フェリチンを基板上に二次元配列させる方法
【課題】フェリチンを基板上に二次元配列させる新たな方法であって、隣接する２つのフェリチンの間を結合させる金属イオンを不要とした方法を提供する。
【解決手段】フェリチンを基板上に二次元配列させる方法であって、前記基板の表面は親水性を有しており、前記方法は、溶媒および前記フェリチンを有する溶液を前記基板上に展開する工程、および前記基板上に展開した溶液から前記溶媒を除去する除去工程を包含し、前記フェリチンにはＮ末端に特定の配列で示されるアミノ酸配列が修飾されている。
【解決手段】フェリチンを基板上に二次元配列させる方法であって、前記基板の表面は親水性を有しており、前記方法は、溶媒および前記フェリチンを有する溶液を前記基板上に展開する工程、および前記基板上に展開した溶液から前記溶媒を除去する除去工程を包含し、前記フェリチンにはＮ末端に特定の配列で示されるアミノ酸配列が修飾されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェリチンを基板上に二次元配列させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェリチンは球状のタンパク質であり、内部には酸化鉄に代表される金属化合物を内包している。なお、内部に金属化合物を内包せず、当該内部が空洞になっている場合には、「アポフェリチン」と呼ばれる。
【０００３】
フェリチンを基板上に二次元的に配列させた後、当該フェリチンを加熱により除去し、必要に応じて金属酸化物を還元することにより、容易に金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットを得ることができる。そのため、図１に示されるように、フェリチンを基板上に二次元的に配列させることが報告されている（例えば、特許文献１や非特許特許文献１を参照）。
【特許文献１】国際公開第０３／０４００２５号公報パンフレット
【非特許文献１】Langmuir, Vol.23, p1615-1618, (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の方法によれば、図８７に示されるように、隣接する２つのフェリチン１５の間を２価の金属イオン（図８７ではカドミニウムイオン）で架橋する。
フェリチンを加熱により除去した後、この２価の金属イオンが基板上に不純物として残存する。
【０００５】
この不純物はイオンとして基板上を移動すると考えられている上、金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットにおいて、予想もしていなかった界面準位が当該不純物によって発生することがある。
【０００６】
結果として、この不純物は上記量子ドットにおいて悪影響をもたらす。
【０００７】
非特許文献１の方法によれば、２価の金属イオンを使うこと無く２次元結晶を形成しているが、図８８に示されるように、特定のペプチド（カーボンナノ材料認識ペプチド、配列番号５）をフェリチン外表面に呈示させる必要がある。
【０００８】
本発明は、このような悪影響がなく、フェリチンを基板上に二次元配列させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を達成する本発明は、フェリチンを基板上に二次元配列させる方法であって、前記基板の表面は親水性を有しており、
前記方法は、溶媒および前記フェリチンを有する溶液を前記基板上に展開する工程、および前記基板上に展開した溶液から前記溶媒を除去する除去工程を包含し、前記フェリチンにはＮ末端に配列番号１で示されるアミノ酸配列が修飾されているという特徴を有する。
【００１０】
前記基板の表面は、ＳｉＯ２で覆われていることが好ましい。
【００１１】
前記溶液は、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid）、硫酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムの少なくとも１種を含むことが好ましい。
【００１２】
前記溶液がＰＩＰＥＳを含む場合、その濃度は、５ｍＭ以上５０ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００１３】
また、前記溶液が硫酸アンモニウムを含む場合、その濃度は、６．５ｍＭ以上５２ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００１４】
また、前記溶液が酢酸アンモニウムを含む場合、その濃度は、２ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００１５】
なお、前記溶液のｐＨは、６．０以上８．０以下の範囲に調整することが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、隣接する２つのフェリチンの間を結合させる金属イオンは存在しない。そのため、金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットにおいて、予想もしていなかった界面準位が現れるということに代表される悪影響を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において用いられるフェリチンは、外周面にＤＹＹＳＳＳＹＹＥＹＹＳ（以下、配列番号１）で示されるアミノ酸配列を有している。一例として、本発明において用いられるフェリチンは、配列番号２に示されるタンパク質である。このタンパク質は、１８７残基を有し、１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列（配列番号６）のアミノ末端に、開始コドンに対応するメチオニンと配列番号１のアミノ酸配列とからなる１３残基のアミノ酸配列が付加されたものである。
【００１９】
後述する実験例では、本発明において用いられるフェリチンは、「Y6S4DE-Fer0」と記述される。アポフェリチンである場合には、それは「apoY6S4DE-Fer0」と記述される。後述する実験例では、他のアポフェリチンについても、フェリチン名の前に「apo」を付して記述される。
【００２０】
従来のフェリチンはこの配列番号１で示されるアミノ酸配列を有さない。従来例のフェリチン(非特許文献１を参照)は、１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列（配列番号６）のアミノ末端に、開始コドンに対応するメチオニンとペプチド配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号５)とからなる１３残基のアミノ酸配列が付加されたものである。後述する比較例からも理解されるように、従来例のフェリチンにおいて、配列番号５に相当するアミノ酸配列を闇雲に改変したフェリチンを用いても、基板上に二次元配列させることはできない。後述する実験例では、従来例のフェリチンは、「N1-LF」と記述される。
【００２１】
本明細書において用いられる用語「二次元配列」とは、図１に模式図を示すように、平面視において複数のフェリチン１５が基板１１の上に規則的に配置され、断面視において複数のフェリチン１５によって１層のフェリチン膜が形成されている配列を意味する。
【００２２】
図２の断面図に示されるように、２層以上のフェリチン膜が形成されている配列は、用語「二次元配列」には含まれない。このような配列は、必要な場合、「三次元配列」と呼ばれ、本明細書では用語「二次元配列」とは区別される。ただし、１層のフェリチン膜において、ごく一部に（すなわち局所的に）三次元配列となっているような場合までを、用語「二次元配列」から排除することは意図されない。
【００２３】
本明細書における「二次元配列」の評価方法には、フェリチンを含む300nm X 300 nm のSEM観察像を二次元フーリエ変換し、得られたフーリエ変換像を用いる。図１の模式図に示す六方最密充填された二次元配列は、６０度ずつ方向の異なった３つの正弦波の重なったもので近似できることが知られている。前述の二次元配列のフーリエ変換像では３つの正弦波に対応する図３のように６つの点が現れる。各点は波数０の点を中心に６０度ずつ回転した位置にある。前述の近似が成立しない（すなわち、二次元配列が存在しない）場合は、フーリエ変換像に６つの点は現れない。
【００２４】
図１の模式図に示す二次元配列の周期性が崩れた（すなわち二次元配列が劣化した）場合や、二次元配列が単一の結晶のみから構成される単結晶ではなく複数の結晶粒塊から構成される多結晶の場合、フーリエ変換像に明瞭な６つの点は現れず、方位の異なる多結晶の数だけ同心円上に点が現れ、極端な場合は図４のように円状の図形が現れる。したがって、図3に模式図を示すように、明瞭な６つの点が現れる場合を「良質な二次元配列」、元のSEM観察像には「二次元配列」が含まれるが図４に模式図を示すように明瞭な６つの点が現れない場合を「劣った二次元配列」、それ以外を「二次元配列を形成しない」と評価する。
【００２５】
基板の表面は親水性を有している。基板としてはＳｉ基板を用いることができる。
【００２６】
Ｓｉ基板の表面を酸化してＳｉＯ２とすることにより、表面に親水性が付与され得る。この場合、基板の表面は微弱なマイナスの電位を有する。
【００２７】
本発明に係るフェリチンを基板上に２次元配列させる方法は、展開工程および除去工程を有する。まず、展開工程を説明する。
【００２８】
（１）展開工程について
展開工程では、溶媒、前記フェリチン、および12.5mM PIPES-NaOH (pH7.0), 12.5mM PIPES-Tris (pH7.0), 13mMの硫酸アンモニウム（(NH4)2SO4）、もしくは20mMの酢酸アンモニウム（CH3CO2NH4）を有する溶液を前記基板上に展開する。なお、緩衝液としてＰＩＰＥＳ（弱酸性）を使用する場合には、ｐＨをＮａＯＨにより調節する（このような緩衝液を「PIPES-NaOH」と記述する）が、本発明では、金属イオンは不純物となり得る。そのため、弱アルカリ性の緩衝液を採用し、そのｐＨをＨＣｌなどの酸によって調節する方が望ましい。
【００２９】
具体的な展開の方法としては、基板上に溶液を滴下する方法の他、次のような方法も挙げられる。すなわち、パラフィルムに代表される薄膜の表面に溶液を滴下し、次いで親水性を有する面を下にして基板を溶液上に静かに置く。すなわち、パラフィルムに代表される薄膜と、親水性を有する面を下にした基板との間に溶液を挟む。
【００３０】
（２）除去工程について
次に、除去工程について説明する。除去工程では、基板上に展開した溶液から溶媒を除去する。代表的には溶液は緩衝液であるため、溶媒は当該緩衝液の大部分を占める水である。そこで、ここでは基板上から水を除去する方法を説明する。
【００３１】
溶媒を除去する具体的な方法としては、基板を遠心分離させる方法や、基板から溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。速やかに溶媒を除去するという観点から、基板を遠心分離させる方法が好ましい。いずれにせよ、乾燥、濃縮、手法を問わず、除去工程では基板上から水を除去すればよい。
【００３２】
このようにして、フェリチンを基板上に２次元配列させることができる。なお、量子ドットを得る場合、一般的にこのように２次元配列されたフェリチンを加熱して、外側のタンパク質を除去し、さらに必要に応じて金属酸化物を還元することにより、容易に金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットを得ることができる。
【００３３】
なお、金属を化合物半導体に置換することも可能である（国際公開第０３／０９９００８号パンフレットを参照）。
【００３４】
［実施例］
以下、本発明を実験例と共にさらに詳細に説明する。
【００３５】
本実験例では、以下の表１に示される試薬を用いた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
本実験例では、１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列（配列番号６）のアミノ末端に、開始コドンに対応するメチオニンと以下の表２に示されるアミノ酸配列とからなるペプチド配列を導入したフェリチンを用いた。各アミノ酸配列に対応するDNA配列は、表２に記載の通りである。本実験例において、各フェリチンは、「ペプチド名称-Fer0」と記述される。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（準備１・タンパク質発現ベクターの構築）
まず、以下にタンパク質発現ベクターの構築手順を示す。
【００４０】
１．タンパク質発現用プラスミドベクターpKIS9(配列番号4)溶液を準備した。必要ならば、前述のプラスミドベクターを保持する大腸菌より単離精製した。(ＱＩＡＧＥＮ社より頒布されている、QIAprep_Miniprepプロトコールとトラブルシューティングも参照)
【００４１】
２．プラスミド溶液の260nmを含む吸収波長をUV/VISスペクトロメーター（ND-1000, NanoDrop社）で測定し、DNA濃度を算出した。
【００４２】
３．オートクレーブ滅菌済1.5mlエッペンドルフチューブに、2μLのx10 NEB 4 buffer, 15μLの148ng/μLのpKIS9 プラスミドDNA溶液[TE Buffer （10 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM EDTA], 1μLのSac I溶液, 1μLのNde I溶液を加え、ピペッティングで混合し、37℃で１時間、反応させた。
【００４３】
４．反応液を2%(w/v)アガロースゲルを用いたアガロースゲル電気泳動し、目的のプラスミドDNA断片を分離し、アガロースゲルより抽出した (ＱＩＡＧＥＮ社より頒布されている、MinElute Gel Extraction Kitプロトコールとトラブルシューティングも参照)。
【００４４】
５．DNA断片溶液の260nmを含む吸収波長をUV/VISスペクトロメーター（ND-1000, NanoDrop社）で測定し、DNA濃度を算出した。
【００４５】
６．所望のアミノ酸配列をコードするDNA配列の5’末端側にNde I制限酵素切断部位、3’末端側にSaＩ制限酵素切断部位を付加した一本鎖オリゴDNAを合成した。同時に、前述の一本鎖オリゴDNAを相補するオリゴDNAを合わせて合成した（一本鎖オリゴDNAは、シグマジェノシスもしくはTaKaRaバイオより入手した）。
【００４６】
７．挿入する5μMの一本鎖オリゴDNA溶液と5μMの相補DNA鎖溶液を10μLずつ等量混合し、95℃で３分間アニーリングした後、室温で冷却し、末端にNde I/Sac I部位をもつ二本鎖オリゴDNAを作製した。
【００４７】
８．pKIS9 プラスミドDNA断片と二本鎖オリゴDNAを接合させ、タンパク質発現用（各フェリチン発現用）プラスミドベクターを作製した（TaKaRa社より頒布されている、DNA Ligation System DNA Ligation Kit Ver.2.1説明書も参照）。
【００４８】
（準備２-1・Y6S4DE-Fer0大量発現・精製）
まず、以下にapo Y6S4DE-Fer0の合成・精製手順を示す。なお、Shuffle-Fer0, D2N-Fer0, E10Q-Fer0, E10S-Fer0, P7S-Fer0, ΔHY-Fer0, 2ndhalf-Fer0, Y8F-Y9F-Fer0、S5T-S6T-Fer0、NF-LFの合成・精製方法も、使用するタンパク質発現用プラスミドベクターのＮ末端側の塩基配列がそれぞれ表２に記載の塩基配列である点以外は同様である。
【００４９】
１．大腸菌XL1-blue (NOVAGENE)にタンパク質発現用プラスミドベクター（配列番号３）を導入し、形質転換した (ニッポンジーンにより頒布されている、ECOS TM Competent E.coli DH5α, JM109, XL1-Blue, BL21(DE3) Manual （ver.6）のマニュアルも参照) 。
【００５０】
２．形質転換済の大腸菌コロニーを15ml滅菌済コーニングチューブに入れた1 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で振盪培養（装置：TAITEC Bio Shaker BR-40LF、設定温度：37℃、培養時間：5〜7時間、振盪速度120rpm）した。
【００５１】
３．前述の培養液(0.1〜0.5ml)を500mlの三角フラスコ中で50 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で37℃、16-20時間、振盪培養した。
【００５２】
４．培地の濁度測定を分光光度計（Ultrospec 3100 pro, GEヘルスケアバイオサイエンス社）で行い、OD600: 0.1〜0.5に達した時点で、前述の培養液50mlを6LのLB培地(100μg/ml アンピシリンを含む)で撹拌培養（装置：ABLE BMS-10/05、設定温度：37℃、撹拌速度：振盪速度200rpm、空気流量：4L／min、培養時間：18〜20時間）した。
【００５３】
５．培地の濁度測定を行い、OD600: 4.0〜5.0であることを確認し、低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-10, BECMAN社、設定温度：4℃、設定回転数：8000rpm, 時間：10min）でJA-10用遠沈管に集菌した。
【００５４】
６．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (200ml〜300ml) に懸濁し、低速遠心機（前述5と同様）でJA-10用遠沈管に回収した。
【００５５】
７．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (120ml) に懸濁、氷中に設置し、超音波破砕機（装置：Branson Digital Sonifier 450、設定出力値：140W、パルス設定：on／off 1秒、破砕時間：2分間 x 3回、）で、細胞を破砕した。
【００５６】
８．低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-20, BECMAN社、設定温度：4℃、設定遠心力：6000×g, 時間：10min）で遠心し、上清を回収した。
【００５７】
９．回収した上清を、熱処理（75℃, 20分間）し、熱処理後、常温に戻るまで（おおよそ１時間程度）室温に静置した。
【００５８】
１０．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、上清を回収した。
【００５９】
１１．回収した上清に最終濃度0.5 M NaClとなるように、5 M NaClを加え懸濁した。
【００６０】
１２．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、沈殿を回収した。
【００６１】
１３．回収した沈殿を50mM Tris-HCl (120ml) に懸濁し、最終濃度0.4 M NaCl となるように、5M NaClを10.54ml加え懸濁した。
【００６２】
１４．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、沈殿を回収した。
【００６３】
１５．沈殿を回収後、13〜14の操作を再度繰り返した。
【００６４】
１６．沈殿を50mM Tris-HCl (60ml) に懸濁し、0.22μmのシリンジフィルターに通し、精製を完了した。
【００６５】
（準備２-２・apoΔAR-Fer0の大量発現・精製）
まず、以下にapoΔAR-Fer0の合成・精製手順を示す。なお、1st half-Fer0, 5AA-Fer0の合成・精製方法も、使用するタンパク質発現用プラスミドベクターのＮ末端側の塩基配列がそれぞれ表２に記載の塩基配列である点以外は同様である。
【００６６】
１．大腸菌XL1-blue (NOVAGENE)にタンパク質発現用プラスミドベクターを導入し、形質転換した。(ニッポンジーンにより頒布されている、ECOS TM Competent E.coli DH5α, JM109, XL1-Blue, BL21(DE3) Manual （ver.6）のマニュアルも参照)
【００６７】
２．形質転換済の大腸菌コロニーを15ml滅菌済コーニングチューブに入れた1 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で振盪培養（装置：TAITEC Bio Shaker BR-40LF、設定温度：37℃、培養時間：5〜7時間、振盪速度120rpm）した。
【００６８】
３．前述の培養液(0.1〜0.5ml)を500mlの三角フラスコ中で50 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で37℃、16-20時間、振盪培養した。
【００６９】
４．培地の濁度測定を分光光度計（Ultrospec 3100 pro, GEヘルスケアバイオサイエンス社）で行い、OD600: 0.1〜0.5に達した時点で、前述の培養液50mlを6LのLB培地(100μg/ml アンピシリンを含む)で撹拌培養（装置：ABLE BMS-10/05、設定温度：37℃、撹拌速度：振盪速度200rpm、空気流量：4L／min、培養時間：18〜20時間）した。
【００７０】
５．培地の濁度測定を行い、OD600: 4.0〜5.0であることを確認し、低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-10, BECMAN社、設定温度：4℃、設定回転数：8000rpm, 時間：10min）でJA-10用遠沈管に集菌した。
【００７１】
６．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (200ml〜300ml) に懸濁し、低速遠心機（前述5と同様）でJA-10用遠沈管に回収した。
【００７２】
７．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (120ml) に懸濁、氷中に設置し、超音波破砕機（装置：Branson Digital Sonifier 450、設定出力値：140W、パルス設定：on／off 1秒、破砕時間：2分間 x 3回、）で、細胞を破砕した。
【００７３】
８．低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-20, BECMAN社、設定温度：4℃、設定遠心力：6000×g, 時間：10min）で遠心し、上清を回収した。
【００７４】
９．回収した上清を、熱処理（75℃, 20分間）し、熱処理後、常温に戻るまで（おおよそ１時間程度）室温に静置した。
【００７５】
１０．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、上清を回収した。
【００７６】
１１．但し、十分に破砕物が沈殿しない場合は、低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-20, BECMAN社、設定温度：4℃、設定遠心力：15000×g, 時間：10min）で遠心し、上清を回収した。
【００７７】
１２．破砕上清を0.22μmフィルター (MilieX-GV Cat.No.SLGV033RS, Millipore社) で濾過し、濾液1を得た。
【００７８】
１３．陰イオン交換カラムHiLoad-26/10 Q Sepharose-HP(GE Healthcare社)をタンパク質精製用HPLCシステム(AKTA explorer 10S, GE Heathcare社)に接続した。
【００７９】
１４．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を開始移動相(buffer A)として用い、事前に400ml以上を毎分7.0mlの流速で送液した。
【００８０】
１５．上記濾液1をサンプルループに装填し、毎分7mlの流速で上記カラムに注入した。
【００８１】
１６．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を開始移動相(buffer A)として用い、400ml以上を毎分7.0mlの流速で送液し、非吸着画分を取り除いた。
【００８２】
１７．1 M NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を勾配移動相(buffer B)として用い、カラムベッド容量(53.093 ml)の10容量(530.93ml)でbuffer Aとの混合比10〜60 %の勾配でタンパク質画分の溶出を実施した。
【００８３】
１８．目的のタンパク質はおおよそ混合比30%程度で溶出した。
【００８４】
１９．混合比30%を含む各画分より10μLを取り分け、アクリルアミド濃度12.5%のSDS-PAGEゲルを用い、SDS-PAGEを実施した。
【００８５】
２０．SDS-PAGEにより目的タンパク質の画分を決定し、限外ろ過装置(Centriprep YM30, Millipore社)に上記画分を移した。
【００８６】
２１．上記Centriprep YM30を遠心機（LC-200 TOMY社 設置温度：4℃）のスウィングローターに設置した。
【００８７】
２２．回収管に残る溶液が3ml以下になるまで、3000rpmで遠心を繰り返し濃縮した。
【００８８】
２３．回収管より濃縮溶液を回収した。
【００８９】
２４．（準備２-1）に示した精製手順と比較して、目的タンパク質の純度が低い場合は、以下の手順でゲル濾過を実施した。
【００９０】
２５．TSK-GEL BIOASSIST G4SWXL樹脂(東ソー社)を充填したTricorn 10/600カラム(GE Healthcare社)を汎用HPLCシステム(8020シリーズ 東ソー社)に接続した。
【００９１】
２６．150mM NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を移動相として用い、事前に100ml以上を毎分0.5mlの流速で送液した。
【００９２】
２７．3ml以下の濃縮溶液1をサンプルループに装填し、毎分0.5mlの流速で上記カラムに注入した。
【００９３】
２８．280nmの波長をUV/VIS検出器(UV-8020 東ソー社)で監視し、制御用PCにインストールされたソフトウェア(LC-8020 Model II東ソー社)を用いて記録した。
【００９４】
２９．フラクションコレクター (FC-8020 東ソー社)で溶出液を1.0mlずつ回収し、目的タンパク質の含まれる画分を回収した。
【００９５】
３０．得られたタンパク質溶液は濃度未知である。
【００９６】
（準備３・タンパク質の濃度定量）
上記大量発現・精製により得られたタンパク質溶液（例えばapoY6S4DE0-Fer0を含む溶液）は濃度未知である。そこで、以下の方法に従って、濃度未知のタンパク質溶液の濃度を測定した。
【００９７】
タンパク質濃度定量は、Lowry法に従い、DCプロテインアッセイキット(Cat. No. 500-0112JA, BioRad社)を用いた。
【００９８】
１．標準タンパク質として、濃度既知のBSA (Bovine Albumin Serum, Cat. No. 23209 PIACE社)溶液を、所定の濃度(0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 mg/ml)に超純水で希釈して用いた。
【００９９】
２．反応液を次の手順で作製した。タンパク質溶液（もしくはコントロールとして超純水）25 μｌと試薬A 125 μｌをマイクロチューブに取り混合した。
【０１００】
３．続いて、試薬B 1mlを同マイクロチューブに取り混合し、室温25(±1)℃で15分以上反応させた。
【０１０１】
４．反応後、１時間以内に750nmで吸光度を分光光度計（Ultrospec 3100 pro, GEヘルスケアバイオサイエンス社）で測定した。
【０１０２】
５．BSA溶液のタンパク質濃度に対する750nmの吸光度をプロットし、最小二乗法により（未知試料のタンパク質濃度）＝A（未知試料の750nmの吸光度）+Cの式を導いた。
【０１０３】
６．試料の任意希釈液を上記の手順でタンパク質濃度を定量し、希釈率を掛けて試料原液の濃度を導いた。得られたタンパク質濃度（溶液に含まれるapoY6S4DE-Fer0の濃度）は、2.5 mg/mlであった。
【０１０４】
（準備４・アポフェリチンの純度検定）
得られたアポフェリチン（例えば、apoY6S4DE-Fer0）が、コア合成に適した純度であるかどうかについて、以下の手順により検定した。
【０１０５】
純度は以下のようなゲル濾過により決定した。
【０１０６】
１．TSK-GEL BIOASSIST G4SWXLカラム(東ソー社)を接続したを汎用HPLCシステム(8020シリーズ 東ソー社)を用いた。
【０１０７】
２．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を移動相として用い、事前に50ml以上を毎分1.0mlの流速で送液した。
【０１０８】
３．濃度1mg/mlの精製溶液0.1mlをサンプルループに装填し、毎分1.0mlの流速で上記カラムに注入した。
【０１０９】
４．280nmの波長をUV/VIS検出器(UV-8020 東ソー社)で監視し、制御用PCにインストールされたソフトウェア(LC-8020 Model II東ソー社)を用いて記録した。
【０１１０】
５．試料に含まれるフェリチンサブユニット相当のピーク(溶出時間：13〜14分)が検出限界以下であり、アポフェリチン由来のピーク(単量体:8.6分, 二量体:7.8分)のみであることを確認した。
【０１１１】
（準備５・Ｉｎを内包するフェリチンの合成）
以下のように、二次元配列作製に用いるIn酸化物をアポフェリチン（例えば、apoY6S4DE-Fer0）の内部に合成した。
【０１１２】
本実施例では、最終溶液組成が[0.2 M リン酸二水素ナトリウム, 12 mM アンモニア, 40 mM HCl, 0.1 mg/ml apoY6S4DE-Fer0, 1 mM 硫酸インジウム]となるように以下の手順で80 mlの反応液を調製した。
【０１１３】
１．125 mlの角形培地瓶(Nalge Nunc 2019-0125)に16 mlの1 M リン酸二水素ナトリウム, 0.96 mlの1 M アンモニア, 3.2 mlの1 N HCl, 56.64 mlの超純水を表記の順番で加え撹拌子で撹拌した。
【０１１４】
２．pHメーターでpHを測定し、pH 2.88 (±0.02以内)であることを確認した。
【０１１５】
３．3.2 mlの2.5 mg/ml apoY6S4DE-Fer0を含む2 mM Tris (pH8.0)溶液を加え、撹拌子で撹拌した。
【０１１６】
４．41.4 mgの硫酸インジウム粉末を加え、粉末を反応液に溶かした。
【０１１７】
５．反応液の入った角形培地瓶をキャップで密封し、撹拌しつつ２５℃（±１℃）で３時間、反応させた。
【０１１８】
６．反応後、反応液を40mlずつ50mlのファルコンチューブに分注した。
【０１１９】
７．ファルコンチューブを遠心機LC-200(TOMY)のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清1を取り除き、沈殿1を回収した。
【０１２０】
８．沈殿１に5mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁した。
【０１２１】
９．沈殿１を含むファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清2と沈殿2とを得た。上清2を新しいファルコンチューブに分注した。
【０１２２】
１０．沈殿2に5mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁した。
【０１２３】
１１．沈殿2を含むファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清2’と沈殿2’とを得た。上清2’を新しいファルコンチューブに分注した。
【０１２４】
１２．沈殿2'に5mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁した。
【０１２５】
１３．沈殿2'を含むファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清2’'と沈殿2’'とを得た。上清2'’を新しいファルコンチューブに分注した。
【０１２６】
１４．上清2（約5ml）、上清2'（約5ml）、および上清2''（約5ml）のそれぞれに0.5mlの5 M NaClを加え、ファルコンチューブを倒置し、撹拌した。
【０１２７】
１５．上記ファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清3、上清3’、上清3’’、を取り除き、沈殿3、沈殿3’、沈殿3’’を回収した。
【０１２８】
１６．沈殿3に10mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液3を得た。
【０１２９】
１７．沈殿3’に懸濁液3を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液3’を得た。
【０１３０】
１８．沈殿3’’に10mlの懸濁液3’を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液3’’を得た。
【０１３１】
１９．上記の懸濁液3’’（約10ml）に0.9mlの5 M NaClを加え、ファルコンチューブを倒置し撹拌した。
【０１３２】
２０．ファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清4を取り除き、沈殿4を回収した。
【０１３３】
２１．沈殿4に10mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液4を得た。
【０１３４】
２２．Apollo 20ml(QMWL 150kDa) 遠心濃縮器の回収管に懸濁液5を移した。
【０１３５】
２３．Apollo 20ml遠心濃縮器を遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、回収管に残る溶液が1ml以下になるまで、3000rpmで遠心を繰り返し濃縮した。
【０１３６】
２４．回収管より濃縮溶液1を回収した。
【０１３７】
２５．上記「準備３・タンパク質の濃度定量」に示した手順で、In酸化物をコアに持つY6S4DE-Fer0（以下、Y6S4DE-Fer0(In)と表記）の濃度を決定した。以下においては、In酸化物をコアに持つフェリチンを、フェリチン名の最後に(In)との表記を付して表す。
【０１３８】
（準備６・X-Fer0(In)の高純度化）
二次元規則配列化には、In酸化物コアを内部に持つ高純度（単量体純度99.5%以上）なフェリチン（以後、X-Fer0 (In)と表記、ＸはY6S4DEなどのペプチド名称）が望まれる。
【０１３９】
そこで、本実施例では、以下に示すように、二次元規則配列化に用いるX-Fer0 (In)を高純度化した。
【０１４０】
１．TSK-GEL BIOASSIST G4SWXL樹脂(東ソー社)を充填したTricorn 10/600カラム(GE Healthcare社)を汎用HPLCシステム(8020シリーズ 東ソー社)に接続した。
【０１４１】
２．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を移動相として用い、事前に100ml以上を毎分0.5mlの流速で送液した。
【０１４２】
３．3ml以下の濃縮溶液1をサンプルループに装填し、毎分0.5mlの流速で上記カラムに注入した。
【０１４３】
４．280nmの波長をUV/VIS検出器(UV-8020 東ソー社)で監視し、制御用PCにインストールされたソフトウェア(LC-8020 Model II東ソー社)を用いて記録した。
【０１４４】
５．フラクションコレクター (FC-8020 東ソー社)で溶出液を1.0mlずつ回収し、X-Fer0 (In)単量体の含まれる画分を回収した。
【０１４５】
６．上記「準備３・タンパク質の濃度定量」に示した手順で、X-Fer0 (In)の濃度を決定した。
【０１４６】
（準備７・基板の準備）
本発明の二次元配列化に用いる、表面が親水性を有する基板を準備する。
【０１４７】
（熱酸化シリコン基板）
UV/オゾン処理（紫外線／オゾンによる洗浄）により、表面の有機物を取り除く手順を以下に示す。
【０１４８】
１．使用直前（すなわち、後述するように、フェリチンを２次元配列させる直前）に、熱酸化シリコン基板（SiO2膜厚3nm）を5 x 10 mmに劈開した。
【０１４９】
２．装置 (Model UV-1, SAMCO社)を用い、 基板温度110℃, 酸素流量0.5 L/min, 洗浄時間10分間として熱酸化シリコン基板をUV/オゾン処理した。
【０１５０】
（フェリチンの二次元配列）
以上の準備１〜７が終了後、フェリチンを以下の手順（以下、「サンドウィッチ法」と呼ぶことがある）に従って２次元配列させた。
【０１５１】
１．最終濃度の２倍濃度のタンパク質/2mM Tris緩衝液を用意した。例えば、最終濃度が0.5mg/ml Y6S4DE-Fer0 (In)の場合は、1.0mg/ml Y6S4DE-Fer0 (In)を用意した。
【０１５２】
２．最終濃度の２倍濃度の配列化溶液を用意した。例えば、最終濃度が13 mM 硫安の場合は、26 mM 硫安溶液を用意した。
【０１５３】
３．タンパク質溶液、結晶化溶液それぞれ5 μlずつをマイクロテストチューブに取り、ピペッティングもしくはVortex mixtureで混合した。
【０１５４】
４．任意の大きさのパラフィルムをプラスチックシャーレ中に設置し、混合溶液5 μlをパラフィルム上に滴下した。
【０１５５】
５．「（準備７・基板の準備）」に従い準備した基板の親水化処理面を液滴に接触させるように設置した。
【０１５６】
６．プラスチックシャーレの蓋を被せて、恒温器(LTI-2000, 東京理化器械社)中で20(±0.5) ℃ 30分間、静置した。
【０１５７】
７．所定時間経過後、基板を真空ピンセットでパラフィルムより引き剥がし、1.5 mlのマイクロテストチューブ内に移した。
【０１５８】
８．上記のマイクロテストチューブを遠心機(5415D eppendrf社)で1500Ｇ 10分間、遠心し基板上の余剰溶液を除去した。
【０１５９】
９．基板をマイクロテストチューブより取り出し、SEM(JEOL SEM7400F)観察を行う。観察条件は加速電圧：5 kV, エミッション電流10μAとした。
【０１６０】
結果は以下の通りである。
【０１６１】
（実施例１）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図5に、そのフーリエ変換像を図６に示す。
【０１６２】
（実施例２）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-Tris (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図7に、そのフーリエ変換像を図8に示す。
【０１６３】
（実施例３）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図９に、そのフーリエ変換像を図１０に示す。
【０１６４】
（実施例４）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１１に、そのフーリエ変換像を図１２に示す
【０１６５】
図５から図１２までに示されるように、外周面に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフェリチンは「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが確認された。
【０１６６】
（比較例１）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１３に、そのフーリエ変換像を図１４に示す。
【０１６７】
（比較例２）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および12.5 mM PIPES-Tris (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１５に、そのフーリエ変換像を図１6に示す。
【０１６８】
（比較例３）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１７に、そのフーリエ変換像を図１８に示す。
【０１６９】
（比較例４）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および20 mM 酢安、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１９に、そのフーリエ変換像を図２０に示す。
【０１７０】
外周面に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフェリチンは、図１３から図２０までに示される従来例のN1-LFと比較して同等にもしくは条件付き同等（例えば、二次元配列のドメインサイズが小さい）だが、「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０１７１】
（比較例５）
0.5mg/ml D2N-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２１に、そのフーリエ変換像を図２２に示す。
【０１７２】
（比較例６）
0.5mg/ml D2N-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２３に、そのフーリエ変換像を図２４に示す。
【０１７３】
（比較例７）
0.5mg/ml D2N-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２５に、そのフーリエ変換像を図２６に示す。
【０１７４】
（比較例８）
0.5mg/ml E10Q-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２７に、そのフーリエ変換像を図２８に示す。
【０１７５】
（比較例９）
0.5mg/ml E10Q-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２９に、そのフーリエ変換像を図３０に示す。
【０１７６】
（比較例１０）
0.5mg/ml E10Q-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３１に、そのフーリエ変換像を図３２に示す。
【０１７７】
（比較例１１）
懸濁されたE10S-Fer0(In)、および2 mM Tris-HCl緩衝液pH8.0、および／熱酸化シリコン基板を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３３に、そのフーリエ変換像を図３４に示す。
【０１７８】
（比較例１２）
0.5mg/ml P7S-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３５に、そのフーリエ変換像を図３６に示す。
【０１７９】
（比較例１３）
0.5mg/ml P7S-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３７に、そのフーリエ変換像を図３８に示す。
【０１８０】
（比較例１４）
0.5mg/ml P7S-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３９に、そのフーリエ変換像を図４０に示す。
【０１８１】
外周面に従来例のN1-LFと一つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンD2N-Fer0, E10Q-Fer0, E10S-Fer0, P7S-Fer0は、「良質な」もしくは「劣った」二次元配列を形成することが確認できた。
【０１８２】
（比較例１５）
0.5mg/ml Y8FY9F-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４１に、そのフーリエ変換像を図４２に示す。
【０１８３】
（比較例１６）
0.5mg/ml Y8FY9F-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-Tris (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４３に、そのフーリエ変換像を図４４に示す。
【０１８４】
（比較例１７）
0.5mg/ml Y8FY9F-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４５に、そのフーリエ変換像を図４６に示す。
【０１８５】
（比較例１８）
0.5mg/ml S5TS6T-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４７に、そのフーリエ変換像を図４８に示す。
【０１８６】
（比較例１９）
0.5mg/ml S5TS6T -Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４９に、そのフーリエ変換像を図５０に示す。
【０１８７】
（比較例２０）
0.5mg/ml S5TS6T -Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図５１に、そのフーリエ変換像を図５２に示す。
【０１８８】
外周面に従来例のN1-LFと２つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンY8FY9F-Fer0, S5TS6T-Fer0は、「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０１８９】
（比較例２１）
0.5mg/ml ΔHY-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図５３に、そのフーリエ変換像を図５４に示す。
【０１９０】
（比較例２２）
0.5mg/ml ΔHY-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図５５に、そのフーリエ変換像を図５６に示す。
【０１９１】
（比較例２３）
0.5mg/ml ΔHY-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図５７に、そのフーリエ変換像を図５８に示す。
【０１９２】
外周面に従来例のN1-LFと５つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンΔHY-Fer0は、二次元配列を形成しないことが確認できた。
【０１９３】
（比較例２４）
0.5mg/ml ΔAR-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図５９に、そのフーリエ変換像を図６０に示す。
【０１９４】
（比較例２５）
0.5mg/ml ΔAR-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６１に、そのフーリエ変換像を図６２に示す。
【０１９５】
（比較例２６）
0.5mg/ml ΔAR-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６３に、そのフーリエ変換像を図６４に示す。
【０１９６】
外周面に従来例のN1-LFと５つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンΔAR-Fer0は、「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０１９７】
（比較例２７）
0.5mg/ml Shuffle-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６５に、そのフーリエ変換像を図６６に示す。
【０１９８】
（比較例２８）
0.5mg/ml shuffle-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６７に、そのフーリエ変換像を図６８に示す。
【０１９９】
外周面に従来例のN1-LFと１２つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンShuffle-Fer0は、「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０２００】
（比較例２９）
0.5mg/ml 1st-half-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図６９に、そのフーリエ変換像を図７０に示す。
【０２０１】
（比較例３０）
0.5mg/ml 1st-half-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７１に、そのフーリエ変換像を図７２に示す。
【０２０２】
（比較例３１）
0.5mg/ml 1st-half-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７３に、そのフーリエ変換像を図７４に示す。
【０２０３】
（比較例３２）
0.5mg/ml 2nd-half-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７５に、そのフーリエ変換像を図７６に示す。
【０２０４】
（比較例３３）
0.5mg/ml 2nd-half-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７７に、そのフーリエ変換像を図７８に示す。
【０２０５】
（比較例３４）
0.5mg/ml 2nd-half-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７９に、そのフーリエ変換像を図８０に示す。
【０２０６】
外周面に従来例のN1-LF（アミノ酸残基数１２）よりアミノ酸を削除した、すなわち短いアミノ酸配列（アミノ酸残基数６）を有するフェリチン1st-half-Fer0, 2nd-half-Fer0は、「二次元配列を形成しない」ことが確認できた。
【０２０７】
（比較例３５）
0.5mg/ml 5AA-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図８１に、そのフーリエ変換像を図８２に示す。
【０２０８】
（比較例３６）
0.5mg/ml 5AA-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図８３に、そのフーリエ変換像を図８４に示す。
【０２０９】
（比較例３７）
0.5mg/ml 5AA-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図８５に、そのフーリエ変換像を図８６に示す
外周面に従来例のN1-LF（アミノ酸残基数１２）より、７個のアミノ酸を削除した、すなわち短いアミノ酸配列（アミノ酸残基数５）を有するフェリチン5AA-Fer0は、「二次元配列を形成しない」ことが確認できた。
【０２１０】
二次元配列形成とアミノ改変数（N1-LFからの改変数）の対応を表３にまとめる。
【０２１１】
【表３】
【０２１２】
本発明に用いられたフェリチンは、二次元配列を形成する際に二価の金属イオンを必要としない。そのため、金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットにおいて、予想もしていなかった界面準位が現れるということに代表される悪影響を抑制することができる。
【０２１３】
本発明に用いられたフェリチンの外表面に呈示された配列番号１で表されるペプチドは、配列番号５で表される従来例のアミノ酸配列と比較して１２アミノ酸残基中５アミノ酸残基が異なる新たな配列を有し、基板上に「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが出来る。
【０２１４】
上記より、本発明で用いられたフェリチンは、予想もしていなかった界面準位が現れるということに代表される悪影響がなく、基板上に二次元配列可能なフェリチンであって、従来例と異なる配列を持つ新たなペプチドを外表面に呈示させたフェリチンであることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明は、基板上に配置したナノ粒子を利用する各種デバイス、半導体装置、などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】基板上で複数個のフェリチンが二次元配列した状態を示す概略図（特許文献１の図８）である。
【図２】三次元配列の断面図である。
【図３】二次元フーリエ変換によって得られたフーリエ変換像の模式図である。
【図４】二次元フーリエ変換によって得られたフーリエ変換像の模式図である。
【図５】実施例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６】実施例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７】実施例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８】実施例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真フーリエ変換像である。
【図９】実施例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１０】実施例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１１】実施例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１２】実施例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真フーリエ変換像である。
【図１３】比較例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１４】比較例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１５】比較例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１６】比較例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１７】比較例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１８】比較例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１９】比較例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２０】比較例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２１】比較例５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２２】比較例５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２３】比較例６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２４】比較例６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２５】比較例７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２６】比較例７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２７】比較例８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２８】比較例８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２９】比較例９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３０】比較例９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３１】比較例１０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３２】比較例１０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３３】比較例１１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３４】比較例１１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３５】比較例１２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３６】比較例１２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３７】比較例１３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３８】比較例１３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３９】比較例１４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４０】比較例１４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４１】比較例１５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４２】比較例１５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４３】比較例１６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４４】比較例１６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４５】比較例１７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４６】比較例１７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４７】比較例１８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４８】比較例１８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４９】比較例１９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５０】比較例１９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５１】比較例２０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５２】比較例２０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５３】比較例２１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５４】比較例２１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５５】比較例２２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５６】比較例２２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５７】比較例２３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５８】比較例２３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５９】比較例２４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６０】比較例２４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６１】比較例２５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６２】比較例２５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６３】比較例２６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６４】比較例２６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６５】比較例２７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６６】比較例２７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６７】比較例２８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６８】比較例２８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６９】比較例２９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７０】比較例２９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７１】比較例３０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７２】である。 比較例３０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７３】比較例３１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７４】比較例３１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７５】比較例３２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７６】比較例３２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７７】比較例３３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７８】比較例３３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７９】比較例３４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８０】比較例３４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８１】比較例３５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８２】比較例３５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８３】比較例３６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８４】比較例３６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８５】比較例３７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８６】比較例３７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８７】特許文献１の図８に示される、隣接する２つのフェリチンの間が２価の金属イオン（図８７ではカドミニウムイオン）で架橋された状態を示す模式図である。
【図８８】非特許文献１に記載された改変型フェリチン(N1-LF)の模式図である。
【符号の説明】
【０２１７】
１１ 基板
１５ フェリチン
【配列表のフリーテキスト】
【０２１８】
配列番号１の<223>：本発明のフェリチンを基板に配列させるための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号２の<223>：本発明のアミノ末端にアミノ末端メチオニンと１２残基からなるアミノ酸とが付加された改変ウマ由来フェリチン
配列番号３の<223>： 本発明のフェリチン・タンパク質発現用プラスミドベクター
配列番号４の<223>： タンパク質発現用プラスミドベクター
配列番号５の<223>： 非特許文献1に記載されたフェリチンを基板に配列させるための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号７の<223>： E10S-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号８の<223>： D2N-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号９の<223>： E10Q-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１０の<223>： P7S-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１１の<223>： Shuffle-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１２の<223>： S5T-S6T-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１３の<223>： ΔAR-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１４の<223>： Y8F-Y9F-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１５の<223>： ΔHY-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１６の<223>： 1st half-Fer0製造のための６残基からなるアミノ酸配列
配列番号１７の<223>： 2nd half-Fer0製造のための６残基からなるアミノ酸配列
配列番号１８の<223>： 5AA-Fer0製造のための５残基からなるアミノ酸配列
配列番号１９の<223>： ペプチドY6S4DE対応のDNA
配列番号２０の<223>： ペプチドE10S対応のDNA
配列番号２１の<223>： ペプチドD2N対応のDNA
配列番号２２の<223>： ペプチドE10Q対応のDNA
配列番号２３の<223>： ペプチドP7S対応のDNA
配列番号２４の<223>： ペプチドShuffle対応のDNA
配列番号２５の<223>： ペプチドS5T-S6T対応のDNA
配列番号２６の<223>： ペプチドΔAR対応のDNA
配列番号２７の<223>： ペプチドY8F-Y9F対応のDNA
配列番号２８の<223>： ペプチドΔHY対応のDNA
配列番号２９の<223>： ペプチド1st half対応のDNA
配列番号３０の<223>： ペプチド2nd half対応のDNA
配列番号３１の<223>： ペプチド5AA対応のDNA
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェリチンを基板上に二次元配列させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェリチンは球状のタンパク質であり、内部には酸化鉄に代表される金属化合物を内包している。なお、内部に金属化合物を内包せず、当該内部が空洞になっている場合には、「アポフェリチン」と呼ばれる。
【０００３】
フェリチンを基板上に二次元的に配列させた後、当該フェリチンを加熱により除去し、必要に応じて金属酸化物を還元することにより、容易に金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットを得ることができる。そのため、図１に示されるように、フェリチンを基板上に二次元的に配列させることが報告されている（例えば、特許文献１や非特許特許文献１を参照）。
【特許文献１】国際公開第０３／０４００２５号公報パンフレット
【非特許文献１】Langmuir, Vol.23, p1615-1618, (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の方法によれば、図８７に示されるように、隣接する２つのフェリチン１５の間を２価の金属イオン（図８７ではカドミニウムイオン）で架橋する。
フェリチンを加熱により除去した後、この２価の金属イオンが基板上に不純物として残存する。
【０００５】
この不純物はイオンとして基板上を移動すると考えられている上、金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットにおいて、予想もしていなかった界面準位が当該不純物によって発生することがある。
【０００６】
結果として、この不純物は上記量子ドットにおいて悪影響をもたらす。
【０００７】
非特許文献１の方法によれば、２価の金属イオンを使うこと無く２次元結晶を形成しているが、図８８に示されるように、特定のペプチド（カーボンナノ材料認識ペプチド、配列番号５）をフェリチン外表面に呈示させる必要がある。
【０００８】
本発明は、このような悪影響がなく、フェリチンを基板上に二次元配列させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を達成する本発明は、フェリチンを基板上に二次元配列させる方法であって、前記基板の表面は親水性を有しており、
前記方法は、溶媒および前記フェリチンを有する溶液を前記基板上に展開する工程、および前記基板上に展開した溶液から前記溶媒を除去する除去工程を包含し、前記フェリチンにはＮ末端に配列番号１で示されるアミノ酸配列が修飾されているという特徴を有する。
【００１０】
前記基板の表面は、ＳｉＯ２で覆われていることが好ましい。
【００１１】
前記溶液は、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid）、硫酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムの少なくとも１種を含むことが好ましい。
【００１２】
前記溶液がＰＩＰＥＳを含む場合、その濃度は、５ｍＭ以上５０ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００１３】
また、前記溶液が硫酸アンモニウムを含む場合、その濃度は、６．５ｍＭ以上５２ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００１４】
また、前記溶液が酢酸アンモニウムを含む場合、その濃度は、２ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００１５】
なお、前記溶液のｐＨは、６．０以上８．０以下の範囲に調整することが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、隣接する２つのフェリチンの間を結合させる金属イオンは存在しない。そのため、金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットにおいて、予想もしていなかった界面準位が現れるということに代表される悪影響を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において用いられるフェリチンは、外周面にＤＹＹＳＳＳＹＹＥＹＹＳ（以下、配列番号１）で示されるアミノ酸配列を有している。一例として、本発明において用いられるフェリチンは、配列番号２に示されるタンパク質である。このタンパク質は、１８７残基を有し、１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列（配列番号６）のアミノ末端に、開始コドンに対応するメチオニンと配列番号１のアミノ酸配列とからなる１３残基のアミノ酸配列が付加されたものである。
【００１９】
後述する実験例では、本発明において用いられるフェリチンは、「Y6S4DE-Fer0」と記述される。アポフェリチンである場合には、それは「apoY6S4DE-Fer0」と記述される。後述する実験例では、他のアポフェリチンについても、フェリチン名の前に「apo」を付して記述される。
【００２０】
従来のフェリチンはこの配列番号１で示されるアミノ酸配列を有さない。従来例のフェリチン(非特許文献１を参照)は、１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列（配列番号６）のアミノ末端に、開始コドンに対応するメチオニンとペプチド配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号５)とからなる１３残基のアミノ酸配列が付加されたものである。後述する比較例からも理解されるように、従来例のフェリチンにおいて、配列番号５に相当するアミノ酸配列を闇雲に改変したフェリチンを用いても、基板上に二次元配列させることはできない。後述する実験例では、従来例のフェリチンは、「N1-LF」と記述される。
【００２１】
本明細書において用いられる用語「二次元配列」とは、図１に模式図を示すように、平面視において複数のフェリチン１５が基板１１の上に規則的に配置され、断面視において複数のフェリチン１５によって１層のフェリチン膜が形成されている配列を意味する。
【００２２】
図２の断面図に示されるように、２層以上のフェリチン膜が形成されている配列は、用語「二次元配列」には含まれない。このような配列は、必要な場合、「三次元配列」と呼ばれ、本明細書では用語「二次元配列」とは区別される。ただし、１層のフェリチン膜において、ごく一部に（すなわち局所的に）三次元配列となっているような場合までを、用語「二次元配列」から排除することは意図されない。
【００２３】
本明細書における「二次元配列」の評価方法には、フェリチンを含む300nm X 300 nm のSEM観察像を二次元フーリエ変換し、得られたフーリエ変換像を用いる。図１の模式図に示す六方最密充填された二次元配列は、６０度ずつ方向の異なった３つの正弦波の重なったもので近似できることが知られている。前述の二次元配列のフーリエ変換像では３つの正弦波に対応する図３のように６つの点が現れる。各点は波数０の点を中心に６０度ずつ回転した位置にある。前述の近似が成立しない（すなわち、二次元配列が存在しない）場合は、フーリエ変換像に６つの点は現れない。
【００２４】
図１の模式図に示す二次元配列の周期性が崩れた（すなわち二次元配列が劣化した）場合や、二次元配列が単一の結晶のみから構成される単結晶ではなく複数の結晶粒塊から構成される多結晶の場合、フーリエ変換像に明瞭な６つの点は現れず、方位の異なる多結晶の数だけ同心円上に点が現れ、極端な場合は図４のように円状の図形が現れる。したがって、図3に模式図を示すように、明瞭な６つの点が現れる場合を「良質な二次元配列」、元のSEM観察像には「二次元配列」が含まれるが図４に模式図を示すように明瞭な６つの点が現れない場合を「劣った二次元配列」、それ以外を「二次元配列を形成しない」と評価する。
【００２５】
基板の表面は親水性を有している。基板としてはＳｉ基板を用いることができる。
【００２６】
Ｓｉ基板の表面を酸化してＳｉＯ２とすることにより、表面に親水性が付与され得る。この場合、基板の表面は微弱なマイナスの電位を有する。
【００２７】
本発明に係るフェリチンを基板上に２次元配列させる方法は、展開工程および除去工程を有する。まず、展開工程を説明する。
【００２８】
（１）展開工程について
展開工程では、溶媒、前記フェリチン、および12.5mM PIPES-NaOH (pH7.0), 12.5mM PIPES-Tris (pH7.0), 13mMの硫酸アンモニウム（(NH4)2SO4）、もしくは20mMの酢酸アンモニウム（CH3CO2NH4）を有する溶液を前記基板上に展開する。なお、緩衝液としてＰＩＰＥＳ（弱酸性）を使用する場合には、ｐＨをＮａＯＨにより調節する（このような緩衝液を「PIPES-NaOH」と記述する）が、本発明では、金属イオンは不純物となり得る。そのため、弱アルカリ性の緩衝液を採用し、そのｐＨをＨＣｌなどの酸によって調節する方が望ましい。
【００２９】
具体的な展開の方法としては、基板上に溶液を滴下する方法の他、次のような方法も挙げられる。すなわち、パラフィルムに代表される薄膜の表面に溶液を滴下し、次いで親水性を有する面を下にして基板を溶液上に静かに置く。すなわち、パラフィルムに代表される薄膜と、親水性を有する面を下にした基板との間に溶液を挟む。
【００３０】
（２）除去工程について
次に、除去工程について説明する。除去工程では、基板上に展開した溶液から溶媒を除去する。代表的には溶液は緩衝液であるため、溶媒は当該緩衝液の大部分を占める水である。そこで、ここでは基板上から水を除去する方法を説明する。
【００３１】
溶媒を除去する具体的な方法としては、基板を遠心分離させる方法や、基板から溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。速やかに溶媒を除去するという観点から、基板を遠心分離させる方法が好ましい。いずれにせよ、乾燥、濃縮、手法を問わず、除去工程では基板上から水を除去すればよい。
【００３２】
このようにして、フェリチンを基板上に２次元配列させることができる。なお、量子ドットを得る場合、一般的にこのように２次元配列されたフェリチンを加熱して、外側のタンパク質を除去し、さらに必要に応じて金属酸化物を還元することにより、容易に金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットを得ることができる。
【００３３】
なお、金属を化合物半導体に置換することも可能である（国際公開第０３／０９９００８号パンフレットを参照）。
【００３４】
［実施例］
以下、本発明を実験例と共にさらに詳細に説明する。
【００３５】
本実験例では、以下の表１に示される試薬を用いた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
本実験例では、１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列（配列番号６）のアミノ末端に、開始コドンに対応するメチオニンと以下の表２に示されるアミノ酸配列とからなるペプチド配列を導入したフェリチンを用いた。各アミノ酸配列に対応するDNA配列は、表２に記載の通りである。本実験例において、各フェリチンは、「ペプチド名称-Fer0」と記述される。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（準備１・タンパク質発現ベクターの構築）
まず、以下にタンパク質発現ベクターの構築手順を示す。
【００４０】
１．タンパク質発現用プラスミドベクターpKIS9(配列番号4)溶液を準備した。必要ならば、前述のプラスミドベクターを保持する大腸菌より単離精製した。(ＱＩＡＧＥＮ社より頒布されている、QIAprep_Miniprepプロトコールとトラブルシューティングも参照)
【００４１】
２．プラスミド溶液の260nmを含む吸収波長をUV/VISスペクトロメーター（ND-1000, NanoDrop社）で測定し、DNA濃度を算出した。
【００４２】
３．オートクレーブ滅菌済1.5mlエッペンドルフチューブに、2μLのx10 NEB 4 buffer, 15μLの148ng/μLのpKIS9 プラスミドDNA溶液[TE Buffer （10 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM EDTA], 1μLのSac I溶液, 1μLのNde I溶液を加え、ピペッティングで混合し、37℃で１時間、反応させた。
【００４３】
４．反応液を2%(w/v)アガロースゲルを用いたアガロースゲル電気泳動し、目的のプラスミドDNA断片を分離し、アガロースゲルより抽出した (ＱＩＡＧＥＮ社より頒布されている、MinElute Gel Extraction Kitプロトコールとトラブルシューティングも参照)。
【００４４】
５．DNA断片溶液の260nmを含む吸収波長をUV/VISスペクトロメーター（ND-1000, NanoDrop社）で測定し、DNA濃度を算出した。
【００４５】
６．所望のアミノ酸配列をコードするDNA配列の5’末端側にNde I制限酵素切断部位、3’末端側にSaＩ制限酵素切断部位を付加した一本鎖オリゴDNAを合成した。同時に、前述の一本鎖オリゴDNAを相補するオリゴDNAを合わせて合成した（一本鎖オリゴDNAは、シグマジェノシスもしくはTaKaRaバイオより入手した）。
【００４６】
７．挿入する5μMの一本鎖オリゴDNA溶液と5μMの相補DNA鎖溶液を10μLずつ等量混合し、95℃で３分間アニーリングした後、室温で冷却し、末端にNde I/Sac I部位をもつ二本鎖オリゴDNAを作製した。
【００４７】
８．pKIS9 プラスミドDNA断片と二本鎖オリゴDNAを接合させ、タンパク質発現用（各フェリチン発現用）プラスミドベクターを作製した（TaKaRa社より頒布されている、DNA Ligation System DNA Ligation Kit Ver.2.1説明書も参照）。
【００４８】
（準備２-1・Y6S4DE-Fer0大量発現・精製）
まず、以下にapo Y6S4DE-Fer0の合成・精製手順を示す。なお、Shuffle-Fer0, D2N-Fer0, E10Q-Fer0, E10S-Fer0, P7S-Fer0, ΔHY-Fer0, 2ndhalf-Fer0, Y8F-Y9F-Fer0、S5T-S6T-Fer0、NF-LFの合成・精製方法も、使用するタンパク質発現用プラスミドベクターのＮ末端側の塩基配列がそれぞれ表２に記載の塩基配列である点以外は同様である。
【００４９】
１．大腸菌XL1-blue (NOVAGENE)にタンパク質発現用プラスミドベクター（配列番号３）を導入し、形質転換した (ニッポンジーンにより頒布されている、ECOS TM Competent E.coli DH5α, JM109, XL1-Blue, BL21(DE3) Manual （ver.6）のマニュアルも参照) 。
【００５０】
２．形質転換済の大腸菌コロニーを15ml滅菌済コーニングチューブに入れた1 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で振盪培養（装置：TAITEC Bio Shaker BR-40LF、設定温度：37℃、培養時間：5〜7時間、振盪速度120rpm）した。
【００５１】
３．前述の培養液(0.1〜0.5ml)を500mlの三角フラスコ中で50 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で37℃、16-20時間、振盪培養した。
【００５２】
４．培地の濁度測定を分光光度計（Ultrospec 3100 pro, GEヘルスケアバイオサイエンス社）で行い、OD600: 0.1〜0.5に達した時点で、前述の培養液50mlを6LのLB培地(100μg/ml アンピシリンを含む)で撹拌培養（装置：ABLE BMS-10/05、設定温度：37℃、撹拌速度：振盪速度200rpm、空気流量：4L／min、培養時間：18〜20時間）した。
【００５３】
５．培地の濁度測定を行い、OD600: 4.0〜5.0であることを確認し、低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-10, BECMAN社、設定温度：4℃、設定回転数：8000rpm, 時間：10min）でJA-10用遠沈管に集菌した。
【００５４】
６．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (200ml〜300ml) に懸濁し、低速遠心機（前述5と同様）でJA-10用遠沈管に回収した。
【００５５】
７．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (120ml) に懸濁、氷中に設置し、超音波破砕機（装置：Branson Digital Sonifier 450、設定出力値：140W、パルス設定：on／off 1秒、破砕時間：2分間 x 3回、）で、細胞を破砕した。
【００５６】
８．低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-20, BECMAN社、設定温度：4℃、設定遠心力：6000×g, 時間：10min）で遠心し、上清を回収した。
【００５７】
９．回収した上清を、熱処理（75℃, 20分間）し、熱処理後、常温に戻るまで（おおよそ１時間程度）室温に静置した。
【００５８】
１０．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、上清を回収した。
【００５９】
１１．回収した上清に最終濃度0.5 M NaClとなるように、5 M NaClを加え懸濁した。
【００６０】
１２．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、沈殿を回収した。
【００６１】
１３．回収した沈殿を50mM Tris-HCl (120ml) に懸濁し、最終濃度0.4 M NaCl となるように、5M NaClを10.54ml加え懸濁した。
【００６２】
１４．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、沈殿を回収した。
【００６３】
１５．沈殿を回収後、13〜14の操作を再度繰り返した。
【００６４】
１６．沈殿を50mM Tris-HCl (60ml) に懸濁し、0.22μmのシリンジフィルターに通し、精製を完了した。
【００６５】
（準備２-２・apoΔAR-Fer0の大量発現・精製）
まず、以下にapoΔAR-Fer0の合成・精製手順を示す。なお、1st half-Fer0, 5AA-Fer0の合成・精製方法も、使用するタンパク質発現用プラスミドベクターのＮ末端側の塩基配列がそれぞれ表２に記載の塩基配列である点以外は同様である。
【００６６】
１．大腸菌XL1-blue (NOVAGENE)にタンパク質発現用プラスミドベクターを導入し、形質転換した。(ニッポンジーンにより頒布されている、ECOS TM Competent E.coli DH5α, JM109, XL1-Blue, BL21(DE3) Manual （ver.6）のマニュアルも参照)
【００６７】
２．形質転換済の大腸菌コロニーを15ml滅菌済コーニングチューブに入れた1 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で振盪培養（装置：TAITEC Bio Shaker BR-40LF、設定温度：37℃、培養時間：5〜7時間、振盪速度120rpm）した。
【００６８】
３．前述の培養液(0.1〜0.5ml)を500mlの三角フラスコ中で50 ml のLB培地(50μg/ml アンピシリンを含む)で37℃、16-20時間、振盪培養した。
【００６９】
４．培地の濁度測定を分光光度計（Ultrospec 3100 pro, GEヘルスケアバイオサイエンス社）で行い、OD600: 0.1〜0.5に達した時点で、前述の培養液50mlを6LのLB培地(100μg/ml アンピシリンを含む)で撹拌培養（装置：ABLE BMS-10/05、設定温度：37℃、撹拌速度：振盪速度200rpm、空気流量：4L／min、培養時間：18〜20時間）した。
【００７０】
５．培地の濁度測定を行い、OD600: 4.0〜5.0であることを確認し、低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-10, BECMAN社、設定温度：4℃、設定回転数：8000rpm, 時間：10min）でJA-10用遠沈管に集菌した。
【００７１】
６．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (200ml〜300ml) に懸濁し、低速遠心機（前述5と同様）でJA-10用遠沈管に回収した。
【００７２】
７．集菌した菌体を、50mM Tris-HCl (120ml) に懸濁、氷中に設置し、超音波破砕機（装置：Branson Digital Sonifier 450、設定出力値：140W、パルス設定：on／off 1秒、破砕時間：2分間 x 3回、）で、細胞を破砕した。
【００７３】
８．低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-20, BECMAN社、設定温度：4℃、設定遠心力：6000×g, 時間：10min）で遠心し、上清を回収した。
【００７４】
９．回収した上清を、熱処理（75℃, 20分間）し、熱処理後、常温に戻るまで（おおよそ１時間程度）室温に静置した。
【００７５】
１０．低速遠心機（前述8と同様）で遠心し、上清を回収した。
【００７６】
１１．但し、十分に破砕物が沈殿しない場合は、低速遠心機（型番：Avanti HP-25、ローター型番:JA-20, BECMAN社、設定温度：4℃、設定遠心力：15000×g, 時間：10min）で遠心し、上清を回収した。
【００７７】
１２．破砕上清を0.22μmフィルター (MilieX-GV Cat.No.SLGV033RS, Millipore社) で濾過し、濾液1を得た。
【００７８】
１３．陰イオン交換カラムHiLoad-26/10 Q Sepharose-HP(GE Healthcare社)をタンパク質精製用HPLCシステム(AKTA explorer 10S, GE Heathcare社)に接続した。
【００７９】
１４．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を開始移動相(buffer A)として用い、事前に400ml以上を毎分7.0mlの流速で送液した。
【００８０】
１５．上記濾液1をサンプルループに装填し、毎分7mlの流速で上記カラムに注入した。
【００８１】
１６．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を開始移動相(buffer A)として用い、400ml以上を毎分7.0mlの流速で送液し、非吸着画分を取り除いた。
【００８２】
１７．1 M NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を勾配移動相(buffer B)として用い、カラムベッド容量(53.093 ml)の10容量(530.93ml)でbuffer Aとの混合比10〜60 %の勾配でタンパク質画分の溶出を実施した。
【００８３】
１８．目的のタンパク質はおおよそ混合比30%程度で溶出した。
【００８４】
１９．混合比30%を含む各画分より10μLを取り分け、アクリルアミド濃度12.5%のSDS-PAGEゲルを用い、SDS-PAGEを実施した。
【００８５】
２０．SDS-PAGEにより目的タンパク質の画分を決定し、限外ろ過装置(Centriprep YM30, Millipore社)に上記画分を移した。
【００８６】
２１．上記Centriprep YM30を遠心機（LC-200 TOMY社 設置温度：4℃）のスウィングローターに設置した。
【００８７】
２２．回収管に残る溶液が3ml以下になるまで、3000rpmで遠心を繰り返し濃縮した。
【００８８】
２３．回収管より濃縮溶液を回収した。
【００８９】
２４．（準備２-1）に示した精製手順と比較して、目的タンパク質の純度が低い場合は、以下の手順でゲル濾過を実施した。
【００９０】
２５．TSK-GEL BIOASSIST G4SWXL樹脂(東ソー社)を充填したTricorn 10/600カラム(GE Healthcare社)を汎用HPLCシステム(8020シリーズ 東ソー社)に接続した。
【００９１】
２６．150mM NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を移動相として用い、事前に100ml以上を毎分0.5mlの流速で送液した。
【００９２】
２７．3ml以下の濃縮溶液1をサンプルループに装填し、毎分0.5mlの流速で上記カラムに注入した。
【００９３】
２８．280nmの波長をUV/VIS検出器(UV-8020 東ソー社)で監視し、制御用PCにインストールされたソフトウェア(LC-8020 Model II東ソー社)を用いて記録した。
【００９４】
２９．フラクションコレクター (FC-8020 東ソー社)で溶出液を1.0mlずつ回収し、目的タンパク質の含まれる画分を回収した。
【００９５】
３０．得られたタンパク質溶液は濃度未知である。
【００９６】
（準備３・タンパク質の濃度定量）
上記大量発現・精製により得られたタンパク質溶液（例えばapoY6S4DE0-Fer0を含む溶液）は濃度未知である。そこで、以下の方法に従って、濃度未知のタンパク質溶液の濃度を測定した。
【００９７】
タンパク質濃度定量は、Lowry法に従い、DCプロテインアッセイキット(Cat. No. 500-0112JA, BioRad社)を用いた。
【００９８】
１．標準タンパク質として、濃度既知のBSA (Bovine Albumin Serum, Cat. No. 23209 PIACE社)溶液を、所定の濃度(0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 mg/ml)に超純水で希釈して用いた。
【００９９】
２．反応液を次の手順で作製した。タンパク質溶液（もしくはコントロールとして超純水）25 μｌと試薬A 125 μｌをマイクロチューブに取り混合した。
【０１００】
３．続いて、試薬B 1mlを同マイクロチューブに取り混合し、室温25(±1)℃で15分以上反応させた。
【０１０１】
４．反応後、１時間以内に750nmで吸光度を分光光度計（Ultrospec 3100 pro, GEヘルスケアバイオサイエンス社）で測定した。
【０１０２】
５．BSA溶液のタンパク質濃度に対する750nmの吸光度をプロットし、最小二乗法により（未知試料のタンパク質濃度）＝A（未知試料の750nmの吸光度）+Cの式を導いた。
【０１０３】
６．試料の任意希釈液を上記の手順でタンパク質濃度を定量し、希釈率を掛けて試料原液の濃度を導いた。得られたタンパク質濃度（溶液に含まれるapoY6S4DE-Fer0の濃度）は、2.5 mg/mlであった。
【０１０４】
（準備４・アポフェリチンの純度検定）
得られたアポフェリチン（例えば、apoY6S4DE-Fer0）が、コア合成に適した純度であるかどうかについて、以下の手順により検定した。
【０１０５】
純度は以下のようなゲル濾過により決定した。
【０１０６】
１．TSK-GEL BIOASSIST G4SWXLカラム(東ソー社)を接続したを汎用HPLCシステム(8020シリーズ 東ソー社)を用いた。
【０１０７】
２．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を移動相として用い、事前に50ml以上を毎分1.0mlの流速で送液した。
【０１０８】
３．濃度1mg/mlの精製溶液0.1mlをサンプルループに装填し、毎分1.0mlの流速で上記カラムに注入した。
【０１０９】
４．280nmの波長をUV/VIS検出器(UV-8020 東ソー社)で監視し、制御用PCにインストールされたソフトウェア(LC-8020 Model II東ソー社)を用いて記録した。
【０１１０】
５．試料に含まれるフェリチンサブユニット相当のピーク(溶出時間：13〜14分)が検出限界以下であり、アポフェリチン由来のピーク(単量体:8.6分, 二量体:7.8分)のみであることを確認した。
【０１１１】
（準備５・Ｉｎを内包するフェリチンの合成）
以下のように、二次元配列作製に用いるIn酸化物をアポフェリチン（例えば、apoY6S4DE-Fer0）の内部に合成した。
【０１１２】
本実施例では、最終溶液組成が[0.2 M リン酸二水素ナトリウム, 12 mM アンモニア, 40 mM HCl, 0.1 mg/ml apoY6S4DE-Fer0, 1 mM 硫酸インジウム]となるように以下の手順で80 mlの反応液を調製した。
【０１１３】
１．125 mlの角形培地瓶(Nalge Nunc 2019-0125)に16 mlの1 M リン酸二水素ナトリウム, 0.96 mlの1 M アンモニア, 3.2 mlの1 N HCl, 56.64 mlの超純水を表記の順番で加え撹拌子で撹拌した。
【０１１４】
２．pHメーターでpHを測定し、pH 2.88 (±0.02以内)であることを確認した。
【０１１５】
３．3.2 mlの2.5 mg/ml apoY6S4DE-Fer0を含む2 mM Tris (pH8.0)溶液を加え、撹拌子で撹拌した。
【０１１６】
４．41.4 mgの硫酸インジウム粉末を加え、粉末を反応液に溶かした。
【０１１７】
５．反応液の入った角形培地瓶をキャップで密封し、撹拌しつつ２５℃（±１℃）で３時間、反応させた。
【０１１８】
６．反応後、反応液を40mlずつ50mlのファルコンチューブに分注した。
【０１１９】
７．ファルコンチューブを遠心機LC-200(TOMY)のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清1を取り除き、沈殿1を回収した。
【０１２０】
８．沈殿１に5mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁した。
【０１２１】
９．沈殿１を含むファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清2と沈殿2とを得た。上清2を新しいファルコンチューブに分注した。
【０１２２】
１０．沈殿2に5mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁した。
【０１２３】
１１．沈殿2を含むファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清2’と沈殿2’とを得た。上清2’を新しいファルコンチューブに分注した。
【０１２４】
１２．沈殿2'に5mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁した。
【０１２５】
１３．沈殿2'を含むファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清2’'と沈殿2’'とを得た。上清2'’を新しいファルコンチューブに分注した。
【０１２６】
１４．上清2（約5ml）、上清2'（約5ml）、および上清2''（約5ml）のそれぞれに0.5mlの5 M NaClを加え、ファルコンチューブを倒置し、撹拌した。
【０１２７】
１５．上記ファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清3、上清3’、上清3’’、を取り除き、沈殿3、沈殿3’、沈殿3’’を回収した。
【０１２８】
１６．沈殿3に10mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液3を得た。
【０１２９】
１７．沈殿3’に懸濁液3を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液3’を得た。
【０１３０】
１８．沈殿3’’に10mlの懸濁液3’を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液3’’を得た。
【０１３１】
１９．上記の懸濁液3’’（約10ml）に0.9mlの5 M NaClを加え、ファルコンチューブを倒置し撹拌した。
【０１３２】
２０．ファルコンチューブを遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、3000rpm、10分間遠心し、上清4を取り除き、沈殿4を回収した。
【０１３３】
２１．沈殿4に10mlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、vortexミキサーを使い懸濁し、懸濁液4を得た。
【０１３４】
２２．Apollo 20ml(QMWL 150kDa) 遠心濃縮器の回収管に懸濁液5を移した。
【０１３５】
２３．Apollo 20ml遠心濃縮器を遠心機LC-200のスウィングローターに設置し、回収管に残る溶液が1ml以下になるまで、3000rpmで遠心を繰り返し濃縮した。
【０１３６】
２４．回収管より濃縮溶液1を回収した。
【０１３７】
２５．上記「準備３・タンパク質の濃度定量」に示した手順で、In酸化物をコアに持つY6S4DE-Fer0（以下、Y6S4DE-Fer0(In)と表記）の濃度を決定した。以下においては、In酸化物をコアに持つフェリチンを、フェリチン名の最後に(In)との表記を付して表す。
【０１３８】
（準備６・X-Fer0(In)の高純度化）
二次元規則配列化には、In酸化物コアを内部に持つ高純度（単量体純度99.5%以上）なフェリチン（以後、X-Fer0 (In)と表記、ＸはY6S4DEなどのペプチド名称）が望まれる。
【０１３９】
そこで、本実施例では、以下に示すように、二次元規則配列化に用いるX-Fer0 (In)を高純度化した。
【０１４０】
１．TSK-GEL BIOASSIST G4SWXL樹脂(東ソー社)を充填したTricorn 10/600カラム(GE Healthcare社)を汎用HPLCシステム(8020シリーズ 東ソー社)に接続した。
【０１４１】
２．50mM Tris-HCl緩衝液pH8.0を移動相として用い、事前に100ml以上を毎分0.5mlの流速で送液した。
【０１４２】
３．3ml以下の濃縮溶液1をサンプルループに装填し、毎分0.5mlの流速で上記カラムに注入した。
【０１４３】
４．280nmの波長をUV/VIS検出器(UV-8020 東ソー社)で監視し、制御用PCにインストールされたソフトウェア(LC-8020 Model II東ソー社)を用いて記録した。
【０１４４】
５．フラクションコレクター (FC-8020 東ソー社)で溶出液を1.0mlずつ回収し、X-Fer0 (In)単量体の含まれる画分を回収した。
【０１４５】
６．上記「準備３・タンパク質の濃度定量」に示した手順で、X-Fer0 (In)の濃度を決定した。
【０１４６】
（準備７・基板の準備）
本発明の二次元配列化に用いる、表面が親水性を有する基板を準備する。
【０１４７】
（熱酸化シリコン基板）
UV/オゾン処理（紫外線／オゾンによる洗浄）により、表面の有機物を取り除く手順を以下に示す。
【０１４８】
１．使用直前（すなわち、後述するように、フェリチンを２次元配列させる直前）に、熱酸化シリコン基板（SiO2膜厚3nm）を5 x 10 mmに劈開した。
【０１４９】
２．装置 (Model UV-1, SAMCO社)を用い、 基板温度110℃, 酸素流量0.5 L/min, 洗浄時間10分間として熱酸化シリコン基板をUV/オゾン処理した。
【０１５０】
（フェリチンの二次元配列）
以上の準備１〜７が終了後、フェリチンを以下の手順（以下、「サンドウィッチ法」と呼ぶことがある）に従って２次元配列させた。
【０１５１】
１．最終濃度の２倍濃度のタンパク質/2mM Tris緩衝液を用意した。例えば、最終濃度が0.5mg/ml Y6S4DE-Fer0 (In)の場合は、1.0mg/ml Y6S4DE-Fer0 (In)を用意した。
【０１５２】
２．最終濃度の２倍濃度の配列化溶液を用意した。例えば、最終濃度が13 mM 硫安の場合は、26 mM 硫安溶液を用意した。
【０１５３】
３．タンパク質溶液、結晶化溶液それぞれ5 μlずつをマイクロテストチューブに取り、ピペッティングもしくはVortex mixtureで混合した。
【０１５４】
４．任意の大きさのパラフィルムをプラスチックシャーレ中に設置し、混合溶液5 μlをパラフィルム上に滴下した。
【０１５５】
５．「（準備７・基板の準備）」に従い準備した基板の親水化処理面を液滴に接触させるように設置した。
【０１５６】
６．プラスチックシャーレの蓋を被せて、恒温器(LTI-2000, 東京理化器械社)中で20(±0.5) ℃ 30分間、静置した。
【０１５７】
７．所定時間経過後、基板を真空ピンセットでパラフィルムより引き剥がし、1.5 mlのマイクロテストチューブ内に移した。
【０１５８】
８．上記のマイクロテストチューブを遠心機(5415D eppendrf社)で1500Ｇ 10分間、遠心し基板上の余剰溶液を除去した。
【０１５９】
９．基板をマイクロテストチューブより取り出し、SEM(JEOL SEM7400F)観察を行う。観察条件は加速電圧：5 kV, エミッション電流10μAとした。
【０１６０】
結果は以下の通りである。
【０１６１】
（実施例１）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図5に、そのフーリエ変換像を図６に示す。
【０１６２】
（実施例２）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-Tris (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図7に、そのフーリエ変換像を図8に示す。
【０１６３】
（実施例３）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図９に、そのフーリエ変換像を図１０に示す。
【０１６４】
（実施例４）
0.5mg/ml Y6F4DE-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１１に、そのフーリエ変換像を図１２に示す
【０１６５】
図５から図１２までに示されるように、外周面に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフェリチンは「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが確認された。
【０１６６】
（比較例１）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１３に、そのフーリエ変換像を図１４に示す。
【０１６７】
（比較例２）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および12.5 mM PIPES-Tris (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１５に、そのフーリエ変換像を図１6に示す。
【０１６８】
（比較例３）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１７に、そのフーリエ変換像を図１８に示す。
【０１６９】
（比較例４）
0.5mg/ml N1-LF(In)、および20 mM 酢安、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図１９に、そのフーリエ変換像を図２０に示す。
【０１７０】
外周面に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフェリチンは、図１３から図２０までに示される従来例のN1-LFと比較して同等にもしくは条件付き同等（例えば、二次元配列のドメインサイズが小さい）だが、「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０１７１】
（比較例５）
0.5mg/ml D2N-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２１に、そのフーリエ変換像を図２２に示す。
【０１７２】
（比較例６）
0.5mg/ml D2N-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２３に、そのフーリエ変換像を図２４に示す。
【０１７３】
（比較例７）
0.5mg/ml D2N-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２５に、そのフーリエ変換像を図２６に示す。
【０１７４】
（比較例８）
0.5mg/ml E10Q-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２７に、そのフーリエ変換像を図２８に示す。
【０１７５】
（比較例９）
0.5mg/ml E10Q-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図２９に、そのフーリエ変換像を図３０に示す。
【０１７６】
（比較例１０）
0.5mg/ml E10Q-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３１に、そのフーリエ変換像を図３２に示す。
【０１７７】
（比較例１１）
懸濁されたE10S-Fer0(In)、および2 mM Tris-HCl緩衝液pH8.0、および／熱酸化シリコン基板を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３３に、そのフーリエ変換像を図３４に示す。
【０１７８】
（比較例１２）
0.5mg/ml P7S-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３５に、そのフーリエ変換像を図３６に示す。
【０１７９】
（比較例１３）
0.5mg/ml P7S-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３７に、そのフーリエ変換像を図３８に示す。
【０１８０】
（比較例１４）
0.5mg/ml P7S-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図３９に、そのフーリエ変換像を図４０に示す。
【０１８１】
外周面に従来例のN1-LFと一つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンD2N-Fer0, E10Q-Fer0, E10S-Fer0, P7S-Fer0は、「良質な」もしくは「劣った」二次元配列を形成することが確認できた。
【０１８２】
（比較例１５）
0.5mg/ml Y8FY9F-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４１に、そのフーリエ変換像を図４２に示す。
【０１８３】
（比較例１６）
0.5mg/ml Y8FY9F-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-Tris (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４３に、そのフーリエ変換像を図４４に示す。
【０１８４】
（比較例１７）
0.5mg/ml Y8FY9F-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４５に、そのフーリエ変換像を図４６に示す。
【０１８５】
（比較例１８）
0.5mg/ml S5TS6T-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４７に、そのフーリエ変換像を図４８に示す。
【０１８６】
（比較例１９）
0.5mg/ml S5TS6T -Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図４９に、そのフーリエ変換像を図５０に示す。
【０１８７】
（比較例２０）
0.5mg/ml S5TS6T -Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図５１に、そのフーリエ変換像を図５２に示す。
【０１８８】
外周面に従来例のN1-LFと２つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンY8FY9F-Fer0, S5TS6T-Fer0は、「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０１８９】
（比較例２１）
0.5mg/ml ΔHY-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図５３に、そのフーリエ変換像を図５４に示す。
【０１９０】
（比較例２２）
0.5mg/ml ΔHY-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図５５に、そのフーリエ変換像を図５６に示す。
【０１９１】
（比較例２３）
0.5mg/ml ΔHY-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図５７に、そのフーリエ変換像を図５８に示す。
【０１９２】
外周面に従来例のN1-LFと５つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンΔHY-Fer0は、二次元配列を形成しないことが確認できた。
【０１９３】
（比較例２４）
0.5mg/ml ΔAR-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図５９に、そのフーリエ変換像を図６０に示す。
【０１９４】
（比較例２５）
0.5mg/ml ΔAR-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６１に、そのフーリエ変換像を図６２に示す。
【０１９５】
（比較例２６）
0.5mg/ml ΔAR-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６３に、そのフーリエ変換像を図６４に示す。
【０１９６】
外周面に従来例のN1-LFと５つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンΔAR-Fer0は、「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０１９７】
（比較例２７）
0.5mg/ml Shuffle-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６５に、そのフーリエ変換像を図６６に示す。
【０１９８】
（比較例２８）
0.5mg/ml shuffle-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真を図６７に、そのフーリエ変換像を図６８に示す。
【０１９９】
外周面に従来例のN1-LFと１２つ異なるアミノ酸配列を有するフェリチンShuffle-Fer0は、「劣った二次元配列」を形成することが確認できた。
【０２００】
（比較例２９）
0.5mg/ml 1st-half-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図６９に、そのフーリエ変換像を図７０に示す。
【０２０１】
（比較例３０）
0.5mg/ml 1st-half-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７１に、そのフーリエ変換像を図７２に示す。
【０２０２】
（比較例３１）
0.5mg/ml 1st-half-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７３に、そのフーリエ変換像を図７４に示す。
【０２０３】
（比較例３２）
0.5mg/ml 2nd-half-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７５に、そのフーリエ変換像を図７６に示す。
【０２０４】
（比較例３３）
0.5mg/ml 2nd-half-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７７に、そのフーリエ変換像を図７８に示す。
【０２０５】
（比較例３４）
0.5mg/ml 2nd-half-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図７９に、そのフーリエ変換像を図８０に示す。
【０２０６】
外周面に従来例のN1-LF（アミノ酸残基数１２）よりアミノ酸を削除した、すなわち短いアミノ酸配列（アミノ酸残基数６）を有するフェリチン1st-half-Fer0, 2nd-half-Fer0は、「二次元配列を形成しない」ことが確認できた。
【０２０７】
（比較例３５）
0.5mg/ml 5AA-Fer0(In)、および12.5 mM PIPES-NaOH (pH7.0)を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図８１に、そのフーリエ変換像を図８２に示す。
【０２０８】
（比較例３６）
0.5mg/ml 5AA-Fer0(In)、および13 mM 硫安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図８３に、そのフーリエ変換像を図８４に示す。
【０２０９】
（比較例３７）
0.5mg/ml 5AA-Fer0(In)、および20 mM 酢安を用い、得られたフェリチンの吸着の様子を示す写真を図８５に、そのフーリエ変換像を図８６に示す
外周面に従来例のN1-LF（アミノ酸残基数１２）より、７個のアミノ酸を削除した、すなわち短いアミノ酸配列（アミノ酸残基数５）を有するフェリチン5AA-Fer0は、「二次元配列を形成しない」ことが確認できた。
【０２１０】
二次元配列形成とアミノ改変数（N1-LFからの改変数）の対応を表３にまとめる。
【０２１１】
【表３】
【０２１２】
本発明に用いられたフェリチンは、二次元配列を形成する際に二価の金属イオンを必要としない。そのため、金属を基板上に二次元的に配列させてなる量子ドットにおいて、予想もしていなかった界面準位が現れるということに代表される悪影響を抑制することができる。
【０２１３】
本発明に用いられたフェリチンの外表面に呈示された配列番号１で表されるペプチドは、配列番号５で表される従来例のアミノ酸配列と比較して１２アミノ酸残基中５アミノ酸残基が異なる新たな配列を有し、基板上に「良質な二次元配列」もしくは「劣った二次元配列」を形成することが出来る。
【０２１４】
上記より、本発明で用いられたフェリチンは、予想もしていなかった界面準位が現れるということに代表される悪影響がなく、基板上に二次元配列可能なフェリチンであって、従来例と異なる配列を持つ新たなペプチドを外表面に呈示させたフェリチンであることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明は、基板上に配置したナノ粒子を利用する各種デバイス、半導体装置、などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】基板上で複数個のフェリチンが二次元配列した状態を示す概略図（特許文献１の図８）である。
【図２】三次元配列の断面図である。
【図３】二次元フーリエ変換によって得られたフーリエ変換像の模式図である。
【図４】二次元フーリエ変換によって得られたフーリエ変換像の模式図である。
【図５】実施例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６】実施例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７】実施例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８】実施例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真フーリエ変換像である。
【図９】実施例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１０】実施例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１１】実施例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１２】実施例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真フーリエ変換像である。
【図１３】比較例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１４】比較例１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１５】比較例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１６】比較例２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１７】比較例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図１８】比較例３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図１９】比較例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２０】比較例４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２１】比較例５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２２】比較例５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２３】比較例６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２４】比較例６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２５】比較例７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２６】比較例７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２７】比較例８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図２８】比較例８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図２９】比較例９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３０】比較例９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３１】比較例１０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３２】比較例１０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３３】比較例１１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３４】比較例１１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３５】比較例１２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３６】比較例１２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３７】比較例１３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図３８】比較例１３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図３９】比較例１４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４０】比較例１４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４１】比較例１５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４２】比較例１５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４３】比較例１６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４４】比較例１６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４５】比較例１７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４６】比較例１７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４７】比較例１８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図４８】比較例１８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図４９】比較例１９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５０】比較例１９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５１】比較例２０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５２】比較例２０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５３】比較例２１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５４】比較例２１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５５】比較例２２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５６】比較例２２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５７】比較例２３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図５８】比較例２３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図５９】比較例２４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６０】比較例２４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６１】比較例２５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６２】比較例２５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６３】比較例２６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６４】比較例２６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６５】比較例２７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６６】比較例２７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６７】比較例２８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図６８】比較例２８により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図６９】比較例２９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７０】比較例２９により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７１】比較例３０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７２】である。 比較例３０により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７３】比較例３１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７４】比較例３１により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７５】比較例３２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７６】比較例３２により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７７】比較例３３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図７８】比較例３３により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図７９】比較例３４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８０】比較例３４により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８１】比較例３５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８２】比較例３５により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８３】比較例３６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８４】比較例３６により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８５】比較例３７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真である。
【図８６】比較例３７により得られたフェリチンの二次元配列の様子を示す写真のフーリエ変換像である。
【図８７】特許文献１の図８に示される、隣接する２つのフェリチンの間が２価の金属イオン（図８７ではカドミニウムイオン）で架橋された状態を示す模式図である。
【図８８】非特許文献１に記載された改変型フェリチン(N1-LF)の模式図である。
【符号の説明】
【０２１７】
１１ 基板
１５ フェリチン
【配列表のフリーテキスト】
【０２１８】
配列番号１の<223>：本発明のフェリチンを基板に配列させるための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号２の<223>：本発明のアミノ末端にアミノ末端メチオニンと１２残基からなるアミノ酸とが付加された改変ウマ由来フェリチン
配列番号３の<223>： 本発明のフェリチン・タンパク質発現用プラスミドベクター
配列番号４の<223>： タンパク質発現用プラスミドベクター
配列番号５の<223>： 非特許文献1に記載されたフェリチンを基板に配列させるための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号７の<223>： E10S-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号８の<223>： D2N-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号９の<223>： E10Q-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１０の<223>： P7S-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１１の<223>： Shuffle-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１２の<223>： S5T-S6T-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１３の<223>： ΔAR-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１４の<223>： Y8F-Y9F-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１５の<223>： ΔHY-Fer0製造のための１２残基からなるアミノ酸配列
配列番号１６の<223>： 1st half-Fer0製造のための６残基からなるアミノ酸配列
配列番号１７の<223>： 2nd half-Fer0製造のための６残基からなるアミノ酸配列
配列番号１８の<223>： 5AA-Fer0製造のための５残基からなるアミノ酸配列
配列番号１９の<223>： ペプチドY6S4DE対応のDNA
配列番号２０の<223>： ペプチドE10S対応のDNA
配列番号２１の<223>： ペプチドD2N対応のDNA
配列番号２２の<223>： ペプチドE10Q対応のDNA
配列番号２３の<223>： ペプチドP7S対応のDNA
配列番号２４の<223>： ペプチドShuffle対応のDNA
配列番号２５の<223>： ペプチドS5T-S6T対応のDNA
配列番号２６の<223>： ペプチドΔAR対応のDNA
配列番号２７の<223>： ペプチドY8F-Y9F対応のDNA
配列番号２８の<223>： ペプチドΔHY対応のDNA
配列番号２９の<223>： ペプチド1st half対応のDNA
配列番号３０の<223>： ペプチド2nd half対応のDNA
配列番号３１の<223>： ペプチド5AA対応のDNA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェリチンを基板上に二次元配列させる方法であって、
前記フェリチンにはＮ末端に配列番号１で示されるアミノ酸配列が修飾されており、
前記基板の表面は親水性を有しており、
前記方法は、
溶媒および前記フェリチンを有する溶液を前記基板上に展開する工程、および
前記基板上に展開した溶液から前記溶媒を除去する除去工程
を包含する。
【請求項２】
前記基板の表面がＳｉＯ２で覆われている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、ＰＩＰＥＳ、硫酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムの少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液におけるＰＩＰＥＳ濃度が５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液における硫酸アンモニウム濃度が６．５ｍＭ以上５２ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液における酢酸アンモニウム濃度が２ｍＭ以上１００ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
フェリチンを基板上に二次元配列させる方法であって、
前記フェリチンにはＮ末端に配列番号１で示されるアミノ酸配列が修飾されており、
前記基板の表面は親水性を有しており、
前記方法は、
溶媒および前記フェリチンを有する溶液を前記基板上に展開する工程、および
前記基板上に展開した溶液から前記溶媒を除去する除去工程
を包含する。
【請求項２】
前記基板の表面がＳｉＯ２で覆われている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、ＰＩＰＥＳ、硫酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムの少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液におけるＰＩＰＥＳ濃度が５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液における硫酸アンモニウム濃度が６．５ｍＭ以上５２ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液における酢酸アンモニウム濃度が２ｍＭ以上１００ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８３】
【図８４】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【公開番号】特開２００９−１３７９４０（Ｐ２００９−１３７９４０Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７９７９４（Ｐ２００８−２７９７９４）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学省、科学技術試験研究委託費による「ナノテクノロジーを活用した新しい原理のデバイス開発（固体基板上微細パターン化タンパク質ナノ構造作製技術開発）」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学省、科学技術試験研究委託費による「ナノテクノロジーを活用した新しい原理のデバイス開発（固体基板上微細パターン化タンパク質ナノ構造作製技術開発）」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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