ブタ胚をガラス化する高スループットおよび非侵襲的方法
本発明は、インビトロ産生されたブタ胚の凍結保存に対する、実践的で非侵襲的、かつ効率的な方法を提供する。本発明の方法は、ＩＶＰ（ＩＶＦまたはＮＴ由来等）胚を、胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期に、高浸透圧、その後の高速遠心分離で処置する。高浸透圧処置は、囲卵腔を拡大し、遠心分離によって、脂質の細胞質からの分離を可能にする。高浸透圧処置後の脂質分離胚の凍結保存、後の回復および移植に成功し、生きた子孫を産生した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
助成金記載
本発明は、国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金番号Ｒ０１ＲＲ０１３４３８、および助成金番号Ｕ４２ＲＲ０１８８７７の下、政府の支援により一部が行われた。政府は、発明における一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ブタ胚の保存の方法、特にインビトロ産生されたブタ胚を保存する新規および改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
初期哺乳類の胚の凍結保存の成功は、生殖質の保存、ならびに遺伝学の国家的および国際的運動に好機を提供する。残念ながら、ブタ胚は、多くの哺乳類の胚よりも凍結保存が困難であった。ブタ胚が低体温状態に非常に感応性があり、細胞内脂質（脱脂質）の除去がこの感応性を軽減すると見られるという観察に基づき、ブタ胚の凍結保存の成功へと大きく進歩している［１〜４］。ほとんどの研究は、インビトロ産生された胚よりも発生的に有能であると見なされることから、インビボ産生された胚に焦点を合わせている。機械的脱脂質の代替には、細胞骨格の不安定化［５］、またはガラス化状態の変化［６〜８］が含まれる。
【０００４】
インビボ産生胚の凍結保存に関する先の研究によると、無傷の透明帯を持つブタ卵母細胞または胚を遠心分離後、偏光脂肪滴は、橋様構造を介して卵母細胞の細胞質または胚の卵割球と、結合したままである傾向がある［１１］。偏光脂肪滴は、その後の培養または凍結保存手順中、卵母細胞または卵割球へと再分布し得る。囲卵腔が拡大された場合、橋様構造は、遠心分離後破壊され、脂肪滴は、卵母細胞の細胞質または胚の卵割球へ再分布されることはないが、無傷の透明帯内に残る。したがって、インビボ由来胚は、凍結保存前に、脂質再分布を防止するため、遠心分離後即時に、凍結保存される必要がある［１２］。
【０００５】
先の研究はまた、脂肪滴が、ブタ胚の初期に豊富かつ大きく、胚が、胚盤胞期へ、ならびに胚盤胞期を越えて進むに従い、サイズおよび存在量が次第に減少することを発見した［１５、１６］。興味深いことに、初期胚の大きな脂肪滴は、後期胚における小さな液滴よりも、容易に遠心分離により除去される。
【０００６】
インビトロ受精（ＩＶＦ）または核移植（ＮＴ）による胚由来等の、ブタ胚のインビトロ産生は、疾患モデル、または異種移植に対し潜在性のある臓器ドナーを作成するため使用された。結果として、インビトロ産生胚の効果的凍結保存に対する需要が、著しく増加した。しかしながら、インビトロ産生された（ＩＶＰ）胚は、ましてやさらに凍結保存に対し感応性があり、したがって、インビボ産生された対応物よりも、凍結保存がさらに困難である［９］。
【０００７】
これまでのところ、ＩＶＰ胚を凍結保存に対して、極めて限られた成功しか達成されていない。２００６年、発明者の研究室は、凍結保存されたＮＴ胚［９］より産生された、２リットルの形質転換された子ブタを報告した。後に、Ｎａｇａｓｈｉｍａら［１０］は、凍結保存されたＩＶＦ由来胚より産生された子ブタを報告した。しかしながら、ＩＶＦまたはＮＴ由来胚のこれら成功報告の双方の凍結保存は、遠心分離および顕微操作を介し、機械的脱脂質を使用した［９、１０］。機械的脱脂質は、顕微操作中に透明帯へ損傷を与えるため、病原体の伝染の可能性を実質的に増加させる。それはまた、重労働であり、時間のかかるものである。
【０００８】
２つの他のグループ［１３、１４］は、ブタ単為生殖の胚およびハンドメイドクローン胚の凍結保存の生存性を改善するため、部分的消化酵素およびその後の遠心分離を用いる試みを報告した。具体的に、トリプシン、プロナーゼ、または別の酵素により該透明帯が部分的に消化された場合、それは、サイズにおいて肥大し、卵母細胞形質膜および該透明帯間の空間の量の増加をもたらす。したがって、卵母細胞または胚が遠心分離された場合、脂質が完全に分離するために十分な空間が存在する。しかしながら、部分的な消化酵素処置は、脂質分離のための使用の場合、いくつかの不都合を有する。例えば、酵素（トリプシンまたはプロナーゼ等）は、卵母細胞の単為生殖の活性を誘発し得る。加えて、消化酵素処置は、一貫しては効き得ず、酵素処置の効果が酵素の個々のバッチに過度に依存するため、小グループで厳密に観察かつ監視される必要がある。さらに、どちらのグループも、消化酵素および遠心分離方法の組み合わせを使用する凍結保存胚からの、いずれの子ブタ産生も報告していない。
【０００９】
したがって、研究および商業目的に好適である、ＩＶＰ（ＩＶＦ由来またはＮＴ由来等）ブタ胚の脂質分離および凍結保存の実践的かつ非侵襲的な方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様において、インビトロ産生された（ＩＶＰ）（インビトロ受精（ＩＶＦ）由来または核移植（ＮＴ）産生された）ブタ胚の細胞質からの脂質を分離または除去する新規および改善された方法が説明される。本発明の脂質除去方法は、（１）１細胞期または卵割期（胚細胞緊密化前）にＩＶＰブタ胚を産生するステップと、（２）凝縮胚を産生するために胚を凝縮するステップと、（３）脂質分離胚を産生するために、細胞質から脂質を分離し凝縮胚を遠心分離するステップと、を含む。
【００１１】
本発明の方法の一実施形態により、胚の体積は、高浸透圧処置を介し、凝縮され得る。特に、胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期のＩＶＦまたはＮＴ由来胚を、事前に決定された短期間、前の培養培地よりもより大きな事前に選択された浸透圧を持つ培地に暴露することができる。培地の浸透圧は、任意の標準手順に従って、ＮａＣｌ等の塩、ショ糖、ラフィノース、フルクトース、マンニトール、またはトレハロース等の糖、またはＤＭＳＯ等の他の有機試薬、あるいはエチレングリコールを培地へ添加することにより、調節することができる。
【００１２】
本発明の別の態様において、脂質分離されたＩＶＦまたはＮＴ由来のブタ胚の凍結保存およびその後の移植のための新規および改善された方法が説明される。該脂質分離されたブタ胚は、胚盤胞期、およびガラス化に供するさらなる胚発生後、凍結保存することができる。該ガラス化胚は、加温し、その透明帯を除去し、レシピエント（代理ブタ等）へと移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の凍結保存および回復過程のフローダイアグラムである。
【図２】図２（ａ）から（ｆ）は、高浸透圧処置後のインビトロ受精由来胚の発生の写真である。
【図３】図３（ａ）から（ｆ）は、高浸透圧処置後のＮＴ由来胚の発生の写真である。
【図４】図４は、異なる浸透圧（ＮａＣｌまたはショ糖により調節された）（列１）で処置された胚の写真、および遠心分離（列２）後即時のそれらの対応の写真を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野に精通する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で言及されたすべての発行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照することによって、その全体が組み込まれる。
【００１５】
本発明は、先の研究に基づき、初期胚発生段階での脂質除去、または分離がＩＶＰ（ＩＶＦまたはＮＴ由来）ブタ胚の凍結保存に対し重要であり、それは部分的酵素消化法による透明帯の膨化に加えて、ＩＶＰブタ胚の囲卵腔は、容易な脂質除去／分離を可能とするため胚の体積を凝縮することにより、拡大し得ることを教示する。本発明はまた、高浸透圧処置へのＩＶＰ胚の暴露が、胚を凝縮し得るが、胚の活力を保存し得ることを開示する。さらに、本発明の脂質分離方法は、一度に複数の胚を処置するために用いられ、現在の脱脂質手順とは対照的に、それは、それぞれ個々の卵母細胞または胚の顕微操作を必要とするため用いられ得る。
【００１６】
参照される図１は、本発明の胚を凝縮する方法を介し本発明の凍結保存および回復過程のフローダイアグラムである。図１のステップ１は、事前に選択された初期発生段階、具体的に、胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期で、ＩＶＰ胚を提供する。ＩＶＦまたはＮＴ等のいずれの標準ＩＶＰ手順も、順応し得る。
【００１７】
本発明の方法の一実施形態により、インビトロ受精過程は、１つまたは複数のブタ卵巣の胞状卵胞から吸引された卵母細胞と共に開始し得る。該卵母細胞は、ある期間成熟培地で成熟期まで培養され得、かつ剥皮され得る。例示的成熟培地は、０．１％ＰＶＡ、３．０５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、０．９１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍｍｏｌ／Ｌシステイン、０．５μｇ／ｍＬ ＬＨ、０．５μｇ／ｍＬ ＦＳＨ、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、７５μｇ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンと共にＴＣＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ、３１１０００３５、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有し得る。卵母細胞は、加湿空気において５％ＣＯ２、３８．５℃で、約４０〜４４時間、成熟培地で培養し得る。成熟後、卵母細胞は、約４分等の短時間、０．１％ＰＶＡおよび０．１％ヒアルロニダーゼを追加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ［２０］で、ボルテックスを通して卵丘細胞を除去することにより剥皮され得る。剥皮された卵母細胞は、精子注入前に多くの異なる培地で貯蔵され得る。優れた培地は、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、２．９ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、５０μｇ／ｍｌペニシリン、６０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ［２６］と共に、ＴＣＭ１９９を含有し得る。
【００１８】
いずれの標準精子注入手順も、ＩＶＰ胚を産生するために順次し得る。一実施形態により、剥皮された卵母細胞は、極体と共に好適なＩＶＦ培地へ、精子懸濁液と混合されるために、最初に移植され得る。例示的ＩＶＦ培地は、１１３．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、２ｍｍｏｌ／Ｌカフェイン、および２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡと共に、修飾されたトリス緩衝培地を含有し得る。
【００１９】
本発明の別の実施形態によると、ＮＴ由来胚は、核移植ドナー細胞および商業的な卵母細胞と共に開始し得る。核移植ドナー細胞は、形質転換された子ブタから収集、もしくは野生型細胞の遺伝子修飾を介して産生され得る。卵母細胞が成熟可能とされた後、０．１％ＰＶＡおよび０．１％ヒアルロニダーゼを追加されたＴＬ−ＨＥＰＥＳで約４分、ボルテックスにより卵母細胞から卵丘細胞が除去された。これら卵母細胞からの最初の極体および隣接細胞質は、次いで、操作培地中、７．０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢで吸引される。ドナー細胞は、次いで、囲卵空間へ移植される。融合および活性は、融合／活性培地（０．３Ｍマニトール、１．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ等）で、１．２ｋＶ／ｃｍの２つの３０μｓ脈拍と共に、同時に達成し得る。あるいは、融合および活性は、まず融合において、低濃度のカルシウムを含む培地（０．３Ｍマニトール、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ等）に暴露し、次いで、暗所で、２００μＭチメロサールに約１０分間、その後、８ｍＭ ＤＴＴに３０分間暴露して活性化［２１］、または任意の他の好適方法で、段階的に達成することができる。
【００２０】
精子注入またはＮＴ後、ＩＶＰ胚は、１細胞期または卵割期（接合体、２細胞または４細胞段階、胚細胞緊密化前）へと培養される。いずれの好適培養手順も順応し得る。一実施形態により、ＩＶＰ胚（インビトロ受精またはＮＴ由来）は、２細胞段階胚を選択するため、３８．５℃、空気中５％ＣＯ２で２８〜３０時間、種々の異なる培養培地において培養され得る。例示的培養培地ＰＺＭ３［２７］は、浸透圧２８８±２、およびｐＨ７．３±２と共に、ＮａＣｌ １０８．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ １０．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３ ２５．０７ｍｍｏｌ／Ｌ、ピルビン酸Ｎａ ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ（乳酸）２．５Ｈ２Ｏ ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、グルタミン１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ヒポタウリン５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＢＭＥアミノ酸溶液２０ｍｌ／Ｌ、ＭＥＭアミノ酸溶液１０ｍｌ／Ｌ、ゲンタマイシン０．０５ｍｇ／ｍＬ、ＢＳＡ ３ｍｇ／ｍＬを含有し得る。
【００２１】
図１のステップ２は、胚の浸透圧を上昇させ、胚を凝縮する。いくつかの異なる培地製剤は、浸透圧を上昇させ、卵母細胞または胚の体積を凝縮するのに用いられ得る。本発明は、異なる濃度（結果として、異なる浸透圧）でＮａＣｌまたはショ糖を使用する例を提供するが、高浸透圧およびその後の細胞（複数可）の体積の縮みをもたらす他の製剤も機能すべきである。
【００２２】
本発明の方法の一実施形態により、浸透圧は、胚が浸される培地の浸透圧を調節することにより、上昇し得る。例えば、ＮａＣｌまたはショ糖は、約３００ｍＯｓｍｏ（７．０μｇ／ｍＬサイトカラシンＢおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを伴う３００〜３１０ｍＯｓｍｏを伴う保存溶液等）と保存用培地へ、３５０、４００、５００、６００、および８００〜８５０ｍＯｓｍｏ等の種々の浸透圧で培地を生じさせるため、添加され得る。ＩＶＰ由来胚は、短時間、約５〜１０分、遠心分離前に事前に選択された高浸透圧の培地に暴露され得る。
【００２３】
図１のステップ３は、通常、遠心分離を介し、凝縮胚から脂質を分離するものである。例えば、高浸透圧培地における凝縮胚は、約６〜２０分、１３，４００×ｇで遠心分離し得る。遠心分離条件（力または期間）は、胚の活力を保存すると同時に、完全な脂質分離を達成するのに十分である限り、遠心分離力および時間が大きい範囲で変化し得る。短い期間は、該力が増加した場合、特に役立つ。同様に、より低い力が使用される場合、長い期間が必要で有り得る。高浸透圧への長期暴露は、胚の活力に影響を及ぼし得る。
【００２４】
脂質分離は、約１２時間の培養後、確認され得、いくつかの場合（それらが比較的重要であるため、特に、ＮＴ由来胚に対し）、第二期の高浸透圧処置、およびその後の遠心分離は、比較的完全な脂質分離を達成するために適用され得る。胚細胞緊密化前の卵割期で胚が残存する限り、第二期の高浸透圧処置は、任意で有り得る。
【００２５】
脂質分離胚は、次いで、図１の胚盤胞期ステップ４へとさらに発生することを可能とする。具体的に、脂質分離胚は、胚が胚盤胞段階を得るため、ＰＺＭ３において３〜６日培養され得る。
【００２６】
図１のステップ５は、さらに発生した胚のガラス化である。胚は、いずれの標準方法／手順を通してもガラス化され得る。一実施形態により、さらに発生した胚は、修飾されたオープンプルドストロー（ＯＰＳ）法の使用により、胚盤胞期でガラス化され得る。具体的に、さらに発生した胚は、平衡溶液中に短時間（約２分等）配置され得、その後、ガラス化溶液への暴露が続き、次いでＯＰＳストローに積み込まれ、かつ液体窒素へと即時に浸され得る。例示的平衡溶液は、例示的ガラス化溶液が、２０％エチレングリコール、および２０％ＤＭＳＯを含有すると同時に、１０％エチレングリコール、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有し得る。窒素に浸される前の過程は、３８．５℃の加温段階で行われ得る。ガラス化溶液への暴露から窒素に浸すまでの期間は、概して、約２５〜３０秒間と短い範囲である。
【００２７】
図１のステップ６〜８は、保存胚を回復する、かつかかるものをレシピエントへと移植するステップである。具体的に、ガラス化胚は、若干昇温（約３８．５℃等）である期間、緩衝液（ショ糖等）へと浸すことにより解凍され得る。解凍胚は、透明帯を軟化かつ除去するため０．５％プロナーゼで処置され得る。脂質分離および帯除去胚は、次いでレシピエントまたは代理体の卵管または子宮へと移植され得る。
【００２８】
図２（ａ）〜（ｆ）は、高浸透圧処置（ＮａＣｌで４００ｍＯｓｍ）後のＩＶＦ由来胚の写真である。図２（ａ）は、高浸透圧処置および遠心分離後、数時間培養された胚を表示する。図２（ｂ）および２（ｃ）は、胚盤胞段階での胚を表示する。図２（ｄ）は、ガラス化および加温後の胚を表示する。図２（ｅ）は、それらの透明帯の除去後の胚を表示する。図２（ｆ）は、ＢＲＬ細胞調整培地においてインビトロ培養後再拡張した胚を表示する。
【００２９】
図３（ａ）〜（ｆ）は、ＮａＣｌまたはショ糖との高浸透圧処置後のＮＴ由来胚の発生の写真である。図３（ａ）および３（ｂ）は、高浸透圧処置および遠心分離後、数時間培養されたＮＴ由来胚を表示し、図３（ｃ）および３（ｄ）は、胚盤胞段階へとさらに培養された胚を表示し、図３（ｅ）は、ガラス化後に加温された胚を表示し、かつ図３（ｆ）は、ＢＲＬ細胞調整培地においてインビトロ培養後、再拡張した胚を表示する。
【００３０】
本発明はさらに、異なる試薬（浸透圧を調節する）の効果、異なる浸透圧、および脂質分離の速度上の遠心分離時間を研究した。本発明は、ＮａＣｌまたはショ糖等の異なる試薬が、脂質分離において同様の効果を有し、脂質分離に対する理想的な浸透圧は、約３５０〜約５００ｍＯｓｍまでの範囲であり、かつ好適遠心分離力／速度で、約６分〜約２０分の範囲である遠心分離期間はまた、脂質分離速度において陽性作用を有することを発見した。
【００３１】
図４は、遠心分離前後に、異なる浸透圧（ＮａＣｌまたはショ糖で調節された）で処置されたインビトロ受精胚の写真を表示する。列１は、上昇した浸透圧（対照との比較）で明らかに表示される凝縮と共に、異なる浸透圧、３００ｍＯｓｍ（対照）、４００ｍＯｓｍ（ＮａＣｌで調節された）、６００ｍＯｓｍ（ショ糖で調節された）、および８００ｍＯｓｍ（ショ糖で調節された）で暴露された胚の写真を表示する。列２は、遠心分離後の胚の対応の写真を列挙する。遠心分離後の橋様構造（不完全脂質分離を示唆する）は、該対照においても見られ得、完全脂質分離は、６００または８００ｍＯｓｍｏで処置された胚において、大きな橋様構造が存在すると同時に、４００ｍＯｓｍで暴露された胚において観察され得る。図２は、約４００ｍＯｓｍの浸透圧が、最も完全な脂質分離を提供し、浸透圧が６００以上へ上昇した場合、脂質分離が邪魔されることを示唆している。
【００３２】
本発明はさらに、脂質分離速度、胚の発生、および孵化能力へ与える、異なる浸透圧および遠心分離条件の影響を定量的に評価した。表１（ＩＶＦ由来胚、ＮａＣｌで調節された浸透圧）、２（ＩＶＦ由来胚、ショ糖で調節された浸透圧）、および３（ＮＴ由来胚、ＮａＣｌおよびショ糖の双方で調節された浸透圧、３つの表すべてが添付されている）に含まれるデータに基づき、脂質分離の好まれる状態は、３００以上〜約５００ｍＯｓｍまでの範囲、好ましくは約３５０〜約４５０ｍＯｓｍ、である浸透圧にＩＶＰ胚を暴露し、続いて１３，４００×ｇ速度で約６〜約２０分、遠心分離するためである。該遠心分離時間は、遠心分離速度により、短縮または延長され得る。しかしながら、遠心分離時間の延長は、高浸透圧に胚を長期暴露させ得、それは胚の活力に対し悪影響を有しえる。さらに、表３において、第ニ期高浸透圧処置は、総脂質分離速度を上昇させる第一期の処置上で、凝縮に失敗したＮＴ由来胚のために、選出される。第ニ期高浸透圧処置は、胚細胞緊密化前の卵割期に胚が未だ在る限り、選出され得る。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
表４は、高浸透圧処置、遠心分離、およびガラス化によって保存されたＩＶＦ由来胚に関する妊娠および子孫データを評価する。表４に含まれるデータの中で、９つの代理体のうち３つが妊娠を確立し、正常な子孫を産生した。１つの代理体は、３５０ｍＯｓｍの浸透圧で処置した胚を受容し、５匹の子ブタ、オス３匹およびメス２匹を産生し、１つの代理体は、４００ｍＯｓｍで処置した胚を受容し、４匹の子ブタ、オス２匹およびメス２匹を産生し、１つの代理体は、４５０ｍＯｓｍで処置した胚を受容し、３匹の子ブタ、オス１匹およびメス２匹を産生した。
【００３７】
【表４】
【００３８】
表５は、高浸透圧処置、遠心分離、およびガラス化後のＮＴ由来胚の移植、妊娠、および子孫のデータを一覧にする。３つの胚の移植を行い、記録した。それぞれの移植について、透明帯をプロナーゼ処置によって軟化または除去した８０〜９０個の胚を代理体に移植した。４００ｍＯｓｍｏで処置し、６分間遠心分離した胚を受容した３つの代理体のうちの２つ、ならびに３５０ｍＯｓｍｏで処置し、２０分間遠心分離した胚を受容した１つが、妊娠を生じ、前者については１匹のオスの子ブタを産生した。表４および５のデータは、本発明の方法が、特に好ましい範囲の浸透圧（約３５０〜約４５０ｍＯｓｍ）を適用するとき、ＩＶＰ胚のための凍結保存方法に成功することを示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】
本発明をその具体的な実施形態に関連して説明したが、さらに改良することが可能であることを理解されたい。本特許出願は、概して本発明の原理に従い、本発明が関連する技術分野内で既知または慣例の実践内に入り、本明細書の上記および以下の添付の特許請求の範囲内に記載される本質的特徴に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、本発明のいずれの変形、使用、または適合をも網羅することを意図する。
【００４１】
参考文献
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７．Ｂｅｅｂｅ ＬＦＳ，Ｃａｍｅｒｏｎ ＲＤＡ，Ｂｌａｃｋｓｈａｗ ＡＷ，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａ，Ｎｏｔｔｌｅ ＭＢ．Ｐｉｇｌｅｔｓ ｂｏｒｎ ｆｒｏｍ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ ａｎｄ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｐｅｒｉ−ｈａｔｃｈｉｎｇ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００２；５７：２１５５−２１６５．
８．Ｍｉｓｕｍｉ Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｓ，Ｓａｉｔｏ Ｎ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｍｏｒｕｌａｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２５３−２６０．
９．Ｌｉ Ｒ，Ｌａｉ Ｌ，Ｗａｘ Ｄ，Ｈａｏ Ｙ，Ｍｕｒｐｈｙ ＣＮ，Ｒｉｅｋｅ Ａ，Ｓａｍｕｅｌ Ｍ，Ｌｉｎｖｉｌｌｅ ＭＬ，Ｋｏｒｔｅ ＳＷ，Ｅｖａｎｓ ＲＷ，Ｔｕｒｋ ＪＲ，Ｋａｎｇ ＪＸ，Ｗｉｔｔ ＷＴ，Ｄａｉ Ｙ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｃｌｏｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｗｉｎｅ ｖｉａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００６；７５：２２６−２３０．
１０．Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｈ，Ｈｉｒｕｍａ Ｋ，Ｓａｉｔｏ Ｈ，Ｔｏｍｉｉ Ｒ，Ｕｅｎｏ Ｓ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｎ，Ｍａｔｓｕｎａｒｉ Ｈ，Ｋｕｒｏｍｅ Ｍ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅ ｐｉｇｌｅｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｍａｔｕｒｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００７；７６：９００−９０５．
１１．Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｈ，Ｃａｍｅｒｏｎ ＲＤ，Ｋｕｗａｙａｍａ Ｍ，Ｙｏｕｎｇ Ｍ，Ｂｅｅｂｅ Ｌ，Ｂｌａｃｋｓｈａｗ ＡＷ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｅｌｉｐａｔｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｏｒ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９９；４５：１６７−１７６．
１２．Ｃａｍｅｒｏｎ ＲＤＡ，Ｂｅｅｂｅ ＬＦＳ，Ｂｌａｃｋｓｈａｗ ＡＷ，Ｋｅａｔｅｓ ＨＬ．Ｆａｒｒｏｗｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｌｉｔｔｅｒ ｓｉｚｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｉｎｔｏ ａ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｗｉｎｅ ｈｅｒｄ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００４；６１：１５３３−１５４３．
１３．Ｅｓａｋｉ Ｒ，Ｕｅｄａ Ｈ，Ｋｕｒｏｍｅ Ｍ，Ｈｉｒａｋａｗａ Ｋ，Ｔｏｍｉｉ Ｒ，Ｙｏｓｈｉｏｋａ Ｈ，Ｕｓｈｉｊｉｍａ Ｈ，Ｋｕｗａｙａｍａ Ｍ，Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｈ．Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｍａｔｕｒｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００４；７１：４３２−４３７．
１４．Ｄｕ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｌｉ Ｊ，Ｋｒａｇｈ ＰＭ，Ｋｕｗａｙａｍａ Ｍ，Ｉｅｄａ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ，Ｂｏｇｈ ＩＢ，Ｐｕｒｕｐ Ｓ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＡＭ，Ｖｉｌｌｅｍｏｅｓ Ｋ，Ｙａｎｇ Ｈ，Ｂｏｌｕｎｄ Ｌ，Ｖａｊｔａ Ｇ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｌｏｎｅｄ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７；５４：１８１−１８７．
１５．Ｎｏｒｂｅｒｇ ＨＳ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅａｔｔａｃｈｅｄ ｐｉｇ ｅｍｂｒｙｏ：ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ．Ｚ．Ａｎａｔ．Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇｓｇｅｓｃｈ １９７３；１４３：９５−１１４．
１６．Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｋ，Ｅｋｗａｌｌ Ｈ，Ｔｉｅｎｔｈａｉ Ｐ，Ｋａｗａｉ Ｙ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｊ，Ｋａｎｅｋｏ Ｈ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｈ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅ ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｚｙｇｏｔｅ ２００２；１０：３５５−３６６．
１７．Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｈ，Ｋａｔｏ Ｙ，Ｙａｍａｋａｗａ Ｈ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｔ，Ｏｇｗａ Ｓ．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｐｉｇ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ ｉｎ ｐｅｒｉ−ｈａｔｃｈｉｎｇ ｓｔａｇｅｓ．Ｊｐｎ Ｊ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９８９；３５：１３０−１３４．
１８．Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｈ，Ｙａｍａｋａｗａ Ｈ，Ｎｉｅｍａｎｎ Ｈ．Ｆｒｅｅｚａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｅｒｉ−ｈａｔｃｈｉｎｇ ｓｔａｇｅｓ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １９９２；３７：８３９−８５０．
１９．Ｌｉ Ｒ，Ｈｏｓｏｅ Ｍ，Ｓｈｉｏｙａ Ｙ，Ｂｏｕ Ｓ．Ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ ２００２；３５：１１２５−１１２９．
２０．Ｔａｏ Ｔ，Ｍａｃｈａｔｙ Ｚ，Ｂｏｑｕｅｓｔ ＡＣ，Ｄａｙ ＢＮ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｉｇ ｅｍｂｒｙｏｓ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；５６：１３３−１４１．
２１．Ｍａｃｈａｔｙ Ｚ，Ｗａｎｇ ＷＨ，Ｄａｙ ＢＮ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９９７；５７：１１２３−１１２７．
２２．Ｎｉｅｍａｎｎ Ｈ，Ｒａｔｈ Ｄ，Ｗｒｅｎｚｙｃｋｉ Ｃ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ ｐｉｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｒｅｖｉｅｗ］．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｏｍｅｓｔｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ ２００３；３８：８２−８９．
２３．Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ，Ｈａｗｌｅｙ ＲＪ，Ｃａｒｔｅｒ ＤＢ，Ｌａｉ Ｌ，Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｗｉｎｅ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００３；５９：１１５−１２３．
２４．Ｌａｉ ＬＸ，Ｋｏｌｂｅｒ−Ｓｉｍｏｎｄｓ Ｄ，Ｐａｒｋ ＫＷ，Ｃｈｅｏｎｇ ＨＴ，Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬ，Ｉｍ ＧＳ，Ｓａｍｕｅｌ Ｍ，Ｂｏｎｋ Ａ，Ｒｉｅｋｅ Ａ，Ｄａｙ ＢＮ，Ｍｕｒｐｈｙ ＣＮ，Ｃａｒｔｅｒ ＤＢ，Ｈａｗｌｅｙ ＲＪ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｌ，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｐｉｇｓ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｎｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９５：１０８９−１０９２．
２５．Ｄｕ Ｙ，Ｋｒａｇｈ ＰＭ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｐｕｒｕｐ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｈ，Ｂｏｌｕｎｄ Ｌ，Ｖａｊｔａ Ｇ．Ｈｉｇｈ ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｈａｎｄｍａｄｅ ｃｌｏｎｉｎｇ（ＨＭＣ） ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ ｚｏｎａ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅ ｔｒｉｓｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５；７：１９９−２０５．
２６．Ｋｒａｇｈ ＰＭ，Ｄｕ Ｙ，Ｃｏｒｙｄｏｎ ＴＪ，Ｐｕｒｕｐ Ｓ，Ｂｏｌｕｎｄ Ｌ，Ｖａｊｔａ Ｇ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ ｂｙ ｈａｎｄｍａｄｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００５；６４：１５３６−１５４５．
２７．Ｃｏｌｌｉｎｓ ＪＬ，Ｂａｌｔｚ ＪＭ．Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｏｖｉｄｕｃｔａｌ ｆｌｕｉｄ ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｓｍｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９９９；６０：１１８８−１１９３．
２８．Ｌｉ ＲＦ，Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ Ｋ，Ｌａｉ ＬＸ，Ｗａｘ Ｄ，Ｓｐａｔｅ Ｌ，Ｍｕｒｐｈｙ ＣＮ，Ｒｉｅｋｅ Ａ，Ｉｓｏｍ Ｃ，Ｈａｏ ＹＨ，Ｚｈｏｎｇ ＺＳ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｍ，Ｓｃｈａｔｔｅｎ Ｈ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｏｓｍｏｌａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｖｉｄｕｃｔａｌ ａｎｄ ｕｔｅｒｉｎｅ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＶＦ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００７；７４：１２２８−１２３５．
２９．Ｈｗａｎｇ Ｉ−Ｓ，Ｐａｒｋ Ｍ−Ｒ，Ｍｏｏｎ Ｈ−Ｊ，Ｓｈｉｍ Ｊ−Ｈ，Ｋｉｍ Ｄ−Ｈ，Ｙａｎｇ Ｂ−Ｃ，Ｋｏ Ｙ−Ｇ，Ｙａｎｇ Ｂ−Ｓ，Ｃｈｅｏｎｇ ＨＴ，Ｉｍ ＧＳ．Ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ ａｔ ｅａｒｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｔａｇｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ（Ｂａｘ−ａ ａｎｄ Ｂｃｌ−ｘｌ） ｉｎ ｐｒｅＯｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ＮＴ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００８；７５：４６４−４７１．
３０．Ｄｏｂｒｉｎｓｋｙ ＪＲ．Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５７（１ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ ２００２；５７：２８５−３０２．
３１．Ｂｅｅｂｅ ＬＦＳ，Ｃａｍｅｒｏｎ ＲＤＡ，Ｂｌａｃｋｓｈａｗ ＡＷ，Ｋｅａｔｅｓ ＨＬ，Ｎｏｔｔｌｅ ＭＢ．Ａｓｓｉｓｔｅｄ ｈａｔｃｈｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｏｓｔ−ｗａｒｍｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００４；１６：１６４．
【技術分野】
【０００１】
助成金記載
本発明は、国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金番号Ｒ０１ＲＲ０１３４３８、および助成金番号Ｕ４２ＲＲ０１８８７７の下、政府の支援により一部が行われた。政府は、発明における一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ブタ胚の保存の方法、特にインビトロ産生されたブタ胚を保存する新規および改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
初期哺乳類の胚の凍結保存の成功は、生殖質の保存、ならびに遺伝学の国家的および国際的運動に好機を提供する。残念ながら、ブタ胚は、多くの哺乳類の胚よりも凍結保存が困難であった。ブタ胚が低体温状態に非常に感応性があり、細胞内脂質（脱脂質）の除去がこの感応性を軽減すると見られるという観察に基づき、ブタ胚の凍結保存の成功へと大きく進歩している［１〜４］。ほとんどの研究は、インビトロ産生された胚よりも発生的に有能であると見なされることから、インビボ産生された胚に焦点を合わせている。機械的脱脂質の代替には、細胞骨格の不安定化［５］、またはガラス化状態の変化［６〜８］が含まれる。
【０００４】
インビボ産生胚の凍結保存に関する先の研究によると、無傷の透明帯を持つブタ卵母細胞または胚を遠心分離後、偏光脂肪滴は、橋様構造を介して卵母細胞の細胞質または胚の卵割球と、結合したままである傾向がある［１１］。偏光脂肪滴は、その後の培養または凍結保存手順中、卵母細胞または卵割球へと再分布し得る。囲卵腔が拡大された場合、橋様構造は、遠心分離後破壊され、脂肪滴は、卵母細胞の細胞質または胚の卵割球へ再分布されることはないが、無傷の透明帯内に残る。したがって、インビボ由来胚は、凍結保存前に、脂質再分布を防止するため、遠心分離後即時に、凍結保存される必要がある［１２］。
【０００５】
先の研究はまた、脂肪滴が、ブタ胚の初期に豊富かつ大きく、胚が、胚盤胞期へ、ならびに胚盤胞期を越えて進むに従い、サイズおよび存在量が次第に減少することを発見した［１５、１６］。興味深いことに、初期胚の大きな脂肪滴は、後期胚における小さな液滴よりも、容易に遠心分離により除去される。
【０００６】
インビトロ受精（ＩＶＦ）または核移植（ＮＴ）による胚由来等の、ブタ胚のインビトロ産生は、疾患モデル、または異種移植に対し潜在性のある臓器ドナーを作成するため使用された。結果として、インビトロ産生胚の効果的凍結保存に対する需要が、著しく増加した。しかしながら、インビトロ産生された（ＩＶＰ）胚は、ましてやさらに凍結保存に対し感応性があり、したがって、インビボ産生された対応物よりも、凍結保存がさらに困難である［９］。
【０００７】
これまでのところ、ＩＶＰ胚を凍結保存に対して、極めて限られた成功しか達成されていない。２００６年、発明者の研究室は、凍結保存されたＮＴ胚［９］より産生された、２リットルの形質転換された子ブタを報告した。後に、Ｎａｇａｓｈｉｍａら［１０］は、凍結保存されたＩＶＦ由来胚より産生された子ブタを報告した。しかしながら、ＩＶＦまたはＮＴ由来胚のこれら成功報告の双方の凍結保存は、遠心分離および顕微操作を介し、機械的脱脂質を使用した［９、１０］。機械的脱脂質は、顕微操作中に透明帯へ損傷を与えるため、病原体の伝染の可能性を実質的に増加させる。それはまた、重労働であり、時間のかかるものである。
【０００８】
２つの他のグループ［１３、１４］は、ブタ単為生殖の胚およびハンドメイドクローン胚の凍結保存の生存性を改善するため、部分的消化酵素およびその後の遠心分離を用いる試みを報告した。具体的に、トリプシン、プロナーゼ、または別の酵素により該透明帯が部分的に消化された場合、それは、サイズにおいて肥大し、卵母細胞形質膜および該透明帯間の空間の量の増加をもたらす。したがって、卵母細胞または胚が遠心分離された場合、脂質が完全に分離するために十分な空間が存在する。しかしながら、部分的な消化酵素処置は、脂質分離のための使用の場合、いくつかの不都合を有する。例えば、酵素（トリプシンまたはプロナーゼ等）は、卵母細胞の単為生殖の活性を誘発し得る。加えて、消化酵素処置は、一貫しては効き得ず、酵素処置の効果が酵素の個々のバッチに過度に依存するため、小グループで厳密に観察かつ監視される必要がある。さらに、どちらのグループも、消化酵素および遠心分離方法の組み合わせを使用する凍結保存胚からの、いずれの子ブタ産生も報告していない。
【０００９】
したがって、研究および商業目的に好適である、ＩＶＰ（ＩＶＦ由来またはＮＴ由来等）ブタ胚の脂質分離および凍結保存の実践的かつ非侵襲的な方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様において、インビトロ産生された（ＩＶＰ）（インビトロ受精（ＩＶＦ）由来または核移植（ＮＴ）産生された）ブタ胚の細胞質からの脂質を分離または除去する新規および改善された方法が説明される。本発明の脂質除去方法は、（１）１細胞期または卵割期（胚細胞緊密化前）にＩＶＰブタ胚を産生するステップと、（２）凝縮胚を産生するために胚を凝縮するステップと、（３）脂質分離胚を産生するために、細胞質から脂質を分離し凝縮胚を遠心分離するステップと、を含む。
【００１１】
本発明の方法の一実施形態により、胚の体積は、高浸透圧処置を介し、凝縮され得る。特に、胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期のＩＶＦまたはＮＴ由来胚を、事前に決定された短期間、前の培養培地よりもより大きな事前に選択された浸透圧を持つ培地に暴露することができる。培地の浸透圧は、任意の標準手順に従って、ＮａＣｌ等の塩、ショ糖、ラフィノース、フルクトース、マンニトール、またはトレハロース等の糖、またはＤＭＳＯ等の他の有機試薬、あるいはエチレングリコールを培地へ添加することにより、調節することができる。
【００１２】
本発明の別の態様において、脂質分離されたＩＶＦまたはＮＴ由来のブタ胚の凍結保存およびその後の移植のための新規および改善された方法が説明される。該脂質分離されたブタ胚は、胚盤胞期、およびガラス化に供するさらなる胚発生後、凍結保存することができる。該ガラス化胚は、加温し、その透明帯を除去し、レシピエント（代理ブタ等）へと移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の凍結保存および回復過程のフローダイアグラムである。
【図２】図２（ａ）から（ｆ）は、高浸透圧処置後のインビトロ受精由来胚の発生の写真である。
【図３】図３（ａ）から（ｆ）は、高浸透圧処置後のＮＴ由来胚の発生の写真である。
【図４】図４は、異なる浸透圧（ＮａＣｌまたはショ糖により調節された）（列１）で処置された胚の写真、および遠心分離（列２）後即時のそれらの対応の写真を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野に精通する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で言及されたすべての発行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照することによって、その全体が組み込まれる。
【００１５】
本発明は、先の研究に基づき、初期胚発生段階での脂質除去、または分離がＩＶＰ（ＩＶＦまたはＮＴ由来）ブタ胚の凍結保存に対し重要であり、それは部分的酵素消化法による透明帯の膨化に加えて、ＩＶＰブタ胚の囲卵腔は、容易な脂質除去／分離を可能とするため胚の体積を凝縮することにより、拡大し得ることを教示する。本発明はまた、高浸透圧処置へのＩＶＰ胚の暴露が、胚を凝縮し得るが、胚の活力を保存し得ることを開示する。さらに、本発明の脂質分離方法は、一度に複数の胚を処置するために用いられ、現在の脱脂質手順とは対照的に、それは、それぞれ個々の卵母細胞または胚の顕微操作を必要とするため用いられ得る。
【００１６】
参照される図１は、本発明の胚を凝縮する方法を介し本発明の凍結保存および回復過程のフローダイアグラムである。図１のステップ１は、事前に選択された初期発生段階、具体的に、胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期で、ＩＶＰ胚を提供する。ＩＶＦまたはＮＴ等のいずれの標準ＩＶＰ手順も、順応し得る。
【００１７】
本発明の方法の一実施形態により、インビトロ受精過程は、１つまたは複数のブタ卵巣の胞状卵胞から吸引された卵母細胞と共に開始し得る。該卵母細胞は、ある期間成熟培地で成熟期まで培養され得、かつ剥皮され得る。例示的成熟培地は、０．１％ＰＶＡ、３．０５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、０．９１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍｍｏｌ／Ｌシステイン、０．５μｇ／ｍＬ ＬＨ、０．５μｇ／ｍＬ ＦＳＨ、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、７５μｇ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンと共にＴＣＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ、３１１０００３５、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有し得る。卵母細胞は、加湿空気において５％ＣＯ２、３８．５℃で、約４０〜４４時間、成熟培地で培養し得る。成熟後、卵母細胞は、約４分等の短時間、０．１％ＰＶＡおよび０．１％ヒアルロニダーゼを追加したＴＬ−ＨＥＰＥＳ［２０］で、ボルテックスを通して卵丘細胞を除去することにより剥皮され得る。剥皮された卵母細胞は、精子注入前に多くの異なる培地で貯蔵され得る。優れた培地は、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、２．９ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、５０μｇ／ｍｌペニシリン、６０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ［２６］と共に、ＴＣＭ１９９を含有し得る。
【００１８】
いずれの標準精子注入手順も、ＩＶＰ胚を産生するために順次し得る。一実施形態により、剥皮された卵母細胞は、極体と共に好適なＩＶＦ培地へ、精子懸濁液と混合されるために、最初に移植され得る。例示的ＩＶＦ培地は、１１３．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、２ｍｍｏｌ／Ｌカフェイン、および２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡと共に、修飾されたトリス緩衝培地を含有し得る。
【００１９】
本発明の別の実施形態によると、ＮＴ由来胚は、核移植ドナー細胞および商業的な卵母細胞と共に開始し得る。核移植ドナー細胞は、形質転換された子ブタから収集、もしくは野生型細胞の遺伝子修飾を介して産生され得る。卵母細胞が成熟可能とされた後、０．１％ＰＶＡおよび０．１％ヒアルロニダーゼを追加されたＴＬ−ＨＥＰＥＳで約４分、ボルテックスにより卵母細胞から卵丘細胞が除去された。これら卵母細胞からの最初の極体および隣接細胞質は、次いで、操作培地中、７．０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢで吸引される。ドナー細胞は、次いで、囲卵空間へ移植される。融合および活性は、融合／活性培地（０．３Ｍマニトール、１．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ等）で、１．２ｋＶ／ｃｍの２つの３０μｓ脈拍と共に、同時に達成し得る。あるいは、融合および活性は、まず融合において、低濃度のカルシウムを含む培地（０．３Ｍマニトール、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ等）に暴露し、次いで、暗所で、２００μＭチメロサールに約１０分間、その後、８ｍＭ ＤＴＴに３０分間暴露して活性化［２１］、または任意の他の好適方法で、段階的に達成することができる。
【００２０】
精子注入またはＮＴ後、ＩＶＰ胚は、１細胞期または卵割期（接合体、２細胞または４細胞段階、胚細胞緊密化前）へと培養される。いずれの好適培養手順も順応し得る。一実施形態により、ＩＶＰ胚（インビトロ受精またはＮＴ由来）は、２細胞段階胚を選択するため、３８．５℃、空気中５％ＣＯ２で２８〜３０時間、種々の異なる培養培地において培養され得る。例示的培養培地ＰＺＭ３［２７］は、浸透圧２８８±２、およびｐＨ７．３±２と共に、ＮａＣｌ １０８．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ １０．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３ ２５．０７ｍｍｏｌ／Ｌ、ピルビン酸Ｎａ ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ（乳酸）２．５Ｈ２Ｏ ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、グルタミン１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ヒポタウリン５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＢＭＥアミノ酸溶液２０ｍｌ／Ｌ、ＭＥＭアミノ酸溶液１０ｍｌ／Ｌ、ゲンタマイシン０．０５ｍｇ／ｍＬ、ＢＳＡ ３ｍｇ／ｍＬを含有し得る。
【００２１】
図１のステップ２は、胚の浸透圧を上昇させ、胚を凝縮する。いくつかの異なる培地製剤は、浸透圧を上昇させ、卵母細胞または胚の体積を凝縮するのに用いられ得る。本発明は、異なる濃度（結果として、異なる浸透圧）でＮａＣｌまたはショ糖を使用する例を提供するが、高浸透圧およびその後の細胞（複数可）の体積の縮みをもたらす他の製剤も機能すべきである。
【００２２】
本発明の方法の一実施形態により、浸透圧は、胚が浸される培地の浸透圧を調節することにより、上昇し得る。例えば、ＮａＣｌまたはショ糖は、約３００ｍＯｓｍｏ（７．０μｇ／ｍＬサイトカラシンＢおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを伴う３００〜３１０ｍＯｓｍｏを伴う保存溶液等）と保存用培地へ、３５０、４００、５００、６００、および８００〜８５０ｍＯｓｍｏ等の種々の浸透圧で培地を生じさせるため、添加され得る。ＩＶＰ由来胚は、短時間、約５〜１０分、遠心分離前に事前に選択された高浸透圧の培地に暴露され得る。
【００２３】
図１のステップ３は、通常、遠心分離を介し、凝縮胚から脂質を分離するものである。例えば、高浸透圧培地における凝縮胚は、約６〜２０分、１３，４００×ｇで遠心分離し得る。遠心分離条件（力または期間）は、胚の活力を保存すると同時に、完全な脂質分離を達成するのに十分である限り、遠心分離力および時間が大きい範囲で変化し得る。短い期間は、該力が増加した場合、特に役立つ。同様に、より低い力が使用される場合、長い期間が必要で有り得る。高浸透圧への長期暴露は、胚の活力に影響を及ぼし得る。
【００２４】
脂質分離は、約１２時間の培養後、確認され得、いくつかの場合（それらが比較的重要であるため、特に、ＮＴ由来胚に対し）、第二期の高浸透圧処置、およびその後の遠心分離は、比較的完全な脂質分離を達成するために適用され得る。胚細胞緊密化前の卵割期で胚が残存する限り、第二期の高浸透圧処置は、任意で有り得る。
【００２５】
脂質分離胚は、次いで、図１の胚盤胞期ステップ４へとさらに発生することを可能とする。具体的に、脂質分離胚は、胚が胚盤胞段階を得るため、ＰＺＭ３において３〜６日培養され得る。
【００２６】
図１のステップ５は、さらに発生した胚のガラス化である。胚は、いずれの標準方法／手順を通してもガラス化され得る。一実施形態により、さらに発生した胚は、修飾されたオープンプルドストロー（ＯＰＳ）法の使用により、胚盤胞期でガラス化され得る。具体的に、さらに発生した胚は、平衡溶液中に短時間（約２分等）配置され得、その後、ガラス化溶液への暴露が続き、次いでＯＰＳストローに積み込まれ、かつ液体窒素へと即時に浸され得る。例示的平衡溶液は、例示的ガラス化溶液が、２０％エチレングリコール、および２０％ＤＭＳＯを含有すると同時に、１０％エチレングリコール、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有し得る。窒素に浸される前の過程は、３８．５℃の加温段階で行われ得る。ガラス化溶液への暴露から窒素に浸すまでの期間は、概して、約２５〜３０秒間と短い範囲である。
【００２７】
図１のステップ６〜８は、保存胚を回復する、かつかかるものをレシピエントへと移植するステップである。具体的に、ガラス化胚は、若干昇温（約３８．５℃等）である期間、緩衝液（ショ糖等）へと浸すことにより解凍され得る。解凍胚は、透明帯を軟化かつ除去するため０．５％プロナーゼで処置され得る。脂質分離および帯除去胚は、次いでレシピエントまたは代理体の卵管または子宮へと移植され得る。
【００２８】
図２（ａ）〜（ｆ）は、高浸透圧処置（ＮａＣｌで４００ｍＯｓｍ）後のＩＶＦ由来胚の写真である。図２（ａ）は、高浸透圧処置および遠心分離後、数時間培養された胚を表示する。図２（ｂ）および２（ｃ）は、胚盤胞段階での胚を表示する。図２（ｄ）は、ガラス化および加温後の胚を表示する。図２（ｅ）は、それらの透明帯の除去後の胚を表示する。図２（ｆ）は、ＢＲＬ細胞調整培地においてインビトロ培養後再拡張した胚を表示する。
【００２９】
図３（ａ）〜（ｆ）は、ＮａＣｌまたはショ糖との高浸透圧処置後のＮＴ由来胚の発生の写真である。図３（ａ）および３（ｂ）は、高浸透圧処置および遠心分離後、数時間培養されたＮＴ由来胚を表示し、図３（ｃ）および３（ｄ）は、胚盤胞段階へとさらに培養された胚を表示し、図３（ｅ）は、ガラス化後に加温された胚を表示し、かつ図３（ｆ）は、ＢＲＬ細胞調整培地においてインビトロ培養後、再拡張した胚を表示する。
【００３０】
本発明はさらに、異なる試薬（浸透圧を調節する）の効果、異なる浸透圧、および脂質分離の速度上の遠心分離時間を研究した。本発明は、ＮａＣｌまたはショ糖等の異なる試薬が、脂質分離において同様の効果を有し、脂質分離に対する理想的な浸透圧は、約３５０〜約５００ｍＯｓｍまでの範囲であり、かつ好適遠心分離力／速度で、約６分〜約２０分の範囲である遠心分離期間はまた、脂質分離速度において陽性作用を有することを発見した。
【００３１】
図４は、遠心分離前後に、異なる浸透圧（ＮａＣｌまたはショ糖で調節された）で処置されたインビトロ受精胚の写真を表示する。列１は、上昇した浸透圧（対照との比較）で明らかに表示される凝縮と共に、異なる浸透圧、３００ｍＯｓｍ（対照）、４００ｍＯｓｍ（ＮａＣｌで調節された）、６００ｍＯｓｍ（ショ糖で調節された）、および８００ｍＯｓｍ（ショ糖で調節された）で暴露された胚の写真を表示する。列２は、遠心分離後の胚の対応の写真を列挙する。遠心分離後の橋様構造（不完全脂質分離を示唆する）は、該対照においても見られ得、完全脂質分離は、６００または８００ｍＯｓｍｏで処置された胚において、大きな橋様構造が存在すると同時に、４００ｍＯｓｍで暴露された胚において観察され得る。図２は、約４００ｍＯｓｍの浸透圧が、最も完全な脂質分離を提供し、浸透圧が６００以上へ上昇した場合、脂質分離が邪魔されることを示唆している。
【００３２】
本発明はさらに、脂質分離速度、胚の発生、および孵化能力へ与える、異なる浸透圧および遠心分離条件の影響を定量的に評価した。表１（ＩＶＦ由来胚、ＮａＣｌで調節された浸透圧）、２（ＩＶＦ由来胚、ショ糖で調節された浸透圧）、および３（ＮＴ由来胚、ＮａＣｌおよびショ糖の双方で調節された浸透圧、３つの表すべてが添付されている）に含まれるデータに基づき、脂質分離の好まれる状態は、３００以上〜約５００ｍＯｓｍまでの範囲、好ましくは約３５０〜約４５０ｍＯｓｍ、である浸透圧にＩＶＰ胚を暴露し、続いて１３，４００×ｇ速度で約６〜約２０分、遠心分離するためである。該遠心分離時間は、遠心分離速度により、短縮または延長され得る。しかしながら、遠心分離時間の延長は、高浸透圧に胚を長期暴露させ得、それは胚の活力に対し悪影響を有しえる。さらに、表３において、第ニ期高浸透圧処置は、総脂質分離速度を上昇させる第一期の処置上で、凝縮に失敗したＮＴ由来胚のために、選出される。第ニ期高浸透圧処置は、胚細胞緊密化前の卵割期に胚が未だ在る限り、選出され得る。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
表４は、高浸透圧処置、遠心分離、およびガラス化によって保存されたＩＶＦ由来胚に関する妊娠および子孫データを評価する。表４に含まれるデータの中で、９つの代理体のうち３つが妊娠を確立し、正常な子孫を産生した。１つの代理体は、３５０ｍＯｓｍの浸透圧で処置した胚を受容し、５匹の子ブタ、オス３匹およびメス２匹を産生し、１つの代理体は、４００ｍＯｓｍで処置した胚を受容し、４匹の子ブタ、オス２匹およびメス２匹を産生し、１つの代理体は、４５０ｍＯｓｍで処置した胚を受容し、３匹の子ブタ、オス１匹およびメス２匹を産生した。
【００３７】
【表４】
【００３８】
表５は、高浸透圧処置、遠心分離、およびガラス化後のＮＴ由来胚の移植、妊娠、および子孫のデータを一覧にする。３つの胚の移植を行い、記録した。それぞれの移植について、透明帯をプロナーゼ処置によって軟化または除去した８０〜９０個の胚を代理体に移植した。４００ｍＯｓｍｏで処置し、６分間遠心分離した胚を受容した３つの代理体のうちの２つ、ならびに３５０ｍＯｓｍｏで処置し、２０分間遠心分離した胚を受容した１つが、妊娠を生じ、前者については１匹のオスの子ブタを産生した。表４および５のデータは、本発明の方法が、特に好ましい範囲の浸透圧（約３５０〜約４５０ｍＯｓｍ）を適用するとき、ＩＶＰ胚のための凍結保存方法に成功することを示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】
本発明をその具体的な実施形態に関連して説明したが、さらに改良することが可能であることを理解されたい。本特許出願は、概して本発明の原理に従い、本発明が関連する技術分野内で既知または慣例の実践内に入り、本明細書の上記および以下の添付の特許請求の範囲内に記載される本質的特徴に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、本発明のいずれの変形、使用、または適合をも網羅することを意図する。
【００４１】
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２４．Ｌａｉ ＬＸ，Ｋｏｌｂｅｒ−Ｓｉｍｏｎｄｓ Ｄ，Ｐａｒｋ ＫＷ，Ｃｈｅｏｎｇ ＨＴ，Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬ，Ｉｍ ＧＳ，Ｓａｍｕｅｌ Ｍ，Ｂｏｎｋ Ａ，Ｒｉｅｋｅ Ａ，Ｄａｙ ＢＮ，Ｍｕｒｐｈｙ ＣＮ，Ｃａｒｔｅｒ ＤＢ，Ｈａｗｌｅｙ ＲＪ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｌ，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｐｉｇｓ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｎｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９５：１０８９−１０９２．
２５．Ｄｕ Ｙ，Ｋｒａｇｈ ＰＭ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｐｕｒｕｐ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｈ，Ｂｏｌｕｎｄ Ｌ，Ｖａｊｔａ Ｇ．Ｈｉｇｈ ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｈａｎｄｍａｄｅ ｃｌｏｎｉｎｇ（ＨＭＣ） ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ ｚｏｎａ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅ ｔｒｉｓｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５；７：１９９−２０５．
２６．Ｋｒａｇｈ ＰＭ，Ｄｕ Ｙ，Ｃｏｒｙｄｏｎ ＴＪ，Ｐｕｒｕｐ Ｓ，Ｂｏｌｕｎｄ Ｌ，Ｖａｊｔａ Ｇ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ ｂｙ ｈａｎｄｍａｄｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００５；６４：１５３６−１５４５．
２７．Ｃｏｌｌｉｎｓ ＪＬ，Ｂａｌｔｚ ＪＭ．Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｏｖｉｄｕｃｔａｌ ｆｌｕｉｄ ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｓｍｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９９９；６０：１１８８−１１９３．
２８．Ｌｉ ＲＦ，Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ Ｋ，Ｌａｉ ＬＸ，Ｗａｘ Ｄ，Ｓｐａｔｅ Ｌ，Ｍｕｒｐｈｙ ＣＮ，Ｒｉｅｋｅ Ａ，Ｉｓｏｍ Ｃ，Ｈａｏ ＹＨ，Ｚｈｏｎｇ ＺＳ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｍ，Ｓｃｈａｔｔｅｎ Ｈ，Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｏｓｍｏｌａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｖｉｄｕｃｔａｌ ａｎｄ ｕｔｅｒｉｎｅ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＶＦ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００７；７４：１２２８−１２３５．
２９．Ｈｗａｎｇ Ｉ−Ｓ，Ｐａｒｋ Ｍ−Ｒ，Ｍｏｏｎ Ｈ−Ｊ，Ｓｈｉｍ Ｊ−Ｈ，Ｋｉｍ Ｄ−Ｈ，Ｙａｎｇ Ｂ−Ｃ，Ｋｏ Ｙ−Ｇ，Ｙａｎｇ Ｂ−Ｓ，Ｃｈｅｏｎｇ ＨＴ，Ｉｍ ＧＳ．Ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ ａｔ ｅａｒｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｔａｇｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ（Ｂａｘ−ａ ａｎｄ Ｂｃｌ−ｘｌ） ｉｎ ｐｒｅＯｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ＮＴ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００８；７５：４６４−４７１．
３０．Ｄｏｂｒｉｎｓｋｙ ＪＲ．Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５７（１ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ ２００２；５７：２８５−３０２．
３１．Ｂｅｅｂｅ ＬＦＳ，Ｃａｍｅｒｏｎ ＲＤＡ，Ｂｌａｃｋｓｈａｗ ＡＷ，Ｋｅａｔｅｓ ＨＬ，Ｎｏｔｔｌｅ ＭＢ．Ａｓｓｉｓｔｅｄ ｈａｔｃｈｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｏｓｔ−ｗａｒｍｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００４；１６：１６４．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶＰブタ胚の脂質分離の方法であって、
（ａ）胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期にＩＶＰブタ胚を産生することと、
（ｂ）凝縮胚を産生するために、かかる胚を、短時間、事前に選択された浸透圧を持つ培地に暴露することと、
（ｃ）脂質分離胚を産生するために、かかる凝縮胚を、事前に選択された速度で事前に選択された期間、遠心分離することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＶＰブタ胚が、インビトロ受精、核移植、または他のインビトロ方法を介し産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地の浸透圧が、約３００ｍＯｓｍｏ〜約５００ｍＯｓｍｏの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遠心分離条件が、１３，４００×ｇの速度で約６〜約２０分の範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
インビトロ産生されたブタ胚の凍結保存および回復の方法であって、
（ａ）胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期に、インビトロ産生されたブタ胚を産生することと、
（ｂ）凝縮胚を産生するために、前記胚を、事前に選択された浸透圧に短時間、暴露することと、
（ｃ）脂質分離胚を産生するために、前記凝縮胚を遠心分離することと、
（ｄ）脂質分離胚盤胞を産生するために、前記脂質分離胚を、胚盤胞期へ培養することと、
（ｅ）ガラス化または凍結により、前記胚盤胞を凍結保存することと、
（ｆ）加温、再水和、および透明帯の除去により、前記胚盤胞を回復することと、
（ｇ）前記帯除去胚盤胞を、レシピエントへ移植することと、を含む、方法。
【請求項１】
ＩＶＰブタ胚の脂質分離の方法であって、
（ａ）胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期にＩＶＰブタ胚を産生することと、
（ｂ）凝縮胚を産生するために、かかる胚を、短時間、事前に選択された浸透圧を持つ培地に暴露することと、
（ｃ）脂質分離胚を産生するために、かかる凝縮胚を、事前に選択された速度で事前に選択された期間、遠心分離することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＶＰブタ胚が、インビトロ受精、核移植、または他のインビトロ方法を介し産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地の浸透圧が、約３００ｍＯｓｍｏ〜約５００ｍＯｓｍｏの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遠心分離条件が、１３，４００×ｇの速度で約６〜約２０分の範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
インビトロ産生されたブタ胚の凍結保存および回復の方法であって、
（ａ）胚細胞緊密化前の１細胞期または卵割期に、インビトロ産生されたブタ胚を産生することと、
（ｂ）凝縮胚を産生するために、前記胚を、事前に選択された浸透圧に短時間、暴露することと、
（ｃ）脂質分離胚を産生するために、前記凝縮胚を遠心分離することと、
（ｄ）脂質分離胚盤胞を産生するために、前記脂質分離胚を、胚盤胞期へ培養することと、
（ｅ）ガラス化または凍結により、前記胚盤胞を凍結保存することと、
（ｆ）加温、再水和、および透明帯の除去により、前記胚盤胞を回復することと、
（ｇ）前記帯除去胚盤胞を、レシピエントへ移植することと、を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図３ｆ】
【図４】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図３ｆ】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５０１１８７（Ｐ２０１２−５０１１８７Ａ）
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５２４９（Ｐ２０１１−５２５２４９）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５５４２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５４０４
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５０１３０５８４４）ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＵＲＡＴＯＲＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＳＳＯＵＲＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５５４２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５４０４
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５０１３０５８４４）ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＵＲＡＴＯＲＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＳＳＯＵＲＩ
【Ｆターム（参考）】
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