ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビンＡｏを定量する方法、および糖尿病のマーカーの一つである血液中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病の指標の一つとして、血液中に含まれる糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下ＨｂＡ１ｃ）が知られ、臨床検査の分野において、広くその測定が行われている。また、ＨｂＡ１ｃは、患者の約１〜２ケ月前の血糖値と良く相関することから、糖尿病患者の病態把握において、その臨床的意義も高まってきている。
【０００３】ＨｂＡ１ｃは、下記式に示されるように、β鎖Ｎ末端に存在するバリンのアミノ基にグルコースが非酵素的に結合した複合体である。下記式においてβＡ−ＮＨ2 は、ヘモグロビンＡｏ（以下ＨｂＡｏ）を示し、その中のＮＨ2 は該ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端であるバリンのアミノ基を示す。即ち、ヘモグロビンのアミノ基にグルコースが結合すると、まず、シッフ塩基である不安定型ＨｂＡ１ｃ（Ｉ）が形成され、この不安定型ＨｂＡ１ｃ（Ｉ）はさらにアマドリ転移反応の結果ケトアミン型の安定型ＨｂＡ１ｃ（II）に変化する。臨床的に重要なＨｂＡ１ｃは、血糖値に左右されない安定型ＨｂＡ１ｃ（II）である。
【０００４】
【化１】
【０００５】従来、血液中のＨｂＡ１ｃを測定するには、血液を溶血させ、その後、イオン交換クロマトグラフィーの原理に基づいて、グリシコル化及び非グリシコル化ヘモグロビンを高速液体クロマトグラフィーにより分離し、測定する方法が主流であった。しかしながら、この方法では、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃをクロマトグラフィーで分離することが難しく、血糖値によって変動する不安定型ＨｂＡ１ｃの量が測定値に影響するという欠点がある。そのため、ジヒドロキシボリル化合物（特開昭５８−５１００２４号公報）や２，３−ジホスホグリセリン酸ポケット親和性物質（特開昭６３−２９８０６３号公報、特開平２−２５９４６７号公報）が、上記不安定型ＨｂＡ１ｃをＨｂＡｏとグルコースに解離させ、測定系から除外する目的で用いられている。しかしながら、上記の高速液体クロマトグラフィーを用いる方法は、いずれにしても、特殊な分離カラムを用いた専用の装置が必要であるためコストが高く、測定に時間がかかるという欠点があった。
【０００６】また、高速液体クロマトグラフィーを用いない方法としては、ボロン酸がシス−ジオール基を有する炭水化物部分を結合することを利用した方法が特表平−５０６７０３号公報に開示されている。この方法は、蛍光物質などでラベルした有機ボロン酸と血液を接触させ、生成した沈殿物を遠心分離し、有機溶剤に再溶解後、ラベル分子を測定するというものである。しかしながら、この方法は、血液中に大量に存在するグルコースや、グルコース以外のシス−ジオール基を有する炭水化物が測定値に影響を与える恐れがあり、また、ラベルした有機ボロン酸が、ＨｂＡ１ｃ以外の糖化蛋白質とも結合することから、正確な測定はできない。また、沈殿物の遠心分離や有機溶剤による再溶解という煩雑な操作が必要である。
【０００７】また、高速液体クロマトグラフィーを用いない別の方法としては、ＨｂＡ１ｃに対して特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いた多くの方法が開示されている（特開昭５４−１４５２１０、特開昭６１−１７２０６４、特開昭６３−２７７９６７、特開平０２−８７４３、特開平０６−１１５１０）。しかしながら、これらの方法では、ＨｂＡ１ｃに特有の抗原決定基がグルコースの結合したＮ末端バリン残基を含む部分にあり、この部分が分子外に露出しておらず、容易に抗体と結合できないため、変性を目的にした種々の煩雑な前処理が必要である。また、これらの免疫反応を利用した方法では、モノクローナル抗体の場合には、細胞培養等の特殊な技術が必要であり、また長期間の細胞培養の過程でハイブリドーマの変異といった問題点があり、ポリクローナル抗体の場合には、抗血清のロット間差、長期間に及ぶ動物への免疫が必要であるという問題点がある。また、いずれの場合にも、抗体の精製工程が必要であり、コストが高くなる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の欠点を解決するものであり、従来よりも、低コストで、簡単に血液中のＨｂＡ１ｃを特異的に測定する方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ＨｂＡｏは、一般に、図１R>１の模式図に示されるような、α2 β2 の４量体構造をなしており、β鎖の会合部に２，３−ジホスホグリセリン酸が結合するポケット（以下ＤＰＧポケットともいう）が存在する。血液中の２，３−ジホスホグリセリン酸は、このＤＰＧポケットに結合することにより、ヘモグロビン（以下Ｈｂともいう）の酸素解離能をアロステリックに調節していることが知られている（今井清博、蛋白質、核酸、酵素、Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．６，８１−８８，１９８７）。ＨｂＡ１ｃは、このポケットの中にグルコースが入り込んでβ鎖Ｎ末端バリンと結合し、生成すると考えられている。
【００１０】本発明者らは、鋭意研究の結果、上記ＤＰＧポケットに対する種々の親和性物質が、ＨｂＡｏに特異的に反応することを利用することによって、血液中のＨｂＡｏを定量し得ることを発見し本発明に到達した。
【００１１】すなわち、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質（以下ＤＰＧポケット親和性物質ともいう）と溶血液とを反応させ、前記ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液中のＨｂＡｏとの反応体を定量し、得られた値を別に求めた総ヘモグロビン量から差し引くことによって、血液中のＨｂＡ１ｃ量を測定することを特徴とするものである。
【００１２】また、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、前記方法において、ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液中のＨｂＡｏとの反応体の定量において、濁度を求めることにより定量することを特徴とするものである。
【００１３】また、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、前記方法において、ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液とを反応させるときの溶液のｐＨが５〜６．８であることを特徴とするものである。
【００１４】さらに、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、前記方法において、ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液とを反応させるときの溶液の電気伝導度が１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍであることを特徴とするものである。
【００１５】本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、より詳細には下記の通りである。
(1) 全血の赤血球を後述する種々の方法で溶血させ、(2) この溶血液とＤＰＧポケット親和性物質とを反応させ、(3) 上記ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液中のＨｂＡｏとの反応体を後述する種々の方法で定量することによって、ＨｂＡｏを定量し、(4) 溶血液中の総Ｈｂ量を後述する種々の方法で定量し、(5) 以下の計算式により、血中のＨｂＡ１ｃ量（％）を計算する。
【００１６】ＨｂＡ１ｃ（％）＝｛１−（ＨｂＡｏ量／総Ｈｂ量）｝×１００
【００１７】本発明で用いられるＤＰＧポケット親和性物質とは、ＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物及びそれらが担持された担体、又はＤＰＧポケットに対する親和性を有する高分子化合物であり、特に、メチレンホスホン酸基又はホスホン基を有する高分子化合物が好ましい。
【００１８】上記ＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物としては、特開昭６３−２９８０６３号公報、特開平２−２５９４６７号公報に不安定型ＨｂＡ１ｃ解離剤として開示されているリン酸縮合体やフィチン酸もしくはフィチン酸の塩のような多価リン酸化合物が挙げられる。上記リン酸縮合体としては、（ＨＰＯ3 ）ｎ（ｎは２以上の整数）で表されるメタリン酸、２原子以上のリンを含みＰ−Ｏ−Ｐ−結合を有するポリリン酸及びそれらの類似体が挙げられ、メタリン酸としては、トリメタリン酸、テトラメタリン酸等が、ポリリン酸としては、ピロリン酸、テトラポリリン酸等が挙げられる。
【００１９】さらに、本発明で用いられるＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物には、アンモニア、１級及び２級アミンの窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換されてなる化合物が用いられる。上記アミンとしては、種々のアルキルモノアミンやアミノ酸、直鎖アルキレンジアミン、ジアミノシクロヘキサン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、グリコールエーテルジアミン等が挙げられる。さらに、上記分子中の水素原子がアルキル基、水酸基などに置換された化合物を用いることもでき、例えばエチレンジアミンの１置換体として、炭素原子にメチル基が導入された１，２−ジアミノプロパン、プロピレンジアミンの１置換体として、水酸基が導入された１，３−ジアミノ−２−プロパノール等が挙げられる。
【００２０】上記のメチレンホスホン酸基置換体の製造方法としては、古くから種々の方法が知られている。例えば、Irani,R,R 等、J.Org. Chem. 31, 1603 (1966)によって開発された方法が挙げられる。これは、アミン、ホルマリン及び亜リン酸のMannich 反応を利用したものであり、ホスホン酸誘導体の合成方法として優れた方法である。また、Motekaitis, R. J. 等、J.inorg. nucl.Chem．33,3353 （1971) によって開発された方法も上記置換体の製造方法として利用できる。これは、クロロメチレンホスフィン酸を用いて、まずアミノ酸の水素原子をメチレンホスフィン酸に置換し、続いて塩化水銀を加えて加熱し、メチレンホスフィン酸をメチレンホスホン酸に酸化する方法であり、得られるメチレンホスホン酸置換体の純度も高く好ましい。
【００２１】前記化合物が担持される担体としては、該化合物を固定化し得る種々の水溶性ポリマーや、従来から生化学分野で担体として用いられる種々の水不溶性物質等が挙げられる。上記水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びその塩、ポリアミノ酸等が挙げられる。上記水不溶性物質としては、例えば、架橋デキストランや架橋アガロース等のクロマトグラフ用の担体として用いられてきたもの；ポリスチレン等のポリマービーズ；ガラスビーズ；ポリスチレンラテックス等のラテックス粒子などが挙げられる。
【００２２】担体に上記化合物を担持させる方法としては、既存の種々の方法が利用でき、例えば、ＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物もしくは、水溶性ポリマーや不溶性物質いずれか一方の水酸基をブロモシアンで活性化し、他方のアミノ基と反応させる方法、両方のアミノ基をグルタルアルデヒドで架橋する方法、またはいずれか一方のカルボキシル基と他方のアミノ基とを水溶性カルボジイミドのような試薬で縮合させる方法等の化学結合法が挙げられる。また、固相表面への上記化合物の固定化は、アルブミンなどの蛋白質にあらかじめ前記化学結合法により上記化合物を結合し、この結合体を物理吸着させることもできる。
【００２３】また、本発明に用いられるＤＰＧポケットに対する親和性を有する高分子化合物としては、１級又は２級アミンを有する高分子、例えばポリアリルアミンやポリリジン等の高分子の窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子、あるいはビニルホスホン酸等のホスホン基を有するモノマーの重合体などが挙げられ、特に、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体が好ましい。上記高分子の水素原子をメチレンホスホン酸基に置換する方法としては、１級又は２級アミンを有する高分子を直接前述のような反応を介してメチルホスホン化する方法等が挙げられる。
【００２４】上述したような種々のＤＰＧポケット親和性物質は、多価のリン酸基やホスホン酸基というアニオン性官能基を有するため、図１に示されるような、ヘモグロビンのβ鎖のヒスチジン、リジンなどの塩基性アミノ酸残基、及びβ鎖Ｎ末端バリンによって形成されるカチオン性を帯びたポケットに結合することができる。一方、ＨｂＡ１ｃにおいては、このＤＰＧポケット内のＮ末端バリンのアミノ基にグルコースが結合しているため、イオン相互作用が弱められ、上記の種々のＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡ１ｃとの親和性が低下する。
【００２５】本発明において、ＤＰＧポケットに対する親和性を利用し、血液中のＨｂＡｏ成分を定量する方法としては、抗原−抗体やリガンド−リセプター等の物質間の親和性を利用した既存の種々のアフィニティアッセイ法を用いることができる。
【００２６】上記定量方法としては、例えば、ＤＰＧポケットに対する親和性を有する水溶性高分子化合物と溶血液を混合し、前記高分子化合物へのＨｂＡｏの結合により、高分子化合物の溶解度が減少することによって生ずる濁度を直接的に測定する方法等が挙げられる。
【００２７】さらに別の方法としては、ラテックス等の水不溶性担体や水溶性ポリマーにＨｂＡｏを固定化したものと、水不溶性担体や水溶性ポリマーにＤＰＧポケット親和性物質を固定化したものとを混合することによって、凝集反応を起こさせ、その結果生じた濁度を測定する方法が用いられる。すなわち、溶血液中の遊離のＨｂＡｏ成分の濃度に応じて、上記凝集反応による濁度が減少することを利用した凝集阻止法が挙げられる。
【００２８】上記ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応体の濁度を測定する方法としては、例えば、既存の紫外可視分光光度計を用いる方法等が挙げられる。測定する波長は、ヘモグロビンやその他の血液成分が干渉しない波長であれば、いずれの波長を用いてもよく、特にヘモグロビンの干渉を避ける意味において、ＯＤ６３０ｎｍやＯＤ６６０ｎｍを用いるのが好ましい。
【００２９】その他、放射性同位元素、蛍光分子、酵素等のラベル物質を標識したＤＰＧポケット親和性物質と溶血液とを混合し、ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏ成分との結合体を分離し、用いたラベル物質に応じた検出手段でＨｂＡｏ成分を定量する方法が考えられる。上記ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏ成分との結合体の分離方法には、ラベル物質を標識したＤＰＧポケット親和性物質をプレートのような固相表面に固定化し、洗浄操作によって分離する方法、水不溶性の粒子担体に前記物質を固定化し、遠心洗浄する方法等、種々のアフィニティアッセイ法に用いられるいずれの方法であっても用いることができる。
【００３０】上記ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応は、反応液のｐＨや電気伝導度に強く影響を受ける。反応液のｐＨは、後述の実施例から明らかなように、低くなると血液中の蛋白質の変性の恐れが有り、高くなるとＨｂＡｏとの反応が極度に低下するので、５．０〜６．８であることが望ましい。本発明の反応に用いられる緩衝液は、ｐＨが５〜６．８の範囲で緩衝能を有するものであれば特に限定されないが、例えばリン酸緩衝液や、クエン酸緩衝液、フタル酸緩衝液等が好適である。
【００３１】また、反応液の電気伝導度は、後述の実施例から明らかなように、小さくなると緩衝液のｐＨ緩衝能が低くなって定量性が低下し、大きくなるとＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応が極度に低下するので、１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍであることが望ましい。
【００３２】反応液の電気伝導度を調整する際に用いられる塩類には、特に制限はないが、反応液のｐＨを変動させにくく、水への解離度の高い強酸と強塩基の塩類が好適であり、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）や塩化カリウム（ＫＣｌ）等が挙げられる。
【００３３】上述したように、ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応は、ＤＰＧポケット親和性物質の種類や濃度、検体である血液の希釈度、反応液のｐＨや電気伝導度によって変化するため、目的に応じて最適の条件が選択される。例えば、後述の実施例で詳しく述べるように、ＤＰＧポケット親和性物質としてポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を用い、ＨｂＡｏとの反応によるポリマーの溶解度の低下によって生じた濁度の変化からＨｂＡ１ｃを測定する場合を取り上げると、ポリマー濃度０．００２〜０．０１％、血液の希釈度２５０〜１０００倍希釈、反応液のｐＨ５〜６．８、電気伝導度１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍの範囲から、最適の条件を設定することができる。
【００３４】また、通常、ＨｂＡ１ｃの測定には全血が用いられるが、全血は赤血球分散液であるため、測定の際には、ヘモグロビンを赤血球膜外に溶出させるよう、赤血球をまず溶血させる必要がある。赤血球の溶血方法として既存の種々の方法を用いることができるが、例えば、古くからよく知られる蒸留水等の低張液での処理や、血液の凍結融解により赤血球を破壊せしめてもよく、また、通常、よく用いられる種々の溶血剤で赤血球を処理してもよい。このような溶血剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、高級脂肪族アルコール、スルホネート化合物及びサルフェート化合物のポリオキシエチレンエーテルソルビット脂肪酸エステルのポリオキシエチレン付加体等の界面活性剤が挙げられる。溶血剤の使用量は、その種類等によっても異なるが、通常血液１ｍｌ当たり、１０〜２００ｍｇである。溶血剤が過剰である場合には、ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応が阻害される場合があり、溶血液の適当な希釈が必要である。
【００３５】本発明で用いられる溶血液中の総ヘモグロビン量は、Drabkins法（National Commission for Clinical Laboratory Standards of the U.S.,Proposed Standard PSH-15）、シアンメト化法（ＨｉＣＮ法）（International Committee for Standarization in Haematology:J.Chin.Path.USA,31,139-143(1978)のようないかなる通常の方法によっても測定することができる。例えば、フェリシアン化カリウムで全ヘモグロビンをメトヘモグロビンに酸化し、５４０ｎｍの特徴的な吸収を測定する方法である。また、メトヘモグロビンをさらにシアン化カリウムやチオシアン酸塩で処理することによって、シアンメトヘモグロビンやチオシアンメトヘモグロビンとして測定することも可能である。
【００３６】通常、糖尿病の臨床検査において、ＨｂＡ１ｃの値は、総ヘモグロビンに対する相対パーセンテージで評価される。本発明のように、ＨｂＡｏ量と総Ｈｂ量を別々に測定し、総Ｈｂ量からＨｂＡｏ量を差し引き、ＨｂＡ１ｃ量を測定する方法は、ＨｂＡ１ｃの値を自動的に総Ｈｂに対する相対パーセンテージに換算できるため都合がよい。また、後述の実施例から明らかなように、本発明によるＤＰＧポケット親和性物質は、天然ＨｂＡｏ（Ｆｅ2+）でも、シアンメト化ＨｂＡｏ（Ｆｅ3+）でも同様に反応するので、例えば全血を検体とする場合にも、溶血操作において、メト化処理を同時に行うことによって、総Ｈｂ量とＨｂＡｏ量を同時に測定することが可能である。
【００３７】また、本発明によるＨｂＡ１ｃの測定方法は、後述の実施例からも明らかなように不安定型ＨｂＡ１ｃの影響を受けないため、食物等の摂取による血糖値の影響を受けず、正確な測定値が得られる。
【００３８】
【実施例】次に、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００３９】実施例１＜ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の合成＞ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績（株）、分子量７５００〜１１，０００）５．７ｇとホスホン酸（ナカライテスク社製）１６．４ｇを１００ｍｌの脱イオン水に溶解し、セパラブルフラスコに入れた。これに、温度計、攪拌棒、還流管、滴下ロートをセットした。次に、濃塩酸（１１．３３Ｎ）１００ｍｌ添加し、マントルヒーターにて加熱した。還流状態に達したところで、滴下ロートに６０ｍｌのホルムアルデヒド水（３７重量％）を入れ、１時間かけてゆっくり滴下し、さらに１時間反応を続けた。次に、この溶液を室温に冷却し、水酸化ナトリウム５４ｇを加えた。次にこの溶液を約８００ｍｌのアセトンにコマゴメピペットを用いてゆっくり滴下し、白色沈殿を生成させた。この沈殿物を吸引ロートを用いて濾過した。沈殿物は、アセトン：水＝４：１の溶液で３回洗浄濾過し、沈殿物をスパーテルでサンプル瓶に回収し、約２００ｍｌの脱イオン水を少量ずつ加えながら、沈殿物を泥濘状にし、これを透析チューブにつめ、脱イオン水に一昼夜以上、外液を５回交換して、透析した。透析チューブ内で溶解した沈殿物をもう一度アセトンに滴下し、沈殿させ、上記のように濾過し、室温で減圧乾燥し、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体６．４ｇを得た。
【００４０】＜ＤＰＧポケット親和性の評価＞実施例２実施例１で合成したポリアリルアミンのホスホン酸誘導体のＤＰＧポケットに対する親和性を評価するため、不安定型ＨｂＡ１ｃ除去能を測定した。はじめに、健常人からアングロットＧ（１滴／ｍｌ）添加血を採取し、採取した血液にグルコースを１ｇ／ｄｌになるように添加した。これを３７℃で３時間処理し、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃを含有する血液を作成し、試験血液とした。
【００４１】不安定型ＨｂＡ１ｃ除去能は、（株）京都第一化学製のＡｕｔｏ−Ａ１ｃＨＡ−８１２１を用いて測定した。このＡｕｔｏ−Ａ１ｃＨＡ−８１２１は、ＨＰＬＣによる糖化ヘモグロビン測定専用装置であり、本装置専用の陽イオン交換樹脂を充填した分離カラムにより、各ヘモグロビン成分を分離して測定する装置である。本装置を用いて、上記のグルコース添加処理を行っていない血液を測定したときの結果を図２（イ）に示す。また、上記のグルコース添加処理を行い、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃを含有する血液を分析したときの測定結果を図２（ロ）に示す。血液の溶血には、本装置専用の溶血剤を含有する溶血用緩衝液を用い、その他の装置の使用方法の詳細は、本装置の取扱説明書に従った。
【００４２】上記のポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を溶血用緩衝液に０．０７４％になるように溶解し、この溶液４５０μｌに３μｌの高濃度不安定型ＨｂＡ１ｃ含有血液を添加し、４分間反応後に上記装置で測定した。測定結果を図２（ハ）に示す。図２（イ）、（ロ）及び（ハ）において、Ｐ１及びＰ２はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ（ＨｂＡ１ａ＋ｂ）に起因するピーク、Ｐ３は安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピーク、Ｐ３' は不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピーク、Ｐ４はＨｂＡｏに起因するピーク、Ｐ５は胎児性ヘモグロビンに起因するピークである。上記の測定結果から明らかなように、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピークを減少させ、ＤＰＧポケット親和性を有することが示された。
【００４３】比較例１実施例２と同様にポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績（株）、分子量７５００〜１１，０００）を溶血用緩衝液に０．１８％になるように溶解し、この溶液４５０μｌに３μｌの高濃度不安定型ＨｂＡ１ｃ含有血液を添加し、４分間反応後に上記装置で測定した。測定結果を図２R>２（ニ）に示す。ホスホン酸誘導体にしていないポリアリルアミンでは、不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピークの減少は見られず、ＤＰＧポケット親和性を示さなかった。図２（ニ）において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ３' 、Ｐ４及びＰ５は上記実施例２と同様である。
【００４４】＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーとＨｂＡｏとの反応性評価−ＨｂＡｏ濃度依存性−＞実施例３実施例１に示したように合成したポリアリルアミンのホスホン酸誘導体のヒトＨｂＡｏとの反応性を評価した。ヒトＨｂＡｏは、Ｓｉｇｍａ社より購入したもの（Ｌｏｔ６２Ｈ９３１０、純度９０％以上）を用いた。反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２４）、１０ｍＭＮａＣｌを用い、この反応液に図３に示すような最終濃度でヒトＨｂＡｏを溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４％になるように添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６３０ｎｍで測定した。結果を図３に示す。図３から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ヒトＨｂＡｏと反応し、その濃度に依存して濁度が増加した。特に、ヒトＨｂＡｏ０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲では良い直線性を示した。
【００４５】比較例２ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の代わりにポリアリルアミン塩酸塩を用いて、実施例３と同様に行った。測定結果は、図３に実施例３の測定結果と一緒に示す。この結果から明らかなように、ホスホン酸誘導体化していないポリアリルアミンは、ヒトＨｂＡｏに反応しなかった。
【００４６】実施例４＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーとＨｂＡｏとの反応性評価−ｐＨ依存性−＞１／１５ＭＮａ2 ＨＰＯ4 溶液と１／１５ＭＫＨ2 ＰＯ4 溶液とを種々の比率で混合し、Ｓφｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液を調製し、それを１０ｍＭになるように希釈した。各々のｐＨの緩衝液にヒトＨｂＡｏを最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４％になるように添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６３０ｎｍで測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ｐＨ５〜６．８でヒトＨｂＡｏと反応し、濁度の増加が見られた。ｐＨが６．８より高い場合には、急激な濁度の低下が見られた。
【００４７】実施例５＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーとＨｂＡｏとの反応性評価−電気伝導度依存性−＞反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液を用い、これに種々の濃度になるようにＮａＣｌを添加した。各々のＮａＣｌ濃度の緩衝液にヒトＨｂＡｏを最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６６０ｎｍで測定した。図５（イ）には、ｐＨ６．２１、ポリマー濃度０．００４％の時の測定結果を、図５（ロ）には、ｐＨ６．００、ポリマー濃度０．００６％の時の測定結果を、それぞれ示す。これらの測定結果から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体とヒトＨｂＡｏとの反応による濁度は、ｐＨやポリマー濃度が異なると電気伝導度依存性も異なるパターンを示し、各条件において最適の電気伝導度（言い換えればＮａＣｌ濃度）があることがわかる。
【００４８】実施例６＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーの特異性評価＞上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の特異性を評価した。ヒトＨｂＡ１ｃは、以下の方法によって精製したものを用いた。
【００４９】−ヒトＨｂＡ１ｃの精製方法−健常人ボランティアから採取した新鮮ヘパリン加血４０ｍｌ（ノボヘパリン１０Ｕ／ｍｌ）を１，５００Ｇで遠心し、沈殿赤血球を生理食塩水で３回で遠心洗浄した。この洗浄赤血球に８．８ｇ／ｌＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌテトラポリリン酸ナトリウム（ナカライテスク）溶液（ｐＨ＝６．５）を４５０ｍｌ添加し、３７℃で５時間間欠的に、ゆっくりと攪拌した。この溶液から、再度遠心操作（４℃）によって、沈殿赤血球を回収し、赤血球とほぼ同体積の冷却脱イオン水を添加し、赤血球を溶血させた。この溶血液のｐＨを氷浴下で５．０にあわせ、３０分攪拌し、５，０００Ｇで２０分遠心した。この上澄みのｐＨを氷浴下で７．０に合わせ、３０分攪拌し、５，０００Ｇで２０分遠心した。この上澄みを透析チューブに詰めて、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝６．３）に、外液を３回交換して２日間にわたって透析した。この透析後の溶血液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、濾液をＨＰＬＣシステム（島津製作所社製ＬＣ９Ａ）及びＭｅｒｃｋ社製フラクトゲル（ＥＭＤ−ＳＯ3 −６５０、２５〜４０μｍ）充填ステンレスカラム（φ３０×１００ｍｍ）を用い、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．１）、３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．１）の２液グラジエントによって分離精製した。
【００５０】上記のように、精製したヒトＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡｏ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ６２Ｈ９３１０、純度９０％以上）、及び松原（蛋白質、核酸、酵素、Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．６，１９８７，ｐ２２３−２２６）の方法によってＨｂＡｏをvan Kampen-Zijlstra reagent modified by Matsubara 液（Ｋ3 Ｆｅ（ＣＮ）6 ２００ｍｇ／ｌ、ＫＣＮ５０ｎｇ／ｌ、トリトンＸ−１００；０．１％（ｗ／ｗ）、Ｍ／３０ｐＨ７．２リン酸緩衝液）で処理したシアンメト化ヘモグロビンを用い、それぞれ図６に示すような最終濃度になるように、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の反応溶液に溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００６％になるように添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６６０ｎｍで測定した。結果を図６に示す。図６から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ＨｂＡｏとは反応するがＨｂＡ１ｃとの反応性は大きく低下した。一方、これはシアンメト化ヘモグロビン（ＨｉＣＮ）とはＨｂＡｏ同様の反応性を示した。
【００５１】実施例７＜不安定型ＨｂＡ１ｃの影響＞健常人ボランティアから採取した新鮮ヘパリン加血（ノボヘパリン１０Ｕ／ｍｌ）１０ｍｌに、グルコースを１、２、５、１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６時間及び４℃で一昼夜反応させ、不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含有する血液試料を調製した。次に、０．００６％ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体、０．１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２４）の溶液２．５ｍｌに、上記血液試料５μｌを添加し、５分後に生じた濁度を実施例３と同様の方法で測定した。結果を図７に示す。測定結果から明らかなように、グルコース添加によって濁度はほとんど変化せず、不安定型ＨｂＡ１ｃの影響はほとんどなかった。
【００５２】実施例８＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーによるＨｂＡ１ｃの定量＞実施例２で用いた溶血用緩衝液に実施例１で合成したポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を０．００６％になるように溶解した。この溶液２．５ｍｌと種々の濃度になるようにＨｂＡｏ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ６２Ｈ９３１０、純度９０％以上）を添加したヒト血漿５μｌとを反応させ、生じた濁度を実施例３と同様の方法で測定し、ＨｂＡｏの検量線を作成した。結果を図８に示す。次に、ヒト血液検体０．０２ｍｌをvan kampen-Zijlstra reagent modified by Matsubara 液５．０ｍｌに添加し、シアンメト化した。この溶液のＯＤ５４０ｎｍの吸光度を前記試薬を対照に測定し、総Ｈｂ量を求めた。次に、ヒト血液検体５μｌを前記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を溶解した溶血用緩衝液２．５ｍｌに添加し、５分後に生じた濁度を実施例３と同様の方法で測定した。この測定値と前述のＨｂＡｏの検量線から、検体中のＨｂＡｏ量を算出した。次に、以下の計算式により、検体のＨｂＡ１ｃ量（％）を求めた。
ＨｂＡ１ｃ（％）＝｛１−（ＨｂＡｏ量／総Ｈｂ量）｝×１００
【００５３】また、同一の検体を実施例１で用いた糖化ヘモグロビン測定専用装置（Ａｕｔｏ−Ａ１ｃＨＡ−８１２１）で測定し（ＨＰＬＣ法）、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関性を評価した。結果を図９に示す。
【００５４】
【発明の効果】本発明のＤＰＧポケット親和性物質を利用したＨｂＡ１ｃ測定方法は、上記のようにＨｂＡｏのＤＰＧポケットに上記物質が結合するため、同時に不安定型ＨｂＡ１ｃをグルコースとＨｂＡｏに解離させ、安定型のＨｂＡ１ｃを測定できる。そのため、一次的な血糖上昇もしくは下降に左右されることなく、より信頼度の高い測定値が得られ、しかも簡単に測定できる。また、ＤＰＧポケット親和性物質は抗体等に比べて低コストで製造できるため、安価な試薬を供給できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｂＡｏを示す模式図である。
【図２】ＨＰＬＣによる糖化ヘモグロビン測定専用装置を用いてヘモグロビン成分を測定した結果を示すグラフである。
【図３】ヘモグロビンＡｏの濃度に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図４】ｐＨに対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図５】電気伝導度（ＮａＣｌ濃度）に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図６】ヘモグロビン濃度Ａｏに対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図７】グルコース濃度に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図８】ヘモグロビンＡｏ濃度に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した時のヘモグロビンＡｏの検量線を示すグラフである。
【図９】同一の検体について、本発明による方法とＨＰＬＣ法のそれぞれでＨｂＡ１ｃの定量を行った時の相関性を示すグラフである。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビンＡｏを定量する方法、および糖尿病のマーカーの一つである血液中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病の指標の一つとして、血液中に含まれる糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下ＨｂＡ１ｃ）が知られ、臨床検査の分野において、広くその測定が行われている。また、ＨｂＡ１ｃは、患者の約１〜２ケ月前の血糖値と良く相関することから、糖尿病患者の病態把握において、その臨床的意義も高まってきている。
【０００３】ＨｂＡ１ｃは、下記式に示されるように、β鎖Ｎ末端に存在するバリンのアミノ基にグルコースが非酵素的に結合した複合体である。下記式においてβＡ−ＮＨ2 は、ヘモグロビンＡｏ（以下ＨｂＡｏ）を示し、その中のＮＨ2 は該ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端であるバリンのアミノ基を示す。即ち、ヘモグロビンのアミノ基にグルコースが結合すると、まず、シッフ塩基である不安定型ＨｂＡ１ｃ（Ｉ）が形成され、この不安定型ＨｂＡ１ｃ（Ｉ）はさらにアマドリ転移反応の結果ケトアミン型の安定型ＨｂＡ１ｃ（II）に変化する。臨床的に重要なＨｂＡ１ｃは、血糖値に左右されない安定型ＨｂＡ１ｃ（II）である。
【０００４】
【化１】
【０００５】従来、血液中のＨｂＡ１ｃを測定するには、血液を溶血させ、その後、イオン交換クロマトグラフィーの原理に基づいて、グリシコル化及び非グリシコル化ヘモグロビンを高速液体クロマトグラフィーにより分離し、測定する方法が主流であった。しかしながら、この方法では、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃをクロマトグラフィーで分離することが難しく、血糖値によって変動する不安定型ＨｂＡ１ｃの量が測定値に影響するという欠点がある。そのため、ジヒドロキシボリル化合物（特開昭５８−５１００２４号公報）や２，３−ジホスホグリセリン酸ポケット親和性物質（特開昭６３−２９８０６３号公報、特開平２−２５９４６７号公報）が、上記不安定型ＨｂＡ１ｃをＨｂＡｏとグルコースに解離させ、測定系から除外する目的で用いられている。しかしながら、上記の高速液体クロマトグラフィーを用いる方法は、いずれにしても、特殊な分離カラムを用いた専用の装置が必要であるためコストが高く、測定に時間がかかるという欠点があった。
【０００６】また、高速液体クロマトグラフィーを用いない方法としては、ボロン酸がシス−ジオール基を有する炭水化物部分を結合することを利用した方法が特表平−５０６７０３号公報に開示されている。この方法は、蛍光物質などでラベルした有機ボロン酸と血液を接触させ、生成した沈殿物を遠心分離し、有機溶剤に再溶解後、ラベル分子を測定するというものである。しかしながら、この方法は、血液中に大量に存在するグルコースや、グルコース以外のシス−ジオール基を有する炭水化物が測定値に影響を与える恐れがあり、また、ラベルした有機ボロン酸が、ＨｂＡ１ｃ以外の糖化蛋白質とも結合することから、正確な測定はできない。また、沈殿物の遠心分離や有機溶剤による再溶解という煩雑な操作が必要である。
【０００７】また、高速液体クロマトグラフィーを用いない別の方法としては、ＨｂＡ１ｃに対して特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いた多くの方法が開示されている（特開昭５４−１４５２１０、特開昭６１−１７２０６４、特開昭６３−２７７９６７、特開平０２−８７４３、特開平０６−１１５１０）。しかしながら、これらの方法では、ＨｂＡ１ｃに特有の抗原決定基がグルコースの結合したＮ末端バリン残基を含む部分にあり、この部分が分子外に露出しておらず、容易に抗体と結合できないため、変性を目的にした種々の煩雑な前処理が必要である。また、これらの免疫反応を利用した方法では、モノクローナル抗体の場合には、細胞培養等の特殊な技術が必要であり、また長期間の細胞培養の過程でハイブリドーマの変異といった問題点があり、ポリクローナル抗体の場合には、抗血清のロット間差、長期間に及ぶ動物への免疫が必要であるという問題点がある。また、いずれの場合にも、抗体の精製工程が必要であり、コストが高くなる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の欠点を解決するものであり、従来よりも、低コストで、簡単に血液中のＨｂＡ１ｃを特異的に測定する方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ＨｂＡｏは、一般に、図１R>１の模式図に示されるような、α2 β2 の４量体構造をなしており、β鎖の会合部に２，３−ジホスホグリセリン酸が結合するポケット（以下ＤＰＧポケットともいう）が存在する。血液中の２，３−ジホスホグリセリン酸は、このＤＰＧポケットに結合することにより、ヘモグロビン（以下Ｈｂともいう）の酸素解離能をアロステリックに調節していることが知られている（今井清博、蛋白質、核酸、酵素、Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．６，８１−８８，１９８７）。ＨｂＡ１ｃは、このポケットの中にグルコースが入り込んでβ鎖Ｎ末端バリンと結合し、生成すると考えられている。
【００１０】本発明者らは、鋭意研究の結果、上記ＤＰＧポケットに対する種々の親和性物質が、ＨｂＡｏに特異的に反応することを利用することによって、血液中のＨｂＡｏを定量し得ることを発見し本発明に到達した。
【００１１】すなわち、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質（以下ＤＰＧポケット親和性物質ともいう）と溶血液とを反応させ、前記ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液中のＨｂＡｏとの反応体を定量し、得られた値を別に求めた総ヘモグロビン量から差し引くことによって、血液中のＨｂＡ１ｃ量を測定することを特徴とするものである。
【００１２】また、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、前記方法において、ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液中のＨｂＡｏとの反応体の定量において、濁度を求めることにより定量することを特徴とするものである。
【００１３】また、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、前記方法において、ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液とを反応させるときの溶液のｐＨが５〜６．８であることを特徴とするものである。
【００１４】さらに、本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、前記方法において、ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液とを反応させるときの溶液の電気伝導度が１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍであることを特徴とするものである。
【００１５】本発明によるＨｂＡ１ｃ測定方法は、より詳細には下記の通りである。
(1) 全血の赤血球を後述する種々の方法で溶血させ、(2) この溶血液とＤＰＧポケット親和性物質とを反応させ、(3) 上記ＤＰＧポケット親和性物質と溶血液中のＨｂＡｏとの反応体を後述する種々の方法で定量することによって、ＨｂＡｏを定量し、(4) 溶血液中の総Ｈｂ量を後述する種々の方法で定量し、(5) 以下の計算式により、血中のＨｂＡ１ｃ量（％）を計算する。
【００１６】ＨｂＡ１ｃ（％）＝｛１−（ＨｂＡｏ量／総Ｈｂ量）｝×１００
【００１７】本発明で用いられるＤＰＧポケット親和性物質とは、ＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物及びそれらが担持された担体、又はＤＰＧポケットに対する親和性を有する高分子化合物であり、特に、メチレンホスホン酸基又はホスホン基を有する高分子化合物が好ましい。
【００１８】上記ＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物としては、特開昭６３−２９８０６３号公報、特開平２−２５９４６７号公報に不安定型ＨｂＡ１ｃ解離剤として開示されているリン酸縮合体やフィチン酸もしくはフィチン酸の塩のような多価リン酸化合物が挙げられる。上記リン酸縮合体としては、（ＨＰＯ3 ）ｎ（ｎは２以上の整数）で表されるメタリン酸、２原子以上のリンを含みＰ−Ｏ−Ｐ−結合を有するポリリン酸及びそれらの類似体が挙げられ、メタリン酸としては、トリメタリン酸、テトラメタリン酸等が、ポリリン酸としては、ピロリン酸、テトラポリリン酸等が挙げられる。
【００１９】さらに、本発明で用いられるＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物には、アンモニア、１級及び２級アミンの窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換されてなる化合物が用いられる。上記アミンとしては、種々のアルキルモノアミンやアミノ酸、直鎖アルキレンジアミン、ジアミノシクロヘキサン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、グリコールエーテルジアミン等が挙げられる。さらに、上記分子中の水素原子がアルキル基、水酸基などに置換された化合物を用いることもでき、例えばエチレンジアミンの１置換体として、炭素原子にメチル基が導入された１，２−ジアミノプロパン、プロピレンジアミンの１置換体として、水酸基が導入された１，３−ジアミノ−２−プロパノール等が挙げられる。
【００２０】上記のメチレンホスホン酸基置換体の製造方法としては、古くから種々の方法が知られている。例えば、Irani,R,R 等、J.Org. Chem. 31, 1603 (1966)によって開発された方法が挙げられる。これは、アミン、ホルマリン及び亜リン酸のMannich 反応を利用したものであり、ホスホン酸誘導体の合成方法として優れた方法である。また、Motekaitis, R. J. 等、J.inorg. nucl.Chem．33,3353 （1971) によって開発された方法も上記置換体の製造方法として利用できる。これは、クロロメチレンホスフィン酸を用いて、まずアミノ酸の水素原子をメチレンホスフィン酸に置換し、続いて塩化水銀を加えて加熱し、メチレンホスフィン酸をメチレンホスホン酸に酸化する方法であり、得られるメチレンホスホン酸置換体の純度も高く好ましい。
【００２１】前記化合物が担持される担体としては、該化合物を固定化し得る種々の水溶性ポリマーや、従来から生化学分野で担体として用いられる種々の水不溶性物質等が挙げられる。上記水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びその塩、ポリアミノ酸等が挙げられる。上記水不溶性物質としては、例えば、架橋デキストランや架橋アガロース等のクロマトグラフ用の担体として用いられてきたもの；ポリスチレン等のポリマービーズ；ガラスビーズ；ポリスチレンラテックス等のラテックス粒子などが挙げられる。
【００２２】担体に上記化合物を担持させる方法としては、既存の種々の方法が利用でき、例えば、ＤＰＧポケットに対する親和性を有する化合物もしくは、水溶性ポリマーや不溶性物質いずれか一方の水酸基をブロモシアンで活性化し、他方のアミノ基と反応させる方法、両方のアミノ基をグルタルアルデヒドで架橋する方法、またはいずれか一方のカルボキシル基と他方のアミノ基とを水溶性カルボジイミドのような試薬で縮合させる方法等の化学結合法が挙げられる。また、固相表面への上記化合物の固定化は、アルブミンなどの蛋白質にあらかじめ前記化学結合法により上記化合物を結合し、この結合体を物理吸着させることもできる。
【００２３】また、本発明に用いられるＤＰＧポケットに対する親和性を有する高分子化合物としては、１級又は２級アミンを有する高分子、例えばポリアリルアミンやポリリジン等の高分子の窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子、あるいはビニルホスホン酸等のホスホン基を有するモノマーの重合体などが挙げられ、特に、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体が好ましい。上記高分子の水素原子をメチレンホスホン酸基に置換する方法としては、１級又は２級アミンを有する高分子を直接前述のような反応を介してメチルホスホン化する方法等が挙げられる。
【００２４】上述したような種々のＤＰＧポケット親和性物質は、多価のリン酸基やホスホン酸基というアニオン性官能基を有するため、図１に示されるような、ヘモグロビンのβ鎖のヒスチジン、リジンなどの塩基性アミノ酸残基、及びβ鎖Ｎ末端バリンによって形成されるカチオン性を帯びたポケットに結合することができる。一方、ＨｂＡ１ｃにおいては、このＤＰＧポケット内のＮ末端バリンのアミノ基にグルコースが結合しているため、イオン相互作用が弱められ、上記の種々のＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡ１ｃとの親和性が低下する。
【００２５】本発明において、ＤＰＧポケットに対する親和性を利用し、血液中のＨｂＡｏ成分を定量する方法としては、抗原−抗体やリガンド−リセプター等の物質間の親和性を利用した既存の種々のアフィニティアッセイ法を用いることができる。
【００２６】上記定量方法としては、例えば、ＤＰＧポケットに対する親和性を有する水溶性高分子化合物と溶血液を混合し、前記高分子化合物へのＨｂＡｏの結合により、高分子化合物の溶解度が減少することによって生ずる濁度を直接的に測定する方法等が挙げられる。
【００２７】さらに別の方法としては、ラテックス等の水不溶性担体や水溶性ポリマーにＨｂＡｏを固定化したものと、水不溶性担体や水溶性ポリマーにＤＰＧポケット親和性物質を固定化したものとを混合することによって、凝集反応を起こさせ、その結果生じた濁度を測定する方法が用いられる。すなわち、溶血液中の遊離のＨｂＡｏ成分の濃度に応じて、上記凝集反応による濁度が減少することを利用した凝集阻止法が挙げられる。
【００２８】上記ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応体の濁度を測定する方法としては、例えば、既存の紫外可視分光光度計を用いる方法等が挙げられる。測定する波長は、ヘモグロビンやその他の血液成分が干渉しない波長であれば、いずれの波長を用いてもよく、特にヘモグロビンの干渉を避ける意味において、ＯＤ６３０ｎｍやＯＤ６６０ｎｍを用いるのが好ましい。
【００２９】その他、放射性同位元素、蛍光分子、酵素等のラベル物質を標識したＤＰＧポケット親和性物質と溶血液とを混合し、ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏ成分との結合体を分離し、用いたラベル物質に応じた検出手段でＨｂＡｏ成分を定量する方法が考えられる。上記ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏ成分との結合体の分離方法には、ラベル物質を標識したＤＰＧポケット親和性物質をプレートのような固相表面に固定化し、洗浄操作によって分離する方法、水不溶性の粒子担体に前記物質を固定化し、遠心洗浄する方法等、種々のアフィニティアッセイ法に用いられるいずれの方法であっても用いることができる。
【００３０】上記ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応は、反応液のｐＨや電気伝導度に強く影響を受ける。反応液のｐＨは、後述の実施例から明らかなように、低くなると血液中の蛋白質の変性の恐れが有り、高くなるとＨｂＡｏとの反応が極度に低下するので、５．０〜６．８であることが望ましい。本発明の反応に用いられる緩衝液は、ｐＨが５〜６．８の範囲で緩衝能を有するものであれば特に限定されないが、例えばリン酸緩衝液や、クエン酸緩衝液、フタル酸緩衝液等が好適である。
【００３１】また、反応液の電気伝導度は、後述の実施例から明らかなように、小さくなると緩衝液のｐＨ緩衝能が低くなって定量性が低下し、大きくなるとＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応が極度に低下するので、１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍであることが望ましい。
【００３２】反応液の電気伝導度を調整する際に用いられる塩類には、特に制限はないが、反応液のｐＨを変動させにくく、水への解離度の高い強酸と強塩基の塩類が好適であり、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）や塩化カリウム（ＫＣｌ）等が挙げられる。
【００３３】上述したように、ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応は、ＤＰＧポケット親和性物質の種類や濃度、検体である血液の希釈度、反応液のｐＨや電気伝導度によって変化するため、目的に応じて最適の条件が選択される。例えば、後述の実施例で詳しく述べるように、ＤＰＧポケット親和性物質としてポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を用い、ＨｂＡｏとの反応によるポリマーの溶解度の低下によって生じた濁度の変化からＨｂＡ１ｃを測定する場合を取り上げると、ポリマー濃度０．００２〜０．０１％、血液の希釈度２５０〜１０００倍希釈、反応液のｐＨ５〜６．８、電気伝導度１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍの範囲から、最適の条件を設定することができる。
【００３４】また、通常、ＨｂＡ１ｃの測定には全血が用いられるが、全血は赤血球分散液であるため、測定の際には、ヘモグロビンを赤血球膜外に溶出させるよう、赤血球をまず溶血させる必要がある。赤血球の溶血方法として既存の種々の方法を用いることができるが、例えば、古くからよく知られる蒸留水等の低張液での処理や、血液の凍結融解により赤血球を破壊せしめてもよく、また、通常、よく用いられる種々の溶血剤で赤血球を処理してもよい。このような溶血剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、高級脂肪族アルコール、スルホネート化合物及びサルフェート化合物のポリオキシエチレンエーテルソルビット脂肪酸エステルのポリオキシエチレン付加体等の界面活性剤が挙げられる。溶血剤の使用量は、その種類等によっても異なるが、通常血液１ｍｌ当たり、１０〜２００ｍｇである。溶血剤が過剰である場合には、ＤＰＧポケット親和性物質とＨｂＡｏとの反応が阻害される場合があり、溶血液の適当な希釈が必要である。
【００３５】本発明で用いられる溶血液中の総ヘモグロビン量は、Drabkins法（National Commission for Clinical Laboratory Standards of the U.S.,Proposed Standard PSH-15）、シアンメト化法（ＨｉＣＮ法）（International Committee for Standarization in Haematology:J.Chin.Path.USA,31,139-143(1978)のようないかなる通常の方法によっても測定することができる。例えば、フェリシアン化カリウムで全ヘモグロビンをメトヘモグロビンに酸化し、５４０ｎｍの特徴的な吸収を測定する方法である。また、メトヘモグロビンをさらにシアン化カリウムやチオシアン酸塩で処理することによって、シアンメトヘモグロビンやチオシアンメトヘモグロビンとして測定することも可能である。
【００３６】通常、糖尿病の臨床検査において、ＨｂＡ１ｃの値は、総ヘモグロビンに対する相対パーセンテージで評価される。本発明のように、ＨｂＡｏ量と総Ｈｂ量を別々に測定し、総Ｈｂ量からＨｂＡｏ量を差し引き、ＨｂＡ１ｃ量を測定する方法は、ＨｂＡ１ｃの値を自動的に総Ｈｂに対する相対パーセンテージに換算できるため都合がよい。また、後述の実施例から明らかなように、本発明によるＤＰＧポケット親和性物質は、天然ＨｂＡｏ（Ｆｅ2+）でも、シアンメト化ＨｂＡｏ（Ｆｅ3+）でも同様に反応するので、例えば全血を検体とする場合にも、溶血操作において、メト化処理を同時に行うことによって、総Ｈｂ量とＨｂＡｏ量を同時に測定することが可能である。
【００３７】また、本発明によるＨｂＡ１ｃの測定方法は、後述の実施例からも明らかなように不安定型ＨｂＡ１ｃの影響を受けないため、食物等の摂取による血糖値の影響を受けず、正確な測定値が得られる。
【００３８】
【実施例】次に、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００３９】実施例１＜ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の合成＞ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績（株）、分子量７５００〜１１，０００）５．７ｇとホスホン酸（ナカライテスク社製）１６．４ｇを１００ｍｌの脱イオン水に溶解し、セパラブルフラスコに入れた。これに、温度計、攪拌棒、還流管、滴下ロートをセットした。次に、濃塩酸（１１．３３Ｎ）１００ｍｌ添加し、マントルヒーターにて加熱した。還流状態に達したところで、滴下ロートに６０ｍｌのホルムアルデヒド水（３７重量％）を入れ、１時間かけてゆっくり滴下し、さらに１時間反応を続けた。次に、この溶液を室温に冷却し、水酸化ナトリウム５４ｇを加えた。次にこの溶液を約８００ｍｌのアセトンにコマゴメピペットを用いてゆっくり滴下し、白色沈殿を生成させた。この沈殿物を吸引ロートを用いて濾過した。沈殿物は、アセトン：水＝４：１の溶液で３回洗浄濾過し、沈殿物をスパーテルでサンプル瓶に回収し、約２００ｍｌの脱イオン水を少量ずつ加えながら、沈殿物を泥濘状にし、これを透析チューブにつめ、脱イオン水に一昼夜以上、外液を５回交換して、透析した。透析チューブ内で溶解した沈殿物をもう一度アセトンに滴下し、沈殿させ、上記のように濾過し、室温で減圧乾燥し、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体６．４ｇを得た。
【００４０】＜ＤＰＧポケット親和性の評価＞実施例２実施例１で合成したポリアリルアミンのホスホン酸誘導体のＤＰＧポケットに対する親和性を評価するため、不安定型ＨｂＡ１ｃ除去能を測定した。はじめに、健常人からアングロットＧ（１滴／ｍｌ）添加血を採取し、採取した血液にグルコースを１ｇ／ｄｌになるように添加した。これを３７℃で３時間処理し、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃを含有する血液を作成し、試験血液とした。
【００４１】不安定型ＨｂＡ１ｃ除去能は、（株）京都第一化学製のＡｕｔｏ−Ａ１ｃＨＡ−８１２１を用いて測定した。このＡｕｔｏ−Ａ１ｃＨＡ−８１２１は、ＨＰＬＣによる糖化ヘモグロビン測定専用装置であり、本装置専用の陽イオン交換樹脂を充填した分離カラムにより、各ヘモグロビン成分を分離して測定する装置である。本装置を用いて、上記のグルコース添加処理を行っていない血液を測定したときの結果を図２（イ）に示す。また、上記のグルコース添加処理を行い、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃを含有する血液を分析したときの測定結果を図２（ロ）に示す。血液の溶血には、本装置専用の溶血剤を含有する溶血用緩衝液を用い、その他の装置の使用方法の詳細は、本装置の取扱説明書に従った。
【００４２】上記のポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を溶血用緩衝液に０．０７４％になるように溶解し、この溶液４５０μｌに３μｌの高濃度不安定型ＨｂＡ１ｃ含有血液を添加し、４分間反応後に上記装置で測定した。測定結果を図２（ハ）に示す。図２（イ）、（ロ）及び（ハ）において、Ｐ１及びＰ２はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ（ＨｂＡ１ａ＋ｂ）に起因するピーク、Ｐ３は安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピーク、Ｐ３' は不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピーク、Ｐ４はＨｂＡｏに起因するピーク、Ｐ５は胎児性ヘモグロビンに起因するピークである。上記の測定結果から明らかなように、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピークを減少させ、ＤＰＧポケット親和性を有することが示された。
【００４３】比較例１実施例２と同様にポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績（株）、分子量７５００〜１１，０００）を溶血用緩衝液に０．１８％になるように溶解し、この溶液４５０μｌに３μｌの高濃度不安定型ＨｂＡ１ｃ含有血液を添加し、４分間反応後に上記装置で測定した。測定結果を図２R>２（ニ）に示す。ホスホン酸誘導体にしていないポリアリルアミンでは、不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピークの減少は見られず、ＤＰＧポケット親和性を示さなかった。図２（ニ）において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ３' 、Ｐ４及びＰ５は上記実施例２と同様である。
【００４４】＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーとＨｂＡｏとの反応性評価−ＨｂＡｏ濃度依存性−＞実施例３実施例１に示したように合成したポリアリルアミンのホスホン酸誘導体のヒトＨｂＡｏとの反応性を評価した。ヒトＨｂＡｏは、Ｓｉｇｍａ社より購入したもの（Ｌｏｔ６２Ｈ９３１０、純度９０％以上）を用いた。反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２４）、１０ｍＭＮａＣｌを用い、この反応液に図３に示すような最終濃度でヒトＨｂＡｏを溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４％になるように添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６３０ｎｍで測定した。結果を図３に示す。図３から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ヒトＨｂＡｏと反応し、その濃度に依存して濁度が増加した。特に、ヒトＨｂＡｏ０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲では良い直線性を示した。
【００４５】比較例２ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の代わりにポリアリルアミン塩酸塩を用いて、実施例３と同様に行った。測定結果は、図３に実施例３の測定結果と一緒に示す。この結果から明らかなように、ホスホン酸誘導体化していないポリアリルアミンは、ヒトＨｂＡｏに反応しなかった。
【００４６】実施例４＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーとＨｂＡｏとの反応性評価−ｐＨ依存性−＞１／１５ＭＮａ2 ＨＰＯ4 溶液と１／１５ＭＫＨ2 ＰＯ4 溶液とを種々の比率で混合し、Ｓφｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液を調製し、それを１０ｍＭになるように希釈した。各々のｐＨの緩衝液にヒトＨｂＡｏを最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４％になるように添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６３０ｎｍで測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ｐＨ５〜６．８でヒトＨｂＡｏと反応し、濁度の増加が見られた。ｐＨが６．８より高い場合には、急激な濁度の低下が見られた。
【００４７】実施例５＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーとＨｂＡｏとの反応性評価−電気伝導度依存性−＞反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液を用い、これに種々の濃度になるようにＮａＣｌを添加した。各々のＮａＣｌ濃度の緩衝液にヒトＨｂＡｏを最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６６０ｎｍで測定した。図５（イ）には、ｐＨ６．２１、ポリマー濃度０．００４％の時の測定結果を、図５（ロ）には、ｐＨ６．００、ポリマー濃度０．００６％の時の測定結果を、それぞれ示す。これらの測定結果から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体とヒトＨｂＡｏとの反応による濁度は、ｐＨやポリマー濃度が異なると電気伝導度依存性も異なるパターンを示し、各条件において最適の電気伝導度（言い換えればＮａＣｌ濃度）があることがわかる。
【００４８】実施例６＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーの特異性評価＞上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の特異性を評価した。ヒトＨｂＡ１ｃは、以下の方法によって精製したものを用いた。
【００４９】−ヒトＨｂＡ１ｃの精製方法−健常人ボランティアから採取した新鮮ヘパリン加血４０ｍｌ（ノボヘパリン１０Ｕ／ｍｌ）を１，５００Ｇで遠心し、沈殿赤血球を生理食塩水で３回で遠心洗浄した。この洗浄赤血球に８．８ｇ／ｌＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌテトラポリリン酸ナトリウム（ナカライテスク）溶液（ｐＨ＝６．５）を４５０ｍｌ添加し、３７℃で５時間間欠的に、ゆっくりと攪拌した。この溶液から、再度遠心操作（４℃）によって、沈殿赤血球を回収し、赤血球とほぼ同体積の冷却脱イオン水を添加し、赤血球を溶血させた。この溶血液のｐＨを氷浴下で５．０にあわせ、３０分攪拌し、５，０００Ｇで２０分遠心した。この上澄みのｐＨを氷浴下で７．０に合わせ、３０分攪拌し、５，０００Ｇで２０分遠心した。この上澄みを透析チューブに詰めて、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝６．３）に、外液を３回交換して２日間にわたって透析した。この透析後の溶血液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、濾液をＨＰＬＣシステム（島津製作所社製ＬＣ９Ａ）及びＭｅｒｃｋ社製フラクトゲル（ＥＭＤ−ＳＯ3 −６５０、２５〜４０μｍ）充填ステンレスカラム（φ３０×１００ｍｍ）を用い、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．１）、３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．１）の２液グラジエントによって分離精製した。
【００５０】上記のように、精製したヒトＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡｏ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ６２Ｈ９３１０、純度９０％以上）、及び松原（蛋白質、核酸、酵素、Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．６，１９８７，ｐ２２３−２２６）の方法によってＨｂＡｏをvan Kampen-Zijlstra reagent modified by Matsubara 液（Ｋ3 Ｆｅ（ＣＮ）6 ２００ｍｇ／ｌ、ＫＣＮ５０ｎｇ／ｌ、トリトンＸ−１００；０．１％（ｗ／ｗ）、Ｍ／３０ｐＨ７．２リン酸緩衝液）で処理したシアンメト化ヘモグロビンを用い、それぞれ図６に示すような最終濃度になるように、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の反応溶液に溶解した。次に、上記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００６％になるように添加し、室温で５分間反応後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所ＵＶ２６０）で、ＯＤ６６０ｎｍで測定した。結果を図６に示す。図６から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ＨｂＡｏとは反応するがＨｂＡ１ｃとの反応性は大きく低下した。一方、これはシアンメト化ヘモグロビン（ＨｉＣＮ）とはＨｂＡｏ同様の反応性を示した。
【００５１】実施例７＜不安定型ＨｂＡ１ｃの影響＞健常人ボランティアから採取した新鮮ヘパリン加血（ノボヘパリン１０Ｕ／ｍｌ）１０ｍｌに、グルコースを１、２、５、１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６時間及び４℃で一昼夜反応させ、不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含有する血液試料を調製した。次に、０．００６％ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体、０．１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２４）の溶液２．５ｍｌに、上記血液試料５μｌを添加し、５分後に生じた濁度を実施例３と同様の方法で測定した。結果を図７に示す。測定結果から明らかなように、グルコース添加によって濁度はほとんど変化せず、不安定型ＨｂＡ１ｃの影響はほとんどなかった。
【００５２】実施例８＜ＤＰＧポケット親和性ポリマーによるＨｂＡ１ｃの定量＞実施例２で用いた溶血用緩衝液に実施例１で合成したポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を０．００６％になるように溶解した。この溶液２．５ｍｌと種々の濃度になるようにＨｂＡｏ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ６２Ｈ９３１０、純度９０％以上）を添加したヒト血漿５μｌとを反応させ、生じた濁度を実施例３と同様の方法で測定し、ＨｂＡｏの検量線を作成した。結果を図８に示す。次に、ヒト血液検体０．０２ｍｌをvan kampen-Zijlstra reagent modified by Matsubara 液５．０ｍｌに添加し、シアンメト化した。この溶液のＯＤ５４０ｎｍの吸光度を前記試薬を対照に測定し、総Ｈｂ量を求めた。次に、ヒト血液検体５μｌを前記ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を溶解した溶血用緩衝液２．５ｍｌに添加し、５分後に生じた濁度を実施例３と同様の方法で測定した。この測定値と前述のＨｂＡｏの検量線から、検体中のＨｂＡｏ量を算出した。次に、以下の計算式により、検体のＨｂＡ１ｃ量（％）を求めた。
ＨｂＡ１ｃ（％）＝｛１−（ＨｂＡｏ量／総Ｈｂ量）｝×１００
【００５３】また、同一の検体を実施例１で用いた糖化ヘモグロビン測定専用装置（Ａｕｔｏ−Ａ１ｃＨＡ−８１２１）で測定し（ＨＰＬＣ法）、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関性を評価した。結果を図９に示す。
【００５４】
【発明の効果】本発明のＤＰＧポケット親和性物質を利用したＨｂＡ１ｃ測定方法は、上記のようにＨｂＡｏのＤＰＧポケットに上記物質が結合するため、同時に不安定型ＨｂＡ１ｃをグルコースとＨｂＡｏに解離させ、安定型のＨｂＡ１ｃを測定できる。そのため、一次的な血糖上昇もしくは下降に左右されることなく、より信頼度の高い測定値が得られ、しかも簡単に測定できる。また、ＤＰＧポケット親和性物質は抗体等に比べて低コストで製造できるため、安価な試薬を供給できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｂＡｏを示す模式図である。
【図２】ＨＰＬＣによる糖化ヘモグロビン測定専用装置を用いてヘモグロビン成分を測定した結果を示すグラフである。
【図３】ヘモグロビンＡｏの濃度に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図４】ｐＨに対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図５】電気伝導度（ＮａＣｌ濃度）に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図６】ヘモグロビン濃度Ａｏに対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図７】グルコース濃度に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した結果を示すグラフである。
【図８】ヘモグロビンＡｏ濃度に対し溶液の濁度を紫外可視分光光度計で測定した時のヘモグロビンＡｏの検量線を示すグラフである。
【図９】同一の検体について、本発明による方法とＨＰＬＣ法のそれぞれでＨｂＡ１ｃの定量を行った時の相関性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質と溶血液とを反応させ、前記親和性を有する物質と溶血液中のヘモグロビンＡｏとの反応体を定量し、得られた値を別に求めた総ヘモグロビン量から差し引くことによって、血液中のヘモグロビンＡ１ｃ量を測定することを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】親和性を有する物質と溶血液中のヘモグロビンＡｏとの反応体の定量において、濁度を求めることにより定量することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項３】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質と溶血液との反応において、反応液のｐＨが５〜６．８であることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質と溶血液との反応において、反応液の電気伝導度が１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする請求項３記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項５】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質が、メチレンホスホン酸基又はホスホン基を有する高分子化合物であることを特徴とする請求項１乃至４記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項１】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質と溶血液とを反応させ、前記親和性を有する物質と溶血液中のヘモグロビンＡｏとの反応体を定量し、得られた値を別に求めた総ヘモグロビン量から差し引くことによって、血液中のヘモグロビンＡ１ｃ量を測定することを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】親和性を有する物質と溶血液中のヘモグロビンＡｏとの反応体の定量において、濁度を求めることにより定量することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項３】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質と溶血液との反応において、反応液のｐＨが５〜６．８であることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質と溶血液との反応において、反応液の電気伝導度が１．３〜８．０ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする請求項３記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項５】ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対する親和性を有する物質が、メチレンホスホン酸基又はホスホン基を有する高分子化合物であることを特徴とする請求項１乃至４記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許番号】特許第３４７８９１３号（Ｐ３４７８９１３）
【登録日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【発行日】平成１５年１２月１５日（２００３．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平７−２２６３１０
【出願日】平成７年９月４日（１９９５．９．４）
【公開番号】特開平８−１６００４８
【公開日】平成８年６月２１日（１９９６．６．２１）
【審査請求日】平成１４年４月２５日（２００２．４．２５）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【登録日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【発行日】平成１５年１２月１５日（２００３．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成７年９月４日（１９９５．９．４）
【公開番号】特開平８−１６００４８
【公開日】平成８年６月２１日（１９９６．６．２１）
【審査請求日】平成１４年４月２５日（２００２．４．２５）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
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