ヒト胚性幹細胞分化抑制剤
【課題】本発明の目的は、ヒト胚性幹細胞を、フィーダー細胞を用いずに未分化な状態で培養させ得るヒト胚性幹細胞分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用いた培地およびこのヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞を提供することである。
【解決手段】低分子化合物またはその塩を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【解決手段】低分子化合物またはその塩を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化合物、特に２環化合物を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤、それを用いるヒト胚性幹細胞培養方法、培地およびそれを用いて作製されたヒト胚性幹細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷や病気、さらには加齢などによって傷害を受けた臓器・組織は、再生を促進し、その機能を回復させる必要がある。特に、心臓・肝臓・腎臓・膵臓などの実質臓器は生命維持に必須であるためその機能低下・廃絶は死に直結することから、臓器移植により救命を図る移植医療が盛んに行われている。しかし、恒常的なドナー不足からその解決には新たなアプローチが必要になっている。
【０００３】
最近になり、胚、或いは成体に存在し、無制限に分裂して、ひとつ或いは複数の方向に分化する能力を有すると考えられる幹細胞を利用して組織・器官の作製を行い、欠損組織の補填を行う再生医療が、従来の臓器移植の欠点を凌駕する治療法として注目されている。
【０００４】
具体的には、幹細胞を増殖させた後、分化させ細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築を行い、それを生体内へ移植したり人工臓器として利用したりすることなどが考えられている。幹細胞を細胞移植治療や組織工学に利用できれば、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できると期待される。
【０００５】
幹細胞は、血管、神経、血液、軟骨、骨、肝臓、膵臓など数々の分野で同定されているが、そのなかでも特に全ての細胞型に分化する能力を有する全能性幹細胞は、上述の再生医療分野のほか、創薬、および遺伝子治療に用いるための細胞ならびに組織を容易に提供し得る細胞として特に注目されている。
【０００６】
全能性幹細胞の一例として、胚性幹（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍ、以下ＥＳ）細胞や、胚性生殖（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ、以下ＥＧ）細胞が知られている。ＥＳ細胞は、マウスの胚盤胞期の内部細胞塊（Inner Cell Mass, ICM）から分離された細胞株である（非特許文献１）。個体を構成する細胞は胚盤胞期の内部細胞塊（Inner Cell Mass,以下 ICM）あるいは原腸胚上層（epiblast、以下エピブラスト）から派生した一次外胚葉に由来しており、ICM およびエピブラストは全能性を持った幹細胞群であるといえる。ＥＳ細胞は各種個体形成組織への分化能を保持し、正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有している。また、試験管内の分化誘導条件によっても、血液細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、色素細胞、膵内分泌細胞など様々な細胞を生成させる能力をもっている（非特許文献２）。
【０００７】
ＥＧ細胞は始原生殖細胞をＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）とｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）存在下で培養することにより樹立された細胞であり（非特許文献３及び４）、ＥＳ細胞と同様に各種組織への分化能を有している。
【０００８】
最近になって、マウス以外でもＥＳ細胞株の樹立が報告され、マウスＥＳ細胞と同様多分化能を有していることが示されている（ウシＥＳ細胞：非特許文献５、豚ＥＳ細胞：非特許文献６、羊ＥＳ細胞：非特許文献７、ハムスターＥＳ細胞：非特許文献８、 アカゲザルＥＳ細胞：非特許文献９、マーモセットＥＳ細胞：非特許文献１０、ヒトＥＳ細胞：非特許文献１１から１４、カニクイザルＥＳ細胞：非特許文献１５）。
【０００９】
ヒトＥＳ細胞の未分化を維持するには、通常マウス胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することが必要である。（非特許文献９及び１１から１４）。しかし、マウス初代線維芽細胞の調製は煩雑である。即ち、妊娠マウスから13.5から15.5日の胚を取り出し、酵素処理によって胚体を分解し、ディッシュ上に得られた線維芽細胞を回収する。初代細胞であるため、品質管理は複雑で、GMP適応レベルの管理は困難であり、ES細胞の未分化維持能も、用いる胚体により異なる可能性が考えられる。
【００１０】
また、最近になって異種動物間での内在性ウィルスの感染例が報告されている（非特許文献１６）。医療用途でのヒトＥＳ細胞の利用を目的とした培養方法においては異種動物細胞間での接触をでき得る限り回避した培養方法の開発が望まれている。従って、マウス由来細胞を用いる上記のＥＳ細胞未分化維持培養方法は、医療用途を目的としたＥＳ細胞の培養には適していない。
【００１１】
マウス由来フィーダー細胞を用いない霊長類ES細胞の培養方法として、マウス初代線維芽細胞の分泌成分を培養培地中に加える方法が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。しかし、この場合においても培養中のES細胞がマウス細胞から分泌される未同定の因子に曝されることから、このような環境で培養されたES細胞は医療用途の使用には適していないうえに、内在性ウィルスの感染の危険性も残されている。従って、マウス初代線維芽細胞との共培養による欠点が全く解消されていない。
【００１２】
また、マウス由来フィーダー細胞を用いない他のヒトＥＳ細胞培養方法として、ＧＳＫ−３β阻害作用を有する化合物（ＢＩＯ）を用いる方法が報告されている（非特許文献１７）。しかし、ＢＩＯの未分化維持効果は短期間の培養においてのみ有効であり、継代培養による長期培養でのヒトＥＳ細胞の未分化維持作用は確認されていない。従って、フィーダー細胞または、フィーダー細胞由来物質を用いずにヒトＥＳ細胞を未分化状態で継代培養する方法は知られていなかった。
【００１３】
【非特許文献１】Evansら、Nature, 292,p154, 1981年
【非特許文献２】仲野徹、最新医学別冊−再生医学、ｐ８１−８９、２０００
【非特許文献３】Matsuiら、Cell、70、p841、1992年
【非特許文献４】Resnicら、Nature、359、p550、1992年
【非特許文献５】Schellanderら、Theriogenology,31, p15-17, 1989年
【非特許文献６】Strojekら、Theriogenology, 33:p901, 1990年
【非特許文献７】Handyside、Roux’s Arch.De v.Biol.,196 :p185, 1987年
【非特許文献８】Doetschmanら，Dev.Biol.,127、p224,1988年
【非特許文献９】Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 92、p7844、 1995年
【非特許文献１０】Thomsonら、Biology of Production、55、p254、1996年
【非特許文献１１】Thomsonら、Science, 282, p1145, 1998年
【非特許文献１２】Reubinoffら、Nature Biotech, 18, p399, 2000年
【非特許文献１３】Mitalipovaら、Stem Cells、21、p521、2003
【非特許文献１４】Heinsら、Stem Cells, 22, p367, 2004年
【非特許文献１５】Suemoriら、Dev.Dyn.222、P273,2001年
【非特許文献１６】van der Laanら、Nature, 407, p90, 2000年
【非特許文献１７】Satoら、Nature Medicine、vol.10、p55、2004年
【特許文献１】特開２００１−１７１６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ヒト胚性幹細胞を、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに、未分化状態で培養させ得るヒト胚性幹細胞分化抑制剤を提供することにある。また、本発明の課題は、かかるヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずにヒト胚性幹細胞を未分化の状態で培養する方法を提供すること、このような分化抑制剤を含む培地を提供すること、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ヒト胚性幹細胞の未分化維持作用を有する化合物について鋭意検討した結果、下記一般式（１）〜（６）で表される二環化合物がヒト胚性幹細胞の未分化維持作用ならびに増殖作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は、上記課題を達成するためになされたものであって、ヒト胚性幹細胞を未分化な状態で増殖させ得る分化抑制剤、それを用いたヒト胚性幹細胞の培養方法、分化抑制剤を含む培地、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株に関する。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
（１） 低分子化合物またはその塩を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（２） 低分子化合物が、一般式（１）
【化１】
［式中、R1、R2、R3、及びR4は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。］で表される化合物である、（１）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００１８】
（３） Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（４） Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（５） Ｘで表されるアルキレン基が、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している、（２）〜（４）の何れかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００１９】
（６） 低分子化合物が、一般式（２）
【化２】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5、R6、R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２０】
（７） 低分子化合物が、一般式（３）
【化３】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5及びR6は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２１】
（８） 低分子化合物が、一般式（４）
【化４】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12、及びR13は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。二重片側破線は単結合または二重結合を表す。二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］で表される化合物である、（６）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２２】
（９） R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、及びR13が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、（８）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２３】
（１０） 低分子化合物が、一般式（５）
【化５】
ただし、Aは水素原子もしくは
【化６】
を表す。
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（６）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２４】
（１１） R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、及びR12が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、（１０）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２５】
（１２） 低分子化合物が、一般式（６）
【化７】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は前記請求項７中の定義と同義である。R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（７）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２６】
（１３） R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9がそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、（１２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２７】
（１４） R1、R2、R3、R4、R8、R9及びR10が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R11が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、R13が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、二級アミノカルボニル基、三級アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基である、（８）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２８】
（１５） R1、R2、R3、R4、R8、及びR9が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R10が水素原子又は低級アルキル基であり、R11が、水素原子、またはニトロ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、低級アルコキシカルボニル基、または低級アルコキシ基である、（１０）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２９】
（１６） R1およびR2が水素原子であり、R3がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、R4がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり、R5が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基、またはアリールアミノビニル基であり、R6がニトロ基であり、R7、R8、及びR9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子である、（１２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００３０】
（１７） 低分子化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させる作用を有する化合物である、（１）〜（１６）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（１８） 低分子化合物が、ＳＳＥＡ−４抗原発現量を増加させる作用を有する化合物である、（１）〜（１７）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（１９） 低分子化合物が、Nａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物である（１）〜（１８）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００３１】
（２０） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いてヒト胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とするヒト胚性幹細胞培養方法。
（２１） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
（２２） ヒト胚性幹細胞分化抑制剤の濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする（２１）に記載の培地。
【００３２】
（２３） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞。
（２４） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
（２５） 細胞または組織が生体内へ移植するためのものである（２３）または（２４）に記載の細胞または組織。
（２６） （２３）〜（２５）のいずれかに記載の細胞または／および組織を生体内に移植する治療方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、ヒト胚性幹細胞を未分化状態で増殖させる効果を有する。そして、本分化抑制剤を用いて培養したヒト胚性幹細胞を用いて医療用の細胞や組織を作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下の用語は他で述べない限り、以下に提供されるように定義される。
本明細書で使用される他の全ての用語は、他に述べない限り、その用語に関する特定の分野でのその語法に関して定義される。
幹細胞：幹細胞とは、特異化された機能を有する他の細胞型、即ち、最終的に分化した細胞、もしくは、より狭い範囲の細胞型に分化可能な他の幹細胞型に分化し得る細胞を指す。
全能性幹細胞：全能性幹細胞とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る細胞のことを言う。
【００３５】
多能性幹細胞：多能性幹細胞とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る細胞をいう。多能性細胞の１つの例は、造血幹細胞であり、この細胞はリンパ球および赤血球のような種々の血液細胞型へと分化し得る。
胚性幹細胞：胚性幹細胞とは、幹細胞の中でも特に前着床段階の胚の、桑実胚または胚盤胞段階から得られた全能性の細胞をいい、ＥＳ細胞とも呼ばれる。また、胚性幹細胞には、精子あるいは卵子になると決まっている、胚または胎児（胎仔）の始原生殖細胞に由来する多能性の幹細胞のことをいう場合もある。ただし、この細胞は胚性生殖（Embryonic Germ、EG）細胞と呼ばれて胚性幹細胞と区別される場合もある。本明細書中で用いる胚性幹細胞は、いかなる動物種のものであってよく、例えばヒトを含む霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類などの胚性幹細胞が挙げられる。
【００３６】
全能性：全能性とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る状態を言う。
多能性：多能性とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る状態をいう。
未分化：未分化とは、1つの細胞、或いは複数の細胞からなる任意の細胞集団が、１つまたは複数の、さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有する状態である細胞、或いは該細胞を含む細胞集団である状態であることをいう。
【００３７】
フィーダー：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダーとは、 全能性幹細胞がその上にプレートされ、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供するものをいう。
フィーダー細胞：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダー細胞とは、 全能性幹細胞がその上にプレートされる非全能性幹細胞をいい、非全能性幹細胞は、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供する。
細胞由来成分：細胞から分泌される成分、内容物、および細胞膜成分など、細胞に由来する全ての成分をいう。
【００３８】
本発明は、ヒト胚性幹細胞を未分化の状態で、増殖および維持させ得る分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用いた培地、それを用いて培養し作製された細胞株を提供する。本発明で提供するヒト胚性幹細胞分化抑制剤、培養方法および培地は、従来より簡便に、安全に、未分化のヒト胚性幹細胞を増殖しそして維持する。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を含む細胞培養方法はまた、特定の分化誘導因子、および分化誘導因子の有用な組み合わせについてスクリーニングするために使用され得る。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤、および培養方法を使用して、未分化なヒト胚性幹細胞を増殖させる能力は、重要な治療適用を有する単一もしくは複数の遺伝的改変を有するヒト胚性幹細胞系を産生する能力を含む重要な利益を提供する。
【００３９】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、化学的に安定な低分子化合物で、ヒト胚性幹細胞を未分化な状態で維持する活性を有するものであればいずれも用いることができるが、好ましくは下記一般式（１）で表される低分子化合物があげられる。
【化８】
【００４０】
式中、R1、R2、R3、及びR4は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。電子供与基とは、ベンゼン環へ電子を供与し得る置換基、電子吸引基とはベンゼン環上のπ電子を吸引する性質を有する置換基をいう。また、Hammettの置換基定数σを用いてσ＜0を電子供与基、σ＞0を電子吸引基と定義することもできる（基礎有機反応論、橋本静信ら著、三共出版、1997年）。
【００４１】
Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。
Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を1つ以上有してもよい。
【００４２】
Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。 このうち、Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環であることが望ましい。
また、Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である場合も同様に望ましい。この場合、５員環は不飽和であることが望ましく、６員環は飽和であることが望ましい。
【００４３】
さらに、Ｘで表されるアルキレン基は、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している場合が望ましい。
【００４４】
たとえば一般式（１）の例としては、式（２）で表されるようなテトラヒドロイソキノリン誘導体および一般式（３）で表されるようなインドール誘導体があげられる。
【化９】
【００４５】
式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記と同義である。R5、R6、R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【化１０】
【００４６】
式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記と同義である。R5及びR6は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【００４７】
一般式（２）で表されるテトラヒドロイソキノリン誘導体の具体例としては、式（４）
若しくは式（５）で示される構造の化合物および塩があげられる。
【化１１】
【００４８】
【化１２】
【００４９】
ただし、Aは水素原子もしくは
【化１３】
を表す。
【００５０】
式中、R1〜R13は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【００５１】
より好ましくは、R1〜R13は、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。
【００５２】
また、一般式（４）の場合、さらに好ましくは、R1、R2、R3、R4、R8、R9及びR10が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R11が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、R13が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、二級アミノカルボニル基、三級アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基があげられる。
【００５３】
一般式（５）の場合、さらに好ましくは、R1、R2、R3、R4、R8、及びR9が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R10が水素原子又は低級アルキル基であり、R11が、水素原子またはニトロ基、であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、低級アルコキシカルボニル基、または低級アルコキシ基があげられる。
【００５４】
一般式（４）の具体例として式（４）中、二重片側破線が二重結合であり、R13がアミノカルボニル基である、一般式（７）で表される化合物があげられる。
【化１４】
【００５５】
また、テトラヒドロイソンキノリン誘導体である前記一般式（４）に含まれるさらに具体的な化合物には、次のようなものが例示される。
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(4-ブロモ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-ブロモ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(4-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-p-トリルアゾ-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
【００５６】
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-スルファモイル-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-スルファモイル-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(4-アセチルアミノ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-アセチルアミノ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(2-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-フェニルアゾ-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -酢酸エチルエステル
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-1-イル)-アセトアミド
【００５７】
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-メチル-アセトアミド
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)- N-フェニル-アセトアミド
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(2,3,3-トリメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -アセトニトリル
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)- N,N-ジメチル-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -酢酸
2-(2-アセチル-3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-アセチル-フェニルアゾ)- アセトアミド
【００５８】
また、一般式（５）の具体例として以下に示す一般式（８）で表される化合物があげら
れる。
【化１５】
【００５９】
また一般式（５）に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-m-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-o-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(4-メトキシ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(3-メトキシ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(4-ニトロ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(3-ニトロ-フェニル)-アセトアミド
4-[2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセチルアミノ]-安息香酸エチルエステル
3-[2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセチルアミノ]-安息香酸エチルエステル
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-フェニル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(2,4-ジメチル-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
【００６０】
一般式（３）に表されるようなインドール誘導体としては、以下の式（６）で表される化合物があげられる。
【化１６】
【００６１】
式中、R1〜R9は同一または異なった電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。このうち、好ましくは、R1〜R9はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。さらには、R1およびR2が水素原子であり、R3がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、R4がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり、R5が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基またはアリールアミノビニル基であり、R6がニトロ基であり、R7、R8、及びR9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子であることが望ましい。
【００６２】
また、一般式（６）に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール塩酸塩
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルフォリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール塩酸塩
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
【００６３】
7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イルエステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-1-（4-メトキシ-フェニル）-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
【００６４】
酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
7-[[ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)-アミノ]-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-[[ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)-アミノ]-メチル]-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
2-(6-ヒドロキシ-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-2-イルメチル)-イソチオウレア酢酸 2-(N,N'-ジフェニル-カーバムイミドイルスルファニルメチル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-イル エステル
酢酸 6-アセトキシ-1-(4-アセトキシ-フェニル)-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
【００６５】
2-(2-ジメチルアミノ-5-ヒドロキシ-ベンゾフラン-3-イル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
5-ブロモ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-イル エステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
7-ジエチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
2-(2-ジメチルアミノ-5-ヒドロキシ-ベンゾフラン-3-イル)-6-メトキシ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-メトキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-メトキシ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル5-ブロモ-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
【００６６】
5,7-ジブロモ-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
1H-フロ[2,3-g]インドール-3-酢酸, 5-ヒドロキシ-1-(4-メトキシフェニル)-2,8-ジメチル-, エチルエステル
5-ブロモ-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸
5-ブロモ-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5-ブロモ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5-ブロモ-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００６７】
6-アセトキシ-5-ブロモ-2-ブロモメチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-2-ブロモメチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
ピロロ[2,3-f][1,3]ベンゾキサジン-3-酢酸, 8-エチル-1,7,8,9-テトラヒドロ-2-メチル-1-(4-ニトロフェニル)-, エチルエステル
6-アセトキシ-2-メチル-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2,4-ジメトキシ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-エトキシカルボニル-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-シアノ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００６８】
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-ブロモ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-フルオロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-5,7-ビス-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5,7-ビス-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００６９】
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-5,7-ジニトロ-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-5,7-ジニトロ-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5,7-ジブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００７０】
5,7-ジブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5-ブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5-ブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸
1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００７１】
Rで表される低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1-メチルプロピル、n-ヘキシル、イソヘキシル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルプロピル、2-エチルブチルなどが挙げられる。好ましくは、メチルである。
【００７２】
Rで表される低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキシロキシ、へプチロキシ、オクチロキシなどが挙げられる。好ましくはメトキシである。
【００７３】
Rで表されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられるが、好ましくは塩素または臭素である。
Rで表される低級アシル基として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられるが、好ましくはアセチルである。
【００７４】
Rで表される環状構造を形成してもよい低級アルキル基としてシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられるが、好ましくはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルである。
Rで表される低級アルコキシカルボニルとして、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポオキシカルボニルなどが挙げられるが、好ましくはメトキシカルボニルもしくはエトキシカルボニルである。
【００７５】
Rで表されるアミノカルボニルとしては、例えば、-CONR2（Rは同一でも異なってもよい水素原子、先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
Rで表される二級アミノカルボニル基としては、例えば、-CONHR（先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。また、三級アミノカルボニル基としては、例えば、-CONR2（Rは同一でも異なってもよい先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
【００７６】
Rで表されるアミノアルキル基としては、例えば、−（CH2）n−NR2（ｎは１〜８を示すが、好ましくは１である。またRは同一でも異なっても良い水素原子、低級アルキル基、環状構造を形成しても良い低級アルキル基（環状構造中には窒素や酸素などのヘテロ原子を１〜３個含んでも良い）、置換基を有しても良いフェニル基を表す）などがあげられる。
Rで表されるアセトキシアルキルとしては、−（CH2）n−OAc（ｎは１〜８を表す）があげられるが、好ましくはｎは１である。
【００７７】
また、式（４）における二重片側破線は単結合または二重結合を表す。さらに、式（４）で表される化合物において、二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部（２箇所）に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよく、本発明で用いる化合物は、これらの幾何異性に基づく純粋な形態の幾何異性体の任意の混合物であってもよい。さらに、互変異性体を任意の比率で含んでもよい。
【００７８】
一般式(２)および（３）であらわされる化合物の塩としては、薬学的に許容しうる塩が望ましい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などを形成してもよい。
また、一般式（４）および（５）であらわされる化合物のエステル化合物も本発明の範囲であり、例えば、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、無機酸エステルなどがあげられる。
本発明において記載されている化合物名は、ＩＵＰＡＣ命名法、或いは市販のソフト（例えばChemDraw Ultra, CambridgeSoft社、米国）を用いて変換される名称を用いる。
【００７９】
本発明で用いる化合物は以下に述べる方法及びそれらに準ずる方法、または公知の方法を行うことにより製造することができる。式(９)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【００８０】
【化１７】
【００８１】
【化１８】
【００８２】
等量のチオエーテル誘導体(Ｉ)とフェニルアゾアセトアミド誘導体(ＩＩ)を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に溶解し、原料がなくなるまで還流することにより製造することができる。該誘導体(Ｉ)は公知の方法（例えば、Khim.Geterotsikl.Soedin.,No.7, p995(1990)などに記載）により、もしくは、市販品から購入することができる。具体的には、下表１に示すとおりである。
【００８３】
【表１】
【００８４】
フェニルアゾアセトアミド誘導体(ＩＩ)は、公知の手法（Materialy Ural'sk. Soveshc
h. po Spektroskopii, 4th, Sverdlovsk 1963, p205(1965), Bulletin de l'Academie Po
lonaise des Sciences, Serie des Sciences Chimiques , 14(1), p29 (1966), Am. Chem
. Soc., Div. Org. Coatings, Plastics Chem. Preprints , 23(2), p486 (1963), Zhurn
al Obshchei Khimii ,35(3), p559 (1965)、Zhurnal Obshchei Khimii, 32, p526 (1962)
など）により製造することができる。
式(９)で表される化合物は以下のスキームでも合成可能である。
【００８５】
【化１９】
【００８６】
ベンジルカルビノール誘導体と2-シアノアセトアミド誘導体とを硫酸存在下で反応することにより得られる化合物(IV)とジアゾニウム塩(V)とを反応に悪影響を及ぼさないアルコール水溶液中、塩酸存在下で反応させることにより得られる。ベンジルカルビノール誘導体は様々な誘導体が市販品から購入でき、さらに公知の方法（例えば、J.Gen.Chem.USSR, No.6, p1263(1936)により得る事が出来る。また、ジアゾニウム塩は市販のアミノベンゼン誘導体を塩酸、亜硝酸ナトリウム水溶液により公知の方法で誘導できる。
【００８７】
式(９)で表される化合物のうち、2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex, ロシア）、2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド（Asinex, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド（PHARMEKS, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド（PHARMEKS, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド（IBS, ロシア）は市販品であり、サプライヤーから入手することが出来る。
【００８８】
式(９)で表される化合物の中で、R5がメチル基である場合の製造法を以下に示す。反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、アセトニトリルのニトリル類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に式(4)で表される化合物（R5=-H）及び炭酸ナトリウムを加えて溶解し、ヨウ化メチルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に溶解したものをゆっくり滴下し、還流することにより製造することができる。
【００８９】
式(９)で表される化合物の中で、R5がアセチル基である場合の製造法を以下に示す。氷浴下、式(９)で表される化合物（R5=-H）及びジメチルアミノピリジンをピリジンに溶解し、無水酢酸を加え、攪拌することにより製造することができる。
【００９０】
式(１１)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２０】
【００９１】
式(９)で表される化合物を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類）に溶解し、塩化チオニルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類）に溶解したものを氷浴下で滴下することにより製造できる。
【００９２】
式(１２)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２１】
【００９３】
エタノールに水酸化カリウム及び式(９)で表される化合物を加え、還流することにより製造することができる。
【００９４】
式(１３)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２２】
【００９５】
式(１２)で表される化合物をエタノールに懸濁し、冷却しながら塩化チオニルをゆっくり滴下し、室温で攪拌することにより製造することができる。
【００９６】
式(１４)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２３】
【００９７】
式(１２)で表される化合物、該当する１級または２級アミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類など）に溶解し、これにHBTU（Advanced ChemTech社、米国）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒など）に溶解したものを加えた。室温で攪拌することにより製造することができる。
【００９８】
式(１０)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２４】
【００９９】
反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、アセトニトリルのニトリル類など）に式(９)及び(１１)〜(１４)で表される化合物を溶解し、トリフェニルすず水素化物（Aldrich、米国）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類）に溶解したものを前記溶媒に加え、還流することにより製造することができる。
【０１００】
一般式（４）で示される化合物は、適当な溶媒に溶解させることができるが、溶媒中においてはそのままで、或いは下記式（１５）で表される還元型で、あるいはその混合物として存在してもよい。
【化２５】
【０１０１】
かくして得られる本発明で用いる化合物またはその塩は、例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィーなどの通常の分離手段により単離、精製することができる。かくして本発明で用いる化合物が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じた方法によって塩に変換することができる。逆に塩で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じた方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。化合物またはその塩が不斉炭素を有する場合もあるが、光学活性の混合物（ラセミ体）として得られた場合には、通常の光学分割手段によりそれぞれの光学活性に分離することができる。
【０１０２】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤における有効成分である低分子化合物の濃度としては、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用することが望ましく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲で使用することである。
【０１０３】
また、本発明の分化抑制剤はSTAT3(signaltransducer and activator of transcription 3)の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物、特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を含む。特定のマウス系統の胚性幹細胞は、マウス胎仔由来の線維芽細胞からなるフィーダー細胞の存在、非存在にかかわらず、LIFによって未分化が維持される。LIFはSTAT3の活性化を介して下流にシグナルを伝えることが知られている（Matsudaら、EMBO Journal、18、15、p4261、1999年）。しかし、最近になってSTAT3を活性化せずに胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制因子が存在することが報告されたことから（Daniら、Developmental Biology、 203、 p149、 1998年）、STAT3を介さない胚性幹細胞の未分化維持機構が存在すると考えられている。さらに、LIFが、霊長類胚性幹細胞の未分化維持に効果を示さないことから（Thomsonら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995年、Thomsonら、Science, 282,p1145, 1998年、Reubinoffら、 Nature Biotech,
18, p399, 2000年）、霊長類胚性幹細胞には、LIFおよびSTAT3とは異なるシグナルによって未分化状態を維持する機構が存在することが示唆される。本発明の分化抑制剤にはSTAT3の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物が含まれる。いいかえれば、LIFとは異なる作用により胚性幹細胞の未分化を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
【０１０４】
最近、LIFおよびSTAT3を介さずに胚性幹細胞の未分化を制御する分子のひとつとしてＮａｎｏｇ遺伝子が同定された（Mitsuiら、Cell、113、p631、2003年、Chambersら、Cell、113、p643、2003年）。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、マウス、ヒトでその存在が確認され、遺伝子破壊により発現を抑制すると、胚性幹細胞の全能性は失われ、逆に、Ｎａｎｏｇ遺伝子を強発現させて発現量を増加させると、LIF非存在下でも胚性幹細胞の未分化を維持することができる。従って、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させ得る物質、例えば低分子化合物は、胚性幹細胞の未分化維持、即ち、全能性の胚性幹細胞の培養に利用することができる。
【０１０５】
また、Ｎａｎｏｇ遺伝子の強発現がSTAT3を活性化しないことから、Ｎａｎｏｇ遺伝子はLIFおよびSTAT3非依存的に胚性幹細胞の未分化を維持する。即ち、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させ得る物質、例えば低分子化合物は、LIFによる未分化維持の効果が認められない胚性幹細胞においても、その培養に用い得ることが示唆される。
【０１０６】
本発明の分化抑制剤にはＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる低分子化合物が含まれる。即ち、本発明の分化抑制剤にはＮａｎｏｇ遺伝子の発現量の増加を介して胚性幹細胞の未分化維持能を発揮する低分子化合物が含まれる。
【０１０７】
また、最近の報告によれば、ある種の骨髄由来間葉系幹細胞においても胚性幹細胞と同様に、マウス由来の幹細胞の培養はLIF依存的であるが、ヒト由来の幹細胞はLIF非依存的であることが示されている（Verfaillieら、Nature, 418,p41, 2002年）。これは、多分化能を示す幹細胞は、胚性幹細胞と同様の未分化維持機構を有していることを示唆し、従って、霊長類幹細胞においても、胚性幹細胞と同様に、LIF-STAT3経路とは異なるシグナルによって未分化が維持されている可能性が示唆される。本発明の分化抑制剤には、STAT3を介さずに細胞の未分化状態を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
【０１０８】
本発明の分化抑制剤は、動物細胞培養用基礎培地である任意の哺乳類細胞培養基本培地に添加して使用することができる。動物細胞基本培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地：DMEM、ノックアウトDMEM、グラスゴーMEM：GMEM、RPMI1640、IMDM（以上 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様としての細胞培地はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）である。さらにこれらの基礎培地に血清または血清代替物、各種増殖因子、サイトカインなど、細胞増殖や分化制御に関わる蛋白質を添加して用いることもできる。また、任意の化合物を添加しても良い。血清は、幹細胞ならびに胚性幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄養素を供給する任意の血清、または、血清ベースの溶液であり得る。このような血清の例には、ウシ胎仔血清（FCS）、ウシ血清（CS）、馬血清（HS）などがあり、また、血清代替物としては当業者に周知のもの、蛋白質、アミノ酸、脂質、ビタミンなどを単独で、或いは組み合わせて用いることができる。蛋白質としてはインスリン、トランスフェリン、アルブミン、ペプトン、FGF（Fibroblast Growth Factor）、EGF（EpitherialGrowth Factor）などが、アミノ酸としてはアルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどが、ビタミンとしては、パントテン酸、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸アミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシンなどが例示されるがこれらに限定されない。１つの実施態様において、血清はウシ胎仔血清である。より特定の実施態様において、ウシ胎仔血清は約２５％と約１％との間の濃度で提供される。さらにより特定の実施態様において、細胞培地でのウシ胎仔血清濃度は15％である。また、他の実施態様において、血清代替物はノックアウト血清リプレースメント： KSR（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）である。添加し得る細胞増殖因子としては、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｗｎｔ、Nogginなどが例示されるがこれらに限定されない。添加し得るサイトカインとしてはインターロイキン（ＩＬ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などが例示されるがこれらに限定されない。また、ＬＩＦ、ノッチリガンドなどの分化制御因子を添加することもできる。また、副腎皮質刺激ホルモン（human ACTH(1-24)）(American peptide社)などのホルモン類を添加することができる。また、添加する化合物は特に限定されないが、任意の蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストであってよく、また、任意のリン酸化阻害剤であっても良い。１つの実施態様に於いて、ＰＤ９８０５９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）が提供される。また、他の実施態様に於いて6-ブロモインジルビン-3オキシムが提供される。
【０１０９】
細胞培地は、抗酸化剤（還元剤）（例えば、β−メルカプトエタノール）も含む。ある好適な実施態様において、β−メルカプトエタノールは、約0.1mMの濃度を有する。他の抗酸化剤 （例えば、モノチオグリセロール、もしくは、ジチオス レイトール（DTT）の単独もしくは組み合わせ）が同様の効果のために使用され得る。さらに他の等価な物質は、細胞培養の分野の当業者に周知である。
【０１１０】
本発明の分化抑制剤ならびにその有効成分は、任意の培養基材とともにあるいは培養基材に固定して使用することもできる。培養基材には多孔質体を使用することがでる。多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、その材質、厚さ、形状、寸法などは特に限定はない。多孔質体の材質は、有機材料、無機材料及び有機材料と無機材料からなる複合材料であっても良い。多孔質体の形状は平板状、球状、棒状、繊維状、中空状のいずれの形態であっても良く、例えば、フィルム、シート、膜、板、不織布、ろ紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。細胞を培養するにあたって、３次元的に培養できるように細胞を支持する孔の大きさを簡単に制御できることや、基材作製の容易さ及びコストなどを考慮すると不織布がより好ましい。多孔質体の孔の大きさについては、特に限定はないが、細胞を３次元的に支持できるようにすることを考慮すると、平均孔径が、0.1μm以上100μm以下であることが好ましく、１μm以上50μm以下がさらに好ましい。繊維径については特に限定はないが、0.03デニール以下が好ましい。
【０１１１】
上記の多孔質体は、細胞の接着性や分化維持機能、増殖能を向上させるために、高分子化合物により表面コーティング処理を施されていてもよい。高分子物質とは、１種以上の繰り返し構成単位の単量体が１次元、２次元、３次元的に連なった分子量数百以上の物質のことをいう。高分子物質は、大きく天然高分子物質、半合成高分子物質、合成高分子物質の３つに分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。
【０１１２】
例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類及びゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲン等に代表されるタンパク質等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
【０１１３】
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質やペプチド並びに有機合成高分子物質がさらに好ましい。一つの実施態様に於いて、培養基材はゼラチンである。また、他の実施態様においては、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、もしくは、BD Purematrixペプチドハイドロゲル （BD Biosciences社）である。
【０１１４】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を固定した培養基材を細胞捕捉材として用いることにより、複数の異なる細胞からなる集団から、ヒト胚性幹細胞を分離し、かつ、培養を行える方法及び装置が提供され得る。即ち、ヒト胚性幹細胞と、除去対象細胞を含む細胞含有液を本発明の分化抑制剤を固定した、多孔質体などの培養基材からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、細胞捕捉材に胚性幹細胞を捕捉させ、除去対象細胞を容器外に導出した後に容器ごと培養することを特徴とする胚性幹細胞培養方法であり、また本発明の分化抑制剤を固定化した培養基材からなる細胞捕捉材を容器に充填した細胞培養装置であって、前記細胞捕捉材は細胞培養用担体として使用し得るものであり、前記容器は細胞培養に使用し得るものであることを特徴とする細胞培養装置である。除去対象細胞とは、ヒト胚性幹細胞以外の全ての細胞をいう。また、胚性幹細胞から分化して、多分化能を失った細胞もこれに含まれる。細胞捕捉材に導入する細胞含有液としては、胚性幹細胞を含有する細胞液であればいかなるものでもよく、一例として、胚性幹細胞の培養液などがあげられる。
【０１１５】
本発明はヒト胚性幹細胞を増殖するための方法に関する。本発明の分化抑制剤を用いて増殖させたヒト胚性幹細胞の培養物を提供することができる。
【０１１６】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて培養される細胞には、公知の方法および材料を使用して入手し得る全てのヒト胚性幹細胞が含まれる。ヒト胚性幹細胞には以下の公知の方法によって入手し得る細胞が一例として挙げられる。ヒトＥＳ細胞：Thomsonら、Science, 282, p1145, 1998年、Reubinoffら、NatureBiotech, 18, p399, 2000年、Mitalipovaら、Stem Cells、21、p521、2003、Heinsら、Stem Cells, 22, p367, 2004年、ヒトEG細胞：Gearhartら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, p13726, 1998年。また、ヒトES細胞の供給機関としては、下記の研究機関が一例として挙げられる。BresaGen, Inc(米国)、Cellartis AB(スウェーデン)、ES Cell International（オーストラリア）、MizMedi Hospital-Seoul National University（韓国）、Technion Technion-Israel Institute of Technology(イスラエル)、University of California at San Francisco（米国）、Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute)（米国）、京都大学再生医科科学研究所（日本）。
【０１１７】
本発明により提供されるヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、既に単離された胚性幹細胞に用いることもできるし、または、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いてヒト胚性幹細胞を単離並びに培養することもできる。本発明の分化抑制剤を用いて培養したヒト胚性幹細胞の未分化程度は幹細胞の細胞膜上に存在するアルカリホスファターゼ（ALP）活性を測定することにより確認することができる。未分化な胚性幹細胞ではALPの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Williamsら、Nature、336、p684、1988年。Thomsonら、Science、282、 p1145,、1998年。）。不溶性基質を用いた染色法、あるいは水溶性基質を用いた分光学的測定法などによりアルカリホスファターゼ（ALP）活性を検出する方法が挙げられる。
【０１１８】
一つの実施態様において、分光学的測定法によりALP活性を定量することができる。培養ディッシュ上の細胞にパラニトロフェニルホスフェイト（pNPP）のアルカリ性溶液を添加する。細胞膜上に存在するALPによってpNPPが加水分解され、パラニトロフェノールが生じる。生成した溶液の405nmの吸光度を測定することによって、アルカリホスファターゼ活性を定量することができる。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を添加して培養したヒト胚性幹細胞のALP活性を測定すると、分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロールのヒト胚性幹細胞にくらべ有意に高いALP活性を有していることが示される。即ち本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒト胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
【０１１９】
他の実施態様において、ALP染色法によりALP活性を検出することもできる。培養ディッシュ上の細胞に、基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加する。細胞膜状に存在するアルカリホスファターゼによりリン酸エステル塩が加水分解され、次いでジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ALP活性部位に色素が沈殿する。染色されたコロニー数を計測することにより細胞のALP活性を定量化することが可能となり、即ち細胞の未分化度合いを定量することができる。実施例１（５）に記載の方法により、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて培養したヒト胚性幹細胞をALP染色すると、分化抑制剤を用いないコントロール細胞に比べ有意にALP活性が高いことが示され、即ち本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒト胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
【０１２０】
また、ヒト胚性幹細胞の未分化程度はOct-3/4遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。Oct-3/4遺伝子はPOUファミリーに属する転写因子で、ヒト胚性幹細胞、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）で、未分化状態特異的に発現し（Mitalipovaら, Stem Cells, 21, p521, 2003年、Okamotoら、Cell、60、p461、1990年）、胚発生においても未分化細胞系譜においてのみ発現し（Scholer、Trends Genet、7、 p323、 1991年）、さらに、Oct-3/4遺伝子破壊マウスのホモ個体は胚盤胞期で発生を停止することから未分化状態維持に重要な機能を有していることが明らかにされている（Nicholsら、Cell、 95、 p379、 1998年）。また、一方、Oct-3/4遺伝子の過剰発現は胚性幹細胞の分化を促進することが最近明らかにされ（Niwaら、Nat .Genet. 24、 p372、2000年）、Oct-3/4の発現量をある一定の範囲に保つことが未分化状態の維持に重要である。また、Nanog遺伝子の発現量を測定することによって、ヒト胚性幹細胞の未分化程度を確認することができる。Nanogは、NK-2ファミリーのホメオボックスを有する転写因子で、機能喪失により原始内胚葉への分化が誘導され、胚性幹細胞の自己複製維持に重要な役割を果たしている（Mitsuiら、Cell、113、p631、2003年、Chambersら、Cell、113、p643、2003年、Clark ら、22、p169、2004年、）。
Oct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子の発現量を測定する一つの実施態様としては定量的PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることができる。
【０１２１】
リアルタイムPCR技術には、ABIPRISM7700TM (Applied Biosystems)を使用したTaq Manプローブを用いる方法や、LightCyclerTM（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いた方法がある。特に後者の場合はPCRの温度サイクルが数十分で終了する高速反応サイクルのもとで、サイクルごとに合成されるDNAの増幅量変化をリアルタイムに検出できる。リアルタイムPCR法のDNA検出法としては、DNA結合色素（インターカレーター）、ハイブリダイゼーション・プローブ（キッシングプローブ）、TaqManプローブおよびSunriseユニプライマー（モレキュラー・ビーコン）を利用する４種類の方法がある。また、DNA結合色素、例えばSYBR GreenIを利用してOct-3/4遺伝子の発現量を解析することができる。SYBR GreenIはDNAの二本鎖特異的に結合色素であり、二本鎖に結合することで本来の蛍光強度が増強される。PCR反応時にSYBR GreenIを加え、伸張反応の各サイクルの終わりに蛍光強度を測定すれば、PCR産物の増加が検出できる。Oct-3/4遺伝子を検出するには通常のPCRと同様にOct-3/4遺伝子の配列をもとに、市販の遺伝子解析ソフトウェアなどを用いてプライマーを設計する。SYBR GreenIは非特異的産物も検出してしまうため最適なプライマーの設定が必要となる。設計基準としては、オリゴマーの長さ、配列の塩基組成、GC含量、およびＴｍ値などに留意が必要である。
【０１２２】
多くの場合、定量PCRにおいて明らかにすることを目的とするのは、サンプル一定量当たりの目的DNA量である。このためには最初に反応系に加えたサンプル量の評価が必要である。この場合サンプル量を反映するような内部標準となる別のDNAを目的DNAとは別に測定し、最初に反応系に加えたサンプル量を補正することができる。サンプル量を補正する目的で用いる内部標準には、通常、組織によって発現量に差がないと考えられているハウスキーピング遺伝子を用いることができる。例えば、解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素(GAPDH)、細胞骨格の構成成分であるβアクチンまたはγアクチン、リボゾームの構成蛋白質であるS26などの遺伝子が挙げられる。
【０１２３】
Oct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子の発現レベルは、本発明の分化抑制剤に暴露された細胞について決定することができる。分化抑制剤に暴露されていない、即ち、胚性幹細胞から分化誘導されたコントロール細胞のOct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子発現量にくらべ、有意にOct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子の発現量を維持させることができる活性を有する化合物が、胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制剤であるとみなされる。
【０１２４】
最適化されたヒト胚性幹細胞の分化抑制剤をスクリーニングするさらに他の方法として、ステージ特異的胚抗原(Stage Specific Embryonic Antigen)(以後SSEAと記載)-4、TRA-1-60、TRA-1-81などの未分化な細胞に特異的に発現する抗原を検出する方法が挙げられる (Smithら、 Nature、 336、 p688、 1988年、Solterら、Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A、75、p5565、1978年、Kannagiら、EMBO J.2、p2355、1983年、Thomsonら、Science, 282, p1145, 1998年)。
【０１２５】
一つの実施態様において、SSEA-4などの表面抗原は、同抗原を認識する特異的抗体（一次抗体）とインキュベートし、さらに蛍光標識のようなレポーターと結合した第二の抗体（二次抗体）とインキュベートことにより、標識することができる。この操作により目的の抗原を発現する細胞が、蛍光性になる。次いで、標識された細胞を標準的な方法、例えばフローサイトメーターを用いて、計数、さらには分取され得る。次いで、標識および非標識細胞の数は、目的とする分化抑制剤の効果を決定するために比較され得る。あるいは、非標識細胞表面マーカー抗体に曝露された後、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）形式において、その細胞は、抗細胞表面抗原抗体（例えば抗SSEA-4抗体）に対して特異的な第二の抗体に曝露され得、そこから、所望の表面抗原を発現する細胞の数が、比色定量的に、または蛍光を測定することにより定量され得る。表面抗原を発現する細胞を定量するさらに他の方法も、細胞培養の当業者に周知である。
【０１２６】
本発明のヒトES分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞の多分化能を評価するための一つの方法として、胚様体法が挙げられる。未分化なES細胞を浮遊培養することにより、胚様体が形成され、その後、浮遊もしくはプレートに接着させて培養することにより、様々な細胞が分化誘導される。ヒトES細胞においても、心筋細胞、内皮細胞、神経前駆細胞、インスリン産生細胞などが分化誘導されることが報告されている（Conley、The International Journal of Biochemistry & Cell Biology、36、p555、2004年）。また、一つの実施様態として、ES細胞の小塊を、分化を誘導する支持細胞上や様々なマトリックス上で培養することによっても細胞分化が誘導される（Sone、Circulation、107、p2085、2003年、Kaufman、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Sates of America、98、p10716、2001年、Mummery、Circulation、107、p2085、2003年）。本発明のヒトES細胞分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞が、例えば、上記に示された誘導法で分化できれば、分化能を有するヒトES細胞であるとみなされる。一つの具体例としては、本発明のヒトES細胞分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞は、心筋・骨格筋の細胞、肝細胞、又は神経細胞などに分化させることができる。また、本発明のヒトES分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞の多分化能を評価するための別の方法として、テラトーマ形成能が挙げられる。例えば、胚性幹細胞を8〜12週齢のSCIDマウスもしくはヌードマウスの皮下、腎皮膜もしくは精巣に注射し、5〜16週後に腫瘍の形成の有無を調べ、腫瘍が形成された場合には、組織学的検査を行うことにより、外胚様由来、中胚様由来、内胚様由来の細胞への分化が確認できる。例えば、本発明の分化抑制剤で培養されたヒトES細胞を上記の方法で、分化が確認できれば、多分化能を有するES細胞であるとみなされる。
【０１２７】
本発明によって提供される、ヒト胚性幹細胞の増殖に対する改善された分化抑制剤、培養方法および培養液は、ヒト胚性幹細胞が有用であるすべての技術に対して適用されることが予想される。
本発明の分化抑制剤、培養方法および培養液を用いて産生される細胞は、分化させ、細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築に使用され、生体内へ移植したり人工臓器として利用されうる。ヒト胚性幹細胞の細胞移植治療や組織工学への利用は、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できる。移植のために培養された細胞や組織は、治療のため、採取した人と同一人に戻す場合と他人に移植する場合があるが、本発明の細胞等はいずれにも用いることができる。
【０１２８】
本発明の分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを含む培養液により得られた、非改変および改変されたヒト胚性幹細胞の培養物は、ヒト胚性幹細胞のモニタリングまたは幹細胞収集を改良する物質についてスクリーニングするために使用される。例えば、推定のヒト胚性幹細胞分化誘導物質は、上記の方法を用いて増殖させた細胞培養物へ添加され得る。推定のヒト胚性幹細胞分化誘導物質を欠損した対照細胞培養物と比較して、三胚葉系列への分化を誘導し得る物質は、ヒト胚性幹細胞分化誘導因子として同定される。
【０１２９】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、優れた幹細胞未分化維持ならびに増殖能を有することから、病気または外傷などにより傷害を受けた組織または器官の治療剤として用いることができる。対象となる疾患としては、例えば皮膚関連では、熱傷、難治性皮膚潰瘍、じょくそう、肥厚性瘢痕、母斑、刺青など、骨関連では、骨折、骨粗しょう症など、軟骨関連では、変形性関節症、慢性リウマチ、椎間板ヘルニア、骨端症、スポーツ障害など、神経関連では、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、外傷による四肢の神経切断、頭頸部外科・胸部外科に伴う損傷、顔面神経麻痺、横隔膜神経損傷、骨盤内神経損傷など、歯関連では歯周病・歯槽膿漏による歯槽骨損傷、無歯症が、毛髪では男性型脱毛症が、角膜では先天性異常、内皮細胞代償不全、角膜感染による混濁、角膜変性症、角膜形状異常など、血管関連では高血圧、慢性動脈閉塞症、虚血性心疾患など、心筋では心筋梗塞、膵臓では糖尿病など、肝臓では肝炎、肝硬変、肝不全などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、上記の疾患に対して予防および／または治療剤として、経口投与または非経口投与のいずれも可能であり、薬学的に許容される担体と混合し、通常、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など固形製剤として経口投与されるか、静脈内、皮下、筋肉内などに注射剤、坐薬若しくは舌下錠などとして非経口投与される。また、舌下錠、マイクロカプセルなどの徐放製剤として、舌下、皮下および筋肉内などに投与してもよい。一日の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重、感受性差；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、通常、哺乳動物１ｋｇ体重あたり約０.０１〜１００ｍｇ、好ましくは約０.０２〜２０ｍｇ、更に好ましくは０.１〜１０ｍｇ、最も好ましくは０.５〜１０ｍｇを、通常１日１〜４回に分けて投与する。畜産または水産分野で使用する場合の投与量も上記に準ずるが、投与対象生物１ｋｇ体重あたり約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０ｍｇを、通常一日１〜３回に分けて投与する。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤の医薬組成物中の含有量は、組成物全体の約０．０１ないし１００重量％である。
【０１３１】
上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。上記賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。上記滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。上記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１３２】
上記崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。上記溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。上記懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【０１３３】
上記等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。上記緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。上記防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。上記抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【０１３４】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤に、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等脹化剤、保存剤などを添加し、公知の方法により静脈、皮下、筋肉内注射剤とすることができる。その際必要により公知の方法により凍結乾燥物とすることも可能である。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を例えばヒトに投与する場合は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、医薬組成物として経口的または非経口的に安全に投与することができる。上記医薬組成物としては、経口剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤）、非経口剤〔例、注射剤、点滴10 剤、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）など〕が挙げられる。これらの製剤は、製剤工程において通常一般に用いられる自体公知の方法により製造することができる。
【０１３５】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、分散剤（例、ツイーン（Tween）８０（アトラスパウダー社製、米国、ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ製）ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性注射剤に、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコールなどに溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤に成形し、注射剤とすることができる。経口剤とするには、自体公知の方法に従い、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を例えば賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプンなど）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。そのコーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。腸溶性製剤とする場合、腸溶相と薬剤含有相との間に両相の分離を目的として、自体公知の方法により中間相を設けることもできる。
【０１３６】
外用剤とするには、公知の方法に従い、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を固状、半固状または液状の外用投与剤とすることができる。例えば、上記固状のものとしては、本発明化合物をそのまま、あるいは賦形剤（例、グリコール、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体など）などを添加、混合して粉状の組成物とする。上記液状のものとしては、注射剤の場合とほとんど同様に油性または水性懸濁剤とする。半固状の場合は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらはいずれも、ｐＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを加えてもよい。例えば坐剤とするには、自体公知の方法に従い、本発明化合物を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の坐剤とすることができる。上記組成物に用いる油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド〔例、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製，ドイツ）など〕、中級脂肪酸〔例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製，ドイツ）など〕、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など）などが挙げられる。また、水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール、水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが挙げられる。
【実施例】
【０１３７】
次に本発明を具体化した実施例を示す。この実施例は、本発明を実施する当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる様式においても、決して本発明の範囲を制限するものではない。また、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。以下の実施例に記載の「室温」は0ないし30℃を示す。「％」は特記しない限り重量パーセントを意味する。
【０１３８】
合成例：化合物の製造方法
[１] 3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニデン-1-アセトアミドの合成
【化２６】
【０１３９】
ベンゼンに2-シアノアセトアミド（Aldrich社、米国）を加え攪拌しながら、10℃に上がらないようにゆっくりと濃硫酸を滴下する。室温に戻した後、ジメチルベンジルカルビノール（Lancaster社、英国）を加える。約30分間還流し、室温に放冷後、反応混合液を氷水に注ぐ。抽出した水相を中和し、生じた沈殿を濾別する。乾燥後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
MS(m/z)=217(M+1)
【０１４０】
[２] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1
-イリデン)-アセトアミドの合成
【化２７】
【０１４１】
p-アミノアセトフェノン（Aldrich社、米国）をベンゼンに溶解し、塩酸ガスを通気し、得られた沈殿を濾別し、イソプロパノールにより再結晶することによりp-アミノアセトフェノン塩酸塩を得る。得られたp-アミノアセトフェノン塩酸塩を20%エタノール水溶液に溶解し、氷浴下、濃塩酸で酸性にする。亜硝酸ナトリウム水溶液を滴下し、尿素で処理することにより、ジアゾニウム塩溶液を得る。
【０１４２】
3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニデン-1-アセトアミドを20%エタノール水溶液に溶解し、濃塩酸を加える。10℃を越えないように温度を調整し、先のジアゾニウム塩溶液を加える。反応液が変化し、攪拌しながら飽和酢酸ナトリウム水溶液を加える。得られた沈殿を濾別後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
MS(m/z)=363(M+1)
【０１４３】
[３] 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1
-イリデン)-アセトアミドの合成
【化２８】
【０１４４】
m-アミノアセトフェノン（Aldrich社、米国）をベンゼンに溶解し、塩酸ガスを通気し、得られた沈殿を濾別し、イソプロパノールにより再結晶することによりp-アミノアセトフェノン塩酸塩を得る。得られたp-アミノアセトフェノン塩酸塩を20%エタノール水溶液に溶解し、氷浴下、濃塩酸で酸性にする。亜硝酸ナトリウム水溶液を滴下し、尿素で処理することにより、ジアゾニウム塩溶液を得る。
【０１４５】
3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニデン-1-アセトアミドを20%エタノール水溶液に溶解し、濃塩酸を加える。10℃を越えないように温度を調整し、先のジアゾニウム塩溶液を加える。反応液が変化し、攪拌しながら飽和酢酸ナトリウム水溶液を加える。得られた沈殿を濾別後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
MS(m/z)=363(M+1)
【０１４６】
[４] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(2,3,3-トリメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリ
ン-1-イリデン)-アセトアミドの合成
【化２９】
【０１４７】
アセトニトリルに2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）及び炭酸ナトリウムを加え、ヨウ化メチルのアセトニトリル溶液をゆっくり滴下し、還流する。還流物を室温まで放冷後、溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、蒸留水で洗浄する。その後無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=377(M+1)
【０１４８】
[５] 2-(2-アセチル-3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-
アセチル-フェニルアゾ)-アセトアミドの合成
【化３０】
【０１４９】
氷浴下、2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）及びジメチルアミノピリジンをピリジンに溶解し、無水酢酸を加える。停止後、前記反応後の溶媒を氷水に注ぎ、ジクロロメタンにより反応生成物を抽出する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=405(M+1)
【０１５０】
[６] (4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトニトリルの合成
【化３１】
【０１５１】
氷浴下、2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）、塩化チオニル及びDMFを混合し、ゆっくり攪拌する。混合溶媒から過剰の塩化チオニルを減圧留去し、反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=345(M+1)
【０１５２】
[７] (4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イ
リデン)-酢酸の合成
【化３２】
【０１５３】
エタノールに水酸化カリウム及び2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）を加え、加熱還流する。還流物を室温まで放冷後、これに蒸留水を加え、さらに塩酸を加えて中性にした後、エーテルで反応生成物を抽出する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=364(M+1)
【０１５４】
[８] (4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イ
リデン)-酢酸エチルエステルの合成
【化３３】
【０１５５】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸をエタノールに懸濁し、攪拌する。冷却しながら塩化チオニルをゆっくり滴下し、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒から溶媒を減圧留去し、水で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=392(M+1)
【０１５６】
[９] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-メチル-アセトアミドの合成
【化３４】
【０１５７】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸、メチルアミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンをDMFに溶解し、HBTU（Advanced ChemTech社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=377(M+1)
【０１５８】
[１０] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N,N-ジメチル-アセトアミドの合成
【化３５】
【０１５９】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸、ジメチルアミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンをDMFに溶解し、HBTU（Advanced ChemTech社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=391(M+1)
【０１６０】
[１１] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-フェニル-アセトアミドの合成
【化３６】
【０１６１】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸、フェニルアミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンをDMFに溶解し、HBTU（Advanced ChemTech社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=439(M+1)
【０１６２】
[１２] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-1-イル)-アセトアミドの合成
【化３７】
【０１６３】
窒素気流下、アセトニトリルに2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）を溶解したものに、トリフェニルすず水素化物（Aldrich、米国）を溶解したキシレンを加え、還流する。還流物を室温まで放冷し、不溶物を濾別する。濾液から溶媒を減圧留去し、反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=365(M+1)
【０１６４】
実施例１
（１）ヒトＥＳ細胞の培養
ヒトＥＳ細胞培養培地として、ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヒアルロン酸を添加したＶｉｔｒｏＨＥＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ）培地、または、20％FBS（Hyclone, Utha）、β-メルカプトエタノール-0.1 mM（GIBCO）、非必須アミノ酸-NEAA 1%（GIBCO）、Ｌ−グルタミン2mM（GIBCO）、ペニシリン50u/ml (GIBCO)およびストレプトマイシン50μg/ml（GIBCO）を添加したＤＭＥＭ（GIBCO）、または20％KSR（Invitrogen）、β-メルカプトエタノール-0.1 mM（GIBCO）、非必須アミノ酸-NEAA 1%（GIBCO）、Ｌ−グルタミン2mM（GIBCO）、ペニシリン50u/ml (GIBCO)およびストレプトマイシン50μg/ml（GIBCO）を添加したノックアウトＤＭＥＭ（GIBCO）を調製する。また、ヒトＥＳ細胞培養用のマウスフィーダー細胞用の培地として、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社製 １１９６０−０４４）に、以下に示す最終濃度で各因子を添加して調製する。１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２ｍＭ Ｌ―Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｇ７５１３）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＳＩＧＭＡ Ｐ０７８１）。
【０１６５】
直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に０．１％の濃度でＧｅｌａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製 TypeA:from porcinESkin、G2500）を溶解し、滅菌して作製した０．１％ゼラチン水溶液５ｍｌを添加し、３７℃で３０分以上静置する。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンC（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 ＹＥ９２８４４００）２×106個を播種し、前記のフィーダー細胞用培地を用いて３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養する。ヒトＥＳ細胞を、マウス胚性初代培養細胞に播種し、５ｍｌのヒトＥＳ細胞培養培地で、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養して増殖させる。
【０１６６】
尚、ヒトＥＳ細胞は、表２に記載の研究機関から入手することができる。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
（２）ヒトＥＳ細胞の調製
前記（１）の「ヒトＥＳ細胞の培養」に記載の方法に従って培養するヒトＥＳ細胞を、ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳを用い、マイクロピペットによってヒトＥＳ細胞のコロニーを機械的に単離し、または、ＣａおよびＭｇを含有するＰＢＳ中で、マイクロピペットを使用してコロニーの領域をこすり取ることによりコロニーを切断し、次いで、ディスパーゼ（Gibco）10 mg/mlを含有する通常の平衡化したヒト胚性幹細胞培地に変更し、37℃、5％ＣＯ2においてインキュベーションすることによりコロニーを解離してヒトＥＳ細胞を得る。
【０１６９】
（３）マトリゲルコートディッシュの作製
グロースファクターリデュースド(GFR)BDマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354230、日本）及びBDマトリゲル基底膜マトリックス（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354234）を２〜８℃の冷蔵庫で一晩解凍し、冷やしたピペットを用いてゆっくりと混合する。冷却したDMEM／F12 1：1 (Ｓｉｇｍａ社製、Ｄ６４２１、米国)でマトリゲルを20倍希釈し、培養ディッシュに加え、室温で1時間インキュベートする。溶液を除去し、DMEM／F12 1：1で洗浄し、マトリゲルコートディッシュを得る。
【０１７０】
（４）ＥＳ細胞分化抑制剤アッセイ
前記の（２）ヒトＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製するヒトＥＳ細胞を３〜５倍に培地で希釈し、予めマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製）でコートした直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュ１枚当たり４．５ｍｌを播種する。次いで、各ディッシュに８〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した以下に記載の本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養する。２〜４日毎に前記（２）の「ヒトＥＳ細胞の調製」に記載の方法に従って継代する。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにする。
【０１７１】
実施例で用いるヒト胚性幹細胞分化抑制剤
Ａ： 2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
Ｂ： 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｃ： 2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｄ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｅ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｆ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-トリルアゾ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｇ： 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｈ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
ａ： 2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｂ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｃ： 2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｄ： 2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｅ： 1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｆ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｇ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｈ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルホリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｉ： 7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｊ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｋ： 7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｌ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｍ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｎ： 酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イル エステル
ｏ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｐ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｑ： 7-ジメチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｒ： 酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｓ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｔ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｕ： 酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｖ： 1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｗ： 酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｘ： 5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
【０１７２】
（５）アルカリホスファターゼ染色
前記（４）の「ES細胞分化抑制剤アッセイ」に記載の方法に従い培養して得られるヒトＥＳ細胞を、アルカリホスファターゼ染色キット(SIGMADiagnostic社製 Cat.No.86-R)を用いて染色する。即ち、各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を2mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で１回洗浄後、2mlの細胞固定液（25mlクエン酸溶液(SIGMA社製 Cat.No.91-5)、65mlアセトン、8ml 37％ホルムアルデヒド）を各穴に加え、室温で30秒静置する。固定液を吸引除去し、2mlの脱イオン水を各ウェルに加えて45秒室温で静置する。脱イオン水を吸引除去し、ついでアルカリホスファターゼ染色液（1ml亜硝酸ナトリウム溶液、1ml ファーストレッドバイオレットLBソルト溶液、1mlナフトールAS-BIアルカリ溶液、45ml蒸留水）を1ウェルあたり2ml加え15分間室温で静置後、染色液を吸引除去し、脱イオン水2mlで洗浄すれば、ヒトＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ染色像が得られる。
【０１７３】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤存在下で培養して得られるヒトES細胞は、分化抑制剤を含まない培地にて培養して得られるヒトES細胞に比べ、有意アルカリホスファターゼ活性が亢進していることが確認できる。従って、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒトES細胞の未分化維持効果を有することを確認することができる。
【０１７４】
（６）ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現検討
前記の（４）ES細胞分化抑制剤アッセイに示す方法で培養したヒトES細胞からISOGEN（株式会社ニッポンジーン社製、日本）を用い、添付の方法に従ってトータルRNAを抽出する。即ち、培養後のディッシュから培地を除去し、PBS 10mlで二回洗浄し、ISOGENE 1mlに溶解する。室温で５分間静置した後、1.5mlのエッペンドルフチューブに回収する。クロロホルム（和光純薬）を0.2ml加え、15秒間振とうし、２〜3分間室温で静置した。微量遠心機（トミー精工）で4℃、10000ｒｐｍで１５分間遠心する。上清400μｌを新しい1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、500μｌのイソプロパノール（和光純薬）を加え、室温で10分間静置後、微量遠心機にて4℃、10000ｒｐｍで１0分間遠心する。上清を除去後、70%エタノール水溶液を1ml加え、振とう後、微量遠心機にて4℃、10000ｒｐｍ、約5分間遠心する。上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、30μlの蒸留水に溶解させ、トータルRNA溶液を得る。
【０１７５】
このようにして得られるトータルＲＮＡの２μｇ を鋳型に、ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Oligo(dT)12-18プライマー(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 18418-012)、オムニスクリプトリバーストランスクリプターゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い添付のプロトコールに従ってcDNAを合成する。即ち、トータルＲＮＡ２μｇに１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅR１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と蒸留水を加えて１０μｌとなるように反応液を調製し、室温で１０分間インキュベートする。２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μｌ加えて、６５℃で１０分間加熱し、室温に戻した後、２μｌの１０× Ｂｕｆｆｅｒ ＲＴ、２μｌの５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２μｌのOligo(dT)12-18プライマー、０．２５μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１０７７７−０１９）、１μｌのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え、ＲＮａｓｅフリー精製水で全量２０μｌに合わせ、次いで３７℃で６０分間インキュベートし、ｃＤＮＡ溶液を得る。このようにして得られる合成ｃＤＮＡの一部を蒸留水で５倍に希釈し、その２μlを鋳型として、ライトサイクラーファーストスタートDNA マスターSYBRグリーンI キット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い添付のプロトコールに従ってPCR を行う。Oct-3/4 遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、並びに内部標準としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子の発現量を測定する。Oct-3/4 遺伝子の増幅には、センスプライマーOCT3 up（配列表配列番号１）、およびアンチセンスプライマーOct3 down(配列表配列番号２)を用い、Ｎａｎｏｇ遺伝子の増幅には、センスプライマーＮａｎｏｇ up（配列表配列番号５）、およびアンチセンスプライマーＮａｎｏｇ＿down(配列表配列番号６)を用い、GAPDH 遺伝子の増幅には、センスプライマーGAPDH up (配列表配列番号３)、およびアンチセンスプライマーGAPDH down（配列表配列番号４）を用いる。PCR 反応液の組成と反応条件を以下にそれぞれ示す。
【０１７６】
【表３】
【０１７７】
【表４】
【０１７８】
【表５】
【０１７９】
【表６】
【０１８０】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤存在下で培養したヒトＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現が、分化抑制剤を含まない培地にて培養したヒトES細胞に比べ有意に維持されていることが確認できる。従って、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒトES細胞の未分化維持効果を有することを確認することができる。
【０１８１】
（７）ヒトＥＳ細胞のマーカー蛋白の発現検討
前記（４）の「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ」に記載の方法に従って培養して得られるヒトＥＳ細胞のヒトＥＳ細胞マーカー蛋白を確認する。PBSで2回洗浄し、セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離し、細胞数が6×105個になるように2％FBSを含むHanks balanced salt solution(HBSS、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)を添加する。ヒトES細胞表面抗原、ＳＳＥＡ-４、TRA-1-60、TRA-1-81に対する抗体（いずれもCHEMICON社製）をHBSSでそれぞれ希釈して加え、40分間氷上で静置する。HBSS(1ml)で二回洗浄後、HBSS (300μl)に再分散し、2次抗体として、HBSSに希釈したFITC-Goat anti Mouse IgM、またはIgG抗体（Ｚｙｍｅｄ社製、米国）を加え30分間、遮光して氷上で静置する。HBSS(1ml)で二回洗浄後、HBSS (1ml)に再分散し、20μg/ml PI溶液(Dojindo社製)を100μl加え、フローサイトメーター測定に用いるサンプルを得る。またフローサイトメーター測定に用いるサンプルは、凝集塊を除く目的で孔径100μmのナイロン・メッシュに通した後に測定を行う。フローサイトメーターはFACSCalibur(BECTON DICKINSON社製、米国)を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアはCELLQuest(BECTON DICKINSON社製、米国)を用いる。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を添加して培養したヒトES細胞は、分化抑制剤を含有しない培地にて培養して得られるヒトES細胞に比べ、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１抗原の発現が有意に亢進していることが確認できる。即ち、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、未分化なヒトES細胞を維持することが確認できる。
【０１８２】
実施例２
（１）ヒトＥＳ細胞の培養
ヒトＥＳ細胞培養培地として、vitroHES medium (Vitrolife AB) に終濃度が4 ng/mlになるよう Human recombinant basic FGF (bFGF) (Invitrogen, 13256-029)を添加した培地、またはDMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421) 400ml、Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen 10828-028) 100ml、非必須アミノ酸溶液(Sigma M7145) 5ml、100mM ピルビン酸ナトリウム(Sigma S-8636)5ml、200mM L-グルタミン(Sigma G7513) 5ml、終濃度が5ng/mlになるようbFGFを添加した培地を調整した。また、ヒトＥＳ細胞培養用のマウスフィーダー細胞用の培地として、DMEM（Invitrogen, 11960-044）に、以下に示す最終濃度で各因子を添加して調製した。10%ウシ胎仔血清（Invitrogen）、2mM L-グルタミン（Sigma G7513）、1×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma P0781）。
【０１８３】
直径6cmの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に0.1%の濃度でゼラチン（Sigma, TypeA:from porcinESkin、G2500）を溶解し、滅菌して作製した0.1%ゼラチン水溶液を5ml添加し、37℃で30分以上静置した。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンC（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（Invitrogen, YE9284400）1.5×106個を播種し、前記のフィーダー細胞用培地を用いて37℃、5%CO2インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養した。ヒトES細胞（Cellartis AB,スウェーデン, SA181株）を、マウス胚性初代培養細胞上に播種し、５mlのヒトES細胞培養培地で、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。3日から４日に一度継代を行い、継代には、0.1%コラゲナーゼ溶液(Wako, 032-10534)を用いた。
【０１８４】
（２）マトリゲルコートディッシュの作製
グロースファクターリデュースド(GFR)BDマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354230）及びBDマトリゲル基底膜マトリックス（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354234）を2〜8℃の冷蔵庫で一晩解凍し、冷やしたピペットを用いてゆっくりと混合する。冷却したDMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421)でマトリゲルを20倍希釈し、培養ディッシュに加え、室温で2時間静置した。溶液を除去し、DMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421)で洗浄し、マトリゲルコートディッシュを得た。
【０１８５】
（３）ヒトES細胞の無フィーダー培養
前記（１）ヒトＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したヒトＥＳ細胞をマトリゲル（BectonDickinson）コートしたディッシュに播種し、無フィーダー培養を開始した。この際、使用した培地は、DMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421) 400ml, Knockout Serum Replacement (KSR) )(Invitrogen 10828-028) 100ml, 非必須アミノ酸溶液(Sigma M7145)5ml, 100mM ピルビン酸ナトリウム(Sigma S-8636)5ml, 200mM L-グルタミン (Sigma G7513) 5mlに、5ng/ml bFGF(Invitrogen, 13256-029) とDMSO(×2000) または本発明の分化抑制剤(終濃度 2μg/ml) を添加した。培地交換は2日に一度行った。継代は、0．25％ Tripsin＋20% KSR＋1mM CaCl2 を加えて、37℃で5分反応させた後、ピペッティングでコロニーをディッシュから解離させ、適当なコロニーサイズになるようにコロニーを分割して、新しいマトリゲルコートしたディッシュに播種した。
【０１８６】
実施例で用いたヒト胚性幹細胞分化抑制剤
Ａ： 2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
Ｂ： 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｃ： 2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｄ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｅ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｆ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-トリルアゾ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｇ： 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｈ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
ａ： 2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｂ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｃ： 2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｄ： 2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｅ： 1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｆ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｇ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｈ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルホリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｉ： 7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｊ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル) -3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｋ： 7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｌ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｍ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｎ： 酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イル エステル
ｏ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｐ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オールｑ： 7-ジメチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｒ： 酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｓ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｔ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｕ： 酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｖ： 1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｗ： 酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｘ： 5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
【０１８７】
前記（３）で示した方法に従って培養したヒトES細胞の形態を図１に示した。分化抑制剤を含まない培地(DMSO 0.05%)で培養した場合、数継代で死滅するのに対して、本発明の分化抑制剤bを含む培地で培養した場合、長期間（図１に8継代及び48継代の写真を示した）にわたり増殖し、かつ、ヒトES細胞に特徴的な扁平なコロニー及び高い核／細胞質比を示した。他の分化抑制剤についても同様の検討を行ったところ、同様の結果が得られ、本発明の分化抑制剤は、未分化なヒトES細胞を維持することが明らかとなった。
【０１８８】
（４）ヒトＥＳ細胞のマーカー蛋白の発現検討
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞のヒトＥＳ細胞マーカー蛋白をES cell characterization kit(Chemicon, SCR001)を用いて免疫染色により確認した。また、一次抗体は、キットに付属のSSEA-4モノクローナル抗体、TRA-1-60 抗体、TRA-1-81 抗体、を用い、二次抗体は、Fluorolink Cy3 labelled goat anti-mouse IgG(H+L) (Amersham Biosciences, PA43002)、GOAT ANTI-MOUSE IgM AFFINITY PURIFIED, CY3-CONJUGATE SECONDARY ANTIBODY（Chemicon, AP128C）を用い、添付の方法に従って免疫染色を行った。即ち、PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒドPBS溶液を添加し、15分から20分間室温で静置し、固定した。PBSで洗浄後、10%BSA PBS溶液を添加し、30分間室温でブロッキングした。1%BSA PBS溶液で500倍希釈した一次抗体を添加し、室温で2〜3時間静置した。PBSで洗浄後、1%BSA PBS溶液で希釈した二次抗体を添加し、室温で1〜2時間静置した。PBSで洗浄後、顕微鏡により観察した。図２に染色図を示した。前記（３）に記載したように本発明の分化抑制剤で培養されたヒトES細胞は、ヒトES細胞の未分化に特異的なマーカーである、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81を発現しており本発明の分化抑制剤がヒトES細胞の、未分化維持効果を有してしていることが明らかとなった。
【０１８９】
（５）多分化能の評価１（胚様体形成による分化誘導）
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞のコロニーを、ディスパーゼ(Becton Dickinson, 354235)を用いて剥離した。ヒトES細胞培養培地(vitroHES medium (Vitrolife) に4ng/ml b FGFを添加) に懸濁し、約5日浮遊培養して胚様体を形成させ、さらに、分化誘導培地(DMEM/HamF-12 1:1 に15% FBS, 1mM L-グルタミン、 0.1 mM 2-mercaptoethanolを添加)中で、約5日間浮遊培養を行った。その後、ゼラチンコートディッシュに播種し、分化誘導培地で1週間から10日程度接着培養した。
【０１９０】
得られた細胞の免疫染色を前記（４）記載の方法で同様に行った。また、必要であれば、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄後、0.1%Triton X-100/PBS溶液で5分間室温処理を行った。その際、一次抗体は、抗muscle actin ポリクローナル抗体 (DAKO)、抗α-fetoproteinモノクローナル抗体(Sigma)を用いた。結果を図３に示した。心筋・骨格筋のマーカーであるMuscle actin及び肝細胞のマーカーであるα-fetoprotinの発現が認められ、本発明の分化抑制剤存在下で培養されたヒトES細胞は多分化能を有することが明らかとなった。
【０１９１】
（６）多分化能の評価２（神経分化誘導）
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞のコロニーを、ディスパーゼ(Becton Dickinson, 354235)を用いて剥離した。コロニーは、神経培養培地（住友ベークライト, MB-X9501）に20ng/mlのbFGF を加えた培地中で浮遊培養して胚様体を形成させた。bFGFを毎日添加し、13日間培養した後、凝集塊を5μg/ml Laminin((Becton Dickinson, 334239)をコートしたPoly-L-Lysine(PLL)コーティングディッシュ(住友ベークライト)に播種し、1週間ほど接着培養を行った。
【０１９２】
得られた細胞の免疫染色を前記（４）記載の方法で同様に行った。また、必要であれば、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄後、0.1%Triton X-100/PBS溶液で5分間室温処理を行った。その際、一次抗体は、抗βIII-tubulin mAb (TuJ1)(Chemicon)、 抗MAP2 mAb (Sigma)、抗 Glial fibrillary acidic protein (GFAP) pAb (Chemicon)を用いた。結果を図４に示した。神経細胞のマーカーであるTuJ1、MAP2、、GFAPの発現が認められ、本発明の分化抑制剤存在下で培養されたヒトES細胞は神経分化能を有することが明らかとなった。
【０１９３】
（７）多分化能の評価３
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞を、0.1%コラゲナーゼもしくはディスパーゼ(Becton Dickinson, 354235)を用いてES細胞を剥離し、6週齢、雄のSCIDマウスの皮下に移植した。二ヶ月後、形成された腫瘍を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後に、切片を作成、ヘマトキシリン−エオジン染色（HE染色）して組織学的検査を行った。その結果、HE染色図を図５に示した。腫瘍は、三胚葉、即ち、外胚葉、内胚葉、中胚葉に由来する細胞群で構成されていた。外胚葉由来組織としては、ニューロン、グリア、メラノサイトが、、中胚葉由来組織としては、骨格筋、骨、軟骨が、また、内胚葉由来組織としては消化管上皮および平滑筋などが観察された。即ち本発明の分化抑制剤は、ヒトES細胞の、内胚葉、外胚葉、中胚葉の三胚葉への分化能を維持したまま増殖させ得る活性を有する。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
本発明によれば、ヒト胚性幹細胞を、未分化なまま、期間を延長してまたは無期限に、大量にかつ安全に増殖させることができる。本発明によって提供されるヒト胚性幹細胞分化抑制剤、それを用いた培養方法、培地は、細胞移植用途で用いる細胞ソースとしてのヒト胚性幹細胞を産生するために適用され得る。ヒト胚性幹細胞を利用することにより得られる多くの恩恵に加え、本発明によって提供されるヒト胚性幹細胞分化抑制剤およびそれを用いた培養方法は、１つもしくは多数の遺伝的な改変を有するヒト胚性幹細胞を産生するために適用され得る。このような適用の例は、疾患について細胞ベースでのモデルの開発、ならびに遺伝病を処置するために移植について特異化された組織の開発を含むが、これに限定されない。
【０１９５】
上記の通り、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、ヒト胚性幹細胞を未分化状態で増殖させることができ、その結果培養された細胞や組織を再生医療分野で好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞の形態の写真を示す。
【図２】図２は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞のマーカー蛋白の発現結果を示す。
【図３】図３は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞の分化誘導後のマーカー蛋白の発現結果を示す。
【図４】図４は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞の神経分化誘導誘導後のマーカー蛋白の発現結果を示す。
【図５】図５は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞のテラトーマ形成後の組織写真を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１９７】
SEQUENCE LISTING
<110> ASAHI KASEI KABUSHIKI KAISHA
<120> Human embryo stem cell differentiation supressing agent
<130> A51942A
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The forward primer used for amplifing human Oct-3/4 gene by PCR
<400> 1
cgaccatctg ccgctttgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The reverse primer used for amplifing human Oct-3/4 gene by PCR
<400> 2
taggaatggg ggacaggggg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The forward primer used for amplifing human GAPDH gene by PCR
<400> 3
tgaacgggaa gctcactgg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The reverse primer used for amplifing human GAPDH gene by PCR
<400> 4
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The forward primer used for amplifing human Nanog gene by PCR
<400> 5
agagacagaa atacctcagc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The reverse primer used for amplifing human Nanog gene by PCR
<400> 6
cgtcacacca ttgctattct t 21
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化合物、特に２環化合物を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤、それを用いるヒト胚性幹細胞培養方法、培地およびそれを用いて作製されたヒト胚性幹細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷や病気、さらには加齢などによって傷害を受けた臓器・組織は、再生を促進し、その機能を回復させる必要がある。特に、心臓・肝臓・腎臓・膵臓などの実質臓器は生命維持に必須であるためその機能低下・廃絶は死に直結することから、臓器移植により救命を図る移植医療が盛んに行われている。しかし、恒常的なドナー不足からその解決には新たなアプローチが必要になっている。
【０００３】
最近になり、胚、或いは成体に存在し、無制限に分裂して、ひとつ或いは複数の方向に分化する能力を有すると考えられる幹細胞を利用して組織・器官の作製を行い、欠損組織の補填を行う再生医療が、従来の臓器移植の欠点を凌駕する治療法として注目されている。
【０００４】
具体的には、幹細胞を増殖させた後、分化させ細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築を行い、それを生体内へ移植したり人工臓器として利用したりすることなどが考えられている。幹細胞を細胞移植治療や組織工学に利用できれば、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できると期待される。
【０００５】
幹細胞は、血管、神経、血液、軟骨、骨、肝臓、膵臓など数々の分野で同定されているが、そのなかでも特に全ての細胞型に分化する能力を有する全能性幹細胞は、上述の再生医療分野のほか、創薬、および遺伝子治療に用いるための細胞ならびに組織を容易に提供し得る細胞として特に注目されている。
【０００６】
全能性幹細胞の一例として、胚性幹（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍ、以下ＥＳ）細胞や、胚性生殖（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ、以下ＥＧ）細胞が知られている。ＥＳ細胞は、マウスの胚盤胞期の内部細胞塊（Inner Cell Mass, ICM）から分離された細胞株である（非特許文献１）。個体を構成する細胞は胚盤胞期の内部細胞塊（Inner Cell Mass,以下 ICM）あるいは原腸胚上層（epiblast、以下エピブラスト）から派生した一次外胚葉に由来しており、ICM およびエピブラストは全能性を持った幹細胞群であるといえる。ＥＳ細胞は各種個体形成組織への分化能を保持し、正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有している。また、試験管内の分化誘導条件によっても、血液細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、色素細胞、膵内分泌細胞など様々な細胞を生成させる能力をもっている（非特許文献２）。
【０００７】
ＥＧ細胞は始原生殖細胞をＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）とｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）存在下で培養することにより樹立された細胞であり（非特許文献３及び４）、ＥＳ細胞と同様に各種組織への分化能を有している。
【０００８】
最近になって、マウス以外でもＥＳ細胞株の樹立が報告され、マウスＥＳ細胞と同様多分化能を有していることが示されている（ウシＥＳ細胞：非特許文献５、豚ＥＳ細胞：非特許文献６、羊ＥＳ細胞：非特許文献７、ハムスターＥＳ細胞：非特許文献８、 アカゲザルＥＳ細胞：非特許文献９、マーモセットＥＳ細胞：非特許文献１０、ヒトＥＳ細胞：非特許文献１１から１４、カニクイザルＥＳ細胞：非特許文献１５）。
【０００９】
ヒトＥＳ細胞の未分化を維持するには、通常マウス胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することが必要である。（非特許文献９及び１１から１４）。しかし、マウス初代線維芽細胞の調製は煩雑である。即ち、妊娠マウスから13.5から15.5日の胚を取り出し、酵素処理によって胚体を分解し、ディッシュ上に得られた線維芽細胞を回収する。初代細胞であるため、品質管理は複雑で、GMP適応レベルの管理は困難であり、ES細胞の未分化維持能も、用いる胚体により異なる可能性が考えられる。
【００１０】
また、最近になって異種動物間での内在性ウィルスの感染例が報告されている（非特許文献１６）。医療用途でのヒトＥＳ細胞の利用を目的とした培養方法においては異種動物細胞間での接触をでき得る限り回避した培養方法の開発が望まれている。従って、マウス由来細胞を用いる上記のＥＳ細胞未分化維持培養方法は、医療用途を目的としたＥＳ細胞の培養には適していない。
【００１１】
マウス由来フィーダー細胞を用いない霊長類ES細胞の培養方法として、マウス初代線維芽細胞の分泌成分を培養培地中に加える方法が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。しかし、この場合においても培養中のES細胞がマウス細胞から分泌される未同定の因子に曝されることから、このような環境で培養されたES細胞は医療用途の使用には適していないうえに、内在性ウィルスの感染の危険性も残されている。従って、マウス初代線維芽細胞との共培養による欠点が全く解消されていない。
【００１２】
また、マウス由来フィーダー細胞を用いない他のヒトＥＳ細胞培養方法として、ＧＳＫ−３β阻害作用を有する化合物（ＢＩＯ）を用いる方法が報告されている（非特許文献１７）。しかし、ＢＩＯの未分化維持効果は短期間の培養においてのみ有効であり、継代培養による長期培養でのヒトＥＳ細胞の未分化維持作用は確認されていない。従って、フィーダー細胞または、フィーダー細胞由来物質を用いずにヒトＥＳ細胞を未分化状態で継代培養する方法は知られていなかった。
【００１３】
【非特許文献１】Evansら、Nature, 292,p154, 1981年
【非特許文献２】仲野徹、最新医学別冊−再生医学、ｐ８１−８９、２０００
【非特許文献３】Matsuiら、Cell、70、p841、1992年
【非特許文献４】Resnicら、Nature、359、p550、1992年
【非特許文献５】Schellanderら、Theriogenology,31, p15-17, 1989年
【非特許文献６】Strojekら、Theriogenology, 33:p901, 1990年
【非特許文献７】Handyside、Roux’s Arch.De v.Biol.,196 :p185, 1987年
【非特許文献８】Doetschmanら，Dev.Biol.,127、p224,1988年
【非特許文献９】Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 92、p7844、 1995年
【非特許文献１０】Thomsonら、Biology of Production、55、p254、1996年
【非特許文献１１】Thomsonら、Science, 282, p1145, 1998年
【非特許文献１２】Reubinoffら、Nature Biotech, 18, p399, 2000年
【非特許文献１３】Mitalipovaら、Stem Cells、21、p521、2003
【非特許文献１４】Heinsら、Stem Cells, 22, p367, 2004年
【非特許文献１５】Suemoriら、Dev.Dyn.222、P273,2001年
【非特許文献１６】van der Laanら、Nature, 407, p90, 2000年
【非特許文献１７】Satoら、Nature Medicine、vol.10、p55、2004年
【特許文献１】特開２００１−１７１６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ヒト胚性幹細胞を、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに、未分化状態で培養させ得るヒト胚性幹細胞分化抑制剤を提供することにある。また、本発明の課題は、かかるヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずにヒト胚性幹細胞を未分化の状態で培養する方法を提供すること、このような分化抑制剤を含む培地を提供すること、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ヒト胚性幹細胞の未分化維持作用を有する化合物について鋭意検討した結果、下記一般式（１）〜（６）で表される二環化合物がヒト胚性幹細胞の未分化維持作用ならびに増殖作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は、上記課題を達成するためになされたものであって、ヒト胚性幹細胞を未分化な状態で増殖させ得る分化抑制剤、それを用いたヒト胚性幹細胞の培養方法、分化抑制剤を含む培地、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株に関する。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
（１） 低分子化合物またはその塩を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（２） 低分子化合物が、一般式（１）
【化１】
［式中、R1、R2、R3、及びR4は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。］で表される化合物である、（１）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００１８】
（３） Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（４） Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（５） Ｘで表されるアルキレン基が、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している、（２）〜（４）の何れかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００１９】
（６） 低分子化合物が、一般式（２）
【化２】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5、R6、R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２０】
（７） 低分子化合物が、一般式（３）
【化３】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5及びR6は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２１】
（８） 低分子化合物が、一般式（４）
【化４】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12、及びR13は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。二重片側破線は単結合または二重結合を表す。二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］で表される化合物である、（６）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２２】
（９） R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、及びR13が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、（８）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２３】
（１０） 低分子化合物が、一般式（５）
【化５】
ただし、Aは水素原子もしくは
【化６】
を表す。
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（６）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２４】
（１１） R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、及びR12が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、（１０）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２５】
（１２） 低分子化合物が、一般式（６）
【化７】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は前記請求項７中の定義と同義である。R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、（７）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２６】
（１３） R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9がそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、（１２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２７】
（１４） R1、R2、R3、R4、R8、R9及びR10が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R11が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、R13が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、二級アミノカルボニル基、三級アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基である、（８）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２８】
（１５） R1、R2、R3、R4、R8、及びR9が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R10が水素原子又は低級アルキル基であり、R11が、水素原子、またはニトロ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、低級アルコキシカルボニル基、または低級アルコキシ基である、（１０）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００２９】
（１６） R1およびR2が水素原子であり、R3がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、R4がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり、R5が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基、またはアリールアミノビニル基であり、R6がニトロ基であり、R7、R8、及びR9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子である、（１２）に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００３０】
（１７） 低分子化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させる作用を有する化合物である、（１）〜（１６）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（１８） 低分子化合物が、ＳＳＥＡ−４抗原発現量を増加させる作用を有する化合物である、（１）〜（１７）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
（１９） 低分子化合物が、Nａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物である（１）〜（１８）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【００３１】
（２０） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いてヒト胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とするヒト胚性幹細胞培養方法。
（２１） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
（２２） ヒト胚性幹細胞分化抑制剤の濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする（２１）に記載の培地。
【００３２】
（２３） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞。
（２４） （１）〜（１９）のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
（２５） 細胞または組織が生体内へ移植するためのものである（２３）または（２４）に記載の細胞または組織。
（２６） （２３）〜（２５）のいずれかに記載の細胞または／および組織を生体内に移植する治療方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、ヒト胚性幹細胞を未分化状態で増殖させる効果を有する。そして、本分化抑制剤を用いて培養したヒト胚性幹細胞を用いて医療用の細胞や組織を作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下の用語は他で述べない限り、以下に提供されるように定義される。
本明細書で使用される他の全ての用語は、他に述べない限り、その用語に関する特定の分野でのその語法に関して定義される。
幹細胞：幹細胞とは、特異化された機能を有する他の細胞型、即ち、最終的に分化した細胞、もしくは、より狭い範囲の細胞型に分化可能な他の幹細胞型に分化し得る細胞を指す。
全能性幹細胞：全能性幹細胞とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る細胞のことを言う。
【００３５】
多能性幹細胞：多能性幹細胞とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る細胞をいう。多能性細胞の１つの例は、造血幹細胞であり、この細胞はリンパ球および赤血球のような種々の血液細胞型へと分化し得る。
胚性幹細胞：胚性幹細胞とは、幹細胞の中でも特に前着床段階の胚の、桑実胚または胚盤胞段階から得られた全能性の細胞をいい、ＥＳ細胞とも呼ばれる。また、胚性幹細胞には、精子あるいは卵子になると決まっている、胚または胎児（胎仔）の始原生殖細胞に由来する多能性の幹細胞のことをいう場合もある。ただし、この細胞は胚性生殖（Embryonic Germ、EG）細胞と呼ばれて胚性幹細胞と区別される場合もある。本明細書中で用いる胚性幹細胞は、いかなる動物種のものであってよく、例えばヒトを含む霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類などの胚性幹細胞が挙げられる。
【００３６】
全能性：全能性とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る状態を言う。
多能性：多能性とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る状態をいう。
未分化：未分化とは、1つの細胞、或いは複数の細胞からなる任意の細胞集団が、１つまたは複数の、さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有する状態である細胞、或いは該細胞を含む細胞集団である状態であることをいう。
【００３７】
フィーダー：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダーとは、 全能性幹細胞がその上にプレートされ、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供するものをいう。
フィーダー細胞：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダー細胞とは、 全能性幹細胞がその上にプレートされる非全能性幹細胞をいい、非全能性幹細胞は、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供する。
細胞由来成分：細胞から分泌される成分、内容物、および細胞膜成分など、細胞に由来する全ての成分をいう。
【００３８】
本発明は、ヒト胚性幹細胞を未分化の状態で、増殖および維持させ得る分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用いた培地、それを用いて培養し作製された細胞株を提供する。本発明で提供するヒト胚性幹細胞分化抑制剤、培養方法および培地は、従来より簡便に、安全に、未分化のヒト胚性幹細胞を増殖しそして維持する。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を含む細胞培養方法はまた、特定の分化誘導因子、および分化誘導因子の有用な組み合わせについてスクリーニングするために使用され得る。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤、および培養方法を使用して、未分化なヒト胚性幹細胞を増殖させる能力は、重要な治療適用を有する単一もしくは複数の遺伝的改変を有するヒト胚性幹細胞系を産生する能力を含む重要な利益を提供する。
【００３９】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、化学的に安定な低分子化合物で、ヒト胚性幹細胞を未分化な状態で維持する活性を有するものであればいずれも用いることができるが、好ましくは下記一般式（１）で表される低分子化合物があげられる。
【化８】
【００４０】
式中、R1、R2、R3、及びR4は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。電子供与基とは、ベンゼン環へ電子を供与し得る置換基、電子吸引基とはベンゼン環上のπ電子を吸引する性質を有する置換基をいう。また、Hammettの置換基定数σを用いてσ＜0を電子供与基、σ＞0を電子吸引基と定義することもできる（基礎有機反応論、橋本静信ら著、三共出版、1997年）。
【００４１】
Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。
Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を1つ以上有してもよい。
【００４２】
Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。 このうち、Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環であることが望ましい。
また、Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である場合も同様に望ましい。この場合、５員環は不飽和であることが望ましく、６員環は飽和であることが望ましい。
【００４３】
さらに、Ｘで表されるアルキレン基は、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している場合が望ましい。
【００４４】
たとえば一般式（１）の例としては、式（２）で表されるようなテトラヒドロイソキノリン誘導体および一般式（３）で表されるようなインドール誘導体があげられる。
【化９】
【００４５】
式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記と同義である。R5、R6、R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【化１０】
【００４６】
式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記と同義である。R5及びR6は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【００４７】
一般式（２）で表されるテトラヒドロイソキノリン誘導体の具体例としては、式（４）
若しくは式（５）で示される構造の化合物および塩があげられる。
【化１１】
【００４８】
【化１２】
【００４９】
ただし、Aは水素原子もしくは
【化１３】
を表す。
【００５０】
式中、R1〜R13は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【００５１】
より好ましくは、R1〜R13は、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。
【００５２】
また、一般式（４）の場合、さらに好ましくは、R1、R2、R3、R4、R8、R9及びR10が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R11が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、R13が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、二級アミノカルボニル基、三級アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基があげられる。
【００５３】
一般式（５）の場合、さらに好ましくは、R1、R2、R3、R4、R8、及びR9が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R10が水素原子又は低級アルキル基であり、R11が、水素原子またはニトロ基、であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、低級アルコキシカルボニル基、または低級アルコキシ基があげられる。
【００５４】
一般式（４）の具体例として式（４）中、二重片側破線が二重結合であり、R13がアミノカルボニル基である、一般式（７）で表される化合物があげられる。
【化１４】
【００５５】
また、テトラヒドロイソンキノリン誘導体である前記一般式（４）に含まれるさらに具体的な化合物には、次のようなものが例示される。
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(4-ブロモ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-ブロモ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(4-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-p-トリルアゾ-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
【００５６】
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-スルファモイル-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-スルファモイル-フェニルアゾ)-アセトアミド
2-(4-アセチルアミノ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3-アセチルアミノ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(2-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-フェニルアゾ-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -酢酸エチルエステル
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-1-イル)-アセトアミド
【００５７】
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-メチル-アセトアミド
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)- N-フェニル-アセトアミド
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(2,3,3-トリメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -アセトニトリル
2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)- N,N-ジメチル-アセトアミド
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -酢酸
2-(2-アセチル-3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-アセチル-フェニルアゾ)- アセトアミド
【００５８】
また、一般式（５）の具体例として以下に示す一般式（８）で表される化合物があげら
れる。
【化１５】
【００５９】
また一般式（５）に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-m-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-o-トリル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(4-メトキシ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(3-メトキシ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(4-ニトロ-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(3-ニトロ-フェニル)-アセトアミド
4-[2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセチルアミノ]-安息香酸エチルエステル
3-[2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセチルアミノ]-安息香酸エチルエステル
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-フェニル-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-(2,4-ジメチル-フェニル)-アセトアミド
2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
【００６０】
一般式（３）に表されるようなインドール誘導体としては、以下の式（６）で表される化合物があげられる。
【化１６】
【００６１】
式中、R1〜R9は同一または異なった電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。このうち、好ましくは、R1〜R9はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。さらには、R1およびR2が水素原子であり、R3がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、R4がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり、R5が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基またはアリールアミノビニル基であり、R6がニトロ基であり、R7、R8、及びR9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子であることが望ましい。
【００６２】
また、一般式（６）に含まれる化合物には次のようなものが例示される。
2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール塩酸塩
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルフォリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール塩酸塩
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
【００６３】
7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イルエステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-1-（4-メトキシ-フェニル）-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
【００６４】
酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
7-[[ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)-アミノ]-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
7-[[ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)-アミノ]-メチル]-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
2-(6-ヒドロキシ-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-2-イルメチル)-イソチオウレア酢酸 2-(N,N'-ジフェニル-カーバムイミドイルスルファニルメチル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-イル エステル
酢酸 6-アセトキシ-1-(4-アセトキシ-フェニル)-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
【００６５】
2-(2-ジメチルアミノ-5-ヒドロキシ-ベンゾフラン-3-イル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
5-ブロモ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
酢酸 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-イル エステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
7-ジエチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
2-(2-ジメチルアミノ-5-ヒドロキシ-ベンゾフラン-3-イル)-6-メトキシ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-メトキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-メトキシ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル5-ブロモ-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
【００６６】
5,7-ジブロモ-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-カルボニトリル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボニトリル
1H-フロ[2,3-g]インドール-3-酢酸, 5-ヒドロキシ-1-(4-メトキシフェニル)-2,8-ジメチル-, エチルエステル
5-ブロモ-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸
5-ブロモ-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5-ブロモ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5-ブロモ-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-1-フェニル-2-フェニルスルファニルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００６７】
6-アセトキシ-5-ブロモ-2-ブロモメチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-2-ブロモメチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
ピロロ[2,3-f][1,3]ベンゾキサジン-3-酢酸, 8-エチル-1,7,8,9-テトラヒドロ-2-メチル-1-(4-ニトロフェニル)-, エチルエステル
6-アセトキシ-2-メチル-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2,4-ジメトキシ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-エトキシカルボニル-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-シアノ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(2-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００６８】
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-ブロモ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-フルオロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-5,7-ビス-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5,7-ビス-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-(4-ニトロ-フェニル)-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００６９】
7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-p-トリル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-7-ジメチルアミノメチル-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(2-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-5,7-ジニトロ-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-5,7-ジニトロ-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5,7-ジブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００７０】
5,7-ジブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
6-アセトキシ-5-ブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
5-ブロモ-1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸
1-(4-クロロ-フェニル)-6-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
1-(4-クロロ-フェニル)-6-ヒドロキシ-2-メチル-1H-インドール-3-酢酸 エチルエステル
【００７１】
Rで表される低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1-メチルプロピル、n-ヘキシル、イソヘキシル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルプロピル、2-エチルブチルなどが挙げられる。好ましくは、メチルである。
【００７２】
Rで表される低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキシロキシ、へプチロキシ、オクチロキシなどが挙げられる。好ましくはメトキシである。
【００７３】
Rで表されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられるが、好ましくは塩素または臭素である。
Rで表される低級アシル基として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられるが、好ましくはアセチルである。
【００７４】
Rで表される環状構造を形成してもよい低級アルキル基としてシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられるが、好ましくはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルである。
Rで表される低級アルコキシカルボニルとして、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポオキシカルボニルなどが挙げられるが、好ましくはメトキシカルボニルもしくはエトキシカルボニルである。
【００７５】
Rで表されるアミノカルボニルとしては、例えば、-CONR2（Rは同一でも異なってもよい水素原子、先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
Rで表される二級アミノカルボニル基としては、例えば、-CONHR（先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。また、三級アミノカルボニル基としては、例えば、-CONR2（Rは同一でも異なってもよい先に例示した低級アルキル基、置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
【００７６】
Rで表されるアミノアルキル基としては、例えば、−（CH2）n−NR2（ｎは１〜８を示すが、好ましくは１である。またRは同一でも異なっても良い水素原子、低級アルキル基、環状構造を形成しても良い低級アルキル基（環状構造中には窒素や酸素などのヘテロ原子を１〜３個含んでも良い）、置換基を有しても良いフェニル基を表す）などがあげられる。
Rで表されるアセトキシアルキルとしては、−（CH2）n−OAc（ｎは１〜８を表す）があげられるが、好ましくはｎは１である。
【００７７】
また、式（４）における二重片側破線は単結合または二重結合を表す。さらに、式（４）で表される化合物において、二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部（２箇所）に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよく、本発明で用いる化合物は、これらの幾何異性に基づく純粋な形態の幾何異性体の任意の混合物であってもよい。さらに、互変異性体を任意の比率で含んでもよい。
【００７８】
一般式(２)および（３）であらわされる化合物の塩としては、薬学的に許容しうる塩が望ましい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などを形成してもよい。
また、一般式（４）および（５）であらわされる化合物のエステル化合物も本発明の範囲であり、例えば、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、無機酸エステルなどがあげられる。
本発明において記載されている化合物名は、ＩＵＰＡＣ命名法、或いは市販のソフト（例えばChemDraw Ultra, CambridgeSoft社、米国）を用いて変換される名称を用いる。
【００７９】
本発明で用いる化合物は以下に述べる方法及びそれらに準ずる方法、または公知の方法を行うことにより製造することができる。式(９)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【００８０】
【化１７】
【００８１】
【化１８】
【００８２】
等量のチオエーテル誘導体(Ｉ)とフェニルアゾアセトアミド誘導体(ＩＩ)を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に溶解し、原料がなくなるまで還流することにより製造することができる。該誘導体(Ｉ)は公知の方法（例えば、Khim.Geterotsikl.Soedin.,No.7, p995(1990)などに記載）により、もしくは、市販品から購入することができる。具体的には、下表１に示すとおりである。
【００８３】
【表１】
【００８４】
フェニルアゾアセトアミド誘導体(ＩＩ)は、公知の手法（Materialy Ural'sk. Soveshc
h. po Spektroskopii, 4th, Sverdlovsk 1963, p205(1965), Bulletin de l'Academie Po
lonaise des Sciences, Serie des Sciences Chimiques , 14(1), p29 (1966), Am. Chem
. Soc., Div. Org. Coatings, Plastics Chem. Preprints , 23(2), p486 (1963), Zhurn
al Obshchei Khimii ,35(3), p559 (1965)、Zhurnal Obshchei Khimii, 32, p526 (1962)
など）により製造することができる。
式(９)で表される化合物は以下のスキームでも合成可能である。
【００８５】
【化１９】
【００８６】
ベンジルカルビノール誘導体と2-シアノアセトアミド誘導体とを硫酸存在下で反応することにより得られる化合物(IV)とジアゾニウム塩(V)とを反応に悪影響を及ぼさないアルコール水溶液中、塩酸存在下で反応させることにより得られる。ベンジルカルビノール誘導体は様々な誘導体が市販品から購入でき、さらに公知の方法（例えば、J.Gen.Chem.USSR, No.6, p1263(1936)により得る事が出来る。また、ジアゾニウム塩は市販のアミノベンゼン誘導体を塩酸、亜硝酸ナトリウム水溶液により公知の方法で誘導できる。
【００８７】
式(９)で表される化合物のうち、2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex, ロシア）、2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン) -2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド（Asinex, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド（PHARMEKS, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド（PHARMEKS, ロシア）、2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド（IBS, ロシア）は市販品であり、サプライヤーから入手することが出来る。
【００８８】
式(９)で表される化合物の中で、R5がメチル基である場合の製造法を以下に示す。反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、アセトニトリルのニトリル類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に式(4)で表される化合物（R5=-H）及び炭酸ナトリウムを加えて溶解し、ヨウ化メチルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類）に溶解したものをゆっくり滴下し、還流することにより製造することができる。
【００８９】
式(９)で表される化合物の中で、R5がアセチル基である場合の製造法を以下に示す。氷浴下、式(９)で表される化合物（R5=-H）及びジメチルアミノピリジンをピリジンに溶解し、無水酢酸を加え、攪拌することにより製造することができる。
【００９０】
式(１１)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２０】
【００９１】
式(９)で表される化合物を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類）に溶解し、塩化チオニルを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類）に溶解したものを氷浴下で滴下することにより製造できる。
【００９２】
式(１２)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２１】
【００９３】
エタノールに水酸化カリウム及び式(９)で表される化合物を加え、還流することにより製造することができる。
【００９４】
式(１３)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２２】
【００９５】
式(１２)で表される化合物をエタノールに懸濁し、冷却しながら塩化チオニルをゆっくり滴下し、室温で攪拌することにより製造することができる。
【００９６】
式(１４)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２３】
【００９７】
式(１２)で表される化合物、該当する１級または２級アミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンを反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類など）に溶解し、これにHBTU（Advanced ChemTech社、米国）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒など）に溶解したものを加えた。室温で攪拌することにより製造することができる。
【００９８】
式(１０)で表される化合物の製造法を以下に示す。
【化２４】
【００９９】
反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、アセトニトリルのニトリル類など）に式(９)及び(１１)〜(１４)で表される化合物を溶解し、トリフェニルすず水素化物（Aldrich、米国）を反応に悪影響を及ぼさない適当な溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類）に溶解したものを前記溶媒に加え、還流することにより製造することができる。
【０１００】
一般式（４）で示される化合物は、適当な溶媒に溶解させることができるが、溶媒中においてはそのままで、或いは下記式（１５）で表される還元型で、あるいはその混合物として存在してもよい。
【化２５】
【０１０１】
かくして得られる本発明で用いる化合物またはその塩は、例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィーなどの通常の分離手段により単離、精製することができる。かくして本発明で用いる化合物が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じた方法によって塩に変換することができる。逆に塩で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じた方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。化合物またはその塩が不斉炭素を有する場合もあるが、光学活性の混合物（ラセミ体）として得られた場合には、通常の光学分割手段によりそれぞれの光学活性に分離することができる。
【０１０２】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤における有効成分である低分子化合物の濃度としては、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用することが望ましく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲で使用することである。
【０１０３】
また、本発明の分化抑制剤はSTAT3(signaltransducer and activator of transcription 3)の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物、特にテトラヒドロイソキノリン誘導体を含む。特定のマウス系統の胚性幹細胞は、マウス胎仔由来の線維芽細胞からなるフィーダー細胞の存在、非存在にかかわらず、LIFによって未分化が維持される。LIFはSTAT3の活性化を介して下流にシグナルを伝えることが知られている（Matsudaら、EMBO Journal、18、15、p4261、1999年）。しかし、最近になってSTAT3を活性化せずに胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制因子が存在することが報告されたことから（Daniら、Developmental Biology、 203、 p149、 1998年）、STAT3を介さない胚性幹細胞の未分化維持機構が存在すると考えられている。さらに、LIFが、霊長類胚性幹細胞の未分化維持に効果を示さないことから（Thomsonら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 92, p7844, 1995年、Thomsonら、Science, 282,p1145, 1998年、Reubinoffら、 Nature Biotech,
18, p399, 2000年）、霊長類胚性幹細胞には、LIFおよびSTAT3とは異なるシグナルによって未分化状態を維持する機構が存在することが示唆される。本発明の分化抑制剤にはSTAT3の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物が含まれる。いいかえれば、LIFとは異なる作用により胚性幹細胞の未分化を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
【０１０４】
最近、LIFおよびSTAT3を介さずに胚性幹細胞の未分化を制御する分子のひとつとしてＮａｎｏｇ遺伝子が同定された（Mitsuiら、Cell、113、p631、2003年、Chambersら、Cell、113、p643、2003年）。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、マウス、ヒトでその存在が確認され、遺伝子破壊により発現を抑制すると、胚性幹細胞の全能性は失われ、逆に、Ｎａｎｏｇ遺伝子を強発現させて発現量を増加させると、LIF非存在下でも胚性幹細胞の未分化を維持することができる。従って、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させ得る物質、例えば低分子化合物は、胚性幹細胞の未分化維持、即ち、全能性の胚性幹細胞の培養に利用することができる。
【０１０５】
また、Ｎａｎｏｇ遺伝子の強発現がSTAT3を活性化しないことから、Ｎａｎｏｇ遺伝子はLIFおよびSTAT3非依存的に胚性幹細胞の未分化を維持する。即ち、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させ得る物質、例えば低分子化合物は、LIFによる未分化維持の効果が認められない胚性幹細胞においても、その培養に用い得ることが示唆される。
【０１０６】
本発明の分化抑制剤にはＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる低分子化合物が含まれる。即ち、本発明の分化抑制剤にはＮａｎｏｇ遺伝子の発現量の増加を介して胚性幹細胞の未分化維持能を発揮する低分子化合物が含まれる。
【０１０７】
また、最近の報告によれば、ある種の骨髄由来間葉系幹細胞においても胚性幹細胞と同様に、マウス由来の幹細胞の培養はLIF依存的であるが、ヒト由来の幹細胞はLIF非依存的であることが示されている（Verfaillieら、Nature, 418,p41, 2002年）。これは、多分化能を示す幹細胞は、胚性幹細胞と同様の未分化維持機構を有していることを示唆し、従って、霊長類幹細胞においても、胚性幹細胞と同様に、LIF-STAT3経路とは異なるシグナルによって未分化が維持されている可能性が示唆される。本発明の分化抑制剤には、STAT3を介さずに細胞の未分化状態を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
【０１０８】
本発明の分化抑制剤は、動物細胞培養用基礎培地である任意の哺乳類細胞培養基本培地に添加して使用することができる。動物細胞基本培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地：DMEM、ノックアウトDMEM、グラスゴーMEM：GMEM、RPMI1640、IMDM（以上 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様としての細胞培地はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）である。さらにこれらの基礎培地に血清または血清代替物、各種増殖因子、サイトカインなど、細胞増殖や分化制御に関わる蛋白質を添加して用いることもできる。また、任意の化合物を添加しても良い。血清は、幹細胞ならびに胚性幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄養素を供給する任意の血清、または、血清ベースの溶液であり得る。このような血清の例には、ウシ胎仔血清（FCS）、ウシ血清（CS）、馬血清（HS）などがあり、また、血清代替物としては当業者に周知のもの、蛋白質、アミノ酸、脂質、ビタミンなどを単独で、或いは組み合わせて用いることができる。蛋白質としてはインスリン、トランスフェリン、アルブミン、ペプトン、FGF（Fibroblast Growth Factor）、EGF（EpitherialGrowth Factor）などが、アミノ酸としてはアルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどが、ビタミンとしては、パントテン酸、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸アミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシンなどが例示されるがこれらに限定されない。１つの実施態様において、血清はウシ胎仔血清である。より特定の実施態様において、ウシ胎仔血清は約２５％と約１％との間の濃度で提供される。さらにより特定の実施態様において、細胞培地でのウシ胎仔血清濃度は15％である。また、他の実施態様において、血清代替物はノックアウト血清リプレースメント： KSR（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）である。添加し得る細胞増殖因子としては、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｗｎｔ、Nogginなどが例示されるがこれらに限定されない。添加し得るサイトカインとしてはインターロイキン（ＩＬ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などが例示されるがこれらに限定されない。また、ＬＩＦ、ノッチリガンドなどの分化制御因子を添加することもできる。また、副腎皮質刺激ホルモン（human ACTH(1-24)）(American peptide社)などのホルモン類を添加することができる。また、添加する化合物は特に限定されないが、任意の蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストであってよく、また、任意のリン酸化阻害剤であっても良い。１つの実施態様に於いて、ＰＤ９８０５９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）が提供される。また、他の実施態様に於いて6-ブロモインジルビン-3オキシムが提供される。
【０１０９】
細胞培地は、抗酸化剤（還元剤）（例えば、β−メルカプトエタノール）も含む。ある好適な実施態様において、β−メルカプトエタノールは、約0.1mMの濃度を有する。他の抗酸化剤 （例えば、モノチオグリセロール、もしくは、ジチオス レイトール（DTT）の単独もしくは組み合わせ）が同様の効果のために使用され得る。さらに他の等価な物質は、細胞培養の分野の当業者に周知である。
【０１１０】
本発明の分化抑制剤ならびにその有効成分は、任意の培養基材とともにあるいは培養基材に固定して使用することもできる。培養基材には多孔質体を使用することがでる。多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、その材質、厚さ、形状、寸法などは特に限定はない。多孔質体の材質は、有機材料、無機材料及び有機材料と無機材料からなる複合材料であっても良い。多孔質体の形状は平板状、球状、棒状、繊維状、中空状のいずれの形態であっても良く、例えば、フィルム、シート、膜、板、不織布、ろ紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。細胞を培養するにあたって、３次元的に培養できるように細胞を支持する孔の大きさを簡単に制御できることや、基材作製の容易さ及びコストなどを考慮すると不織布がより好ましい。多孔質体の孔の大きさについては、特に限定はないが、細胞を３次元的に支持できるようにすることを考慮すると、平均孔径が、0.1μm以上100μm以下であることが好ましく、１μm以上50μm以下がさらに好ましい。繊維径については特に限定はないが、0.03デニール以下が好ましい。
【０１１１】
上記の多孔質体は、細胞の接着性や分化維持機能、増殖能を向上させるために、高分子化合物により表面コーティング処理を施されていてもよい。高分子物質とは、１種以上の繰り返し構成単位の単量体が１次元、２次元、３次元的に連なった分子量数百以上の物質のことをいう。高分子物質は、大きく天然高分子物質、半合成高分子物質、合成高分子物質の３つに分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。
【０１１２】
例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類及びゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲン等に代表されるタンパク質等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
【０１１３】
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質やペプチド並びに有機合成高分子物質がさらに好ましい。一つの実施態様に於いて、培養基材はゼラチンである。また、他の実施態様においては、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、もしくは、BD Purematrixペプチドハイドロゲル （BD Biosciences社）である。
【０１１４】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を固定した培養基材を細胞捕捉材として用いることにより、複数の異なる細胞からなる集団から、ヒト胚性幹細胞を分離し、かつ、培養を行える方法及び装置が提供され得る。即ち、ヒト胚性幹細胞と、除去対象細胞を含む細胞含有液を本発明の分化抑制剤を固定した、多孔質体などの培養基材からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、細胞捕捉材に胚性幹細胞を捕捉させ、除去対象細胞を容器外に導出した後に容器ごと培養することを特徴とする胚性幹細胞培養方法であり、また本発明の分化抑制剤を固定化した培養基材からなる細胞捕捉材を容器に充填した細胞培養装置であって、前記細胞捕捉材は細胞培養用担体として使用し得るものであり、前記容器は細胞培養に使用し得るものであることを特徴とする細胞培養装置である。除去対象細胞とは、ヒト胚性幹細胞以外の全ての細胞をいう。また、胚性幹細胞から分化して、多分化能を失った細胞もこれに含まれる。細胞捕捉材に導入する細胞含有液としては、胚性幹細胞を含有する細胞液であればいかなるものでもよく、一例として、胚性幹細胞の培養液などがあげられる。
【０１１５】
本発明はヒト胚性幹細胞を増殖するための方法に関する。本発明の分化抑制剤を用いて増殖させたヒト胚性幹細胞の培養物を提供することができる。
【０１１６】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて培養される細胞には、公知の方法および材料を使用して入手し得る全てのヒト胚性幹細胞が含まれる。ヒト胚性幹細胞には以下の公知の方法によって入手し得る細胞が一例として挙げられる。ヒトＥＳ細胞：Thomsonら、Science, 282, p1145, 1998年、Reubinoffら、NatureBiotech, 18, p399, 2000年、Mitalipovaら、Stem Cells、21、p521、2003、Heinsら、Stem Cells, 22, p367, 2004年、ヒトEG細胞：Gearhartら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, p13726, 1998年。また、ヒトES細胞の供給機関としては、下記の研究機関が一例として挙げられる。BresaGen, Inc(米国)、Cellartis AB(スウェーデン)、ES Cell International（オーストラリア）、MizMedi Hospital-Seoul National University（韓国）、Technion Technion-Israel Institute of Technology(イスラエル)、University of California at San Francisco（米国）、Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute)（米国）、京都大学再生医科科学研究所（日本）。
【０１１７】
本発明により提供されるヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、既に単離された胚性幹細胞に用いることもできるし、または、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いてヒト胚性幹細胞を単離並びに培養することもできる。本発明の分化抑制剤を用いて培養したヒト胚性幹細胞の未分化程度は幹細胞の細胞膜上に存在するアルカリホスファターゼ（ALP）活性を測定することにより確認することができる。未分化な胚性幹細胞ではALPの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Williamsら、Nature、336、p684、1988年。Thomsonら、Science、282、 p1145,、1998年。）。不溶性基質を用いた染色法、あるいは水溶性基質を用いた分光学的測定法などによりアルカリホスファターゼ（ALP）活性を検出する方法が挙げられる。
【０１１８】
一つの実施態様において、分光学的測定法によりALP活性を定量することができる。培養ディッシュ上の細胞にパラニトロフェニルホスフェイト（pNPP）のアルカリ性溶液を添加する。細胞膜上に存在するALPによってpNPPが加水分解され、パラニトロフェノールが生じる。生成した溶液の405nmの吸光度を測定することによって、アルカリホスファターゼ活性を定量することができる。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を添加して培養したヒト胚性幹細胞のALP活性を測定すると、分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロールのヒト胚性幹細胞にくらべ有意に高いALP活性を有していることが示される。即ち本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒト胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
【０１１９】
他の実施態様において、ALP染色法によりALP活性を検出することもできる。培養ディッシュ上の細胞に、基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加する。細胞膜状に存在するアルカリホスファターゼによりリン酸エステル塩が加水分解され、次いでジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ALP活性部位に色素が沈殿する。染色されたコロニー数を計測することにより細胞のALP活性を定量化することが可能となり、即ち細胞の未分化度合いを定量することができる。実施例１（５）に記載の方法により、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて培養したヒト胚性幹細胞をALP染色すると、分化抑制剤を用いないコントロール細胞に比べ有意にALP活性が高いことが示され、即ち本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒト胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
【０１２０】
また、ヒト胚性幹細胞の未分化程度はOct-3/4遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。Oct-3/4遺伝子はPOUファミリーに属する転写因子で、ヒト胚性幹細胞、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）で、未分化状態特異的に発現し（Mitalipovaら, Stem Cells, 21, p521, 2003年、Okamotoら、Cell、60、p461、1990年）、胚発生においても未分化細胞系譜においてのみ発現し（Scholer、Trends Genet、7、 p323、 1991年）、さらに、Oct-3/4遺伝子破壊マウスのホモ個体は胚盤胞期で発生を停止することから未分化状態維持に重要な機能を有していることが明らかにされている（Nicholsら、Cell、 95、 p379、 1998年）。また、一方、Oct-3/4遺伝子の過剰発現は胚性幹細胞の分化を促進することが最近明らかにされ（Niwaら、Nat .Genet. 24、 p372、2000年）、Oct-3/4の発現量をある一定の範囲に保つことが未分化状態の維持に重要である。また、Nanog遺伝子の発現量を測定することによって、ヒト胚性幹細胞の未分化程度を確認することができる。Nanogは、NK-2ファミリーのホメオボックスを有する転写因子で、機能喪失により原始内胚葉への分化が誘導され、胚性幹細胞の自己複製維持に重要な役割を果たしている（Mitsuiら、Cell、113、p631、2003年、Chambersら、Cell、113、p643、2003年、Clark ら、22、p169、2004年、）。
Oct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子の発現量を測定する一つの実施態様としては定量的PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることができる。
【０１２１】
リアルタイムPCR技術には、ABIPRISM7700TM (Applied Biosystems)を使用したTaq Manプローブを用いる方法や、LightCyclerTM（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いた方法がある。特に後者の場合はPCRの温度サイクルが数十分で終了する高速反応サイクルのもとで、サイクルごとに合成されるDNAの増幅量変化をリアルタイムに検出できる。リアルタイムPCR法のDNA検出法としては、DNA結合色素（インターカレーター）、ハイブリダイゼーション・プローブ（キッシングプローブ）、TaqManプローブおよびSunriseユニプライマー（モレキュラー・ビーコン）を利用する４種類の方法がある。また、DNA結合色素、例えばSYBR GreenIを利用してOct-3/4遺伝子の発現量を解析することができる。SYBR GreenIはDNAの二本鎖特異的に結合色素であり、二本鎖に結合することで本来の蛍光強度が増強される。PCR反応時にSYBR GreenIを加え、伸張反応の各サイクルの終わりに蛍光強度を測定すれば、PCR産物の増加が検出できる。Oct-3/4遺伝子を検出するには通常のPCRと同様にOct-3/4遺伝子の配列をもとに、市販の遺伝子解析ソフトウェアなどを用いてプライマーを設計する。SYBR GreenIは非特異的産物も検出してしまうため最適なプライマーの設定が必要となる。設計基準としては、オリゴマーの長さ、配列の塩基組成、GC含量、およびＴｍ値などに留意が必要である。
【０１２２】
多くの場合、定量PCRにおいて明らかにすることを目的とするのは、サンプル一定量当たりの目的DNA量である。このためには最初に反応系に加えたサンプル量の評価が必要である。この場合サンプル量を反映するような内部標準となる別のDNAを目的DNAとは別に測定し、最初に反応系に加えたサンプル量を補正することができる。サンプル量を補正する目的で用いる内部標準には、通常、組織によって発現量に差がないと考えられているハウスキーピング遺伝子を用いることができる。例えば、解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素(GAPDH)、細胞骨格の構成成分であるβアクチンまたはγアクチン、リボゾームの構成蛋白質であるS26などの遺伝子が挙げられる。
【０１２３】
Oct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子の発現レベルは、本発明の分化抑制剤に暴露された細胞について決定することができる。分化抑制剤に暴露されていない、即ち、胚性幹細胞から分化誘導されたコントロール細胞のOct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子発現量にくらべ、有意にOct-3/4遺伝子及びNanog遺伝子の発現量を維持させることができる活性を有する化合物が、胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制剤であるとみなされる。
【０１２４】
最適化されたヒト胚性幹細胞の分化抑制剤をスクリーニングするさらに他の方法として、ステージ特異的胚抗原(Stage Specific Embryonic Antigen)(以後SSEAと記載)-4、TRA-1-60、TRA-1-81などの未分化な細胞に特異的に発現する抗原を検出する方法が挙げられる (Smithら、 Nature、 336、 p688、 1988年、Solterら、Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A、75、p5565、1978年、Kannagiら、EMBO J.2、p2355、1983年、Thomsonら、Science, 282, p1145, 1998年)。
【０１２５】
一つの実施態様において、SSEA-4などの表面抗原は、同抗原を認識する特異的抗体（一次抗体）とインキュベートし、さらに蛍光標識のようなレポーターと結合した第二の抗体（二次抗体）とインキュベートことにより、標識することができる。この操作により目的の抗原を発現する細胞が、蛍光性になる。次いで、標識された細胞を標準的な方法、例えばフローサイトメーターを用いて、計数、さらには分取され得る。次いで、標識および非標識細胞の数は、目的とする分化抑制剤の効果を決定するために比較され得る。あるいは、非標識細胞表面マーカー抗体に曝露された後、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）形式において、その細胞は、抗細胞表面抗原抗体（例えば抗SSEA-4抗体）に対して特異的な第二の抗体に曝露され得、そこから、所望の表面抗原を発現する細胞の数が、比色定量的に、または蛍光を測定することにより定量され得る。表面抗原を発現する細胞を定量するさらに他の方法も、細胞培養の当業者に周知である。
【０１２６】
本発明のヒトES分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞の多分化能を評価するための一つの方法として、胚様体法が挙げられる。未分化なES細胞を浮遊培養することにより、胚様体が形成され、その後、浮遊もしくはプレートに接着させて培養することにより、様々な細胞が分化誘導される。ヒトES細胞においても、心筋細胞、内皮細胞、神経前駆細胞、インスリン産生細胞などが分化誘導されることが報告されている（Conley、The International Journal of Biochemistry & Cell Biology、36、p555、2004年）。また、一つの実施様態として、ES細胞の小塊を、分化を誘導する支持細胞上や様々なマトリックス上で培養することによっても細胞分化が誘導される（Sone、Circulation、107、p2085、2003年、Kaufman、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Sates of America、98、p10716、2001年、Mummery、Circulation、107、p2085、2003年）。本発明のヒトES細胞分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞が、例えば、上記に示された誘導法で分化できれば、分化能を有するヒトES細胞であるとみなされる。一つの具体例としては、本発明のヒトES細胞分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞は、心筋・骨格筋の細胞、肝細胞、又は神経細胞などに分化させることができる。また、本発明のヒトES分化抑制剤を用いて培養されるヒトES細胞の多分化能を評価するための別の方法として、テラトーマ形成能が挙げられる。例えば、胚性幹細胞を8〜12週齢のSCIDマウスもしくはヌードマウスの皮下、腎皮膜もしくは精巣に注射し、5〜16週後に腫瘍の形成の有無を調べ、腫瘍が形成された場合には、組織学的検査を行うことにより、外胚様由来、中胚様由来、内胚様由来の細胞への分化が確認できる。例えば、本発明の分化抑制剤で培養されたヒトES細胞を上記の方法で、分化が確認できれば、多分化能を有するES細胞であるとみなされる。
【０１２７】
本発明によって提供される、ヒト胚性幹細胞の増殖に対する改善された分化抑制剤、培養方法および培養液は、ヒト胚性幹細胞が有用であるすべての技術に対して適用されることが予想される。
本発明の分化抑制剤、培養方法および培養液を用いて産生される細胞は、分化させ、細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築に使用され、生体内へ移植したり人工臓器として利用されうる。ヒト胚性幹細胞の細胞移植治療や組織工学への利用は、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できる。移植のために培養された細胞や組織は、治療のため、採取した人と同一人に戻す場合と他人に移植する場合があるが、本発明の細胞等はいずれにも用いることができる。
【０１２８】
本発明の分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを含む培養液により得られた、非改変および改変されたヒト胚性幹細胞の培養物は、ヒト胚性幹細胞のモニタリングまたは幹細胞収集を改良する物質についてスクリーニングするために使用される。例えば、推定のヒト胚性幹細胞分化誘導物質は、上記の方法を用いて増殖させた細胞培養物へ添加され得る。推定のヒト胚性幹細胞分化誘導物質を欠損した対照細胞培養物と比較して、三胚葉系列への分化を誘導し得る物質は、ヒト胚性幹細胞分化誘導因子として同定される。
【０１２９】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、優れた幹細胞未分化維持ならびに増殖能を有することから、病気または外傷などにより傷害を受けた組織または器官の治療剤として用いることができる。対象となる疾患としては、例えば皮膚関連では、熱傷、難治性皮膚潰瘍、じょくそう、肥厚性瘢痕、母斑、刺青など、骨関連では、骨折、骨粗しょう症など、軟骨関連では、変形性関節症、慢性リウマチ、椎間板ヘルニア、骨端症、スポーツ障害など、神経関連では、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、外傷による四肢の神経切断、頭頸部外科・胸部外科に伴う損傷、顔面神経麻痺、横隔膜神経損傷、骨盤内神経損傷など、歯関連では歯周病・歯槽膿漏による歯槽骨損傷、無歯症が、毛髪では男性型脱毛症が、角膜では先天性異常、内皮細胞代償不全、角膜感染による混濁、角膜変性症、角膜形状異常など、血管関連では高血圧、慢性動脈閉塞症、虚血性心疾患など、心筋では心筋梗塞、膵臓では糖尿病など、肝臓では肝炎、肝硬変、肝不全などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、上記の疾患に対して予防および／または治療剤として、経口投与または非経口投与のいずれも可能であり、薬学的に許容される担体と混合し、通常、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など固形製剤として経口投与されるか、静脈内、皮下、筋肉内などに注射剤、坐薬若しくは舌下錠などとして非経口投与される。また、舌下錠、マイクロカプセルなどの徐放製剤として、舌下、皮下および筋肉内などに投与してもよい。一日の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重、感受性差；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、通常、哺乳動物１ｋｇ体重あたり約０.０１〜１００ｍｇ、好ましくは約０.０２〜２０ｍｇ、更に好ましくは０.１〜１０ｍｇ、最も好ましくは０.５〜１０ｍｇを、通常１日１〜４回に分けて投与する。畜産または水産分野で使用する場合の投与量も上記に準ずるが、投与対象生物１ｋｇ体重あたり約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０ｍｇを、通常一日１〜３回に分けて投与する。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤の医薬組成物中の含有量は、組成物全体の約０．０１ないし１００重量％である。
【０１３１】
上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。上記賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。上記滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。上記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１３２】
上記崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。上記溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。上記懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【０１３３】
上記等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。上記緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。上記防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。上記抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【０１３４】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤に、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等脹化剤、保存剤などを添加し、公知の方法により静脈、皮下、筋肉内注射剤とすることができる。その際必要により公知の方法により凍結乾燥物とすることも可能である。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を例えばヒトに投与する場合は、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、医薬組成物として経口的または非経口的に安全に投与することができる。上記医薬組成物としては、経口剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤）、非経口剤〔例、注射剤、点滴10 剤、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）など〕が挙げられる。これらの製剤は、製剤工程において通常一般に用いられる自体公知の方法により製造することができる。
【０１３５】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、分散剤（例、ツイーン（Tween）８０（アトラスパウダー社製、米国、ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ製）ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性注射剤に、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコールなどに溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤に成形し、注射剤とすることができる。経口剤とするには、自体公知の方法に従い、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を例えば賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプンなど）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。そのコーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。腸溶性製剤とする場合、腸溶相と薬剤含有相との間に両相の分離を目的として、自体公知の方法により中間相を設けることもできる。
【０１３６】
外用剤とするには、公知の方法に従い、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を固状、半固状または液状の外用投与剤とすることができる。例えば、上記固状のものとしては、本発明化合物をそのまま、あるいは賦形剤（例、グリコール、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体など）などを添加、混合して粉状の組成物とする。上記液状のものとしては、注射剤の場合とほとんど同様に油性または水性懸濁剤とする。半固状の場合は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらはいずれも、ｐＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを加えてもよい。例えば坐剤とするには、自体公知の方法に従い、本発明化合物を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の坐剤とすることができる。上記組成物に用いる油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド〔例、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製，ドイツ）など〕、中級脂肪酸〔例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製，ドイツ）など〕、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など）などが挙げられる。また、水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール、水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが挙げられる。
【実施例】
【０１３７】
次に本発明を具体化した実施例を示す。この実施例は、本発明を実施する当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる様式においても、決して本発明の範囲を制限するものではない。また、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。以下の実施例に記載の「室温」は0ないし30℃を示す。「％」は特記しない限り重量パーセントを意味する。
【０１３８】
合成例：化合物の製造方法
[１] 3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニデン-1-アセトアミドの合成
【化２６】
【０１３９】
ベンゼンに2-シアノアセトアミド（Aldrich社、米国）を加え攪拌しながら、10℃に上がらないようにゆっくりと濃硫酸を滴下する。室温に戻した後、ジメチルベンジルカルビノール（Lancaster社、英国）を加える。約30分間還流し、室温に放冷後、反応混合液を氷水に注ぐ。抽出した水相を中和し、生じた沈殿を濾別する。乾燥後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
MS(m/z)=217(M+1)
【０１４０】
[２] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1
-イリデン)-アセトアミドの合成
【化２７】
【０１４１】
p-アミノアセトフェノン（Aldrich社、米国）をベンゼンに溶解し、塩酸ガスを通気し、得られた沈殿を濾別し、イソプロパノールにより再結晶することによりp-アミノアセトフェノン塩酸塩を得る。得られたp-アミノアセトフェノン塩酸塩を20%エタノール水溶液に溶解し、氷浴下、濃塩酸で酸性にする。亜硝酸ナトリウム水溶液を滴下し、尿素で処理することにより、ジアゾニウム塩溶液を得る。
【０１４２】
3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニデン-1-アセトアミドを20%エタノール水溶液に溶解し、濃塩酸を加える。10℃を越えないように温度を調整し、先のジアゾニウム塩溶液を加える。反応液が変化し、攪拌しながら飽和酢酸ナトリウム水溶液を加える。得られた沈殿を濾別後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
MS(m/z)=363(M+1)
【０１４３】
[３] 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1
-イリデン)-アセトアミドの合成
【化２８】
【０１４４】
m-アミノアセトフェノン（Aldrich社、米国）をベンゼンに溶解し、塩酸ガスを通気し、得られた沈殿を濾別し、イソプロパノールにより再結晶することによりp-アミノアセトフェノン塩酸塩を得る。得られたp-アミノアセトフェノン塩酸塩を20%エタノール水溶液に溶解し、氷浴下、濃塩酸で酸性にする。亜硝酸ナトリウム水溶液を滴下し、尿素で処理することにより、ジアゾニウム塩溶液を得る。
【０１４５】
3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニデン-1-アセトアミドを20%エタノール水溶液に溶解し、濃塩酸を加える。10℃を越えないように温度を調整し、先のジアゾニウム塩溶液を加える。反応液が変化し、攪拌しながら飽和酢酸ナトリウム水溶液を加える。得られた沈殿を濾別後、イソプロパノールで再結晶することにより標題化合物を得る。
MS(m/z)=363(M+1)
【０１４６】
[４] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(2,3,3-トリメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリ
ン-1-イリデン)-アセトアミドの合成
【化２９】
【０１４７】
アセトニトリルに2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）及び炭酸ナトリウムを加え、ヨウ化メチルのアセトニトリル溶液をゆっくり滴下し、還流する。還流物を室温まで放冷後、溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、蒸留水で洗浄する。その後無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=377(M+1)
【０１４８】
[５] 2-(2-アセチル-3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-
アセチル-フェニルアゾ)-アセトアミドの合成
【化３０】
【０１４９】
氷浴下、2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）及びジメチルアミノピリジンをピリジンに溶解し、無水酢酸を加える。停止後、前記反応後の溶媒を氷水に注ぎ、ジクロロメタンにより反応生成物を抽出する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=405(M+1)
【０１５０】
[６] (4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトニトリルの合成
【化３１】
【０１５１】
氷浴下、2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）、塩化チオニル及びDMFを混合し、ゆっくり攪拌する。混合溶媒から過剰の塩化チオニルを減圧留去し、反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=345(M+1)
【０１５２】
[７] (4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イ
リデン)-酢酸の合成
【化３２】
【０１５３】
エタノールに水酸化カリウム及び2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）を加え、加熱還流する。還流物を室温まで放冷後、これに蒸留水を加え、さらに塩酸を加えて中性にした後、エーテルで反応生成物を抽出する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=364(M+1)
【０１５４】
[８] (4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イ
リデン)-酢酸エチルエステルの合成
【化３３】
【０１５５】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸をエタノールに懸濁し、攪拌する。冷却しながら塩化チオニルをゆっくり滴下し、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒から溶媒を減圧留去し、水で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=392(M+1)
【０１５６】
[９] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-メチル-アセトアミドの合成
【化３４】
【０１５７】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸、メチルアミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンをDMFに溶解し、HBTU（Advanced ChemTech社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=377(M+1)
【０１５８】
[１０] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N,N-ジメチル-アセトアミドの合成
【化３５】
【０１５９】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸、ジメチルアミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンをDMFに溶解し、HBTU（Advanced ChemTech社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=391(M+1)
【０１６０】
[１１] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-フェニル-アセトアミドの合成
【化３６】
【０１６１】
(4-アセチル-フェニルアゾ)-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-酢酸、フェニルアミン、HOBt（Advanced ChemTech社、米国）及びトリエチルアミンをDMFに溶解し、HBTU（Advanced ChemTech社、米国）のジクロロメタン溶液を加え、その後、室温で攪拌する。攪拌混合溶媒を飽和塩化ナトリウム水溶液、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。反応生成物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、これを濾別した後、溶媒を減圧留去する。反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=439(M+1)
【０１６２】
[１２] 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-1-イル)-アセトアミドの合成
【化３７】
【０１６３】
窒素気流下、アセトニトリルに2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド（Asinex社, ロシア）を溶解したものに、トリフェニルすず水素化物（Aldrich、米国）を溶解したキシレンを加え、還流する。還流物を室温まで放冷し、不溶物を濾別する。濾液から溶媒を減圧留去し、反応生成物を含む残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得る。
MS(m/z)=365(M+1)
【０１６４】
実施例１
（１）ヒトＥＳ細胞の培養
ヒトＥＳ細胞培養培地として、ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヒアルロン酸を添加したＶｉｔｒｏＨＥＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ）培地、または、20％FBS（Hyclone, Utha）、β-メルカプトエタノール-0.1 mM（GIBCO）、非必須アミノ酸-NEAA 1%（GIBCO）、Ｌ−グルタミン2mM（GIBCO）、ペニシリン50u/ml (GIBCO)およびストレプトマイシン50μg/ml（GIBCO）を添加したＤＭＥＭ（GIBCO）、または20％KSR（Invitrogen）、β-メルカプトエタノール-0.1 mM（GIBCO）、非必須アミノ酸-NEAA 1%（GIBCO）、Ｌ−グルタミン2mM（GIBCO）、ペニシリン50u/ml (GIBCO)およびストレプトマイシン50μg/ml（GIBCO）を添加したノックアウトＤＭＥＭ（GIBCO）を調製する。また、ヒトＥＳ細胞培養用のマウスフィーダー細胞用の培地として、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社製 １１９６０−０４４）に、以下に示す最終濃度で各因子を添加して調製する。１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２ｍＭ Ｌ―Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｇ７５１３）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＳＩＧＭＡ Ｐ０７８１）。
【０１６５】
直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に０．１％の濃度でＧｅｌａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製 TypeA:from porcinESkin、G2500）を溶解し、滅菌して作製した０．１％ゼラチン水溶液５ｍｌを添加し、３７℃で３０分以上静置する。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンC（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 ＹＥ９２８４４００）２×106個を播種し、前記のフィーダー細胞用培地を用いて３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養する。ヒトＥＳ細胞を、マウス胚性初代培養細胞に播種し、５ｍｌのヒトＥＳ細胞培養培地で、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養して増殖させる。
【０１６６】
尚、ヒトＥＳ細胞は、表２に記載の研究機関から入手することができる。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
（２）ヒトＥＳ細胞の調製
前記（１）の「ヒトＥＳ細胞の培養」に記載の方法に従って培養するヒトＥＳ細胞を、ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳを用い、マイクロピペットによってヒトＥＳ細胞のコロニーを機械的に単離し、または、ＣａおよびＭｇを含有するＰＢＳ中で、マイクロピペットを使用してコロニーの領域をこすり取ることによりコロニーを切断し、次いで、ディスパーゼ（Gibco）10 mg/mlを含有する通常の平衡化したヒト胚性幹細胞培地に変更し、37℃、5％ＣＯ2においてインキュベーションすることによりコロニーを解離してヒトＥＳ細胞を得る。
【０１６９】
（３）マトリゲルコートディッシュの作製
グロースファクターリデュースド(GFR)BDマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354230、日本）及びBDマトリゲル基底膜マトリックス（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354234）を２〜８℃の冷蔵庫で一晩解凍し、冷やしたピペットを用いてゆっくりと混合する。冷却したDMEM／F12 1：1 (Ｓｉｇｍａ社製、Ｄ６４２１、米国)でマトリゲルを20倍希釈し、培養ディッシュに加え、室温で1時間インキュベートする。溶液を除去し、DMEM／F12 1：1で洗浄し、マトリゲルコートディッシュを得る。
【０１７０】
（４）ＥＳ細胞分化抑制剤アッセイ
前記の（２）ヒトＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製するヒトＥＳ細胞を３〜５倍に培地で希釈し、予めマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製）でコートした直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュ１枚当たり４．５ｍｌを播種する。次いで、各ディッシュに８〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した以下に記載の本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養する。２〜４日毎に前記（２）の「ヒトＥＳ細胞の調製」に記載の方法に従って継代する。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにする。
【０１７１】
実施例で用いるヒト胚性幹細胞分化抑制剤
Ａ： 2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
Ｂ： 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｃ： 2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｄ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｅ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｆ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-トリルアゾ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｇ： 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｈ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
ａ： 2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｂ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｃ： 2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｄ： 2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｅ： 1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｆ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｇ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｈ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルホリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｉ： 7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｊ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｋ： 7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｌ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｍ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｎ： 酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イル エステル
ｏ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｐ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｑ： 7-ジメチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｒ： 酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｓ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｔ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｕ： 酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｖ： 1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｗ： 酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｘ： 5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
【０１７２】
（５）アルカリホスファターゼ染色
前記（４）の「ES細胞分化抑制剤アッセイ」に記載の方法に従い培養して得られるヒトＥＳ細胞を、アルカリホスファターゼ染色キット(SIGMADiagnostic社製 Cat.No.86-R)を用いて染色する。即ち、各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を2mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で１回洗浄後、2mlの細胞固定液（25mlクエン酸溶液(SIGMA社製 Cat.No.91-5)、65mlアセトン、8ml 37％ホルムアルデヒド）を各穴に加え、室温で30秒静置する。固定液を吸引除去し、2mlの脱イオン水を各ウェルに加えて45秒室温で静置する。脱イオン水を吸引除去し、ついでアルカリホスファターゼ染色液（1ml亜硝酸ナトリウム溶液、1ml ファーストレッドバイオレットLBソルト溶液、1mlナフトールAS-BIアルカリ溶液、45ml蒸留水）を1ウェルあたり2ml加え15分間室温で静置後、染色液を吸引除去し、脱イオン水2mlで洗浄すれば、ヒトＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ染色像が得られる。
【０１７３】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤存在下で培養して得られるヒトES細胞は、分化抑制剤を含まない培地にて培養して得られるヒトES細胞に比べ、有意アルカリホスファターゼ活性が亢進していることが確認できる。従って、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒトES細胞の未分化維持効果を有することを確認することができる。
【０１７４】
（６）ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現検討
前記の（４）ES細胞分化抑制剤アッセイに示す方法で培養したヒトES細胞からISOGEN（株式会社ニッポンジーン社製、日本）を用い、添付の方法に従ってトータルRNAを抽出する。即ち、培養後のディッシュから培地を除去し、PBS 10mlで二回洗浄し、ISOGENE 1mlに溶解する。室温で５分間静置した後、1.5mlのエッペンドルフチューブに回収する。クロロホルム（和光純薬）を0.2ml加え、15秒間振とうし、２〜3分間室温で静置した。微量遠心機（トミー精工）で4℃、10000ｒｐｍで１５分間遠心する。上清400μｌを新しい1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、500μｌのイソプロパノール（和光純薬）を加え、室温で10分間静置後、微量遠心機にて4℃、10000ｒｐｍで１0分間遠心する。上清を除去後、70%エタノール水溶液を1ml加え、振とう後、微量遠心機にて4℃、10000ｒｐｍ、約5分間遠心する。上澄みを除去して沈殿を乾燥させた後、30μlの蒸留水に溶解させ、トータルRNA溶液を得る。
【０１７５】
このようにして得られるトータルＲＮＡの２μｇ を鋳型に、ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Oligo(dT)12-18プライマー(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 18418-012)、オムニスクリプトリバーストランスクリプターゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い添付のプロトコールに従ってcDNAを合成する。即ち、トータルＲＮＡ２μｇに１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅR１μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と蒸留水を加えて１０μｌとなるように反応液を調製し、室温で１０分間インキュベートする。２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μｌ加えて、６５℃で１０分間加熱し、室温に戻した後、２μｌの１０× Ｂｕｆｆｅｒ ＲＴ、２μｌの５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２μｌのOligo(dT)12-18プライマー、０．２５μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１０７７７−０１９）、１μｌのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え、ＲＮａｓｅフリー精製水で全量２０μｌに合わせ、次いで３７℃で６０分間インキュベートし、ｃＤＮＡ溶液を得る。このようにして得られる合成ｃＤＮＡの一部を蒸留水で５倍に希釈し、その２μlを鋳型として、ライトサイクラーファーストスタートDNA マスターSYBRグリーンI キット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い添付のプロトコールに従ってPCR を行う。Oct-3/4 遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、並びに内部標準としてグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子の発現量を測定する。Oct-3/4 遺伝子の増幅には、センスプライマーOCT3 up（配列表配列番号１）、およびアンチセンスプライマーOct3 down(配列表配列番号２)を用い、Ｎａｎｏｇ遺伝子の増幅には、センスプライマーＮａｎｏｇ up（配列表配列番号５）、およびアンチセンスプライマーＮａｎｏｇ＿down(配列表配列番号６)を用い、GAPDH 遺伝子の増幅には、センスプライマーGAPDH up (配列表配列番号３)、およびアンチセンスプライマーGAPDH down（配列表配列番号４）を用いる。PCR 反応液の組成と反応条件を以下にそれぞれ示す。
【０１７６】
【表３】
【０１７７】
【表４】
【０１７８】
【表５】
【０１７９】
【表６】
【０１８０】
本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤存在下で培養したヒトＥＳ細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現が、分化抑制剤を含まない培地にて培養したヒトES細胞に比べ有意に維持されていることが確認できる。従って、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤が、ヒトES細胞の未分化維持効果を有することを確認することができる。
【０１８１】
（７）ヒトＥＳ細胞のマーカー蛋白の発現検討
前記（４）の「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ」に記載の方法に従って培養して得られるヒトＥＳ細胞のヒトＥＳ細胞マーカー蛋白を確認する。PBSで2回洗浄し、セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離し、細胞数が6×105個になるように2％FBSを含むHanks balanced salt solution(HBSS、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)を添加する。ヒトES細胞表面抗原、ＳＳＥＡ-４、TRA-1-60、TRA-1-81に対する抗体（いずれもCHEMICON社製）をHBSSでそれぞれ希釈して加え、40分間氷上で静置する。HBSS(1ml)で二回洗浄後、HBSS (300μl)に再分散し、2次抗体として、HBSSに希釈したFITC-Goat anti Mouse IgM、またはIgG抗体（Ｚｙｍｅｄ社製、米国）を加え30分間、遮光して氷上で静置する。HBSS(1ml)で二回洗浄後、HBSS (1ml)に再分散し、20μg/ml PI溶液(Dojindo社製)を100μl加え、フローサイトメーター測定に用いるサンプルを得る。またフローサイトメーター測定に用いるサンプルは、凝集塊を除く目的で孔径100μmのナイロン・メッシュに通した後に測定を行う。フローサイトメーターはFACSCalibur(BECTON DICKINSON社製、米国)を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアはCELLQuest(BECTON DICKINSON社製、米国)を用いる。本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を添加して培養したヒトES細胞は、分化抑制剤を含有しない培地にて培養して得られるヒトES細胞に比べ、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１抗原の発現が有意に亢進していることが確認できる。即ち、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、未分化なヒトES細胞を維持することが確認できる。
【０１８２】
実施例２
（１）ヒトＥＳ細胞の培養
ヒトＥＳ細胞培養培地として、vitroHES medium (Vitrolife AB) に終濃度が4 ng/mlになるよう Human recombinant basic FGF (bFGF) (Invitrogen, 13256-029)を添加した培地、またはDMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421) 400ml、Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen 10828-028) 100ml、非必須アミノ酸溶液(Sigma M7145) 5ml、100mM ピルビン酸ナトリウム(Sigma S-8636)5ml、200mM L-グルタミン(Sigma G7513) 5ml、終濃度が5ng/mlになるようbFGFを添加した培地を調整した。また、ヒトＥＳ細胞培養用のマウスフィーダー細胞用の培地として、DMEM（Invitrogen, 11960-044）に、以下に示す最終濃度で各因子を添加して調製した。10%ウシ胎仔血清（Invitrogen）、2mM L-グルタミン（Sigma G7513）、1×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Sigma P0781）。
【０１８３】
直径6cmの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に0.1%の濃度でゼラチン（Sigma, TypeA:from porcinESkin、G2500）を溶解し、滅菌して作製した0.1%ゼラチン水溶液を5ml添加し、37℃で30分以上静置した。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンC（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（Invitrogen, YE9284400）1.5×106個を播種し、前記のフィーダー細胞用培地を用いて37℃、5%CO2インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養した。ヒトES細胞（Cellartis AB,スウェーデン, SA181株）を、マウス胚性初代培養細胞上に播種し、５mlのヒトES細胞培養培地で、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。3日から４日に一度継代を行い、継代には、0.1%コラゲナーゼ溶液(Wako, 032-10534)を用いた。
【０１８４】
（２）マトリゲルコートディッシュの作製
グロースファクターリデュースド(GFR)BDマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354230）及びBDマトリゲル基底膜マトリックス（日本ベクトン・ディッキンソン社製、354234）を2〜8℃の冷蔵庫で一晩解凍し、冷やしたピペットを用いてゆっくりと混合する。冷却したDMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421)でマトリゲルを20倍希釈し、培養ディッシュに加え、室温で2時間静置した。溶液を除去し、DMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421)で洗浄し、マトリゲルコートディッシュを得た。
【０１８５】
（３）ヒトES細胞の無フィーダー培養
前記（１）ヒトＥＳ細胞の調製に記載の方法に従って調製したヒトＥＳ細胞をマトリゲル（BectonDickinson）コートしたディッシュに播種し、無フィーダー培養を開始した。この際、使用した培地は、DMEM/HamF-12 1:1(Sigma D6421) 400ml, Knockout Serum Replacement (KSR) )(Invitrogen 10828-028) 100ml, 非必須アミノ酸溶液(Sigma M7145)5ml, 100mM ピルビン酸ナトリウム(Sigma S-8636)5ml, 200mM L-グルタミン (Sigma G7513) 5mlに、5ng/ml bFGF(Invitrogen, 13256-029) とDMSO(×2000) または本発明の分化抑制剤(終濃度 2μg/ml) を添加した。培地交換は2日に一度行った。継代は、0．25％ Tripsin＋20% KSR＋1mM CaCl2 を加えて、37℃で5分反応させた後、ピペッティングでコロニーをディッシュから解離させ、適当なコロニーサイズになるようにコロニーを分割して、新しいマトリゲルコートしたディッシュに播種した。
【０１８６】
実施例で用いたヒト胚性幹細胞分化抑制剤
Ａ： 2-シアノ-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-N-p-トリル-アセトアミド
Ｂ： 2-(4-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｃ： 2-(3-クロロ-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｄ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-メトキシ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｅ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(3-ニトロ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｆ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-(4-トリルアゾ-フェニルアゾ)-アセトアミド
Ｇ： 2-(3-アセチル-フェニルアゾ)-2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-アセトアミド
Ｈ： 2-(3,3-ジメチル-3,4-ジヒドロ-2H-イソキノリン-1-イリデン)-2-m-トリルアゾ-アセトアミド
ａ： 2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｂ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｃ： 2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｄ： 2-[2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-ビニル]-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｅ： 1-(2-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｆ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｇ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｈ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-7-モルホリン-4-イルメチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｉ： 7-[(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-メチル]-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｊ： 7-ジメチルアミノメチル-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル) -3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｋ： 7-ジエチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｌ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｍ： 1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｎ： 酢酸 7-アセトキシメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-イル エステル
ｏ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-7-ピペリジン-1-イルメチル-1H-インドール-6-オール
ｐ： 7-ジメチルアミノメチル-2-メチル-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オールｑ： 7-ジメチルアミノメチル-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｒ： 酢酸 6-アセトキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｓ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-p-トリル-1H-インドール-6-オール
ｔ： 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-3-ニトロ-1-フェニル-1H-インドール-6-オール
ｕ： 酢酸 6-アセトキシ-2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｖ： 1-(4-クロロ-フェニル)-2-メチル-3-ニトロ-1H-インドール-6-オール
ｗ： 酢酸 2-(2-ジメチルアミノ-ビニル)-6-ヒドロキシ-1-(4-メトキシ-フェニル)-3-ニトロ-1H-インドール-7-イルメチル エステル
ｘ： 5-ヒドロキシ-2-メチル-4,6-ジニトロ-1-フェニル-1H-インドール-3-カルボン酸エチルエステル
【０１８７】
前記（３）で示した方法に従って培養したヒトES細胞の形態を図１に示した。分化抑制剤を含まない培地(DMSO 0.05%)で培養した場合、数継代で死滅するのに対して、本発明の分化抑制剤bを含む培地で培養した場合、長期間（図１に8継代及び48継代の写真を示した）にわたり増殖し、かつ、ヒトES細胞に特徴的な扁平なコロニー及び高い核／細胞質比を示した。他の分化抑制剤についても同様の検討を行ったところ、同様の結果が得られ、本発明の分化抑制剤は、未分化なヒトES細胞を維持することが明らかとなった。
【０１８８】
（４）ヒトＥＳ細胞のマーカー蛋白の発現検討
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞のヒトＥＳ細胞マーカー蛋白をES cell characterization kit(Chemicon, SCR001)を用いて免疫染色により確認した。また、一次抗体は、キットに付属のSSEA-4モノクローナル抗体、TRA-1-60 抗体、TRA-1-81 抗体、を用い、二次抗体は、Fluorolink Cy3 labelled goat anti-mouse IgG(H+L) (Amersham Biosciences, PA43002)、GOAT ANTI-MOUSE IgM AFFINITY PURIFIED, CY3-CONJUGATE SECONDARY ANTIBODY（Chemicon, AP128C）を用い、添付の方法に従って免疫染色を行った。即ち、PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒドPBS溶液を添加し、15分から20分間室温で静置し、固定した。PBSで洗浄後、10%BSA PBS溶液を添加し、30分間室温でブロッキングした。1%BSA PBS溶液で500倍希釈した一次抗体を添加し、室温で2〜3時間静置した。PBSで洗浄後、1%BSA PBS溶液で希釈した二次抗体を添加し、室温で1〜2時間静置した。PBSで洗浄後、顕微鏡により観察した。図２に染色図を示した。前記（３）に記載したように本発明の分化抑制剤で培養されたヒトES細胞は、ヒトES細胞の未分化に特異的なマーカーである、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81を発現しており本発明の分化抑制剤がヒトES細胞の、未分化維持効果を有してしていることが明らかとなった。
【０１８９】
（５）多分化能の評価１（胚様体形成による分化誘導）
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞のコロニーを、ディスパーゼ(Becton Dickinson, 354235)を用いて剥離した。ヒトES細胞培養培地(vitroHES medium (Vitrolife) に4ng/ml b FGFを添加) に懸濁し、約5日浮遊培養して胚様体を形成させ、さらに、分化誘導培地(DMEM/HamF-12 1:1 に15% FBS, 1mM L-グルタミン、 0.1 mM 2-mercaptoethanolを添加)中で、約5日間浮遊培養を行った。その後、ゼラチンコートディッシュに播種し、分化誘導培地で1週間から10日程度接着培養した。
【０１９０】
得られた細胞の免疫染色を前記（４）記載の方法で同様に行った。また、必要であれば、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄後、0.1%Triton X-100/PBS溶液で5分間室温処理を行った。その際、一次抗体は、抗muscle actin ポリクローナル抗体 (DAKO)、抗α-fetoproteinモノクローナル抗体(Sigma)を用いた。結果を図３に示した。心筋・骨格筋のマーカーであるMuscle actin及び肝細胞のマーカーであるα-fetoprotinの発現が認められ、本発明の分化抑制剤存在下で培養されたヒトES細胞は多分化能を有することが明らかとなった。
【０１９１】
（６）多分化能の評価２（神経分化誘導）
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞のコロニーを、ディスパーゼ(Becton Dickinson, 354235)を用いて剥離した。コロニーは、神経培養培地（住友ベークライト, MB-X9501）に20ng/mlのbFGF を加えた培地中で浮遊培養して胚様体を形成させた。bFGFを毎日添加し、13日間培養した後、凝集塊を5μg/ml Laminin((Becton Dickinson, 334239)をコートしたPoly-L-Lysine(PLL)コーティングディッシュ(住友ベークライト)に播種し、1週間ほど接着培養を行った。
【０１９２】
得られた細胞の免疫染色を前記（４）記載の方法で同様に行った。また、必要であれば、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄後、0.1%Triton X-100/PBS溶液で5分間室温処理を行った。その際、一次抗体は、抗βIII-tubulin mAb (TuJ1)(Chemicon)、 抗MAP2 mAb (Sigma)、抗 Glial fibrillary acidic protein (GFAP) pAb (Chemicon)を用いた。結果を図４に示した。神経細胞のマーカーであるTuJ1、MAP2、、GFAPの発現が認められ、本発明の分化抑制剤存在下で培養されたヒトES細胞は神経分化能を有することが明らかとなった。
【０１９３】
（７）多分化能の評価３
前記（３）の「ヒトES細胞の無フィーダー培養」に記載の方法、即ち本発明の分化抑制剤を含む培地で培養して得られたヒトＥＳ細胞を、0.1%コラゲナーゼもしくはディスパーゼ(Becton Dickinson, 354235)を用いてES細胞を剥離し、6週齢、雄のSCIDマウスの皮下に移植した。二ヶ月後、形成された腫瘍を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後に、切片を作成、ヘマトキシリン−エオジン染色（HE染色）して組織学的検査を行った。その結果、HE染色図を図５に示した。腫瘍は、三胚葉、即ち、外胚葉、内胚葉、中胚葉に由来する細胞群で構成されていた。外胚葉由来組織としては、ニューロン、グリア、メラノサイトが、、中胚葉由来組織としては、骨格筋、骨、軟骨が、また、内胚葉由来組織としては消化管上皮および平滑筋などが観察された。即ち本発明の分化抑制剤は、ヒトES細胞の、内胚葉、外胚葉、中胚葉の三胚葉への分化能を維持したまま増殖させ得る活性を有する。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
本発明によれば、ヒト胚性幹細胞を、未分化なまま、期間を延長してまたは無期限に、大量にかつ安全に増殖させることができる。本発明によって提供されるヒト胚性幹細胞分化抑制剤、それを用いた培養方法、培地は、細胞移植用途で用いる細胞ソースとしてのヒト胚性幹細胞を産生するために適用され得る。ヒト胚性幹細胞を利用することにより得られる多くの恩恵に加え、本発明によって提供されるヒト胚性幹細胞分化抑制剤およびそれを用いた培養方法は、１つもしくは多数の遺伝的な改変を有するヒト胚性幹細胞を産生するために適用され得る。このような適用の例は、疾患について細胞ベースでのモデルの開発、ならびに遺伝病を処置するために移植について特異化された組織の開発を含むが、これに限定されない。
【０１９５】
上記の通り、本発明のヒト胚性幹細胞分化抑制剤は、ヒト胚性幹細胞を未分化状態で増殖させることができ、その結果培養された細胞や組織を再生医療分野で好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞の形態の写真を示す。
【図２】図２は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞のマーカー蛋白の発現結果を示す。
【図３】図３は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞の分化誘導後のマーカー蛋白の発現結果を示す。
【図４】図４は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞の神経分化誘導誘導後のマーカー蛋白の発現結果を示す。
【図５】図５は、分化抑制剤b存在下で培養されたヒトES細胞のテラトーマ形成後の組織写真を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１９７】
SEQUENCE LISTING
<110> ASAHI KASEI KABUSHIKI KAISHA
<120> Human embryo stem cell differentiation supressing agent
<130> A51942A
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The forward primer used for amplifing human Oct-3/4 gene by PCR
<400> 1
cgaccatctg ccgctttgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The reverse primer used for amplifing human Oct-3/4 gene by PCR
<400> 2
taggaatggg ggacaggggg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The forward primer used for amplifing human GAPDH gene by PCR
<400> 3
tgaacgggaa gctcactgg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The reverse primer used for amplifing human GAPDH gene by PCR
<400> 4
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The forward primer used for amplifing human Nanog gene by PCR
<400> 5
agagacagaa atacctcagc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> The reverse primer used for amplifing human Nanog gene by PCR
<400> 6
cgtcacacca ttgctattct t 21
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子化合物またはその塩を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項２】
低分子化合物が、一般式（１）
【化１】
［式中、R1、R2、R3、及びR4は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。］
で表される化合物である、請求項１に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項３】
Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項４】
Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項５】
Ｘで表されるアルキレン基が、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している、請求項２〜４の何れかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項６】
低分子化合物が、一般式（２）
【化２】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5、R6、R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項７】
低分子化合物が、一般式（３）
【化３】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5及びR6は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］
で表される化合物である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項８】
低分子化合物が、一般式（４）
【化４】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12、及びR13は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。二重片側破線は単結合または二重結合を表す。二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］で表される化合物である、請求項６に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項９】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、及びR13が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、請求項８に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１０】
低分子化合物が、一般式（５）
【化５】
ただし、Aは水素原子もしくは
【化６】
を表す。
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、請求項６に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１１】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、及びR12が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、請求項１０に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１２】
低分子化合物が、一般式（６）
【化７】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は前記請求項７中の定義と同義である。R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、請求項７に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１３】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9がそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、請求項１２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１４】
R1、R2、R3、R4、R8、R9及びR10が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R11が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、R13が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、二級アミノカルボニル基、三級アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基である、請求項８に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１５】
R1、R2、R3、R4、R8、及びR9が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R10が水素原子又は低級アルキル基であり、R11が、水素原子、またはニトロ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、低級アルコキシカルボニル基、または低級アルコキシ基である、請求項１０に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１６】
R1およびR2が水素原子であり、R3がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、R4がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり、R5が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基、またはアリールアミノビニル基であり、R6がニトロ基であり、R7、R8、及びR9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子である、請求項１２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１７】
低分子化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させる作用を有する化合物である、請求項１〜１６のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１８】
低分子化合物が、ＳＳＥＡ−４抗原発現量を増加させる作用を有する化合物である、請求項１〜１７のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１９】
低分子化合物が、Nａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物である請求項１〜１８のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いてヒト胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とするヒト胚性幹細胞培養方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
【請求項２２】
ヒト胚性幹細胞分化抑制剤の濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項２１に記載の培地。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
【請求項２５】
細胞または組織が生体内へ移植するためのものである請求項２３または２４に記載の細胞または組織。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の細胞または／および組織を生体内に移植する治療方法。
【請求項１】
低分子化合物またはその塩を有効成分として含有するヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項２】
低分子化合物が、一般式（１）
【化１】
［式中、R1、R2、R3、及びR4は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは、単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基を表す。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。］
で表される化合物である、請求項１に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項３】
Ａ環が窒素原子、酸素原子及び硫黄原子よりなる群から選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５もしくは６員環である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項４】
Ａ環が、１つの窒素原子を環内に含む５または６員環である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項５】
Ｘで表されるアルキレン基が、置換基としてアルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基及びハロゲン原子からなる群から選ばれる基及び／又は原子を１つ以上有している、請求項２〜４の何れかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項６】
低分子化合物が、一般式（２）
【化２】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5、R6、R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項７】
低分子化合物が、一般式（３）
【化３】
［式中、R1、R2、R3、R4、Ｘ及びＧは、前記請求項２中の定義と同義である。R5及びR6は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］
で表される化合物である、請求項２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項８】
低分子化合物が、一般式（４）
【化４】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12、及びR13は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。二重片側破線は単結合または二重結合を表す。二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。］で表される化合物である、請求項６に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項９】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、及びR13が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、請求項８に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１０】
低分子化合物が、一般式（５）
【化５】
ただし、Aは水素原子もしくは
【化６】
を表す。
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9は、前記請求項６中の定義と同義である。R10、R11、R12は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、請求項６に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１１】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、及びR12が、それぞれ独立に、アルキル基、アシル基、アルコキシ基、ニトロ基、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、請求項１０に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１２】
低分子化合物が、一般式（６）
【化７】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は前記請求項７中の定義と同義である。R7、R8、及びR9は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。］で表される化合物である、請求項７に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１３】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9がそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である、請求項１２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１４】
R1、R2、R3、R4、R8、R9及びR10が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7は、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R11が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、低級アシル基または低級アルコキシ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、または低級アルコキシ基であり、R13が、ヒドロキシカルボニル基、ニトリル基、カルバモイル基、モノ低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、二級アミノカルボニル基、三級アミノカルボニル基、または低級アルコキシカルボニル基である、請求項８に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１５】
R1、R2、R3、R4、R8、及びR9が水素原子であり、R5が水素原子、低級アシル基、または低級アルキル基であり、R6及びR7が、同一であっても異なってもよい低級アルキル基であり、R10が水素原子又は低級アルキル基であり、R11が、水素原子、またはニトロ基であり、R12が、水素原子、低級アルキル基、低級アシル基、低級アルコキシカルボニル基、または低級アルコキシ基である、請求項１０に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１６】
R1およびR2が水素原子であり、R3がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり、R4がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり、R5が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基、またはアリールアミノビニル基であり、R6がニトロ基であり、R7、R8、及びR9が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子である、請求項１２に記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１７】
低分子化合物がアルカリホスファターゼの活性を維持または上昇させる作用を有する化合物である、請求項１〜１６のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１８】
低分子化合物が、ＳＳＥＡ−４抗原発現量を増加させる作用を有する化合物である、請求項１〜１７のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項１９】
低分子化合物が、Nａｎｏｇ遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物である請求項１〜１８のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いてヒト胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とするヒト胚性幹細胞培養方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を有効成分として含有する培地。
【請求項２２】
ヒト胚性幹細胞分化抑制剤の濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項２１に記載の培地。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒト胚性幹細胞分化抑制剤を用いて未分化状態で培養されたヒト胚性幹細胞を分化させて得られる細胞または組織。
【請求項２５】
細胞または組織が生体内へ移植するためのものである請求項２３または２４に記載の細胞または組織。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の細胞または／および組織を生体内に移植する治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２０４２９２（Ｐ２００６−２０４２９２Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７３２９７（Ｐ２００５−３７３２９７）
【出願日】平成１７年１２月２６日（２００５．１２．２６）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２６日（２００５．１２．２６）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【Ｆターム（参考）】
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