ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸菌の選択および使用
【課題】哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下させるため哺乳動物に投与するための乳酸菌株を提供する。
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリによる胃腸の炎症を低下させる能力について、選択された乳酸桿菌属の株、およびヒトへの投与のため、若しくは関連する炎症の処置、予防のための剤を包含する。これらの株由来の生成物、ならびに、選択された株を増殖させた馴化培地および該馴化培地のタンパク質を含有する抽出物を包含する。
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリによる胃腸の炎症を低下させる能力について、選択された乳酸桿菌属の株、およびヒトへの投与のため、若しくは関連する炎症の処置、予防のための剤を包含する。これらの株由来の生成物、ならびに、選択された株を増殖させた馴化培地および該馴化培地のタンパク質を含有する抽出物を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非病原性の抗炎症性細菌株のスクリーニング方法の使用、ならびにヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）の他の種のような胃腸細菌、および他の炎症を引き起こす胃腸病原体により引き起こされる炎症の処置および予防のための生成物およびこうした株の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）は、とりわけ胃中で酸を中和するウレアーゼを産生するその能力により胃にコロニーを作るらせん形の細菌である。ウレアーゼは尿素（胃中にその豊富な供給が存在する）を、強塩基である重炭酸塩およびアンモニアに転化する。これはＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞の周囲に酸を中和する塩基の雲をもたらし、それらを胃中で酸から保護する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞は胃粘膜層を浸透しかつ横切り、そして胃の内層中の上皮細胞に付着する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の少なくとも数種の株はトキシンを産生する能力を有する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）への感染は宿主免疫系を活性化し、白血球、キラーＴ細胞および他の感染と闘う作用物質を該領域に送るが、しかし、身体の免疫系は胃の粘液内層中のＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の影響の反転において有効でない。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞は内層中に留まり、そして免疫系は該細胞に対するその応答をエスカレートさせて、利用可能な十分な抗炎症機構が存在しない場合は炎症を創製する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）への感染の間に、宿主の上皮樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞および他の免疫防禦細胞により生成されるサイトカイン細胞間シグナルタンパク質は、侵襲する病原体に対する免疫応答を伝播する。結果、宿主の好中球が胃上皮に誘引されかつ浸潤し、そして感染の間中そこに留まる。これらの細胞は、とりわけ、上皮細胞中の酸化ならびに結果としての上皮細胞死、潰瘍形成および究極的に発癌に至るスーパーオキシドラジカルのような活性酸素生成物を生成する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）はまた、胃上皮上への宿主からの栄養素の漏出も誘導してＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞を持続させるための栄養源を供給し、また、感染症およびその結果を悪化させる。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）はヒト免疫系を逃れかつ宿主の免疫応答にもかかわらず胃中で生存することが可能であり、そして、この回避の機構が現在の研究の主題である。
【０００３】
現在の治療は、本発明の目的である、十分な抗炎症機構を利用可能にすることのような感染に対する宿主の過剰な免疫応答の影響を排除することを試みることよりもむしろ抗生物質およびプロトンポンプ阻害剤によりＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）を除菌することに基づいている。
【０００４】
かように、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）への感染は、胃炎、消化性潰瘍を包含する胃および十二指腸潰瘍、胃癌、ならびに胃粘膜関連のリンパ様組織のリンパ腫を発症する増大されたリスクを引き起こす。これらの問題はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞により直接引き起こされるわけではないが、しかしＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に応答しての胃内層の炎症により直接引き起こされる。抗生物質と組合せた胃での酸産生を低下させる処置のような、胃および十二指腸潰瘍の症状を改善する多様な処置が使用されている。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する新規ワクチンもまた試みられているがしかし制限された成功を伴う。ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）の他の種、ならびに他の胃腸病原体が胃腸の炎症を引き起こし得ることもまた既知である。
【０００５】
最近の研究論文では、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染を研究している研究者たちは、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染が慢性の炎症応答の一部として胃粘膜のシアル化を導き出す、また、多くの毒性株が従って炎症を起こした部位に付着することがより良好に可能であると結論した（非特許文献１）。
【０００６】
胃および胃腸管での炎症は、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）若しくは他の病原体により産生されるもののような抗原性刺激に応答して上皮のマクロファージおよび樹状細胞により産生されるサイトカインとして知られる細胞間シグナルタンパク質により媒介される。上皮とＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）若しくはＬＰＳのようなそれにより産生されるエンドトキシンのような抗原との間の接触に際して、上皮中の抗原提示細胞（樹状細胞を包含する）がナイーブなマクロファージにシグナルを伝播し、ナイーブなマクロファージはその後、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２を包含する炎症前サイトカインがマクロファージにより産生されるいわゆるＴｈ−１型応答において応答する。これらのサイトカインは順にナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞および他の細胞を刺激して、炎症の重要なメディエーターであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する。ＩＦＮγは炎症応答および細胞傷害性に至る上述された反応の増大につながる。ナイーブなマクロファージはＴｈ−２型応答を伴う抗原にもまた応答し得る。この応答はＩＦＮγにより抑制される。これらのＴｈ−２型細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１０のような抗炎症サイトカインを産生する。
【０００７】
ＩＬ−１０はＩＦＮγの産生を阻害しかつ従って免疫応答を低下させることが知られている。Ｔｈ−１およびＴｈ−２型細胞とそれらのそれぞれのサイトカイン産生との間の均衡が所定の抗原に対する炎症応答の程度を定義する。Ｔｈ−２型細胞はまた免疫系を介して免疫グロブリンの産生も刺激し得る。低下されたＴＮＦαレベルが存在する胃腸管における抗炎症活性は、高められた上皮細胞（腸管壁内層の完全性）ならびに従って胃腸病原体およびトキシンにより引き起こされる負の影響の低下と相関する。
【０００８】
多数の研究の結果は、ＤＮＡが腸の上皮細胞に対する抗炎症活性を発揮し得るか、若しくは免疫系を刺激し得ることを示す（非特許文献２）。
【０００９】
マウスは無菌動物で起こらない慢性大腸炎を自発的に発症する。マウス大腸炎はヒトクローン病（胃腸管の慢性の重症炎症性疾患）に類似している。クローン病は通常腸で発生するが、しかし胃腸管のどこでも発生するかもしれない。これらの状態は腸内細菌の存在を必要とし、そして双方ともＴｈ−１媒介型のＩＬ−１２依存性の形態の大腸炎である。原因および症状の類似性により、大腸炎のマウスモデルおよび他のマウスモデルが炎症応答の成分を直接研究するのに使用され、そして、同一の機構がヒトで当てはまるために、ヒトの胃腸疾患の処置を開発するために使用されることが許容される。
【００１０】
ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）は動物の胃腸管の天然に存在する生息細菌の１種であり、そして健康な動物の腸および低ｐＨにもかかわらずまれにヒト胃でもまた慣例に見出される。それは抗菌活性を有することが知られている。例えば特許文献１、２、３、４および５を参照されたい。ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）細胞をグリセロールの存在下に嫌気的条件下で増殖させる場合に、それらはロイテリン（β−ヒドロキシプロピオンアルデヒド）として知られる抗菌物質を産生する。
【００１１】
コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）はヒト口腔のむしろ一般的な生息細菌である乳酸桿菌（または「乳酸杆菌」ともいう）属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のより少なく公知の種である。それは土壌、堆肥および植物材料中でもまた見出し得る。それはサイレージ中にビールを腐らせる菌（ｂｅｅｒ ｓｐｏｉｌｅｒ）として見出さ
れており、また、良好な乳酸産生ならびに抗真菌活性が報告されている。本明細書で使用されるコリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭＭ７単離物（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６６０）はヒト母乳中で見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，４３９，６７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４５８，８７５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５３４，２５３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８３７，２３８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８４９，２８９号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ １８：５７３−５７８、２００２
【非特許文献２】それぞれＭａｄｓｅｎらおよびＲａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｗｅｅｋ、２００２年５月１９〜２２日、サンフランシスコ・Ｔｈｅ Ｍｏｓｃｏｎｅ Ｃｅｎｔｅｒでの発表
【発明の概要】
【００１４】
免疫調節活性もまた多様な乳酸杆菌と関連づけられている。数種の乳酸杆菌による有効な抗菌活性の可能性が既知である一方、胃腸の炎症を低下させるそれらの能力の実質的な差異が株間に存在したことも、こうした株を選択し得たことも、以前に知られていなかった。
【００１５】
従って、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択された乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を提供することが本発明の一目的である。前記株を増殖させた馴化培地およびそのタンパク質を含有する抽出物を包含するヒトへの投与のためのヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤を包含する前記株を含有する生成物を提供することが本発明のさらなる一目的である。
【００１６】
他の目的および利点は以下の開示および付属として付けられる請求の範囲からより完全に明らかであろう。
本発明は、本明細書に、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択されたある種の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、およびヒトへの投与のためのヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤を包含する前記株由来の生成物を含んでなり、かつ、前記株が増殖された馴化（またはならし）培地および該馴化培地のタンパク質を含有する抽出物を包含する。
【００１７】
本発明の他の目的および特徴は以下の開示および付属として付けられる請求の範囲からより完全に明らかであろう。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
本発明は、本明細書に、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択された乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を含んでなる。こうした株は、コリニフォルミス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭＭ７、ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−４６６０およびロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＭ２−３、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９を包含する。これらの株由来の全細胞若しくは成分を含有する食物、栄養添加物および製剤、医薬若しくは医療用具のような製品を、当該技術分野で既知であるように処方することができ、かつ、一般に、既知のところの摂取可能な支持体および乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株若しくはそれ由来の成分を包含する。Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ ＡＴＣＣ ５３１０３、ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ５５７３０および他者のような良好なＴＮＦαを低下させる能力を有することが今や同定された以前に既知の株もまた上の製剤中で使用し得る。これらの生成物は、哺乳動物への投与のためのヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤である。
【００１９】
適切なサイトカインを使用するモデル系を使用して、炎症を低下若しくは増大させる因子を決定する。本明細書に提供される実施例において、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージ細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル、ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−７１）を使用するマウスマクロファージアッセイを使用して、炎症経路に対するそれらの影響について細菌、主として乳酸杆菌の株をスクリーニングする。ＩＬ−１０は本アッセイにおいて陽性対照として使用し、ＩＬ−１０での処理はＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）のような炎症前サイトカインの阻害を示す。実験室の培地中のスクリーニングされるべき乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株の個々の増殖後に、生存細菌細胞を濾過により除去し、そして上清液体（本明細書で「馴化培地」ともまた呼ばれる）をマクロファージアッセイで試験する。マクロファージは最初に炎症前抗原、例えば精製されたＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のリポ多糖）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のリポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＴＡ）または細胞を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）の馴化培地で刺激して、ＴＮＦαを包含する炎症前サイトカインを産生させる。スクリーニングされるべき細菌由来の推定の免疫調節物質を含有する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株からの馴化培地を、抗原で活性化したマクロファージと共インキュベートする。マクロファージの免疫応答を調節する馴化培地の能力を、細胞によるＴＮＦα産生の変化によりモニターする。該アッセイからのＴＮＦαプロファイルは、マクロファージによるＴＮＦαの産生の低下において最も効果的な株の選択を可能にする。該アッセイ系におけるｐＨ調節を伴う対照実験は、変化させたｐＨが観察された影響を引き起こし得る可能性を排除する。
【００２０】
驚くべきことに、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の見かけ上類似の細菌単離物および株は、非常に類似のヒト供給源から生じてもなお、炎症前抗原に応答してのマクロファージによるＴＮＦαの産生に影響する変動するかつ広範に異なる能力を示す。これらの株は遺伝子的に９８％まで類似であり得るためにそれらは遺伝子フィンガープリント法によってさえ同定し得ないが、しかしなお免疫細胞に対する非常に異なる影響を示す。かようにスクリーニングされかつマクロファージによる刺激された炎症前サイトカイン産生に対する強い阻害効果を有することが見出された株は、胃中でＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）が引き起こす炎症を包含するヒトの胃腸管における炎症の処置においてとりわけ有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＬＰＳで活性化したマクロファージによるＴＮＦα産生に対する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の馴化培地の影響を示す棒グラフである。４５種の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を試験した。
【図２】ＬＰＳ単独でのマクロファージと比較した、多様な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株からの馴化培地とＬＰＳの存在下におけるマクロファージのＴＮＦα発現の倍数変化を示す棒グラフである。
【００２２】
本発明の特徴は、本発明を制限するとして解釈されるべきでない、以下の実施例への参照によりより明瞭に理解されるであろう。
【実施例１】
【００２３】
抗炎症性株の選択。
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種（例えばＬ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ ＡＴＣＣ ５３１０３、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＡＴＣＣ ３３２００、ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＭ２−３ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９、コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ＭＭ７、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６６０を包含する）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅをそれぞれｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）およびＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ、メリーランド州スパークス）中で増殖させた。乳酸杆菌の一夜培養物を１．０のＯＤ６００（およそ１０９細胞／ｍｌを表す）まで希釈し、そしてさらに１０倍希釈しかつ追加の４、８および２４時間増殖させた。ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（Ｓｙｄｎｅｙ株ＳＳ１）およびヘリコバクター ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）３Ｂ１（ＡＴＣＣ ５１４４９）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＢｒｕｃｅｌｌａ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で４８時間培養した。培養物を１０倍希釈しかつ別の２４および４８時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を４℃、８５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そしてその後０．２２μｍ孔のフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した。
【００２４】
マウス単球／マクロファージ細胞系ＲＡＷ ２６４．７（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）およびＲＡＷ ２６４．７γＮＯ（−）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２７８）を、炎症応答経路を研究するためのレポーター細胞として使用した。ＲＡＷ ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳならびに２％抗生物質（５０００単位／ｍｌペニシリンおよび５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（野性型）若しくはＲＰＭＩ培地１６４０（γＮＯ−）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバード）のいずれか中で８０〜９０％コンフルエントまで５％ＣＯ２ ３７℃で増殖させた。およそ５×１０４細胞を９６ウェル細胞培養クラスターに接種し、そしてリポ多糖（ＬＰＳ）活性化および馴化培地の添加前２時間付着させた。ナイーブなＲＡＷ ２６４．７細胞を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｂ８（Ｓｉｇｍａ）からの精製したＬＰＳに曝露させた。活性化培地はウェルあたり２０μｌの馴化培地に２ｎｇ
ＬＰＳを添加することにより作成した。マクロファージは、細胞を含まない乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の馴化培地と前若しくは共インキュベートのいずれかをした。組換えｍＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を陽性対照として使用した。細胞の生存率をトリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）排除により評価した。細胞培養上清中のＴＮＦ−αの存在はサンドウィッチエンザイムイムノアッセイ、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ（Ｒ）マウスＴＮＦ−αイムノアッセイ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【００２５】
ＬＰＳで活性化したマクロファージによるＴＮＦα産生に対する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地の影響を図１に示し、これは試験した４５株のうち数種の異なる株が活性化されたマクロファージによるＴＮＦα産生を低下させることが可能であることを示す。図２は、ＬＰＳ単独と比較した、多様な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株でのＴＮＦα発現の倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示す。その後、これらの研究の結果を使用して最も効率的な株を選択した。図中に挙げられるがしかし本文中でとりわけ挙げられない株は乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の多様な
株、主として試験したロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）である。
【００２６】
本実施例において、コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭＭ７、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６６０を、上の方法を使用することにより標準的なヨーグルトへの添加について選択した。コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を、乳製品工業での乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の標準的増殖方法を使用して増殖かつ凍結乾燥した。その後、本培養物を、伝統的なヨーグルト培養物を使用して、ヨーグルト１グラムあたり１０Ｅ＋７ ＣＦＵのレベルで、以前に醗酵させた乳に添加し、そして該ヨーグルトをＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）により引き起こされる胃炎の予防としてヒトにより使用した。
【実施例２】
【００２７】
馴化培地の使用
上の方法を使用して、１種の効果的にＴＮＦαを低下させる株からの馴化培地（本実験ではロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９からの培地）を選択した。本培地を、ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）（Ｄｉｆｃｏ、メリーランド州スパークス）中で該株を増殖させることにより、より大きなスケールで製造した。乳酸杆菌の一夜培養物を１．０のＯＤ６００（およそ１０９細胞／ｍｌを表す）まで希釈し、そしてさらに１０倍希釈しかつ追加の２４時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を４℃、８５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そしてその後０．２２μｍ孔のフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した。その後、標準的方法を使用して馴化培地を凍結乾燥かつ処方して錠剤を作成した。本錠剤を、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）により引き起こされる潰瘍を治療するためにヒトにより薬物として使用した。
【実施例３】
【００２８】
ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株のＤＮＡフィンガープリント法
Ｌｕｐｓｋｉらの米国特許第５，５２３，２１７号および同第５，６９１，１３６号明細書の方法を使用して、ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）株のゲノムフィンガープリント法を行った。本方法は、細菌サンプルに一対の外側に向けられたプライマーを添加することによる細菌ＤＮＡの増幅を利用する。増幅後、生じるハイブリダイゼーションの伸長産物を大きさにより分離し、そして、大きさ分類した（ｓｉｚｅｄ）伸長生成物のパターンを測定することにより細菌の株を特徴付けする。Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＢａｒＣｏｄｅｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州ヒューストン）により、Ｕｐｒｉｍｅ Ｅプライマー（１プライマー）を使用してロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の８２種の株について二重のゲル画像を得た。二重のデータ組は比較可能であった。合計で、相互に異なった１１クラスター、および独特であるようであった８種のアウトライヤー（ｏｕｔｌｉｅｒ）が存在した。
【００２９】
ＴＮＦ−αの低下において有効であることが見出された株（図１および２を参照されたい）は、本方法を使用して一緒に集団を形成せず、この方法でＤＮＡフィンガープリント法を使用することがＴＮＦαを低下させる能力をもつ数種の株を見出すのに十分でないことを示した。
【実施例４】
【００３０】
有効な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株により産生されるタンパク質の特徴付け
ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＭＭ２−３の馴化培地を包含する多様な有効な乳
酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の馴化培地を多様な変性させる化合物で処理して、該細菌由来の推定のイムノモジュリン（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｉｎ）の性質を決定した。かように、馴化培地を反復性の凍結−融解、熱処理、ＤＮＡを消化する酵素、プロテアーゼおよび不活性化したプロテアーゼでの消化にかけた。推定のイムノモジュリンはこの方法で本来１種若しくはそれ以上のタンパク質若しくはペプチドであることが決定された。推定のタンパク質イムノモジュリンの大きさを決定するために、馴化培地を濾過により分画し、そして濾液を有効性について試験した。こうして、有効な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の馴化培地の有効成分は大きさがおよそ５ｋＤａ若しくはそれ未満であることが見出された。
【００３１】
本発明は特定の態様に関して記述した一方、多数の変形、改変および態様が可能であり、そして従って全部のこうした変形、改変および態様は本発明の技術思想および範囲内にあるとみなされるべきであることが認識されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非病原性の抗炎症性細菌株のスクリーニング方法の使用、ならびにヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）の他の種のような胃腸細菌、および他の炎症を引き起こす胃腸病原体により引き起こされる炎症の処置および予防のための生成物およびこうした株の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）は、とりわけ胃中で酸を中和するウレアーゼを産生するその能力により胃にコロニーを作るらせん形の細菌である。ウレアーゼは尿素（胃中にその豊富な供給が存在する）を、強塩基である重炭酸塩およびアンモニアに転化する。これはＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞の周囲に酸を中和する塩基の雲をもたらし、それらを胃中で酸から保護する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞は胃粘膜層を浸透しかつ横切り、そして胃の内層中の上皮細胞に付着する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の少なくとも数種の株はトキシンを産生する能力を有する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）への感染は宿主免疫系を活性化し、白血球、キラーＴ細胞および他の感染と闘う作用物質を該領域に送るが、しかし、身体の免疫系は胃の粘液内層中のＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の影響の反転において有効でない。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞は内層中に留まり、そして免疫系は該細胞に対するその応答をエスカレートさせて、利用可能な十分な抗炎症機構が存在しない場合は炎症を創製する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）への感染の間に、宿主の上皮樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞および他の免疫防禦細胞により生成されるサイトカイン細胞間シグナルタンパク質は、侵襲する病原体に対する免疫応答を伝播する。結果、宿主の好中球が胃上皮に誘引されかつ浸潤し、そして感染の間中そこに留まる。これらの細胞は、とりわけ、上皮細胞中の酸化ならびに結果としての上皮細胞死、潰瘍形成および究極的に発癌に至るスーパーオキシドラジカルのような活性酸素生成物を生成する。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）はまた、胃上皮上への宿主からの栄養素の漏出も誘導してＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞を持続させるための栄養源を供給し、また、感染症およびその結果を悪化させる。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）はヒト免疫系を逃れかつ宿主の免疫応答にもかかわらず胃中で生存することが可能であり、そして、この回避の機構が現在の研究の主題である。
【０００３】
現在の治療は、本発明の目的である、十分な抗炎症機構を利用可能にすることのような感染に対する宿主の過剰な免疫応答の影響を排除することを試みることよりもむしろ抗生物質およびプロトンポンプ阻害剤によりＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）を除菌することに基づいている。
【０００４】
かように、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）への感染は、胃炎、消化性潰瘍を包含する胃および十二指腸潰瘍、胃癌、ならびに胃粘膜関連のリンパ様組織のリンパ腫を発症する増大されたリスクを引き起こす。これらの問題はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞により直接引き起こされるわけではないが、しかしＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に応答しての胃内層の炎症により直接引き起こされる。抗生物質と組合せた胃での酸産生を低下させる処置のような、胃および十二指腸潰瘍の症状を改善する多様な処置が使用されている。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する新規ワクチンもまた試みられているがしかし制限された成功を伴う。ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）の他の種、ならびに他の胃腸病原体が胃腸の炎症を引き起こし得ることもまた既知である。
【０００５】
最近の研究論文では、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染を研究している研究者たちは、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染が慢性の炎症応答の一部として胃粘膜のシアル化を導き出す、また、多くの毒性株が従って炎症を起こした部位に付着することがより良好に可能であると結論した（非特許文献１）。
【０００６】
胃および胃腸管での炎症は、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）若しくは他の病原体により産生されるもののような抗原性刺激に応答して上皮のマクロファージおよび樹状細胞により産生されるサイトカインとして知られる細胞間シグナルタンパク質により媒介される。上皮とＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）若しくはＬＰＳのようなそれにより産生されるエンドトキシンのような抗原との間の接触に際して、上皮中の抗原提示細胞（樹状細胞を包含する）がナイーブなマクロファージにシグナルを伝播し、ナイーブなマクロファージはその後、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２を包含する炎症前サイトカインがマクロファージにより産生されるいわゆるＴｈ−１型応答において応答する。これらのサイトカインは順にナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞および他の細胞を刺激して、炎症の重要なメディエーターであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する。ＩＦＮγは炎症応答および細胞傷害性に至る上述された反応の増大につながる。ナイーブなマクロファージはＴｈ−２型応答を伴う抗原にもまた応答し得る。この応答はＩＦＮγにより抑制される。これらのＴｈ−２型細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１０のような抗炎症サイトカインを産生する。
【０００７】
ＩＬ−１０はＩＦＮγの産生を阻害しかつ従って免疫応答を低下させることが知られている。Ｔｈ−１およびＴｈ−２型細胞とそれらのそれぞれのサイトカイン産生との間の均衡が所定の抗原に対する炎症応答の程度を定義する。Ｔｈ−２型細胞はまた免疫系を介して免疫グロブリンの産生も刺激し得る。低下されたＴＮＦαレベルが存在する胃腸管における抗炎症活性は、高められた上皮細胞（腸管壁内層の完全性）ならびに従って胃腸病原体およびトキシンにより引き起こされる負の影響の低下と相関する。
【０００８】
多数の研究の結果は、ＤＮＡが腸の上皮細胞に対する抗炎症活性を発揮し得るか、若しくは免疫系を刺激し得ることを示す（非特許文献２）。
【０００９】
マウスは無菌動物で起こらない慢性大腸炎を自発的に発症する。マウス大腸炎はヒトクローン病（胃腸管の慢性の重症炎症性疾患）に類似している。クローン病は通常腸で発生するが、しかし胃腸管のどこでも発生するかもしれない。これらの状態は腸内細菌の存在を必要とし、そして双方ともＴｈ−１媒介型のＩＬ−１２依存性の形態の大腸炎である。原因および症状の類似性により、大腸炎のマウスモデルおよび他のマウスモデルが炎症応答の成分を直接研究するのに使用され、そして、同一の機構がヒトで当てはまるために、ヒトの胃腸疾患の処置を開発するために使用されることが許容される。
【００１０】
ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）は動物の胃腸管の天然に存在する生息細菌の１種であり、そして健康な動物の腸および低ｐＨにもかかわらずまれにヒト胃でもまた慣例に見出される。それは抗菌活性を有することが知られている。例えば特許文献１、２、３、４および５を参照されたい。ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）細胞をグリセロールの存在下に嫌気的条件下で増殖させる場合に、それらはロイテリン（β−ヒドロキシプロピオンアルデヒド）として知られる抗菌物質を産生する。
【００１１】
コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）はヒト口腔のむしろ一般的な生息細菌である乳酸桿菌（または「乳酸杆菌」ともいう）属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のより少なく公知の種である。それは土壌、堆肥および植物材料中でもまた見出し得る。それはサイレージ中にビールを腐らせる菌（ｂｅｅｒ ｓｐｏｉｌｅｒ）として見出さ
れており、また、良好な乳酸産生ならびに抗真菌活性が報告されている。本明細書で使用されるコリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭＭ７単離物（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６６０）はヒト母乳中で見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，４３９，６７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４５８，８７５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５３４，２５３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８３７，２３８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８４９，２８９号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ １８：５７３−５７８、２００２
【非特許文献２】それぞれＭａｄｓｅｎらおよびＲａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｗｅｅｋ、２００２年５月１９〜２２日、サンフランシスコ・Ｔｈｅ Ｍｏｓｃｏｎｅ Ｃｅｎｔｅｒでの発表
【発明の概要】
【００１４】
免疫調節活性もまた多様な乳酸杆菌と関連づけられている。数種の乳酸杆菌による有効な抗菌活性の可能性が既知である一方、胃腸の炎症を低下させるそれらの能力の実質的な差異が株間に存在したことも、こうした株を選択し得たことも、以前に知られていなかった。
【００１５】
従って、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択された乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を提供することが本発明の一目的である。前記株を増殖させた馴化培地およびそのタンパク質を含有する抽出物を包含するヒトへの投与のためのヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤を包含する前記株を含有する生成物を提供することが本発明のさらなる一目的である。
【００１６】
他の目的および利点は以下の開示および付属として付けられる請求の範囲からより完全に明らかであろう。
本発明は、本明細書に、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択されたある種の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、およびヒトへの投与のためのヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤を包含する前記株由来の生成物を含んでなり、かつ、前記株が増殖された馴化（またはならし）培地および該馴化培地のタンパク質を含有する抽出物を包含する。
【００１７】
本発明の他の目的および特徴は以下の開示および付属として付けられる請求の範囲からより完全に明らかであろう。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
本発明は、本明細書に、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によるもののような胃腸の炎症を低下させるそれらの能力について選択された乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を含んでなる。こうした株は、コリニフォルミス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭＭ７、ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−４６６０およびロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＭ２−３、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９を包含する。これらの株由来の全細胞若しくは成分を含有する食物、栄養添加物および製剤、医薬若しくは医療用具のような製品を、当該技術分野で既知であるように処方することができ、かつ、一般に、既知のところの摂取可能な支持体および乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株若しくはそれ由来の成分を包含する。Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ ＡＴＣＣ ５３１０３、ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ５５７３０および他者のような良好なＴＮＦαを低下させる能力を有することが今や同定された以前に既知の株もまた上の製剤中で使用し得る。これらの生成物は、哺乳動物への投与のためのヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）と関連する炎症の処置若しくは予防のための剤である。
【００１９】
適切なサイトカインを使用するモデル系を使用して、炎症を低下若しくは増大させる因子を決定する。本明細書に提供される実施例において、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージ細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル、ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−７１）を使用するマウスマクロファージアッセイを使用して、炎症経路に対するそれらの影響について細菌、主として乳酸杆菌の株をスクリーニングする。ＩＬ−１０は本アッセイにおいて陽性対照として使用し、ＩＬ−１０での処理はＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）のような炎症前サイトカインの阻害を示す。実験室の培地中のスクリーニングされるべき乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株の個々の増殖後に、生存細菌細胞を濾過により除去し、そして上清液体（本明細書で「馴化培地」ともまた呼ばれる）をマクロファージアッセイで試験する。マクロファージは最初に炎症前抗原、例えば精製されたＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のリポ多糖）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のリポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＴＡ）または細胞を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）の馴化培地で刺激して、ＴＮＦαを包含する炎症前サイトカインを産生させる。スクリーニングされるべき細菌由来の推定の免疫調節物質を含有する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株からの馴化培地を、抗原で活性化したマクロファージと共インキュベートする。マクロファージの免疫応答を調節する馴化培地の能力を、細胞によるＴＮＦα産生の変化によりモニターする。該アッセイからのＴＮＦαプロファイルは、マクロファージによるＴＮＦαの産生の低下において最も効果的な株の選択を可能にする。該アッセイ系におけるｐＨ調節を伴う対照実験は、変化させたｐＨが観察された影響を引き起こし得る可能性を排除する。
【００２０】
驚くべきことに、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の見かけ上類似の細菌単離物および株は、非常に類似のヒト供給源から生じてもなお、炎症前抗原に応答してのマクロファージによるＴＮＦαの産生に影響する変動するかつ広範に異なる能力を示す。これらの株は遺伝子的に９８％まで類似であり得るためにそれらは遺伝子フィンガープリント法によってさえ同定し得ないが、しかしなお免疫細胞に対する非常に異なる影響を示す。かようにスクリーニングされかつマクロファージによる刺激された炎症前サイトカイン産生に対する強い阻害効果を有することが見出された株は、胃中でＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）が引き起こす炎症を包含するヒトの胃腸管における炎症の処置においてとりわけ有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＬＰＳで活性化したマクロファージによるＴＮＦα産生に対する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の馴化培地の影響を示す棒グラフである。４５種の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を試験した。
【図２】ＬＰＳ単独でのマクロファージと比較した、多様な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株からの馴化培地とＬＰＳの存在下におけるマクロファージのＴＮＦα発現の倍数変化を示す棒グラフである。
【００２２】
本発明の特徴は、本発明を制限するとして解釈されるべきでない、以下の実施例への参照によりより明瞭に理解されるであろう。
【実施例１】
【００２３】
抗炎症性株の選択。
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種（例えばＬ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ ＡＴＣＣ ５３１０３、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＡＴＣＣ ３３２００、ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＭ２−３ ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９、コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ＭＭ７、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６６０を包含する）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅをそれぞれｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）およびＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ、メリーランド州スパークス）中で増殖させた。乳酸杆菌の一夜培養物を１．０のＯＤ６００（およそ１０９細胞／ｍｌを表す）まで希釈し、そしてさらに１０倍希釈しかつ追加の４、８および２４時間増殖させた。ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（Ｓｙｄｎｅｙ株ＳＳ１）およびヘリコバクター ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）３Ｂ１（ＡＴＣＣ ５１４４９）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＢｒｕｃｅｌｌａ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で４８時間培養した。培養物を１０倍希釈しかつ別の２４および４８時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を４℃、８５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そしてその後０．２２μｍ孔のフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した。
【００２４】
マウス単球／マクロファージ細胞系ＲＡＷ ２６４．７（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）およびＲＡＷ ２６４．７γＮＯ（−）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２７８）を、炎症応答経路を研究するためのレポーター細胞として使用した。ＲＡＷ ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳならびに２％抗生物質（５０００単位／ｍｌペニシリンおよび５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（野性型）若しくはＲＰＭＩ培地１６４０（γＮＯ−）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバード）のいずれか中で８０〜９０％コンフルエントまで５％ＣＯ２ ３７℃で増殖させた。およそ５×１０４細胞を９６ウェル細胞培養クラスターに接種し、そしてリポ多糖（ＬＰＳ）活性化および馴化培地の添加前２時間付着させた。ナイーブなＲＡＷ ２６４．７細胞を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｂ８（Ｓｉｇｍａ）からの精製したＬＰＳに曝露させた。活性化培地はウェルあたり２０μｌの馴化培地に２ｎｇ
ＬＰＳを添加することにより作成した。マクロファージは、細胞を含まない乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の馴化培地と前若しくは共インキュベートのいずれかをした。組換えｍＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を陽性対照として使用した。細胞の生存率をトリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）排除により評価した。細胞培養上清中のＴＮＦ−αの存在はサンドウィッチエンザイムイムノアッセイ、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ（Ｒ）マウスＴＮＦ−αイムノアッセイ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【００２５】
ＬＰＳで活性化したマクロファージによるＴＮＦα産生に対する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地の影響を図１に示し、これは試験した４５株のうち数種の異なる株が活性化されたマクロファージによるＴＮＦα産生を低下させることが可能であることを示す。図２は、ＬＰＳ単独と比較した、多様な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株でのＴＮＦα発現の倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示す。その後、これらの研究の結果を使用して最も効率的な株を選択した。図中に挙げられるがしかし本文中でとりわけ挙げられない株は乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の多様な
株、主として試験したロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）である。
【００２６】
本実施例において、コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＭＭ７、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６６０を、上の方法を使用することにより標準的なヨーグルトへの添加について選択した。コリニフォルミス菌（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を、乳製品工業での乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の標準的増殖方法を使用して増殖かつ凍結乾燥した。その後、本培養物を、伝統的なヨーグルト培養物を使用して、ヨーグルト１グラムあたり１０Ｅ＋７ ＣＦＵのレベルで、以前に醗酵させた乳に添加し、そして該ヨーグルトをＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）により引き起こされる胃炎の予防としてヒトにより使用した。
【実施例２】
【００２７】
馴化培地の使用
上の方法を使用して、１種の効果的にＴＮＦαを低下させる株からの馴化培地（本実験ではロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４６５９からの培地）を選択した。本培地を、ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）（Ｄｉｆｃｏ、メリーランド州スパークス）中で該株を増殖させることにより、より大きなスケールで製造した。乳酸杆菌の一夜培養物を１．０のＯＤ６００（およそ１０９細胞／ｍｌを表す）まで希釈し、そしてさらに１０倍希釈しかつ追加の２４時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を４℃、８５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そしてその後０．２２μｍ孔のフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した。その後、標準的方法を使用して馴化培地を凍結乾燥かつ処方して錠剤を作成した。本錠剤を、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）により引き起こされる潰瘍を治療するためにヒトにより薬物として使用した。
【実施例３】
【００２８】
ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株のＤＮＡフィンガープリント法
Ｌｕｐｓｋｉらの米国特許第５，５２３，２１７号および同第５，６９１，１３６号明細書の方法を使用して、ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）株のゲノムフィンガープリント法を行った。本方法は、細菌サンプルに一対の外側に向けられたプライマーを添加することによる細菌ＤＮＡの増幅を利用する。増幅後、生じるハイブリダイゼーションの伸長産物を大きさにより分離し、そして、大きさ分類した（ｓｉｚｅｄ）伸長生成物のパターンを測定することにより細菌の株を特徴付けする。Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＢａｒＣｏｄｅｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州ヒューストン）により、Ｕｐｒｉｍｅ Ｅプライマー（１プライマー）を使用してロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の８２種の株について二重のゲル画像を得た。二重のデータ組は比較可能であった。合計で、相互に異なった１１クラスター、および独特であるようであった８種のアウトライヤー（ｏｕｔｌｉｅｒ）が存在した。
【００２９】
ＴＮＦ−αの低下において有効であることが見出された株（図１および２を参照されたい）は、本方法を使用して一緒に集団を形成せず、この方法でＤＮＡフィンガープリント法を使用することがＴＮＦαを低下させる能力をもつ数種の株を見出すのに十分でないことを示した。
【実施例４】
【００３０】
有効な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株により産生されるタンパク質の特徴付け
ロイテリ菌（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＭＭ２−３の馴化培地を包含する多様な有効な乳
酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の馴化培地を多様な変性させる化合物で処理して、該細菌由来の推定のイムノモジュリン（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｉｎ）の性質を決定した。かように、馴化培地を反復性の凍結−融解、熱処理、ＤＮＡを消化する酵素、プロテアーゼおよび不活性化したプロテアーゼでの消化にかけた。推定のイムノモジュリンはこの方法で本来１種若しくはそれ以上のタンパク質若しくはペプチドであることが決定された。推定のタンパク質イムノモジュリンの大きさを決定するために、馴化培地を濾過により分画し、そして濾液を有効性について試験した。こうして、有効な乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の馴化培地の有効成分は大きさがおよそ５ｋＤａ若しくはそれ未満であることが見出された。
【００３１】
本発明は特定の態様に関して記述した一方、多数の変形、改変および態様が可能であり、そして従って全部のこうした変形、改変および態様は本発明の技術思想および範囲内にあるとみなされるべきであることが認識されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下させる目的で哺乳動物に投与するための乳酸菌株の選択方法であって、
ａ．ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株を選択して培養する工程、
ｂ．該菌株からの細胞を含まない培養上清を取得する工程、
ｃ．該上清中でインキュベートされたレポーター細胞のＴＮＦα産生能力について該上清の効果を評価する工程であって、対照試料と比較してレポーター細胞のＴＮＦα産生の低下を乳酸菌株と同定する、上記の評価する工程、
ｄ．該乳酸菌株を選択する工程
を含んでなる、上記の選択方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分であって、細胞を含まない上清から得られ、かつ、ＴＮＦαのレベルを低下する能力を有する、上記の成分。
【請求項３】
請求項２に記載の成分であって、かつ、タンパク質またはタンパク質の部分である上記の成分。
【請求項４】
請求項３に記載の成分であって、かつ、該タンパク質またはタンパク質の部分が５ｋＤａより小さい、上記の成分。
【請求項５】
摂取可能な支持体、ならびに、請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる食物組成物であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、上記の食物組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の食物組成物であって、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の食物組成物。
【請求項７】
摂取可能な支持体、ならびに、請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる栄養補助食品であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、上記の栄養補助食品。
【請求項８】
請求項７に記載の栄養補助食品であって、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の栄養補助食品。
【請求項９】
製薬学的担体、ならびに、請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる栄養補助食品であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、上記の製薬学的組成物
。
【請求項１０】
請求項９に記載の製薬学的組成物であって、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の製薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法により選択された乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの抗炎症成分を含んでなるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を治療または予防するための薬剤であって、該成分が該菌株の増殖後の細胞を含まない培養上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、ことに特徴を有する上記の薬剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法により選択された乳酸菌株の細胞を有効成分として含んでなるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を治療または予防するための製剤であって、該菌株が哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下できることに特徴がある上記の製剤。
【請求項１３】
細胞が経口で投与されるものである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
細胞が直腸に投与されるものである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１５】
請求項１２に記載の製剤であって、該菌株が炎症性サイトカイン活性の低下に関連するタンパク質をならし培地で生産するものである、上記の製剤。
【請求項１６】
タンパク質が５ｋＤａより小さいことに特徴を有する請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
ａ．ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株を選択して培養する工程、
ｂ．該菌株からの細胞を含まない培養上清を取得する工程、
ｃ．該上清中でインキュベートされたレポーター細胞のＴＮＦα産生能力について該上清の効果を評価する工程であって、対照試料と比較してレポーター細胞のＴＮＦα産生の低下を乳酸菌株と同定する、上記の評価する工程、
ｄ．該乳酸菌株を選択する工程、および
ｅ．工程ｄ．で選択された乳酸菌株を含む組成物を製造する工程
を含んでなり、かつ、該組成物が哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下させる目的で哺乳動物に投与されるためのものであることを特徴とする組成物の製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の製造法で製造された乳酸菌株の細胞を含んでなる組成物。
【請求項１】
哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下させる目的で哺乳動物に投与するための乳酸菌株の選択方法であって、
ａ．ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株を選択して培養する工程、
ｂ．該菌株からの細胞を含まない培養上清を取得する工程、
ｃ．該上清中でインキュベートされたレポーター細胞のＴＮＦα産生能力について該上清の効果を評価する工程であって、対照試料と比較してレポーター細胞のＴＮＦα産生の低下を乳酸菌株と同定する、上記の評価する工程、
ｄ．該乳酸菌株を選択する工程
を含んでなる、上記の選択方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分であって、細胞を含まない上清から得られ、かつ、ＴＮＦαのレベルを低下する能力を有する、上記の成分。
【請求項３】
請求項２に記載の成分であって、かつ、タンパク質またはタンパク質の部分である上記の成分。
【請求項４】
請求項３に記載の成分であって、かつ、該タンパク質またはタンパク質の部分が５ｋＤａより小さい、上記の成分。
【請求項５】
摂取可能な支持体、ならびに、請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる食物組成物であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、上記の食物組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の食物組成物であって、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の食物組成物。
【請求項７】
摂取可能な支持体、ならびに、請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる栄養補助食品であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、上記の栄養補助食品。
【請求項８】
請求項７に記載の栄養補助食品であって、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の栄養補助食品。
【請求項９】
製薬学的担体、ならびに、請求項１に記載の方法により選択されたロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株に由来するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を低下させる成分を含んでなる栄養補助食品であって、該菌株の増殖後の細胞を含まない上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、上記の製薬学的組成物
。
【請求項１０】
請求項９に記載の製薬学的組成物であって、ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｒｅｕｔｅｒｉ）株の生物学的に純粋な培養物の細胞を含む、上記の製薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法により選択された乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの抗炎症成分を含んでなるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を治療または予防するための薬剤であって、該成分が該菌株の増殖後の細胞を含まない培養上清から得られ、かつ、モデル系を用いて確定されるとＴＮＦαのレベルを低下させる能力を有する、ことに特徴を有する上記の薬剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法により選択された乳酸菌株の細胞を有効成分として含んでなるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関連する炎症を治療または予防するための製剤であって、該菌株が哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下できることに特徴がある上記の製剤。
【請求項１３】
細胞が経口で投与されるものである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
細胞が直腸に投与されるものである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１５】
請求項１２に記載の製剤であって、該菌株が炎症性サイトカイン活性の低下に関連するタンパク質をならし培地で生産するものである、上記の製剤。
【請求項１６】
タンパク質が５ｋＤａより小さいことに特徴を有する請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
ａ．ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株を選択して培養する工程、
ｂ．該菌株からの細胞を含まない培養上清を取得する工程、
ｃ．該上清中でインキュベートされたレポーター細胞のＴＮＦα産生能力について該上清の効果を評価する工程であって、対照試料と比較してレポーター細胞のＴＮＦα産生の低下を乳酸菌株と同定する、上記の評価する工程、
ｄ．該乳酸菌株を選択する工程、および
ｅ．工程ｄ．で選択された乳酸菌株を含む組成物を製造する工程
を含んでなり、かつ、該組成物が哺乳動物の胃腸管におけるヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染に関連する胃腸の炎症を低下させる目的で哺乳動物に投与されるためのものであることを特徴とする組成物の製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の製造法で製造された乳酸菌株の細胞を含んでなる組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２１０１５（Ｐ２０１１−２１０１５Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８１７１３（Ｐ２０１０−１８１７１３）
【出願日】平成２２年８月１６日（２０１０．８．１６）
【分割の表示】特願２００４−５４１３９２（Ｐ２００４−５４１３９２）の分割
【原出願日】平成１５年１０月６日（２００３．１０．６）
【出願人】（５０４１８６７２５）バイオガイア・エイ・ビー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１６日（２０１０．８．１６）
【分割の表示】特願２００４−５４１３９２（Ｐ２００４−５４１３９２）の分割
【原出願日】平成１５年１０月６日（２００３．１０．６）
【出願人】（５０４１８６７２５）バイオガイア・エイ・ビー (4)
【Ｆターム（参考）】
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