ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメント
ＭＣＰ−１が関与する免疫異常性疾患の治療に有効な物質を提供する。ファージ抗体法を用いて、ヒトＭＣＰ−１に対して高い親和性を有するｓｃＦｖを得た。当該ｓｃＦｖより得られるＶＨ鎖及びＶＬ鎖情報を基に、ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及びヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメントが得られる。当該抗体及び抗体フラグメントは、ＭＣＰ−１が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ヒトＭｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（以下、ヒトＭＣＰ−１とする）に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメントに関する。当該抗体及び抗体フラグメントは、ＭＣＰ−１が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】
ケモカインは８〜１０ｋＤａのペプチドタンパク質で、白血球の遊走や活性化において重要な役割を担っている。ケモカインはＮ末端の４つのシステイン（Ｃ）のうち最初の２つのシステインの並び方により、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカインの４つのサブグループに分けられる。ＭＣＰ−１はＣＣケモカインサブファミリーに属するケモカインで、１９８９年にヒトのグリオーマ細胞株及び単球性白血病細胞株からクローニングされた、７６アミノ酸残基からなる単球走化性因子である（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ら、“ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ”、１９８９年、第２４４巻、ｐ．４８７−４９３参照）。ＭＣＰ−１は単球、血管内皮細胞、繊維芽細胞などから産生され、単球、Ｔ細胞及び好塩基球に作用し、それらの遊走活性、活性酸素・リソソーム酵素の産生放出、サイトカイン産生誘導、好塩基球の脱顆粒、接着分子の発現誘導ヒスタミン・ロイコトリエンの産生放出などを促進する多機能な分子である。
慢性炎症を中心に疾患モデル動物を用いた解析が進められ、いくつかの炎症性疾患においてＭＣＰ−１の関与が示されている（例えば、Ｓｃｈｒｉｅｒ，ＤＪ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１９９８年、第６３巻、ｐ．３５９−３６３参照）。更に、これらの疾患モデル動物のＭＣＰ−１の活性を阻害すると、症状が抑制されることが報告されている。例えば、ラットのコラーゲン誘導性関節炎（以下、ＣＩＡと省略することがある）やアジュバント関節炎モデルで、抗ＭＣＰ−１抗体を投与すると関節炎症状が軽減され、関節炎の予防効果や治療効果があることが報告されている（例えば、Ｙｏｕｓｓｅｆ，Ｓ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、２０００年、第１０６巻、ｐ．３６１−３７１；及びＯｇａｔａ，Ｈ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、１９９７年、第１８２巻、ｐ．１０６−１１４参照）。また、関節炎を自然発症し生涯持続するＭＲＬ−ｌｐｒマウスでは、ＭＣＰ−１を投与すると関節炎が増悪するが、ＭＣＰ−１のアンタゴニストを投与すると関節炎が抑制されることが報告されている（例えば、Ｇｏｎｇ，ＪＨ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、１９９７年、第１８６巻、ｐ．１３１−１３７参照）。
また更に、ＭＣＰ−１やそのレセプターであるＣＣＲ２の遺伝子欠損マウスを用いた解析が進められ、いくつかの炎症性疾患において、病態形成に関わるマクロファージ浸潤にＭＣＰ−１／ＣＣＲ２が必須であることが示されている。例えば、自己免疫疾患マウスのＭＣＰ−１を欠損させるとマクロファージやＴ細胞の遊走が抑制され、腎・肺・皮膚などの各臓器が保護されることにより生存率が改善されることや、ＣＣＲ２遺伝子を破壊したノックアウトマウスでは実験的に腹腔に誘発した炎症に対して、マクロファージの浸潤が抑制されることが報告されている（例えば、Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｔ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、１９９７年、第１８６巻、ｐ．１７５７−１７６２参照）。また、動脈硬化モデルマウスのＭＣＰ−１、あるいはＣＣＲ２を欠損させると動脈壁のマクロファージ遊走・硬化巣形成を抑制するという報告がある（例えば、Ｇｏｓｌｉｎｇ，Ｊ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、１９９９年、第１０３巻、ｐ．７７３−７７８；及びＢｏｒｉｎｇ Ｌ．ら、“Ｎａｔｕｒｅ”、１９９８年、第３９４巻、ｐ．８９４−８９７参照）。
ヒトの疾患との関連においては、変形性関節炎と比較して慢性関節リウマチ（以下、ＲＡと省略することもある）患者では滑膜液中のＭＣＰ−１の濃度が高く、炎症性細胞浸潤ならびに炎症の誘発・増強に中心的な役割を果たしていることが示唆されている（例えば、Ａｋａｈｏｓｈｉ，Ｔ．ら、“Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ”、１９９３年、第３６巻、ｐ．７６２−７７１；及びＫｏｃｈ，ＡＥ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、１９９２年、第９０巻、ｐ．７７２−７７９参照）。また、疫学的な調査から、心筋梗塞や動脈硬化症の発症にＭＣＰ−１が関与し、ＭＣＰ−１の細胞遊走活性がリスクファクターとなることが明らかにされていることから、ＭＣＰ−１抗体を用いて細胞遊走活性を抑えることができれば、心筋梗塞や動脈硬化の予防及び治療に寄与することが期待される。
以上のようにＭＣＰ−１は慢性の炎症性疾患や動脈硬化症において、炎症性細胞の浸潤や炎症の誘発に関わっていることが明らかとなってきた。よって、ＭＣＰ−１の生物活性を中和する特異的なモノクローナル抗体を開発すれば、マクロファージ浸潤の主要な因子である疾患において有効な治療手段になることが期待される。これまでに、ＭＣＰ−１に結合するマウスやラット由来のモノクローナル抗体はいくつか取得されており、実際に抗ＭＣＰ−１モノクローナル抗体よるラット馬杉型腎炎におけるマクロファージの浸潤抑制、ラット肺高血圧モデルにおけるマクロファージの浸潤抑制・右心室圧上昇抑制・肺細動脈内膜肥厚の抑制等が報告されている（例えば、Ｗａｄａ，Ｔ．ら、“ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ”、１９９６年、第１０巻、ｐ．１４１８−１４２５；及びＫｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、“Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．”、１９９８年、第７８巻、ｐ．５７１−５８１参照）。
【発明の開示】
（発明が解決しようとする技術的課題）
しかしながら、上記抗ＭＣＰ−１モノクローナル抗体は異種動物由来のモノクローナル抗体であるため、ヒトに対して投与した場合は異物として認識・排除され、薬剤として利用することは困難である。とりわけＲＡのような慢性の自己免疫性疾患の治療では、長期間の継続投与が行われるので、投与抗体に対する抗体の出現が問題となる。この問題点を解決する方策として、ヒト由来の抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体の取得法が知られている（例えば、特開平９−６７３９９号公報参照）。すなわち、抗ヒトＭＣＰ−１抗体を産生するヒトリンパ球をエプスタイン・バー・ウィルス（以下、ＥＢＶと省略することがある）で形質転換し、得られた形質転換細胞とヒトミエローマ細胞とを細胞融合したハイブリドーマからヒト抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体が得られている。しかしながらここで得られた抗体はＩｇＭ抗体であるので、ＩｇＧ抗体と比較して高い親和性は得にくく、また取り扱いも不便である。またＥＢＶ形質転換細胞では抗体産生量が少なく、実用的に応用する上でも問題が多い。更に、特開平９−６７３９９号公報に記載のヒトＭＣＰ−１に対するＩｇＭ抗体は、ヒトＭＣＰ−１との結合性は明記されているが、中和活性は明らかにされていない。
上記の方法以外にヒトＭＣＰ−１に対するマウスモノクローナル抗体を、遺伝子工学的手法を用いてヒト型化することも可能である。しかしながら、ヒト型化抗体でも、慢性疾患患者に対する繰り返し投与や長期投与した際に、抗ヒトＭＣＰ−１抗体の活性を阻害するような抗体（阻止抗体）が作り出される可能性も否定できなかった。
（その解決方法）
このような状況を鑑み、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、健常人の末梢血Ｂリンパ球より調製した免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を材料として構築したファージ提示ライブラリーから取得した、完全ヒト抗ヒトＭＣＰ−１一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子を取得し、そのＶＨ鎖及びＶＬ鎖を明らかにした。当該ヒト抗体の配列情報を用いて作製される完全ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメントは、ヒトＭＣＰ−１に結合してその生物活性を阻害し、炎症性疾患の予防・治療用として提供されるものである。
（従来技術より有効な効果）
このように、本発明のヒトＭＣＰ−１に対するヒト由来ｓｃＦｖは、ヒトＭＣＰ−１と特異的に結合し、ヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を阻害するものであることが示された。従って、当該ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖのＶＨ鎖及びＶＬ鎖をヒト定常領域またはその一部と結合させたヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体またはその抗体フラグメントは、ヒトＭＣＰ−１の関与する疾患、例えば慢性炎症性疾患や動脈硬化症等の治療への適用が期待される。また、ヒトＭＣＰ−１とは結合するが抑制作用を示さなかった抗体を含めてこれらの抗体で、ヒトＭＣＰ−１の血中濃度を測定し、病態の症状の変動をモニターすることもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、分離クローンのｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１への特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
図２は、精製したヒト由来ｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１との結合性をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。
図３は、ヒトＭＣＰ−１によるヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１の細胞遊走をｓｃＦｖが阻害することを示すグラフである。
図４は、精製完全分子型ＭＣ３２のＨＰＬＣパターンを示す（流速：０．５ｍＬ／分；開始バッファー：１００ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．２＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）。
図５は、精製完全分子型ＭＣ３２のＭＣＰ−１との結合性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のヒトＭＣＰ−１と結合するヒト抗体及び該抗体フラグメントは、例えば以下のようにして作製することができる。
健常人の末梢血Ｂリンパ球よりｍＲＮＡを抽出し、免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を、その両端を規定するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、多様な配列を有するＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域集団を得る。次に更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のランダムな組み合わせによる多様なｓｃＦｖ ＤＮＡ集団を調製する。得られたｓｃＦｖ ＤＮＡをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、ｓｃＦｖ提示ファージライブラリーを作製する。このライブラリーをプラスチックチューブに固相化したヒトＭＣＰ−１と反応させ、洗浄により未反応のｓｃＦｖ提示ファージを除去した後に、ヒトＭＣＰ−１と結合しているｓｃＦｖファージクローンを酸で溶出する。分離したファージクローンからｓｃＦｖ ＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養して目的のｓｃＦｖ蛋白のみを得ることができる。
ｓｃＦｖ ＤＮＡの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーターを用い、抗体分泌のためのシグナル配列等を、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，ＳＰ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１６９：４３７９−４３８３）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
前記のように発現されたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にＥ ｔａｇ配列が付加されているので、抗Ｅ ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。
本発明により得られたｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＭＣＰ−１に対する結合活性を有することが明らかになった。本発明で使用される抗ヒトＭＣＰ−１抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＭＣＰ−１を固相化した９６穴プレートに目的の抗ヒトＭＣＰ−１抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質ＴＭＢＺを加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
さらにまた、本発明により得られたｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＭＣＰ−１の有する細胞遊走活性を阻害することが明らかとなった。ヒトＭＣＰ−１による感受性細胞の遊走（ケモタキシス）は、通常用いられるケモタキシスアッセイ、例えばＧｒｏｂらの方法（Ｇｒｏｂ．ＰＭ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５：８３１１−８３１６）を用いて調べることができる。具体的には市販されているケモタキシスチャンバーを用い、抗ヒトＭＣＰ−１抗体とヒトＭＣＰ−１を培養液、例えば、ＲＰＭＩ １６４０で各々希釈して混合し、室温で一定時間インキュベーションを行い、この混合液をフィルターで仕切られたチャンバーの下層に添加する。次いでヒトＭＣＰ−１感受性細胞懸濁液、例えば、単球系の細胞株ＴＨＰ−１、あるいはヒト末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと省略することがある）をチャンバーの上層に添加して３７℃で一定時間放置する。遊走する細胞はチャンバーに装着されたフィルターを通過して下層に移動するので、フィルターに付着した細胞をギムザ染色液等で染色して細胞数をカウントすればよい。あるいは下層に移動した細胞数をコールターカウンター等でカウントしてもよい。また、チャンバーに代わり、ディスポーザブルのケモタキシスアッセイ用のセルが市販されているので、それを使用してもよい。このケモタキシスアッセイ系で、本発明のｓｃＦｖ蛋白はヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を阻害することが明らかとなった。
このように、本発明により得られるｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を濃度依存的に阻害することから、当該細胞遊走により惹起される疾患の予防または治療に有効であると期待される。
上記阻害活性を有するｓｃＦｖクローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、配列番号１及び２（ＶＨ鎖）、及び配列番号６及び７（ＶＬ鎖）にそれぞれ示す。
さらに、上記配列中、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列を下記に示す。
［ＶＨ鎖］
［ＶＬ鎖］
また、本発明のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、上記のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものをも包含する。
本発明で開示されるヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体のＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いてｓｃＦｖの形で得られたものであるが、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常部と連結した完全分子型ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体、またヒト免疫グロブリンの定常部の一部と組み合わせたＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２等のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメント、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンの定常部と結合させたヒト抗ヒトＭＣＰ−１一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）などの他のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメント、並びにこれら抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子断片をも本発明は包含する。また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も本発明に包含される。Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたｓｃＦｖを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１０〜２５残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【産業上の利用の可能性】
以上より、本発明のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗ヒトＭＣＰ−１抗体の可変領域を有し、ヒトＭＣＰ−１と強く反応して、ヒトＭＣＰ−１とヒトＭＣＰ−１受容体間の結合に阻害作用を示す。さらに、本発明のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメント分子は、ヒトＭＣＰ−１によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができ、当該免疫応答により惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬、例えば抗炎症剤あるいは自己免疫疾患の治療及び予防のための薬剤として使用することができる。さらに、本発明の抗体及び抗体フラグメントは心筋梗塞や動脈硬化の予防及び治療に寄与することが期待される。
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。
すなわち、健常者２０名由来末梢血よりＦｉｃｏｌを用いた比重遠心法にてリンパ球を分離し、ＰＢＳで充分に洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で処理して、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。このｔｏｔａｌ ＲＮＡを４つに分割し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、κ鎖、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを使用し、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）にて、それぞれのｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートにして、Ｍａｒｋｓらが報告したのと同様にＶＨ（γまたはμ）とＪＨ及びＶκとＪκ、ＶλとＪλの組合せで各ジーンファミリーに特異的なプライマーを用いて、それぞれの抗体Ｖ領域遺伝子をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて増幅した。
更に、ＶＨ（γまたはμ）とＶκ、及びＶＨ（γまたはμ）とＶλをリンカーＤＮＡを用いて、アッセンブリーＰＣＲ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ら：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６）により結合させ、一本鎖ｓｃＦｖ ＤＮＡを作製した。ｓｃＦｖ ＤＮＡは更にＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位を付加し、アガロースゲルで電気泳動後、精製した。精製したｓｃＦｖ ＤＮＡは制限酵素ＳｆｉＩ（Ｔａｋａｒａ）とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で消化後、ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ＳＣＦｖ ＤＮＡを結合させたｐＣＡＮＴＡＢ５ＥはＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ毎にエレクトロポレイションにより大腸菌ＴＧ１に導入した。形質転換したＴＧ１の数から、ＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ１．１×１０８、２．１×１０８、８．４×１０７、５．３×１０７クローンの多様性を有すると評価された。この形質転換したＴＧ１から、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてファージ抗体を発現し、健常人由来ｓｃＦｖ提示ファージライブラリーを調製した。
《実施例２：パンニング》
ヒトＭＣＰ−１は０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３１ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディッシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。０．５％ゼラチン／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄した。これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を０．９ｍＬ（１×１０１２ｔｕ／ｍＬ）加え、反応させた。
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、１．０ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ヒトＭＣＰ−１と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ９．１を加えてｐＨを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ，１０分で遠心分離して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Ｃｏｓｔａｒ）を使って懸濁、回収した。
このＴＧ１液５０μＬを、３０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファージライブラリーＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれについて前述のヒトＭＣＰ−１固定化プレートを用いてパンニングを計４回行った。４回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認及びヒトＭＣＰ−１ ＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。
《実施例３：スクリーニング ヒトＭＣＰ−１ ＥＬＩＳＡ》
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ヒトＭＣＰ−１及びヒトＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １−α）をＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。２μｇ／ｍＬのヒトＭＣＰ−１或いはヒトＭＩＰ−１α、２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を４０μＬ／ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチン及び５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌを入れて４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液４０μＬ／ｗｅｌｌを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１ｇ／ｍＬ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ）、１０％ジエタノールアミン（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーＮＪ−２００１（Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、ヒトＭＣＰ−１に特異的であることが確認できた（図１）。
《実施例４：クローンの配列分析》
単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ塩基配列をＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した（配列番号１及び配列番号６）。ＥＬＩＳＡ及び配列分析の結果、単離したクローンは４種に分類された。
《実施例５：ヒト由来抗ヒトＭＣＰ−１ ｓｃＦｖの発現と精製》
前記実施例２、３で単離したヒトＭＣＰ−１に反応する４種のｓｃＦｖクローン、ＭＣ８、ＭＣ１５、ＭＣ３２、ＭＣ５９からプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌ＨＢ１２５１を形質転換した。２％グルコースを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１ｍＭ ＩＰＴＧを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで８，９００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのｓｃＦｖの精製出発材料とした。
このようにして調製した精製の出発材料を、抗Ｅ ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラムＤｅｔｏｘｉ−ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ社）で添付のプロトコルに従いエンドトキシンを除去した。分子量カット１０，０００のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ社）で濃縮後、０．４５μｍフィルター濾過して精製標品とした。
《実施例６：精製ｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１との結合性》
次に精製ｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１との結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに調製したヒトＭＣＰ−１を固相化した９６穴プレート（ＮＵＮＣ．ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に、精製抗体を１００μＬ加えて３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと省略することもある）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗Ｅ ｔａｇ抗体と更に３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図２に示す。４種の抗体は全て濃度依存的にヒトＭＣＰ−１と結合した。
《実施例７：ヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性に対する作用》
ヒトＭＣＰ−１の単球に対する遊走活性の阻害効果をケモタキシスアッセイ法にて調べた。２４穴プレートの各穴にポアサイズ８μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｓｔａｒ社）をセットする。この２４穴プレートに１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０（以下１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩと省略することもある）培地を５４０μＬ加えた。次に、濃度調製したｓｃＦｖと２ｘ１０−８ＭのヒトＭＣＰ−１（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を当量混合して室温で３０分インキュベーションを行い、この反応液を５４０μＬの培地を入れた２４穴プレートに６０μＬ加えた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの方に１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １００μＬとヒト単球系の細胞株ＴＨＰ−１の１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ２００μＬを添加して、３７℃で４時間放置した。８μｍのフィルターで仕切られた上方のＴｒａｎｓｗｅｌｌに細胞が、下方の２４穴プレートに抗体の混合液が設置されることになる。フィルターを通過して２４穴に遊走してくる細胞をコールターカウンター（コールター社）で計測した。アッセイ結果を図３に示す。４種の抗体の中でＭＣ１５及びＭＣ３２にはヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を阻害する効果が認められた。
《実施例８：抗ＭＣＰ−１完全分子型ヒト抗体発現プラスミドの構築》
実施例３で分離したｓｃＦｖクローンＭＣ３２のｓｃＦｖ ＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドよりＰＣＲ法にてＶＨ鎖およびＶＬ鎖領域を各々増幅した。増幅に用いたＰＣＲプライマーを以下に示す。
［ＶＨセンス鎖］
［ＶＨアンチセンス鎖］
［ＶＬセンス鎖］
［ＶＬアンチセンス鎖］
増幅されてきたＶＨ鎖、ＶＬ鎖の各々のＤＮＡは動物細胞での分泌発現に必要なリーダー配列を組み込んだプラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１８のリーダー配列の下流にクローニングした。
このようにして得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）−ＢａｍＨＩで３７℃にて２時間消化し、２％アガロースゲル（タカラバイオ社）電気泳動を行ってシグナル配列を含むＶＨ鎖、ＶＬ鎖のＤＮＡ断片を回収した。
ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子ＩｇＧ１の定常領域（ヒンジ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を組み込んだ発現プラスミドｐＣＡＧ−ＨをＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩで３７℃にて２時間消化してベクターのＤＮＡ断片を調製し、この部位に先に調製したＶＨ鎖のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を挿入した。大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、薬剤（アンピシリン）耐性のコロニーからプラスミドを調製して、制限酵素処理によりＶＨ鎖が挿入されていることを確認した。
同様に、ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子κ鎖の定常領域（Ｃκ）を組み込んだ発現プラスミドｐＣＡＧ−Ｌに、ＶＬ鎖を挿入した。
《実施例９：抗ＭＣＰ−１完全分子型ヒト抗体ＭＣ３２の動物細胞での一過性発現と精製》
一過性発現にはＢＭＴ−１０細胞を用いた。
８％ＦＣＳ（インビトロジェン社）入りＤ’ＭＥＭ（インビトロジェン社）で維持したＢＭＴ−１０細胞を、滅菌済み小シャーレ（直径６ｃｍ；コーニング社）に、細胞濃度を１．５ｘ１０５／ｍＬに調製して５ｍＬずつ分注し、炭酸ガス孵卵期で３７℃で一夜培養した。ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社）で細胞を２回洗浄後、低血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）５ｍＬに置換した。ポリスチレン製のディスポ遠心管（ＦＡＬＣＯＮ製）を２本準備し、１本に１０μＬのリポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）と９０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を混合した（以下、リポフェクトアミン液）。もう１本に先に調製したＨ鎖、Ｌ鎖の発現プラスミドＤＮＡを各々３μｇ加え、更に１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭを加えて混合した（以下、ＤＮＡ液）。ＤＮＡ液をリポフェクトアミン液に１滴ずつ加えて混合し、室温で３０分間反応させた。反応後の溶液を１滴ずつ全量（２００μＬ）シャーレに添加し、炭酸ガス孵卵期で３７℃、６時間培養した。６時間後に培地を吸引除去し、８％ＦＣＳ入りＤ’ＭＥＭを静かに加えて３７℃で４日間培養した。４日後に上清を回収し、０．２２μｍフィルター濾過して精製用の出発材料とした。
Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗの精製システム（ＢＩＯ ＲＡＤ社）、およびプロテインＧカラム（ファルマシア社）を用いて定法に従って精製した。
すなわち、プロテインＧカラムをＰＢＳで平衡化後、上記の培養上清５０ｍＬを流速１ｍＬ／分でアプライした。ゲルベッドの５０倍量のＰＢＳで洗浄後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出させた。ＥＴフリーのディスポーザブルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ ２０６３等）に、中和用としてあらかじめ５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０を加えておき、これに１ｍＬずつ溶出液を回収した。すぐに分光光度計で各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、主要なフラクションをプールして（通常２ｍＬ）ＰＢＳにて４℃で一夜透析した。精製抗体の純度検定はＧ３０００ＳＷカラム（トーソー社）を用いたＨＰＬＣ、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。ＨＰＬＣの結果の一例を図４に示す（流速：０．５ｍＬ／分；開始バッファー：１００ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．２＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）。
《実施例１０：精製完全分子型ＭＣ３２抗体のＭＣＰ−１との結合性》
ＥＬＩＳＡ法により精製完全分子型ＭＣ３２抗体のＭＣＰ−１との結合性を評価した。ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに調製したヒトＭＣＰ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を固定化した９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｎｕｎｃ社）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後に、精製した抗ＭＣＰ−１完全分子型ＭＣ３２を５ｕｇ／ｍＬから１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで２倍段階希釈して用いた。３７℃で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで５回洗浄して、パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と更に３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色基質ＴＭＢＺを加えて呈色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図５に示す。精製完全分子型ＭＣ３２抗体はｓｃＦｖと同様に濃度依存性にＭＣＰ−１と結合した。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、ヒトＭｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（以下、ヒトＭＣＰ−１とする）に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメントに関する。当該抗体及び抗体フラグメントは、ＭＣＰ−１が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】
ケモカインは８〜１０ｋＤａのペプチドタンパク質で、白血球の遊走や活性化において重要な役割を担っている。ケモカインはＮ末端の４つのシステイン（Ｃ）のうち最初の２つのシステインの並び方により、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカインの４つのサブグループに分けられる。ＭＣＰ−１はＣＣケモカインサブファミリーに属するケモカインで、１９８９年にヒトのグリオーマ細胞株及び単球性白血病細胞株からクローニングされた、７６アミノ酸残基からなる単球走化性因子である（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ら、“ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ”、１９８９年、第２４４巻、ｐ．４８７−４９３参照）。ＭＣＰ−１は単球、血管内皮細胞、繊維芽細胞などから産生され、単球、Ｔ細胞及び好塩基球に作用し、それらの遊走活性、活性酸素・リソソーム酵素の産生放出、サイトカイン産生誘導、好塩基球の脱顆粒、接着分子の発現誘導ヒスタミン・ロイコトリエンの産生放出などを促進する多機能な分子である。
慢性炎症を中心に疾患モデル動物を用いた解析が進められ、いくつかの炎症性疾患においてＭＣＰ−１の関与が示されている（例えば、Ｓｃｈｒｉｅｒ，ＤＪ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１９９８年、第６３巻、ｐ．３５９−３６３参照）。更に、これらの疾患モデル動物のＭＣＰ−１の活性を阻害すると、症状が抑制されることが報告されている。例えば、ラットのコラーゲン誘導性関節炎（以下、ＣＩＡと省略することがある）やアジュバント関節炎モデルで、抗ＭＣＰ−１抗体を投与すると関節炎症状が軽減され、関節炎の予防効果や治療効果があることが報告されている（例えば、Ｙｏｕｓｓｅｆ，Ｓ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、２０００年、第１０６巻、ｐ．３６１−３７１；及びＯｇａｔａ，Ｈ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、１９９７年、第１８２巻、ｐ．１０６−１１４参照）。また、関節炎を自然発症し生涯持続するＭＲＬ−ｌｐｒマウスでは、ＭＣＰ−１を投与すると関節炎が増悪するが、ＭＣＰ−１のアンタゴニストを投与すると関節炎が抑制されることが報告されている（例えば、Ｇｏｎｇ，ＪＨ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、１９９７年、第１８６巻、ｐ．１３１−１３７参照）。
また更に、ＭＣＰ−１やそのレセプターであるＣＣＲ２の遺伝子欠損マウスを用いた解析が進められ、いくつかの炎症性疾患において、病態形成に関わるマクロファージ浸潤にＭＣＰ−１／ＣＣＲ２が必須であることが示されている。例えば、自己免疫疾患マウスのＭＣＰ−１を欠損させるとマクロファージやＴ細胞の遊走が抑制され、腎・肺・皮膚などの各臓器が保護されることにより生存率が改善されることや、ＣＣＲ２遺伝子を破壊したノックアウトマウスでは実験的に腹腔に誘発した炎症に対して、マクロファージの浸潤が抑制されることが報告されている（例えば、Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｔ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、１９９７年、第１８６巻、ｐ．１７５７−１７６２参照）。また、動脈硬化モデルマウスのＭＣＰ−１、あるいはＣＣＲ２を欠損させると動脈壁のマクロファージ遊走・硬化巣形成を抑制するという報告がある（例えば、Ｇｏｓｌｉｎｇ，Ｊ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、１９９９年、第１０３巻、ｐ．７７３−７７８；及びＢｏｒｉｎｇ Ｌ．ら、“Ｎａｔｕｒｅ”、１９９８年、第３９４巻、ｐ．８９４−８９７参照）。
ヒトの疾患との関連においては、変形性関節炎と比較して慢性関節リウマチ（以下、ＲＡと省略することもある）患者では滑膜液中のＭＣＰ−１の濃度が高く、炎症性細胞浸潤ならびに炎症の誘発・増強に中心的な役割を果たしていることが示唆されている（例えば、Ａｋａｈｏｓｈｉ，Ｔ．ら、“Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ”、１９９３年、第３６巻、ｐ．７６２−７７１；及びＫｏｃｈ，ＡＥ．ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ”、１９９２年、第９０巻、ｐ．７７２−７７９参照）。また、疫学的な調査から、心筋梗塞や動脈硬化症の発症にＭＣＰ−１が関与し、ＭＣＰ−１の細胞遊走活性がリスクファクターとなることが明らかにされていることから、ＭＣＰ−１抗体を用いて細胞遊走活性を抑えることができれば、心筋梗塞や動脈硬化の予防及び治療に寄与することが期待される。
以上のようにＭＣＰ−１は慢性の炎症性疾患や動脈硬化症において、炎症性細胞の浸潤や炎症の誘発に関わっていることが明らかとなってきた。よって、ＭＣＰ−１の生物活性を中和する特異的なモノクローナル抗体を開発すれば、マクロファージ浸潤の主要な因子である疾患において有効な治療手段になることが期待される。これまでに、ＭＣＰ−１に結合するマウスやラット由来のモノクローナル抗体はいくつか取得されており、実際に抗ＭＣＰ−１モノクローナル抗体よるラット馬杉型腎炎におけるマクロファージの浸潤抑制、ラット肺高血圧モデルにおけるマクロファージの浸潤抑制・右心室圧上昇抑制・肺細動脈内膜肥厚の抑制等が報告されている（例えば、Ｗａｄａ，Ｔ．ら、“ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ”、１９９６年、第１０巻、ｐ．１４１８−１４２５；及びＫｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、“Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．”、１９９８年、第７８巻、ｐ．５７１−５８１参照）。
【発明の開示】
（発明が解決しようとする技術的課題）
しかしながら、上記抗ＭＣＰ−１モノクローナル抗体は異種動物由来のモノクローナル抗体であるため、ヒトに対して投与した場合は異物として認識・排除され、薬剤として利用することは困難である。とりわけＲＡのような慢性の自己免疫性疾患の治療では、長期間の継続投与が行われるので、投与抗体に対する抗体の出現が問題となる。この問題点を解決する方策として、ヒト由来の抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体の取得法が知られている（例えば、特開平９−６７３９９号公報参照）。すなわち、抗ヒトＭＣＰ−１抗体を産生するヒトリンパ球をエプスタイン・バー・ウィルス（以下、ＥＢＶと省略することがある）で形質転換し、得られた形質転換細胞とヒトミエローマ細胞とを細胞融合したハイブリドーマからヒト抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル抗体が得られている。しかしながらここで得られた抗体はＩｇＭ抗体であるので、ＩｇＧ抗体と比較して高い親和性は得にくく、また取り扱いも不便である。またＥＢＶ形質転換細胞では抗体産生量が少なく、実用的に応用する上でも問題が多い。更に、特開平９−６７３９９号公報に記載のヒトＭＣＰ−１に対するＩｇＭ抗体は、ヒトＭＣＰ−１との結合性は明記されているが、中和活性は明らかにされていない。
上記の方法以外にヒトＭＣＰ−１に対するマウスモノクローナル抗体を、遺伝子工学的手法を用いてヒト型化することも可能である。しかしながら、ヒト型化抗体でも、慢性疾患患者に対する繰り返し投与や長期投与した際に、抗ヒトＭＣＰ−１抗体の活性を阻害するような抗体（阻止抗体）が作り出される可能性も否定できなかった。
（その解決方法）
このような状況を鑑み、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、健常人の末梢血Ｂリンパ球より調製した免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を材料として構築したファージ提示ライブラリーから取得した、完全ヒト抗ヒトＭＣＰ−１一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子を取得し、そのＶＨ鎖及びＶＬ鎖を明らかにした。当該ヒト抗体の配列情報を用いて作製される完全ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメントは、ヒトＭＣＰ−１に結合してその生物活性を阻害し、炎症性疾患の予防・治療用として提供されるものである。
（従来技術より有効な効果）
このように、本発明のヒトＭＣＰ−１に対するヒト由来ｓｃＦｖは、ヒトＭＣＰ−１と特異的に結合し、ヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を阻害するものであることが示された。従って、当該ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖのＶＨ鎖及びＶＬ鎖をヒト定常領域またはその一部と結合させたヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体またはその抗体フラグメントは、ヒトＭＣＰ−１の関与する疾患、例えば慢性炎症性疾患や動脈硬化症等の治療への適用が期待される。また、ヒトＭＣＰ−１とは結合するが抑制作用を示さなかった抗体を含めてこれらの抗体で、ヒトＭＣＰ−１の血中濃度を測定し、病態の症状の変動をモニターすることもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、分離クローンのｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１への特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
図２は、精製したヒト由来ｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１との結合性をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。
図３は、ヒトＭＣＰ−１によるヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１の細胞遊走をｓｃＦｖが阻害することを示すグラフである。
図４は、精製完全分子型ＭＣ３２のＨＰＬＣパターンを示す（流速：０．５ｍＬ／分；開始バッファー：１００ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．２＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）。
図５は、精製完全分子型ＭＣ３２のＭＣＰ−１との結合性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のヒトＭＣＰ−１と結合するヒト抗体及び該抗体フラグメントは、例えば以下のようにして作製することができる。
健常人の末梢血Ｂリンパ球よりｍＲＮＡを抽出し、免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を、その両端を規定するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、多様な配列を有するＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域集団を得る。次に更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のランダムな組み合わせによる多様なｓｃＦｖ ＤＮＡ集団を調製する。得られたｓｃＦｖ ＤＮＡをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、ｓｃＦｖ提示ファージライブラリーを作製する。このライブラリーをプラスチックチューブに固相化したヒトＭＣＰ−１と反応させ、洗浄により未反応のｓｃＦｖ提示ファージを除去した後に、ヒトＭＣＰ−１と結合しているｓｃＦｖファージクローンを酸で溶出する。分離したファージクローンからｓｃＦｖ ＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養して目的のｓｃＦｖ蛋白のみを得ることができる。
ｓｃＦｖ ＤＮＡの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーターを用い、抗体分泌のためのシグナル配列等を、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，ＳＰ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１６９：４３７９−４３８３）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
前記のように発現されたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にＥ ｔａｇ配列が付加されているので、抗Ｅ ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。
本発明により得られたｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＭＣＰ−１に対する結合活性を有することが明らかになった。本発明で使用される抗ヒトＭＣＰ−１抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＭＣＰ−１を固相化した９６穴プレートに目的の抗ヒトＭＣＰ−１抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質ＴＭＢＺを加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
さらにまた、本発明により得られたｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＭＣＰ−１の有する細胞遊走活性を阻害することが明らかとなった。ヒトＭＣＰ−１による感受性細胞の遊走（ケモタキシス）は、通常用いられるケモタキシスアッセイ、例えばＧｒｏｂらの方法（Ｇｒｏｂ．ＰＭ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５：８３１１−８３１６）を用いて調べることができる。具体的には市販されているケモタキシスチャンバーを用い、抗ヒトＭＣＰ−１抗体とヒトＭＣＰ−１を培養液、例えば、ＲＰＭＩ １６４０で各々希釈して混合し、室温で一定時間インキュベーションを行い、この混合液をフィルターで仕切られたチャンバーの下層に添加する。次いでヒトＭＣＰ−１感受性細胞懸濁液、例えば、単球系の細胞株ＴＨＰ−１、あるいはヒト末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと省略することがある）をチャンバーの上層に添加して３７℃で一定時間放置する。遊走する細胞はチャンバーに装着されたフィルターを通過して下層に移動するので、フィルターに付着した細胞をギムザ染色液等で染色して細胞数をカウントすればよい。あるいは下層に移動した細胞数をコールターカウンター等でカウントしてもよい。また、チャンバーに代わり、ディスポーザブルのケモタキシスアッセイ用のセルが市販されているので、それを使用してもよい。このケモタキシスアッセイ系で、本発明のｓｃＦｖ蛋白はヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を阻害することが明らかとなった。
このように、本発明により得られるｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を濃度依存的に阻害することから、当該細胞遊走により惹起される疾患の予防または治療に有効であると期待される。
上記阻害活性を有するｓｃＦｖクローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、配列番号１及び２（ＶＨ鎖）、及び配列番号６及び７（ＶＬ鎖）にそれぞれ示す。
さらに、上記配列中、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列を下記に示す。
［ＶＨ鎖］
［ＶＬ鎖］
また、本発明のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、上記のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものをも包含する。
本発明で開示されるヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体のＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いてｓｃＦｖの形で得られたものであるが、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常部と連結した完全分子型ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体、またヒト免疫グロブリンの定常部の一部と組み合わせたＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２等のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメント、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンの定常部と結合させたヒト抗ヒトＭＣＰ−１一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）などの他のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメント、並びにこれら抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子断片をも本発明は包含する。また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も本発明に包含される。Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたｓｃＦｖを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１０〜２５残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【産業上の利用の可能性】
以上より、本発明のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗ヒトＭＣＰ−１抗体の可変領域を有し、ヒトＭＣＰ−１と強く反応して、ヒトＭＣＰ−１とヒトＭＣＰ−１受容体間の結合に阻害作用を示す。さらに、本発明のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及び該抗体フラグメント分子は、ヒトＭＣＰ−１によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができ、当該免疫応答により惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬、例えば抗炎症剤あるいは自己免疫疾患の治療及び予防のための薬剤として使用することができる。さらに、本発明の抗体及び抗体フラグメントは心筋梗塞や動脈硬化の予防及び治療に寄与することが期待される。
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。
すなわち、健常者２０名由来末梢血よりＦｉｃｏｌを用いた比重遠心法にてリンパ球を分離し、ＰＢＳで充分に洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で処理して、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。このｔｏｔａｌ ＲＮＡを４つに分割し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、κ鎖、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを使用し、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）にて、それぞれのｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートにして、Ｍａｒｋｓらが報告したのと同様にＶＨ（γまたはμ）とＪＨ及びＶκとＪκ、ＶλとＪλの組合せで各ジーンファミリーに特異的なプライマーを用いて、それぞれの抗体Ｖ領域遺伝子をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて増幅した。
更に、ＶＨ（γまたはμ）とＶκ、及びＶＨ（γまたはμ）とＶλをリンカーＤＮＡを用いて、アッセンブリーＰＣＲ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ら：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６）により結合させ、一本鎖ｓｃＦｖ ＤＮＡを作製した。ｓｃＦｖ ＤＮＡは更にＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位を付加し、アガロースゲルで電気泳動後、精製した。精製したｓｃＦｖ ＤＮＡは制限酵素ＳｆｉＩ（Ｔａｋａｒａ）とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で消化後、ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ＳＣＦｖ ＤＮＡを結合させたｐＣＡＮＴＡＢ５ＥはＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ毎にエレクトロポレイションにより大腸菌ＴＧ１に導入した。形質転換したＴＧ１の数から、ＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ１．１×１０８、２．１×１０８、８．４×１０７、５．３×１０７クローンの多様性を有すると評価された。この形質転換したＴＧ１から、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてファージ抗体を発現し、健常人由来ｓｃＦｖ提示ファージライブラリーを調製した。
《実施例２：パンニング》
ヒトＭＣＰ−１は０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３１ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディッシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。０．５％ゼラチン／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄した。これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を０．９ｍＬ（１×１０１２ｔｕ／ｍＬ）加え、反応させた。
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、１．０ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ヒトＭＣＰ−１と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ９．１を加えてｐＨを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ，１０分で遠心分離して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Ｃｏｓｔａｒ）を使って懸濁、回収した。
このＴＧ１液５０μＬを、３０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファージライブラリーＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれについて前述のヒトＭＣＰ−１固定化プレートを用いてパンニングを計４回行った。４回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認及びヒトＭＣＰ−１ ＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。
《実施例３：スクリーニング ヒトＭＣＰ−１ ＥＬＩＳＡ》
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ヒトＭＣＰ−１及びヒトＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １−α）をＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。２μｇ／ｍＬのヒトＭＣＰ−１或いはヒトＭＩＰ−１α、２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を４０μＬ／ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチン及び５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌを入れて４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液４０μＬ／ｗｅｌｌを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１ｇ／ｍＬ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ）、１０％ジエタノールアミン（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーＮＪ−２００１（Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、ヒトＭＣＰ−１に特異的であることが確認できた（図１）。
《実施例４：クローンの配列分析》
単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ塩基配列をＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した（配列番号１及び配列番号６）。ＥＬＩＳＡ及び配列分析の結果、単離したクローンは４種に分類された。
《実施例５：ヒト由来抗ヒトＭＣＰ−１ ｓｃＦｖの発現と精製》
前記実施例２、３で単離したヒトＭＣＰ−１に反応する４種のｓｃＦｖクローン、ＭＣ８、ＭＣ１５、ＭＣ３２、ＭＣ５９からプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌ＨＢ１２５１を形質転換した。２％グルコースを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１ｍＭ ＩＰＴＧを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで８，９００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのｓｃＦｖの精製出発材料とした。
このようにして調製した精製の出発材料を、抗Ｅ ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラムＤｅｔｏｘｉ−ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ社）で添付のプロトコルに従いエンドトキシンを除去した。分子量カット１０，０００のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ社）で濃縮後、０．４５μｍフィルター濾過して精製標品とした。
《実施例６：精製ｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１との結合性》
次に精製ｓｃＦｖのヒトＭＣＰ−１との結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに調製したヒトＭＣＰ−１を固相化した９６穴プレート（ＮＵＮＣ．ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に、精製抗体を１００μＬ加えて３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと省略することもある）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗Ｅ ｔａｇ抗体と更に３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図２に示す。４種の抗体は全て濃度依存的にヒトＭＣＰ−１と結合した。
《実施例７：ヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性に対する作用》
ヒトＭＣＰ−１の単球に対する遊走活性の阻害効果をケモタキシスアッセイ法にて調べた。２４穴プレートの各穴にポアサイズ８μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｓｔａｒ社）をセットする。この２４穴プレートに１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０（以下１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩと省略することもある）培地を５４０μＬ加えた。次に、濃度調製したｓｃＦｖと２ｘ１０−８ＭのヒトＭＣＰ−１（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を当量混合して室温で３０分インキュベーションを行い、この反応液を５４０μＬの培地を入れた２４穴プレートに６０μＬ加えた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの方に１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １００μＬとヒト単球系の細胞株ＴＨＰ−１の１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ２００μＬを添加して、３７℃で４時間放置した。８μｍのフィルターで仕切られた上方のＴｒａｎｓｗｅｌｌに細胞が、下方の２４穴プレートに抗体の混合液が設置されることになる。フィルターを通過して２４穴に遊走してくる細胞をコールターカウンター（コールター社）で計測した。アッセイ結果を図３に示す。４種の抗体の中でＭＣ１５及びＭＣ３２にはヒトＭＣＰ−１の細胞遊走活性を阻害する効果が認められた。
《実施例８：抗ＭＣＰ−１完全分子型ヒト抗体発現プラスミドの構築》
実施例３で分離したｓｃＦｖクローンＭＣ３２のｓｃＦｖ ＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドよりＰＣＲ法にてＶＨ鎖およびＶＬ鎖領域を各々増幅した。増幅に用いたＰＣＲプライマーを以下に示す。
［ＶＨセンス鎖］
［ＶＨアンチセンス鎖］
［ＶＬセンス鎖］
［ＶＬアンチセンス鎖］
増幅されてきたＶＨ鎖、ＶＬ鎖の各々のＤＮＡは動物細胞での分泌発現に必要なリーダー配列を組み込んだプラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１８のリーダー配列の下流にクローニングした。
このようにして得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）−ＢａｍＨＩで３７℃にて２時間消化し、２％アガロースゲル（タカラバイオ社）電気泳動を行ってシグナル配列を含むＶＨ鎖、ＶＬ鎖のＤＮＡ断片を回収した。
ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子ＩｇＧ１の定常領域（ヒンジ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を組み込んだ発現プラスミドｐＣＡＧ−ＨをＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩで３７℃にて２時間消化してベクターのＤＮＡ断片を調製し、この部位に先に調製したＶＨ鎖のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を挿入した。大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、薬剤（アンピシリン）耐性のコロニーからプラスミドを調製して、制限酵素処理によりＶＨ鎖が挿入されていることを確認した。
同様に、ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子κ鎖の定常領域（Ｃκ）を組み込んだ発現プラスミドｐＣＡＧ−Ｌに、ＶＬ鎖を挿入した。
《実施例９：抗ＭＣＰ−１完全分子型ヒト抗体ＭＣ３２の動物細胞での一過性発現と精製》
一過性発現にはＢＭＴ−１０細胞を用いた。
８％ＦＣＳ（インビトロジェン社）入りＤ’ＭＥＭ（インビトロジェン社）で維持したＢＭＴ−１０細胞を、滅菌済み小シャーレ（直径６ｃｍ；コーニング社）に、細胞濃度を１．５ｘ１０５／ｍＬに調製して５ｍＬずつ分注し、炭酸ガス孵卵期で３７℃で一夜培養した。ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社）で細胞を２回洗浄後、低血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）５ｍＬに置換した。ポリスチレン製のディスポ遠心管（ＦＡＬＣＯＮ製）を２本準備し、１本に１０μＬのリポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）と９０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を混合した（以下、リポフェクトアミン液）。もう１本に先に調製したＨ鎖、Ｌ鎖の発現プラスミドＤＮＡを各々３μｇ加え、更に１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭを加えて混合した（以下、ＤＮＡ液）。ＤＮＡ液をリポフェクトアミン液に１滴ずつ加えて混合し、室温で３０分間反応させた。反応後の溶液を１滴ずつ全量（２００μＬ）シャーレに添加し、炭酸ガス孵卵期で３７℃、６時間培養した。６時間後に培地を吸引除去し、８％ＦＣＳ入りＤ’ＭＥＭを静かに加えて３７℃で４日間培養した。４日後に上清を回収し、０．２２μｍフィルター濾過して精製用の出発材料とした。
Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗの精製システム（ＢＩＯ ＲＡＤ社）、およびプロテインＧカラム（ファルマシア社）を用いて定法に従って精製した。
すなわち、プロテインＧカラムをＰＢＳで平衡化後、上記の培養上清５０ｍＬを流速１ｍＬ／分でアプライした。ゲルベッドの５０倍量のＰＢＳで洗浄後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出させた。ＥＴフリーのディスポーザブルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ ２０６３等）に、中和用としてあらかじめ５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０を加えておき、これに１ｍＬずつ溶出液を回収した。すぐに分光光度計で各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、主要なフラクションをプールして（通常２ｍＬ）ＰＢＳにて４℃で一夜透析した。精製抗体の純度検定はＧ３０００ＳＷカラム（トーソー社）を用いたＨＰＬＣ、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。ＨＰＬＣの結果の一例を図４に示す（流速：０．５ｍＬ／分；開始バッファー：１００ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．２＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）。
《実施例１０：精製完全分子型ＭＣ３２抗体のＭＣＰ−１との結合性》
ＥＬＩＳＡ法により精製完全分子型ＭＣ３２抗体のＭＣＰ−１との結合性を評価した。ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに調製したヒトＭＣＰ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を固定化した９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｎｕｎｃ社）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後に、精製した抗ＭＣＰ−１完全分子型ＭＣ３２を５ｕｇ／ｍＬから１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで２倍段階希釈して用いた。３７℃で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで５回洗浄して、パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と更に３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色基質ＴＭＢＺを加えて呈色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図５に示す。精製完全分子型ＭＣ３２抗体はｓｃＦｖと同様に濃度依存性にＭＣＰ−１と結合した。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（以下、ヒトＭＣＰ−１とする）に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体のＶＨ鎖またはその一部をコードする遺伝子断片。
【請求項２】
当該ＶＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の遺伝子断片。
【請求項３】
当該ＶＨ鎖が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載の遺伝子断片。
【請求項４】
当該ＶＨ鎖が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する請求項３に記載の遺伝子断片。
【請求項５】
ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体のＶＬ鎖またはその一部をコードする遺伝子断片。
【請求項６】
当該ＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列を有する請求項５に記載の遺伝子断片。
【請求項７】
当該ＶＬ鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項５または６に記載の遺伝子断片。
【請求項８】
当該ＶＬ鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する請求項７に記載の遺伝子断片。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体の一本鎖Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖと省略する）をコードする遺伝子断片。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子と結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体をコードする遺伝子断片。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子の一部及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子の一部と結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１２】
当該抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２から選ばれる請求項１１に記載の遺伝子断片。
【請求項１３】
請求項９に記載のｓｃＦｖ遺伝子断片を、ヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子の一部、またはヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子の一部と結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の遺伝子断片を発現ベクターに組込み、遺伝子組換え法により発現される、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメント。
【請求項１５】
請求項１４に記載のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメントに高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子。
【請求項１６】
請求項１４に記載のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメント、または請求項１５に記載の修飾蛋白分子を有効成分として含有するヒトＭＣＰ−１活性阻害剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載のヒトＭＣＰ−１活性阻害剤を用いるヒトＭＣＰ−１により惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬。
【請求項１】
ヒトＭｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（以下、ヒトＭＣＰ−１とする）に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体のＶＨ鎖またはその一部をコードする遺伝子断片。
【請求項２】
当該ＶＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の遺伝子断片。
【請求項３】
当該ＶＨ鎖が、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載の遺伝子断片。
【請求項４】
当該ＶＨ鎖が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する請求項３に記載の遺伝子断片。
【請求項５】
ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体のＶＬ鎖またはその一部をコードする遺伝子断片。
【請求項６】
当該ＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列を有する請求項５に記載の遺伝子断片。
【請求項７】
当該ＶＬ鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項５または６に記載の遺伝子断片。
【請求項８】
当該ＶＬ鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する請求項７に記載の遺伝子断片。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体の一本鎖Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖと省略する）をコードする遺伝子断片。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子と結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体をコードする遺伝子断片。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子の一部及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子の一部と結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１２】
当該抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２から選ばれる請求項１１に記載の遺伝子断片。
【請求項１３】
請求項９に記載のｓｃＦｖ遺伝子断片を、ヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子の一部、またはヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子の一部と結合してなる、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の遺伝子断片を発現ベクターに組込み、遺伝子組換え法により発現される、ヒトＭＣＰ−１に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメント。
【請求項１５】
請求項１４に記載のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメントに高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子。
【請求項１６】
請求項１４に記載のヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体または該抗体フラグメント、または請求項１５に記載の修飾蛋白分子を有効成分として含有するヒトＭＣＰ−１活性阻害剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載のヒトＭＣＰ−１活性阻害剤を用いるヒトＭＣＰ−１により惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４９２１
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【発行日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３５９２８（Ｐ２００４−５３５９２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１５６０
【国際出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【発行日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１５６０
【国際出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Ｆターム（参考）】
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