ヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制するラクトバシラス属乳酸菌を含有する新規納豆
【課題】胃・十二指腸潰瘍の発症に関与するヘリコバクター・ピロリやその他の病原菌を抑制する作用がある乳酸菌を含有するヨーグルトが健康食品として汎用されているが、乳製品の苦手な人やアレルギーのある人は日常的にヨーグルトを摂ることができない。日常的に手軽に飲食でき、乳製品の苦手な人やアレルギーのある人にも病原菌の抑制活性をもつ乳酸菌を日常的に摂取させることができる新規な納豆の作製方法及び／又はその飲食品を提供する。
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリその他の病原菌を抑制するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌と納豆菌を含有する新規の納豆及びその飲食品の製造において、納豆としての糸引き、風味、味等納豆の特性を損なわないラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループの乳酸菌を含有する納豆及びその飲食品。
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリその他の病原菌を抑制するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌と納豆菌を含有する新規の納豆及びその飲食品の製造において、納豆としての糸引き、風味、味等納豆の特性を損なわないラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループの乳酸菌を含有する納豆及びその飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）及びその他の病原菌を抑制するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌と納豆菌を含有する新規納豆の提供及びその飲食品の製造において、納豆としての糸引き、風味、味等納豆の特性を損なわないラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループの乳酸菌を含有する納豆及びその飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、我が国の伝統ある健康維持に優れた食品として知られている。一方、乳酸菌も同様にヨーグルトや健康食品、整腸剤等に利用される健康維持に優れたものとして繁用されている。とりわけ胃・十二指腸潰瘍の発症に関与するヘリコバクター・ピロリの抑制活性をもつ乳酸菌を含有するヨーグルト（特許文献）は、機能性ヨーグルトとして広く飲食されているが、乳製品の苦手な人やアレルギーのある人は日常的にヨーグルトを摂ることができない。病原菌の抑制活性をもつ乳酸菌を日常的に手軽に飲食できて日本人の食生活に馴染みのある納豆とともに摂ることができれば、ヨーグルトと同様に国民の健康に寄与できる。納豆菌と乳酸菌の共存した納豆とその飲食品については、乳酸菌の増殖によって納豆菌の働きが抑制され、納豆としての特性を損なうことが多い。そのため、納豆の製造過程では乳酸菌を加えず製造後に乳酸菌を別途の容器に入れ添付する方法（特許文献２）や、乳酸産生量の少ない菌種（例えば、エンテロコッカス属（特許文献３及び特許文献４）やラクトバチルス属の中でガス産生のヘテロ発酵乳酸菌（特許文献４））の乳酸菌を利用する方法が採られた。さらに、乳酸菌の接種量によって納豆の特性に影響する（特許文献５）ことが考えられるため、乳酸産生量の高い菌種を利用した乳酸菌含有納豆には困難性がある。
ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（以下、Ｎｏ．１０８８と略記）は本発明者によって開発されたラクトバシラス属乳酸菌であり、ヒトの胃液より単離されたものであるため、非常に優れた耐酸性をもちヒトの胃内でも生存できる特性をもつ。また、病原菌（大腸菌Ｏ−１５７やヘリコバクター・ピロリ菌など）に対して強い増殖抑制効果があり、ラクトバシラス属の細菌の中でも非常に有用な菌株であることが示されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３０４６３０３号
【特許文献２】特開２００４−２３６５９９
【特許文献３】特開２００４−５１５３０
【特許文献４】特開２００３−１０９９３０
【特許文献５】特開２００９−１１２２７
【特許文献６】特許４４５７３６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
胃・十二指腸潰瘍の発症に関与するヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制する作用がある乳酸菌を含有するヨーグルトが健康食品として汎用されているが、乳製品の苦手な人やアレルギーのある人は日常的にヨーグルトを摂ることができない。また、ヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制する活性の高い乳酸菌を利用した乳酸菌含有納豆には困難性があった。
【発明が解決するための手段】
【０００４】
病原菌の抑制活性をもつ乳酸菌を日常的に手軽に飲食できる形態として、日本人の食生活に馴染みのある納豆に乳酸菌を接種することで、前記の機能性ヨーグルトと同様の効果をもつ新たな機能性食品を作製する。また、用いる乳酸菌は、ヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制する作用があり、煮大豆中に納豆菌とともに添加し共培養したとき、納豆の特性を失うことなく、増殖・発酵することもなく生存維持するものを使用する。
【０００５】
ラクトバシラス乳酸菌含有納豆の作製
本発明は以下の使用する菌株に限定されるものではなく、ラクトバシラス属乳酸菌によるものである。
【０００６】
納豆菌との共存に適した乳酸菌の選択及びその評価
蒸煮した大豆５０ｇに納豆菌を５ｘ１０９生菌単位（ＣＦＵ）と種々のラクトバシラス属の乳酸菌１〜５ｘ１０９生菌単位をそれぞれ接種し、３７℃下で２４時間培養した後の納豆菌数及び乳酸菌数の測定、さらに冷蔵庫内での菌の保存性について評価した。
【０００７】
結果は表１に示すようにラクトバシラス属の中で、１５℃で増殖せずガスを産生しないラクトバシラス・アシドフィルスグループの乳酸菌（ラクトバシラス・アシドフィルス（以下、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓと略記する）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（以下、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉと略記する）、ラクトバシラス・ガッセリィ（以下、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉと略記する）、ラクトバシラス・クリスパアタス（以下、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓと略記する）、ラクトバシラス・グリンアラウム（以下、Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）と略記する））が増殖せず生存維持していた。また、冷蔵庫内で保存した際も乳酸菌数がわずかに減少したものの納豆菌、乳酸菌共にその存在を確認できた。すなわち、上記で示した機能性ヨーグルトと同様の手法によりラクトバシラス乳酸菌含有納豆の作製の可能性が示唆された。
【０００８】
【表１】
【０００９】
主なラクトバシラス属乳酸菌含有納豆の納豆としての評価
上記［０００６］で示したラクトバシラス属乳酸菌含有納豆のうち、７菌株の納豆についてその特性（糸引き具合、風味、味等）の評価を行った。
【００１０】
結果を表２に示した。ラクトバシラス・アシドフィルスグループのＮｏ．１０８８．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＪＣＭ１１８７及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＣＭ１１３１は納豆としての特性が維持されており、納豆菌のみで作製した納豆と同等のものであった
【００１１】
【表２】
【発明の効果】
【００１２】
納豆とラクトバシラス属乳酸菌による病原菌の抑制効果
上記に示したラクトバシラス乳酸菌含有納豆は、病原菌に対する抑制効果及び有用な腸内細菌の増殖を促進する効果をもつことが示された。以下に、その方法と結果を示す。
【００１３】
納豆エキスの調製
市販納豆５０ｇに４５０ｍＬの精製水を加え１００℃３０抽出し、冷却後ろ過したものを納豆エキスとした。
【００１４】
試験例１．試験管内実験による出血性大腸菌Ｏ−１５７に対する抑制試験
ＭＲＳブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）を１２１℃１５分間オートクレーブした液体培地（納豆エキスを加える場合、全体の５％になるよう調整）を作製した。また、乳酸菌はＮｏ．１０８８又はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＣＭ１１３１を用い、液体培地１０ｍＬ中に１ｘ１０８生菌単位になるよう調製し加えた。実験群として、Ａ群．ＭＲＳブロスのみ、Ｂ群．ＭＲＳブロス＋納豆エキス、Ｃ群．ＭＲＳブロス＋乳酸菌、Ｄ群．ＭＲＳブロス＋納豆エキス＋乳酸菌の４群を作製し、それぞれの液体培地１０ｍＬに出血性大腸菌Ｏ−１５７（以下、Ｏ−１５７と略記）５ｘ１０７生菌単位を加え、３７℃下に静置し、経時的にＯ−１５７の菌数を測定した。Ｏ−１５７の菌数測定にはディー・エイチ・エル（ＤＨＬ）寒天培地（日水製薬社製）を用いた。
【００１５】
試験結果
結果は図１に示したように、Ｏ−１５７は乳酸菌（Ｎｏ．１０８８又はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＣＭ１１３１）を加えたＣ群において抑制され、納豆エキスと乳酸菌を加えたＤ群では培養時間が２４時間の時点で菌数が検出限界以下になる等、Ｃ群に比べてさらに顕著に抑制された。一方、納豆エキスを加えたＢ群では、Ｏ−１５７はＡ群と同様の変化を示し抑制されなかった。すなわち、Ｏ−１５７に対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆エキスを加えることでさらにその効果が強まることが示された。
【００１６】
試験例２．試験管内実験によるサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）に対する抑制試験
試験方法は、試験１の方法に準拠した。
【００１７】
試験結果
結果は図２に示したように、サルモネラ・エンテリティディスは乳酸菌を加えたＣ群において抑制され、納豆エキスと乳酸菌を加えたＤ群では培養時間が２４時間の時点で菌数が検出限界以下になる等、Ｃ群に比べてさらに顕著に抑制された。一方、納豆エキスを加えたＢ群では、サルモネラ・エンテリティディスはＡ群と同様の変化を示し抑制されなかった。すなわち、サルモネラ・エンテリティディスに対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆エキスを加えることでさらにその効果が強まることが示された。
【００１８】
試験例３．試験管内実験によるヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に対する抑制試験
試験方法は、液体培地に５％ウマ血清添加ブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス（ＢＨＩ ｂｒｏｔｈ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた以外は試験１の方法に準拠した。またのヘリコバクター・ピロリの菌数測定には滅菌したＢＨＩ寒天培地（ベクトン・ディッキンソン社製）９９３０ｍＬにウマ血清７０ｍＬ、テトラゾリウム（シグマ社製）２５ｍｇ、ポリミキシン（シグマ社製）２５００単位、バンコマイシン（シグマ社製）１０ｍｇ、バシトラシン（シグマ社製）５ｍｇを添加したものを用いた。
【００１９】
試験結果
結果は図３に示したように、ヘリコバクター・ピロリは乳酸菌を加えたＣ群において抑制され、納豆エキスと乳酸菌を加えたＤ群では培養時間が２４時間の時点で菌数が検出限界以下になる等、Ｃ群に比べてさらに顕著に抑制された。一方、納豆エキスを加えたＢ群では、ヘリコバクター・ピロリはＡ群と同様の変化を示し抑制されなかった。すなわち、ヘリコバクター・ピロリに対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆エキスを加えることでさらにその効果が強まることが示された。
【００２０】
病原菌感染マウスに対する納豆とラクトバシラス属乳酸菌による病原菌の抑制
試験例４．ヘリコバクター・ピロリ感染マウスに対する抑制試験
４週齢のスペシフィック・パソジェン・フリー（ＳＰＦ）バルブ・シー（Ｂａｌｂ／ｃ）雄マウス（日本クレア社製、東海大学医学部施設内で飼育管理）を１０匹ずつ４群用意した。それらのマウスにヘリコバクター・ピロリの生菌１ｘ１０９生菌単位をリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）５００μＬに懸濁したものを４日間連続で経口投与した。この時、ヘリコバクター・ピロリの感染効率を上げるため、毎回のヘリコバクター・ピロリ投与の１８時間前にオメプラゾール（吉富製薬社製）２００μｇをＰＢＳ５００μＬに溶解したものを投与した。市販納豆を１０ｍｇ／ｍＬになるようＰＢＳに懸濁後ガラスホモジナイザーで破砕し液体化した納豆懸濁液を作製、また、Ｎｏ．１０８８ １ｘ１０９生菌単位をＰＢＳ５００μＬに懸濁したＮｏ．１０８８懸濁液を作製、さらに、それらと同様の操作で納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液を作製した。ヘリコバクター・ピロリの最終投与の２週間後より、Ａ（対照）群．ＰＢＳ投与、Ｂ群．納豆懸濁液投与、Ｃ群．Ｎｏ．１０８８懸濁液投与、Ｄ群．納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液投与の４群に分け、それぞれ５００μＬを経口投与によって１日１回、８週間の連続投与を行った。投与終了後、胃組織中のヘリコバクター・ピロリ菌数の測定を行った。測定は以下の方法で行った。まず、マウスをエーテルで麻酔し屠殺、胃を摘出し、胃内容物を除去後、滅菌したＰＢＳに加え、ガラスホモジナイザーにて破砕し、試料液を調製した。この試料液をＰＢＳによって１０倍、１００倍、１０００倍に希釈し、それぞれの希釈液０．１ｍＬを試験例３で使用した平板培地に滴下し、コンラージ棒で撒き広げ、３７℃下で５日間微好気培養した。その後、出現したコロニーの数と希釈倍率より菌数を算出した。次に、それぞれの投与群より得られた菌数を統計学解析ソフトウェアのエス・ピー・エス・エス（ＳＰＳＳ、ＳＰＳＳ社製）を用いたクラスカル・ワリス検定によって有意差検定を行った。
【００２１】
試験結果
結果は図４に示したように、ヘリコバクター・ピロリはＮｏ．１０８８を投与したＣ群において抑制され、納豆とＮｏ．１０８８を投与したＤ群ではＣ群よりも顕著に抑制された。一方、納豆を投与したＢ群では若干の減少は見られたものの、ＰＢＳを投与した対照群であるＡ群との有意な差はなかった。すなわち、生体内においてもヘリコバクター・ピロリに対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆を併用することでさらにその効果が強まることが示された。
【００２２】
納豆とラクトバシラス属乳酸菌の投与による生体内の有用な腸内細菌の増殖
試験例５．納豆とラクトバシラス属乳酸菌の生体への投与による腸内細菌叢の変化
８週齢のＳＰＦ−Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスを１０匹ずつ４群用意した。この４群に試験例４と同様の投与（Ａ群（対照群）．ＰＢＳ投与、Ｂ群．納豆懸濁液投与、Ｃ群．Ｎｏ．１０８８懸濁液投与、Ｄ群．納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液投与）を行った。投与終了後、糞便中の菌叢を光岡らの方法（光岡知足著、「腸内菌の世界・嫌気性菌の分類と同定」、叢文社、１９８０年）により検出した。各群のマウスの糞便を懸濁した試料液を段階希釈し、平板培地に滴下し、コンラージ棒で撒き広げ、３７℃下で３日間好気又は嫌気培養した。その後、出現したコロニーをグラム染色することで菌種の同定をし、コロニーの数と希釈倍率よりそれぞれの菌数を算出した。次に、得られたそれぞれの菌数を統計学解析ソフトウェアのＳＰＳＳを用いたクラスカル・ワリス検定によって有意差検定を行った。
【００２３】
試験結果
結果は表３に示したように、ＰＢＳを投与したＡ群と比較し、納豆を投与したＢ群では乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の有意な増加が認められた。Ｎｏ．１０８８を投与したＣ群では乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の有意な増加が認められたのに加え、乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の有意な増加が認められた。さらに、納豆とＮｏ．１０８８を併用投与したＤ群では乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の有意な増加が認められ、悪玉菌といわれるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）の著明な抑制や一部のバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の抑制が認められ、納豆と乳酸菌を併用することで腸内菌叢がより改善することが示された。
【００２４】
【表３】
Ａ群（対照群）．ＰＢＳ投与、Ｂ群．納豆懸濁液投与、Ｃ群．Ｎｏ．１０８８懸濁液投与、Ｄ群．納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液投与
【００２５】
以上の試験結果を総括すれば、納豆とラクトバシラス乳酸菌の併用は、試験例１、試験例２及び試験例３から試験管内実験において明らかな通り、それぞれ単独の処置と比較し、多くの病原菌に対し格段の抑制効果を有しており、試験例４及び試験例５から生体内でも同様の効果があることを示したのに加え、腸内菌叢をより改善する効果があることも示した。すなわち、ラクトバシラス属乳酸菌含有納豆は新たな機能性を有する納豆であることが立証された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】納豆及びラクトバシラス属乳酸菌によるＯ−１５７の抑制効果（Ｏ−１５７の菌数を指数表示）
【図２】納豆及びラクトバシラス属乳酸菌によるサルモネラ・エンテリティディスの抑制効果（サルモネラ・エンテリティディスの菌数を指数表示）
【図３】納豆及びラクトバシラス属乳酸菌によるヘリコバクター・ピロリの抑制効果（ヘリコバクター・ピロリの菌数を指数表示）
【図４】ヘリコバクター・ピロリ感染マウスに対する抑制試験
【発明を実施するための形態】
【００２７】
次に本発明を実施するための形態について実施例を記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．
ＭＲＳブロス１０ＬにＮｏ．１０８８を生菌数濃度１ｘ１０７生菌単位／ｍＬの割合で接種し、３７℃下で１５時間静置培養し、培養終了後遠心分離により集菌し、集菌した菌体を滅菌した生理食塩水により洗浄、再び遠心し集菌、滅菌した生理食塩水によって１ｘ１０１０生菌単位／ｍＬに調製した。
【００２９】
実施例２．
蒸煮した大豆１ｋｇに納豆菌と実施例１で作製した菌液１０ｍＬを加え、５０ｇずつに小分けし、３７℃下で２４時間静置培養し、乳酸菌含有納豆を製造した。得られた納豆の納豆菌数は５ｘ１０８生菌単位／ｇ、Ｎｏ．１０８８の菌数は２ｘ１０８生菌単位／ｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、１）乳酸菌（例えば、耐酸性で病原菌の抑制効果及び腸内菌叢の改善効果の特性をもつＮｏ．１０８８）を含有する納豆が、納豆又は乳酸菌の単独の場合よりも機能性（病原菌の抑制効果、腸内菌叢の改善など）に優れていること、２）特にＮｏ．１０８８含有納豆はヘリコバクター・ピロリ感染に対して著明な抑制効果を有すること、の以上のことからラクトバシラス乳酸菌含有納豆が新たな機能性を有する発酵食品である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）及びその他の病原菌を抑制するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌と納豆菌を含有する新規納豆の提供及びその飲食品の製造において、納豆としての糸引き、風味、味等納豆の特性を損なわないラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループの乳酸菌を含有する納豆及びその飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、我が国の伝統ある健康維持に優れた食品として知られている。一方、乳酸菌も同様にヨーグルトや健康食品、整腸剤等に利用される健康維持に優れたものとして繁用されている。とりわけ胃・十二指腸潰瘍の発症に関与するヘリコバクター・ピロリの抑制活性をもつ乳酸菌を含有するヨーグルト（特許文献）は、機能性ヨーグルトとして広く飲食されているが、乳製品の苦手な人やアレルギーのある人は日常的にヨーグルトを摂ることができない。病原菌の抑制活性をもつ乳酸菌を日常的に手軽に飲食できて日本人の食生活に馴染みのある納豆とともに摂ることができれば、ヨーグルトと同様に国民の健康に寄与できる。納豆菌と乳酸菌の共存した納豆とその飲食品については、乳酸菌の増殖によって納豆菌の働きが抑制され、納豆としての特性を損なうことが多い。そのため、納豆の製造過程では乳酸菌を加えず製造後に乳酸菌を別途の容器に入れ添付する方法（特許文献２）や、乳酸産生量の少ない菌種（例えば、エンテロコッカス属（特許文献３及び特許文献４）やラクトバチルス属の中でガス産生のヘテロ発酵乳酸菌（特許文献４））の乳酸菌を利用する方法が採られた。さらに、乳酸菌の接種量によって納豆の特性に影響する（特許文献５）ことが考えられるため、乳酸産生量の高い菌種を利用した乳酸菌含有納豆には困難性がある。
ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（以下、Ｎｏ．１０８８と略記）は本発明者によって開発されたラクトバシラス属乳酸菌であり、ヒトの胃液より単離されたものであるため、非常に優れた耐酸性をもちヒトの胃内でも生存できる特性をもつ。また、病原菌（大腸菌Ｏ−１５７やヘリコバクター・ピロリ菌など）に対して強い増殖抑制効果があり、ラクトバシラス属の細菌の中でも非常に有用な菌株であることが示されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３０４６３０３号
【特許文献２】特開２００４−２３６５９９
【特許文献３】特開２００４−５１５３０
【特許文献４】特開２００３−１０９９３０
【特許文献５】特開２００９−１１２２７
【特許文献６】特許４４５７３６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
胃・十二指腸潰瘍の発症に関与するヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制する作用がある乳酸菌を含有するヨーグルトが健康食品として汎用されているが、乳製品の苦手な人やアレルギーのある人は日常的にヨーグルトを摂ることができない。また、ヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制する活性の高い乳酸菌を利用した乳酸菌含有納豆には困難性があった。
【発明が解決するための手段】
【０００４】
病原菌の抑制活性をもつ乳酸菌を日常的に手軽に飲食できる形態として、日本人の食生活に馴染みのある納豆に乳酸菌を接種することで、前記の機能性ヨーグルトと同様の効果をもつ新たな機能性食品を作製する。また、用いる乳酸菌は、ヘリコバクター・ピロリ及びその他の病原菌を抑制する作用があり、煮大豆中に納豆菌とともに添加し共培養したとき、納豆の特性を失うことなく、増殖・発酵することもなく生存維持するものを使用する。
【０００５】
ラクトバシラス乳酸菌含有納豆の作製
本発明は以下の使用する菌株に限定されるものではなく、ラクトバシラス属乳酸菌によるものである。
【０００６】
納豆菌との共存に適した乳酸菌の選択及びその評価
蒸煮した大豆５０ｇに納豆菌を５ｘ１０９生菌単位（ＣＦＵ）と種々のラクトバシラス属の乳酸菌１〜５ｘ１０９生菌単位をそれぞれ接種し、３７℃下で２４時間培養した後の納豆菌数及び乳酸菌数の測定、さらに冷蔵庫内での菌の保存性について評価した。
【０００７】
結果は表１に示すようにラクトバシラス属の中で、１５℃で増殖せずガスを産生しないラクトバシラス・アシドフィルスグループの乳酸菌（ラクトバシラス・アシドフィルス（以下、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓと略記する）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（以下、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉと略記する）、ラクトバシラス・ガッセリィ（以下、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉと略記する）、ラクトバシラス・クリスパアタス（以下、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓと略記する）、ラクトバシラス・グリンアラウム（以下、Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）と略記する））が増殖せず生存維持していた。また、冷蔵庫内で保存した際も乳酸菌数がわずかに減少したものの納豆菌、乳酸菌共にその存在を確認できた。すなわち、上記で示した機能性ヨーグルトと同様の手法によりラクトバシラス乳酸菌含有納豆の作製の可能性が示唆された。
【０００８】
【表１】
【０００９】
主なラクトバシラス属乳酸菌含有納豆の納豆としての評価
上記［０００６］で示したラクトバシラス属乳酸菌含有納豆のうち、７菌株の納豆についてその特性（糸引き具合、風味、味等）の評価を行った。
【００１０】
結果を表２に示した。ラクトバシラス・アシドフィルスグループのＮｏ．１０８８．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＪＣＭ１１８７及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＣＭ１１３１は納豆としての特性が維持されており、納豆菌のみで作製した納豆と同等のものであった
【００１１】
【表２】
【発明の効果】
【００１２】
納豆とラクトバシラス属乳酸菌による病原菌の抑制効果
上記に示したラクトバシラス乳酸菌含有納豆は、病原菌に対する抑制効果及び有用な腸内細菌の増殖を促進する効果をもつことが示された。以下に、その方法と結果を示す。
【００１３】
納豆エキスの調製
市販納豆５０ｇに４５０ｍＬの精製水を加え１００℃３０抽出し、冷却後ろ過したものを納豆エキスとした。
【００１４】
試験例１．試験管内実験による出血性大腸菌Ｏ−１５７に対する抑制試験
ＭＲＳブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）を１２１℃１５分間オートクレーブした液体培地（納豆エキスを加える場合、全体の５％になるよう調整）を作製した。また、乳酸菌はＮｏ．１０８８又はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＣＭ１１３１を用い、液体培地１０ｍＬ中に１ｘ１０８生菌単位になるよう調製し加えた。実験群として、Ａ群．ＭＲＳブロスのみ、Ｂ群．ＭＲＳブロス＋納豆エキス、Ｃ群．ＭＲＳブロス＋乳酸菌、Ｄ群．ＭＲＳブロス＋納豆エキス＋乳酸菌の４群を作製し、それぞれの液体培地１０ｍＬに出血性大腸菌Ｏ−１５７（以下、Ｏ−１５７と略記）５ｘ１０７生菌単位を加え、３７℃下に静置し、経時的にＯ−１５７の菌数を測定した。Ｏ−１５７の菌数測定にはディー・エイチ・エル（ＤＨＬ）寒天培地（日水製薬社製）を用いた。
【００１５】
試験結果
結果は図１に示したように、Ｏ−１５７は乳酸菌（Ｎｏ．１０８８又はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＣＭ１１３１）を加えたＣ群において抑制され、納豆エキスと乳酸菌を加えたＤ群では培養時間が２４時間の時点で菌数が検出限界以下になる等、Ｃ群に比べてさらに顕著に抑制された。一方、納豆エキスを加えたＢ群では、Ｏ−１５７はＡ群と同様の変化を示し抑制されなかった。すなわち、Ｏ−１５７に対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆エキスを加えることでさらにその効果が強まることが示された。
【００１６】
試験例２．試験管内実験によるサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）に対する抑制試験
試験方法は、試験１の方法に準拠した。
【００１７】
試験結果
結果は図２に示したように、サルモネラ・エンテリティディスは乳酸菌を加えたＣ群において抑制され、納豆エキスと乳酸菌を加えたＤ群では培養時間が２４時間の時点で菌数が検出限界以下になる等、Ｃ群に比べてさらに顕著に抑制された。一方、納豆エキスを加えたＢ群では、サルモネラ・エンテリティディスはＡ群と同様の変化を示し抑制されなかった。すなわち、サルモネラ・エンテリティディスに対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆エキスを加えることでさらにその効果が強まることが示された。
【００１８】
試験例３．試験管内実験によるヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に対する抑制試験
試験方法は、液体培地に５％ウマ血清添加ブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス（ＢＨＩ ｂｒｏｔｈ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた以外は試験１の方法に準拠した。またのヘリコバクター・ピロリの菌数測定には滅菌したＢＨＩ寒天培地（ベクトン・ディッキンソン社製）９９３０ｍＬにウマ血清７０ｍＬ、テトラゾリウム（シグマ社製）２５ｍｇ、ポリミキシン（シグマ社製）２５００単位、バンコマイシン（シグマ社製）１０ｍｇ、バシトラシン（シグマ社製）５ｍｇを添加したものを用いた。
【００１９】
試験結果
結果は図３に示したように、ヘリコバクター・ピロリは乳酸菌を加えたＣ群において抑制され、納豆エキスと乳酸菌を加えたＤ群では培養時間が２４時間の時点で菌数が検出限界以下になる等、Ｃ群に比べてさらに顕著に抑制された。一方、納豆エキスを加えたＢ群では、ヘリコバクター・ピロリはＡ群と同様の変化を示し抑制されなかった。すなわち、ヘリコバクター・ピロリに対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆エキスを加えることでさらにその効果が強まることが示された。
【００２０】
病原菌感染マウスに対する納豆とラクトバシラス属乳酸菌による病原菌の抑制
試験例４．ヘリコバクター・ピロリ感染マウスに対する抑制試験
４週齢のスペシフィック・パソジェン・フリー（ＳＰＦ）バルブ・シー（Ｂａｌｂ／ｃ）雄マウス（日本クレア社製、東海大学医学部施設内で飼育管理）を１０匹ずつ４群用意した。それらのマウスにヘリコバクター・ピロリの生菌１ｘ１０９生菌単位をリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）５００μＬに懸濁したものを４日間連続で経口投与した。この時、ヘリコバクター・ピロリの感染効率を上げるため、毎回のヘリコバクター・ピロリ投与の１８時間前にオメプラゾール（吉富製薬社製）２００μｇをＰＢＳ５００μＬに溶解したものを投与した。市販納豆を１０ｍｇ／ｍＬになるようＰＢＳに懸濁後ガラスホモジナイザーで破砕し液体化した納豆懸濁液を作製、また、Ｎｏ．１０８８ １ｘ１０９生菌単位をＰＢＳ５００μＬに懸濁したＮｏ．１０８８懸濁液を作製、さらに、それらと同様の操作で納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液を作製した。ヘリコバクター・ピロリの最終投与の２週間後より、Ａ（対照）群．ＰＢＳ投与、Ｂ群．納豆懸濁液投与、Ｃ群．Ｎｏ．１０８８懸濁液投与、Ｄ群．納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液投与の４群に分け、それぞれ５００μＬを経口投与によって１日１回、８週間の連続投与を行った。投与終了後、胃組織中のヘリコバクター・ピロリ菌数の測定を行った。測定は以下の方法で行った。まず、マウスをエーテルで麻酔し屠殺、胃を摘出し、胃内容物を除去後、滅菌したＰＢＳに加え、ガラスホモジナイザーにて破砕し、試料液を調製した。この試料液をＰＢＳによって１０倍、１００倍、１０００倍に希釈し、それぞれの希釈液０．１ｍＬを試験例３で使用した平板培地に滴下し、コンラージ棒で撒き広げ、３７℃下で５日間微好気培養した。その後、出現したコロニーの数と希釈倍率より菌数を算出した。次に、それぞれの投与群より得られた菌数を統計学解析ソフトウェアのエス・ピー・エス・エス（ＳＰＳＳ、ＳＰＳＳ社製）を用いたクラスカル・ワリス検定によって有意差検定を行った。
【００２１】
試験結果
結果は図４に示したように、ヘリコバクター・ピロリはＮｏ．１０８８を投与したＣ群において抑制され、納豆とＮｏ．１０８８を投与したＤ群ではＣ群よりも顕著に抑制された。一方、納豆を投与したＢ群では若干の減少は見られたものの、ＰＢＳを投与した対照群であるＡ群との有意な差はなかった。すなわち、生体内においてもヘリコバクター・ピロリに対して、乳酸菌のみでも抑制効果があるが、納豆を併用することでさらにその効果が強まることが示された。
【００２２】
納豆とラクトバシラス属乳酸菌の投与による生体内の有用な腸内細菌の増殖
試験例５．納豆とラクトバシラス属乳酸菌の生体への投与による腸内細菌叢の変化
８週齢のＳＰＦ−Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスを１０匹ずつ４群用意した。この４群に試験例４と同様の投与（Ａ群（対照群）．ＰＢＳ投与、Ｂ群．納豆懸濁液投与、Ｃ群．Ｎｏ．１０８８懸濁液投与、Ｄ群．納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液投与）を行った。投与終了後、糞便中の菌叢を光岡らの方法（光岡知足著、「腸内菌の世界・嫌気性菌の分類と同定」、叢文社、１９８０年）により検出した。各群のマウスの糞便を懸濁した試料液を段階希釈し、平板培地に滴下し、コンラージ棒で撒き広げ、３７℃下で３日間好気又は嫌気培養した。その後、出現したコロニーをグラム染色することで菌種の同定をし、コロニーの数と希釈倍率よりそれぞれの菌数を算出した。次に、得られたそれぞれの菌数を統計学解析ソフトウェアのＳＰＳＳを用いたクラスカル・ワリス検定によって有意差検定を行った。
【００２３】
試験結果
結果は表３に示したように、ＰＢＳを投与したＡ群と比較し、納豆を投与したＢ群では乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の有意な増加が認められた。Ｎｏ．１０８８を投与したＣ群では乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の有意な増加が認められたのに加え、乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の有意な増加が認められた。さらに、納豆とＮｏ．１０８８を併用投与したＤ群では乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、乳酸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の有意な増加が認められ、悪玉菌といわれるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）の著明な抑制や一部のバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の抑制が認められ、納豆と乳酸菌を併用することで腸内菌叢がより改善することが示された。
【００２４】
【表３】
Ａ群（対照群）．ＰＢＳ投与、Ｂ群．納豆懸濁液投与、Ｃ群．Ｎｏ．１０８８懸濁液投与、Ｄ群．納豆＋Ｎｏ．１０８８懸濁液投与
【００２５】
以上の試験結果を総括すれば、納豆とラクトバシラス乳酸菌の併用は、試験例１、試験例２及び試験例３から試験管内実験において明らかな通り、それぞれ単独の処置と比較し、多くの病原菌に対し格段の抑制効果を有しており、試験例４及び試験例５から生体内でも同様の効果があることを示したのに加え、腸内菌叢をより改善する効果があることも示した。すなわち、ラクトバシラス属乳酸菌含有納豆は新たな機能性を有する納豆であることが立証された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】納豆及びラクトバシラス属乳酸菌によるＯ−１５７の抑制効果（Ｏ−１５７の菌数を指数表示）
【図２】納豆及びラクトバシラス属乳酸菌によるサルモネラ・エンテリティディスの抑制効果（サルモネラ・エンテリティディスの菌数を指数表示）
【図３】納豆及びラクトバシラス属乳酸菌によるヘリコバクター・ピロリの抑制効果（ヘリコバクター・ピロリの菌数を指数表示）
【図４】ヘリコバクター・ピロリ感染マウスに対する抑制試験
【発明を実施するための形態】
【００２７】
次に本発明を実施するための形態について実施例を記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．
ＭＲＳブロス１０ＬにＮｏ．１０８８を生菌数濃度１ｘ１０７生菌単位／ｍＬの割合で接種し、３７℃下で１５時間静置培養し、培養終了後遠心分離により集菌し、集菌した菌体を滅菌した生理食塩水により洗浄、再び遠心し集菌、滅菌した生理食塩水によって１ｘ１０１０生菌単位／ｍＬに調製した。
【００２９】
実施例２．
蒸煮した大豆１ｋｇに納豆菌と実施例１で作製した菌液１０ｍＬを加え、５０ｇずつに小分けし、３７℃下で２４時間静置培養し、乳酸菌含有納豆を製造した。得られた納豆の納豆菌数は５ｘ１０８生菌単位／ｇ、Ｎｏ．１０８８の菌数は２ｘ１０８生菌単位／ｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、１）乳酸菌（例えば、耐酸性で病原菌の抑制効果及び腸内菌叢の改善効果の特性をもつＮｏ．１０８８）を含有する納豆が、納豆又は乳酸菌の単独の場合よりも機能性（病原菌の抑制効果、腸内菌叢の改善など）に優れていること、２）特にＮｏ．１０８８含有納豆はヘリコバクター・ピロリ感染に対して著明な抑制効果を有すること、の以上のことからラクトバシラス乳酸菌含有納豆が新たな機能性を有する発酵食品である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆菌とラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌を含有する納豆の製造において、納豆菌を抑制することなく、納豆の糸引き、風味、味等納豆の特性を損なわないラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、特にラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループとしてのラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・ガッセリィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシラス・クリスパアタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバシラス・グリンアラウム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）を含有する新規な納豆の作製方法及び／又はその飲食品の製造
【請求項２】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌を含有した納豆菌で製造した製品であり、１）ヘリコバクター・ピロリ及び／又は他の病原菌を抑制すること、２）有用な腸内細菌の増殖を促進すること、を少なくともひとつを特微とする納豆及び／又はその飲食品
【請求項３】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌がラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７８）である請求項１及び請求項２に記載の乳酸菌
【請求項１】
納豆菌とラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌を含有する納豆の製造において、納豆菌を抑制することなく、納豆の糸引き、風味、味等納豆の特性を損なわないラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、特にラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループとしてのラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・ガッセリィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシラス・クリスパアタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバシラス・グリンアラウム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）を含有する新規な納豆の作製方法及び／又はその飲食品の製造
【請求項２】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌を含有した納豆菌で製造した製品であり、１）ヘリコバクター・ピロリ及び／又は他の病原菌を抑制すること、２）有用な腸内細菌の増殖を促進すること、を少なくともひとつを特微とする納豆及び／又はその飲食品
【請求項３】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌がラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２７８）である請求項１及び請求項２に記載の乳酸菌
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１４７７５９（Ｐ２０１２−１４７７５９Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８９９４（Ｐ２０１１−１８９９４）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（５９３２０６８９４）スノーデン株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（５９３２０６８９４）スノーデン株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
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