プロバイオティクス及びシンバイオティックとしてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）の使用
本発明に従い、適当な担体と共に、有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を含んで成る、プロバイオティクス組成物が供される。該プロバイオティクス組成物は、多くのプロバイオティクス効果、例えば、腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護を有する。本発明に従い、該組成物が有利な効果を有する、いくつかの疾患の治療及び／又は予防方法が供される。例えば、該組成物は、高血圧の治療、体重障害の治療、高脂血症の治療、又はチリグリセリド障害の治療における有用性の発見における製品を発酵するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（ａ）本発明の分野
本発明は、腸内健康、免疫の調節、肥満関連問題、例えば、血中脂質レベル、高血圧、及び体重の制御、並びに腫瘍に対する保護における効果を有するプロバイオティクスとしてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ）先行技術の説明
プロバイオティクス微生物の伝統的定義は、細菌（及びその成分）が無毒で、胃／腸内環境において生存でき、胃−腸管中で付着／持続し、正常なヒトミクロフローラとして存在し、そして健康的な利益を及ぼすことを必要とする。しかしながら、近年の証拠は、いくつかのプロバイオティクス効果が非ヒト起源の乳酸菌から得ることができ、そしてプロバイオティクス効果は加熱又は照射失活されたラクトバチルスにより、そしていくつかの場合には溶菌液から得ることができることが示された（米国特許第４，３４７，２４０号）。プロバイオティクス乳酸菌から観察される健康利益は、しばしば株特異的であり、そして極めて可変的である。プロバイオティクス乳酸菌について記載されるいくつかの効果は：腸内ミクロフローラの調節、病原性微生物との競合及び除去、免疫機能の調節、アレルギーの制御、胃腸健康の促進、血中脂質レベルの調節、糖尿病の制御（血中のグルコース及びインスリンの調節）、結腸癌に対する保護、体重の制御を含む。
【０００３】
ケフィアは何世紀もの間、ミルクを発酵するために使用されてきた。ケフィア粒は、グラム陽性の異種−及び同種発酵性乳酸細菌からできている。グラム陰性乳酸菌、並びにラクトース発酵及び非発酵酵母菌は、ケフィラン、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）細菌により分泌されるエキソポリサッカライドファミリーのバイオポリマーにより一緒に保持される。Ｌ．ケフィラノファシエンス（L.kefiranofaciens）種の乳酸菌は異種発酵乳酸菌であり、そしてケフィア粒の主要な細菌集団を表す。２つの独立種として本来分類されるが、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィアグラナム（Lactobacillus kefirgranum）は、近年これらの同じ１６Ｓ ＲＮＡ配列に基づき、Ｌ．ケフィラノファシエンス（L.kefiranofaciens）の亜種として再分類された(Vancanneyt et al., lnt J Syst Evol Microbiol. 54(Pt 2):551-556, 2004)。該２つの亜種への分類は、寒天プレート上及び液体培地中における、異なる糖類からの酸生成、及びＰＡＧＥからのタンパク質プロファイリングにおける形態学に基づき行われた。該亜種ケフィラノファシエンス（kefiranofaciens）由来の株は、通常ケフィランの高い産生株であり、これはケフィア粒の組成及び形成に必須である。ケフィラノファシエンス（kefiranofaciens）株からのケフィラン産生は、寒天プレート上のコロニー形態（光沢又は粘液性の外観を示す）から認識されるが、亜種ケフィグラナム(kefirgranum）由来の株は、有意なレベルのケフィランを産生しない。しかしながらラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）は、継代培養に対して極めて感受性であることが示された。ケフィグラナム(kefirgranum）株はトレアロースから酸を産生することができるが、ケフィラノファシエンス（kefiranofaciens）株は産生することができない。さらに、ケフィグラナム(kefirgranum）亜種由来の株は、液体培養液中で綿状かつ堆積性である。
【０００４】
無毒性が何年にもわたってケフィアに随伴するという事実は、それから分離されるラクトバチルス株の安全性及び無毒性に対する強力な論拠である。Ｌ．アシドフィルス（acidophilus)グループにおけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種は、Ｌ．クリスパツス（crispatus）及びＬ．アシドフィルス（acidophilus)種に近く、これは良く記載されるプロバイオティクス株を含む。
【０００５】
Santos et al. (System. Appl. Microbiol., 26:434-437, 2003)は、酸及び胆汁に対する耐性、異なる付着及び抗微生物特性を示すラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の４つの株を記載する。
【０００６】
米国特許第４，３４７，２４０号は、ケフィア粒由来の未決定の株分類（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens））のラクトバチルスＫＰＢ−１７６の新規株の分離を記載し、これは大量のケフィランを産生し、特定の培地について厳格な選択性を有さず、そして継代培養においてポリサッカライドの生産性における減少に関係しない。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の概要
本発明に従い、適当な担体と共に、有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を含んで成る、プロバイオティクス組成物が供される。該ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、例えば、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択することができる。
【０００８】
本発明の１つの態様において、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、Ｒ２Ｃ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−３）、ＩＮＩＸ（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−４）、Ｋ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−１）；ＥＳ１（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−２）及びTechnologie Biolactis inc.由来のＢｉｏＳＰ株から成る群から選択される株である。
【０００９】
プロバイオティクス効果は、例えば、腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されることができる。該組成物は、経口、直腸又は膣投与に適当に処方することができる。
【００１０】
更に本発明に従い、対象中の腸内ミクロフローラの陽性調節を提供するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１１】
また本発明に従い、腸炎に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。このような腸炎は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じ得る。
【００１２】
更に本発明に従い、アレルギー及び／又は自己免疫疾患に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００１３】
また本発明に従い、下痢に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１４】
本発明に従い、糖尿病に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が更に供される。
【００１５】
また本発明に従い、高脂血症に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１６】
更に本発明に従い、直腸癌に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１７】
また本発明に従い、対象における腸炎を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。このような腸炎は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じ得る。
【００１８】
更に本発明に従い、対象におけるアレルギー及び／又は自己免疫疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００１９】
また本発明に従い、対象における下痢を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００２０】
本発明に従い、対象における糖尿病を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が更に供される。
【００２１】
また本発明に従い、対象における高脂血症を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００２２】
さらに本発明に従い、対象における直腸癌を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００２３】
本発明は更に、プロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。該プロバイオティクス化合物は、例えば、腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されるプロバイオティクス効果を有することができる。該使用は経口投与に適当である。
【００２４】
ある態様において、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、発酵乳製品及び非生細菌試料、例えば、熱殺細菌、照射細菌、及び溶解細菌として、生細菌集団、凍結乾燥細菌集団から成る群から選択される形態において投与される。
【００２５】
本発明のある態様は更に、抗炎症性効果を有するプロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００２６】
ある態様は、乾癬の治療のためのプロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００２７】
本発明に従い、抗炎症性化合物と併用した、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用であって、ここで炎症性化合物が５−ＡＳＡ又は副腎皮質ステロイドである方法もまた供される。
【００２８】
本発明は更に、乾癬の治療のための医薬の製造のためのプロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００２９】
ある態様において、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、乳清を発酵するために使用され、ここで該乳清はチーズ乳清である。
【００３０】
本発明に従い、循環器疾患の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３１】
本発明に従い、高血圧の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３２】
本発明はさらに、体重障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３３】
本発明に従い、高脂血症の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３４】
本発明は更に、トリグリセリド障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３５】
本発明に従い、循環器疾患の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３６】
本発明に従い、高血圧の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３７】
本発明はさらに、体重障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３８】
本発明はさらに、高脂血症の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３９】
本発明に従い、トリグリセリド障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００４０】
本発明は更に、プロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。該プロバイオティクス化合物は、高血圧、低ＨＤＬ、腹部の脂肪、インスリン耐性、及び高レベルのトリグリセリドの５つの問題に関係するメタボリックシンドロームの治療のために使用することができる。従って、本発明のプロバイオティクス化合物は、メタボリックシンドロームに関係する問題を治療及び／又は予防するために使用することができる。
【００４１】
本発明は更に、体重管理を制御するために、プロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００４２】
本発明の詳細な説明
本発明に従い、食料及び医薬中の多様な適用を伴うプロバイオティクス乳酸菌が供される。より具体的には、本発明は、以下に記載されるとおり、４株により定義される、プロバイオティクス種、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）を含む）に関係し、これは動物モデルにおける経口治療に従い有意なプロバイオティクス能を示した。これらのプロバイオティクス効果中、腸内付着、腸内ミクロフローラの陽性調節、免疫調節、アレルギー、下痢、体重管理、高血圧及び高脂血症が観察された。この種から分離された異種株は、一般的及び株特異的な有利な健康効果の両方を示した。これらは、発酵乳製品（ミルク、乳清ベース）として、生きている又は凍結乾燥させた細菌集団として、あるいは生きていない細菌試料（熱滅菌、照射又は溶解化細菌）として、経口的に投与することができる。
【００４３】
本発明は、本発明の範囲を制限せずに例証するために与えられる以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるものと考える。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ケフィア粒由来のラクトバチルスのプ５つのプロバイオティクス株の同定
本願中に記載される３つの株、Ｒ２Ｃ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−３）、Ｋ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−１）及びＥＳ１（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−２）は、乳清中における成長に以前に適合したケフィア粒から分離した。
【００４５】
１つの株、ＩＮＩＸ（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−４）は、ＡＴＣＣケフィラノファシエンス対照株（ＡＴＣＣ受入番号４３７６１）の寒天プレート上におけるケフィラン過剰産生コロニーから分離した。
【００４６】
ＢｉｏＳＰは、Technologie Biolactis inc.由来の液体培養中で強力な綿状性であるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）株である。
【００４７】
１６Ｓ ＲＢＡ遺伝子配列に基づき、本願中に記載した株は、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種に指定した。液体培地及び寒天プレート上の形態、並びに糖発酵特性はまた、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種のいずれかの株のより具体的な指定を許容した。ケフィラノファシエンス（Ｒ２Ｃ２、ＥＳ１及びＩＮＩＸ）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Ｋ２及びＢｉｏＳＰ）。
【００４８】
実施例２
ラクトバチルス株のインビトロ評価
Ｒ２Ｃ２：一般に短い桿菌であり、グラム陽性、単一又は２〜４の連鎖、いくらかのエキソポリサッカライドを非産生又は産生する。該桿菌の長さ及び幅は、使用される培養培地及び保存培地に従い極めて変化する。ＲＣＷプレートにおいて、これは乾燥かつ滑らかな結晶様コロニーを形成し、中央がベージュの白色であり、凸面であり、エンボス上部を伴う。該株は、欠乏培地（例えば、補助なしの乳清）中で良好に成長し、そして液体培地中で小サイズの凝集体を産生する（約１０の細菌又はそれ以下）。
【００４９】
ＩＮＩＸ：伸長した、一般にＲ２Ｃ２よりも長い桿菌、グラム陽性、単一又は２〜４の連鎖桿菌。ＲＣＷプレートにおいて、これは粘液性又は粘性様のコロニーを形成し、これは隣接するコロニーと融合する。液体ＲＣＷ培地中のケフィラン産生率は高く、そして継代培養において安定である。該株は欠乏培地中で弱い成長性を有する；典型的な、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）であり、そして液体培地中で小サイズの凝集体を産生する（約１０〜５０の細菌）。
【００５０】
ＥＳ１：Ｒ２Ｃ２株と類似するが、欠乏培地中で悪い成長性を表す。
【００５１】
Ｋ２：Ｒ２Ｃ２よりも僅かに幅広な平均的長さの桿菌、単一又は２〜４の連鎖桿菌。エキソポリサッカライドを産生しない又は殆ど産生しない。欠乏培地中で成長するが、試験した全ての培養培地について、他の株よりも低レベルにおいて安定段階に達した（ＲＣＷ：Ｒ２Ｃ２及びＥＳ１について１．５〜３×１０9と比較して５〜７×１０8の細菌）。液体培養中の平均サイズの凝集体を示す（約５０〜１００の細菌）。
【００５２】
ＢｉｏＳＰ：平均的長さの桿菌、不規則な細胞表面を伴う、他の全ての株よりも幅広であり、単一又は２〜４の連鎖桿菌。エキソポリサッカライドを産生しない又は殆ど産生しない。グラム陽性、液体培地中の乳酸菌の大きなサイズの凝集体の形成はまた沈殿したタンパク質を含む（１００以上の細菌）。ＲＣＷプレートにおいて、これは白色コロニー、凸面を形成し、より均一な上層を伴うが、該表面上に明らかな白色のポイントを示す。欠乏培地中で成長するが、強カルシウム濃度（１％ＣａＣｌ２ｐ／ｖ）の存在において極めて低下する。
【００５３】
発酵プロフィール
表１は、上述の株の発酵プロフィールについてのデータを供する。
【００５４】
【表１】
【００５５】
代謝産物発酵プロフィール
表２〜４は、代謝産物発酵についてのデータを供する（１が弱、５が強として定義した１〜５のスケール、＋＝５及び−は反応しないことを示す）。
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種に対する株分類：
１６Ｓ ＲＮＡ配列の比較は、ラクトバチルス株の分類のために広く受け入れられる手段である。５つの異なるラクトバチルス株の１６Ｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅し（フォワードプライマー配列番号１、リバースプライマー配列番号２を使用）、そして配列決定した。異種株は、ＮＣＢＩにおいて入手可能な８０のラクトバチルス１６Ｓ配列、及び対照株ＡＴＣＣ４３７６１を伴い得られた配列の得られた配列のアライメントを介して、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種に全て系統学的に分類した。
【００６０】
株Ｒ２Ｃ２（配列番号３）、ＩＮＩＸ（配列番号４）、ＢｉｏＳＰ（配列番号５）、Ｋ２（配列番号６）及びＥＳ１（配列番号７）の１６Ｓ ＲＮＡ配列の対応する相補配列を配列表に挙げる。
【００６１】
細菌計数手順
細菌数及び生存率を評価するためのＦＡＣＳ法を以下のとおり使用した。血球計算器を使用する細菌計数を行う前に、全ての凝集体を解離しなければならない。本明細書に供される乳酸菌株Ｒ２Ｃ２及びＩＮＩＸは、小さくて不安定な凝集体を形成する傾向を有する。解離は、ＰＢＳピロリン酸（１５ｍＬ）に該株を再懸濁することにより容易に達成することができる。株ＢｉｏＳＰ及びＫ２（特にＢｉｏＳＰ）は、ＰＢＳピロリン酸のみを使用して解離することができない大きなサイズの凝集体を形成する。再懸濁後、これら２つの株を５５℃で３０分間加熱する必要がある。その後、該株を室温で１５分間、各細菌が血球計算機により検出可能となるようにＤＮＡに結合する臭化エチジウムに暴露させる。その後、より正確な計数とするために連続希釈（１／１０、１／１００、１／１０００）を行った。
【００６２】
また、他の方法、例えば、プレート計数法及び最確数法（計数を許容する異なる希釈での一連の接種）を使用することができる。
【００６３】
ＭＲＳ、ＲＣＷ及び乳清中の成長特性
異種株の前培養を、ＲＣＷ培地において３７℃で１２〜２４時間行った。新鮮な指数関数的に増殖する培地由来の細胞を計測し、そして１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度において異なる培地中に接種した。培養液を３７℃でインキュベートし、そしてＦＡＣＳ計数法を使用して、２、４、６、８、１２、２４、３２及び４８時間の間隔において、細胞を計測した。
【００６４】
ダイレクトＰＣＲ検出法の開発
異なる組織中のＬ．ケフィラノファシエンスの検出を許容するための種特異的ＰＣＲ増幅法を開発した。ＰＣＲ検出試験は、１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子の増幅において成る。これらのプライマーは、乳酸菌１６Ｓ配列と、我々の株、及び参照株ＡＴＣＣ受入番号４３７６１のアライメントの結果を介して同定した、ユニークなＬ．ケフィラノファシエンスＤＮＡ配列からデザインした。該プライマーの特異性は、５つの異なる乳酸菌株のＤＮＡに対して実験的に試験した。該試験はまた、糞便、粘膜及び結腸全体から単離された実験試料中のＬ．ケフィラノファシエンスＤＮＡを検出するために成功的に使用されている。これらの結果は、該プライマーが高特異性であり、腸内フローラ中の細菌ＤＮＡの重要な多様性を介してＬ．ケフィラノファシエンスＤＮＡの存在を検出することを実証した。
【００６５】
Ｌ．ケフィラノファシエンス特性ＰＣＲプライマー配列は、Ｒ２Ｃ２−１６ＳＦ（配列番号８）及びＲ２Ｃ２−１６ＳＲ（配列番号９）である。
【００６６】
ＰＣＲ増幅周期パラメーターは以下のとおりである：９４℃で１０分後、９４℃で３０秒間、６９℃で３０秒間、そして７２℃で１分間を３０回反復し、その後最後に７２℃で１０分間の１回の工程。２％アガロースゲルにおける電気泳動によりＰＣＲ生成物を分析する。
【００６７】
胃／腸液中の生存
低ｐＨ及び胃液におけるこれらのことなるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）株の生存及び成長を調査した。該実験のために、無菌胃液に供する前に異種株をＲＣＷ培地及び乳清中において３７℃で２４時間前培養した。酸性条件下における異種株の生存を以下のとおり試験した。
【００６８】
ａ）酸溶液中の乳酸菌の株の生存
新鮮な培養液由来の細胞を計測し、その後遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＭＲＳブロス又はｐＨ３．５、３．０、２．５及び２．０に調節した乳清中１０7ｃｆｕ／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を３７℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ及びプレート計数法を使用して、１５、３０、６０及び１２０分の間隔において生存を測定した。
【００６９】
ｂ）ヒト胃液中の乳酸器の株の生存
ＲＣＷ中の新鮮な培養液由来の細胞を計測し、その後遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてヒト胃液中１０8ｃｆｕ／ｍｌの濃度に再懸濁した。３０分、１時間又は２時間のヒト胃液中における３７℃のインキュベーション後、培養液をＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＲＣＷブロス中に再懸濁した。ＲＣＷにおいて３７℃での２４時間のインキュベーション後、分光法（６４０ｎｍ）により生存をモニターし、そして未処理培養液のＯ．Ｄ．値と比較した。胃液は以下のとおり調製した：３．２ｇ／Ｌのペプシン、２．０ｇ／ＬのＮａＣｌを、該実験の目的のためにｐＨ２．０において調製した。該細菌の生存は、胃液の３０分のインキュベーション後、極めて良好であった。表５に示されるとおり、全ての株が、未処理株と同じ培養液レベルに達するように見える。
【００７０】
【表５】
【００７１】
胆汁耐性
ＲＣＷ中の新鮮な培養液由来の細胞を計測し、その後遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして無菌ヒト腸液中１０8ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。３０分、１時間又は２時間の腸液中における３７℃のインキュベーション後、培養液をＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＲＣＷブロス中に再懸濁した。ＲＣＷにおいて３７℃での２４時間のインキュベーション後、分光法（６４０ｎｍ）により生存をモニターし、そして未処理培養液のＯ．Ｄ．値と比較した。腸液は以下のとおり調製した：１０ｇ／Ｌのパンクレアチン、６．８ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．１５％の胆汁塩を、該実験の目的のためにｐＨ８．０において調製した。該細菌の生存は、腸液の３０分のインキュベーション後、極めて良好であった。表６に示されるとおり、全ての株が、未処理株と同じ培養液レベルに達するように見える。
【００７２】
【表６】
【００７３】
ＣａＣｏ−２／ＨＴ−２９に対するインビトロ付着
腸上皮細胞に付着するための異種株の能力を評価した。ＣａＣｏ−２及びＨＴ−２９細胞の単層は、２４ウェルプレート中１４日間でコンフルエンスに成長すること、そして分化することを許容した。Ｓｙｔｏ９色素（ＢａｃＬｉｇｈｔキット）で事前に標識した１０８ｃｆｕ／ｍｌの異なる細菌株を、ＤＭＥＭ（抗菌を伴わない）中の各ウェル（３通り）に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。この後、該細胞をＰＢＳで４回洗浄し、全ウェル内容物を１０分間のトリプシン処理により回収し、そしてウェルあたりの細菌数をＦＡＣＳにより評価した。洗浄後に１５％の細菌がなおウェル中に存在したことから、株Ｒ２Ｃ２は、ＣａＣｏ−２上で良好な付着特性を示した。更に、細胞におけるＲ２Ｃ２の付着は、良好な付着特性について周知のプロバイオティクスであるＬ．ＧＧよりも明らかに高かった。
【００７４】
【表７】
【００７５】
共培養におけるインビトロ免疫調節能
ヒト腸上皮細胞（ＨＴ−２９）及びヒトＰＢＭＣの共培養系は、腸内レベルにおける細菌株の免疫調節効果を評価するためのインビトロモデルとして使用される。端的には、ヒトＨＴ−２９上皮細胞は、トランスウェル系の上部チャンバー中に播種され（１ｍｌあたり１０6細胞において）、そして分化が生じるまで培養される（毎日換えるＲＰＭＩ１６４０中で４週間）。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、新鮮なヒト血液から密度勾配遠心分離により分離し、そして１０6細胞を下部チャンバーに添加する。異種株の免疫調節効果は、１０6細菌の下部又は上部チャンバーのいずれかへの３とおりの添加、続く４８時間のインキュベーションにより評価する。対照は培地のみを含んだ。この後、細胞培養液上清を除去し、そして標準ＥＬＩＳＡキット(R&D systems, Minneapolis, MN USA)を使用して細胞外サイトカインレベルについて評価する。サイトカイン発現レベルの評価は、各グループのプールした３通りの試料から得られた全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定する。
【００７６】
ヒト腸細胞におけるＲ２Ｃ２で発酵させた乳清のインビトロ免疫調節能
ヒト腸上皮細胞（ＨＴ−２９）の培養系は、Ｒ２Ｃ２で発酵した乳清の免疫調節効果を評価するためのインビトロモデルとして使用される。ヒトＨＴ−２９上皮細胞（１ｍｌあたり１０6細胞）を分化が生じるまで培養する（毎日換えるＲＰＭＩ１６４０中で４週間）。異種株の免疫調節効果は、多様な濃度におけるＭＰＭ（順応性タンパク質マトリックス（malleable protein matrice))の添加、続く４８時間のインキュベーションにより評価した。対照は培地のみを含んだ。ヒト腸細胞におけるＭＰＭの抗炎症能の測定のために、炎症性サイトカインの産生を誘発するためのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を該培養培地中に添加した。これらの異なるプロトコル後、細胞培養液上清を除去し、そして標準ＥＬＩＳＡキット(R&D systems)を使用して、細胞外サイトカインレベルについて評価した。サイトカイン発現レベルの評価は、各グループのプールした３通りの試料から得られた全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＬＰＳに暴露した細胞及びＭＰＭの多様な濃度は、ＴＮＦα発現の明らかな減少を示した。結果を表８に示す。
【００７７】
【表８】
【００７８】
実施例３
ラクトバチルス株のインビボ特性及びプロバイオティクス能
インビボにおけるＬ．ケフィラノファシエンス付着
異種株のインビボ付着及び持続を調査した。該モデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（gavage）（経口（ｐ．ｏ．））により処理した。その後、結腸組織中のこれらの細菌の持続を評価するために結腸試料を経管栄養の完了後１日、３日及び１０日目の各処理グループの３匹のマウスから回収した。該試料を縦方向に開き、生理食塩水でリンスすることにより結腸内容物を回収し、そして粘膜層を擦って回収した。また、処理動物中の該株の存在を評価するために、経管栄養の最終日に糞便を回収した。異種細菌の存在は、糞便、結腸内容物、及び粘膜試料において、上述した開発した種特異性プライマーを使用してＰＣＲにより評価した。
【００７９】
マウス中の腸内ミクロフローラの調節
腸内ミクロフローラを調節するための異種株の能力を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（ｐ．ｏ．）により処理した。その後、大腸菌、乳酸菌（ＬＡＢ）のレベルを評価するために糞便試料を各グループから回収し、そしてまた及び糞便ｐＨを測定した。糞便は生理食塩水中で機械的に分裂させ、そして大腸菌の存在を、Perifilm Coliform Count platesTM (3M)で評価する。ＬＡＢのレベルは、Petrifilm Total Aerobic Count platesを使用して評価し、ＭＲＳブロスと共に嫌気的にインキュベートした。試験した４株全てが糞便試料中において３〜４倍の大腸菌レベルの低下を示した。表９に示されるとおり、最も重要かつ一定の効果を示す株は、Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰである。更に、株Ｒ２Ｃ２は、ＬＡＢ計数を僅かに増加させる能力を示したが、糞便ｐＨは低下している。これらの効果は、Ｒ２Ｃ２が、動物の腸管に付着できる可能性を示唆する。
【００８０】
【表９】
【００８１】
免疫調節能：白血球集団の調節
白血球集団を調節するための上記株の効果を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（ｐ．ｏ．）により処理した。処理期間の開始及び最後において、血液試料を回収し、そして白血球集団を評価するためにフローサイトメトリーにより分析した。該異種株は、白血球集団における可変の効果を示した。４種の株は、マウス免疫系を調節しているようであり、全リンパ球及び白血球数を上昇させている。しかしながら、表１０に示されるとおり、Ｒ２Ｃ２のみが多形核（ＰＭＮ）細胞の数を増加する能力を有し、そしてＢｉｏＳＰのみが単球を僅かに上昇させることができる。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
腸炎の予防／治療におけるＬ．ケフィラノファシエンス株
腸炎の症状を予防又は軽減するためのＬ．ケフィラノファシエンスの能力を、ＤＳＳ−誘発マウスモデルにおいて評価した。
【００８４】
ａ）腸炎の予防
ＤＳＳでの炎症の誘発前、その後該実験が完了するまで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（ｐ．ｏ．）により処理した。７日間の飲水中のＤＳＳ（２．５％）の添加により８日目に腸炎が誘発された。炎症のレベル及び進行は、体重減少、下痢、潜血、ヘマトクリット、及び結腸の長さ（死後）の測定を介して評価した。異なる処理グループは、以下の異なるパラメーターにおいて、異なる程度の効果を示した。株Ｒ２Ｃ２、ＢｉｏＳＰ及びＫ２は、炎症の発達に対して強い予防効果を示したが、株ＩＮＩＸはより優れた調節効果を有した。更に株Ｌ．ＧＧは、潜血及び下痢及びヘマトクリットの合わせたスコアを除き、該モデルにおいて有利な効果を示さなかった。結果を表１１〜１４に示す。
【００８５】
実験グループ：
グループ１：５匹のマウス、水＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ2：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ３：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｒ２Ｃ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ４：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＩＮＩＸ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ５：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＢｉｏＳＰ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ６：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｋ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ７：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｌ．ＧＧ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
【００８６】
【表１１】
【００８７】
【表１２】
【００８８】
表１３
ＤＳＳ消費の一定の日数後の組み合わせた潜血及び下痢スコア（８スケールにおいて評価した）。（より具体的には、該スコアは以下のとおり行った）：ヘモカルトＩＩ(Beckman Coulter, Mississauga, Ontario, Canada）、以下に定義されるスケール０〜４の直腸出血を評価するために糞便潜血についての慣習的スクリーニングの連続試験スライドを用いた：０−出血なし、４−糞便様出血。糞便の硬さはまた、以下に定義される０〜４のスケールにおいて評価した：０−正常な硬さ、４−液体状糞便。糞便の硬さ及び直腸出血値をあわせ、そして「臨床スコア」として定義した。スコアは盲検の評価者により与えられた。
【表１３】
【００８９】
【表１４】
【００９０】
ｂ）腸炎の治療
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う経管栄養（ｐ．ｏ．）により、実験期間中１日あたり１回処理した。８日間の飲水中のＤＳＳ（２．５％）の添加により０日目に腸炎が誘発され、その後異なる処理グループの炎症からの回復を評価するために８日間新鮮な水に置き換えた。炎症のレベル及び進行は、体重減少、下痢、潜血、ヘマトクリット、及び結腸の長さ（死後）の測定を介して評価した。全てのＬ．ケフィラノファシエンス株は陽性の効果を示したが、炎症後の回復期間における異種株についての強度は変化した。Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは、動物のＤＳＳ誘発損傷からの回復を助けることにおいて最も優れた能力を示した。事実、株ＢｉｏＳＰを受けたマウスは他の全グループの３日前に体重の回復が始まった。Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは、結腸の完全性（integrity)においてより優れた改善を示した。更に、株Ｌ．ＧＧは該モデルにおいて有利な効果は示さなかった。これらの結果を表１５及び１６に示す。
【００９１】
実験グループ：
グループ１：５匹のマウス、水＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ2：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ３：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ４：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＩＮＩＸ ｐ．ｏ．
グループ５：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ６：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｋ２ ｐ．ｏ．
グループ７：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｌ．ＧＧ ｐ．ｏ．
【００９２】
【表１５】
【００９３】
【表１６】
【００９４】
腸炎における低温殺菌又は照射細菌の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種Ｌ．ケフィラノファシエンス株を伴う経管栄養（ｐ．ｏ．）により、実験期間中１日あたり１回処理した。動物は、生存、低温殺菌又は照射細菌として、株Ｒ２Ｃ２又はＢｉｏＳＰを受けた。ＤＳＳ（２．５％）の飲水への８日間の添加により腸炎が誘発され、その後異なる処理グループの炎症からの回復過程の迅速性を評価するために８日間新鮮な水に置き換えた。炎症のレベル及び進行は、重量偏差、及び下痢と潜血の合計スコアの測定を介して評価した。また、結腸長さ及び結腸中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、該実験の最後に評価した。株Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは、陽性効果を示し、ＤＳＳへの暴露中に体重減少を低下させた、下痢と潜血の合計スコアを低下させた。炎症後の回復期間において、体重増加はより早期に開始した。結腸の完全性はまた、正常な長さ及びＭＰＯ活性により近いことにより示されるとおり、これらのグループについて良好であった。生存、低温殺菌又は照射細菌で処理したグループ間において、主要な違いは観察されなかった。５−ＡＳＡは、その周知の抗炎効果のために、実験における有効性を比較するために使用した。全ての試験パラメーターについて、５−ＡＳＡ、Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは比較可能な保護効果を示した。結果を表１７〜２０に示す。
【００９５】
実験グループ：
グループ１：５匹のマウス、通常の水＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ2：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ３：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生存Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ４：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋低温殺菌Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ５：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋照射Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ６：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生存ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ７：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋低温殺菌ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ８：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋照射ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ９：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋５−ＡＳＡ ｐ．ｏ．
【００９６】
【表１７】
【００９７】
【表１８】
【００９８】
【表１９】
【００９９】
【表２０】
【０１００】
アレルギーに対する保護
このアッセイの目的は、マウスモデル中のアレルギー応答を調節するための該株の能力を変更することである。０日及び１４日目におけるアルミ（Ａｌ（ＯＨ）3ゲル）中のＯＶＡ（卵白アルブミン）の腹腔内注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化し、そして全ＩｇＧ及びＯＶＡ特異抗体応答を検出するために、血清を２１、３５及び４２日目に採取した。該免疫化スケジュールは、対照マウス中のＯＶＡに対する強力なアレルギー反応を誘発するのに十分である。ラクトバチルス株の（Ｌ．カゼイ（L. casei）と比較した）抗アレルギー効果は、該免疫化プロトコルの期間、異種株で経口処理したマウスグループにおいて評価した。アレルギー反応の発達は、ＥＬＩＳＡにより血清中の全ＩｇＧ産生及びＯＶＡ特異抗体の検出を介して評価した。また、サイトカイン及び抗体産生を介するアレルギー反応を評価するために、異なる処理グループ由来の培養した脾臓細胞をインビトロにおいてＯＶＡに暴露した。
【０１０１】
高脂血症の治療
高脂血症における該株の効果を評価するために選択した動物モデルは、共通したいくつかの表現型パラメーターを有し（例えば、高脂血症、肥満及び糖尿病）、そしてこれらにおける該株の有利な効果を独立に確認するために使用した。
【０１０２】
異種細菌株は、高脂血症のラットモデル中の血中脂質レベルを調節するためのこれらの能力について試験した。このプロトコルは、ラット中の人工的に誘発された高脂血症の制御において、ナイアシン（ｖｉｔＢ３）、強力な脂質低下剤、に対する異種株の比較評価を記載する。ポロキサマー４０７で腹腔内注射されたウィスターラットは、急速に、重篤であるが一過性の高脂血症を発症する。グルコースの血清レベルもまた該処理により上昇する。Ｌ．ケフィラノファシエンス株の脂質低下効果は、ポロキサマーの注射前７日間、経口的に前処理したラットのグループにおいて評価する。血中脂質は、注射前、並びに高脂血症の誘発後２４及び７２時間目に測定した。トリグリセリド及びコレステロール（ＬＤＬ）の血漿レベルを評価した。７日の前処理後、血漿トリグリセリドは、ナイアシン処理グループで減少したが、Ｒ２Ｃ２処理グループにおいては明白な減少は僅かであった。また、血漿トリグリセリドの減少は、高脂血症の誘発後７２時間における全ての処理グループにおいて観察された。最も重要な減少は、ナイアシンを受けたグループ中で観察された（表２１）。
【０１０３】
グループ１：４匹のラット、経管栄養 生理食塩水
グループ２：４匹のラット、経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：４匹のラット、経管栄養 Ｒ２Ｃ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
グループ４：４匹のラット、経管栄養 ＩＮＩＸ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
グループ５：４匹のラット、経管栄養 ＢｉｏＳＰ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
グループ６：４匹のラット、経管栄養 Ｋ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
【０１０４】
【表２１】
【０１０５】
結腸癌に対する保護
該アッセイの目的は遺伝子モデルＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎにおいて腫瘍形成に対してマウスを保護するための該株の能力を検証することである。該モデルにおいて、脂肪リッチな食餌に暴露した場合、１００％のＡｐｃＭｉｎヘテロ接合型マウスが少なくとも３０の自然発生的な腸管腺腫を発症した。腫瘍形成期間中に異種株で１週間に３回経口的に処理したＡｐｃＭｉｎヘテロ接合型マウスにおいて該株の抗腫瘍化効果を評価した。
【０１０６】
実施例４
乳清中に発見されたタンパク質の消化
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２を、発酵中のタンパク質基質を加水分解するためのその能力について評価した。乳清は、該細菌が乳清中に発見される通常のタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、α−ラクトアルブミン（α−ＬＡＣ）、β−ラクトグロブリン（βＬＧ）を時間にわたって消化するための能力を有することを示すための基質として使用した。該分析は、勾配溶離によるＨＰＬＣ（カラムＲＰ Ｃ−４ ３００Ａ(Phenomenex, Torrance, CA, USA)によって行った（表２２）。
【０１０７】
【表２２】
【０１０８】
実施例５
アトピー性接触皮膚炎におけるＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品の抗炎症能
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の抗炎症効果を測定するためにマウスにおけるオキサゾロンで誘発したアトピー性接触皮膚炎のマウスモデルを使用した。該炎症モデルは、例えば、皮膚障害、例えば、乾癬において使用されるいくつかの抗炎症性及び免疫抑制薬の有効性及び能力を測定するために感受性かつ有用であることが証明されている。グルココルチコイドのような薬物は、皮膚及び関節炎症を軽減するために一般的に使用される。予防的（表２４）又は治療的（表２３）方法のいずれかにおいて経口的に投与されたＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、両方の場合において耳の厚さの約３０％の減少を伴い示されるとおり、炎症を低下した。より具体的には、アトピー性接触皮膚炎におけるマウスモデルは、Garrigue et al. (Contact Dermatitis., 30(4):231-273, 1994)による最初の記載に基づき、そして以下のとおり改変した：ＣＤ−１マウス腹部の毛を除去し、そして感作段階は、アセトン中の１００μｌのオキサゾロン５％の該腹部における適用により行った(Sigma-Aldrich, Oakville, On)。４日後、誘発段階（一次誘発）は、アセトン中の５０μｌのオキサゾロン５％の右耳における適用により行った（耳の各サイドに２５μｌずつ）。二次誘発は、一次誘発後７日目に同様の手順で行った。マウスの耳の厚さを毎日測定した。
【０１０９】
予防プロトコル（ＭＰＭ）−マウスアトピー性接触皮膚炎
感作７日前に、ＭＰＭの投与により、ＭＰＭ（特許ＰＣＴ／ＣＡ２００２／０１９８８）の予防的抗炎症能を最初に評価した。１０匹のＣＤ−１マウスの３グループは、経管栄養により毎日１００μｌの再構成凍結乾燥ＭＰＭ、水、及び１ｍｇの水溶性ヒドロコルチゾン（１０ｍｇ／ｍＬ）を受けた。前述のとおり皮膚炎が誘発され、そして耳の厚さを毎日測定した。ＭＰＭの治療的抗炎症能は、一次誘発後のＭＰＭのみの投与により評価した。１０匹のＣＤ−１マウスの３グループは、経管栄養により毎日１００μｌの再構成凍結乾燥ＭＰＭ、水、及び１ｍｇの水溶性ヒドロコルチゾン（１０ｍｇ／ｍＬ）を受けた。前述のとおりマウスアトピー性接触皮膚炎を行い、そして耳の厚さを毎日測定した。マウスの体重を週に２回測定した。
【０１１０】
治療プロトコル（Ｒ２Ｃ２）−アトピー性接触皮膚炎のマウスモデル
Ｒ２Ｃ２の治療的抗炎症能を、一次誘発後の細菌検索液の摂食によりアトピー性接触皮膚炎の動物モデルにおいて評価した。Ｒ２Ｃ２の保護効果を、皮膚炎におけるその周知の抗炎症性効果のためにヒドロコルチゾンと比較した。Ｒ２Ｃ２は、炎症の良好な低下を示し、減少した耳の厚さにより実証された。有効性はヒドロコルチゾンと比較可能であった。結果を表２３〜２５に示す。
【０１１１】
【表２３】
【０１１２】
【表２４】
【０１１３】
【表２５】
【０１１４】
実施例６
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品の抗トリグリセリド血症能
該実験のために、７週齢の体重１２５〜１５０ｇのメスのウィスターラットをCharles River Canadaから購入した。該ラットを、それぞれ少なくとも６匹の動物からなる４つの異なるグループに無作為化した。ラットは、１ｍＬ用量のＭＰＭ、１０9細菌／ｍＬのラクトバチルスＲ２Ｃ２（該ラクトバチルス株は乳清を発酵するために使用した）を含有する１ｍＬの生理食塩水懸濁液、１ｍＬのＰＢＳ(Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada)、及び対照として１００ｍｇ／ｋｇのナイアシン(Sigma)を受けた。これらは、特定病原体未感染条件下で飼育され、そして２４時間の明／暗周期に維持した。全ての動物は標準食餌を消費し、水を自由に受けた。ＭＰＭは凍結乾燥形態とし、そして８０％の水を添加することにより毎日調製し、そしてヨーグルト様生成物に戻すために混ぜた。該細菌株ラクトバチルスＲ２Ｃ２は、ＭＲＳブロス(BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada)中、３７℃で２４時間慣習的に培養した。その後細菌を４０００ｒｐｍにおいて、８分間遠心分離によりペレット化し、そして無菌ＰＢＳ(Invitrogen)中１０9細胞／ｍＬの濃度において再懸濁した。ラットについて１ｋｇあたり１００ｍｇの用量の処理を受けるように、ナイアシンを水に溶解した。ナイアシンは完全には溶解しなかったため、２０分間ソニケーションをする必要があった。動物は、ポリキサマー４０７プルロニック（登録商標）Ｆ−１２７注射(BASF corporation, Mississauga, ON, Canada)の前に７日間の処理を受けた。腹腔内注射用のポリキサマー４０７溶液は、該薬剤と無菌水を混合し、そしてコールド法の取り込みによりポリマーの溶解を促進させるために一晩冷蔵することにより調製した。
【０１１５】
高脂血症の誘発
異なる生成物での７日の処理後、全ての動物を、３００ｍｇの用量のポリキサマー４０７の腹腔内注射により高脂血症とさせた。約２３％ｗ／ｗ以上の濃度におけるポリキサマー４０７溶液は逆熱ゼラチン化特性を有するため、注射を促進させるためにポリマーが流動的な粘性状態を維持するようにポリキサマー４０７投与の前に全てのシリンジを氷上においた。
【０１１６】
血液の採取
約１ｍＬの血液を３ｍＬシリンジで頚静脈から採取し、そしてリチウム−ヘパリン処理プラスチックチューブ(Sarstedt, Montreal, QC, Canada)中に直ぐに移した。チューブを１０秒間軽く振り、その後血漿の分離を許容するために遠心分離した。血漿試料を清潔な１．５ｍＬエッペンドルフ中に採取し、そして分析時まで−８０℃で直ぐに凍結させた。血液採取のために、イソフルラン(AErrane, Baxter Corporation, Deerfield, IL, USA)を使用して各動物を麻酔した。血液採取は、異なる生成物での７日の処理後、ポリキサマー４０７注射前（ｔ＝０、処理後脂質レベルの比較）、注射２４時間後（ｔ＝２４時間、誘発脂質レベル）及び注射７２時間後（ｔ＝７２時間、正常レベルへの回復の比較）に行った。最後の血液採取後、動物をＣＯ2窒息法により犠牲にした。ポリキサマー４０７投与のための異なる処理の食餌についての全ての手順及びその後の血液採取は、実験動物の扱い及び使用のための施設ガイドに従い、そして倫理委員会により承認されている。
【０１１７】
脂質分析
全ての実験グループからの試料を、全コレステロール及びトリグリセリドについて分析した。全ての分析は、ISO 9002を取得し、完全性のある血漿脂質定量化サービスを提供する、独立した研究室(Laboratoire medical Biron, 4105-F Matte Blvd, Brassard, Quebec, Canada, J4Y 2P4)で行った。
【０１１８】
表１５に示されるとおり、７日処理後のＲ２Ｃ２は、基礎トリグリセリドレベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）を制御するための僅かな能力を示した。最も優れた効果は、該細菌で発酵させた乳清で得られた。７日の処理後、細菌Ｒ２Ｃ２は、基礎トリグリセリドレベルを３０％近くまで低下し、そしてＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、ナイアシンと同様に、基礎トリグリセリドレベルを４０％近くまで低下した。また、Ｒ２Ｃ２処理グループにおいてトリグリセリドレベルは、高脂血症の誘発後７２時間で低下したが、ナイアシン又はＭＰＭ処理グループにおいては特に調節された。
【０１１９】
【表２６】
【０１２０】
【表２７】
【０１２１】
実施例７
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品の抗高血圧能
Ｒ２Ｃ２で発酵させた乳清の（ＭＰＭ）抗高血圧能を、ＳＨＲメスラット（６週齢）を使用して評価した。１２匹のラットを各処理グループにおけるこれらの体重に従い無作為化した。これらは、特定病原体未感染条件下で飼育され、そして１２時間−明／暗周期に維持した。全ての動物は標準食餌を消費し、水を自由に受けた。グループは、１ｍＬの水（プラセボグループ）、ＭＰＭ（５ｍＬ／ｋｇ）又はその周知の高血圧効果によりマレイン酸エナラプリル（１０ｍＬ／ｋｇ）のいずれかを強制的に食餌させた。収縮期血圧（ＳＢＰ）を、自動化ＲＴＢＰ２０００テール血圧システム(Kent Scientific, Torrington, CT, USA)によるテール−カフ法により毎週測定した。データ収集は毎週行い、そして３通りの測定値の平均を初期平均ＳＢＰとして採用した。データを獲得し、そしてBiopac Student Lab Pro（登録商標）ソフトウェア バージョン 3.6.1 (Biopac System, Goleta, CA, USA)で解析した。処理の２週間後、エナラプリル処理グループは１８４ｍｍＨｇ〜１５６ｍｍＨｇの正常化ＳＢＰを有した。ＳＢＰの着実な減少は、ＭＰＭで強制的に食餌した動物について、４週間目に少なくとも２５％の最大変化を伴い、毎週観察された。結果を表２８に示す。
【０１２２】
【表２８】
【０１２３】
実施例８
高脂血症、肥満及び糖尿病の治療
高脂血症、肥満及び糖尿病における該株の効果を評価するために選択された動物モデルは、共通するいくつかの表現型パラメーターを有し（例えば、高脂血症、肥満及び糖尿病）、そしてＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の有利な効果を独立に確認するために使用された。
【０１２４】
ａ）高脂血症のモデル
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、高脂血症のラットモデル中の血中脂質レベルを制御するためのこれらの能力を評価するために試験した。該プロトコルは、ラット中に人工的に誘発させた高脂血症の制御における、ナイアシン（ｖｉｔＢ３）、強力な脂質低下剤、に対する比較評価を記載する。ポロキサマー４０７で腹腔内注射されたウィスターラットは急速に、重篤であるが一過性の高脂血症を発症する。グルコースの血清レベルもまた該処理により上昇する。Ｌ．ケフィラノファシエンス株の脂質低下効果を、ポロキサマーの注射前７日間、経口的に前処理したラットのグループにおいて評価する。血中脂質を、注射前、並びに高脂血症の誘発後２４及び７２時間目に測定した。トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びグルコースの血漿レベルを評価した。７日も前処理後、血漿トリグリセリドは、ナイアシン処理グループにおいて低下した。血漿トリグリセリドの減少はまた、高脂血症の誘発後７２時間においてＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清中で観察された。
【０１２５】
グループ１：４匹のラット、経管栄養 生理食塩水
グループ２：４匹のラット、経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：４匹のラット、経管栄養 Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清（経管栄養あたり１ｍｌ）
【０１２６】
【表２９】
【０１２７】
ｂ）高トリグリセリド血症及び肥満のモデル
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、高脂血症の食餌誘発ラットモデルにおいて、体重増加及び血中脂質レベルを制御するためのその能力について試験した。このプロトコルは、ラット中の食餌誘発高脂血症の制御にいて、ナイアシン（ｖｉｔＢ３）に対する比較を許容する。飲水中のフルクトース（１０％の濃度）において暴露したウィスターラットは、漸進的な体重増加を示し、そして４週間にわたり高脂血症を発症する。フルクトース処理期間中のＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の高脂質低下効果を測定した。フルクトース処理の開始前、及び高脂血症の誘発中の４週間に１回、血液試料を採取した。トリグリセリドの血漿レベルを測定した。
【０１２８】
グループ１：経管栄養 生理食塩水
グループ２：経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：経管栄養 Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清（１日に２回の経管栄養あたり１ｍｌ）
グループ４：１％エポキシサッカライドの経管栄養
【０１２９】
【表３０】
【０１３０】
【表３１】
【０１３１】
ｃ）体重及び脂肪管理のモデル
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、自然発生高血圧性ラットモデル及び卵巣摘出ラットにおいて、脂肪分布並びに体重増加を制御するためのその能力について試験した。ＳＨＲモデルは、前述のとおり使用したが、腹部に蓄積している内臓脂肪のレベルをモニターするために使用した。動物は、５６日間１日に１回、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２（２０％固体）で発酵させた１ｍｌの乳清を与えられた（Ｐ．Ｏ．ｑ１×５６）。
【０１３２】
グループ１：１２匹のラット、経管栄養 生理食塩水
グループ２：１２匹のラット、経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：１２匹のラット、経管栄養 Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清（経管栄養あたり１ｍｌ）。
【０１３３】
【表３２】
【０１３４】
表３３
卵巣切除ラット
４５匹の１２週齢のメスのウィスターラットを使用し、そして２つの偽手術グループと２つの卵巣摘出（ＯＶＸ）グループ、すなわち、生理食塩水を伴うＯＶＸ（ＯＶＸグループ）、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を伴うＯＶＸ（経管栄養あたり１ｍｌ）に無作為に割り当てた。毎日の経口投与は１２週間のＯＶＸ後４日目に開始した。違いは、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を与えた動物における、約８％の体重増加である。
【表３３】
【０１３５】
実施例９
ヒト皮膚におけるＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の効果
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の局所的活性を、皮膚完全性の感受性かつ有意なバイオマーカー手段、例えば、ともに一定の上皮ホメオスタシス（８）のガーディアンである、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びシクロオキシゲナーゼ２（Ｃｏｘ−２）によりモニターした。Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、非ステロイド性抗炎症薬（イブプロフェン)、Ｃｏｘ−２の非選択性阻害薬、に対して、並びに一般的な商標名を伴う高価な市販製品、Regenerist Olay（登録商標）に対して比較した。該目的は、Ｃｏｘ発現におけるＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の効果、及びＰＥＧ２の基礎レベル及び日光及び環境紫外線（ＵＶＢ）誘発侵襲後の誘発レベルの効果をモニターすることである。これらの実験において、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、ヒト皮膚において予防的又は治療的に使用した。試験した全ての実験条件において、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、両バイオマーカーの完全性における有意な阻害効果を示した。Ｃｏｘ−２の発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより示されるとおり、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の暴露後に誘発された。該観察後、我々は、Ｃｏｘ−２の阻害を説明すべく、この活性を区別かつ説明でき、そして潜在的な悪影響を除外できる遺伝子を検索した。我々は、Ｃｏｘ−２の低下する発現に加え、１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ（１５−ＰＧＤＨ）、Ｃｏｘ−２を生理的かつ自然にアンタゴナイズするプロスタグランジン分解酵素の発現が増強されたことを発見した。この観察を更に推し進めるために、我々は、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清に暴露したヒトケラチノサイト及びヒト皮膚中のＰＧＥ２の生合成におけるＣｏｘ−２減少の結果を測定した。我々は、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清が、外部侵襲なしの２４時間暴露後に、ＰＧＥ２の基礎レベルを約７５％低下していることを発見した。ＵＶＢを環境侵襲として使用した場合、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、ＰＧＥ２の阻害を予防し、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の保護的役割を示唆した。最後に、ＵＶＢ暴露前又は後のいずれかに使用した場合のＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、同様の保護活性を示し、そしてさらにＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清をＵＶＢ暴露後に適用した場合に示されるとおり、治療的な効果をも示した。また、Regenerist Olay（登録商標）は希釈せずに使用したＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清よりも低い有効性であったことに注目することが重要である。Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、該実験設定において非希釈条件において試験できなかったが、我々は非希釈において使用した場合には、その局所的活性は極めて増加したものと考える。まとめとして、これらのデータは、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清がヒト皮膚における興味深い生物機能性を示すことを示唆する。
【０１３６】
実施例１０
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の効果
３人のボランティアは、彼ら自身の承諾に基づき、多様な期間Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品を摂取することを決意した。２人は高いコレステロールを有し、そして１人は腕における時々の痺れにつながる糖尿病及び高血圧を有した。高コレステロールを伴う最初の２人のボランティアは、１日あたり２５グラム相当を１０日間摂取し、そして妊娠糖尿病及び高血圧を伴うボランティアは３週間該製品（１００ｍｌ湿性）を摂取した。結果は以下のとおりである。最初の２人については全コレステロールの１２％及び１５％の低下が、そして痺れの全体的な軽減及び妊娠糖尿病の予防が存在した。これらの結果は、より正確且つ厳格な臨床形式においていくつかの陽性の有利な効果を試験すべきことを示唆する。
【０１３７】
【表３４】
【０１３８】
本発明のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）はまた、多様な効果を有する有用な製品に導き、ミルク製品、乳清及びチーズ乳清等の基質を発酵するために使用することができる。チーズ乳清の発酵プロセスは、ワイン醸造において、タンパク質中に豊富な反芻動物飼料サプリメントの産生のために使用される。発酵チーズ乳清はまた、抗酸化、抗高血圧、抗腫瘍、脂質低下、抗ウイルス、抗細菌及びキレート剤として作用する能力を有する。
【０１３９】
本発明は特定の態様との関連により記載されるが、これはさらなる改変が可能であり、そして本願は、一般に本発明の原理に従い、そして本発明の属する当業界に既知であり又は慣習的に実施されるような、そして前述の本質的特徴に適用できるような、そして付随の特許請求の範囲の範囲に従うような、このような開示からの脱却を含む、本発明のいずれかの変動、使用、又は適応を網羅することを意図することが理解される。
【技術分野】
【０００１】
（ａ）本発明の分野
本発明は、腸内健康、免疫の調節、肥満関連問題、例えば、血中脂質レベル、高血圧、及び体重の制御、並びに腫瘍に対する保護における効果を有するプロバイオティクスとしてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ）先行技術の説明
プロバイオティクス微生物の伝統的定義は、細菌（及びその成分）が無毒で、胃／腸内環境において生存でき、胃−腸管中で付着／持続し、正常なヒトミクロフローラとして存在し、そして健康的な利益を及ぼすことを必要とする。しかしながら、近年の証拠は、いくつかのプロバイオティクス効果が非ヒト起源の乳酸菌から得ることができ、そしてプロバイオティクス効果は加熱又は照射失活されたラクトバチルスにより、そしていくつかの場合には溶菌液から得ることができることが示された（米国特許第４，３４７，２４０号）。プロバイオティクス乳酸菌から観察される健康利益は、しばしば株特異的であり、そして極めて可変的である。プロバイオティクス乳酸菌について記載されるいくつかの効果は：腸内ミクロフローラの調節、病原性微生物との競合及び除去、免疫機能の調節、アレルギーの制御、胃腸健康の促進、血中脂質レベルの調節、糖尿病の制御（血中のグルコース及びインスリンの調節）、結腸癌に対する保護、体重の制御を含む。
【０００３】
ケフィアは何世紀もの間、ミルクを発酵するために使用されてきた。ケフィア粒は、グラム陽性の異種−及び同種発酵性乳酸細菌からできている。グラム陰性乳酸菌、並びにラクトース発酵及び非発酵酵母菌は、ケフィラン、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）細菌により分泌されるエキソポリサッカライドファミリーのバイオポリマーにより一緒に保持される。Ｌ．ケフィラノファシエンス（L.kefiranofaciens）種の乳酸菌は異種発酵乳酸菌であり、そしてケフィア粒の主要な細菌集団を表す。２つの独立種として本来分類されるが、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィアグラナム（Lactobacillus kefirgranum）は、近年これらの同じ１６Ｓ ＲＮＡ配列に基づき、Ｌ．ケフィラノファシエンス（L.kefiranofaciens）の亜種として再分類された(Vancanneyt et al., lnt J Syst Evol Microbiol. 54(Pt 2):551-556, 2004)。該２つの亜種への分類は、寒天プレート上及び液体培地中における、異なる糖類からの酸生成、及びＰＡＧＥからのタンパク質プロファイリングにおける形態学に基づき行われた。該亜種ケフィラノファシエンス（kefiranofaciens）由来の株は、通常ケフィランの高い産生株であり、これはケフィア粒の組成及び形成に必須である。ケフィラノファシエンス（kefiranofaciens）株からのケフィラン産生は、寒天プレート上のコロニー形態（光沢又は粘液性の外観を示す）から認識されるが、亜種ケフィグラナム(kefirgranum）由来の株は、有意なレベルのケフィランを産生しない。しかしながらラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）は、継代培養に対して極めて感受性であることが示された。ケフィグラナム(kefirgranum）株はトレアロースから酸を産生することができるが、ケフィラノファシエンス（kefiranofaciens）株は産生することができない。さらに、ケフィグラナム(kefirgranum）亜種由来の株は、液体培養液中で綿状かつ堆積性である。
【０００４】
無毒性が何年にもわたってケフィアに随伴するという事実は、それから分離されるラクトバチルス株の安全性及び無毒性に対する強力な論拠である。Ｌ．アシドフィルス（acidophilus)グループにおけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種は、Ｌ．クリスパツス（crispatus）及びＬ．アシドフィルス（acidophilus)種に近く、これは良く記載されるプロバイオティクス株を含む。
【０００５】
Santos et al. (System. Appl. Microbiol., 26:434-437, 2003)は、酸及び胆汁に対する耐性、異なる付着及び抗微生物特性を示すラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の４つの株を記載する。
【０００６】
米国特許第４，３４７，２４０号は、ケフィア粒由来の未決定の株分類（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens））のラクトバチルスＫＰＢ−１７６の新規株の分離を記載し、これは大量のケフィランを産生し、特定の培地について厳格な選択性を有さず、そして継代培養においてポリサッカライドの生産性における減少に関係しない。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の概要
本発明に従い、適当な担体と共に、有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を含んで成る、プロバイオティクス組成物が供される。該ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、例えば、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択することができる。
【０００８】
本発明の１つの態様において、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、Ｒ２Ｃ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−３）、ＩＮＩＸ（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−４）、Ｋ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−１）；ＥＳ１（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−２）及びTechnologie Biolactis inc.由来のＢｉｏＳＰ株から成る群から選択される株である。
【０００９】
プロバイオティクス効果は、例えば、腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されることができる。該組成物は、経口、直腸又は膣投与に適当に処方することができる。
【００１０】
更に本発明に従い、対象中の腸内ミクロフローラの陽性調節を提供するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１１】
また本発明に従い、腸炎に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。このような腸炎は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じ得る。
【００１２】
更に本発明に従い、アレルギー及び／又は自己免疫疾患に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００１３】
また本発明に従い、下痢に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１４】
本発明に従い、糖尿病に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が更に供される。
【００１５】
また本発明に従い、高脂血症に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１６】
更に本発明に従い、直腸癌に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００１７】
また本発明に従い、対象における腸炎を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。このような腸炎は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じ得る。
【００１８】
更に本発明に従い、対象におけるアレルギー及び／又は自己免疫疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００１９】
また本発明に従い、対象における下痢を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法もまた供される。
【００２０】
本発明に従い、対象における糖尿病を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が更に供される。
【００２１】
また本発明に従い、対象における高脂血症を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００２２】
さらに本発明に従い、対象における直腸癌を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のこのようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法が供される。
【００２３】
本発明は更に、プロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。該プロバイオティクス化合物は、例えば、腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されるプロバイオティクス効果を有することができる。該使用は経口投与に適当である。
【００２４】
ある態様において、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、発酵乳製品及び非生細菌試料、例えば、熱殺細菌、照射細菌、及び溶解細菌として、生細菌集団、凍結乾燥細菌集団から成る群から選択される形態において投与される。
【００２５】
本発明のある態様は更に、抗炎症性効果を有するプロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００２６】
ある態様は、乾癬の治療のためのプロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００２７】
本発明に従い、抗炎症性化合物と併用した、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用であって、ここで炎症性化合物が５−ＡＳＡ又は副腎皮質ステロイドである方法もまた供される。
【００２８】
本発明は更に、乾癬の治療のための医薬の製造のためのプロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００２９】
ある態様において、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）は、乳清を発酵するために使用され、ここで該乳清はチーズ乳清である。
【００３０】
本発明に従い、循環器疾患の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３１】
本発明に従い、高血圧の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３２】
本発明はさらに、体重障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３３】
本発明に従い、高脂血症の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３４】
本発明は更に、トリグリセリド障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３５】
本発明に従い、循環器疾患の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３６】
本発明に従い、高血圧の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００３７】
本発明はさらに、体重障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３８】
本発明はさらに、高脂血症の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用を供する。
【００３９】
本発明に従い、トリグリセリド障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵により得られた製品の使用もまた供される。
【００４０】
本発明は更に、プロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。該プロバイオティクス化合物は、高血圧、低ＨＤＬ、腹部の脂肪、インスリン耐性、及び高レベルのトリグリセリドの５つの問題に関係するメタボリックシンドロームの治療のために使用することができる。従って、本発明のプロバイオティクス化合物は、メタボリックシンドロームに関係する問題を治療及び／又は予防するために使用することができる。
【００４１】
本発明は更に、体重管理を制御するために、プロバイオティクス化合物として、このようなラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用を供する。
【００４２】
本発明の詳細な説明
本発明に従い、食料及び医薬中の多様な適用を伴うプロバイオティクス乳酸菌が供される。より具体的には、本発明は、以下に記載されるとおり、４株により定義される、プロバイオティクス種、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）を含む）に関係し、これは動物モデルにおける経口治療に従い有意なプロバイオティクス能を示した。これらのプロバイオティクス効果中、腸内付着、腸内ミクロフローラの陽性調節、免疫調節、アレルギー、下痢、体重管理、高血圧及び高脂血症が観察された。この種から分離された異種株は、一般的及び株特異的な有利な健康効果の両方を示した。これらは、発酵乳製品（ミルク、乳清ベース）として、生きている又は凍結乾燥させた細菌集団として、あるいは生きていない細菌試料（熱滅菌、照射又は溶解化細菌）として、経口的に投与することができる。
【００４３】
本発明は、本発明の範囲を制限せずに例証するために与えられる以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるものと考える。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ケフィア粒由来のラクトバチルスのプ５つのプロバイオティクス株の同定
本願中に記載される３つの株、Ｒ２Ｃ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−３）、Ｋ２（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−１）及びＥＳ１（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−２）は、乳清中における成長に以前に適合したケフィア粒から分離した。
【００４５】
１つの株、ＩＮＩＸ（ＩＤＡＣ受入番号０４１２０２−４）は、ＡＴＣＣケフィラノファシエンス対照株（ＡＴＣＣ受入番号４３７６１）の寒天プレート上におけるケフィラン過剰産生コロニーから分離した。
【００４６】
ＢｉｏＳＰは、Technologie Biolactis inc.由来の液体培養中で強力な綿状性であるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）株である。
【００４７】
１６Ｓ ＲＢＡ遺伝子配列に基づき、本願中に記載した株は、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種に指定した。液体培地及び寒天プレート上の形態、並びに糖発酵特性はまた、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種のいずれかの株のより具体的な指定を許容した。ケフィラノファシエンス（Ｒ２Ｃ２、ＥＳ１及びＩＮＩＸ）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Ｋ２及びＢｉｏＳＰ）。
【００４８】
実施例２
ラクトバチルス株のインビトロ評価
Ｒ２Ｃ２：一般に短い桿菌であり、グラム陽性、単一又は２〜４の連鎖、いくらかのエキソポリサッカライドを非産生又は産生する。該桿菌の長さ及び幅は、使用される培養培地及び保存培地に従い極めて変化する。ＲＣＷプレートにおいて、これは乾燥かつ滑らかな結晶様コロニーを形成し、中央がベージュの白色であり、凸面であり、エンボス上部を伴う。該株は、欠乏培地（例えば、補助なしの乳清）中で良好に成長し、そして液体培地中で小サイズの凝集体を産生する（約１０の細菌又はそれ以下）。
【００４９】
ＩＮＩＸ：伸長した、一般にＲ２Ｃ２よりも長い桿菌、グラム陽性、単一又は２〜４の連鎖桿菌。ＲＣＷプレートにおいて、これは粘液性又は粘性様のコロニーを形成し、これは隣接するコロニーと融合する。液体ＲＣＷ培地中のケフィラン産生率は高く、そして継代培養において安定である。該株は欠乏培地中で弱い成長性を有する；典型的な、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）であり、そして液体培地中で小サイズの凝集体を産生する（約１０〜５０の細菌）。
【００５０】
ＥＳ１：Ｒ２Ｃ２株と類似するが、欠乏培地中で悪い成長性を表す。
【００５１】
Ｋ２：Ｒ２Ｃ２よりも僅かに幅広な平均的長さの桿菌、単一又は２〜４の連鎖桿菌。エキソポリサッカライドを産生しない又は殆ど産生しない。欠乏培地中で成長するが、試験した全ての培養培地について、他の株よりも低レベルにおいて安定段階に達した（ＲＣＷ：Ｒ２Ｃ２及びＥＳ１について１．５〜３×１０9と比較して５〜７×１０8の細菌）。液体培養中の平均サイズの凝集体を示す（約５０〜１００の細菌）。
【００５２】
ＢｉｏＳＰ：平均的長さの桿菌、不規則な細胞表面を伴う、他の全ての株よりも幅広であり、単一又は２〜４の連鎖桿菌。エキソポリサッカライドを産生しない又は殆ど産生しない。グラム陽性、液体培地中の乳酸菌の大きなサイズの凝集体の形成はまた沈殿したタンパク質を含む（１００以上の細菌）。ＲＣＷプレートにおいて、これは白色コロニー、凸面を形成し、より均一な上層を伴うが、該表面上に明らかな白色のポイントを示す。欠乏培地中で成長するが、強カルシウム濃度（１％ＣａＣｌ２ｐ／ｖ）の存在において極めて低下する。
【００５３】
発酵プロフィール
表１は、上述の株の発酵プロフィールについてのデータを供する。
【００５４】
【表１】
【００５５】
代謝産物発酵プロフィール
表２〜４は、代謝産物発酵についてのデータを供する（１が弱、５が強として定義した１〜５のスケール、＋＝５及び−は反応しないことを示す）。
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種に対する株分類：
１６Ｓ ＲＮＡ配列の比較は、ラクトバチルス株の分類のために広く受け入れられる手段である。５つの異なるラクトバチルス株の１６Ｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅し（フォワードプライマー配列番号１、リバースプライマー配列番号２を使用）、そして配列決定した。異種株は、ＮＣＢＩにおいて入手可能な８０のラクトバチルス１６Ｓ配列、及び対照株ＡＴＣＣ４３７６１を伴い得られた配列の得られた配列のアライメントを介して、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）種に全て系統学的に分類した。
【００６０】
株Ｒ２Ｃ２（配列番号３）、ＩＮＩＸ（配列番号４）、ＢｉｏＳＰ（配列番号５）、Ｋ２（配列番号６）及びＥＳ１（配列番号７）の１６Ｓ ＲＮＡ配列の対応する相補配列を配列表に挙げる。
【００６１】
細菌計数手順
細菌数及び生存率を評価するためのＦＡＣＳ法を以下のとおり使用した。血球計算器を使用する細菌計数を行う前に、全ての凝集体を解離しなければならない。本明細書に供される乳酸菌株Ｒ２Ｃ２及びＩＮＩＸは、小さくて不安定な凝集体を形成する傾向を有する。解離は、ＰＢＳピロリン酸（１５ｍＬ）に該株を再懸濁することにより容易に達成することができる。株ＢｉｏＳＰ及びＫ２（特にＢｉｏＳＰ）は、ＰＢＳピロリン酸のみを使用して解離することができない大きなサイズの凝集体を形成する。再懸濁後、これら２つの株を５５℃で３０分間加熱する必要がある。その後、該株を室温で１５分間、各細菌が血球計算機により検出可能となるようにＤＮＡに結合する臭化エチジウムに暴露させる。その後、より正確な計数とするために連続希釈（１／１０、１／１００、１／１０００）を行った。
【００６２】
また、他の方法、例えば、プレート計数法及び最確数法（計数を許容する異なる希釈での一連の接種）を使用することができる。
【００６３】
ＭＲＳ、ＲＣＷ及び乳清中の成長特性
異種株の前培養を、ＲＣＷ培地において３７℃で１２〜２４時間行った。新鮮な指数関数的に増殖する培地由来の細胞を計測し、そして１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度において異なる培地中に接種した。培養液を３７℃でインキュベートし、そしてＦＡＣＳ計数法を使用して、２、４、６、８、１２、２４、３２及び４８時間の間隔において、細胞を計測した。
【００６４】
ダイレクトＰＣＲ検出法の開発
異なる組織中のＬ．ケフィラノファシエンスの検出を許容するための種特異的ＰＣＲ増幅法を開発した。ＰＣＲ検出試験は、１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子の増幅において成る。これらのプライマーは、乳酸菌１６Ｓ配列と、我々の株、及び参照株ＡＴＣＣ受入番号４３７６１のアライメントの結果を介して同定した、ユニークなＬ．ケフィラノファシエンスＤＮＡ配列からデザインした。該プライマーの特異性は、５つの異なる乳酸菌株のＤＮＡに対して実験的に試験した。該試験はまた、糞便、粘膜及び結腸全体から単離された実験試料中のＬ．ケフィラノファシエンスＤＮＡを検出するために成功的に使用されている。これらの結果は、該プライマーが高特異性であり、腸内フローラ中の細菌ＤＮＡの重要な多様性を介してＬ．ケフィラノファシエンスＤＮＡの存在を検出することを実証した。
【００６５】
Ｌ．ケフィラノファシエンス特性ＰＣＲプライマー配列は、Ｒ２Ｃ２−１６ＳＦ（配列番号８）及びＲ２Ｃ２−１６ＳＲ（配列番号９）である。
【００６６】
ＰＣＲ増幅周期パラメーターは以下のとおりである：９４℃で１０分後、９４℃で３０秒間、６９℃で３０秒間、そして７２℃で１分間を３０回反復し、その後最後に７２℃で１０分間の１回の工程。２％アガロースゲルにおける電気泳動によりＰＣＲ生成物を分析する。
【００６７】
胃／腸液中の生存
低ｐＨ及び胃液におけるこれらのことなるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）株の生存及び成長を調査した。該実験のために、無菌胃液に供する前に異種株をＲＣＷ培地及び乳清中において３７℃で２４時間前培養した。酸性条件下における異種株の生存を以下のとおり試験した。
【００６８】
ａ）酸溶液中の乳酸菌の株の生存
新鮮な培養液由来の細胞を計測し、その後遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＭＲＳブロス又はｐＨ３．５、３．０、２．５及び２．０に調節した乳清中１０7ｃｆｕ／ｍｌの濃度に再懸濁した。細胞を３７℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ及びプレート計数法を使用して、１５、３０、６０及び１２０分の間隔において生存を測定した。
【００６９】
ｂ）ヒト胃液中の乳酸器の株の生存
ＲＣＷ中の新鮮な培養液由来の細胞を計測し、その後遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてヒト胃液中１０8ｃｆｕ／ｍｌの濃度に再懸濁した。３０分、１時間又は２時間のヒト胃液中における３７℃のインキュベーション後、培養液をＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＲＣＷブロス中に再懸濁した。ＲＣＷにおいて３７℃での２４時間のインキュベーション後、分光法（６４０ｎｍ）により生存をモニターし、そして未処理培養液のＯ．Ｄ．値と比較した。胃液は以下のとおり調製した：３．２ｇ／Ｌのペプシン、２．０ｇ／ＬのＮａＣｌを、該実験の目的のためにｐＨ２．０において調製した。該細菌の生存は、胃液の３０分のインキュベーション後、極めて良好であった。表５に示されるとおり、全ての株が、未処理株と同じ培養液レベルに達するように見える。
【００７０】
【表５】
【００７１】
胆汁耐性
ＲＣＷ中の新鮮な培養液由来の細胞を計測し、その後遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして無菌ヒト腸液中１０8ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。３０分、１時間又は２時間の腸液中における３７℃のインキュベーション後、培養液をＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＲＣＷブロス中に再懸濁した。ＲＣＷにおいて３７℃での２４時間のインキュベーション後、分光法（６４０ｎｍ）により生存をモニターし、そして未処理培養液のＯ．Ｄ．値と比較した。腸液は以下のとおり調製した：１０ｇ／Ｌのパンクレアチン、６．８ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．１５％の胆汁塩を、該実験の目的のためにｐＨ８．０において調製した。該細菌の生存は、腸液の３０分のインキュベーション後、極めて良好であった。表６に示されるとおり、全ての株が、未処理株と同じ培養液レベルに達するように見える。
【００７２】
【表６】
【００７３】
ＣａＣｏ−２／ＨＴ−２９に対するインビトロ付着
腸上皮細胞に付着するための異種株の能力を評価した。ＣａＣｏ−２及びＨＴ−２９細胞の単層は、２４ウェルプレート中１４日間でコンフルエンスに成長すること、そして分化することを許容した。Ｓｙｔｏ９色素（ＢａｃＬｉｇｈｔキット）で事前に標識した１０８ｃｆｕ／ｍｌの異なる細菌株を、ＤＭＥＭ（抗菌を伴わない）中の各ウェル（３通り）に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。この後、該細胞をＰＢＳで４回洗浄し、全ウェル内容物を１０分間のトリプシン処理により回収し、そしてウェルあたりの細菌数をＦＡＣＳにより評価した。洗浄後に１５％の細菌がなおウェル中に存在したことから、株Ｒ２Ｃ２は、ＣａＣｏ−２上で良好な付着特性を示した。更に、細胞におけるＲ２Ｃ２の付着は、良好な付着特性について周知のプロバイオティクスであるＬ．ＧＧよりも明らかに高かった。
【００７４】
【表７】
【００７５】
共培養におけるインビトロ免疫調節能
ヒト腸上皮細胞（ＨＴ−２９）及びヒトＰＢＭＣの共培養系は、腸内レベルにおける細菌株の免疫調節効果を評価するためのインビトロモデルとして使用される。端的には、ヒトＨＴ−２９上皮細胞は、トランスウェル系の上部チャンバー中に播種され（１ｍｌあたり１０6細胞において）、そして分化が生じるまで培養される（毎日換えるＲＰＭＩ１６４０中で４週間）。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、新鮮なヒト血液から密度勾配遠心分離により分離し、そして１０6細胞を下部チャンバーに添加する。異種株の免疫調節効果は、１０6細菌の下部又は上部チャンバーのいずれかへの３とおりの添加、続く４８時間のインキュベーションにより評価する。対照は培地のみを含んだ。この後、細胞培養液上清を除去し、そして標準ＥＬＩＳＡキット(R&D systems, Minneapolis, MN USA)を使用して細胞外サイトカインレベルについて評価する。サイトカイン発現レベルの評価は、各グループのプールした３通りの試料から得られた全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定する。
【００７６】
ヒト腸細胞におけるＲ２Ｃ２で発酵させた乳清のインビトロ免疫調節能
ヒト腸上皮細胞（ＨＴ−２９）の培養系は、Ｒ２Ｃ２で発酵した乳清の免疫調節効果を評価するためのインビトロモデルとして使用される。ヒトＨＴ−２９上皮細胞（１ｍｌあたり１０6細胞）を分化が生じるまで培養する（毎日換えるＲＰＭＩ１６４０中で４週間）。異種株の免疫調節効果は、多様な濃度におけるＭＰＭ（順応性タンパク質マトリックス（malleable protein matrice))の添加、続く４８時間のインキュベーションにより評価した。対照は培地のみを含んだ。ヒト腸細胞におけるＭＰＭの抗炎症能の測定のために、炎症性サイトカインの産生を誘発するためのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を該培養培地中に添加した。これらの異なるプロトコル後、細胞培養液上清を除去し、そして標準ＥＬＩＳＡキット(R&D systems)を使用して、細胞外サイトカインレベルについて評価した。サイトカイン発現レベルの評価は、各グループのプールした３通りの試料から得られた全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＬＰＳに暴露した細胞及びＭＰＭの多様な濃度は、ＴＮＦα発現の明らかな減少を示した。結果を表８に示す。
【００７７】
【表８】
【００７８】
実施例３
ラクトバチルス株のインビボ特性及びプロバイオティクス能
インビボにおけるＬ．ケフィラノファシエンス付着
異種株のインビボ付着及び持続を調査した。該モデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（gavage）（経口（ｐ．ｏ．））により処理した。その後、結腸組織中のこれらの細菌の持続を評価するために結腸試料を経管栄養の完了後１日、３日及び１０日目の各処理グループの３匹のマウスから回収した。該試料を縦方向に開き、生理食塩水でリンスすることにより結腸内容物を回収し、そして粘膜層を擦って回収した。また、処理動物中の該株の存在を評価するために、経管栄養の最終日に糞便を回収した。異種細菌の存在は、糞便、結腸内容物、及び粘膜試料において、上述した開発した種特異性プライマーを使用してＰＣＲにより評価した。
【００７９】
マウス中の腸内ミクロフローラの調節
腸内ミクロフローラを調節するための異種株の能力を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（ｐ．ｏ．）により処理した。その後、大腸菌、乳酸菌（ＬＡＢ）のレベルを評価するために糞便試料を各グループから回収し、そしてまた及び糞便ｐＨを測定した。糞便は生理食塩水中で機械的に分裂させ、そして大腸菌の存在を、Perifilm Coliform Count platesTM (3M)で評価する。ＬＡＢのレベルは、Petrifilm Total Aerobic Count platesを使用して評価し、ＭＲＳブロスと共に嫌気的にインキュベートした。試験した４株全てが糞便試料中において３〜４倍の大腸菌レベルの低下を示した。表９に示されるとおり、最も重要かつ一定の効果を示す株は、Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰである。更に、株Ｒ２Ｃ２は、ＬＡＢ計数を僅かに増加させる能力を示したが、糞便ｐＨは低下している。これらの効果は、Ｒ２Ｃ２が、動物の腸管に付着できる可能性を示唆する。
【００８０】
【表９】
【００８１】
免疫調節能：白血球集団の調節
白血球集団を調節するための上記株の効果を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（ｐ．ｏ．）により処理した。処理期間の開始及び最後において、血液試料を回収し、そして白血球集団を評価するためにフローサイトメトリーにより分析した。該異種株は、白血球集団における可変の効果を示した。４種の株は、マウス免疫系を調節しているようであり、全リンパ球及び白血球数を上昇させている。しかしながら、表１０に示されるとおり、Ｒ２Ｃ２のみが多形核（ＰＭＮ）細胞の数を増加する能力を有し、そしてＢｉｏＳＰのみが単球を僅かに上昇させることができる。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
腸炎の予防／治療におけるＬ．ケフィラノファシエンス株
腸炎の症状を予防又は軽減するためのＬ．ケフィラノファシエンスの能力を、ＤＳＳ−誘発マウスモデルにおいて評価した。
【００８４】
ａ）腸炎の予防
ＤＳＳでの炎症の誘発前、その後該実験が完了するまで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う７日間の経管栄養（ｐ．ｏ．）により処理した。７日間の飲水中のＤＳＳ（２．５％）の添加により８日目に腸炎が誘発された。炎症のレベル及び進行は、体重減少、下痢、潜血、ヘマトクリット、及び結腸の長さ（死後）の測定を介して評価した。異なる処理グループは、以下の異なるパラメーターにおいて、異なる程度の効果を示した。株Ｒ２Ｃ２、ＢｉｏＳＰ及びＫ２は、炎症の発達に対して強い予防効果を示したが、株ＩＮＩＸはより優れた調節効果を有した。更に株Ｌ．ＧＧは、潜血及び下痢及びヘマトクリットの合わせたスコアを除き、該モデルにおいて有利な効果を示さなかった。結果を表１１〜１４に示す。
【００８５】
実験グループ：
グループ１：５匹のマウス、水＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ2：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ３：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｒ２Ｃ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ４：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＩＮＩＸ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ５：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＢｉｏＳＰ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ６：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｋ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
グループ７：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｌ．ＧＧ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ） ｐ．ｏ．
【００８６】
【表１１】
【００８７】
【表１２】
【００８８】
表１３
ＤＳＳ消費の一定の日数後の組み合わせた潜血及び下痢スコア（８スケールにおいて評価した）。（より具体的には、該スコアは以下のとおり行った）：ヘモカルトＩＩ(Beckman Coulter, Mississauga, Ontario, Canada）、以下に定義されるスケール０〜４の直腸出血を評価するために糞便潜血についての慣習的スクリーニングの連続試験スライドを用いた：０−出血なし、４−糞便様出血。糞便の硬さはまた、以下に定義される０〜４のスケールにおいて評価した：０−正常な硬さ、４−液体状糞便。糞便の硬さ及び直腸出血値をあわせ、そして「臨床スコア」として定義した。スコアは盲検の評価者により与えられた。
【表１３】
【００８９】
【表１４】
【００９０】
ｂ）腸炎の治療
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種株を伴う経管栄養（ｐ．ｏ．）により、実験期間中１日あたり１回処理した。８日間の飲水中のＤＳＳ（２．５％）の添加により０日目に腸炎が誘発され、その後異なる処理グループの炎症からの回復を評価するために８日間新鮮な水に置き換えた。炎症のレベル及び進行は、体重減少、下痢、潜血、ヘマトクリット、及び結腸の長さ（死後）の測定を介して評価した。全てのＬ．ケフィラノファシエンス株は陽性の効果を示したが、炎症後の回復期間における異種株についての強度は変化した。Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは、動物のＤＳＳ誘発損傷からの回復を助けることにおいて最も優れた能力を示した。事実、株ＢｉｏＳＰを受けたマウスは他の全グループの３日前に体重の回復が始まった。Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは、結腸の完全性（integrity)においてより優れた改善を示した。更に、株Ｌ．ＧＧは該モデルにおいて有利な効果は示さなかった。これらの結果を表１５及び１６に示す。
【００９１】
実験グループ：
グループ１：５匹のマウス、水＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ2：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ３：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ４：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＩＮＩＸ ｐ．ｏ．
グループ５：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ６：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｋ２ ｐ．ｏ．
グループ７：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋Ｌ．ＧＧ ｐ．ｏ．
【００９２】
【表１５】
【００９３】
【表１６】
【００９４】
腸炎における低温殺菌又は照射細菌の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１０8ｃｆｕ／ｍｌの異種Ｌ．ケフィラノファシエンス株を伴う経管栄養（ｐ．ｏ．）により、実験期間中１日あたり１回処理した。動物は、生存、低温殺菌又は照射細菌として、株Ｒ２Ｃ２又はＢｉｏＳＰを受けた。ＤＳＳ（２．５％）の飲水への８日間の添加により腸炎が誘発され、その後異なる処理グループの炎症からの回復過程の迅速性を評価するために８日間新鮮な水に置き換えた。炎症のレベル及び進行は、重量偏差、及び下痢と潜血の合計スコアの測定を介して評価した。また、結腸長さ及び結腸中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、該実験の最後に評価した。株Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは、陽性効果を示し、ＤＳＳへの暴露中に体重減少を低下させた、下痢と潜血の合計スコアを低下させた。炎症後の回復期間において、体重増加はより早期に開始した。結腸の完全性はまた、正常な長さ及びＭＰＯ活性により近いことにより示されるとおり、これらのグループについて良好であった。生存、低温殺菌又は照射細菌で処理したグループ間において、主要な違いは観察されなかった。５−ＡＳＡは、その周知の抗炎効果のために、実験における有効性を比較するために使用した。全ての試験パラメーターについて、５−ＡＳＡ、Ｒ２Ｃ２及びＢｉｏＳＰは比較可能な保護効果を示した。結果を表１７〜２０に示す。
【００９５】
実験グループ：
グループ１：５匹のマウス、通常の水＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ2：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生理食塩水 ｐ．ｏ．
グループ３：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生存Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ４：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋低温殺菌Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ５：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋照射Ｒ２Ｃ２ ｐ．ｏ．
グループ６：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋生存ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ７：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋低温殺菌ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ８：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋照射ＢｉｏＳＰ ｐ．ｏ．
グループ９：５匹のマウス、水−ＤＳＳ＋５−ＡＳＡ ｐ．ｏ．
【００９６】
【表１７】
【００９７】
【表１８】
【００９８】
【表１９】
【００９９】
【表２０】
【０１００】
アレルギーに対する保護
このアッセイの目的は、マウスモデル中のアレルギー応答を調節するための該株の能力を変更することである。０日及び１４日目におけるアルミ（Ａｌ（ＯＨ）3ゲル）中のＯＶＡ（卵白アルブミン）の腹腔内注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化し、そして全ＩｇＧ及びＯＶＡ特異抗体応答を検出するために、血清を２１、３５及び４２日目に採取した。該免疫化スケジュールは、対照マウス中のＯＶＡに対する強力なアレルギー反応を誘発するのに十分である。ラクトバチルス株の（Ｌ．カゼイ（L. casei）と比較した）抗アレルギー効果は、該免疫化プロトコルの期間、異種株で経口処理したマウスグループにおいて評価した。アレルギー反応の発達は、ＥＬＩＳＡにより血清中の全ＩｇＧ産生及びＯＶＡ特異抗体の検出を介して評価した。また、サイトカイン及び抗体産生を介するアレルギー反応を評価するために、異なる処理グループ由来の培養した脾臓細胞をインビトロにおいてＯＶＡに暴露した。
【０１０１】
高脂血症の治療
高脂血症における該株の効果を評価するために選択した動物モデルは、共通したいくつかの表現型パラメーターを有し（例えば、高脂血症、肥満及び糖尿病）、そしてこれらにおける該株の有利な効果を独立に確認するために使用した。
【０１０２】
異種細菌株は、高脂血症のラットモデル中の血中脂質レベルを調節するためのこれらの能力について試験した。このプロトコルは、ラット中の人工的に誘発された高脂血症の制御において、ナイアシン（ｖｉｔＢ３）、強力な脂質低下剤、に対する異種株の比較評価を記載する。ポロキサマー４０７で腹腔内注射されたウィスターラットは、急速に、重篤であるが一過性の高脂血症を発症する。グルコースの血清レベルもまた該処理により上昇する。Ｌ．ケフィラノファシエンス株の脂質低下効果は、ポロキサマーの注射前７日間、経口的に前処理したラットのグループにおいて評価する。血中脂質は、注射前、並びに高脂血症の誘発後２４及び７２時間目に測定した。トリグリセリド及びコレステロール（ＬＤＬ）の血漿レベルを評価した。７日の前処理後、血漿トリグリセリドは、ナイアシン処理グループで減少したが、Ｒ２Ｃ２処理グループにおいては明白な減少は僅かであった。また、血漿トリグリセリドの減少は、高脂血症の誘発後７２時間における全ての処理グループにおいて観察された。最も重要な減少は、ナイアシンを受けたグループ中で観察された（表２１）。
【０１０３】
グループ１：４匹のラット、経管栄養 生理食塩水
グループ２：４匹のラット、経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：４匹のラット、経管栄養 Ｒ２Ｃ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
グループ４：４匹のラット、経管栄養 ＩＮＩＸ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
グループ５：４匹のラット、経管栄養 ＢｉｏＳＰ（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
グループ６：４匹のラット、経管栄養 Ｋ２（１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）
【０１０４】
【表２１】
【０１０５】
結腸癌に対する保護
該アッセイの目的は遺伝子モデルＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎにおいて腫瘍形成に対してマウスを保護するための該株の能力を検証することである。該モデルにおいて、脂肪リッチな食餌に暴露した場合、１００％のＡｐｃＭｉｎヘテロ接合型マウスが少なくとも３０の自然発生的な腸管腺腫を発症した。腫瘍形成期間中に異種株で１週間に３回経口的に処理したＡｐｃＭｉｎヘテロ接合型マウスにおいて該株の抗腫瘍化効果を評価した。
【０１０６】
実施例４
乳清中に発見されたタンパク質の消化
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２を、発酵中のタンパク質基質を加水分解するためのその能力について評価した。乳清は、該細菌が乳清中に発見される通常のタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、α−ラクトアルブミン（α−ＬＡＣ）、β−ラクトグロブリン（βＬＧ）を時間にわたって消化するための能力を有することを示すための基質として使用した。該分析は、勾配溶離によるＨＰＬＣ（カラムＲＰ Ｃ−４ ３００Ａ(Phenomenex, Torrance, CA, USA)によって行った（表２２）。
【０１０７】
【表２２】
【０１０８】
実施例５
アトピー性接触皮膚炎におけるＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品の抗炎症能
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の抗炎症効果を測定するためにマウスにおけるオキサゾロンで誘発したアトピー性接触皮膚炎のマウスモデルを使用した。該炎症モデルは、例えば、皮膚障害、例えば、乾癬において使用されるいくつかの抗炎症性及び免疫抑制薬の有効性及び能力を測定するために感受性かつ有用であることが証明されている。グルココルチコイドのような薬物は、皮膚及び関節炎症を軽減するために一般的に使用される。予防的（表２４）又は治療的（表２３）方法のいずれかにおいて経口的に投与されたＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、両方の場合において耳の厚さの約３０％の減少を伴い示されるとおり、炎症を低下した。より具体的には、アトピー性接触皮膚炎におけるマウスモデルは、Garrigue et al. (Contact Dermatitis., 30(4):231-273, 1994)による最初の記載に基づき、そして以下のとおり改変した：ＣＤ−１マウス腹部の毛を除去し、そして感作段階は、アセトン中の１００μｌのオキサゾロン５％の該腹部における適用により行った(Sigma-Aldrich, Oakville, On)。４日後、誘発段階（一次誘発）は、アセトン中の５０μｌのオキサゾロン５％の右耳における適用により行った（耳の各サイドに２５μｌずつ）。二次誘発は、一次誘発後７日目に同様の手順で行った。マウスの耳の厚さを毎日測定した。
【０１０９】
予防プロトコル（ＭＰＭ）−マウスアトピー性接触皮膚炎
感作７日前に、ＭＰＭの投与により、ＭＰＭ（特許ＰＣＴ／ＣＡ２００２／０１９８８）の予防的抗炎症能を最初に評価した。１０匹のＣＤ−１マウスの３グループは、経管栄養により毎日１００μｌの再構成凍結乾燥ＭＰＭ、水、及び１ｍｇの水溶性ヒドロコルチゾン（１０ｍｇ／ｍＬ）を受けた。前述のとおり皮膚炎が誘発され、そして耳の厚さを毎日測定した。ＭＰＭの治療的抗炎症能は、一次誘発後のＭＰＭのみの投与により評価した。１０匹のＣＤ−１マウスの３グループは、経管栄養により毎日１００μｌの再構成凍結乾燥ＭＰＭ、水、及び１ｍｇの水溶性ヒドロコルチゾン（１０ｍｇ／ｍＬ）を受けた。前述のとおりマウスアトピー性接触皮膚炎を行い、そして耳の厚さを毎日測定した。マウスの体重を週に２回測定した。
【０１１０】
治療プロトコル（Ｒ２Ｃ２）−アトピー性接触皮膚炎のマウスモデル
Ｒ２Ｃ２の治療的抗炎症能を、一次誘発後の細菌検索液の摂食によりアトピー性接触皮膚炎の動物モデルにおいて評価した。Ｒ２Ｃ２の保護効果を、皮膚炎におけるその周知の抗炎症性効果のためにヒドロコルチゾンと比較した。Ｒ２Ｃ２は、炎症の良好な低下を示し、減少した耳の厚さにより実証された。有効性はヒドロコルチゾンと比較可能であった。結果を表２３〜２５に示す。
【０１１１】
【表２３】
【０１１２】
【表２４】
【０１１３】
【表２５】
【０１１４】
実施例６
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品の抗トリグリセリド血症能
該実験のために、７週齢の体重１２５〜１５０ｇのメスのウィスターラットをCharles River Canadaから購入した。該ラットを、それぞれ少なくとも６匹の動物からなる４つの異なるグループに無作為化した。ラットは、１ｍＬ用量のＭＰＭ、１０9細菌／ｍＬのラクトバチルスＲ２Ｃ２（該ラクトバチルス株は乳清を発酵するために使用した）を含有する１ｍＬの生理食塩水懸濁液、１ｍＬのＰＢＳ(Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada)、及び対照として１００ｍｇ／ｋｇのナイアシン(Sigma)を受けた。これらは、特定病原体未感染条件下で飼育され、そして２４時間の明／暗周期に維持した。全ての動物は標準食餌を消費し、水を自由に受けた。ＭＰＭは凍結乾燥形態とし、そして８０％の水を添加することにより毎日調製し、そしてヨーグルト様生成物に戻すために混ぜた。該細菌株ラクトバチルスＲ２Ｃ２は、ＭＲＳブロス(BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada)中、３７℃で２４時間慣習的に培養した。その後細菌を４０００ｒｐｍにおいて、８分間遠心分離によりペレット化し、そして無菌ＰＢＳ(Invitrogen)中１０9細胞／ｍＬの濃度において再懸濁した。ラットについて１ｋｇあたり１００ｍｇの用量の処理を受けるように、ナイアシンを水に溶解した。ナイアシンは完全には溶解しなかったため、２０分間ソニケーションをする必要があった。動物は、ポリキサマー４０７プルロニック（登録商標）Ｆ−１２７注射(BASF corporation, Mississauga, ON, Canada)の前に７日間の処理を受けた。腹腔内注射用のポリキサマー４０７溶液は、該薬剤と無菌水を混合し、そしてコールド法の取り込みによりポリマーの溶解を促進させるために一晩冷蔵することにより調製した。
【０１１５】
高脂血症の誘発
異なる生成物での７日の処理後、全ての動物を、３００ｍｇの用量のポリキサマー４０７の腹腔内注射により高脂血症とさせた。約２３％ｗ／ｗ以上の濃度におけるポリキサマー４０７溶液は逆熱ゼラチン化特性を有するため、注射を促進させるためにポリマーが流動的な粘性状態を維持するようにポリキサマー４０７投与の前に全てのシリンジを氷上においた。
【０１１６】
血液の採取
約１ｍＬの血液を３ｍＬシリンジで頚静脈から採取し、そしてリチウム−ヘパリン処理プラスチックチューブ(Sarstedt, Montreal, QC, Canada)中に直ぐに移した。チューブを１０秒間軽く振り、その後血漿の分離を許容するために遠心分離した。血漿試料を清潔な１．５ｍＬエッペンドルフ中に採取し、そして分析時まで−８０℃で直ぐに凍結させた。血液採取のために、イソフルラン(AErrane, Baxter Corporation, Deerfield, IL, USA)を使用して各動物を麻酔した。血液採取は、異なる生成物での７日の処理後、ポリキサマー４０７注射前（ｔ＝０、処理後脂質レベルの比較）、注射２４時間後（ｔ＝２４時間、誘発脂質レベル）及び注射７２時間後（ｔ＝７２時間、正常レベルへの回復の比較）に行った。最後の血液採取後、動物をＣＯ2窒息法により犠牲にした。ポリキサマー４０７投与のための異なる処理の食餌についての全ての手順及びその後の血液採取は、実験動物の扱い及び使用のための施設ガイドに従い、そして倫理委員会により承認されている。
【０１１７】
脂質分析
全ての実験グループからの試料を、全コレステロール及びトリグリセリドについて分析した。全ての分析は、ISO 9002を取得し、完全性のある血漿脂質定量化サービスを提供する、独立した研究室(Laboratoire medical Biron, 4105-F Matte Blvd, Brassard, Quebec, Canada, J4Y 2P4)で行った。
【０１１８】
表１５に示されるとおり、７日処理後のＲ２Ｃ２は、基礎トリグリセリドレベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）を制御するための僅かな能力を示した。最も優れた効果は、該細菌で発酵させた乳清で得られた。７日の処理後、細菌Ｒ２Ｃ２は、基礎トリグリセリドレベルを３０％近くまで低下し、そしてＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、ナイアシンと同様に、基礎トリグリセリドレベルを４０％近くまで低下した。また、Ｒ２Ｃ２処理グループにおいてトリグリセリドレベルは、高脂血症の誘発後７２時間で低下したが、ナイアシン又はＭＰＭ処理グループにおいては特に調節された。
【０１１９】
【表２６】
【０１２０】
【表２７】
【０１２１】
実施例７
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品の抗高血圧能
Ｒ２Ｃ２で発酵させた乳清の（ＭＰＭ）抗高血圧能を、ＳＨＲメスラット（６週齢）を使用して評価した。１２匹のラットを各処理グループにおけるこれらの体重に従い無作為化した。これらは、特定病原体未感染条件下で飼育され、そして１２時間−明／暗周期に維持した。全ての動物は標準食餌を消費し、水を自由に受けた。グループは、１ｍＬの水（プラセボグループ）、ＭＰＭ（５ｍＬ／ｋｇ）又はその周知の高血圧効果によりマレイン酸エナラプリル（１０ｍＬ／ｋｇ）のいずれかを強制的に食餌させた。収縮期血圧（ＳＢＰ）を、自動化ＲＴＢＰ２０００テール血圧システム(Kent Scientific, Torrington, CT, USA)によるテール−カフ法により毎週測定した。データ収集は毎週行い、そして３通りの測定値の平均を初期平均ＳＢＰとして採用した。データを獲得し、そしてBiopac Student Lab Pro（登録商標）ソフトウェア バージョン 3.6.1 (Biopac System, Goleta, CA, USA)で解析した。処理の２週間後、エナラプリル処理グループは１８４ｍｍＨｇ〜１５６ｍｍＨｇの正常化ＳＢＰを有した。ＳＢＰの着実な減少は、ＭＰＭで強制的に食餌した動物について、４週間目に少なくとも２５％の最大変化を伴い、毎週観察された。結果を表２８に示す。
【０１２２】
【表２８】
【０１２３】
実施例８
高脂血症、肥満及び糖尿病の治療
高脂血症、肥満及び糖尿病における該株の効果を評価するために選択された動物モデルは、共通するいくつかの表現型パラメーターを有し（例えば、高脂血症、肥満及び糖尿病）、そしてＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の有利な効果を独立に確認するために使用された。
【０１２４】
ａ）高脂血症のモデル
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、高脂血症のラットモデル中の血中脂質レベルを制御するためのこれらの能力を評価するために試験した。該プロトコルは、ラット中に人工的に誘発させた高脂血症の制御における、ナイアシン（ｖｉｔＢ３）、強力な脂質低下剤、に対する比較評価を記載する。ポロキサマー４０７で腹腔内注射されたウィスターラットは急速に、重篤であるが一過性の高脂血症を発症する。グルコースの血清レベルもまた該処理により上昇する。Ｌ．ケフィラノファシエンス株の脂質低下効果を、ポロキサマーの注射前７日間、経口的に前処理したラットのグループにおいて評価する。血中脂質を、注射前、並びに高脂血症の誘発後２４及び７２時間目に測定した。トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びグルコースの血漿レベルを評価した。７日も前処理後、血漿トリグリセリドは、ナイアシン処理グループにおいて低下した。血漿トリグリセリドの減少はまた、高脂血症の誘発後７２時間においてＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清中で観察された。
【０１２５】
グループ１：４匹のラット、経管栄養 生理食塩水
グループ２：４匹のラット、経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：４匹のラット、経管栄養 Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清（経管栄養あたり１ｍｌ）
【０１２６】
【表２９】
【０１２７】
ｂ）高トリグリセリド血症及び肥満のモデル
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、高脂血症の食餌誘発ラットモデルにおいて、体重増加及び血中脂質レベルを制御するためのその能力について試験した。このプロトコルは、ラット中の食餌誘発高脂血症の制御にいて、ナイアシン（ｖｉｔＢ３）に対する比較を許容する。飲水中のフルクトース（１０％の濃度）において暴露したウィスターラットは、漸進的な体重増加を示し、そして４週間にわたり高脂血症を発症する。フルクトース処理期間中のＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の高脂質低下効果を測定した。フルクトース処理の開始前、及び高脂血症の誘発中の４週間に１回、血液試料を採取した。トリグリセリドの血漿レベルを測定した。
【０１２８】
グループ１：経管栄養 生理食塩水
グループ２：経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：経管栄養 Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清（１日に２回の経管栄養あたり１ｍｌ）
グループ４：１％エポキシサッカライドの経管栄養
【０１２９】
【表３０】
【０１３０】
【表３１】
【０１３１】
ｃ）体重及び脂肪管理のモデル
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、自然発生高血圧性ラットモデル及び卵巣摘出ラットにおいて、脂肪分布並びに体重増加を制御するためのその能力について試験した。ＳＨＲモデルは、前述のとおり使用したが、腹部に蓄積している内臓脂肪のレベルをモニターするために使用した。動物は、５６日間１日に１回、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２（２０％固体）で発酵させた１ｍｌの乳清を与えられた（Ｐ．Ｏ．ｑ１×５６）。
【０１３２】
グループ１：１２匹のラット、経管栄養 生理食塩水
グループ２：１２匹のラット、経管栄養 ナイアシン（１００ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：１２匹のラット、経管栄養 Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清（経管栄養あたり１ｍｌ）。
【０１３３】
【表３２】
【０１３４】
表３３
卵巣切除ラット
４５匹の１２週齢のメスのウィスターラットを使用し、そして２つの偽手術グループと２つの卵巣摘出（ＯＶＸ）グループ、すなわち、生理食塩水を伴うＯＶＸ（ＯＶＸグループ）、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を伴うＯＶＸ（経管栄養あたり１ｍｌ）に無作為に割り当てた。毎日の経口投与は１２週間のＯＶＸ後４日目に開始した。違いは、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を与えた動物における、約８％の体重増加である。
【表３３】
【０１３５】
実施例９
ヒト皮膚におけるＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の効果
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の局所的活性を、皮膚完全性の感受性かつ有意なバイオマーカー手段、例えば、ともに一定の上皮ホメオスタシス（８）のガーディアンである、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びシクロオキシゲナーゼ２（Ｃｏｘ−２）によりモニターした。Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、非ステロイド性抗炎症薬（イブプロフェン)、Ｃｏｘ−２の非選択性阻害薬、に対して、並びに一般的な商標名を伴う高価な市販製品、Regenerist Olay（登録商標）に対して比較した。該目的は、Ｃｏｘ発現におけるＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の効果、及びＰＥＧ２の基礎レベル及び日光及び環境紫外線（ＵＶＢ）誘発侵襲後の誘発レベルの効果をモニターすることである。これらの実験において、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清を、ヒト皮膚において予防的又は治療的に使用した。試験した全ての実験条件において、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、両バイオマーカーの完全性における有意な阻害効果を示した。Ｃｏｘ−２の発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより示されるとおり、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の暴露後に誘発された。該観察後、我々は、Ｃｏｘ−２の阻害を説明すべく、この活性を区別かつ説明でき、そして潜在的な悪影響を除外できる遺伝子を検索した。我々は、Ｃｏｘ−２の低下する発現に加え、１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ（１５−ＰＧＤＨ）、Ｃｏｘ−２を生理的かつ自然にアンタゴナイズするプロスタグランジン分解酵素の発現が増強されたことを発見した。この観察を更に推し進めるために、我々は、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清に暴露したヒトケラチノサイト及びヒト皮膚中のＰＧＥ２の生合成におけるＣｏｘ−２減少の結果を測定した。我々は、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清が、外部侵襲なしの２４時間暴露後に、ＰＧＥ２の基礎レベルを約７５％低下していることを発見した。ＵＶＢを環境侵襲として使用した場合、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、ＰＧＥ２の阻害を予防し、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の保護的役割を示唆した。最後に、ＵＶＢ暴露前又は後のいずれかに使用した場合のＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、同様の保護活性を示し、そしてさらにＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清をＵＶＢ暴露後に適用した場合に示されるとおり、治療的な効果をも示した。また、Regenerist Olay（登録商標）は希釈せずに使用したＬ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清よりも低い有効性であったことに注目することが重要である。Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清は、該実験設定において非希釈条件において試験できなかったが、我々は非希釈において使用した場合には、その局所的活性は極めて増加したものと考える。まとめとして、これらのデータは、Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清がヒト皮膚における興味深い生物機能性を示すことを示唆する。
【０１３６】
実施例１０
Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清の効果
３人のボランティアは、彼ら自身の承諾に基づき、多様な期間Ｌ．ケフィラノファシエンスＲ２Ｃ２で発酵させた乳清製品を摂取することを決意した。２人は高いコレステロールを有し、そして１人は腕における時々の痺れにつながる糖尿病及び高血圧を有した。高コレステロールを伴う最初の２人のボランティアは、１日あたり２５グラム相当を１０日間摂取し、そして妊娠糖尿病及び高血圧を伴うボランティアは３週間該製品（１００ｍｌ湿性）を摂取した。結果は以下のとおりである。最初の２人については全コレステロールの１２％及び１５％の低下が、そして痺れの全体的な軽減及び妊娠糖尿病の予防が存在した。これらの結果は、より正確且つ厳格な臨床形式においていくつかの陽性の有利な効果を試験すべきことを示唆する。
【０１３７】
【表３４】
【０１３８】
本発明のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）はまた、多様な効果を有する有用な製品に導き、ミルク製品、乳清及びチーズ乳清等の基質を発酵するために使用することができる。チーズ乳清の発酵プロセスは、ワイン醸造において、タンパク質中に豊富な反芻動物飼料サプリメントの産生のために使用される。発酵チーズ乳清はまた、抗酸化、抗高血圧、抗腫瘍、脂質低下、抗ウイルス、抗細菌及びキレート剤として作用する能力を有する。
【０１３９】
本発明は特定の態様との関連により記載されるが、これはさらなる改変が可能であり、そして本願は、一般に本発明の原理に従い、そして本発明の属する当業界に既知であり又は慣習的に実施されるような、そして前述の本質的特徴に適用できるような、そして付随の特許請求の範囲の範囲に従うような、このような開示からの脱却を含む、本発明のいずれかの変動、使用、又は適応を網羅することを意図することが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適当な担体と共に有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を含んで成るプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されるプロバイオティクス効果を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、経口、直腸、又は膣投与用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
対象中の腸内ミクロフローラの陽性調節を提供するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
腸炎に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項１０】
前記腸炎が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
アレルギー及び／又は自己免疫疾患に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
下痢に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項１７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
糖尿病に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２０】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
高脂血症に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
結腸癌に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
対象における腸炎を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２９】
前記腸炎が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
対象におけるアレルギー及び／又は自己免疫疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項３３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
対象における下痢を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項３６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象における糖尿病を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項３９】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
対象における高脂血症を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項４２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
対象における結腸癌を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項４５】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
プロバイオティクス化合物としてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用。
【請求項４８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されるプロバイオティクス効果を有する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が経口投与用である、請求項４７に記載の使用。
【請求項５２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、発酵乳製品及び非生存細菌試料として、生きている細菌集団、凍結乾燥された細菌集団から成る群から選択される形態において投与される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記非プロバイオティクス試料が、熱殺細菌試料、照射された細菌、及び溶解された細菌から成る群から選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
前記前記プロバイオティクス化合物が、抗炎症性効果を有する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５５】
乾癬の治療のための請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
抗炎症性化合物を伴う、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５７】
前記抗炎症性化合物が５−ＡＳＡ又は副腎皮質ステロイドである、請求項５７に記載の使用。
【請求項５８】
乾癬の治療のための医薬の製造のための、請求項４７に記載の使用。
【請求項５９】
乳清を発酵するためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用。
【請求項６０】
前記乳清がチーズ乳清である、請求項６０に記載の使用。
【請求項６１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項６０又は６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項６０又は６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
循環器疾患の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６４】
高血圧の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６５】
体重障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６６】
高脂血症の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６７】
トリグリセリド障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項６４〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項６４〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
循環器疾患の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７１】
高血圧の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７２】
体重障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７３】
高脂血症の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７４】
トリグリセリド障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７５】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項７１〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項７１〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
適当な担体と共に有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を含んで成るプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されるプロバイオティクス効果を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、経口、直腸、又は膣投与用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
対象中の腸内ミクロフローラの陽性調節を提供するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
腸炎に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項１０】
前記腸炎が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
アレルギー及び／又は自己免疫疾患に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
下痢に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項１７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
糖尿病に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２０】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
高脂血症に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
結腸癌に対して対象を保護するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
対象における腸炎を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２９】
前記腸炎が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）により、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）により生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
対象におけるアレルギー及び／又は自己免疫疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項３３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
対象における下痢を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項３６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象における糖尿病を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項３９】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
対象における高脂血症を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項４２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
対象における結腸癌を治療及び／又は予防するための方法であって、該対象に対して有効量のラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項４５】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
プロバイオティクス化合物としてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用。
【請求項４８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
腸内付着、腸内持続、腸内ミクロフローラの陽性調節、腸内病原菌に対する保護、免疫調節、全身性炎症に対する保護、腸炎に対する保護、アレルギーに対する保護、下痢に対する保護、糖尿病に対する保護、高脂血症に対する保護及び結腸癌に対する保護から成る群から選択されるプロバイオティクス効果を有する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が経口投与用である、請求項４７に記載の使用。
【請求項５２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、発酵乳製品及び非生存細菌試料として、生きている細菌集団、凍結乾燥された細菌集団から成る群から選択される形態において投与される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記非プロバイオティクス試料が、熱殺細菌試料、照射された細菌、及び溶解された細菌から成る群から選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
前記前記プロバイオティクス化合物が、抗炎症性効果を有する、請求項４７に記載の使用。
【請求項５５】
乾癬の治療のための請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
抗炎症性化合物を伴う、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５７】
前記抗炎症性化合物が５−ＡＳＡ又は副腎皮質ステロイドである、請求項５７に記載の使用。
【請求項５８】
乾癬の治療のための医薬の製造のための、請求項４７に記載の使用。
【請求項５９】
乳清を発酵するためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）の使用。
【請求項６０】
前記乳清がチーズ乳清である、請求項６０に記載の使用。
【請求項６１】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項６０又は６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項６０又は６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
循環器疾患の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６４】
高血圧の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６５】
体重障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６６】
高脂血症の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６７】
トリグリセリド障害の治療のためのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項６８】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項６４〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項６４〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
循環器疾患の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７１】
高血圧の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７２】
体重障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７３】
高脂血症の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７４】
トリグリセリド障害の治療のための医薬の製造におけるラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）による乳清の発酵から得られた製品の使用。
【請求項７５】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens）及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum）から成る群から選択される、請求項７１〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）が、Ｒ２Ｃ２、ＩＮＩＸ、Ｋ２、ＢｉｏＳＰ及びＥＳ１から成る群から選択される株である、請求項７１〜７４のいずれかに記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５３００３４（Ｐ２００８−５３００３４Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４４０５（Ｐ２００７−５５４４０５）
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００２０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８４３８１
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０４２３９３３１）テクノロジー バイオラクティス インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００２０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８４３８１
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０４２３９３３１）テクノロジー バイオラクティス インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】
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