プロテインＡ結合タンパク質の作製方法
【課題】従来の抗体のプロテインＡ固定化方法ではＦｃ部位を介して結合するためマウスＩｇＧ１抗体はプロテインＡに対する結合力が比較的弱いという問題を解決し、抗原親和性が高い抗体であってもプロテインＡを利用した免疫検査チップに利用できる、マウスＩｇＧ１抗体のプロテインＡ結合能を増強することができるタンパク質の作製方法を提供する。
【解決手段】目的タンパク質、好ましくは哺乳類由来のＩｇＧ抗体重鎖、のアミノ酸配列中に、特定の配列を有するペプチド断片を挿入し、プロテインＡ結合能を付加させることを特徴とする、プロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【解決手段】目的タンパク質、好ましくは哺乳類由来のＩｇＧ抗体重鎖、のアミノ酸配列中に、特定の配列を有するペプチド断片を挿入し、プロテインＡ結合能を付加させることを特徴とする、プロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫検査チップに用いるプロテインＡ結合タンパク質の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、従来から医療や臨床診断をはじめとする幅広い分野で利用されており、近年では、抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発も盛んに行なわれている。また、抗体は、微量物質を特異的に検出・測定する手段としても利用されており、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に用いられている。これらの測定方法は、検査薬に応用されているほか、医学・薬学・生化学分野等の研究に欠くことのできないものとなっている。
【０００３】
一般的な抗体の作製方法としては、マウス、ウサギ、ヒツジ等の動物に抗原を接種して免疫することによって抗血清を調製し、その抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法、ハイブリドーマをマウス等の腹腔にて増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を調製し、その腹水から抗体を精製する方法、ハイブリドーマを血清培地や無血清培地中で培養してモノクローナル抗体を含む培養液を調製し、その培養液から抗体を精製する方法等がある。
【０００４】
そして、上記のようにして得られた抗血清や腹水、培養液から抗体を精製する方法としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製方法が知られている。例えば、アフィニティクロマトグラフィーには、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対して結合性を有するプロテインＡやプロテインＧをリガンドとして固定化したゲルが広く用いられている。
【０００５】
抗体は分子量２５ｋＤａの軽鎖と分子量５５ｋＤａから７７ｋＤａの重鎖の間でジスルフィド結合を形成し構造を保持している。抗体の軽鎖、重鎖は構成するアミノ酸の多様性それぞれ可変領域（Ｆｖ領域）と定常領域（Ｆｃ領域）に分けることができる。ヒト抗体を例として説明する。重鎖はＦｃ領域の違いにより、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖に分けられ、γ鎖を有するＩｇＧ（単量体、分子量１５０ｋＤａ）、μ鎖を有するＩｇＭ（五量体、分子量９７０ｋＤａ）、α鎖を有するＩｇＡ（単量体、分子量１６０ｋＤａ）、δ鎖を有するＩｇＤ（単量体、分子量１６０ｋＤａ）、ε鎖を有するＩｇＥ（単量体、分子量１９０ｋＤａ）のアイソタイプに分類され、アイソタイプの違いにより抗体の持つエフェクター機能が異なる。
【０００６】
エフェクター機能は抗体のＦｃ領域が担う機能であり，アイソタイプに依存している。補体を活性化する機能はＩｇＭとＩｇＧクラスの抗体に限られ、抗体のＦｖ領域が結合した細胞を溶解させる。
【０００７】
一方ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＡクラスの抗体のＦｃ領域はそれぞれに特異的なＦｃ受容体に結合し、Ｆｃ受容体をもつ細胞を活性化する。特にＩｇＧ抗体はＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージ上のＦｃ受容体を介して、これらのエフェクター細胞を活性化し抗体のＦｖ領域が結合した標的細胞を殺す。
【０００８】
プロテインＡの生理活性について説明する。免疫細胞の遺伝子再構成を経てＢ細胞は数千万種類の多様なＦｖ領域を有する抗体を細胞表面に提示するようになる。生体内に抗原が侵入すると最も特異性の高い抗体と結合する。この抗原認識のシグナルによってＢ細胞が大量に抗体を分泌するようになる。分泌された抗体は上記の各免疫細胞上に発現するＦｃ受容体を介して、侵入した抗原を排除する免疫システムを始動させる。
【０００９】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は侵入した生体の免疫機構に対抗するためにプロテインＡを産生する。プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が産生する細胞壁成分のタンパク質であり、ヒト、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ウシ等の哺乳類由来の抗体と特異的に結合する。ｐＩ＝５．０、Ｍｗ＝４５ｋＤａ、ドメインＥ，Ｄ、Ａ，Ｂ，Ｃで構成されるタンパク質である。（非特許文献１） プロテインＡはＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部位に結合することが非特許文献２で報告されている。
【００１０】
一方でヒトＶＨ３ファミリーのＦａｂ領域と結合することも報告されている。（非特許文献３）
上記のようにプロテインＡはＦｃ領域に結合して抗体のエフェクター機能をブロックすることでＦｃ受容体を介する免疫機構を阻害している。
【００１１】
マウスが産生する抗体（マウスＩｇＧ）はさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３のサブクラスに分類される。ｐＨ７付近におけるプロテインＡとの結合力はＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１であり、ＩｇＧ２ｂとの解離定数は約１０−7 Ｍ、ＩｇＧ１との解離定数は約１０-6 Ｍである。（非特許文献４）
Ｆｃ領域にアミノ酸置換を導入することによってプロテインＡとマウスＩｇＧ１の結合力を向上させることが知られている。（非特許文献５）
プロテインＡがマウスＩｇＧと特異的に結合することを利用してラテックス粒子、ガラス基板、プラスチック基板、金属基板などの担体上にプロテインＡを介してマウスＩｇＧを固定化して免疫検査チップに使用することが特許文献１で示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平５−２７３２１２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｔｏｍａｓ Ｍｏｋｓ著「Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．」ＦＥＢＳ、１９８６年１月、（Ｐ６３７−Ｐ６４３）
【非特許文献２】Ｋｏｉｃｈｉ Ｋａｔｏ著「ＦＥＢＳ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９３年５月、（Ｐ４９−Ｐ５４）
【非特許文献３】Ｂｉｒｇｅｒ Ｊａｎｓｓｏｎ著「ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９８年４月、（Ｐ６９−Ｐ７８）
【非特許文献４】Ｍａｓａｙｕｋｉ Ｏｄａ著「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」日本免疫学会、２００３年４月、（Ｐ４１７−Ｐ４２６）
【非特許文献５】Ｍａｓａｔｏ Ｎａｇａｏｋａ著「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００３年４月、（Ｐ２４３−Ｐ２４５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、従来の抗体のプロテインＡ固定化方法ではＦｃ部位を介して結合するためマウスＩｇＧ１抗体はプロテインＡに対する結合力が比較的弱いという問題があった。特にマウス抗体は大量生産し臨床検査試薬や医薬品等に利用するが、産生抗体がＩｇＧ１サブクラスである場合が多く、抗原親和性が高い抗体であってもプロテインＡを利用した免疫検査チップに利用できないという課題を有していた。
【００１５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、マウスＩｇＧ１抗体のプロテインＡ結合能を向上させるプロテインＡ結合タンパク質の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記従来の課題を解決するために、本発明のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法は、目的タンパク質に対して特定配列のペプチド断片を抗原認識領域内に挿入することでプロテインＡ結合能を付加する。
【００１７】
本構成によって、目的タンパク質のプロテインＡ結合能を増強することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法によれば、目的タンパク質にプロテインＡ結合能を付加することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態１における、配列１挿入の手順図
【図２】本発明の実施の形態１における、抗体の重鎖抗原認識部位の二次構造の模式図
【図３】本発明の実施の形態１における、抗体の重鎖抗原認識部位をコードする遺伝子構造の模式図
【図４】本発明の実施の形態１における、抗体の重鎖抗原認識部位の遺伝子組み換え体の模式図
【図５】実施例１における、配列１を挿入した組み換え抗体とプロテインＡとの表面プラズモン共鳴測定センサグラムの図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
抗体の抗原認識部位にプロテインＡ結合能を挿入する設計方法について説明する。
【００２２】
図１に関して、配列１で示されるペプチド断片１０１をマウスＩｇＧ１抗体１０２の重鎖抗原認識部位に挿入することで、組み換え抗体１０３を作製する手順を示した。
【００２３】
抗体の抗原認識部位のドメイン構造について説明する。
すべての抗体分子の基本構造は２つの同じ軽鎖（Ｌ鎖）と重鎖（Ｈ鎖）からなり、それぞれがジスルフィド結合で結ばれている。Ｎ末端側に可変領域があり、重鎖可変領域をＶＨ、軽鎖可変領域ＶＬとする。それ以外のドメインを定常領域は重鎖のものはＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３、軽鎖のものはＣＬとする。可変領域の中でも、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を変化させることにより多様な抗原認識機能を創出している。
【００２４】
抗原分子のドメイン構造は可変領域で９つ，定常領域で７つの逆平行βシートからなるβバレル構造をしている。
【００２５】
抗体は共通な枠組構造、すなわちフレームワーク領域（ＦＲ領域）が重鎖３個、軽鎖３個の合計６個のループ領域（ＣＤＲ）を支持するように配置され、ＣＤＲのアミノ酸配列に多様性を持たせることにより、さまざまな抗原を認識している。
【００２６】
抗体の抗原特異性はＣＤＲの立体構造、相対的な配置、アミノ酸残基の側鎖の特性によって決定される。ＣＤＲのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とＣＤＲ自体の構造を維持する部位とが存在し、ＣＤＲの取り得る立体構造は、複数のカノニカル構造に分類される。カノニカル構造のクラスは、ＣＤＲのみならずフレームワーク領域の特定の位置のアミノ酸の種類によっても決定される。ＣＤＲ移植法を用いる場合、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基も移植する必要性がある。一般に、移植すべきＣＤＲを有する抗体は「ドナー」、ＣＤＲが移植される側の抗体は「アクセプター」と定義され、ＣＤＲ移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りＣＤＲの構造を保存することにある。この目的を達成するためには、アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、ドナーのＦＲ領域からいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の２点に留意する必要がある。
【００２７】
図２はＶＨにおけるＦＲとＣＤＲの二次構造を示している。一般的に知られているＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法によって各々のモチーフを分類することができる。第一のフレームワーク領域ＦＲ１（２０１）と第二のフレームワーク領域ＦＲ２（２０２）によってＣＤＲ−Ｈ１（２１１）が保持され、同様にＦＲ２とＦＲ３（２０３）によってＣＤＲ−Ｈ２（２１２）が保持され、ＦＲ３とＦＲ４（２０４）によってＣＤＲ−Ｈ３（２１３）が保持されている。
【００２８】
（実施の形態２）
本発明のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法について説明する。
マウス抗体の軽鎖及び重鎖の構造遺伝子をモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞からｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法で増幅し、発現ベクターにクローニングする方法は通常公知の技法で行われる。
ベクターとして用いられるのは、真核細胞を発現宿主とする場合は、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭＶなどのＣＭＶプロモーターで発現制御を行うベクター、及び、ｐＥＦ１、ｐＢｕｄなどのＥＦ１αプロモーターで発現制御を行うベクター、または、これらのプロモーターを組み合わせたベクター使用することができる。
原核細胞を発現宿主として使用する場合はＴ７プロモーターで発現制御を行うベクター、ｔｒｃプロモーターで発現制御を行うベクター、プロモーターの機能を糖化合物の添加によって制御するベクター等を使用することができる。
【００２９】
真核細胞の発現宿主としては、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｋ１、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．などを使用することができる。
【００３０】
原核細胞の発現宿主としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．， Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．，Ａｃｔｉｎｏｍｕｙｃｅｓ ｓｐ．， Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｓｓｕｓ ｓｐ．， Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．， Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．， などを使用することができる。
【００３１】
昆虫細胞の発現宿主としては、ＳＦ株、及びそれらの由来株を使用することができる。
また、上記ベクターのクローニングサイト近傍に蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、アルカリフォスファターゼ、糖類結合タンパク質、グルタチオン、ポリヒスチジン等の通常公知の機能性タンパク質を組み換え抗体と共発現させることもできる。
【００３２】
発現ベクターを細胞内に導入する方法について、真核細胞の場合は、リポフェクタミン法、エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法など、原核細胞の場合は、ヒートショック法、エレクトロポレーション法など通常公知の手法を使用することができる。
【００３３】
組み換え抗体の生産について、真核細胞の場合は、牛血清を添加したＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩなどの合成培地や、無血清培養に最適化された合成培地を使用することができる。原核細胞の場合は、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地など通常公知の微生物培地を使用することができる。
【００３４】
プロテインＡと組み換え抗体の結合性の評価には、表面プラズモン共鳴方式（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡ方式、フローサイトメトリー方式、ラテックス凝集方式、免疫染色方式など通常公知の手法を使用することができる。
【００３５】
（実施例１）
＜組み換え抗体の発現と精製＞
マウスＩｇＧ１を産生するハイブリドーマ細胞株よりｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって重鎖及び軽鎖遺伝子断片が通常公知の手法によって得られた。
増幅した重鎖及び軽鎖遺伝子断片をｐＢｕｄＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＥＦ１αプロモータ下流のクローニングサイトに挿入することでマウスＩｇＧ１遺伝子発現ベクターを構築した。
【００３６】
配列表１で示されるプロテインＡ結合性ペプチド断片をコードする遺伝子断片をＶＨ領域のＦＲ１に相当する部位に挿入した重鎖可変領域の人工遺伝子をＴａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に委託合成して得た。
プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１抗体の遺伝子構築について説明する。
【００３７】
マウスＩｇＧ１抗体の中でもＦａｂ領域でプロテインＡと結合する、すなわち、プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造を３０１に示している。Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法に従ってＦＲ１（３１１）、ＦＲ２（３２１）、ＦＲ３（３３１）、ＦＲ４（３４１）の遺伝子モチーフを同定した。これに対して３０２はプロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造を示している。同様にＦＲ１（３１２）、ＦＲ２（３２２）、ＦＲ３（３３２）、ＦＲ４（３４２）の遺伝子モチーフを同定した。
【００３８】
次に、プロテインＡ結合性ＩｇＧ１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４を各々プロテインＡ非結合性ＩｇＧ１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と交換した組み換え抗体遺伝子を作製した。ＦＲ１交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０１）、ＦＲ２交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０２）、ＦＲ３交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０３）、ＦＲ４交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０４）を作製した。
【００３９】
本発明では上記のフレームワーク交換抗体のプロテインＡ結合性を検討することで配列表１のペプチド断片がプロテインＡ結合能を有することを見出した。
【００４０】
抗原認識には直接的にはＣＤＲ領域のループ部位が関与すると考えられ、立体構造を保持しつつフレームワークに機能を付加すれば抗原認識性は失われることなく、抗体に新たな機能を付加できることは自明である。本発明では鋭意検討の結果、ＣＤＲの立体構造を保持しつつプロテインＡ結合能を発揮することが可能な配列表１のペプチド断片をＦＲ１部位に導入した組み換え抗体を作製した。
【００４１】
次に、上記で構築したマウスＩｇＧ１遺伝子発現ベクターを鋳型としてＶＨ領域を除く全ての領域をＰＣＲ法によって増幅しベクター断片を得た。ＶＨ領域人工遺伝子はさらに、前記ベクター断片の５’末端及び３’末端の１５塩基と同一の配列を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅し、前記ベクター断片と相同配列部位を連結することで、ＶＨ領域のＦＲ１部位に配列表１の遺伝子断片が挿入された発現ベクターを構築した。なお一連の遺伝子連結操作はＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して行った。
【００４２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への遺伝子導入は通常公知のリポフェクション法で行った。まず遺伝子導入の１日前に１０％牛血清を含むＤＭＥＭ培地中に細胞を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。遺伝子直前の培養容器面積に対する細胞密度は約８０％であった。無血清培地に遺伝子とリポフェクション試薬を添加し撹拌した後２０分間室温放置し、培養容器に全量を添加した。次に５％ＣＯ２、３７℃の条件で５時間培養した後、無血清培地に交換してさらに同条件で７２時間の培養の後、培養上清を回収した。
【００４３】
培養上清を回収し遠心分離で細胞や不純物を除去した後、培養上清を０．１等量まで濃縮し１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で４℃、１２時間の透析を行った。
【００４４】
組み換え抗体の精製にはＨｉＴＲＡＰ ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。まず、カラム容量の１０倍量の１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０にて平衡化を行った後、カラムに前記濃縮培養液を添加して組み換え抗体をカラム担体に結合させ、さらに１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０をカラム容量の１０倍量を添加して非特異的結合物を洗浄した。次に、２０ｍＭグリシンンｐＨ２．５を添加して組み換え抗体溶出画分を得た。
【００４５】
得られた溶出画分をＳＤＳＰＡＧＥに供して精製度を確認し、ＨＰＲ標識抗マウス抗体ウェスタンブロットに供してマウス抗体が含まれていることを確認した。
【００４６】
以上の操作によってＦＲ１組み換えＩｇＧ１抗体を作製することができた。
【００４７】
＜プロテインＡと組み換えＩｇＧ１抗体間の相互作用の評価＞
プロテインＡとＦＲ１組変え抗体との相互作用を検討するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。ＳＰＲ測定にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア社）を用いた。Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社）上にプロテインＡを固定化した。固定化方法はアミノカップリング法を用いて、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００のプリセットプログラムに従うことでプロテインＡをリガンドとしたセンサチップを作製した。
【００４８】
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００にセットし、ＮＨＳ（４００ｍＭ）とＥＤＣ（１００ｍＭ）との混合液を添加し、７分間反応後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（１．０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ４．５）を添加し、２０分間反応させた。更に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し７分間反応させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇと反応せずに残存したカルボキシル基をブロックした。 以上の操作により、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡをＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５表面に共有結合で固定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの添加前と洗浄後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を固定量（ＲＵ値）とした。 その結果、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの固定量は３０００ＲＵであった。
【００４９】
アナライトとして濃度１μＭに調整したＦＲ１組み変えＩｇＧ１抗体及び野生型ＩｇＧ１抗体を添加した。移動層には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ３ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ｐＨ７．４バッファーを使用した。流速１０μＬ／ｍｉｎで６００秒間アナライトを添加した後、６００秒間バッファーのみを添加して測定しセンサグラムを得た。
【００５０】
その結果、野生型ＩｇＧ１と比較してＦＲ１組み変えＩｇＧ１抗体はプロテインＡへの結合量が多いことが図５のグラフで示された。マウスＩｇＧ１抗体のＦＲ１部位に配列表１で示されるペプチド断片を挿入することによって、プロテインＡへの結合力が付加された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明にかかるプロテインＡ結合タンパク質の作製方法は、目的タンパク質にプロテインＡへの結合能を付加するという効果を有し、臨床検査試験チップ等として有用である。またプロテインＡを利用した担体へのタンパク質固定化技術としても有用である。
【符号の説明】
【００５２】
１０１ 配列１のペプチド断片
１０２ マウスＩｇＧ１抗体
１０３ 配列１を挿入した組み変えＩｇＧ１抗体
２０１ ＶＨ領域のフレームワーク１
２０２ ＶＨ領域のフレームワーク２
２０３ ＶＨ領域のフレームワーク３
２０４ ＶＨ領域のフレームワーク４
２１１ ＶＨ領域のＣＤＲ１
２１２ ＶＨ領域のＣＤＲ２
２１３ ＶＨ領域のＣＤＲ３
３０１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造
３１１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク１遺伝子
３２１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク２遺伝子
３３１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク３遺伝子
３４１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク４遺伝子
３０２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造
３１２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク１遺伝子
３２２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク２遺伝子
３３２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク３遺伝子
３４２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク４遺伝子
４０１ フレームワーク１交換ＶＨ遺伝子
４０２ フレームワーク２交換ＶＨ遺伝子
４０３ フレームワーク３交換ＶＨ遺伝子
４０４ フレームワーク４交換ＶＨ遺伝子
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫検査チップに用いるプロテインＡ結合タンパク質の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、従来から医療や臨床診断をはじめとする幅広い分野で利用されており、近年では、抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発も盛んに行なわれている。また、抗体は、微量物質を特異的に検出・測定する手段としても利用されており、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に用いられている。これらの測定方法は、検査薬に応用されているほか、医学・薬学・生化学分野等の研究に欠くことのできないものとなっている。
【０００３】
一般的な抗体の作製方法としては、マウス、ウサギ、ヒツジ等の動物に抗原を接種して免疫することによって抗血清を調製し、その抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法、ハイブリドーマをマウス等の腹腔にて増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を調製し、その腹水から抗体を精製する方法、ハイブリドーマを血清培地や無血清培地中で培養してモノクローナル抗体を含む培養液を調製し、その培養液から抗体を精製する方法等がある。
【０００４】
そして、上記のようにして得られた抗血清や腹水、培養液から抗体を精製する方法としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製方法が知られている。例えば、アフィニティクロマトグラフィーには、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対して結合性を有するプロテインＡやプロテインＧをリガンドとして固定化したゲルが広く用いられている。
【０００５】
抗体は分子量２５ｋＤａの軽鎖と分子量５５ｋＤａから７７ｋＤａの重鎖の間でジスルフィド結合を形成し構造を保持している。抗体の軽鎖、重鎖は構成するアミノ酸の多様性それぞれ可変領域（Ｆｖ領域）と定常領域（Ｆｃ領域）に分けることができる。ヒト抗体を例として説明する。重鎖はＦｃ領域の違いにより、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖に分けられ、γ鎖を有するＩｇＧ（単量体、分子量１５０ｋＤａ）、μ鎖を有するＩｇＭ（五量体、分子量９７０ｋＤａ）、α鎖を有するＩｇＡ（単量体、分子量１６０ｋＤａ）、δ鎖を有するＩｇＤ（単量体、分子量１６０ｋＤａ）、ε鎖を有するＩｇＥ（単量体、分子量１９０ｋＤａ）のアイソタイプに分類され、アイソタイプの違いにより抗体の持つエフェクター機能が異なる。
【０００６】
エフェクター機能は抗体のＦｃ領域が担う機能であり，アイソタイプに依存している。補体を活性化する機能はＩｇＭとＩｇＧクラスの抗体に限られ、抗体のＦｖ領域が結合した細胞を溶解させる。
【０００７】
一方ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＡクラスの抗体のＦｃ領域はそれぞれに特異的なＦｃ受容体に結合し、Ｆｃ受容体をもつ細胞を活性化する。特にＩｇＧ抗体はＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージ上のＦｃ受容体を介して、これらのエフェクター細胞を活性化し抗体のＦｖ領域が結合した標的細胞を殺す。
【０００８】
プロテインＡの生理活性について説明する。免疫細胞の遺伝子再構成を経てＢ細胞は数千万種類の多様なＦｖ領域を有する抗体を細胞表面に提示するようになる。生体内に抗原が侵入すると最も特異性の高い抗体と結合する。この抗原認識のシグナルによってＢ細胞が大量に抗体を分泌するようになる。分泌された抗体は上記の各免疫細胞上に発現するＦｃ受容体を介して、侵入した抗原を排除する免疫システムを始動させる。
【０００９】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は侵入した生体の免疫機構に対抗するためにプロテインＡを産生する。プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が産生する細胞壁成分のタンパク質であり、ヒト、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ウシ等の哺乳類由来の抗体と特異的に結合する。ｐＩ＝５．０、Ｍｗ＝４５ｋＤａ、ドメインＥ，Ｄ、Ａ，Ｂ，Ｃで構成されるタンパク質である。（非特許文献１） プロテインＡはＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３部位に結合することが非特許文献２で報告されている。
【００１０】
一方でヒトＶＨ３ファミリーのＦａｂ領域と結合することも報告されている。（非特許文献３）
上記のようにプロテインＡはＦｃ領域に結合して抗体のエフェクター機能をブロックすることでＦｃ受容体を介する免疫機構を阻害している。
【００１１】
マウスが産生する抗体（マウスＩｇＧ）はさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３のサブクラスに分類される。ｐＨ７付近におけるプロテインＡとの結合力はＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１であり、ＩｇＧ２ｂとの解離定数は約１０−7 Ｍ、ＩｇＧ１との解離定数は約１０-6 Ｍである。（非特許文献４）
Ｆｃ領域にアミノ酸置換を導入することによってプロテインＡとマウスＩｇＧ１の結合力を向上させることが知られている。（非特許文献５）
プロテインＡがマウスＩｇＧと特異的に結合することを利用してラテックス粒子、ガラス基板、プラスチック基板、金属基板などの担体上にプロテインＡを介してマウスＩｇＧを固定化して免疫検査チップに使用することが特許文献１で示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平５−２７３２１２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｔｏｍａｓ Ｍｏｋｓ著「Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．」ＦＥＢＳ、１９８６年１月、（Ｐ６３７−Ｐ６４３）
【非特許文献２】Ｋｏｉｃｈｉ Ｋａｔｏ著「ＦＥＢＳ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９３年５月、（Ｐ４９−Ｐ５４）
【非特許文献３】Ｂｉｒｇｅｒ Ｊａｎｓｓｏｎ著「ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９８年４月、（Ｐ６９−Ｐ７８）
【非特許文献４】Ｍａｓａｙｕｋｉ Ｏｄａ著「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」日本免疫学会、２００３年４月、（Ｐ４１７−Ｐ４２６）
【非特許文献５】Ｍａｓａｔｏ Ｎａｇａｏｋａ著「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００３年４月、（Ｐ２４３−Ｐ２４５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、従来の抗体のプロテインＡ固定化方法ではＦｃ部位を介して結合するためマウスＩｇＧ１抗体はプロテインＡに対する結合力が比較的弱いという問題があった。特にマウス抗体は大量生産し臨床検査試薬や医薬品等に利用するが、産生抗体がＩｇＧ１サブクラスである場合が多く、抗原親和性が高い抗体であってもプロテインＡを利用した免疫検査チップに利用できないという課題を有していた。
【００１５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、マウスＩｇＧ１抗体のプロテインＡ結合能を向上させるプロテインＡ結合タンパク質の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記従来の課題を解決するために、本発明のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法は、目的タンパク質に対して特定配列のペプチド断片を抗原認識領域内に挿入することでプロテインＡ結合能を付加する。
【００１７】
本構成によって、目的タンパク質のプロテインＡ結合能を増強することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法によれば、目的タンパク質にプロテインＡ結合能を付加することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態１における、配列１挿入の手順図
【図２】本発明の実施の形態１における、抗体の重鎖抗原認識部位の二次構造の模式図
【図３】本発明の実施の形態１における、抗体の重鎖抗原認識部位をコードする遺伝子構造の模式図
【図４】本発明の実施の形態１における、抗体の重鎖抗原認識部位の遺伝子組み換え体の模式図
【図５】実施例１における、配列１を挿入した組み換え抗体とプロテインＡとの表面プラズモン共鳴測定センサグラムの図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
抗体の抗原認識部位にプロテインＡ結合能を挿入する設計方法について説明する。
【００２２】
図１に関して、配列１で示されるペプチド断片１０１をマウスＩｇＧ１抗体１０２の重鎖抗原認識部位に挿入することで、組み換え抗体１０３を作製する手順を示した。
【００２３】
抗体の抗原認識部位のドメイン構造について説明する。
すべての抗体分子の基本構造は２つの同じ軽鎖（Ｌ鎖）と重鎖（Ｈ鎖）からなり、それぞれがジスルフィド結合で結ばれている。Ｎ末端側に可変領域があり、重鎖可変領域をＶＨ、軽鎖可変領域ＶＬとする。それ以外のドメインを定常領域は重鎖のものはＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３、軽鎖のものはＣＬとする。可変領域の中でも、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を変化させることにより多様な抗原認識機能を創出している。
【００２４】
抗原分子のドメイン構造は可変領域で９つ，定常領域で７つの逆平行βシートからなるβバレル構造をしている。
【００２５】
抗体は共通な枠組構造、すなわちフレームワーク領域（ＦＲ領域）が重鎖３個、軽鎖３個の合計６個のループ領域（ＣＤＲ）を支持するように配置され、ＣＤＲのアミノ酸配列に多様性を持たせることにより、さまざまな抗原を認識している。
【００２６】
抗体の抗原特異性はＣＤＲの立体構造、相対的な配置、アミノ酸残基の側鎖の特性によって決定される。ＣＤＲのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とＣＤＲ自体の構造を維持する部位とが存在し、ＣＤＲの取り得る立体構造は、複数のカノニカル構造に分類される。カノニカル構造のクラスは、ＣＤＲのみならずフレームワーク領域の特定の位置のアミノ酸の種類によっても決定される。ＣＤＲ移植法を用いる場合、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基も移植する必要性がある。一般に、移植すべきＣＤＲを有する抗体は「ドナー」、ＣＤＲが移植される側の抗体は「アクセプター」と定義され、ＣＤＲ移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りＣＤＲの構造を保存することにある。この目的を達成するためには、アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、ドナーのＦＲ領域からいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の２点に留意する必要がある。
【００２７】
図２はＶＨにおけるＦＲとＣＤＲの二次構造を示している。一般的に知られているＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法によって各々のモチーフを分類することができる。第一のフレームワーク領域ＦＲ１（２０１）と第二のフレームワーク領域ＦＲ２（２０２）によってＣＤＲ−Ｈ１（２１１）が保持され、同様にＦＲ２とＦＲ３（２０３）によってＣＤＲ−Ｈ２（２１２）が保持され、ＦＲ３とＦＲ４（２０４）によってＣＤＲ−Ｈ３（２１３）が保持されている。
【００２８】
（実施の形態２）
本発明のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法について説明する。
マウス抗体の軽鎖及び重鎖の構造遺伝子をモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞からｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法で増幅し、発現ベクターにクローニングする方法は通常公知の技法で行われる。
ベクターとして用いられるのは、真核細胞を発現宿主とする場合は、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭＶなどのＣＭＶプロモーターで発現制御を行うベクター、及び、ｐＥＦ１、ｐＢｕｄなどのＥＦ１αプロモーターで発現制御を行うベクター、または、これらのプロモーターを組み合わせたベクター使用することができる。
原核細胞を発現宿主として使用する場合はＴ７プロモーターで発現制御を行うベクター、ｔｒｃプロモーターで発現制御を行うベクター、プロモーターの機能を糖化合物の添加によって制御するベクター等を使用することができる。
【００２９】
真核細胞の発現宿主としては、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｋ１、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．などを使用することができる。
【００３０】
原核細胞の発現宿主としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．， Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．，Ａｃｔｉｎｏｍｕｙｃｅｓ ｓｐ．， Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｓｓｕｓ ｓｐ．， Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．， Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．， などを使用することができる。
【００３１】
昆虫細胞の発現宿主としては、ＳＦ株、及びそれらの由来株を使用することができる。
また、上記ベクターのクローニングサイト近傍に蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、アルカリフォスファターゼ、糖類結合タンパク質、グルタチオン、ポリヒスチジン等の通常公知の機能性タンパク質を組み換え抗体と共発現させることもできる。
【００３２】
発現ベクターを細胞内に導入する方法について、真核細胞の場合は、リポフェクタミン法、エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法など、原核細胞の場合は、ヒートショック法、エレクトロポレーション法など通常公知の手法を使用することができる。
【００３３】
組み換え抗体の生産について、真核細胞の場合は、牛血清を添加したＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩなどの合成培地や、無血清培養に最適化された合成培地を使用することができる。原核細胞の場合は、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地など通常公知の微生物培地を使用することができる。
【００３４】
プロテインＡと組み換え抗体の結合性の評価には、表面プラズモン共鳴方式（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡ方式、フローサイトメトリー方式、ラテックス凝集方式、免疫染色方式など通常公知の手法を使用することができる。
【００３５】
（実施例１）
＜組み換え抗体の発現と精製＞
マウスＩｇＧ１を産生するハイブリドーマ細胞株よりｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって重鎖及び軽鎖遺伝子断片が通常公知の手法によって得られた。
増幅した重鎖及び軽鎖遺伝子断片をｐＢｕｄＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＥＦ１αプロモータ下流のクローニングサイトに挿入することでマウスＩｇＧ１遺伝子発現ベクターを構築した。
【００３６】
配列表１で示されるプロテインＡ結合性ペプチド断片をコードする遺伝子断片をＶＨ領域のＦＲ１に相当する部位に挿入した重鎖可変領域の人工遺伝子をＴａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に委託合成して得た。
プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１抗体の遺伝子構築について説明する。
【００３７】
マウスＩｇＧ１抗体の中でもＦａｂ領域でプロテインＡと結合する、すなわち、プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造を３０１に示している。Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ法に従ってＦＲ１（３１１）、ＦＲ２（３２１）、ＦＲ３（３３１）、ＦＲ４（３４１）の遺伝子モチーフを同定した。これに対して３０２はプロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造を示している。同様にＦＲ１（３１２）、ＦＲ２（３２２）、ＦＲ３（３３２）、ＦＲ４（３４２）の遺伝子モチーフを同定した。
【００３８】
次に、プロテインＡ結合性ＩｇＧ１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４を各々プロテインＡ非結合性ＩｇＧ１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と交換した組み換え抗体遺伝子を作製した。ＦＲ１交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０１）、ＦＲ２交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０２）、ＦＲ３交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０３）、ＦＲ４交換抗体のＶＨ領域遺伝子（４０４）を作製した。
【００３９】
本発明では上記のフレームワーク交換抗体のプロテインＡ結合性を検討することで配列表１のペプチド断片がプロテインＡ結合能を有することを見出した。
【００４０】
抗原認識には直接的にはＣＤＲ領域のループ部位が関与すると考えられ、立体構造を保持しつつフレームワークに機能を付加すれば抗原認識性は失われることなく、抗体に新たな機能を付加できることは自明である。本発明では鋭意検討の結果、ＣＤＲの立体構造を保持しつつプロテインＡ結合能を発揮することが可能な配列表１のペプチド断片をＦＲ１部位に導入した組み換え抗体を作製した。
【００４１】
次に、上記で構築したマウスＩｇＧ１遺伝子発現ベクターを鋳型としてＶＨ領域を除く全ての領域をＰＣＲ法によって増幅しベクター断片を得た。ＶＨ領域人工遺伝子はさらに、前記ベクター断片の５’末端及び３’末端の１５塩基と同一の配列を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅し、前記ベクター断片と相同配列部位を連結することで、ＶＨ領域のＦＲ１部位に配列表１の遺伝子断片が挿入された発現ベクターを構築した。なお一連の遺伝子連結操作はＩｎ Ｆｕｓｉｏｎ ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して行った。
【００４２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への遺伝子導入は通常公知のリポフェクション法で行った。まず遺伝子導入の１日前に１０％牛血清を含むＤＭＥＭ培地中に細胞を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。遺伝子直前の培養容器面積に対する細胞密度は約８０％であった。無血清培地に遺伝子とリポフェクション試薬を添加し撹拌した後２０分間室温放置し、培養容器に全量を添加した。次に５％ＣＯ２、３７℃の条件で５時間培養した後、無血清培地に交換してさらに同条件で７２時間の培養の後、培養上清を回収した。
【００４３】
培養上清を回収し遠心分離で細胞や不純物を除去した後、培養上清を０．１等量まで濃縮し１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で４℃、１２時間の透析を行った。
【００４４】
組み換え抗体の精製にはＨｉＴＲＡＰ ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。まず、カラム容量の１０倍量の１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０にて平衡化を行った後、カラムに前記濃縮培養液を添加して組み換え抗体をカラム担体に結合させ、さらに１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０をカラム容量の１０倍量を添加して非特異的結合物を洗浄した。次に、２０ｍＭグリシンンｐＨ２．５を添加して組み換え抗体溶出画分を得た。
【００４５】
得られた溶出画分をＳＤＳＰＡＧＥに供して精製度を確認し、ＨＰＲ標識抗マウス抗体ウェスタンブロットに供してマウス抗体が含まれていることを確認した。
【００４６】
以上の操作によってＦＲ１組み換えＩｇＧ１抗体を作製することができた。
【００４７】
＜プロテインＡと組み換えＩｇＧ１抗体間の相互作用の評価＞
プロテインＡとＦＲ１組変え抗体との相互作用を検討するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。ＳＰＲ測定にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア社）を用いた。Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社）上にプロテインＡを固定化した。固定化方法はアミノカップリング法を用いて、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００のプリセットプログラムに従うことでプロテインＡをリガンドとしたセンサチップを作製した。
【００４８】
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００にセットし、ＮＨＳ（４００ｍＭ）とＥＤＣ（１００ｍＭ）との混合液を添加し、７分間反応後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（１．０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ４．５）を添加し、２０分間反応させた。更に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し７分間反応させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇと反応せずに残存したカルボキシル基をブロックした。 以上の操作により、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡをＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５表面に共有結合で固定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの添加前と洗浄後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を固定量（ＲＵ値）とした。 その結果、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの固定量は３０００ＲＵであった。
【００４９】
アナライトとして濃度１μＭに調整したＦＲ１組み変えＩｇＧ１抗体及び野生型ＩｇＧ１抗体を添加した。移動層には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ３ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ｐＨ７．４バッファーを使用した。流速１０μＬ／ｍｉｎで６００秒間アナライトを添加した後、６００秒間バッファーのみを添加して測定しセンサグラムを得た。
【００５０】
その結果、野生型ＩｇＧ１と比較してＦＲ１組み変えＩｇＧ１抗体はプロテインＡへの結合量が多いことが図５のグラフで示された。マウスＩｇＧ１抗体のＦＲ１部位に配列表１で示されるペプチド断片を挿入することによって、プロテインＡへの結合力が付加された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明にかかるプロテインＡ結合タンパク質の作製方法は、目的タンパク質にプロテインＡへの結合能を付加するという効果を有し、臨床検査試験チップ等として有用である。またプロテインＡを利用した担体へのタンパク質固定化技術としても有用である。
【符号の説明】
【００５２】
１０１ 配列１のペプチド断片
１０２ マウスＩｇＧ１抗体
１０３ 配列１を挿入した組み変えＩｇＧ１抗体
２０１ ＶＨ領域のフレームワーク１
２０２ ＶＨ領域のフレームワーク２
２０３ ＶＨ領域のフレームワーク３
２０４ ＶＨ領域のフレームワーク４
２１１ ＶＨ領域のＣＤＲ１
２１２ ＶＨ領域のＣＤＲ２
２１３ ＶＨ領域のＣＤＲ３
３０１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造
３１１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク１遺伝子
３２１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク２遺伝子
３３１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク３遺伝子
３４１ プロテインＡ結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク４遺伝子
３０２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のＶＨ領域遺伝子構造
３１２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク１遺伝子
３２２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク２遺伝子
３３２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク３遺伝子
３４２ プロテインＡ非結合性マウスＩｇＧ１のフレームワーク４遺伝子
４０１ フレームワーク１交換ＶＨ遺伝子
４０２ フレームワーク２交換ＶＨ遺伝子
４０３ フレームワーク３交換ＶＨ遺伝子
４０４ フレームワーク４交換ＶＨ遺伝子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質のアミノ酸配列中に、配列表１で示されるペプチド断片を挿入し、プロテインＡ結合能を付加させることを特徴とする、プロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項２】
目的タンパク質が、特異的結合活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１記載のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項３】
目的タンパク質が哺乳類動物由来のＩｇＧである、請求項２記載のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項４】
配列番号１で表されるペプチド断片を、ＩｇＧ抗体重鎖の抗原認識領域に挿入することを特徴とする、請求項１記載のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項１】
目的タンパク質のアミノ酸配列中に、配列表１で示されるペプチド断片を挿入し、プロテインＡ結合能を付加させることを特徴とする、プロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項２】
目的タンパク質が、特異的結合活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１記載のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項３】
目的タンパク質が哺乳類動物由来のＩｇＧである、請求項２記載のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【請求項４】
配列番号１で表されるペプチド断片を、ＩｇＧ抗体重鎖の抗原認識領域に挿入することを特徴とする、請求項１記載のプロテインＡ結合タンパク質の作製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１７９０１７（Ｐ２０１２−１７９０１７Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４４６３６（Ｐ２０１１−４４６３６）
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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