／ｍＬのＡｂ １６８またはＡｂ ７３５を用いて被覆した（実施例３において上記に記載）。結果を表６に示す。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書において記載されるものに加えての本発明の様々な改変は、先の記載および添付の図から当業者らに明白になるであろう。そのような改変は、添付した請求項の範囲内にあるように意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変を含むマウスであって、該遺伝子改変が、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、該内因性マウス低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座に配置される、少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含み、該マウスが機能的ＦｃＲ γ鎖を含む、マウス。
【請求項２】
前記少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢから選択される、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡである、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記ヒトＦｃγＲＩＩＩＡが、前記マウスのＮＫ細胞上に発現される、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
前記少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢである、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
前記ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの遺伝子が、対立遺伝子変異体または多型を含む、請求項３に記載のマウス。
【請求項７】
ヒト低親和性ＦｃγＲ対立遺伝子変異体を含み、前記対立遺伝子変異体が、（ａ）ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子変異体１３１Ｈ、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩＡ対立遺伝子変異体１５８Ｖ、（ｃ）ＦｃγＲＩＩＢ対立遺伝子変異体２３２Ｉ、（ｄ）好中球抗原２（ＮＡ２）対立遺伝子によって特徴付けられるＦｃγＲＩＩＩＢ対立遺伝子変異体、および（ｅ）それらの組合せから成る群から選択される、請求項５に記載のマウス。
【請求項８】
遺伝子改変されたマウスであって、該遺伝子改変が、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶのαサブユニットをコードする内因性マウス遺伝子の、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ αサブユニットをコードする遺伝子による置き換えを含み、該マウスが、内因性マウスＦｃＲ γサブユニットを伴うヒトＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質を発現し、該ヒトＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質がマウスＮＫ細胞の表面上に発現される、マウス。
【請求項９】
マウスＮＫ細胞が、前記マウスの血中で循環するＮＫ細胞であり、該マウスＮＫ細胞の表面上に発現される該ＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質が、ヒトＦｃまたは改変ヒトＦｃを含むイムノアドヘシンまたは抗体に結合し、該イムノアドヘシンまたは抗体が、該マウスにおける標的細胞に特異的に結合し、該ＮＫ細胞の該ＦｃγＲＩＩＩＡへの、該イムノアドヘシンまたは該抗体の結合が、該標的細胞のＮＫ細胞殺傷を媒介する、請求項８に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１０】
前記標的細胞にヒト病原体が感染しており、前記イムノアドヘシンまたは抗体が該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項９に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１１】
前記標的細胞が腫瘍細胞であり、前記イムノアドヘシンまたは抗体が該腫瘍細胞のエピトープに特異的に結合する、請求項９に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１２】
治療薬依存性の細胞殺傷を測定するための方法であって、
（ａ）遺伝子改変されたマウスに、該マウスにおけるＮＫ細胞でない標的細胞に特異的に結合する治療剤を投与するステップであって、該治療剤がヒトＦｃを含む、ステップと、
（ｂ）該マウスまたは該マウスの組織試料におけるＮＫ媒介性の標的細胞殺傷のレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記治療剤によって媒介される標的細胞殺傷の量を決定し、それによって、治療薬依存性の細胞殺傷を測定するステップと
を含み、該遺伝子改変が、マウスＦｃγＲＩＩＢのαサブユニットをコードする遺伝子の欠失、マウスＦｃγＲＩＩＩのαサブユニットをコードする遺伝子の欠失、およびマウスＦｃγＲＩＶのαサブユニットをコードする遺伝子の欠失を含み、前記マウスが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡのαサブユニットをコードする遺伝子を、内因性マウスαサブユニットの遺伝子座に含み、該マウスが機能的ＦｃＲ γ鎖サブユニットを発現する、方法。
【請求項１３】
前記マウスが、前記内因性マウスαサブユニットの遺伝子座に、ＦｃγＲＩＩＡ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＢ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＣ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＩＢ αサブユニット、およびそれらの組合せから選択されるヒトＦｃγＲ αサブユニットをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞がヒト病原体であり、前記治療薬が、該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が、ヒト病原体が感染しているマウス細胞であり、前記治療薬が、該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的細胞が、ヒト病原体が感染しているヒト細胞であり、前記治療薬が、該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的細胞が、ヒト腫瘍細胞であり、前記治療薬が、該ヒト腫瘍細胞のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織試料が血液試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療薬が抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
遺伝子改変を含むマウスであって、該遺伝子改変が、内因性低親和性ＦｃγＲ遺伝子の、該内因性マウス低親和性ＦｃγＲ遺伝子の遺伝子座に配置される、少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子による置き換えを含み、該マウスが機能的ＦｃＲ γ鎖を含む、マウス。
【請求項２】
前記少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢから選択される、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡである、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記ヒトＦｃγＲＩＩＩＡが、前記マウスのＮＫ細胞上に発現される、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
前記少なくとも２つの低親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＢである、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
前記ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの遺伝子が、対立遺伝子変異体または多型を含む、請求項３に記載のマウス。
【請求項７】
ヒト低親和性ＦｃγＲ対立遺伝子変異体を含み、前記対立遺伝子変異体が、（ａ）ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子変異体１３１Ｈ、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩＡ対立遺伝子変異体１５８Ｖ、（ｃ）ＦｃγＲＩＩＢ対立遺伝子変異体２３２Ｉ、（ｄ）好中球抗原２（ＮＡ２）対立遺伝子によって特徴付けられるＦｃγＲＩＩＩＢ対立遺伝子変異体、および（ｅ）それらの組合せから成る群から選択される、請求項５に記載のマウス。
【請求項８】
遺伝子改変されたマウスであって、該遺伝子改変が、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶのαサブユニットをコードする内因性マウス遺伝子の、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ αサブユニットをコードする遺伝子による置き換えを含み、該マウスが、内因性マウスＦｃＲ γサブユニットを伴うヒトＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質を発現し、該ヒトＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質がマウスＮＫ細胞の表面上に発現される、マウス。
【請求項９】
マウスＮＫ細胞が、前記マウスの血中で循環するＮＫ細胞であり、該マウスＮＫ細胞の表面上に発現される該ＦｃγＲＩＩＩＡタンパク質が、ヒトＦｃまたは改変ヒトＦｃを含むイムノアドヘシンまたは抗体に結合し、該イムノアドヘシンまたは抗体が、該マウスにおける標的細胞に特異的に結合し、該ＮＫ細胞の該ＦｃγＲＩＩＩＡへの、該イムノアドヘシンまたは該抗体の結合が、該標的細胞のＮＫ細胞殺傷を媒介する、請求項８に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１０】
前記標的細胞にヒト病原体が感染しており、前記イムノアドヘシンまたは抗体が該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項９に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１１】
前記標的細胞が腫瘍細胞であり、前記イムノアドヘシンまたは抗体が該腫瘍細胞のエピトープに特異的に結合する、請求項９に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１２】
治療薬依存性の細胞殺傷を測定するための方法であって、
（ａ）遺伝子改変されたマウスに、該マウスにおけるＮＫ細胞でない標的細胞に特異的に結合する治療剤を投与するステップであって、該治療剤がヒトＦｃを含む、ステップと、
（ｂ）該マウスまたは該マウスの組織試料におけるＮＫ媒介性の標的細胞殺傷のレベルを測定するステップと、
（ｃ）前記治療剤によって媒介される標的細胞殺傷の量を決定し、それによって、治療薬依存性の細胞殺傷を測定するステップと
を含み、該遺伝子改変が、マウスＦｃγＲＩＩＢのαサブユニットをコードする遺伝子の欠失、マウスＦｃγＲＩＩＩのαサブユニットをコードする遺伝子の欠失、およびマウスＦｃγＲＩＶのαサブユニットをコードする遺伝子の欠失を含み、前記マウスが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡのαサブユニットをコードする遺伝子を、内因性マウスαサブユニットの遺伝子座に含み、該マウスが機能的ＦｃＲ γ鎖サブユニットを発現する、方法。
【請求項１３】
前記マウスが、前記内因性マウスαサブユニットの遺伝子座に、ＦｃγＲＩＩＡ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＢ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＣ αサブユニット、ＦｃγＲＩＩＩＢ αサブユニット、およびそれらの組合せから選択されるヒトＦｃγＲ αサブユニットをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞がヒト病原体であり、前記治療薬が、該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が、ヒト病原体が感染しているマウス細胞であり、前記治療薬が、該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的細胞が、ヒト病原体が感染しているヒト細胞であり、前記治療薬が、該ヒト病原体のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的細胞が、ヒト腫瘍細胞であり、前記治療薬が、該ヒト腫瘍細胞のエピトープに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織試料が血液試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療薬が抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５１４７７８（Ｐ２０１３−５１４７７８Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４８６３（Ｐ２０１２−５４４８６３）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８４６６４
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８４６６４
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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