ペプチドの検出方法
【課題】迅速かつ簡便なペプチドの検出方法などを提供すること。
【解決手段】ペプチドと式（Ｉ）
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。
【解決手段】ペプチドと式（Ｉ）
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの検出方法に関する。特に本発明は、コラーゲン由来のペプチドの検出および定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、ホルモンやシグナル伝達物質などとして生命現象の中心的な役割を担っているだけでなく、治療薬や疾病のマーカーとしても利用されているなど、非常に重要な生体分子である。ペプチドの検出・定量は一般的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離と２１０〜３００ｎｍのＵＶ波長における吸光度測定を組み合わせて行われる。吸光度による検出は、ペプチドに含まれるペプチド結合と芳香族置換基の量に依存するため感度が低く、ナノモル程度が検出限界である。蛍光法は、吸光度法と比較して感度が高いことから、ペプチドのみを選択的に蛍光誘導体化できれば、微量の生体サンプルからペプチドの検出および定量が容易になる。
【０００３】
従来のペプチドの蛍光検出に対しては、第一アミンと反応して蛍光性を与えるｏ−フタルアルデヒド試薬やフルオレッサミン試薬、ペプチド鎖中のアルギニンのアミジノ基と反応して蛍光性を与えるベンゾイン試薬、Ｎ末端にチロシンを含むペプチドを特異的に蛍光体にするヒドロキシルアミン試薬など、数種のペプチドの蛍光誘導体化試薬が開発されている。しかしこれらの試薬は、生体に大量に存在するアミノ酸をはじめとするペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうため、生体試料中のペプチドに対する選択性が低いという欠点を有する。
【０００４】
一方で本発明者らは、逆相液体クロマトグラフィーとペプチドＮ末端部位における蛍光体形成反応を利用したペプチド定量方法を開発した（非特許文献１参照）。この反応は、ホウ酸塩緩衝液中でペプチドとカテコールを過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤の存在下で１００℃付近の高温で加熱する操作により、ペプチドを蛍光誘導体化するものである。
【０００５】
ところで、コラーゲンは臓器や骨など組織の構造を維持するために重要なタンパク質であり、ヒト生体中に存在する総タンパク質の約３０％を占めている。コラーゲン量は老化と密接な関係があることから、生体試料中に含まれるコラーゲンの簡便かつ特異的な検出、またコラーゲン量の簡便かつ特異的な測定の開発は、ヒトの健康状態を検査するためにも重要である。さらに、コラーゲンは被験者から外科的に試料を入手する必要があるが、そのため被験者の負担を最小限に抑えるよう、微量の試料から高感度にコラーゲン量を測定する必要もある。
現在、公知のコラーゲン定量法としてＥＬＩＳＡ法や比色法、o−フタルアルデヒドを用いた蛍光法等に基づく技術が知られており、その技術に基づくキットが市販されている。しかし、ＥＬＩＳＡ法は抗原抗体反応に依存するため、高価なキットになっている。また比色法によれば、コラーゲンと色素の相互作用に基づく吸収の変化を測定するために感度が低く、また多くの試料を必要とすること、特異性が低いこと、などの欠点があった。またo−フタルアルデヒドを用いる方法（非特許文献２参照）では、アミノ末端を検出するという特徴から、サンプル中に含まれるコラーゲン（またはコラーゲン由来のペプチド）以外のタンパク質やペプチド、アミノ基を有するペプチド側鎖をも検出してしまい、ブランクが非常に高いという欠点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｂａｓｈｉｍａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２９（２００８）ｐｐ．３５６−３６３
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ７０，ｐｐ．８７８−８８２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ペプチドを選択的に穏和な条件で蛍光誘導体化可能な方法や、試薬が求められている。特に、コラーゲン由来のペプチドを簡便かつ選択的に検出・定量可能な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、今回、種々のカテコール類縁化合物のペプチドに対する反応性をスクリーニングした結果、カテコールのベンゼン環の置換基によって反応性が変化して、特に、数種のカテコール類縁化合物によれば、２０〜５０℃付近、最も好ましくは３７℃付近の穏和な条件で、選択的にペプチドを蛍光誘導体に変換可能であることを明らかにした。
さらに特定のカテコール類縁化合物によれば、コラーゲンに由来するペプチドを上記条件で選択的に蛍光誘導体に変換可能なことも明らかにした。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、例えば以下に関するものである。
［１］ペプチドと式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法；
［２］反応が、ｐＨ７〜８で行われる、［１］に記載の方法；
［３］酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、［１］または［２］に記載の方法；
［４］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、［１］〜［３］のいずれか一に記載の方法；
［５］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法；
［６］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法；
［７］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法；
［８］試料中のコラーゲンを検出する方法である、［７］に記載の方法；
［９］試料中のコラーゲンを定量する方法である、［７］に記載の方法；
［１０］式（Ｉ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、ペプチド検出試薬；
［１１］酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、［１０］に記載の試薬；
［１２］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、［１０］または［１１］に記載の試薬；
［１３］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、［１０］〜［１２］のいずれか一に記載の試薬；
［１４］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、［１０］〜［１２］のいずれか一に記載の試薬；
［１５］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、［１０］〜［１２］のいずれか一に記載の試薬；
［１６］コラーゲンの検出試薬である、［１５］に記載の試薬；
［１７］ペプチドと式（Ｉ）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法；
［１８］反応が、ｐＨ７〜８で行われる、［１７］に記載の方法；
［１９］酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、［１７］または［１８］に記載の方法；
［２０］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、［１７］〜［１９］のいずれか一に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のペプチド検出方法は、穏和な温度条件でペプチドを選択的に蛍光誘導体化することを特徴とする。したがって、ペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうことが無く、またマイルドな条件にも関わらずペプチドを高い割合で蛍光体化することができる。
特に本発明のペプチド検出方法は、アミノ酸の種類や隣接するペプチド結合を認識して、特定のペプチド（例えば、Ｎ末端がプロリンであるペプチドや、グリシンを含むペプチド）を高選択的に蛍光体化することができる。特にグリシンを含むペプチドの検出は、コラゲナーゼの使用と組み合わせて、コラーゲン検出方法として応用することができる点で有用である。
また当該コラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを定量的に測定することも可能であるし、コラーゲンをバイオマーカーとする疾患の診断を行うことも可能である。
さらに本発明のペプチド検出方法は、従来のペプチド蛍光体形成反応に比べてよりマイルドな温度条件で、短時間にペプチドを高選択的に蛍光検出できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ジヒドロキシフェニル酢酸を用い蛍光体化したペプチドの蛍光強度を示す図である。
【図２】ジヒドロキシ安息香酸を用い蛍光体化したペプチドの蛍光強度を示す図である。
【図３】４−クロロカテコールを用い蛍光体化したペプチドの蛍光強度を示す図である。
【図４】ジヒドロキシフェニル酢酸を用いたペプチドの蛍光体化により、コラーゲンを選択的に検出したことを示す図である。
【図５】コラゲナーゼ処理したヒトコラーゲンおよびウシコラーゲンの量と蛍光体化したペプチドの蛍光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ペプチドと式（Ｉ）
【００１９】
【化４】
【００２０】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と略記する）とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、３０〜４０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法を提供する。
【００２１】
本発明のペプチドの検出方法は、ペプチドを蛍光体化する工程と、得られた蛍光体を検出する工程に分けられる。以下、各工程に分けて説明する。
【００２２】
工程（１）：ペプチドを蛍光体化する工程
本発明における「ペプチド」とは、後述する蛍光体形成反応により蛍光体化される限りその配列は特に限定されず、例えばアミノ酸数が２以上のペプチドが挙げられる。
【００２３】
後述する蛍光体形成反応において、化合物（Ｉ）が、Ｒがカルボキシルである化合物（３，４−ジヒドロ安息香酸）またはＲがハロゲン原子である化合物（４−ハロゲン化カテコール）の場合、ペプチドのＮ末端はプロリンであることが好ましい。すなわち本発明の方法において、化合物（Ｉ）が３，４−ジヒドロ安息香酸である場合は、ペプチドの中でもＮ末端がプロリンであるペプチドを選択的に蛍光体化し、検出することが可能である。一方、化合物（Ｉ）が、Ｒがカルボキシル−Ｃ１−６アルキルである化合物（例えば、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）である化合物の場合は、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドに対して蛍光を与える傾向にあるが、ペプチドの中でもグリシンを含むペプチドを選択的に蛍光体化し、検出することが可能である。
【００２４】
後述の蛍光体形成反応におけるペプチドとしては、通常単一のペプチドであるが、２種以上の複数のペプチドであってもよい。複数のペプチドを用いることによって、得られるペプチド蛍光体が増え、結果として得られる蛍光強度が変化する。従って本発明の方法によれば、ペプチドの検出だけでなく、得られた蛍光強度のデータをデータベース化して多種多様なペプチドの存在を予測することも可能になる。
【００２５】
あるいは検出対象となるペプチドは、どのような方法で製造されてもよく、当業者であれば適切な製造方法を選択することが可能である。例えば、当業者であれば自体公知のペプチド合成法を用いてペプチドを製造することができるし、また市販品があればそれを購入して用いてもよい。また、プロテアーゼなどの酵素を用いて断片化したペプチドであってもよい。プロテアーゼとしては特に限定されず、当業者であれば最終的な目的に沿ったプロテアーゼを適宜選択することが可能である。例えば、本発明のペプチド検出方法をコラーゲンの検出・定量に応用する場合には、コラゲナーゼを用いてペプチドを得ればよい。
コラゲナーゼを用いる場合の反応条件、コラゲナーゼの量などは、当業者であれば適宜選択することができる。またコラゲナーゼの種類は、検出・定量したいコラーゲンの種類に合わせて適宜選択することが可能である。
【００２６】
本発明のペプチドを含むサンプルは、本発明のペプチドそのものであってもよいが、後述する蛍光体形成反応を妨げない限り、どのような物質が含まれていてもよい。例えば、本発明のペプチドを含むサンプルとしては、ペプチド水溶液、ペプチド緩衝液だけでなく、ペプチドを含む種々の生体サンプル：例えば、血液、血清、リンパ液、細胞抽出液、細胞培養液、組織抽出液、組織培養液など：が挙げられる。したがって、例えば血中のコラーゲンを定量する場合、血液自体をコラゲナーゼ処理し、これをそのままコラーゲン由来のペプチドを含むサンプルとして用いてもよい。またこれらのサンプルは、後述する蛍光体形成反応を妨げないように、さらに処理されていてもよい。当該処理方法は、当業者であれば適宜選択し、実行することが可能である。
【００２７】
蛍光体は、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で、ペプチドと化合物（Ｉ）とを反応させて製造する。
【００２８】
本工程における「酸化剤」としては特に限定されるものではなく、例えば過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過ホウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ｍ−クロロ過安息香酸などの酸化剤が挙げられる。なかでも過ヨウ素酸ナトリウムであることがより好ましい。
酸化剤の添加量は、後述する蛍光体形成反応を進行させ、特定の波長で発光する蛍光体が形成される限り特に限定されるものではない。しかしながら、反応系中に酸化剤と反応するような物質が存在する場合や、後述する蛍光体形成を妨げるような物質が存在する場合は、酸化剤が消費されて実質的に工程（１）で用いられる酸化剤の量が減少するので、酸化剤の量を増やす必要がある。例えば検出に用いられるサンプルが血液や血清であった場合、本工程において血液や血清中の物質によって酸化剤が消費される場合がある。このような場合は、通常よりも酸化剤の量を増やすことで本工程を進行させることができる。
このような酸化剤の量は、当業者であれば適宜決定することが可能である。
【００２９】
本発明の化合物（Ｉ）として好ましくは、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸または４−ハロゲン化カテコールである。
特に後述する蛍光体形成反応において、化合物（Ｉ）としてＲがカルボキシルである化合物（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）またはＲがハロゲン原子である化合物（４−ハロゲン化カテコール）を用いた場合は、Ｎ末端がプロリンであるペプチドを高選択的に蛍光体化することができる。
一方、化合物（Ｉ）としてＲがカルボキシル−Ｃ１−６アルキルである化合物（例えば、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）を用いた場合は、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドに対して蛍光を与えるが、後述する実施例１および２で示されるように、特にグリシンを含むペプチドに対して蛍光を与える（図１参照）。
【００３０】
本工程（１）においては、上記した酸化剤の存在下において、ペプチドのＮ末端のアミノ基が化合物（Ｉ）と反応し、さらに、これがホウ酸溶液中のホウ素と反応して蛍光体を形成すると考えられる。化合物（Ｉ）として３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ＤＨＰＡＡ）を用いた場合に、推定されるペプチド蛍光体合成に関する反応式を以下に示す。
【００３１】
【化５】
【００３２】
ペプチドと反応する化合物（Ｉ）の量や、ホウ酸溶液中のホウ酸（ホウ素）量は、本工程が進行する限り特に限定されず、当業者であれば適宜適切な量を調整することが可能である。
【００３３】
ホウ酸溶液の組成としては、特に限定されず、本工程における反応を阻害しないのであればどのような溶媒であってもよいし、ホウ酸（ホウ素）以外にどのような化合物が含まれていても構わない。本工程におけるホウ酸溶液として好ましくは、ホウ酸水溶液またはホウ酸緩衝液である。ホウ酸溶液がホウ酸緩衝液である場合のｐＨは特に限定されないが、中性（ｐＨ６〜８）付近が好ましく、ｐＨ７〜８がより好ましい。
【００３４】
本工程における反応温度は、本発明がマイルドな条件で行われるという特徴を鑑み、通常２０℃〜５０℃であるが、１００℃程度の高温でも本工程の反応は進行する。しかしながら、本工程における反応温度として好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３８℃、最も好ましくは３７℃である。反応温度が２０℃（好ましくは３０℃、より好ましくは３５℃）より低ければ、たとえ本発明の化合物（Ｉ）であっても蛍光体が形成しにくくなり、反応温度が５０℃（好ましくは４０℃、より好ましくは３８℃）より高くても、ペプチドが分解される、副反応が増加するなどして蛍光体が形成されにくくなる。
【００３５】
本発明は、非特許文献１により従来公知のペプチド定量方法とは異なり、よりマイルドな条件でペプチドを蛍光体化できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。また本発明は、従来公知の方法と比較して、１００℃近くの過酷な反応条件によるペプチド分解の恐れを低減できることや、加熱操作を省くことによる操作の簡便化などの利点を有する。
【００３６】
なお、本工程における反応温度は前述のとおりであるが、必ずしもこの範囲内でなければ本発明が実施できないというわけではない。本発明は、従来のペプチド蛍光体化方法に比べてマイルドな条件でペプチドを蛍光体化できる化合物（Ｉ）を発見したことに基づくものであって、反応温度が若干本発明の範囲外となったとしても、化合物（Ｉ）、酸化物、ホウ酸溶液などの本発明の構成要素や、後述する反応時間等を適宜調整することによって、本発明を実施することが可能である。
【００３７】
反応時間は、通常３〜１５分間であり、好ましくは５〜１３分間、より好ましくは１０分間である。
【００３８】
本工程により、励起波長約３７０〜４５０ｎｍ、蛍光波長約４６５〜５４０ｎｍの蛍光体が製造される。得られた蛍光体は単離することなく、次の工程（２）に付すことが可能である。
【００３９】
ところで、本発明の検出方法は、特にコラーゲンの検出・定量に応用され得る。工程（２）の前に、本発明の検出方法を利用したコラーゲンの検出方法、定量方法にかかる、蛍光体の製造工程について説明する。
【００４０】
コラーゲンの検出の対象である「コラーゲン」としては特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンなどが挙げられる。検出するコラーゲンがどのようなコラーゲンであるかは、用いるコラゲナーゼの種類に依存する。
コラーゲンは、グリシン−アミノ酸（Ｘ）−アミノ酸（Ｙ）という、グリシンが３残基ごとに繰り返される一次構造を有しており、各種コラゲナーゼによってグリシンをＮ末端に含むペプチド断片に分解することができる。コラゲナーゼとしては、検出したいコラーゲンの種類に合わせて選択すればよく、したがって、例えばＩ型コラーゲンを検出する場合は、コラーゲンを含む試料をＩ型コラゲナーゼ（Ｉ型コラーゲンを消化するコラゲナーゼ）で消化すればよい。得られたペプチド断片はＩ型コラーゲン由来であるので、このペプチド断片を検出することでＩ型コラーゲンを特異的に検出することになる。コラゲナーゼの反応条件、量などは、当業者であれば適宜選択可能である。
【００４１】
このグリシンを含むペプチド断片は、前述したように、ＲがカルボキシＣ１−６アルキルである化合物（Ｉ）によって特異的に蛍光体化できる。特に後述する図１に示されるように、本発明の化合物（Ｉ）はＧＰ、ＧＰＰ（Ｇ：グリシン、Ｐ：プロリン）という配列に非常に反応性が高いことが分かる。コラーゲンの一次構造において、アミノ酸（Ｘ）はプロリンであることが多く、またアミノ酸（Ｙ）はヒドロキシプロリンであることが多いので、結果的に、本発明の化合物（Ｉ）は特にコラーゲン由来のペプチド断片を選択的に蛍光体化することになる。
よって上記工程を経て得られた蛍光体を、後述する工程（２）において蛍光スペクトロメーター等に付し、蛍光強度を測定するのみで、試料中に存在するコラーゲンを検出することができる。
【００４２】
本発明のコラーゲン検出方法において、化合物（Ｉ）としては特に限定されないが、ＲがカルボキシＣ１−６アルキルである化合物が望ましく、Ｒがカルボキシメチルである３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸がより好ましい。
【００４３】
コラーゲンを含む試料としては特に限定されないが、生体試料、例えば血液、血清、尿などが挙げられる。また食品、飲料、化粧品、実験用試薬なども挙げられる。本発明のコラーゲン検出方法における、コラーゲンを含むこれらの試料には、コラゲナーゼによるコラーゲンのペプチド断片化を阻害しない限り、コラーゲン以外の成分が含まれていてもよい。
【００４４】
従来のコラーゲンの検出には、ＥＬＩＳＡ法や比色法、o−フタルアルデヒドを用いた蛍光法が用いられてきた。本発明のコラーゲン検出方法は、試料に含まれるコラーゲンをコラゲナーゼによって切断して生成される多くのペプチド断片を、グリシンを含むペプチドに特異的な蛍光反応によって検出するものである。この方法の感度はペプチド断片数が多くなるほどシグナルが増加することに伴い増大するので、本発明のコラーゲン検出方法によれば、微量のコラーゲンであっても高い感度で検出することができる。
【００４５】
ところで本発明のコラーゲン検出方法においては、後述する図４に示されるように、コラーゲン量と蛍光強度との間に線形性が認められる。したがって、検出方法ごとにその都度検量線を作成することで、コラーゲン量を定量することも可能である。よって本発明のコラーゲン検出方法は、コラーゲン定量方法でもあり得る。
【００４６】
更に、この蛍光反応は２０〜５０℃というマイルドな条件でも進行することから、試料にコラゲナーゼ及び蛍光試薬を同時に加え、コラゲナーゼによるペプチド断片化と蛍光試薬による蛍光体化を同時に行うことが可能である。これにより、従来のコラーゲン検出方法で必要とされていた免疫反応や洗浄操作などが省略されるため、検出時間を大幅に短縮しつつ、簡便な操作で試料中のコラーゲンを検出・定量できる。
現在のところ、このような蛍光法に基づくコラーゲン測定キットは市販されておらず、本発明は簡便かつ高感度なコラーゲンの蛍光検出・定量法と成り得るものである。
【００４７】
また、血中コラーゲン（特に、血中ＩＶ型コラーゲン）は肝臓の線維化に相関する肝線維化マーカーであり、また尿中コラーゲン（特に、尿中ＩＶ型コラーゲン）は、糖尿や腎炎による腎臓の糸球体崩壊に相関するマーカーであることが知られている。
よって本発明のコラーゲン検出・定量方法によれば、これらの疾患を発見・診断することも可能となる。
【００４８】
工程（２）：蛍光体を検出する工程
本工程は、工程（１）で得られた蛍光体を検出することで、サンプル中に存在するペプチドを検出する工程である。
【００４９】
蛍光体の検出方法は特に限定されるものではないが、簡便性や多数のペプチドを分析する必要性、夾雑物の存在などを鑑みて、蛍光スペクトロメーターやマイクロプレートリーダーにより検出することが望ましい。また、ＨＰＬＣやマイクロチップ電気泳動による分離も可能である。ＨＰＬＣやマイクロチップ電気泳動を利用することで、多数のペプチドを分離して分析することが可能である。ＨＰＬＣ条件としては、励起波長を３２０〜５００ｎｍ近傍、好ましくは３７０〜４５０ｎｍ近傍に、蛍光を４００〜５９０ｎｍ近傍、好ましくは４６５〜５４０ｎｍ近傍にそれぞれ設定する。なお、当業者であれば、化合物（Ｉ）に含まれる化合物に応じて、その都度適宜最適な条件を設定することが可能である。これ以外のＨＰＬＣ条件は特に限定されず、当業者であれば適宜条件を設定することが可能である。
【００５０】
蛍光体の検出に際しては、蛍光体を含む試料中に他の成分が含まれていても構わない。したがって本発明の検出方法では、工程（１）において化合物（Ｉ）、酸化剤、ホウ酸溶液やプロテアーゼを試料に添加して蛍光体を製造し、次いで蛍光体を含む混合液を工程（２）に付してそのまま蛍光を測定するという極めて単純な操作で、ペプチドやコラーゲンを検出することができるのである。
また夾雑物が蛍光測定の妨げになる場合は、自体公知の方法によって、蛍光体以外の成分を除く操作を行うか、あるいは上記ＨＰＬＣのような蛍光体を分離する操作を行えばよい。このような方法は、当業者に公知である。
【００５１】
また本発明は、化合物（Ｉ）、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、ペプチド検出試薬を提供する。本発明のペプチド検出試薬に含まれる、化合物（Ｉ）、酸化剤およびホウ酸溶液は、前記したとおりである。
【００５２】
本発明のペプチド検出試薬は、対象とするサンプルに加えることで、サンプルに含まれるペプチドを蛍光体化することができる。この際、サンプルに加える各成分の量については、当業者であれば適宜決定することができる。
【００５３】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。なお以下の実施例は本願発明の一例を挙げるに過ぎず、本発明をこの範囲に限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：蛍光体への変換およびスペクトロメーターによる蛍光体の検出
４０μＭの各ペプチド溶液２５０μＬに、０．５ｍＭの化合物（Ｉ） ３７５μＬ、１００ｍＭ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ ８．０）３１２μＬ、５ｍＭ ＮａＩＯ４ ６３μＬを加え（終濃度としてペプチド１０μＭ、Ｎａ３ＢＯ３ ３１ｍＭ、ＮａＩＯ４ ３１５μＭ）、３７℃で１０分間反応を進行させた。その後反応液を１０分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）によって蛍光強度を測定した。結果を図１〜図３に示す。
蛍光光度分析：
機種：日本分光 ＦＰ−６３００ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
スリット幅：１０ｎｍ、１０ｎｍ
感度：ｍｅｄｉｕｍ
レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ
【００５５】
実施例２：ＨＰＬＣによる蛍光体の検出
実施例１で得られた反応液をＨＰＬＣによって分析した。
ＨＰＬＣ条件：移動層；１５−８０％メタノール＋５％ ０．２５Ｍ ｐＨ７．０ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（０−４０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、励起波長３７０〜４５０ｎｍ，蛍光波長４６５〜５４０ｎｍ，カラムＯＤＳ−８０Ｔｓ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ，ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ５ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）。
【００５６】
化合物（Ｉ）として３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ＤＨＰＡＡ）を用いた場合（図１）、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド、特にグリシンを含むペプチドを蛍光体化することができる一方で、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（図２）や４−ハロゲン化カテコール（図３）は、Ｎ末端がプロリンであるペプチドを高選択的に蛍光体化することが分かった。
【００５７】
実施例３：コラーゲンの検出
コラーゲンを含む各タンパク質（２０ｎＭ）またはＨｅＬａ細胞抽出物（全タンパク質量１５．２μｇ／ｔｕｂｅ；４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、微生物由来コラゲナーゼ（２．０μｇ／ｔｕｂｅ，ナカライテスク社製）と３７℃で１時間反応させた。その後、３１５μＭ ＮａＩＯ４と３１．２ｍＭホウ酸緩衝液の存在下、１８７μＭ ３，４−ＤＨＰＡＡと３７℃で１０分間反応させ、蛍光体を製造した。その後、反応液を１０分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター（実施例１参照）によって、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍで、得られた蛍光体を含む溶液の蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。
本発明のコラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを特異的に検出できることが明らかとなった。
【００５８】
実施例４：コラーゲンの定量
ヒトまたはウシコラーゲン−Ｉ（シグマ社製）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ ７．５）中、微生物由来コラゲナーゼ（２．０μｇ／ｔｕｂｅ，ナカライテスク社製）と３７℃で１時間反応させた。その後、３１５μＭ ＮａＩＯ４と３１．２ｍＭホウ酸緩衝液の存在下、１８７μＭ ３，４−ＤＨＰＡＡと３７℃で１０分間反応させ、蛍光体を製造した。その後、反応液を１０分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター（実施例1参照）によって、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍで、得られた蛍光体を含む溶液の蛍光強度を測定した。得られた結果を、ヒトまたはウシコラーゲン−Ｉ量との関係でプロットし、検量線を作成した。結果を図５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のペプチド検出方法は、穏和な温度条件でペプチドを選択的に蛍光誘導体化することを特徴とする。したがって、ペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうことが無く、またマイルドな条件にも関わらずペプチドを高い割合で蛍光体化することができる。
特に本発明のペプチド検出方法は、アミノ酸の種類や隣接するペプチド結合を認識して、特定のペプチド（例えば、Ｎ末端がプロリンであるペプチドや、グリシンを含むペプチド）を高選択的に蛍光体化することができる。特にグリシンを含むペプチドの検出は、コラゲナーゼの使用と組み合わせて、コラーゲン検出方法として応用することができる点で有用である。
また当該コラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを定量的に測定することも可能であるし、コラーゲンをバイオマーカーとする疾患の診断を行うことも可能である。
さらに本発明のペプチド検出方法は、従来のペプチド蛍光体形成反応に比べてよりマイルドな温度条件で、短時間にペプチドを高選択的に蛍光検出できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。
【００６０】
本出願は、特願２０１１−０４５４９１（出願日：平成２３年３月２日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの検出方法に関する。特に本発明は、コラーゲン由来のペプチドの検出および定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、ホルモンやシグナル伝達物質などとして生命現象の中心的な役割を担っているだけでなく、治療薬や疾病のマーカーとしても利用されているなど、非常に重要な生体分子である。ペプチドの検出・定量は一般的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離と２１０〜３００ｎｍのＵＶ波長における吸光度測定を組み合わせて行われる。吸光度による検出は、ペプチドに含まれるペプチド結合と芳香族置換基の量に依存するため感度が低く、ナノモル程度が検出限界である。蛍光法は、吸光度法と比較して感度が高いことから、ペプチドのみを選択的に蛍光誘導体化できれば、微量の生体サンプルからペプチドの検出および定量が容易になる。
【０００３】
従来のペプチドの蛍光検出に対しては、第一アミンと反応して蛍光性を与えるｏ−フタルアルデヒド試薬やフルオレッサミン試薬、ペプチド鎖中のアルギニンのアミジノ基と反応して蛍光性を与えるベンゾイン試薬、Ｎ末端にチロシンを含むペプチドを特異的に蛍光体にするヒドロキシルアミン試薬など、数種のペプチドの蛍光誘導体化試薬が開発されている。しかしこれらの試薬は、生体に大量に存在するアミノ酸をはじめとするペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうため、生体試料中のペプチドに対する選択性が低いという欠点を有する。
【０００４】
一方で本発明者らは、逆相液体クロマトグラフィーとペプチドＮ末端部位における蛍光体形成反応を利用したペプチド定量方法を開発した（非特許文献１参照）。この反応は、ホウ酸塩緩衝液中でペプチドとカテコールを過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤の存在下で１００℃付近の高温で加熱する操作により、ペプチドを蛍光誘導体化するものである。
【０００５】
ところで、コラーゲンは臓器や骨など組織の構造を維持するために重要なタンパク質であり、ヒト生体中に存在する総タンパク質の約３０％を占めている。コラーゲン量は老化と密接な関係があることから、生体試料中に含まれるコラーゲンの簡便かつ特異的な検出、またコラーゲン量の簡便かつ特異的な測定の開発は、ヒトの健康状態を検査するためにも重要である。さらに、コラーゲンは被験者から外科的に試料を入手する必要があるが、そのため被験者の負担を最小限に抑えるよう、微量の試料から高感度にコラーゲン量を測定する必要もある。
現在、公知のコラーゲン定量法としてＥＬＩＳＡ法や比色法、o−フタルアルデヒドを用いた蛍光法等に基づく技術が知られており、その技術に基づくキットが市販されている。しかし、ＥＬＩＳＡ法は抗原抗体反応に依存するため、高価なキットになっている。また比色法によれば、コラーゲンと色素の相互作用に基づく吸収の変化を測定するために感度が低く、また多くの試料を必要とすること、特異性が低いこと、などの欠点があった。またo−フタルアルデヒドを用いる方法（非特許文献２参照）では、アミノ末端を検出するという特徴から、サンプル中に含まれるコラーゲン（またはコラーゲン由来のペプチド）以外のタンパク質やペプチド、アミノ基を有するペプチド側鎖をも検出してしまい、ブランクが非常に高いという欠点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｂａｓｈｉｍａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２９（２００８）ｐｐ．３５６−３６３
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ７０，ｐｐ．８７８−８８２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ペプチドを選択的に穏和な条件で蛍光誘導体化可能な方法や、試薬が求められている。特に、コラーゲン由来のペプチドを簡便かつ選択的に検出・定量可能な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、今回、種々のカテコール類縁化合物のペプチドに対する反応性をスクリーニングした結果、カテコールのベンゼン環の置換基によって反応性が変化して、特に、数種のカテコール類縁化合物によれば、２０〜５０℃付近、最も好ましくは３７℃付近の穏和な条件で、選択的にペプチドを蛍光誘導体に変換可能であることを明らかにした。
さらに特定のカテコール類縁化合物によれば、コラーゲンに由来するペプチドを上記条件で選択的に蛍光誘導体に変換可能なことも明らかにした。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、例えば以下に関するものである。
［１］ペプチドと式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法；
［２］反応が、ｐＨ７〜８で行われる、［１］に記載の方法；
［３］酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、［１］または［２］に記載の方法；
［４］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、［１］〜［３］のいずれか一に記載の方法；
［５］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法；
［６］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法；
［７］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法；
［８］試料中のコラーゲンを検出する方法である、［７］に記載の方法；
［９］試料中のコラーゲンを定量する方法である、［７］に記載の方法；
［１０］式（Ｉ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、ペプチド検出試薬；
［１１］酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、［１０］に記載の試薬；
［１２］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、［１０］または［１１］に記載の試薬；
［１３］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、［１０］〜［１２］のいずれか一に記載の試薬；
［１４］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、［１０］〜［１２］のいずれか一に記載の試薬；
［１５］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、［１０］〜［１２］のいずれか一に記載の試薬；
［１６］コラーゲンの検出試薬である、［１５］に記載の試薬；
［１７］ペプチドと式（Ｉ）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法；
［１８］反応が、ｐＨ７〜８で行われる、［１７］に記載の方法；
［１９］酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、［１７］または［１８］に記載の方法；
［２０］式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、［１７］〜［１９］のいずれか一に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のペプチド検出方法は、穏和な温度条件でペプチドを選択的に蛍光誘導体化することを特徴とする。したがって、ペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうことが無く、またマイルドな条件にも関わらずペプチドを高い割合で蛍光体化することができる。
特に本発明のペプチド検出方法は、アミノ酸の種類や隣接するペプチド結合を認識して、特定のペプチド（例えば、Ｎ末端がプロリンであるペプチドや、グリシンを含むペプチド）を高選択的に蛍光体化することができる。特にグリシンを含むペプチドの検出は、コラゲナーゼの使用と組み合わせて、コラーゲン検出方法として応用することができる点で有用である。
また当該コラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを定量的に測定することも可能であるし、コラーゲンをバイオマーカーとする疾患の診断を行うことも可能である。
さらに本発明のペプチド検出方法は、従来のペプチド蛍光体形成反応に比べてよりマイルドな温度条件で、短時間にペプチドを高選択的に蛍光検出できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ジヒドロキシフェニル酢酸を用い蛍光体化したペプチドの蛍光強度を示す図である。
【図２】ジヒドロキシ安息香酸を用い蛍光体化したペプチドの蛍光強度を示す図である。
【図３】４−クロロカテコールを用い蛍光体化したペプチドの蛍光強度を示す図である。
【図４】ジヒドロキシフェニル酢酸を用いたペプチドの蛍光体化により、コラーゲンを選択的に検出したことを示す図である。
【図５】コラゲナーゼ処理したヒトコラーゲンおよびウシコラーゲンの量と蛍光体化したペプチドの蛍光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ペプチドと式（Ｉ）
【００１９】
【化４】
【００２０】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と略記する）とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、３０〜４０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法を提供する。
【００２１】
本発明のペプチドの検出方法は、ペプチドを蛍光体化する工程と、得られた蛍光体を検出する工程に分けられる。以下、各工程に分けて説明する。
【００２２】
工程（１）：ペプチドを蛍光体化する工程
本発明における「ペプチド」とは、後述する蛍光体形成反応により蛍光体化される限りその配列は特に限定されず、例えばアミノ酸数が２以上のペプチドが挙げられる。
【００２３】
後述する蛍光体形成反応において、化合物（Ｉ）が、Ｒがカルボキシルである化合物（３，４−ジヒドロ安息香酸）またはＲがハロゲン原子である化合物（４−ハロゲン化カテコール）の場合、ペプチドのＮ末端はプロリンであることが好ましい。すなわち本発明の方法において、化合物（Ｉ）が３，４−ジヒドロ安息香酸である場合は、ペプチドの中でもＮ末端がプロリンであるペプチドを選択的に蛍光体化し、検出することが可能である。一方、化合物（Ｉ）が、Ｒがカルボキシル−Ｃ１−６アルキルである化合物（例えば、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）である化合物の場合は、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドに対して蛍光を与える傾向にあるが、ペプチドの中でもグリシンを含むペプチドを選択的に蛍光体化し、検出することが可能である。
【００２４】
後述の蛍光体形成反応におけるペプチドとしては、通常単一のペプチドであるが、２種以上の複数のペプチドであってもよい。複数のペプチドを用いることによって、得られるペプチド蛍光体が増え、結果として得られる蛍光強度が変化する。従って本発明の方法によれば、ペプチドの検出だけでなく、得られた蛍光強度のデータをデータベース化して多種多様なペプチドの存在を予測することも可能になる。
【００２５】
あるいは検出対象となるペプチドは、どのような方法で製造されてもよく、当業者であれば適切な製造方法を選択することが可能である。例えば、当業者であれば自体公知のペプチド合成法を用いてペプチドを製造することができるし、また市販品があればそれを購入して用いてもよい。また、プロテアーゼなどの酵素を用いて断片化したペプチドであってもよい。プロテアーゼとしては特に限定されず、当業者であれば最終的な目的に沿ったプロテアーゼを適宜選択することが可能である。例えば、本発明のペプチド検出方法をコラーゲンの検出・定量に応用する場合には、コラゲナーゼを用いてペプチドを得ればよい。
コラゲナーゼを用いる場合の反応条件、コラゲナーゼの量などは、当業者であれば適宜選択することができる。またコラゲナーゼの種類は、検出・定量したいコラーゲンの種類に合わせて適宜選択することが可能である。
【００２６】
本発明のペプチドを含むサンプルは、本発明のペプチドそのものであってもよいが、後述する蛍光体形成反応を妨げない限り、どのような物質が含まれていてもよい。例えば、本発明のペプチドを含むサンプルとしては、ペプチド水溶液、ペプチド緩衝液だけでなく、ペプチドを含む種々の生体サンプル：例えば、血液、血清、リンパ液、細胞抽出液、細胞培養液、組織抽出液、組織培養液など：が挙げられる。したがって、例えば血中のコラーゲンを定量する場合、血液自体をコラゲナーゼ処理し、これをそのままコラーゲン由来のペプチドを含むサンプルとして用いてもよい。またこれらのサンプルは、後述する蛍光体形成反応を妨げないように、さらに処理されていてもよい。当該処理方法は、当業者であれば適宜選択し、実行することが可能である。
【００２７】
蛍光体は、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で、ペプチドと化合物（Ｉ）とを反応させて製造する。
【００２８】
本工程における「酸化剤」としては特に限定されるものではなく、例えば過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過ホウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ｍ−クロロ過安息香酸などの酸化剤が挙げられる。なかでも過ヨウ素酸ナトリウムであることがより好ましい。
酸化剤の添加量は、後述する蛍光体形成反応を進行させ、特定の波長で発光する蛍光体が形成される限り特に限定されるものではない。しかしながら、反応系中に酸化剤と反応するような物質が存在する場合や、後述する蛍光体形成を妨げるような物質が存在する場合は、酸化剤が消費されて実質的に工程（１）で用いられる酸化剤の量が減少するので、酸化剤の量を増やす必要がある。例えば検出に用いられるサンプルが血液や血清であった場合、本工程において血液や血清中の物質によって酸化剤が消費される場合がある。このような場合は、通常よりも酸化剤の量を増やすことで本工程を進行させることができる。
このような酸化剤の量は、当業者であれば適宜決定することが可能である。
【００２９】
本発明の化合物（Ｉ）として好ましくは、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸または４−ハロゲン化カテコールである。
特に後述する蛍光体形成反応において、化合物（Ｉ）としてＲがカルボキシルである化合物（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）またはＲがハロゲン原子である化合物（４−ハロゲン化カテコール）を用いた場合は、Ｎ末端がプロリンであるペプチドを高選択的に蛍光体化することができる。
一方、化合物（Ｉ）としてＲがカルボキシル−Ｃ１−６アルキルである化合物（例えば、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）を用いた場合は、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドに対して蛍光を与えるが、後述する実施例１および２で示されるように、特にグリシンを含むペプチドに対して蛍光を与える（図１参照）。
【００３０】
本工程（１）においては、上記した酸化剤の存在下において、ペプチドのＮ末端のアミノ基が化合物（Ｉ）と反応し、さらに、これがホウ酸溶液中のホウ素と反応して蛍光体を形成すると考えられる。化合物（Ｉ）として３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ＤＨＰＡＡ）を用いた場合に、推定されるペプチド蛍光体合成に関する反応式を以下に示す。
【００３１】
【化５】
【００３２】
ペプチドと反応する化合物（Ｉ）の量や、ホウ酸溶液中のホウ酸（ホウ素）量は、本工程が進行する限り特に限定されず、当業者であれば適宜適切な量を調整することが可能である。
【００３３】
ホウ酸溶液の組成としては、特に限定されず、本工程における反応を阻害しないのであればどのような溶媒であってもよいし、ホウ酸（ホウ素）以外にどのような化合物が含まれていても構わない。本工程におけるホウ酸溶液として好ましくは、ホウ酸水溶液またはホウ酸緩衝液である。ホウ酸溶液がホウ酸緩衝液である場合のｐＨは特に限定されないが、中性（ｐＨ６〜８）付近が好ましく、ｐＨ７〜８がより好ましい。
【００３４】
本工程における反応温度は、本発明がマイルドな条件で行われるという特徴を鑑み、通常２０℃〜５０℃であるが、１００℃程度の高温でも本工程の反応は進行する。しかしながら、本工程における反応温度として好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３８℃、最も好ましくは３７℃である。反応温度が２０℃（好ましくは３０℃、より好ましくは３５℃）より低ければ、たとえ本発明の化合物（Ｉ）であっても蛍光体が形成しにくくなり、反応温度が５０℃（好ましくは４０℃、より好ましくは３８℃）より高くても、ペプチドが分解される、副反応が増加するなどして蛍光体が形成されにくくなる。
【００３５】
本発明は、非特許文献１により従来公知のペプチド定量方法とは異なり、よりマイルドな条件でペプチドを蛍光体化できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。また本発明は、従来公知の方法と比較して、１００℃近くの過酷な反応条件によるペプチド分解の恐れを低減できることや、加熱操作を省くことによる操作の簡便化などの利点を有する。
【００３６】
なお、本工程における反応温度は前述のとおりであるが、必ずしもこの範囲内でなければ本発明が実施できないというわけではない。本発明は、従来のペプチド蛍光体化方法に比べてマイルドな条件でペプチドを蛍光体化できる化合物（Ｉ）を発見したことに基づくものであって、反応温度が若干本発明の範囲外となったとしても、化合物（Ｉ）、酸化物、ホウ酸溶液などの本発明の構成要素や、後述する反応時間等を適宜調整することによって、本発明を実施することが可能である。
【００３７】
反応時間は、通常３〜１５分間であり、好ましくは５〜１３分間、より好ましくは１０分間である。
【００３８】
本工程により、励起波長約３７０〜４５０ｎｍ、蛍光波長約４６５〜５４０ｎｍの蛍光体が製造される。得られた蛍光体は単離することなく、次の工程（２）に付すことが可能である。
【００３９】
ところで、本発明の検出方法は、特にコラーゲンの検出・定量に応用され得る。工程（２）の前に、本発明の検出方法を利用したコラーゲンの検出方法、定量方法にかかる、蛍光体の製造工程について説明する。
【００４０】
コラーゲンの検出の対象である「コラーゲン」としては特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンなどが挙げられる。検出するコラーゲンがどのようなコラーゲンであるかは、用いるコラゲナーゼの種類に依存する。
コラーゲンは、グリシン−アミノ酸（Ｘ）−アミノ酸（Ｙ）という、グリシンが３残基ごとに繰り返される一次構造を有しており、各種コラゲナーゼによってグリシンをＮ末端に含むペプチド断片に分解することができる。コラゲナーゼとしては、検出したいコラーゲンの種類に合わせて選択すればよく、したがって、例えばＩ型コラーゲンを検出する場合は、コラーゲンを含む試料をＩ型コラゲナーゼ（Ｉ型コラーゲンを消化するコラゲナーゼ）で消化すればよい。得られたペプチド断片はＩ型コラーゲン由来であるので、このペプチド断片を検出することでＩ型コラーゲンを特異的に検出することになる。コラゲナーゼの反応条件、量などは、当業者であれば適宜選択可能である。
【００４１】
このグリシンを含むペプチド断片は、前述したように、ＲがカルボキシＣ１−６アルキルである化合物（Ｉ）によって特異的に蛍光体化できる。特に後述する図１に示されるように、本発明の化合物（Ｉ）はＧＰ、ＧＰＰ（Ｇ：グリシン、Ｐ：プロリン）という配列に非常に反応性が高いことが分かる。コラーゲンの一次構造において、アミノ酸（Ｘ）はプロリンであることが多く、またアミノ酸（Ｙ）はヒドロキシプロリンであることが多いので、結果的に、本発明の化合物（Ｉ）は特にコラーゲン由来のペプチド断片を選択的に蛍光体化することになる。
よって上記工程を経て得られた蛍光体を、後述する工程（２）において蛍光スペクトロメーター等に付し、蛍光強度を測定するのみで、試料中に存在するコラーゲンを検出することができる。
【００４２】
本発明のコラーゲン検出方法において、化合物（Ｉ）としては特に限定されないが、ＲがカルボキシＣ１−６アルキルである化合物が望ましく、Ｒがカルボキシメチルである３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸がより好ましい。
【００４３】
コラーゲンを含む試料としては特に限定されないが、生体試料、例えば血液、血清、尿などが挙げられる。また食品、飲料、化粧品、実験用試薬なども挙げられる。本発明のコラーゲン検出方法における、コラーゲンを含むこれらの試料には、コラゲナーゼによるコラーゲンのペプチド断片化を阻害しない限り、コラーゲン以外の成分が含まれていてもよい。
【００４４】
従来のコラーゲンの検出には、ＥＬＩＳＡ法や比色法、o−フタルアルデヒドを用いた蛍光法が用いられてきた。本発明のコラーゲン検出方法は、試料に含まれるコラーゲンをコラゲナーゼによって切断して生成される多くのペプチド断片を、グリシンを含むペプチドに特異的な蛍光反応によって検出するものである。この方法の感度はペプチド断片数が多くなるほどシグナルが増加することに伴い増大するので、本発明のコラーゲン検出方法によれば、微量のコラーゲンであっても高い感度で検出することができる。
【００４５】
ところで本発明のコラーゲン検出方法においては、後述する図４に示されるように、コラーゲン量と蛍光強度との間に線形性が認められる。したがって、検出方法ごとにその都度検量線を作成することで、コラーゲン量を定量することも可能である。よって本発明のコラーゲン検出方法は、コラーゲン定量方法でもあり得る。
【００４６】
更に、この蛍光反応は２０〜５０℃というマイルドな条件でも進行することから、試料にコラゲナーゼ及び蛍光試薬を同時に加え、コラゲナーゼによるペプチド断片化と蛍光試薬による蛍光体化を同時に行うことが可能である。これにより、従来のコラーゲン検出方法で必要とされていた免疫反応や洗浄操作などが省略されるため、検出時間を大幅に短縮しつつ、簡便な操作で試料中のコラーゲンを検出・定量できる。
現在のところ、このような蛍光法に基づくコラーゲン測定キットは市販されておらず、本発明は簡便かつ高感度なコラーゲンの蛍光検出・定量法と成り得るものである。
【００４７】
また、血中コラーゲン（特に、血中ＩＶ型コラーゲン）は肝臓の線維化に相関する肝線維化マーカーであり、また尿中コラーゲン（特に、尿中ＩＶ型コラーゲン）は、糖尿や腎炎による腎臓の糸球体崩壊に相関するマーカーであることが知られている。
よって本発明のコラーゲン検出・定量方法によれば、これらの疾患を発見・診断することも可能となる。
【００４８】
工程（２）：蛍光体を検出する工程
本工程は、工程（１）で得られた蛍光体を検出することで、サンプル中に存在するペプチドを検出する工程である。
【００４９】
蛍光体の検出方法は特に限定されるものではないが、簡便性や多数のペプチドを分析する必要性、夾雑物の存在などを鑑みて、蛍光スペクトロメーターやマイクロプレートリーダーにより検出することが望ましい。また、ＨＰＬＣやマイクロチップ電気泳動による分離も可能である。ＨＰＬＣやマイクロチップ電気泳動を利用することで、多数のペプチドを分離して分析することが可能である。ＨＰＬＣ条件としては、励起波長を３２０〜５００ｎｍ近傍、好ましくは３７０〜４５０ｎｍ近傍に、蛍光を４００〜５９０ｎｍ近傍、好ましくは４６５〜５４０ｎｍ近傍にそれぞれ設定する。なお、当業者であれば、化合物（Ｉ）に含まれる化合物に応じて、その都度適宜最適な条件を設定することが可能である。これ以外のＨＰＬＣ条件は特に限定されず、当業者であれば適宜条件を設定することが可能である。
【００５０】
蛍光体の検出に際しては、蛍光体を含む試料中に他の成分が含まれていても構わない。したがって本発明の検出方法では、工程（１）において化合物（Ｉ）、酸化剤、ホウ酸溶液やプロテアーゼを試料に添加して蛍光体を製造し、次いで蛍光体を含む混合液を工程（２）に付してそのまま蛍光を測定するという極めて単純な操作で、ペプチドやコラーゲンを検出することができるのである。
また夾雑物が蛍光測定の妨げになる場合は、自体公知の方法によって、蛍光体以外の成分を除く操作を行うか、あるいは上記ＨＰＬＣのような蛍光体を分離する操作を行えばよい。このような方法は、当業者に公知である。
【００５１】
また本発明は、化合物（Ｉ）、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、ペプチド検出試薬を提供する。本発明のペプチド検出試薬に含まれる、化合物（Ｉ）、酸化剤およびホウ酸溶液は、前記したとおりである。
【００５２】
本発明のペプチド検出試薬は、対象とするサンプルに加えることで、サンプルに含まれるペプチドを蛍光体化することができる。この際、サンプルに加える各成分の量については、当業者であれば適宜決定することができる。
【００５３】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。なお以下の実施例は本願発明の一例を挙げるに過ぎず、本発明をこの範囲に限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：蛍光体への変換およびスペクトロメーターによる蛍光体の検出
４０μＭの各ペプチド溶液２５０μＬに、０．５ｍＭの化合物（Ｉ） ３７５μＬ、１００ｍＭ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ ８．０）３１２μＬ、５ｍＭ ＮａＩＯ４ ６３μＬを加え（終濃度としてペプチド１０μＭ、Ｎａ３ＢＯ３ ３１ｍＭ、ＮａＩＯ４ ３１５μＭ）、３７℃で１０分間反応を進行させた。その後反応液を１０分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）によって蛍光強度を測定した。結果を図１〜図３に示す。
蛍光光度分析：
機種：日本分光 ＦＰ−６３００ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
スリット幅：１０ｎｍ、１０ｎｍ
感度：ｍｅｄｉｕｍ
レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ
【００５５】
実施例２：ＨＰＬＣによる蛍光体の検出
実施例１で得られた反応液をＨＰＬＣによって分析した。
ＨＰＬＣ条件：移動層；１５−８０％メタノール＋５％ ０．２５Ｍ ｐＨ７．０ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（０−４０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、励起波長３７０〜４５０ｎｍ，蛍光波長４６５〜５４０ｎｍ，カラムＯＤＳ−８０Ｔｓ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ，ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ５ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）。
【００５６】
化合物（Ｉ）として３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ＤＨＰＡＡ）を用いた場合（図１）、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド、特にグリシンを含むペプチドを蛍光体化することができる一方で、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（図２）や４−ハロゲン化カテコール（図３）は、Ｎ末端がプロリンであるペプチドを高選択的に蛍光体化することが分かった。
【００５７】
実施例３：コラーゲンの検出
コラーゲンを含む各タンパク質（２０ｎＭ）またはＨｅＬａ細胞抽出物（全タンパク質量１５．２μｇ／ｔｕｂｅ；４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、微生物由来コラゲナーゼ（２．０μｇ／ｔｕｂｅ，ナカライテスク社製）と３７℃で１時間反応させた。その後、３１５μＭ ＮａＩＯ４と３１．２ｍＭホウ酸緩衝液の存在下、１８７μＭ ３，４−ＤＨＰＡＡと３７℃で１０分間反応させ、蛍光体を製造した。その後、反応液を１０分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター（実施例１参照）によって、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍで、得られた蛍光体を含む溶液の蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。
本発明のコラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを特異的に検出できることが明らかとなった。
【００５８】
実施例４：コラーゲンの定量
ヒトまたはウシコラーゲン−Ｉ（シグマ社製）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ ７．５）中、微生物由来コラゲナーゼ（２．０μｇ／ｔｕｂｅ，ナカライテスク社製）と３７℃で１時間反応させた。その後、３１５μＭ ＮａＩＯ４と３１．２ｍＭホウ酸緩衝液の存在下、１８７μＭ ３，４−ＤＨＰＡＡと３７℃で１０分間反応させ、蛍光体を製造した。その後、反応液を１０分間氷冷し、蛍光スペクトロメーター（実施例1参照）によって、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍで、得られた蛍光体を含む溶液の蛍光強度を測定した。得られた結果を、ヒトまたはウシコラーゲン−Ｉ量との関係でプロットし、検量線を作成した。結果を図５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のペプチド検出方法は、穏和な温度条件でペプチドを選択的に蛍光誘導体化することを特徴とする。したがって、ペプチド以外の生体成分と反応して蛍光性を与えてしまうことが無く、またマイルドな条件にも関わらずペプチドを高い割合で蛍光体化することができる。
特に本発明のペプチド検出方法は、アミノ酸の種類や隣接するペプチド結合を認識して、特定のペプチド（例えば、Ｎ末端がプロリンであるペプチドや、グリシンを含むペプチド）を高選択的に蛍光体化することができる。特にグリシンを含むペプチドの検出は、コラゲナーゼの使用と組み合わせて、コラーゲン検出方法として応用することができる点で有用である。
また当該コラーゲン検出方法によれば、コラーゲンを定量的に測定することも可能であるし、コラーゲンをバイオマーカーとする疾患の診断を行うことも可能である。
さらに本発明のペプチド検出方法は、従来のペプチド蛍光体形成反応に比べてよりマイルドな温度条件で、短時間にペプチドを高選択的に蛍光検出できるので、各種プロテアーゼの酵素活性の測定方法など、生化学や病態検査学の分野にも応用することが可能である。
【００６０】
本出願は、特願２０１１−０４５４９１（出願日：平成２３年３月２日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドと式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。
【請求項２】
反応が、ｐＨ７〜８で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料中のコラーゲンを検出する方法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料中のコラーゲンを定量する方法である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）
【化２】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、ペプチド検出試薬。
【請求項１１】
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項１０または１１に記載の試薬。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１４】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１５】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１６】
コラーゲンの検出試薬である、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
ペプチドと式（Ｉ）
【化３】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法。
【請求項１８】
反応が、ｐＨ７〜８で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
ペプチドと式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物を、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させて蛍光体を製造することを特徴とする、ペプチドの検出方法。
【請求項２】
反応が、ｐＨ７〜８で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料中のコラーゲンを検出する方法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料中のコラーゲンを定量する方法である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）
【化２】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物、酸化剤およびホウ酸溶液を含んでなる、ペプチド検出試薬。
【請求項１１】
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項１０または１１に記載の試薬。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、ペプチドが、Ｎ末端がプロリンであるペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１４】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、グリシンを含むペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１５】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、ペプチドが、試料のコラゲナーゼ処理により得られるペプチドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１６】
コラーゲンの検出試薬である、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
ペプチドと式（Ｉ）
【化３】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子、カルボキシＣ１−６アルキルまたはカルボキシルを示す）で表される化合物とを、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下、２０〜５０℃で反応させることを特徴とする、ペプチドの蛍光標識方法。
【請求項１８】
反応が、ｐＨ７〜８で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）で表される化合物が、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸および４−ハロゲン化カテコールから選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１９４１７０（Ｐ２０１２−１９４１７０Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８７９６９（Ｐ２０１１−１８７９６９）
【出願日】平成２３年８月３０日（２０１１．８．３０）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月３０日（２０１１．８．３０）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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