ヘモゾイン誘導による自然免疫を利用したマラリア感染症の検出・測定、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング、及び該自然免疫誘導の調節
【課題】ヘモゾイン（ＨＺ）の誘導を利用したマラリア感染症の検出・測定方法、該検出・測定法を用いたマラリア感染症のワクチン及びマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び該ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節手段を提供する。
【解決手段】ＨＺの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することにより、マラリア感染症の検出・測定を行なう。該マラリア感染症の検出・測定は、マラリア感染症の診断のために用いることができる。また、該検出・測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行う。更に、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、ＨＺの誘導による自然免疫誘導の調節を行う。
【解決手段】ＨＺの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することにより、マラリア感染症の検出・測定を行なう。該マラリア感染症の検出・測定は、マラリア感染症の診断のために用いることができる。また、該検出・測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行う。更に、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、ＨＺの誘導による自然免疫誘導の調節を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾインの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することによるマラリア感染症の検出・測定方法、該検出・測定法を用いたマラリア感染症のワクチン又はマラリア感染症の予防或いは治療薬のスクリーニング、及び該ヘモゾイン或いは合成ヘモゾインをアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有するＴＬＲ９作動剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリア感染は、特に世界の熱帯地域における、ヒトの疾病や死亡の主要な原因である。マラリアの効果的な免疫治療が必要であるにも関わらず、ライフサイクルの複雑さ及び多型性の早さ（rapid polymorphism）が原因で、宿主−原虫の相互作用及びそれによるマラリア原虫に対する自然免疫応答は、ほとんど理解されていない（Nat. Med. 4: 520-524, 1998; Nat. Rev. Immunol. 4: 169-180, 2004）。マラリア原虫に応答した炎症誘発性サイトカイン（proinflammatory cytokine）の産出を含む、強い自然免疫活性及び／又は感染し破壊した赤血球から放出された代謝物が、高熱等の主要な症状を導くとされていた（Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 533-542, 1997）。最近の論証は、トール様受容体（ＴＬＲ）がPlasmodiumを含む様々な病原体に対する自然免疫応答に関与していることを示唆している（Annu. Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002; Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004）。
【０００３】
マウスにおけるマラリア感染では、ＴＬＲを介したサイトカイン産出に必須のアダプター分子である骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）が、肝臓障害を引き起こすPlasmodium berghei原虫によるＩＬ−１２誘導に重要であることが示されている（J. Immunol. 167: 5928-5934, 2001）。最近の研究は、P. falciparum blood-stage原虫が、ＭｙＤ８８依存性及びＴＬＲ９依存性経路を通じて、ヒトplasmacytoid樹状細胞（ＤＣ）及びマウスＤＣを活性化することを報告しているが、それに起因する分子はまだ同定されていないものの、シゾント溶解物に含まれるタンパク質あるいはその複合体であることが示唆されている（J. Immunol. 172: 4926-4933, 2004）。
【０００４】
マラリア色素として知られるヘモゾイン（Hemozoin：ＨＺ）は、Plasmodium 原虫の食胞（food vacuoles）に存在するヘム分子の解毒産物である（Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002; Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997）。細胞間のＨＺは、シゾントの破壊中に血液に放出され、骨髄細胞に貧食され、細網内皮系内のＨＺの集中を導く（Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997）。すなわち、赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、ＨＺとして知られる疎水性ヘムポリマー（hydorophobic hemepolymer）へと消化し、かかるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積する。P. falciparumから生成されたＨＺは、マクロファージを活性化し、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、窒素を産出し、ヒト骨髄樹状細胞（ＤＣ）の成熟を亢進することが報告されている（J. Inflamm. 45: 85-96, 1995; Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002）。これらの研究は、ＨＺが自然免疫を活性化する分子秩序を研究し、マラリア原虫−宿主間の相互作用の理解を深める必要性を促している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nat. Med. 4: 520-524, 1998。
【非特許文献２】Nat. Rev. Immunol. 4: 169-180, 2004。
【非特許文献３】Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 533-542, 1997。
【非特許文献４】Annu. Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002。
【非特許文献５】Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004。
【非特許文献６】J. Immunol. 167: 5928-5934, 2001。
【非特許文献７】J. Immunol. 172: 4926-4933, 2004。
【非特許文献８】Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002。
【非特許文献９】Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997。
【非特許文献１１】J. Inflamm. 45: 85-96, 1995。
【非特許文献１２】Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、マラリア感染における宿主とマラリア原虫の相互作用を解明し、該知見により、マラリア感染症の診断のための、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン（Hemozoin：ＨＺ）の誘導を利用したマラリア感染症の検出・測定方法、該検出・測定法を用いたマラリア感染症のワクチン及びマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び該ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節手段等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、ヘモゾイン（ＨＺ）として知られる疎水性ヘムポリマー（hydrophobic heme polymer）に消化し、かかるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積される。本発明者は、マラリア原虫−宿主間の相互作用について、ＨＺが自然免疫を活性化する免疫反応のメカニズムを分子レベルで解明すべく研究する中で、ヒト熱帯熱マラリア原虫の該ヘム代謝産物であるＨＺが自然免疫の受容体であるToll様受容体９（ＴＬＲ９）を強く刺激する新規のリガンドであることを見い出した。すなわち、 P. falciparumから精製したＨＺが、インビトロ、インビボの両方でＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存するマウス免疫細胞を活性化することを見い出した。そして、この活性化は、公知の抗マラリア薬であるクロロキンにより阻害されることを確認した。
【０００８】
そして、これらの知見に基いて本発明者は、該ＨＺの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することにより、マラリア感染症の検出・測定を行なうことが可能であり、該マラリア感染症の検出・測定をマラリア感染症の診断のために用いることが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。また、該ＨＺの誘導による自然免疫活性の検出・測定によるマラリア感染症の検出・測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことが可能であることを見い出し、本発明をなした。更に、上記知見に基いて、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、ＨＺの誘導によるＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導の調節を行うことが可能であることを見い出した。すなわち、ヘモゾインが、ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路を経由して、Ｔｈ１を誘導する選択的な免疫応答制御・活性化効果を持つリガンドであり、他のＴＬＲファミリーや非ＭｙＤ８８依存経路であるＴＲＩＦ依存経路を活性化しないことを初めて実証した。本発明は以上の知見により完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することを特徴とするマラリア感染症の検出・測定方法や、（２）ヘモゾイン誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性の検出・測定が、ヘモゾインによる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する免疫細胞の活性化であることを特徴とする前記（１）記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（３）ヘモゾイン誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する免疫細胞の活性化の検出・測定が、ヘモゾインの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生の検出・測定であることを特徴とする前記（２）記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（４）ヘモゾインの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生の検出・測定が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生の検出・測定であることを特徴とする前記（３）記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（５）ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する免疫細胞の活性化が、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する脾臓細胞又は樹状細胞の活性化であることを特徴とする前記（２）〜（４）のいずれか記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（６）前記（１）〜（５）のいずれか記載のマラリア感染症の検出・測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用いることを特徴とするマラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、（７）被検物質の存在下、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体の誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（８）ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定する方法が、前記（２）〜（５）のいずれか記載のＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性の測定方法であることを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（９）マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体からなる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導調節用アジュバントや、（１０）マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体を活性成分とする、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導用免疫賦活剤からなる。
【００１１】
また本発明は、（１１）ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１２）非ヒト動物におけるサイトカインの産生量を、非ヒト動物における血清サイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することを特徴とする前記（１１）に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１３）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする前記（１１）又は（１２）に記載のスクリーニング方法や、（１４）ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１５）細胞が、脾臓細胞又は樹状細胞であることを特徴とする前記（１４）に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１６）細胞におけるサイトカインの産生量を、細胞の培養上澄中のサイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することを特徴とする前記（１４）又は（１５）に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１７）サイトカインの産生量の測定が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生量の測定であることを特徴とする前記（１１）〜（１６）のいずれかに記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（１８）ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質の受容体としての使用方法や、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；（１９）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１８）に記載の使用方法や、（２０）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１８）記載の使用方法や、（２１）以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の受容体タンパク質に対する、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体のリガンドとしての使用方法や、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；（２２）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（２１）に記載の使用方法や、（２３）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつヘモゾインに対して反応性を有するタンパク質であることを特徴とする前記（２１）記載の使用方法に関する。
【００１３】
また本発明は、（２４）ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有することを特徴とするＴＬＲ９作動剤や、（２５）ＭｙＤ８８を活性化することを特徴とする前記（２４）記載のＴＬＲ９作動剤や、（２６）ＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導することを特徴とする前記（２５）記載のＴＬＲ９作動剤や、（２７）ＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生であることを特徴とする前記（２６）記載のＴＬＲ９作動剤や、（２８）ＴＬＲ９を選択的に活性化することを特徴とする前記（２４）〜（２７）のいずれか記載のＴＬＲ９作動剤や、（２９）ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＲＩＦを活性化しないことを特徴とする前記（２８）記載のＴＬＲ９作動剤や、（３０）自然免疫制御剤として用いられることを特徴とする前記（２４）〜（２９）のいずれか記載のＴＬＲ９作動剤に関する。
【００１４】
また本発明は、（３１）ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体をＴＬＲ９のリガンドとして使用する方法や、（３２）ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導させる方法を含むことを特徴とする前記（３１）記載の使用する方法や、（３３）ＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生であることを特徴とする前記（３２）記載の使用する方法や、（３４）自然免疫の制御方法を含むことを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか記載の使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例において、P. falciparum由来の精製ＨＺが、マウス免疫システムを活性化するかどうかを調べるために、脾臓細胞及びＤＣ（ヒト骨髄樹状細胞）を、インビトロで精製ＨＺで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイトカインの産出をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、ＨＺ誘導性の自然免疫の活性化が、ＭｙＤ８８にのみ依存的であることを確認するために、ＭｙＤ８８非依存性経路に必須のアダプター分子であるＴＲＩＦ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）領域含有アダプター）が欠損しているマウスを用い、ＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０の産生量をＥＬＩＳＡで分析し、定量した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、ＨＺ誘導性の自然免疫活性化が障害されているか、又は変更されているかを調べるために脾臓細胞及びＤＣを用いて、ＣＤ４０及びＣＤ８８の発現をフローサイトメトリーで分析した結果（ｂ）、ＦＬ−ＤＣによるＩＦＮαの産生を、ＥＬＩＳＡで分析した結果（ｃ）を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、合成ＨＺがＴＬＲ９依存形式で、自然免疫システムを活性化しているかどうか調べるために、野生型マウス又はＴＬＲ９−／−マウスに、合成ＨＺを注入し、血清内のＩＬ−６及びＭＣＰ−１産生量をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、P. falciparumの培養物中、又はP. falciparum培養物からＨＺ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、ＨＺの精製度を定量するための分析を行った結果を示す図である。（ａ）は、ＤＮＡの混入を検出するために、ＨＺをアガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した結果を、（ｂ）は、Ｃ５７／Ｂ６マウスのＦＬ−ＤＣを、ＨＺ又はDNase処理、熱失活、及び／又はＣＱ（１０μＭ）でインキュベートした後、ＥＬＩＳＡでＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのＨＺ誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することによりマラリア感染症の検出・測定を行う方法よりなるものである。本発明において、ＨＺ誘導による自然免疫活性の検出・測定には、脾臓細胞又は樹状細胞のような免疫細胞のＨＺによる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する活性化の状況を検出・測定することにより行うことができる。該ＨＺによる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する活性化の検出・測定は、ＨＺの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生を検出・測定することにより行うことができる。該サイトカインの産生の検出・測定としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生の検出・測定により行うことができる。該サイトカインの産生の検出・測定には、サイトカインＥＬＩＳＡ法のような公知のサイトカインの検出・測定法を用いることができる。本発明のマラリア感染症の検出・測定方法により、マラリア感染症の診断を行うことが可能である。
【００１７】
また本発明は、本発明のＨＺ誘導によるマラリア感染症の検出・測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用い、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング方法又は検査方法として用いることからなる。該ワクチンのスクリーニング又は検査方法は、ワクチンの開発或いは開発したワクチンの製造に際しての検査等における被検ワクチンの評価方法として用いることができる。更に、本発明は、本発明のマラリア感染症の検出・測定方法を、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法として用いることよりなる。該スクリーニング方法は、被検物質の存在下、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体の誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定する本発明の方法により行うことができる。
【００１８】
また、本発明は、本発明においてＴＬＲ９の新規リガンドとして見い出されたＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体を、自然免疫誘導調節用アジュバントとして、或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることよりなる。ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体を自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることにより、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導の調節を行うことができる。本発明において、ＨＺは（不溶性クリスタロイド構造）は、P. falciparum (３Ｄ７株)で感染した赤血球から精製する方法で調製することができる（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991）。また、合成ＨＺ（βヘマチン）は、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づくJaramillo et al.のプロトコール（J. Immunol. 172:3101-3110）を用いて精製し、製造することができる。自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤の利用は、いずれも公知の利用形態にしたがって行うことができる。
【００１９】
また本発明は、野生型マウス等のＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定・評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の遺伝子が発現している脾臓細胞、樹状細胞等の細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較・評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関し、上記サイトカインとしては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮα等を例示することができ、また、上記非ヒト動物におけるサイトカインの産生量は、非ヒト動物における血清サイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することができ、細胞におけるサイトカインの産生量は、細胞の培養上澄中のサイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することができる。そして、ＭｙＤ８８−／−マウスやＭｙＤ８８−／−の遺伝子が発現している細胞はＷＯ００／４１５６１号公報に記載の方法により、ＴＬＲ９−／−マウスやＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞は特開２００２−３４５６５号公報に記載の方法により調製することができる。
【００２０】
また本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；の受容体としての使用方法に関する。上記タンパク質としては、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡにコードされるタンパク質；配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；を用いることができる。ここで、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００２１】
上記本発明の使用方法の具体的態様としては、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定するマラリア感染症の検出・測定方法や、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、ヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体の誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答誘導のメカニズムを解明する方法等を挙げることができる。
【００２２】
また本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有する、ＴＬＲ９と相互作用して全活性の細胞内シグナル伝達を引き起こす物質であるＴＬＲ９作動剤（アゴニスト）に関し、かかるＴＬＲ９作動剤は、ＭｙＤ８８を活性化することや、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生等を伴うＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導することや、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＲＩＦを活性化することなく、ＴＬＲ９を選択的に活性化することが可能で、自然免疫制御剤として用いることができる。
【００２３】
さらに本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体をＴＬＲ９のリガンドとして使用する方法に関し、かかる方法は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生等を伴うＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導させる方法や、自然免疫の制御方法を含み、その具体的態様としては、前記の本発明の使用方法の具体的態様として例示した方法を挙げることができる。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
『ＨＺの自然免疫活性の活性化とその調節』
［材料及び方法］
（マウス）
変異マウス（ＭｙＤ８８−、ＴＲＩＦ−、ＴＬＲ２−、ＴＬＲ４−、ＴＬＲ７−、ＴＬＲ９欠損マウス）を、１２９／Ｏｌａ×Ｃ５７／ＢＬ６又はＣ５７／ＢＬ６をバックグランドとし、文献（Immunity 9: 143-150, 1999; Immunity 11: 443-451, 1999; Nature 408: 740-745, 2000; Nat. Immunol. 3: 196-200, 2002; Science 301: 640-643, 2003）記載の通りに産出した。同年齢の野生型マウスと変異マウスを実験に使用した。インビボの研究には、P. falciparum培養物から精製したＨＺ１５００μｇと合成ＨＺ（βヘマチン）とを、野生型マウス、ＭｙＤ８８−／−マウス又はＴＬＲ９−／−マウスの腹腔内に注入した（J. Immunol. 172: 3101-3110, 2004）。サイトカインＥＬＩＳＡ用に、１、２、４及び６時間後に尾から血清を収集した。
【００２６】
（試薬）
合成ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｄ３５は、北海道システムサイエンス株式会社より購入、合成した。Salmonella minnesota Re-595由来リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、塩化ヘミン（hemin chloride）及びクロロキン（ＣＱ）はSigma-Aldrichより購入した。DNase (Dnase- I) はInvitrogenから購入した。
【００２７】
（ＨＺ及び合成ＨＺ（βヘマチン）の調製）
ＨＺ（不溶性クリスタロイド構造）は、P. falciparum(３Ｄ７株)で感染した赤血球から精製した（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991）。要約すると、赤血球をサポニンで溶解した後、原虫を超音波処理し、２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で７〜８回洗浄した。次に、ペレットをプロテイナーゼＫ（２ｍｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で一晩インキュベートした。ペレットはその後、２％のＳＤＳ内で３回洗浄し、６Ｍの尿素内で室温で３時間、シェーカー上でインキュベートした。ＨＺペレットを２％のＳＤＳで洗浄した後、蒸留水で３〜５回洗浄し、蒸留水に再懸濁し、使用前に再び超音波処理した。いくつかの実験において、文献（J. Immunol. 167: 2602-2607, 2001）記載の通りに、ＨＺは、９５℃で１５分間の熱失活を行うか又は、１００Ｕ／ｍｌのDNase-Iで１時間処理を行った。DNase-I処理は、Ｐ．falciparumの粗抽出物から完全にゲノムＤＮＡを除去することによって行った（図５ａ）。
【００２８】
核酸、タンパク質の定量化は、分光光度計を使用するか、又はアガロースゲル内の臭化エチジウム染色法、ＢＣＡ法（Biorad） 若しくはピロガロールレッド方法（和光純薬工業）によって行った。全脂質（ＴＰ）は、Bligh-Dyer 法（東レリサーチセンター）によるＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）又はIatron LQ（三菱化学ヤトロン）を使用した酵素方法によって測定した。合成ＨＺ（βヘマチン）は、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づくJaramillo et al.のプロトコール（J. Immunol. 172:3101-3110）を用いて精製した。エンドトキシンの混入を避けるために、全ての溶液はエンドトキシンを含まないＰＢＳ又は蒸留水を用いて調製した。ＬＡＬ分析（Bio-Whittaker）により測定したエンドトキシンの量は、使用したＨＺ１ｎｍｏｌｅ当たり０．００１ＥＵ未満であった。
【００２９】
（ＨＺ又は合成ＨＺ（ｂヘマチン）の定量化）
ＨＺ又は合成ＨＺの濃度は、ヘムポリマーを、２０ｍＭ水酸化ナトリウム／２％ＳＤＳの溶液内で、室温で、２時間脱重合して定量し、Ｏ．Ｄ．は４００ｎｍであった（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996）。ヘムのモラー吸光係数は４００ｎｍで１×１０５であり、２５μｇのP. falciparum ＨＺは、ヘム含有量２９ｎｍｏｌｅと同等である。
【００３０】
（細胞）
脾臓細胞の単一細胞懸濁液（single cell suspension）（５×１０５細胞／ウェル）を、１０％のＦＣＳを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０培地内で４８時間培養した。Ｆｌｔ３リガンド誘導骨髄由来ＤＣ（ＦＬ−ＤＣ）（１×１０５細胞／ウェル）は、骨髄細胞とＦｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ；Pepro Tech 社製）とを、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地内で８〜９日間培養して産出した。細胞を、指定の刺激によって刺激し、サイトカインＥＬＩＳＡ用に、上澄みを回収した。
【００３１】
（サイトカインＥＬＩＳＡ）
マウスのＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６(R & D Systems)及びＩＦＮα（PBL Bio. Lab 社製）を、上澄み又は血清のいずれかで、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡで測定した。
【００３２】
（共刺激による分子発現のフローサイトメトリー分析）
刺激した細胞の細胞表面の分子発現を、文献（J. Exp. Med. 196: 269-274, 2002）記載の通り測定した。要約すると、刺激した細胞を、冷却したＰＢＳ内で洗浄し、固定し、抗ＣＤ１６抗体の存在下で、ＦＩＴＣ標識抗体、ＰＥ標識抗体、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ標識抗体及びＡＰＣ標識抗体で、室温で３０分染色した。染色した細胞を洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．１％NaN３内に再懸濁し、ＦＡＣＳCalliberで分析した後、CellQuest software(BD社製)で分析した。全ての抗体は、ＢＤより入手した。
【００３３】
（統計的分析）
統計的な有意差は、Student’s t-testを用いて分析した。Ｐ＜０．０５は有意とみなした。
【００３４】
［試験、結果及び評価］
（P. falciparum由来の精製ＨＺの、ＭｙＤ８８依存性経路を通してのマウスの脾臓細胞及び樹状細胞の活性化）
P. falciparum由来の精製ＨＺが、マウス免疫システムを活性化するかどうかを調べるために、脾臓細胞及びＤＣ（マウス骨髄樹状細胞）を、インビトロで精製ＨＺで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイトカインの産出をＥＬＩＳＡによって測定した。ＦＬ−ＤＣ（Ｆｉｔ３リガンド誘導骨髄由来ＤＣ）は、ＨＺに応答して、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）及びＩＬ−６を、用量依存的に大量に産出し、その量はＣｐＧ ＯＤＮとほぼ同様の値だった（図１ａ）。ＨＺ誘導性の自然免疫活性化における、ＴＬＲの役割を調べるために、多数のＴＬＲが介するサイトカイン誘導に必須の分子アダプターであるＭｙＤ８８が欠損しているマウスを用いた（Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004）。ＭｙＤ８８−／−マウス由来のＦＬ−ＤＣでは、ＨＺ刺激により、ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ４０、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６の産出が著しく障害された（図１ｂ）。
【００３５】
同様に、ＭｙＤ８８−／−脾臓細胞では、ＨＺに応答して、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）を産出する応答が障害されていた（図１ｃ）。更に、ヘモゾインは、ＦＬ−ＤＣのＣＤ１１ｃ＋、Ｂ２２０＋plasmacytoidＤＣサブセット及びＣＤ１１ｃ＋、Ｂ２２０−骨髄ＤＣサブセットの両方を刺激し、ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて、ＦＬ−ＤＣの両サブセットで阻害されていたＣＤ４０及びＣＤ８６の発現をアップレギュレートした（図１ｄ）。
【００３６】
（自然免疫応答のＨＺ活性化のＴＲＩＦ依存性）
ＨＺ誘導性の自然免疫の活性化が、ＭｙＤ８８にのみ依存的であることを確認するために、ＭｙＤ８８非依存性経路に必須のアダプター分子であるＴＲＩＦ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）領域含有アダプター）が欠損しているマウスを用いた（Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004）。ＭｙＤ８８−／−マウスとは対照的に、ＴＲＩＦ−／−マウスのＦＬ−ＤＣは、ＨＺに応答し、ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０（ｐ＜０．０５、ＴＲＩＦ−／−ｖｓ培地）を産出し、野生型マウス（ｐ＞０．０５）の値とほぼ同じであった（図２）。ＬＰＳ誘導性のＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０は、ＴＲＩＦ−／−マウスのＦＬ−ＤＣで障害され、P. falciparum培養物から精製した多量のＨＺに、ＬＰＳが混入していないことを示唆した。これらのデータは、ＨＺがＭｙＤ８８を通してマウスにおける炎症誘発性応答を活性化することを示し、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲの１つがＨＺの認識に関与していることを示した。
【００３７】
（自然免疫応答のＨＺ活性化のＴＬＲ−９依存性）
ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス及びＴＬＲ９−／−マウスから得た脾臓細胞及びＤＣを用いて、ＨＺ誘導性の自然免疫活性化が障害されているか、又は変更されているかを調べるために、さらに実験を行った。ＨＺは、野生型マウス、ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウスにおいて、ＦＬ−ＤＣを刺激し、ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０＋plasmacytoidＤＣサブセット及びＣＤ１１ｃ＋、Ｂ２２０−骨髄ＤＣサブセットの両方で、ＣＤ４０及びＣＤ８６をアップレギュレートした（図３ａ）。対照的に、ＴＬＲ９−／−マウス由来のＦＬ−ＤＣの両サブセットでは、ＨＺに応答してＣＤ４０及びＣＤ８６をアップレギュレートしなかった（図３ａ）。
【００３８】
同様に、野生型マウス、ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス由来のＦＬ−ＤＣは、ＨＺに応答して、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６を産出したが、ＴＬＲ９−／−マウスでは産出しなかった（図３ｂ）。ＨＺはＦＬ−ＤＣによってＩＦＮαを誘導しなかった点は注目すべきであり、ＨＺ誘導性サイトカインの特性が、Ｋ型ＣｐＧＯＤＮ（Ｂ型としても知られている）と同様であるが、Ｄ型ＯＣＮ（Ａ型としても知られている）、細菌性若しくはウイルス性ＤＮＡ等のＴＬＲ９の既知の天然ＤＮＡリガンドとは異なることを示唆している（図３ｃ）（Nat. Rev. Immunol. 4: 249-258, 2004）。それにもかかわらず、これらのデータは、ＴＬＲ９及びＭｙＤ８８が、マウス脾臓細胞及びＤＣにおけるＨＺ誘導性の活性化に重要であることを、明らかに証明している。
【００３９】
（炎症誘導性サイトカインのＨＺ活性化のインビボにおけるＭｙＤ８８／ＴＬＲ９依存性）
ＨＺ活性化が、インビボで、ＴＬＲ９に介され、ＭｙＤ８８に依存的であることを確認するために、P. falciparum精製ＨＺを、野生型マウス及びＭｙＤ８８−／−マウス又はＴＬＲ９−／−マウスの腹腔内に注入し、血清サイトカインの産出をモニターした。ＨＺの注入により、野生型マウスのＭＣＰ−１及びＩＬ−６の血清量が著しく上昇し、その値は１〜４時間に最大となり、６時間以内に減少した（図４ａ）。対照的に、ＭｙＤ８８−／−マウス及びＴＬＲ−／−マウスでは、この上昇は、完全に阻害されていた。６時間後、サイトカインの量は、野生型マウスで減少した。これらのデータは、インビボ及びインビトロの両方で、ＨＺ誘導性の炎症誘導性応答が、ＴＬＲ９及びＭｙＤ８８によって介されていることを明確に示している。
【００４０】
合成ＨＺ（βヘマチン、実験室条件で短量体ヘムより合成）は、原虫で天然に形成されたＨＺと構造が似ており（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991）、原虫又は培養物由来の混入物を含んでいない。合成ＨＺがＴＬＲ９依存形式で、自然免疫システムを活性化しているかどうか調べるために、野生型マウス又はＴＬＲ９−／−マウスに、合成ＨＺを注入し、血清内のＩＬ−６及びＭＣＰ−１産生量をモニターした。野生型マウスへの合成ＨＺの注入は、血清内のＭＣＰ−１及びＩＬ−６産出を誘導し、その量は１〜４時間に最大となった（図４ｂ）。対照的に、この応答は、ＴＬＲ９−／−マウスでは阻害されていた（図４ｂ）。これらのデータは、合成ＨＺと同様P. falciparum由来精製天然ＨＺも、マウスの自然免疫システムを刺激していることを示唆し、ＨＺ誘導性の、ＴＬＲ９仲介自然免疫活性化に他の混入物が関与している可能性を排除している。
【００４１】
P. falciparumの培養物中、又はP. falciparum培養物からＨＺ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、上記の多くの精製方法に加えて、ＨＺの精製度を定量するために、一連の分析を行った（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002）。臭化ブロマイド染色アガロースゲル（図５）でも、分光光度計でも、ＨＺ又はDNase処理ＨＺ溶液（１ｍＭ）において、ＤＮＡもＲＮＡも検出されなかった。DNase処理又は熱失活も、ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０のＨＺ誘導ＤＣ産出に影響しなかった（図５ｂ）。さらに、P. falciparumから単離したゲノムＤＮＡ及びＲＮＡは、ＴＮＦα及びＩＬ−１２の産出を含む自然免疫応答を著しく活性化しなかった（未公表の実験及び（J. Immunol. 172: 3989-3993, 2004））。どの方法でも、ＨＺ溶液（１ｍＭ）内に、タンパク質も脂質も検出されなかった。つまり、これらのデータを合わせると、ＨＺ誘導性、ＴＬＲ９−仲介性の自然免疫活性は、他の混入物に起因するものではないことを、強く示唆している。
【００４２】
（ＨＺ誘導性自然免疫の活性化のクロロキン感受性）
抗マラリア製剤クロロキン（ＣＱ）は、エンドソーム／リソソームの成熟、マラリアヘモゾインのクリスタル形成（crystal formation）を阻害するほか、マラリア感染中の炎症誘導性応答を阻害することが報告されているが、ＣＱの抗マラリア効果の正確なメカニズムは、未だに論争中である（Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002; Life Sci. 74: 1957-1972, 2004）。最近の論拠は、ＣＱは、ＴＬＲ９仲介性自然免疫活性化も阻害することを示唆している（J. Immunol. 160: 1122-1131, 1998）。ＨＺ誘導性の炎症誘導性応答に対するＣＱの効果を調べるために、ＣＱの存在下で、ＦＬ―ＤＣをＨＺで刺激した。ＨＺ誘導性のＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０の産出は、ＣＱにより減少した（図５ｂ）。
【００４３】
これらは、既知のメカニズムである、マラリア病原体によるＣＱ阻害に加えて、ＣＱが、マラリア感染中のＨＺ誘導性、ＴＬＲ９仲介性の自然免疫応答を阻害することができ、それは治療効果に貢献する可能性があることを示唆している。さらなる研究が必要ではあるが、ＨＺ形成を阻害する能力に加えて、ＣＱがＨＺとＴＬＲ９の相互作用に干渉し、又は食胞を含むＨＺの成熟を阻害し、結果的に以下の自然免疫活性化を阻害する可能性がある。
【００４４】
ＴＬＲ９が特異的ＩｇＧにより、細菌性ＤＮＡ又は自己ＤＮＡクロマチン複合体中にＣｐＧモチーフを認識することは報告されているが、ＴＬＲ９リガンドとしての非ＤＮＡ分子は報告されていない（Trends Immunol. 25: 381-386, 2004; Annu. Rev. Immunol. 20: 709-760, 2002）。最近の研究によって、ＴＬＲ９により認識される非ＤＮＡリガンドの最初の論拠が報告されている。ＨＺは、赤血球からヘモグビンが分解される間に寄生虫の食胞に産出した重合ヘム（ferriprotoporphyrin IX）の結晶形である。マクロファージ、ＤＣ等の貪食細胞に捕獲されると、ＨＺは、ＴＬＲ９がＰ１３キナーゼを経由して、小胞体から補充されることがあるファゴソーム内に蓄積する（J. Exp. Med. 196: 269-274, 2002; Nat. Immunol. 5: 190-198, 2004）。これは、ＴＬＲ９が、ファゴソーム内でＨＺを認識しうることを示唆している。
【００４５】
ＨＺは、高疎水性であり、最近提案された仮説に従うと、免疫刺激効果に関与する可能性がある（Nat. Rev. Immunol. 4: 469-478, 2004）。ＨＺは本来、宿主赤血球内のヘモグロビンに由来しているが、生存し続けるために、原虫によって、毒性のヘムから、原虫に無毒の代謝物であるＨＺへと、変更されることは興味深い。これは、不活性自己分子（inert self molecule）（ヘム）が、マラリア感染中に不活性免疫システム内において、活性化した“非自己”分子となることを示唆している。
【００４６】
マラリア感染中のＨＺ誘導性、ＴＬＲ９仲介性の自己免疫活性化及びそれに対する宿主の防御の生物学的な役割は現在調査中である。予備的な結果により、マラリア原虫に対する自然免疫応答は、ＴＬＲを含む宿主やPlasmodiumの複数の要因に依存していることを示唆している。最近の研究を含む、マラリア感染中のＴＬＲ仲介性の自然免疫活性化が、宿主防御免疫（host protective immunity）に寄与しているのか、マラリア免疫逃避メカニズム(malarial immune escape mechanism)に寄与しているのかを、研究することは重要である。また、ＴＬＲ９がＣｐＧＤＮＡ及びＨＺを識別する分子メカニズムを研究することも重要である。それにもかかわらず、現在までの観察により、マラリア感染中のヘム代謝物であるＨＺは、ＴＬＲ９仲介性、ＭｙＤ８８依存性及びクロロキンビン敏感性の経路を通して、不活性免疫システムを活性化することを確かに証明しており、これは、不活性免疫におけるマラリア寄生虫−宿主相互作用をさらに理解する鍵となる。
【００４７】
［図の説明］
図１．P. Falciparum由来精製ＨＺは、ＭｙＤ８８依存性経路を通して、炎症誘発性応答を活性化する：
（ａ）野生型（ＷＴ）マウスのＦＬ−ＤＣを、精製ヘモゾイン（ＨＺ）（３０及び１００μＭ）で２４時間刺激した。ＥＬＩＳＡで、上澄み中のＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１又はＩＬ−６の産生を測定した。コントロールとして、３μＭのＣｐＧＤＮＡ（Ｄ３５）を用いた。野生型（黒いバー）、ＭｙＤ８８−／−マウス（白いバー）の（ｂ）ＦＬ−ＤＣ、及び（ｃ）脾臓細胞を、３０μＭのＨＺ及びＣｐＧＤＮＡ（Ｄ３５、３μＭ）又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で、２４時間刺激した。培養上澄み中のＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１又はＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡで測定した。（ｄ）ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を調べるために、骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０−）及びplasmacytoid ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０＋）を、フローサイトメトリーによって分析した。斜線部分は、ＨＺで刺激されていない細胞を現し、実線はＨＺで刺激された細胞を現す。結果は、２度の培養の平均値＋Ｓ．Ｄ．を現し、少なくとも５回の別個の実験の代表例である。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【００４８】
図２．ＨＺ誘導性のＤＣ活性化はＴＲＩＦ非依存的である：
野生型（ＷＴ）マウス及びＴＲＩＦ−／−マウスのＦＬ−ＤＣは、３０μＭのＨＺ及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートし、その後上澄みをＥＬＩＳＡで分析し、ＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０の産生量を定量した。結果は、平均値＋４回の別個の実験のＳＥＭ（ｎ＝４）である。Ｐ＞０．０５、ＨＺ（ＷＴ）ｖｓＨＺ（ＴＲＩＦ−／−）。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【００４９】
図３．ＴＬＲ９はＨＺ誘導性の自然免疫活性化を仲介する：
（ａ）野生型（ＷＴ）マウス及びＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス、ＴＬＲ９−／−マウスの骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０−）及びplasmacytoid ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０＋）を、フローサイトメトリーで分析し、ＣＤ４０及びＣＤ８８の発現を定量した。斜線部分はＨＺで刺激されていない細胞を現し、実線はＨＺで刺激された細胞を現す。野生型及びＴＬＲ９−／−細胞は指定の刺激でインキュベートし、（ｂ）脾臓細胞によるＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１又はＩＬ−６の産生、及び（ｃ）ＦＬ−ＤＣによるＩＦＮα産生を、ＥＬＩＳＡで分析した。結果は、少なくとも５回の別個の実験の代表例である。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【００５０】
図４．インビボのＨＺ及び合成ＨＺ（βヘマチン）による血清サイトカインの産生はＭｙＤ８８及びＴＬＲ９依存的である：
１５００μｇの（ａ）P. falciparum精製ＨＺ、又は（ｂ）合成ＨＺ（ｓＨＺ）のいずれかを、ＭｙＤ８８−／−マウス、ＴＬＲ９−／−マウス又は野生型（ＷＴ）マウスの腹腔内に注入した。ＭＣＰ−１及びＩＬ−６の血清量は指定の時点においてＥＬＩＳＡで測定した。
【００５１】
図５．ヘモゾインはＤＮＡを含まず、ＨＺ誘導性の炎症誘導性サイトカインの産生は、DNase耐性及び熱耐性であるが、クロロキン感受性である：
（ａ）ＤＮＡの混入を検出するために、ＨＺをアガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した。Ｍ、マーカー；レーン１、ＨＺ溶液（１ｍＭ、５μｌ）；レーン２、熱失活ＨＺ（１ｍＭ、５μｌ）；レーン３、DNase処理ＨＺ（１ｍＭ、５μｌ）；レーン４P.falciparum粗抽出物（４．５％の寄生虫血症を含む１００ｍｌの濃縮培養物から５μｌ）；DNase処理粗抽出物（５μｌ）。（ｂ）Ｃ５７／Ｂ６マウスのＦＬ−ＤＣを、３０μＭのＨＺ又はDNase処理、熱失活、及び／又はＣＱ（１０μＭ）で２４時間インキュベートした。その後、上澄みを回収し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０を測定した。コントロールとして、ＣｐＧＯＤＮ（Ｄ３５）を３μＭで用いた。Ｄ３５のＴＮＦαの値を図に示す。結果は、２度ずつ行った、３回の別個の実験の内の１つの代表例である（平均＋Ｓ．Ｄ．）。＊Ｐ．＜０．０５、ＨＺｖｓＨＺ＋ＣＱ；＊＊Ｐ．＜０．０５、ＣｐＧＯＤＮｖｓＣｐＧＯＤＮ＋ＣＱ）。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明において、マラリア原虫−宿主間の相互作用について、ＨＺが自然免疫を活性化する免疫反応のメカニズムを分子レベルで解明した。本発明は、この知見に基いて、マラリア感染症の診断のために用いることができるマラリア感染症の検出・測定方法、該ＨＺの誘導によるマラリア感染症の検出・測定方法を用いたマラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法を開発したものである。更に、上記知見に基いて、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いることによる、ＨＺの誘導によるＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導の調節手段を開発した。
【００５３】
本発明は、これらの開発により、マラリア感染症の診断、マラリア感染症のワクチン又は予防或いは治療薬の創製、更にはマラリア感染症に対する免疫療法としての自然免疫誘導の調節、すなわち、ＨＺ、ＴＬＲ９（Toll様受容体９）、ＭｙＤ８８を含む自然免疫関連分子若しくはそのシグナル経路をターゲットにしたマラリア感染症の診断、抗マラリア薬や免疫療法の開発に対処する方策を提示し、これらの分野での利用に大きな貢献が期待できるものである。そして、ＴＬＲ９リガンドとして知られているＣｐＧＯＤＮは、自然免疫賦活剤として、癌や感染症の治療薬とのＣｐＧＯＤＮの併用療法や、抗アレルギー薬、およびワクチンアジュバントとして開発されていることから、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体は、ＣｐＧＯＤＮと同様に、自然免疫賦活剤として、癌や感染症の治療薬との併用療法や、抗アレルギー薬、およびワクチンアジュバントとして開発され得る。また、ヘモゾインはマウスＰＤＣにおいてＩＦＮαを誘導しないことも、各種のＣｐＧＯＤＮの活性と比較するうえで重要な知見である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾインの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することによるマラリア感染症の検出・測定方法、該検出・測定法を用いたマラリア感染症のワクチン又はマラリア感染症の予防或いは治療薬のスクリーニング、及び該ヘモゾイン或いは合成ヘモゾインをアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有するＴＬＲ９作動剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリア感染は、特に世界の熱帯地域における、ヒトの疾病や死亡の主要な原因である。マラリアの効果的な免疫治療が必要であるにも関わらず、ライフサイクルの複雑さ及び多型性の早さ（rapid polymorphism）が原因で、宿主−原虫の相互作用及びそれによるマラリア原虫に対する自然免疫応答は、ほとんど理解されていない（Nat. Med. 4: 520-524, 1998; Nat. Rev. Immunol. 4: 169-180, 2004）。マラリア原虫に応答した炎症誘発性サイトカイン（proinflammatory cytokine）の産出を含む、強い自然免疫活性及び／又は感染し破壊した赤血球から放出された代謝物が、高熱等の主要な症状を導くとされていた（Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 533-542, 1997）。最近の論証は、トール様受容体（ＴＬＲ）がPlasmodiumを含む様々な病原体に対する自然免疫応答に関与していることを示唆している（Annu. Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002; Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004）。
【０００３】
マウスにおけるマラリア感染では、ＴＬＲを介したサイトカイン産出に必須のアダプター分子である骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）が、肝臓障害を引き起こすPlasmodium berghei原虫によるＩＬ−１２誘導に重要であることが示されている（J. Immunol. 167: 5928-5934, 2001）。最近の研究は、P. falciparum blood-stage原虫が、ＭｙＤ８８依存性及びＴＬＲ９依存性経路を通じて、ヒトplasmacytoid樹状細胞（ＤＣ）及びマウスＤＣを活性化することを報告しているが、それに起因する分子はまだ同定されていないものの、シゾント溶解物に含まれるタンパク質あるいはその複合体であることが示唆されている（J. Immunol. 172: 4926-4933, 2004）。
【０００４】
マラリア色素として知られるヘモゾイン（Hemozoin：ＨＺ）は、Plasmodium 原虫の食胞（food vacuoles）に存在するヘム分子の解毒産物である（Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002; Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997）。細胞間のＨＺは、シゾントの破壊中に血液に放出され、骨髄細胞に貧食され、細網内皮系内のＨＺの集中を導く（Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997）。すなわち、赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、ＨＺとして知られる疎水性ヘムポリマー（hydorophobic hemepolymer）へと消化し、かかるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積する。P. falciparumから生成されたＨＺは、マクロファージを活性化し、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、窒素を産出し、ヒト骨髄樹状細胞（ＤＣ）の成熟を亢進することが報告されている（J. Inflamm. 45: 85-96, 1995; Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002）。これらの研究は、ＨＺが自然免疫を活性化する分子秩序を研究し、マラリア原虫−宿主間の相互作用の理解を深める必要性を促している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nat. Med. 4: 520-524, 1998。
【非特許文献２】Nat. Rev. Immunol. 4: 169-180, 2004。
【非特許文献３】Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 533-542, 1997。
【非特許文献４】Annu. Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002。
【非特許文献５】Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004。
【非特許文献６】J. Immunol. 167: 5928-5934, 2001。
【非特許文献７】J. Immunol. 172: 4926-4933, 2004。
【非特許文献８】Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002。
【非特許文献９】Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997。
【非特許文献１１】J. Inflamm. 45: 85-96, 1995。
【非特許文献１２】Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、マラリア感染における宿主とマラリア原虫の相互作用を解明し、該知見により、マラリア感染症の診断のための、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン（Hemozoin：ＨＺ）の誘導を利用したマラリア感染症の検出・測定方法、該検出・測定法を用いたマラリア感染症のワクチン及びマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び該ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節手段等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、ヘモゾイン（ＨＺ）として知られる疎水性ヘムポリマー（hydrophobic heme polymer）に消化し、かかるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積される。本発明者は、マラリア原虫−宿主間の相互作用について、ＨＺが自然免疫を活性化する免疫反応のメカニズムを分子レベルで解明すべく研究する中で、ヒト熱帯熱マラリア原虫の該ヘム代謝産物であるＨＺが自然免疫の受容体であるToll様受容体９（ＴＬＲ９）を強く刺激する新規のリガンドであることを見い出した。すなわち、 P. falciparumから精製したＨＺが、インビトロ、インビボの両方でＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存するマウス免疫細胞を活性化することを見い出した。そして、この活性化は、公知の抗マラリア薬であるクロロキンにより阻害されることを確認した。
【０００８】
そして、これらの知見に基いて本発明者は、該ＨＺの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することにより、マラリア感染症の検出・測定を行なうことが可能であり、該マラリア感染症の検出・測定をマラリア感染症の診断のために用いることが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。また、該ＨＺの誘導による自然免疫活性の検出・測定によるマラリア感染症の検出・測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことが可能であることを見い出し、本発明をなした。更に、上記知見に基いて、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、ＨＺの誘導によるＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導の調節を行うことが可能であることを見い出した。すなわち、ヘモゾインが、ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路を経由して、Ｔｈ１を誘導する選択的な免疫応答制御・活性化効果を持つリガンドであり、他のＴＬＲファミリーや非ＭｙＤ８８依存経路であるＴＲＩＦ依存経路を活性化しないことを初めて実証した。本発明は以上の知見により完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することを特徴とするマラリア感染症の検出・測定方法や、（２）ヘモゾイン誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性の検出・測定が、ヘモゾインによる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する免疫細胞の活性化であることを特徴とする前記（１）記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（３）ヘモゾイン誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する免疫細胞の活性化の検出・測定が、ヘモゾインの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生の検出・測定であることを特徴とする前記（２）記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（４）ヘモゾインの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生の検出・測定が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生の検出・測定であることを特徴とする前記（３）記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（５）ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する免疫細胞の活性化が、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する脾臓細胞又は樹状細胞の活性化であることを特徴とする前記（２）〜（４）のいずれか記載のマラリア感染症の検出・測定方法や、（６）前記（１）〜（５）のいずれか記載のマラリア感染症の検出・測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用いることを特徴とするマラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、（７）被検物質の存在下、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体の誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（８）ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定する方法が、前記（２）〜（５）のいずれか記載のＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性の測定方法であることを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（９）マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体からなる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導調節用アジュバントや、（１０）マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体を活性成分とする、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導用免疫賦活剤からなる。
【００１１】
また本発明は、（１１）ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１２）非ヒト動物におけるサイトカインの産生量を、非ヒト動物における血清サイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することを特徴とする前記（１１）に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１３）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする前記（１１）又は（１２）に記載のスクリーニング方法や、（１４）ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１５）細胞が、脾臓細胞又は樹状細胞であることを特徴とする前記（１４）に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１６）細胞におけるサイトカインの産生量を、細胞の培養上澄中のサイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することを特徴とする前記（１４）又は（１５）に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（１７）サイトカインの産生量の測定が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生量の測定であることを特徴とする前記（１１）〜（１６）のいずれかに記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（１８）ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質の受容体としての使用方法や、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；（１９）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１８）に記載の使用方法や、（２０）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（１８）記載の使用方法や、（２１）以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の受容体タンパク質に対する、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体のリガンドとしての使用方法や、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；（２２）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡにコードされることを特徴とする前記（２１）に記載の使用方法や、（２３）タンパク質が、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつヘモゾインに対して反応性を有するタンパク質であることを特徴とする前記（２１）記載の使用方法に関する。
【００１３】
また本発明は、（２４）ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有することを特徴とするＴＬＲ９作動剤や、（２５）ＭｙＤ８８を活性化することを特徴とする前記（２４）記載のＴＬＲ９作動剤や、（２６）ＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導することを特徴とする前記（２５）記載のＴＬＲ９作動剤や、（２７）ＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生であることを特徴とする前記（２６）記載のＴＬＲ９作動剤や、（２８）ＴＬＲ９を選択的に活性化することを特徴とする前記（２４）〜（２７）のいずれか記載のＴＬＲ９作動剤や、（２９）ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＲＩＦを活性化しないことを特徴とする前記（２８）記載のＴＬＲ９作動剤や、（３０）自然免疫制御剤として用いられることを特徴とする前記（２４）〜（２９）のいずれか記載のＴＬＲ９作動剤に関する。
【００１４】
また本発明は、（３１）ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体をＴＬＲ９のリガンドとして使用する方法や、（３２）ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導させる方法を含むことを特徴とする前記（３１）記載の使用する方法や、（３３）ＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生であることを特徴とする前記（３２）記載の使用する方法や、（３４）自然免疫の制御方法を含むことを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか記載の使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例において、P. falciparum由来の精製ＨＺが、マウス免疫システムを活性化するかどうかを調べるために、脾臓細胞及びＤＣ（ヒト骨髄樹状細胞）を、インビトロで精製ＨＺで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイトカインの産出をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、ＨＺ誘導性の自然免疫の活性化が、ＭｙＤ８８にのみ依存的であることを確認するために、ＭｙＤ８８非依存性経路に必須のアダプター分子であるＴＲＩＦ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）領域含有アダプター）が欠損しているマウスを用い、ＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０の産生量をＥＬＩＳＡで分析し、定量した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、ＨＺ誘導性の自然免疫活性化が障害されているか、又は変更されているかを調べるために脾臓細胞及びＤＣを用いて、ＣＤ４０及びＣＤ８８の発現をフローサイトメトリーで分析した結果（ｂ）、ＦＬ−ＤＣによるＩＦＮαの産生を、ＥＬＩＳＡで分析した結果（ｃ）を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、合成ＨＺがＴＬＲ９依存形式で、自然免疫システムを活性化しているかどうか調べるために、野生型マウス又はＴＬＲ９−／−マウスに、合成ＨＺを注入し、血清内のＩＬ−６及びＭＣＰ−１産生量をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、P. falciparumの培養物中、又はP. falciparum培養物からＨＺ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、ＨＺの精製度を定量するための分析を行った結果を示す図である。（ａ）は、ＤＮＡの混入を検出するために、ＨＺをアガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した結果を、（ｂ）は、Ｃ５７／Ｂ６マウスのＦＬ−ＤＣを、ＨＺ又はDNase処理、熱失活、及び／又はＣＱ（１０μＭ）でインキュベートした後、ＥＬＩＳＡでＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのＨＺ誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することによりマラリア感染症の検出・測定を行う方法よりなるものである。本発明において、ＨＺ誘導による自然免疫活性の検出・測定には、脾臓細胞又は樹状細胞のような免疫細胞のＨＺによる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する活性化の状況を検出・測定することにより行うことができる。該ＨＺによる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する活性化の検出・測定は、ＨＺの誘導による免疫細胞のサイトカインの産生を検出・測定することにより行うことができる。該サイトカインの産生の検出・測定としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生の検出・測定により行うことができる。該サイトカインの産生の検出・測定には、サイトカインＥＬＩＳＡ法のような公知のサイトカインの検出・測定法を用いることができる。本発明のマラリア感染症の検出・測定方法により、マラリア感染症の診断を行うことが可能である。
【００１７】
また本発明は、本発明のＨＺ誘導によるマラリア感染症の検出・測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用い、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング方法又は検査方法として用いることからなる。該ワクチンのスクリーニング又は検査方法は、ワクチンの開発或いは開発したワクチンの製造に際しての検査等における被検ワクチンの評価方法として用いることができる。更に、本発明は、本発明のマラリア感染症の検出・測定方法を、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法として用いることよりなる。該スクリーニング方法は、被検物質の存在下、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体の誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定する本発明の方法により行うことができる。
【００１８】
また、本発明は、本発明においてＴＬＲ９の新規リガンドとして見い出されたＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体を、自然免疫誘導調節用アジュバントとして、或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることよりなる。ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体を自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることにより、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導の調節を行うことができる。本発明において、ＨＺは（不溶性クリスタロイド構造）は、P. falciparum (３Ｄ７株)で感染した赤血球から精製する方法で調製することができる（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991）。また、合成ＨＺ（βヘマチン）は、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づくJaramillo et al.のプロトコール（J. Immunol. 172:3101-3110）を用いて精製し、製造することができる。自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤の利用は、いずれも公知の利用形態にしたがって行うことができる。
【００１９】
また本発明は、野生型マウス等のＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定・評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の遺伝子が発現している脾臓細胞、樹状細胞等の細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較・評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関し、上記サイトカインとしては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮα等を例示することができ、また、上記非ヒト動物におけるサイトカインの産生量は、非ヒト動物における血清サイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することができ、細胞におけるサイトカインの産生量は、細胞の培養上澄中のサイトカインの量としてＥＬＩＳＡにより測定することができる。そして、ＭｙＤ８８−／−マウスやＭｙＤ８８−／−の遺伝子が発現している細胞はＷＯ００／４１５６１号公報に記載の方法により、ＴＬＲ９−／−マウスやＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞は特開２００２−３４５６５号公報に記載の方法により調製することができる。
【００２０】
また本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；の受容体としての使用方法に関する。上記タンパク質としては、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡにコードされるタンパク質；配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、かつヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；を用いることができる。ここで、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００２１】
上記本発明の使用方法の具体的態様としては、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定するマラリア感染症の検出・測定方法や、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、ヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体の誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の非ヒト動物に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の非ヒト動物に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＭｙＤ８８＋／＋及びＴＬＲ９＋／＋の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量と、ＭｙＤ８８−／−及び／又はＴＬＲ９−／−の遺伝子が発現している細胞に被検物質とヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイトカインの産生量とを比較・評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、ＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答誘導のメカニズムを解明する方法等を挙げることができる。
【００２２】
また本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有する、ＴＬＲ９と相互作用して全活性の細胞内シグナル伝達を引き起こす物質であるＴＬＲ９作動剤（アゴニスト）に関し、かかるＴＬＲ９作動剤は、ＭｙＤ８８を活性化することや、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生等を伴うＴＬＲ−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導することや、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＲＩＦを活性化することなく、ＴＬＲ９を選択的に活性化することが可能で、自然免疫制御剤として用いることができる。
【００２３】
さらに本発明は、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン又はそれらの誘導体をＴＬＲ９のリガンドとして使用する方法に関し、かかる方法は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＦＮαのいずれか１以上のサイトカインの産生等を伴うＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存経路による免疫応答を誘導させる方法や、自然免疫の制御方法を含み、その具体的態様としては、前記の本発明の使用方法の具体的態様として例示した方法を挙げることができる。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
『ＨＺの自然免疫活性の活性化とその調節』
［材料及び方法］
（マウス）
変異マウス（ＭｙＤ８８−、ＴＲＩＦ−、ＴＬＲ２−、ＴＬＲ４−、ＴＬＲ７−、ＴＬＲ９欠損マウス）を、１２９／Ｏｌａ×Ｃ５７／ＢＬ６又はＣ５７／ＢＬ６をバックグランドとし、文献（Immunity 9: 143-150, 1999; Immunity 11: 443-451, 1999; Nature 408: 740-745, 2000; Nat. Immunol. 3: 196-200, 2002; Science 301: 640-643, 2003）記載の通りに産出した。同年齢の野生型マウスと変異マウスを実験に使用した。インビボの研究には、P. falciparum培養物から精製したＨＺ１５００μｇと合成ＨＺ（βヘマチン）とを、野生型マウス、ＭｙＤ８８−／−マウス又はＴＬＲ９−／−マウスの腹腔内に注入した（J. Immunol. 172: 3101-3110, 2004）。サイトカインＥＬＩＳＡ用に、１、２、４及び６時間後に尾から血清を収集した。
【００２６】
（試薬）
合成ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｄ３５は、北海道システムサイエンス株式会社より購入、合成した。Salmonella minnesota Re-595由来リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、塩化ヘミン（hemin chloride）及びクロロキン（ＣＱ）はSigma-Aldrichより購入した。DNase (Dnase- I) はInvitrogenから購入した。
【００２７】
（ＨＺ及び合成ＨＺ（βヘマチン）の調製）
ＨＺ（不溶性クリスタロイド構造）は、P. falciparum(３Ｄ７株)で感染した赤血球から精製した（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991）。要約すると、赤血球をサポニンで溶解した後、原虫を超音波処理し、２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で７〜８回洗浄した。次に、ペレットをプロテイナーゼＫ（２ｍｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で一晩インキュベートした。ペレットはその後、２％のＳＤＳ内で３回洗浄し、６Ｍの尿素内で室温で３時間、シェーカー上でインキュベートした。ＨＺペレットを２％のＳＤＳで洗浄した後、蒸留水で３〜５回洗浄し、蒸留水に再懸濁し、使用前に再び超音波処理した。いくつかの実験において、文献（J. Immunol. 167: 2602-2607, 2001）記載の通りに、ＨＺは、９５℃で１５分間の熱失活を行うか又は、１００Ｕ／ｍｌのDNase-Iで１時間処理を行った。DNase-I処理は、Ｐ．falciparumの粗抽出物から完全にゲノムＤＮＡを除去することによって行った（図５ａ）。
【００２８】
核酸、タンパク質の定量化は、分光光度計を使用するか、又はアガロースゲル内の臭化エチジウム染色法、ＢＣＡ法（Biorad） 若しくはピロガロールレッド方法（和光純薬工業）によって行った。全脂質（ＴＰ）は、Bligh-Dyer 法（東レリサーチセンター）によるＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）又はIatron LQ（三菱化学ヤトロン）を使用した酵素方法によって測定した。合成ＨＺ（βヘマチン）は、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づくJaramillo et al.のプロトコール（J. Immunol. 172:3101-3110）を用いて精製した。エンドトキシンの混入を避けるために、全ての溶液はエンドトキシンを含まないＰＢＳ又は蒸留水を用いて調製した。ＬＡＬ分析（Bio-Whittaker）により測定したエンドトキシンの量は、使用したＨＺ１ｎｍｏｌｅ当たり０．００１ＥＵ未満であった。
【００２９】
（ＨＺ又は合成ＨＺ（ｂヘマチン）の定量化）
ＨＺ又は合成ＨＺの濃度は、ヘムポリマーを、２０ｍＭ水酸化ナトリウム／２％ＳＤＳの溶液内で、室温で、２時間脱重合して定量し、Ｏ．Ｄ．は４００ｎｍであった（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996）。ヘムのモラー吸光係数は４００ｎｍで１×１０５であり、２５μｇのP. falciparum ＨＺは、ヘム含有量２９ｎｍｏｌｅと同等である。
【００３０】
（細胞）
脾臓細胞の単一細胞懸濁液（single cell suspension）（５×１０５細胞／ウェル）を、１０％のＦＣＳを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０培地内で４８時間培養した。Ｆｌｔ３リガンド誘導骨髄由来ＤＣ（ＦＬ−ＤＣ）（１×１０５細胞／ウェル）は、骨髄細胞とＦｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ；Pepro Tech 社製）とを、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地内で８〜９日間培養して産出した。細胞を、指定の刺激によって刺激し、サイトカインＥＬＩＳＡ用に、上澄みを回収した。
【００３１】
（サイトカインＥＬＩＳＡ）
マウスのＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６(R & D Systems)及びＩＦＮα（PBL Bio. Lab 社製）を、上澄み又は血清のいずれかで、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡで測定した。
【００３２】
（共刺激による分子発現のフローサイトメトリー分析）
刺激した細胞の細胞表面の分子発現を、文献（J. Exp. Med. 196: 269-274, 2002）記載の通り測定した。要約すると、刺激した細胞を、冷却したＰＢＳ内で洗浄し、固定し、抗ＣＤ１６抗体の存在下で、ＦＩＴＣ標識抗体、ＰＥ標識抗体、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ標識抗体及びＡＰＣ標識抗体で、室温で３０分染色した。染色した細胞を洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．１％NaN３内に再懸濁し、ＦＡＣＳCalliberで分析した後、CellQuest software(BD社製)で分析した。全ての抗体は、ＢＤより入手した。
【００３３】
（統計的分析）
統計的な有意差は、Student’s t-testを用いて分析した。Ｐ＜０．０５は有意とみなした。
【００３４】
［試験、結果及び評価］
（P. falciparum由来の精製ＨＺの、ＭｙＤ８８依存性経路を通してのマウスの脾臓細胞及び樹状細胞の活性化）
P. falciparum由来の精製ＨＺが、マウス免疫システムを活性化するかどうかを調べるために、脾臓細胞及びＤＣ（マウス骨髄樹状細胞）を、インビトロで精製ＨＺで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイトカインの産出をＥＬＩＳＡによって測定した。ＦＬ−ＤＣ（Ｆｉｔ３リガンド誘導骨髄由来ＤＣ）は、ＨＺに応答して、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）及びＩＬ−６を、用量依存的に大量に産出し、その量はＣｐＧ ＯＤＮとほぼ同様の値だった（図１ａ）。ＨＺ誘導性の自然免疫活性化における、ＴＬＲの役割を調べるために、多数のＴＬＲが介するサイトカイン誘導に必須の分子アダプターであるＭｙＤ８８が欠損しているマウスを用いた（Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004）。ＭｙＤ８８−／−マウス由来のＦＬ−ＤＣでは、ＨＺ刺激により、ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ４０、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６の産出が著しく障害された（図１ｂ）。
【００３５】
同様に、ＭｙＤ８８−／−脾臓細胞では、ＨＺに応答して、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）を産出する応答が障害されていた（図１ｃ）。更に、ヘモゾインは、ＦＬ−ＤＣのＣＤ１１ｃ＋、Ｂ２２０＋plasmacytoidＤＣサブセット及びＣＤ１１ｃ＋、Ｂ２２０−骨髄ＤＣサブセットの両方を刺激し、ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて、ＦＬ−ＤＣの両サブセットで阻害されていたＣＤ４０及びＣＤ８６の発現をアップレギュレートした（図１ｄ）。
【００３６】
（自然免疫応答のＨＺ活性化のＴＲＩＦ依存性）
ＨＺ誘導性の自然免疫の活性化が、ＭｙＤ８８にのみ依存的であることを確認するために、ＭｙＤ８８非依存性経路に必須のアダプター分子であるＴＲＩＦ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）領域含有アダプター）が欠損しているマウスを用いた（Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004）。ＭｙＤ８８−／−マウスとは対照的に、ＴＲＩＦ−／−マウスのＦＬ−ＤＣは、ＨＺに応答し、ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０（ｐ＜０．０５、ＴＲＩＦ−／−ｖｓ培地）を産出し、野生型マウス（ｐ＞０．０５）の値とほぼ同じであった（図２）。ＬＰＳ誘導性のＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０は、ＴＲＩＦ−／−マウスのＦＬ−ＤＣで障害され、P. falciparum培養物から精製した多量のＨＺに、ＬＰＳが混入していないことを示唆した。これらのデータは、ＨＺがＭｙＤ８８を通してマウスにおける炎症誘発性応答を活性化することを示し、ＭｙＤ８８依存性ＴＬＲの１つがＨＺの認識に関与していることを示した。
【００３７】
（自然免疫応答のＨＺ活性化のＴＬＲ−９依存性）
ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス及びＴＬＲ９−／−マウスから得た脾臓細胞及びＤＣを用いて、ＨＺ誘導性の自然免疫活性化が障害されているか、又は変更されているかを調べるために、さらに実験を行った。ＨＺは、野生型マウス、ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウスにおいて、ＦＬ−ＤＣを刺激し、ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０＋plasmacytoidＤＣサブセット及びＣＤ１１ｃ＋、Ｂ２２０−骨髄ＤＣサブセットの両方で、ＣＤ４０及びＣＤ８６をアップレギュレートした（図３ａ）。対照的に、ＴＬＲ９−／−マウス由来のＦＬ−ＤＣの両サブセットでは、ＨＺに応答してＣＤ４０及びＣＤ８６をアップレギュレートしなかった（図３ａ）。
【００３８】
同様に、野生型マウス、ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス由来のＦＬ−ＤＣは、ＨＺに応答して、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６を産出したが、ＴＬＲ９−／−マウスでは産出しなかった（図３ｂ）。ＨＺはＦＬ−ＤＣによってＩＦＮαを誘導しなかった点は注目すべきであり、ＨＺ誘導性サイトカインの特性が、Ｋ型ＣｐＧＯＤＮ（Ｂ型としても知られている）と同様であるが、Ｄ型ＯＣＮ（Ａ型としても知られている）、細菌性若しくはウイルス性ＤＮＡ等のＴＬＲ９の既知の天然ＤＮＡリガンドとは異なることを示唆している（図３ｃ）（Nat. Rev. Immunol. 4: 249-258, 2004）。それにもかかわらず、これらのデータは、ＴＬＲ９及びＭｙＤ８８が、マウス脾臓細胞及びＤＣにおけるＨＺ誘導性の活性化に重要であることを、明らかに証明している。
【００３９】
（炎症誘導性サイトカインのＨＺ活性化のインビボにおけるＭｙＤ８８／ＴＬＲ９依存性）
ＨＺ活性化が、インビボで、ＴＬＲ９に介され、ＭｙＤ８８に依存的であることを確認するために、P. falciparum精製ＨＺを、野生型マウス及びＭｙＤ８８−／−マウス又はＴＬＲ９−／−マウスの腹腔内に注入し、血清サイトカインの産出をモニターした。ＨＺの注入により、野生型マウスのＭＣＰ−１及びＩＬ−６の血清量が著しく上昇し、その値は１〜４時間に最大となり、６時間以内に減少した（図４ａ）。対照的に、ＭｙＤ８８−／−マウス及びＴＬＲ−／−マウスでは、この上昇は、完全に阻害されていた。６時間後、サイトカインの量は、野生型マウスで減少した。これらのデータは、インビボ及びインビトロの両方で、ＨＺ誘導性の炎症誘導性応答が、ＴＬＲ９及びＭｙＤ８８によって介されていることを明確に示している。
【００４０】
合成ＨＺ（βヘマチン、実験室条件で短量体ヘムより合成）は、原虫で天然に形成されたＨＺと構造が似ており（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991）、原虫又は培養物由来の混入物を含んでいない。合成ＨＺがＴＬＲ９依存形式で、自然免疫システムを活性化しているかどうか調べるために、野生型マウス又はＴＬＲ９−／−マウスに、合成ＨＺを注入し、血清内のＩＬ−６及びＭＣＰ−１産生量をモニターした。野生型マウスへの合成ＨＺの注入は、血清内のＭＣＰ−１及びＩＬ−６産出を誘導し、その量は１〜４時間に最大となった（図４ｂ）。対照的に、この応答は、ＴＬＲ９−／−マウスでは阻害されていた（図４ｂ）。これらのデータは、合成ＨＺと同様P. falciparum由来精製天然ＨＺも、マウスの自然免疫システムを刺激していることを示唆し、ＨＺ誘導性の、ＴＬＲ９仲介自然免疫活性化に他の混入物が関与している可能性を排除している。
【００４１】
P. falciparumの培養物中、又はP. falciparum培養物からＨＺ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、上記の多くの精製方法に加えて、ＨＺの精製度を定量するために、一連の分析を行った（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002）。臭化ブロマイド染色アガロースゲル（図５）でも、分光光度計でも、ＨＺ又はDNase処理ＨＺ溶液（１ｍＭ）において、ＤＮＡもＲＮＡも検出されなかった。DNase処理又は熱失活も、ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０のＨＺ誘導ＤＣ産出に影響しなかった（図５ｂ）。さらに、P. falciparumから単離したゲノムＤＮＡ及びＲＮＡは、ＴＮＦα及びＩＬ−１２の産出を含む自然免疫応答を著しく活性化しなかった（未公表の実験及び（J. Immunol. 172: 3989-3993, 2004））。どの方法でも、ＨＺ溶液（１ｍＭ）内に、タンパク質も脂質も検出されなかった。つまり、これらのデータを合わせると、ＨＺ誘導性、ＴＬＲ９−仲介性の自然免疫活性は、他の混入物に起因するものではないことを、強く示唆している。
【００４２】
（ＨＺ誘導性自然免疫の活性化のクロロキン感受性）
抗マラリア製剤クロロキン（ＣＱ）は、エンドソーム／リソソームの成熟、マラリアヘモゾインのクリスタル形成（crystal formation）を阻害するほか、マラリア感染中の炎症誘導性応答を阻害することが報告されているが、ＣＱの抗マラリア効果の正確なメカニズムは、未だに論争中である（Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002; Life Sci. 74: 1957-1972, 2004）。最近の論拠は、ＣＱは、ＴＬＲ９仲介性自然免疫活性化も阻害することを示唆している（J. Immunol. 160: 1122-1131, 1998）。ＨＺ誘導性の炎症誘導性応答に対するＣＱの効果を調べるために、ＣＱの存在下で、ＦＬ―ＤＣをＨＺで刺激した。ＨＺ誘導性のＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０の産出は、ＣＱにより減少した（図５ｂ）。
【００４３】
これらは、既知のメカニズムである、マラリア病原体によるＣＱ阻害に加えて、ＣＱが、マラリア感染中のＨＺ誘導性、ＴＬＲ９仲介性の自然免疫応答を阻害することができ、それは治療効果に貢献する可能性があることを示唆している。さらなる研究が必要ではあるが、ＨＺ形成を阻害する能力に加えて、ＣＱがＨＺとＴＬＲ９の相互作用に干渉し、又は食胞を含むＨＺの成熟を阻害し、結果的に以下の自然免疫活性化を阻害する可能性がある。
【００４４】
ＴＬＲ９が特異的ＩｇＧにより、細菌性ＤＮＡ又は自己ＤＮＡクロマチン複合体中にＣｐＧモチーフを認識することは報告されているが、ＴＬＲ９リガンドとしての非ＤＮＡ分子は報告されていない（Trends Immunol. 25: 381-386, 2004; Annu. Rev. Immunol. 20: 709-760, 2002）。最近の研究によって、ＴＬＲ９により認識される非ＤＮＡリガンドの最初の論拠が報告されている。ＨＺは、赤血球からヘモグビンが分解される間に寄生虫の食胞に産出した重合ヘム（ferriprotoporphyrin IX）の結晶形である。マクロファージ、ＤＣ等の貪食細胞に捕獲されると、ＨＺは、ＴＬＲ９がＰ１３キナーゼを経由して、小胞体から補充されることがあるファゴソーム内に蓄積する（J. Exp. Med. 196: 269-274, 2002; Nat. Immunol. 5: 190-198, 2004）。これは、ＴＬＲ９が、ファゴソーム内でＨＺを認識しうることを示唆している。
【００４５】
ＨＺは、高疎水性であり、最近提案された仮説に従うと、免疫刺激効果に関与する可能性がある（Nat. Rev. Immunol. 4: 469-478, 2004）。ＨＺは本来、宿主赤血球内のヘモグロビンに由来しているが、生存し続けるために、原虫によって、毒性のヘムから、原虫に無毒の代謝物であるＨＺへと、変更されることは興味深い。これは、不活性自己分子（inert self molecule）（ヘム）が、マラリア感染中に不活性免疫システム内において、活性化した“非自己”分子となることを示唆している。
【００４６】
マラリア感染中のＨＺ誘導性、ＴＬＲ９仲介性の自己免疫活性化及びそれに対する宿主の防御の生物学的な役割は現在調査中である。予備的な結果により、マラリア原虫に対する自然免疫応答は、ＴＬＲを含む宿主やPlasmodiumの複数の要因に依存していることを示唆している。最近の研究を含む、マラリア感染中のＴＬＲ仲介性の自然免疫活性化が、宿主防御免疫（host protective immunity）に寄与しているのか、マラリア免疫逃避メカニズム(malarial immune escape mechanism)に寄与しているのかを、研究することは重要である。また、ＴＬＲ９がＣｐＧＤＮＡ及びＨＺを識別する分子メカニズムを研究することも重要である。それにもかかわらず、現在までの観察により、マラリア感染中のヘム代謝物であるＨＺは、ＴＬＲ９仲介性、ＭｙＤ８８依存性及びクロロキンビン敏感性の経路を通して、不活性免疫システムを活性化することを確かに証明しており、これは、不活性免疫におけるマラリア寄生虫−宿主相互作用をさらに理解する鍵となる。
【００４７】
［図の説明］
図１．P. Falciparum由来精製ＨＺは、ＭｙＤ８８依存性経路を通して、炎症誘発性応答を活性化する：
（ａ）野生型（ＷＴ）マウスのＦＬ−ＤＣを、精製ヘモゾイン（ＨＺ）（３０及び１００μＭ）で２４時間刺激した。ＥＬＩＳＡで、上澄み中のＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１又はＩＬ−６の産生を測定した。コントロールとして、３μＭのＣｐＧＤＮＡ（Ｄ３５）を用いた。野生型（黒いバー）、ＭｙＤ８８−／−マウス（白いバー）の（ｂ）ＦＬ−ＤＣ、及び（ｃ）脾臓細胞を、３０μＭのＨＺ及びＣｐＧＤＮＡ（Ｄ３５、３μＭ）又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で、２４時間刺激した。培養上澄み中のＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１又はＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡで測定した。（ｄ）ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を調べるために、骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０−）及びplasmacytoid ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０＋）を、フローサイトメトリーによって分析した。斜線部分は、ＨＺで刺激されていない細胞を現し、実線はＨＺで刺激された細胞を現す。結果は、２度の培養の平均値＋Ｓ．Ｄ．を現し、少なくとも５回の別個の実験の代表例である。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【００４８】
図２．ＨＺ誘導性のＤＣ活性化はＴＲＩＦ非依存的である：
野生型（ＷＴ）マウス及びＴＲＩＦ−／−マウスのＦＬ−ＤＣは、３０μＭのＨＺ及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートし、その後上澄みをＥＬＩＳＡで分析し、ＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０の産生量を定量した。結果は、平均値＋４回の別個の実験のＳＥＭ（ｎ＝４）である。Ｐ＞０．０５、ＨＺ（ＷＴ）ｖｓＨＺ（ＴＲＩＦ−／−）。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【００４９】
図３．ＴＬＲ９はＨＺ誘導性の自然免疫活性化を仲介する：
（ａ）野生型（ＷＴ）マウス及びＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス、ＴＬＲ９−／−マウスの骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０−）及びplasmacytoid ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+、Ｂ２２０＋）を、フローサイトメトリーで分析し、ＣＤ４０及びＣＤ８８の発現を定量した。斜線部分はＨＺで刺激されていない細胞を現し、実線はＨＺで刺激された細胞を現す。野生型及びＴＬＲ９−／−細胞は指定の刺激でインキュベートし、（ｂ）脾臓細胞によるＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１又はＩＬ−６の産生、及び（ｃ）ＦＬ−ＤＣによるＩＦＮα産生を、ＥＬＩＳＡで分析した。結果は、少なくとも５回の別個の実験の代表例である。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【００５０】
図４．インビボのＨＺ及び合成ＨＺ（βヘマチン）による血清サイトカインの産生はＭｙＤ８８及びＴＬＲ９依存的である：
１５００μｇの（ａ）P. falciparum精製ＨＺ、又は（ｂ）合成ＨＺ（ｓＨＺ）のいずれかを、ＭｙＤ８８−／−マウス、ＴＬＲ９−／−マウス又は野生型（ＷＴ）マウスの腹腔内に注入した。ＭＣＰ−１及びＩＬ−６の血清量は指定の時点においてＥＬＩＳＡで測定した。
【００５１】
図５．ヘモゾインはＤＮＡを含まず、ＨＺ誘導性の炎症誘導性サイトカインの産生は、DNase耐性及び熱耐性であるが、クロロキン感受性である：
（ａ）ＤＮＡの混入を検出するために、ＨＺをアガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した。Ｍ、マーカー；レーン１、ＨＺ溶液（１ｍＭ、５μｌ）；レーン２、熱失活ＨＺ（１ｍＭ、５μｌ）；レーン３、DNase処理ＨＺ（１ｍＭ、５μｌ）；レーン４P.falciparum粗抽出物（４．５％の寄生虫血症を含む１００ｍｌの濃縮培養物から５μｌ）；DNase処理粗抽出物（５μｌ）。（ｂ）Ｃ５７／Ｂ６マウスのＦＬ−ＤＣを、３０μＭのＨＺ又はDNase処理、熱失活、及び／又はＣＱ（１０μＭ）で２４時間インキュベートした。その後、上澄みを回収し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦα又はＩＬ−１２ｐ４０を測定した。コントロールとして、ＣｐＧＯＤＮ（Ｄ３５）を３μＭで用いた。Ｄ３５のＴＮＦαの値を図に示す。結果は、２度ずつ行った、３回の別個の実験の内の１つの代表例である（平均＋Ｓ．Ｄ．）。＊Ｐ．＜０．０５、ＨＺｖｓＨＺ＋ＣＱ；＊＊Ｐ．＜０．０５、ＣｐＧＯＤＮｖｓＣｐＧＯＤＮ＋ＣＱ）。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明において、マラリア原虫−宿主間の相互作用について、ＨＺが自然免疫を活性化する免疫反応のメカニズムを分子レベルで解明した。本発明は、この知見に基いて、マラリア感染症の診断のために用いることができるマラリア感染症の検出・測定方法、該ＨＺの誘導によるマラリア感染症の検出・測定方法を用いたマラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法を開発したものである。更に、上記知見に基いて、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いることによる、ＨＺの誘導によるＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導の調節手段を開発した。
【００５３】
本発明は、これらの開発により、マラリア感染症の診断、マラリア感染症のワクチン又は予防或いは治療薬の創製、更にはマラリア感染症に対する免疫療法としての自然免疫誘導の調節、すなわち、ＨＺ、ＴＬＲ９（Toll様受容体９）、ＭｙＤ８８を含む自然免疫関連分子若しくはそのシグナル経路をターゲットにしたマラリア感染症の診断、抗マラリア薬や免疫療法の開発に対処する方策を提示し、これらの分野での利用に大きな貢献が期待できるものである。そして、ＴＬＲ９リガンドとして知られているＣｐＧＯＤＮは、自然免疫賦活剤として、癌や感染症の治療薬とのＣｐＧＯＤＮの併用療法や、抗アレルギー薬、およびワクチンアジュバントとして開発されていることから、ヘモゾイン、合成ヘモゾイン、又はそれらの誘導体は、ＣｐＧＯＤＮと同様に、自然免疫賦活剤として、癌や感染症の治療薬との併用療法や、抗アレルギー薬、およびワクチンアジュバントとして開発され得る。また、ヘモゾインはマウスＰＤＣにおいてＩＦＮαを誘導しないことも、各種のＣｐＧＯＤＮの活性と比較するうえで重要な知見である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体からなる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導調節用アジュバント。
【請求項１】
マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのヘモゾイン又は合成ヘモゾイン或いはその誘導体からなる、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫誘導調節用アジュバント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１２４１２（Ｐ２０１２−１２４１２Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１９１３１（Ｐ２０１１−２１９１３１）
【出願日】平成２３年１０月３日（２０１１．１０．３）
【分割の表示】特願２００６−５４７７０２（Ｐ２００６−５４７７０２）の分割
【原出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月３日（２０１１．１０．３）
【分割の表示】特願２００６−５４７７０２（Ｐ２００６−５４７７０２）の分割
【原出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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