ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法
【課題】ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法の提供。
【手段】微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物に、ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入していないことを特徴とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【手段】微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物に、ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入していないことを特徴とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物を用いたポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−ガンマ−グルタミン酸は、グルタミン酸のγ-位のカルボキシル基とα-位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。また、ポリ−ガンマ−グルタミン酸はγ-ポリグルタミン酸と呼称される場合もある。ポリ−ガンマ−グルタミン酸は、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から近年新たな高分子素材として注目されている。以下の説明においてポリ−ガンマ−グルタミン酸をPGAと略称する。
【０００３】
PGAを生産する微生物としては、納豆菌を含む一部のBacillus属細菌とその近縁種（Bacillus subtilis var.chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる（非特許文献１）。上記微生物の中でPGA生産性を有する納豆菌は分類学上はPGA非生産性である枯草菌の亜種とされるが、納豆菌を含む多くのBacillus属細菌においてPGA合成酵素をコードするpgsB、pgsC及びpgsA遺伝子は同一の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域の下流に存在し、クラスター構造（オペロン）を有していることが明らかにされている（例えば、非特許文献３、６及び８参照）。さらに、納豆菌のPGA産生制御機構は、枯草菌の形質転換能獲得機構とともに細胞内の多くの制御因子が関与する複雑な制御を受けていると推察されている（例えば、非特許文献９及び１０参照）。上記のような野生型でPGAを生産する微生物種の育種により、PGAの生産性を高めることは可能であるが、これら安定な生産性を得るための最適化には、野生株の複雑な栄養要求性を解消したり、PGA合成系が受ける厳密な制御を解除するなど、多大な労力を要することから効率的なPGA生産法ではないと判断される。さらに、クラスター構造を有しているPGA合成系は細胞内で同一の制御系により発現調節を受けることが予測されるため、変異育種などの方法では個々の遺伝子機能の発現量を厳密に調節することは難しいと考えられる。このため、野生株の育種に代わる効率的な手法として遺伝子組換え技術を用いた高生産化法が検討されていると考えられる。これまでに知られている遺伝子組換え技術を用いたPGA生産の例としては、プラスミドにて遺伝子導入された組換え枯草菌（Bacillus subtilis ISW1214株）において約9g/L/5日（非特許文献２参照）、プラスミドにて遺伝子導入された組換え大腸菌において約4g/L/1.5日（非特許文献７参照）、あるいは2.5mg/40mg-乾燥菌体（特許文献１及び非特許文献６参照）の生産性が得られることが開示されている。しかしながら、これら開示されている生産法では充分な生産性に達していないものと判断される。またさらに、上記のような遺伝子組換え技術を用いた生産法において、PGA合成に関与するタンパク質群（PgsBCA）のなかから選ばれる１つを、単独あるいは組み合わせて発現させることで生産性を向上させたとの報告はなされていない。
【０００４】
PGAは、枯草菌においてPgsBCAと称される膜結合型酵素系によってリボソーム非依存的に生産されることが示されている（非特許文献４）。これらPGA合成酵素系PgsBCAのなかで、PgsB（YwsCと別称）はグルタミン酸におけるγ−位のカルボシキル基を用いたアミドリガーゼ反応に関与していることが知られている（非特許文献３及び５）。一方で、非特許文献３によれば、PgsC（YwtAと別称）は膜結合型タンパク質でPGAの細胞外への排出に関与すると推察されているが、非特許文献４及び５によればPgsCはPgsBと共存してグルタミン酸の結合反応に関わるとされ、PgsCの機能は現在のところ明確にはなっていない。また、非特許文献４及び５においてPgsA（YwtBと別称）はPGAの排出に関わると推察されているが現在までのところその機能は明らかにされていない。
【０００５】
さらに、非特許文献２において、染色体上のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を欠損した枯草菌に、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子から選ばれる１つの遺伝子を単独もしくは複数を組み合わせて発現するベクターを導入し、PGAの生産性を検討した結果が開示されている。非特許文献２によれば、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を全て発現しなければPGAが生産できないと結論されている。また、非特許文献３には、PGA生産能を有する納豆菌（IFO16449株）において、pgsB遺伝子（ywsC遺伝子と別称）欠損株、pgsC遺伝子（ywtA遺伝子と別称）欠損株及びpgsA遺伝子（ywtB遺伝子と別称）欠損株を構築し、それぞれの欠損株におけるPGA生産能を検証している。このなかで非特許文献３によれば、PGA生産能を有する納豆菌において、PGA生産にはpgsB遺伝子及びpgsC遺伝子が必須であり、さらに最大のPGA生産性を得るためにはpgsA遺伝子が必要であると推論されている。
【０００６】
またさらに、特許文献１においては、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子をこの順で導入したベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、本来、PGA生産能を有していない大腸菌においてPGA生産能が付与できることが開示されているが、非特許文献６によれば、組換え大腸菌においてpgsBCA遺伝子を導入した条件ではPGAの生産が認められるが、pgsBC遺伝子を導入した条件ではPGAが生産されないことが明示されている。以上のことから、PGA生産においてPgsBCAは必須であり、PgsAを必要としないとは一般的には考えられていない。
【０００７】
特許文献２〜５においては、納豆菌等のPGA産生微生物を用いてPGAを生産させる方法が開示されている。これらによれば、納豆菌等を種々の栄養塩培地で培養することにより、分子量数千〜200万のPGAが生産できるとされている。また、特許文献６においては納豆菌に外的ストレスを与えることによって分子量300万以上のPGAが生産できることが開示されている。特許文献８においてはナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）の変異株が分子量130万以上のポリ−ガンマ−Ｌ−グルタミン酸を約5g/L/6日で生産できることが開示されている。
【０００８】
一方、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、近年のゲノム解読の結果からは、細胞増殖／分裂、代謝、核酸合成、情報伝達に関わる遺伝子群、さらに多くの機能未知の遺伝子群が存在することが明らかにされている。一方で、工業的な有用物質生産に微生物を用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され、安定に生存できる環境が与えられるため、ゲノム上にコードにされる上記のような遺伝子のなかには有用物質の生産にとっては不要な或いは有害な働きをする遺伝子も存在するものと考えられる。
【０００９】
そこで、不要な或いは有害な働きをすると考えられる遺伝子を欠失又は不活性化することによって、有用物質（例えば異種タンパク質）の生産性を向上させるといった試みが行われているが（特許文献７及び８参照）、それらはリボソーム依存的に生産されるタンパク質の生産性に係わる報告例が多く、リボソーム非依存的に生産されるPGAやその他のポリ-アミノ酸に関して、宿主として用いる微生物菌株に遺伝子組換え技術を用いて変異導入を行ない、具体的には、特定の遺伝子を欠失又は不活性化することによりPGAを効率的に生産させるといった試みについての報告例はあまりない。
【００１０】
以上のことから、目的に応じた種々の分子量のPGAを効率良く生産するために必要な技術は開示されておらず、また、これまでにPGAの生産法として、宿主として用いる微生物菌株に積極的に変異導入を行ない、具体的には特定の遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物を用いて、目的に応じて種々の分子量を調整したPGAを効率的に生産させるといった試みはなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ashiuchi，M.，et al.:Appl．Microbiol．Biotechnol.，59，pp.9-14(2002)
【非特許文献２】Ashiuchi，M.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，70，pp.1794-1797(2006)
【非特許文献３】Urushibata，Y.，et al.:J．Bacteriol.，184，pp.337-343(2002)
【非特許文献４】芦内誠ほか:未来材料，3，pp.44-50(2003)
【非特許文献５】Ashiuchi，M.，et al.:Eur．J．Biochem.，268，pp.5321-5328(2001)
【非特許文献６】Ashiuchi，M.，et al.:Biochem．Biophys．Res．Commun.，263,pp.6-12(1999)
【非特許文献７】Jiang，H.，et al.:Biotechnol．Lett.，28，pp.1241-1246(2006)
【非特許文献８】Presecan，E.，et al.:Microbiology，143，pp.3313-3328(1997)
【非特許文献９】Itaya，M.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，63，pp.2034-2037(1999)
【非特許文献１０】今中忠行ほか:微生物利用の大展開，第１章4節，pp.657-663(2002)
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−１７１８２号公報
【特許文献２】特公昭４３−２４４７２号公報
【特許文献３】特開平１−１７４３９７号公報
【特許文献４】特開平３−４７０８７号公報
【特許文献５】特許第３０８１９０１号明細書
【特許文献６】特開２００６−４２６１７号公報
【特許文献７】特開２００５−３４８６４１号公報
【特許文献８】特開２００７−１３００１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、組換え微生物を用いたPGAの分子量調整方法、当該分子量調整方法を用いたPGAの製造方法及び組換え微生物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前述のような実情に鑑み、PGAの分子量の調整方法等について鋭意検討した結果、PGA合成に関与するpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を全てを宿主微生物に導入することでPGAの生産が可能であると云う従来の知見に反し、pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を特定の遺伝子を欠失又は不活性化して得られる宿主微生物に導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入せずに得られる組換え微生物を用いることで、分子量の異なったPGAが得られること、すなわちPGAの分子量を調整することができるという知見を見出し、本発明を完成するに至った。
ここで、「PGAの分子量調整」とは、本発明の遺伝子導入によって、導入前の微生物が生産するPGAの分子量に比較して、導入後の微生物が生産するPGAを高分子化又は低分子化して、その分子量を調整することである。また、ここで分子量と重量平均分子量は同義である。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。尚当該発明において、相当する遺伝子とは、対象となる遺伝子がコードする特定の機能を有するタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子などを意味する。
【００１６】
１） 微生物を用いてPGAを生産する方法において、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物に、PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入しないことを特徴とする、PGAの分子量調整方法。
【００１７】
２） 枯草菌におけるackA遺伝子、acoR遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、phrE遺伝子、proB遺伝子、rocF遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて、PGAを高分子化することを特徴とする上記（１）のPGAの分子量調整方法。
【００１８】
３） 枯草菌におけるacoA遺伝子、ahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、gapB遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて、PGAを低分子化することを特徴とする上記（１）のPGAの分子量調整方法。
【００１９】
４） 上記組換え微生物を用いることを特徴とするPGAの分子量調整方法。
５） 上記PGAの分子量調整方法を用いて、生成されたPGAを取得することを特徴とするPGAの製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るPGAの分子量調整方法を用いれば、目的に応じて種々の分子量のPGAを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】PGAの合成に関与する遺伝子群のクローニング工程の一例を説明するための、PGA組換え生産用ベクターの構築フローである。
【図２】製造例６における、SOE-PCR断片を用いた２回交差法による標的遺伝子欠失手順を説明するためのフローである。
【図３】製造例２及び３におけるPGAの合成に関与する遺伝子群のクローニング工程を説明するための、PGA組換え生産用ベクターの構築フローである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法[Lipman,DJ.,Pearson.WR.：Science, 227, 1435-1441 (1985)]によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００２３】
本発明において、遺伝子の上流／下流とは、翻訳開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００２４】
本明細書において、転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するShine-Dalgarno（SD）配列[Shine,J.,Dalgarno,L.：Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 71, 1342-1346, (1974)]に相当する部位である。
【００２５】
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、国際コンソーシアムの成果として報告され［Kunst,F., et al.：Nature, 390, 249-256 （1997）］、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2006年1月18日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００２６】
本発明に係る組換え微生物は、後述する特定の遺伝子を欠失又は不活性化して得られる宿主微生物に、PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を除く、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入して得られるものであって、PGA産生能を有するものである。
【００２７】
ここで、PGA合成に関与する遺伝子群とは、枯草菌においては、pgsB遺伝子（BG12531:ywsC遺伝子、またはcapB遺伝子と別称される）、pgsC遺伝子（BG12532:ywtA遺伝子、またはcapC遺伝子と別称される）及びpgsA遺伝子（BG12533:ywtB遺伝子、またはcapA遺伝子と別称される）から構成されている。遺伝子組換えの宿主微生物として広く利用されているBacillus subtilis Marburg No.168系統株は、これらpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を染色体上に有しているが、PGA生産能を有していない。同じく、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）は、これらpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を染色体（ゲノム）上に有しているが、PGA生産能を有している。
【００２８】
pgsB遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、pgsB遺伝子によってコードされるPgsBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
尚、本発明においてpgsB遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、また配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、グルタミン酸を基質とするアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２９】
また、本発明において、pgsB遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３０】
また、本発明においてpgsB遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列に対して60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、上記アミドリガーゼ活性は、グルタミン酸及びATP又はGTPを基質とし、これに塩化マンガン加えたものを反応溶液として用いた場合に、反応溶液中にPGAの生成を確認することにより測定することができる［Urushibata，Y.，et al.:J．Bacteriol.，184，pp.337-343(2002)］。
【００３１】
さらに、本発明においてpgsB遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)］記載の条件が挙げられる。例えば、6×SSC（1×SSCの組成：0.15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、5×デンハート及び100mg／mL ニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。尚、後述する「ストリンジェントな条件下」についてはこれと同義である。
【００３２】
また、前述したアミドリガーゼ活性とは、pgsC遺伝子とともに宿主微生物に導入された際に菌体外にPGAを生産する能力を意味する。所定の微生物におけるPGA生産能の評価は、例えばグルタミン酸又はその塩を含有するPGA生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法、SDS-PAGEによってPGAを検出する方法［Yamaguchi，F.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem．60，pp.255-258(1996)］、或いは酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法［Ogawa，Y.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，61，pp.1684-1687(1997)］、培養液から精製し乾燥重量を求める定量法［、Ashiuchi，M.，et al.:Biochem．Biophys．Res．Commun.，263:pp.6-12(1999)］、ゲルろ過カラムを用いたHPLC（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法［Kubota，H.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，57，pp.1212-1213(1993)］によって行うことができる。
【００３３】
pgsC遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、pgsC遺伝子によってコードされるPgsCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
尚、本発明においてpgsC遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
また、本発明においてpgsC遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３４】
また、本発明においてpgsC遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列に対して55％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３５】
さらに、本発明においてpgsC遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは上記と同じ定義を用いる。
【００３６】
また、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成するといったPgsCタンパク質の機能とは、宿主微生物にてpgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた際にPGAを生産する能力を意味する。このことは、pgsB遺伝子を単独で発現させた宿主微生物ではPGAが生産されず、pgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた場合に、PGAが生産されるといった本発明者らが見出した知見に基づいている。
【００３７】
因みに、pgsA遺伝子の塩基配列を配列番号５に示し、pgsA遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
前述のとおり、pgsA遺伝子にコードされるタンパク質の機能は明確にされていないが、PGAの菌体外排出に関与するタンパク質であることが示唆されており、PGA生産には必須であると考えられている。一方で、後述するが、本発明に係る組換え微生物は、pgsA遺伝子を導入していないにも拘わらず、PGAの生産性に優れるといった特徴を有している。
【００３８】
本発明においてpgsA遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、また配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００３９】
また、本発明においてpgsA遺伝子は、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００４０】
また、本発明においてpgsA遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列に対して45％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは65％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列を含み、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで「塩基配列の同一性」は前述と同じ定義である。
さらに、本発明においてpgsA遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、PgsB及びPgsCと共存してPGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは前述と同じ定義を用いる。
【００４１】
また、宿主微生物に導入する遺伝子は、前述したような枯草菌由来のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子に限定されず、例えば枯草菌以外の微生物に由来するPGA合成関連遺伝子を構成する遺伝子群のうち、pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子に相当する遺伝子であっても良い。
【００４２】
尚、pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子、又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子は、PGAを生産することが知られている微生物から常法に従って単離／同定することができる。PGA生産能を有する微生物としては、Bacillus subtilisの他に、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus haloduransや、Oceanobacillus iheyensis、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができ、これら微生物からpgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子を単離／同定することができる。
上記遺伝子を単離／同定する方法としては、例えば、上記の微生物からゲノムDNAを抽出し、前述した配列番号１、３又は５などに示した塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってpgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子について単離することができる。さらに、近年の急速なゲノム解読の進展によりPGA非生産微生物であってもそのゲノム配列情報を基に、Oceanobacillus iheyensis等から前述のように定義した枯草菌pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子を単離／同定することができる。
【００４３】
前述の枯草菌のpgsB遺伝子と同等の機能を有する遺伝子のアミノ酸配列と50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の100％未満の同一性を有する、又は、pgsB遺伝子の塩基配列と塩基配列において60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の100％未満の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌及びOceanobacillus属細菌、より好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、pgsB遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
より具体的には、枯草菌168株のpgsB遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との同一性は塩基配列において、それぞれ79％、82％及び62％であり、またそのアミノ酸配列において、それぞれ90％、93％及び55％であり、これらは相当する遺伝子と考えられる。
【００４４】
前述の枯草菌のpgsC遺伝子と同等の機能を有する遺伝子のアミノ酸配列と50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、又は、pgsC遺伝子の塩基配列と塩基配列において55％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌及びOceanobacillus属細菌、より好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、pgsC遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
より具体的には、枯草菌168株のpgsC遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との同一性は塩基配列において、それぞれ78％、84％及び59％であり、またそのアミノ酸配列において、それぞれ90％、94％及び51％であり、これらは相当する遺伝子と考えられる。
【００４５】
前述の枯草菌のpgsA遺伝子と同等の機能を有する遺伝子のアミノ酸配列と30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、又は、pgsA遺伝子の塩基配列と塩基配列において45％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは65％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、98％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌及びOceanobacillus属細菌、より好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、pgsA遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
より具体的には、枯草菌168株のpgsA遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との同一性は塩基配列において、それぞれ69％、75％及び49％であり、またそのアミノ酸配列において、それぞれ67％、79％及び30％であり、これらは相当する遺伝子と考えられる。
【００４６】
これら各遺伝子に相当する遺伝子の好適なものとして、表１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子や塩基配列からなる遺伝子などが挙げられる。
具体的には、pgsB遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、グルタミン酸を基質とするアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号１２、１８、２４又は３０など）が挙げられる。
また、pgsC遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１５，２１、２７又は３３に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号１４，２０、２６又は３２など）が挙げられる。
また、pgsA遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１７、２３、２９又は３５に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号１６、２２、２８又は３４など）が挙げられる。
【００４７】
本発明に係る組換え微生物は、前述のpgsB遺伝子又はpgsB相同遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC相同遺伝子を後述する特定の各遺伝子及びこれら各遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物に導入することで作製される。
尚、上記pgsBC遺伝子を導入した親微生物のゲノム上の後述の特定の遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化しても良いし、ゲノム上の当該特定の遺伝子などから選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した親微生物に上記pgsBC遺伝子を導入して組換え微生物を作製してもよく、遺伝子の導入や失活・不活化の時期は特に限定されない。
【００４８】
本発明に係る組換え微生物は、前述したpgsB遺伝子又はpgsB遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC遺伝子に相当する遺伝子を、後述する特定の各遺伝子及びこれら各遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物に導入することで作製される。
尚、上記pgsBC遺伝子を導入した親微生物のゲノム上の後述の特定の遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化しても良く、或いはゲノム上の後述の特定の遺伝子などから選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した親微生物に上記pgsBC遺伝子を導入して組換え微生物を作製しても良く、対象遺伝子の導入や当該遺伝子の失活・不活化の時期は特に限定されない。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ここで、本発明の宿主微生物を構築するための親微生物は、具体的には、野生型でPGA生産能を有するBacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis 等のバチルス（Bacillus）属細菌や、遺伝子組み換えによりPGA生産能を付与したクロストリジウム(Clostridium)属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、大腸菌（Escherichia coli）或いは酵母等が挙げられる。なかでも、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、宿主微生物として安全かつ且つ優良と認められた微生物菌株として開発されている点から、Bacillus属細菌のなかでも特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。さらに、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、宿主微生物として安全且つ優良と認められた微生物菌株として開発されている点から、特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００５１】
また、選択される宿主微生物は、本来的にPGA生産能を有している微生物であっても良いし、本来的にPGA生産能を有していない微生物であっても良い。すなわち、pgsBCA遺伝子を染色体（ゲノム）上に有し、且つPGA生産能を有する微生物、pgsBCA遺伝子を染色体上に有しているが、PGA生産能を有していない微生物、pgsBCA遺伝子を有していない微生物の何れでも良い。PGA生産能を有している微生物に前述したpgsB遺伝子又はpgsB遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC遺伝子に相当する遺伝子を導入した場合には、PGA生産能を強化及び／又はPGAを高分子量化することになる。一方で、PGA生産能を有しない微生物に前述したpgsB遺伝子又はpgsB遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC遺伝子に相当する遺伝子を導入した場合には、PGA生産能を付与することとなる。
【００５２】
尚、宿主微生物としては、染色体（ゲノム）上に有している枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、後述するような微生物において機能を有する転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域を導入すること等によってPGA生産能を有する微生物を用いることもできる。
【００５３】
本発明において、失活又は不活性化の対象となる枯草菌のackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子は、それぞれAckA、AcoA、AcoR、AhrC、ArgC、ArgD、ArgF、ArgJ,AsnO、CarA、CodY、ComP、ComQ、ComX、DhaS、GapB、GlcK、GlcP、GlpP、GltB、LicR 、OppABCDF、PhrA、PhrE、PhrI、PhrK、ProB、RocA、RocF、SigE、SigF、SigG、SigH、SigK、SkfA、YgaC 、YqfN、YrzL、YuzB、YwpGをコードする遺伝子である。
【００５４】
上記遺伝子のうち、ackA遺伝子、acoA遺伝子、acoB遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argE遺伝子、argF遺伝子、argG遺伝子、argJ遺伝子、asnH遺伝子、asnO遺伝子、carA遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltA遺伝子、gltB遺伝子、proA遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、ansZ遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、codY遺伝子、gltR遺伝子、licR遺伝子は糖、有機酸、アミノ酸の代謝に関わる遺伝子群であり、上記遺伝子のうち、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、codY遺伝子、gltR遺伝子、licR遺伝子はそれら代謝に関わる遺伝子の発現制御に関与する遺伝子群である。また、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrG遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子は細胞間の情報伝達に関わる遺伝子群である。さらに、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子は胞子形成に関与する遺伝子群である。またさらに、ygaC遺伝子、yhaJ遺伝子、yqfN遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子、yjbM遺伝子、yrzL遺伝子は前述のデータベース上では機能未知遺伝子であったが、これら機能未知遺伝子のなかで、yjbM遺伝子はGTPピロホスホキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしていること［Nanamiya,H., et al. ：Mol.Microbiol., 67, 291-304(2008)］、yrzL遺伝子はtRNAメチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていること［Roovers,M., et al.：Nucleic Acids Res., 36, 3252-3262(2008)］が近年報告されている。尚、上記遺伝子がコードするタンパク質は下記表２に記載されている各種機能を有するものである。
【００５５】
【表２−１】
【００５６】
【表２−２】
【００５７】
また、表２に示される枯草菌の各遺伝子と実質的に同じ機能を有する、好ましくは、これら各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、これら遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失又は不活性化すべき遺伝子に含まれる。
【００５８】
これら欠失又は不活性化される遺伝子は、上記各遺伝子単独の欠失又は不活化でも良いし、２種以上組み合わせても良い。
PGAを高分子化できる点から、親微生物の枯草菌におけるackA遺伝子、acoR遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、phrE遺伝子、proB遺伝子、rocF遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させることが好ましく、野生株を宿主微生物として用いた場合よりもPGAを150％以上に高分子化する際には、親微生物のackA遺伝子、argC遺伝子、acoR遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させて得られる宿主微生物を用いるのが好ましい。
またPGAを低分子化できる点から、親微生物のacoA遺伝子、ahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、gapB遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させることが好ましく、野生株を宿主微生物として用いた場合よりもPGAを70％以下に低分子化する際には、親微生物のsigH遺伝子、codY遺伝子、glpP遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させて得られる宿主微生物を用いるのが好ましい。
尚、遺伝子の欠失や不活性化には、当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。
【００５９】
また、更なる生産性向上に対してより大きな効果を図るべく、上記特定の遺伝子以外の遺伝子の欠失又は不活性化を併せて行っても良い。
例えば、変異株のなかでも、PGA分解酵素をコードする遺伝子（PGA分解酵素遺伝子）を欠失又は不活性化させた変異株を宿主として使用することで、より良好な効果が期待できる。枯草菌におけるPGA分解酵素遺伝子としては、ggt遺伝子などが知られている［Kimura，K.，et al.:Microbiology，150，pp.4115-4123(2004)］。ggt遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示し、ggt遺伝子によりコードされるPGA分解酵素のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。 また、枯草菌以外の微生物を宿主として使用する場合にも、ggt遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活化させた変異株を使用することが好ましい。
本発明においてggt遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、また配列番号１１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、数個とは、例えば好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜3個である。
また、本発明においてggt遺伝子とは、配列番号１０に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
さらに、本発明においてggt遺伝子とは、配列番号１１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは前述と同じ定義を用いる。
また、枯草菌のggt遺伝子と同じ機能を有する、好ましくは当該遺伝子の塩基配列と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、ggt遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
【００６０】
本発明の遺伝子の欠失又は不活性化は、各遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、或いは、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行なうことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させることがより望ましい。
【００６１】
上記遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、当該遺伝子（標的とする遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００６２】
標的とする遺伝子或いはその相同遺伝子等を欠失又は不活性化させる方法としては、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、特定の各遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である［Leenhouts，K.，et al.:Mol．Gen．Genet.，253，pp.217-224(1996)］。
【００６３】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり［Itaya，M.，Tanaka，T.:Mol．Gen．Genet.，223，pp.268-272(1990)］、このような方法を繰り返すことによって、目的の宿主微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法としては、変異誘発剤の使用や親微生物への紫外線、ガンマ線等の照射によっても実施可能である。この場合、標的とする構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、または標的遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。さらに、より効率的な手法として、標的とする遺伝子の上流、下流領域を含むが標的とする遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE（splicing by overlap extension）-PCR法［Horton，RM.，et al.:Gene，77，pp.61-68(1989)］によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノム上の標的とする遺伝子の外側の２箇所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的とする遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である（図２参照）。
【００６４】
また、本発明に係る組換え微生物は、導入したpgsB遺伝子又はpgsBに相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsCに相当する遺伝子が、その上流に、宿主細胞内において機能を有しており正的に発現制御を受ける転写開始制御領域、翻訳開始制御領域が結合されたものであることが好ましい。当該制御領域は、結合した下流遺伝子を発現させ、当該遺伝子の発現を宿主細胞内において高めることができるものであることがより好ましく、下流遺伝子を構成的に発現又は／及び高発現させるものが特に好ましい。このような制御領域として、バチルス（Bacillus）属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、rapA遺伝子の制御領域、Bacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域などが例示されるが特に限定されない。
【００６５】
前述したBacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点上流0.4〜1.0kb領域由来の制御領域の塩基配列を配列番号７に示す。また当該制御領域としては、配列番号７に示す塩基配列に限定されず、例えば配列番号７に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列の意味である。
【００６６】
また、枯草菌に由来するrapA遺伝子（BG10652）の当該制御領域の塩基配列を配列番号８に示す。また、当該制御領域としては、配列番号８に示す塩基配列に限定されず、例えば配列番号８に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列の意味である。
【００６７】
さらに、枯草菌に由来するspoVG遺伝子（BG10112）の当該制御領域の塩基配列を配列番号９に示す。当該制御領域としては、配列番号９に示す塩基配列に限定されず、例えば配列番号９に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列の意味である。
【００６８】
前述したpgsB遺伝子又はpgsBに相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsCに相当する遺伝子を宿主微生物に導入する際は、通常のプラスミド（ベクター）を使用することができる。また、プラスミドは、遺伝子導入対象の宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。枯草菌を宿主とする場合、例えば、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等を例示することができる。選択されるプラスミドは、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミドであることが好ましく、そのプラスミドが多コピーであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム（染色体）に対し、2以上100コピー以下であれば良く、好ましくは2以上50コピー以下、より好ましくは2以上30コピー以下であれば良い。また、発現ベクターを用いた形質転換には、通常の手法、例えばプロトプラスト法［Chamg，S.，Cohen，SH.:Mol．Gen．Genet.，168，pp.111-115(1979)］やコンピテントセル法［Young，FE.，Spizizen，J.:J. Bacteriol.，86，pp.392-400(1963)］を適用することができる。
【００６９】
後述の実施例に示すように、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_S237/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のackA遺伝子、argC遺伝子、phrE遺伝子、argD遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、proB遺伝子、skfA遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を有する枯草菌pgsBC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入することにより、分子量を105〜240％に高分子化したPGAが得られる。一方、枯草菌株のahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、asnO遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株を用いた場合、分子量を60〜95％に低分子化したPGAが得られる。
【００７０】
また、前述の枯草菌spoVG遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_spoVG/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のackA遺伝子、acoR遺伝子、asnO遺伝子、phrA遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入することにより、分子量を110〜330％に高分子化したPGAが得られる。一方、枯草菌株のacoA遺伝子、ahrC遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glpP遺伝子、glcK遺伝子、rocA遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、skfA遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入した場合、分子量を40〜95％に低分子化したPGAが得られる。
【００７１】
また、前述の枯草菌rapA遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_rapA/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のackA遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、glcK遺伝子、rocA遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入することにより、分子量を110〜240％に高分子化したPGAが得られる。一方、枯草菌株のcarA遺伝子、codY遺伝子、gapB遺伝子、glpP遺伝子、phrA遺伝子、sigH遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入した場合、分子量を70〜95％に低分子化したPGAが得られる。
【００７２】
また、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_S237/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のsigH遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を有するBacillus amyloliquefaciens NBRC3022株由来pgsBC遺伝子、Bacillus licheniformis ATCC9945a株由来pgsBC遺伝子、Bacillus licheniformis AHU1371株由来pgsBC遺伝子又はOceanobacillus iheyensis HTE831株由来pgsBC遺伝子を導入することにより、分子量を15〜60％に低分子化したPGAが得られることから、上記のような枯草菌pgsBC遺伝子に相当する遺伝子を用いても同様の効果が得られる。
【００７３】
すなわち、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、yqga遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌変異株を宿主微生物として用い、当該宿主微生物に、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入せず、且つ、枯草菌におけるpgsBC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入すれば、PGAの分子量を調整でき、目的に応じて種々の分子量のPGAを効率良く生産できる。
【００７４】
以上で説明した本発明に係る組換え微生物を用いることによって、目的に応じて種々の分子量のPGAを効率よく製造することができる。製造されたPGAは、化粧品、医薬品、食品、水質浄化剤、保水材料、増粘剤等の様々な用途に使用することができる。特に本発明に係る組換え微生物においては、従来の遺伝子組換え技術によるPGA生産法と比較して優れた生産性が得られることから上記用途で利用されるPGAの生産コストを大幅に低減することができる。
【００７５】
尚、本発明に係る組換え微生物を用いてPGAを製造する際には、先ず、適切な培地において当該組換え微生物を培養し、菌体外に生産されたPGAを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。また、培地としては合成培地でも良いし、天然培地でも良い。
【００７６】
PGAの生産性を向上させる点から、培養対象の組換え微生物が生育に必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地を使用することが好ましい。具体的には培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは0.005〜600g/L、より好ましくは0.05〜500g/L、より好ましくは0.1〜400g/L、より好ましくは0.5〜300g/Lとする。培地中のグルタミン酸は組換え微生物の生育に消費されるのでPGAの生産性を向上させる点から、グルタミン酸濃度0.005g/L以上が好ましく、また、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度600g/L以下が好ましい。
【００７７】
培養条件として、至適温度は、好ましくは10〜40℃であり、より好ましくは30〜40℃である。至適pHは、好ましくはpH4〜8であり、より好ましくは5〜8である。また、培養日数は、種菌接種後、好ましくは1〜10日間であり、より好ましくは2〜5日間である。培養は、特に限定されないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。
【００７８】
培地中に蓄積されたPGAを回収する際には、PGAを生産させた微生物菌体を除去する必要があるが、これには遠心分離による方法、限外濾過膜を用いる方法、電気透析法、pHをPGAの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法等が挙げられ、さらに上記手法を組み合わせて用いることも可能である。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。表３及び４には、本実施例で使用したプライマーの名称、その塩基配列及び配列番号をまとめて示した。尚、表３に示す塩基配列において、下線部分は付加した制限酵素認識配列を示している。
【００８０】
〔製造例１〕ベクターの構築（１）
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した（図１参照）。
先ず、Bacillus sp．KSM-366株（FERM BP-6262）から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したP-S237/BSpgsB atg FW（配列番号３６）及びHindIII_BSpgsBCA RV（配列番号３７）のプライマーセットを用いてpgsBCA遺伝子2.9kbのDNA断片（BCA）、同様にP-S237/BSpgsB atg FW（配列番号３６）及びHindIII_BSpgsBC RV（配列番号３８）のプライマーセットを用いてpgsBC遺伝子1.7kbのDNA断片（BC）をそれぞれ調製した。尚、Bacillus sp．KSM-366株のpgsB遺伝子の塩基配列を配列番号１２に、上記pgsB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に、pgsC遺伝子の塩基配列を配列番号１４に、上記pgsC遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に、pgsA遺伝子の塩基配列を配列番号１６に、上記pgsA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。さらに、Bacillus sp．KSM-S237株（FERM BP-7875）から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したCm_S237 FW（配列番号３９）とP_S237-RV（配列番号４０）のプライマーセットを用いて、KSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報参照）プロモーター領域0.6kbのDNA断片（P_S237）を調製した。
【００８１】
次に、断片（P_S237）及び（BCA）を鋳型とし、Cm_S237 FWとHindIII_BSpgsBCA RVとのプライマーセットを用いたSOE−PCR法にて（P_S237）及び（BCA）を１断片化した3.5kbのDNA断片（P_BCA）、同様に断片（P_S237）及び（BC）を鋳型とし、Cm_S237 FWとHindIII_BSpgsBC RVとのプライマーセットを用いたSOE−PCR法にて（P_S237）及び（BC）を１断片化した2.3kbのDNA断片（P_BC）を得た。続いて、このDNA断片（P_BCA）及び（P_BC）を制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、それぞれを同様の制限酵素処理を施したプラスミドベクターpHY300PLK（Takara）とDNA Ligation kit Ver.2（Takara）を用いてライゲーション反応（結合化）を行なった。
【００８２】
上記ライゲーション試料を用いて、大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、テトラサイクリン-塩酸塩（SIGMA-ALDRICH）を15ppm添加したLB寒天培地（LBTc寒天培地）上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュア プラスミドアイソレーションキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス）を用い組換えプラスミドを調製した。これらを制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上のBamHI及びHindIII制限酵素認識部位に目的とする上記DNA断片（P_BC）が挿入していることを確認した。
【００８３】
本製造例において、DNA断片（P_BC）の挿入が確認できた組換えプラスミドをそれぞれPGA組換え生産用ベクターpHY-P_S237/pgsBCとした。尚、PCR反応はGeneAmp9700（PE Applied Biosystems）とTaKaRa LA Taq（Takara）を用い、キット添付のプロトコールに従い実施した。
【００８４】
〔製造例２〕ベクターの構築（２）
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した（図３参照）。
先ず、Bacillus subtilis Marburg No.168株（枯草菌168株）から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したP_spoVG FW2（配列番号４１）とP_spoVG/Cm R（配列番号４２）のプライマーセットを用いて、spoVG遺伝子ORFより約0.6kb上流にプラスミドpC194［例えば、Horinouchi，S.，Weisblum，B.:J．Bacteriol.,150，pp.815-825(1982)参照]由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Cmr）を挿入するための上流側0.9kbのDNA断片（spoVG-UP）を調製した。同様に、表３に示したP_spoVG/Cm F（配列番号４３）とP_spoVG RV（配列番号４４）のプライマーセットを用いて、下流側0.6kbのDNA断片（spoVG-DW）を調製した（尚、この際にP_spoVG RVのプライマーはspoVG遺伝子ORFの開始コドンgtgをatgに変更するようにデザインした）。また、プラスミドpC194を鋳型とし、表３に示したcomp_Cm FW（配列番号４５）とcomp_Cm RV（配列番号４６）のプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子0.9kbのDNA断片（comp_Cm）を調製した。
【００８５】
次に、得られた断片（spoVG-UP）、（spoVG-DW）及び（comp_Cm）を鋳型とし、P_spoVGFW2とP_spoVG RVとのプライマーセットを用いて、SOE−PCR法にて上記3断片を1断片化した2.4kbのDNA断片（Cm-P_spoVG）を得た。さらに、このようにして得られたDNA断片を用いてコンピテントセル法（前述）により枯草菌168株の形質転換を行ない、クロラムフェニコール（SIGMA-ALDRICH）を10ppm添加したLB寒天培地（LBCm寒天培地）上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００８６】
次に、得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示したcomp_Cm FWとP_spoVG RVのプライマーセットを用いたPCRによってクロラムフェニコール耐性遺伝子とspoVG遺伝子プロモーター領域からなる1.5kbのDNA断片（P-spoVG-Cm2）を調製した。さらに、comp_P-spoVG R/BSpgsB atg FW（配列番号４７）とpgsC FW（配列番号４８）のプライマーセットを用いて、枯草菌168株から調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRによってpgsB遺伝子1.2kbのDNA断片（pgsB1）を、pgsB/Cm F（配列番号４９）とpgsB RV（配列番号５０）のプライマーセットを用いてpgsB遺伝子ORFの上流側1.1kbのDNA断片（pgsB-UP）を調製した。さらに、得られた上記（pgsB1）、（P-spoVG-Cm2）及び（pgsB-UP）の3断片を鋳型として、pgsC FWとpgsB RVのプライマーセットを用いて、SOE-PCRにより3.6kbのDNA断片を調製した。
【００８７】
続いて、このようにして得られたDNA断片を用いてコンピテントセル法にて枯草菌168株の形質転換を行い、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、HindIII_BSpgsBC RVとBamHI_PspoVG FW（配列番号５１）のプライマーセットを用いて、枯草菌pgsBC遺伝子の上流に枯草菌spoVG遺伝子プロモーターを有する2.3kbのDNA断片（P_spoVG/pgsBC）を調製した。さらに、得られたDNA断片を製造例１と同様の手順にてプラスミドベクターにクローニングし、取得したPGA組換え生産用ベクターをpHY-P_spoVG/pgsBCとした。
【００８８】
〔製造例３〕ベクターの構築（３）
本製造例には、製造例２と同様にPGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した（図３参照）。
枯草菌168株から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したrapA FW（配列番号５２）とP_rapA/Cm R（配列番号５３）のプライマーセットを用いて、rapA遺伝子ORFより約0.5kb上流にプラスミドpC194由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入するための上流側0.5kbのDNA断片（rapA-UP）を調製した。同様に、表３に示したP_rapA/Cm F（配列番号５４）とP_rapA RV（配列番号５５）のプライマーセットを用いて、下流側0.5kbのDNA断片（rapA-DW）を調製した（尚、この際にP_rapA RVのプライマーはrapA遺伝子ORFの開始コドンttgをatgに変更するようにデザインした）。
【００８９】
次に、得られた断片（rapA-UP）、（rapA-DW）及び製造例２にて調製したDNA断片（comp_Cm）を鋳型とし、rapA FWとP_rapA RVとのプライマーセットを用いて、SOE−PCR法にて上記3断片を1断片化した1.9kbのDNA断片（Cm-P_rapA）を得た。さらに、このようにして得られたDNA断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００９０】
次に、得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示したcomp_CmFWとP_rapA RVのプライマーセットを用いたPCRにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子とrapA遺伝子プロモーター領域からなる1.4kbのDNA断片（P-rapA-Cm2）を調製した。また、comp_P-rapA R/BSpgsB atg FW（配列番号５６）とpgsC FWのプライマーセットを用いて、枯草菌168株から調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRによってpgsB遺伝子1.2kbのDNA断片（pgsB2）を調製した。さらに、得られた上記（pgsB2）、（P-rapA-Cm2）及び製造例２にて調製したDNA断片（pgsB-UP）の3断片を鋳型として、pgsC FWとpgsB RVのプライマーセットを用いて、SOE-PCRにより3.5kbのDNA断片を調製した。
【００９１】
続いて、製造例２と同様の手順により得られたDNA断片を用いて、コンピテントセル法にて枯草菌168株の形質転換を行なった。得られた形質転換体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型としてHindIII_BSpgsBC RVとBamHI_PrapA FW（配列番号５７）のプライマーセットを用いて、枯草菌pgsBC遺伝子の上流に枯草菌rapA遺伝子プロモーターを有する2.2kbのDNA断片（P_rapA/pgsBC）を調製した。さらに、得られたDNA断片を製造例１と同様の手順にてプラスミドベクターにクローニングし、得られた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクターpHY-P_rapA/pgsBCとした。
【００９２】
〔製造例４〕ベクターの構築（４）
本製造例には、PGA合成に関与する枯草菌pgsBC遺伝子に相当する遺伝子群のクローニング方法を示した。
Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP−7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子DNA断片（約3.1kb）がプラスミドベクターpHY300PLK（Takara） のBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237［特開2007-130013号公報］を制限酵素XbaIにて処理し、この線状化したプラスミドDNAを鋳型とし、表３に示したP_S237-RV（配列番号４０）とINFU_pHY-HindIII FW（配列番号５８）のプライマーセットを用いKSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子プロモーター領域とプラスミドベクターpHY300PLKからなる5.5kb のDNA断片（pHY-P_S237）を調製した。続いて、Bacillus amyloliquefaciens NBRC3022株）から調製した染色体DNAを鋳型として、表３に示したINFU_P-S237 RV/BAL pgsB atg FW（配列番号５９）とINFU_pHY-HindIII/BAL pgsC RV（配列番号６２）のプライマーセットを用い、Bacillus amyloliquefaciens由来pgsBC遺伝子1.7kbのDNA断片（BALpgsBC-3022）を調製した。さらに、上記DNA断片を組み合わせ（pHY-P_S237及びBALpgsBC-3022）を基質としてIn-Fusion PCR Cloning Kit（Takara）にて結合反応を行なった。得られた結合試料を用いて大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、LBTc寒天培地上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュア プラスミドアイソレーションキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス）にて組換えプラスミドを調製した。得られたプラスミドを制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上に目的とする上記DNA断片（BALpgsBC-3022）が挿入していることを確認し、本製造例において得られた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター（pHY-P_S237/BALpgsBC-3022）とした。尚、本製造例で用いるプライマー配列のデザイン及び実験条件等はキット添付のプロトコールに従い実施した。
【００９３】
〔製造例５〕ベクターの構築（５）
本製造例には、製造例５と同様にPGA合成に関与する枯草菌pgsBC遺伝子に相当する遺伝子群のクローニング方法を示した。
Bacillus licheniformis ATCC9945a株及びAHU1371株から調製した染色体DNAをそれぞれ鋳型として、表３に示したINFU_P-S237 RV/BLi pgsB atg FW（配列番号６０）とINFU_pHY-HindIII/BAL pgsC RV（配列番号６３）のプライマーセットを用い、Bacillus licheniformis由来pgsBC遺伝子の1.7kbのDNA断片（BLipgsBC-9945、BLipgsBC-1371）、また、Oceanobacillus iheyensis HTE831株から調製した染色体DNAを鋳型として、表３に示したINFU_P-S237 RV/OBi pgsB atg FW（配列番号６１）とINFU_pHY-HindIII/OBi pgsC RV（配列番号６４）のプライマーセットを用い、Oceanobacillus iheyensis由来pgsBC遺伝子の1.7kbのDNA断片（OBipgsBC-831）をそれぞれ調製した。続いて、前述の製造例４により得られたDNA断片（pHY-P_S237）と上記DNA断片を各々組み合わせ（pHY-P_S237及びBLipgsBC-9945、pHY-P_S237及びBLipgsBC-1371、pHY-P_S237及びOBipgsBC-831）、In-Fusion PCR Cloning Kit（Takara）を用いて結合反応を行なった。得られた結合試料を用いて大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、前述の製造例４と同様の手順にて組換えプラスミドを調製した。得られたプラスミドに目的とするDNA断片（BLipgsBC-9945、BLipgsBC-1371、OBipgsBC-831）が挿入していることを確認し、本製造例において得られた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター（pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371、pHY-P_S237/OBipgsBC-831）とした。
【００９４】
【表３−１】
【００９５】
【表３−２】
【００９６】
〔製造例６〕枯草菌改変体の作製（１）
本製造例では、製造例１〜３で得られたベクターを導入するための枯草菌変異株の作製方法を示した（図２参照）。
枯草菌168株から調製したゲノムDNAを鋳型とし、表４に示したackA-FW（配列番号７１）とackA/Cm-R（配列番号７２）とのプライマーセットを用いてゲノム上のackA遺伝子の下流に隣接する1.0kbのDNA断片（ackA-UP）、ackA/Cm-F（配列番号７３）とackA-RV（配列番号７４）とのプライマーセットを用いてゲノム上のackA遺伝子の上流に隣接する1.0kbのDNA断片（ackA-DW）をそれぞれ調製した。また、プラスミドpC194由来を鋳型として、表４に示したCmFW（配列番号６９）とCmRV（配列番号７０）のプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子含む0.9kbのDNA断片（Cmr）を調製した。
【００９７】
次に、得られたDNA断片（ackA-UP）、（ackA-DW）及び（Cmr）を混合して鋳型とし、ackA-FWとacoA-RVとのプライマーセットを用いたSOE−PCRにて3断片を（ackA-UP）-（Cmr）-（ackA-DW）の順になる様に結合し、2.9kbの遺伝子欠失用DNA断片を得た。次に、この遺伝子欠失用DNA断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってackA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子（断片Cmr）と置換した目的とする枯草菌変異株（以下、ΔackA株とする）であることを確認した。以下、その他の遺伝子欠失株の調製も同様に、表４に示した遺伝子名-FWと遺伝子名/Cm-Rとのプライマーセット、及び遺伝子名/Cm-Fと遺伝子名-RVとのプライマーセットを用いて調製を行ない、得られた枯草菌変異株には、記号「Δ」を欠失遺伝子名に付し、変異株名とした。
【００９８】
【表４−１】
【００９９】
【表４−２】
【０１００】
【表４−３】
【０１０１】
【表４−４】
【０１０２】
【表４−５】
【０１０３】
【表４−６】
【０１０４】
【表４−７】
【０１０５】
〔製造例７〕プラスミド導入による形質転換
本製造例では、宿主となる枯草菌株及びその変異株の形質転換法を示した。野生株である枯草菌（Bacillus subtilis Marburg No.168株）、製造例６で作製した枯草菌変異株に対し、製造例１〜５で得られたPGA組換え生産用ベクター（pHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_spoVG/pgsBC、pHY-P_rapA/pgsBC pHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371及びpHY-P_S237/OBipgsBC-831）を用い、形質転換を行なった。上記野生株及び変異体からリゾチーム処理により調製したプロトプラスト105〜106個に上記プラスミドDNA 20〜100ngを供し、プラスミド導入を行なった。テトラサイクリン-塩酸塩30ppmを添加したDM3プロトプラスト再生培地（DM3培地）上に生育したコロニーを、プラスミドを導入した目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
【０１０６】
〔実施例１〕生産性評価（１）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_S237/pgsBCを導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、その相対値を表５に示した。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５に示したように、pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株及び枯草菌変異株において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_S237/pgsBCを導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量は大きく変化し、PGAの分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１０９】
〔実施例２〕生産性評価（２）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_spoVG/pgsBCを導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、評価結果を表６に示した。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
表６に示したように、pHY-P_spoVG/pgsBCを導入した枯草菌168株及び枯草菌変異株において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_spoVG/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_spoVG/pgsBCを導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量は大きく変化し、PGAの分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１１２】
〔実施例３〕生産性評価（３）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_rapA/pgsBCを導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、評価結果を表７に示した。
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
表７に示したように、pHY-P_rapA/pgsBCを導入した枯草菌168株及び枯草菌変異株において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_rapA/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_rapA/pgsBCを導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量は大きく変化し、PGAの分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１１５】
〔実施例４〕生産性評価（４）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371又はpHY-P_S237/OBipgsBC-831を導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、評価結果を表７に示した。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
表８に示したように、pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株及びpHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371又はpHY-P_S237/OBipgsBC-831を導入した枯草菌変異株（ΔsigH株）において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371又はpHY-P_S237/OBipgsBC-831を導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量はいずれも大きく変化（低分子化）し、PGA分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１１８】
〔測定例〕PGAの定量及び分子量測定法
実施例１〜４に示した評価培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間遠心分離（商品名himacCF15RX、日立工機）に供し、遠心分離にて得られた培養液上清中の組換えPGA生産量の測定を行なった。上清試料中のPGA検出はYamaguchiらの方法（前述）に準じ、試料をアガロースゲル電気泳動に供した後、メチレンブルーによるゲルの染色を行ない、PGAに由来する染色物質の有無による組換えPGA生産を確認した。さらに、組換えPGAが検出された試料については、TSKGel G4000PWXL及びTSKGel G6000PWXLゲルろ過カラム（商品名、東ソー）を用いたHPLC分析を実施した。尚、分析条件は溶離液に0.1M硫酸ナトリウムを使用し、流速1.0mL/分、カラム温度50℃、UV検出波長を210nmとした。また、濃度検定には分子量80万のPGA（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。さらに、分子量検定にはプルラン（Shodex STANDRD P-82、商品名、昭和電工）を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸［和光純薬工業（162-21411、162-21401）、SIGMA-ALDRICH（P-4886、P-4761）、明治フードマテリアル（分子量88万）］を用いた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物を用いたポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−ガンマ−グルタミン酸は、グルタミン酸のγ-位のカルボキシル基とα-位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。また、ポリ−ガンマ−グルタミン酸はγ-ポリグルタミン酸と呼称される場合もある。ポリ−ガンマ−グルタミン酸は、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から近年新たな高分子素材として注目されている。以下の説明においてポリ−ガンマ−グルタミン酸をPGAと略称する。
【０００３】
PGAを生産する微生物としては、納豆菌を含む一部のBacillus属細菌とその近縁種（Bacillus subtilis var.chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる（非特許文献１）。上記微生物の中でPGA生産性を有する納豆菌は分類学上はPGA非生産性である枯草菌の亜種とされるが、納豆菌を含む多くのBacillus属細菌においてPGA合成酵素をコードするpgsB、pgsC及びpgsA遺伝子は同一の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域の下流に存在し、クラスター構造（オペロン）を有していることが明らかにされている（例えば、非特許文献３、６及び８参照）。さらに、納豆菌のPGA産生制御機構は、枯草菌の形質転換能獲得機構とともに細胞内の多くの制御因子が関与する複雑な制御を受けていると推察されている（例えば、非特許文献９及び１０参照）。上記のような野生型でPGAを生産する微生物種の育種により、PGAの生産性を高めることは可能であるが、これら安定な生産性を得るための最適化には、野生株の複雑な栄養要求性を解消したり、PGA合成系が受ける厳密な制御を解除するなど、多大な労力を要することから効率的なPGA生産法ではないと判断される。さらに、クラスター構造を有しているPGA合成系は細胞内で同一の制御系により発現調節を受けることが予測されるため、変異育種などの方法では個々の遺伝子機能の発現量を厳密に調節することは難しいと考えられる。このため、野生株の育種に代わる効率的な手法として遺伝子組換え技術を用いた高生産化法が検討されていると考えられる。これまでに知られている遺伝子組換え技術を用いたPGA生産の例としては、プラスミドにて遺伝子導入された組換え枯草菌（Bacillus subtilis ISW1214株）において約9g/L/5日（非特許文献２参照）、プラスミドにて遺伝子導入された組換え大腸菌において約4g/L/1.5日（非特許文献７参照）、あるいは2.5mg/40mg-乾燥菌体（特許文献１及び非特許文献６参照）の生産性が得られることが開示されている。しかしながら、これら開示されている生産法では充分な生産性に達していないものと判断される。またさらに、上記のような遺伝子組換え技術を用いた生産法において、PGA合成に関与するタンパク質群（PgsBCA）のなかから選ばれる１つを、単独あるいは組み合わせて発現させることで生産性を向上させたとの報告はなされていない。
【０００４】
PGAは、枯草菌においてPgsBCAと称される膜結合型酵素系によってリボソーム非依存的に生産されることが示されている（非特許文献４）。これらPGA合成酵素系PgsBCAのなかで、PgsB（YwsCと別称）はグルタミン酸におけるγ−位のカルボシキル基を用いたアミドリガーゼ反応に関与していることが知られている（非特許文献３及び５）。一方で、非特許文献３によれば、PgsC（YwtAと別称）は膜結合型タンパク質でPGAの細胞外への排出に関与すると推察されているが、非特許文献４及び５によればPgsCはPgsBと共存してグルタミン酸の結合反応に関わるとされ、PgsCの機能は現在のところ明確にはなっていない。また、非特許文献４及び５においてPgsA（YwtBと別称）はPGAの排出に関わると推察されているが現在までのところその機能は明らかにされていない。
【０００５】
さらに、非特許文献２において、染色体上のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を欠損した枯草菌に、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子から選ばれる１つの遺伝子を単独もしくは複数を組み合わせて発現するベクターを導入し、PGAの生産性を検討した結果が開示されている。非特許文献２によれば、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を全て発現しなければPGAが生産できないと結論されている。また、非特許文献３には、PGA生産能を有する納豆菌（IFO16449株）において、pgsB遺伝子（ywsC遺伝子と別称）欠損株、pgsC遺伝子（ywtA遺伝子と別称）欠損株及びpgsA遺伝子（ywtB遺伝子と別称）欠損株を構築し、それぞれの欠損株におけるPGA生産能を検証している。このなかで非特許文献３によれば、PGA生産能を有する納豆菌において、PGA生産にはpgsB遺伝子及びpgsC遺伝子が必須であり、さらに最大のPGA生産性を得るためにはpgsA遺伝子が必要であると推論されている。
【０００６】
またさらに、特許文献１においては、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子をこの順で導入したベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、本来、PGA生産能を有していない大腸菌においてPGA生産能が付与できることが開示されているが、非特許文献６によれば、組換え大腸菌においてpgsBCA遺伝子を導入した条件ではPGAの生産が認められるが、pgsBC遺伝子を導入した条件ではPGAが生産されないことが明示されている。以上のことから、PGA生産においてPgsBCAは必須であり、PgsAを必要としないとは一般的には考えられていない。
【０００７】
特許文献２〜５においては、納豆菌等のPGA産生微生物を用いてPGAを生産させる方法が開示されている。これらによれば、納豆菌等を種々の栄養塩培地で培養することにより、分子量数千〜200万のPGAが生産できるとされている。また、特許文献６においては納豆菌に外的ストレスを与えることによって分子量300万以上のPGAが生産できることが開示されている。特許文献８においてはナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）の変異株が分子量130万以上のポリ−ガンマ−Ｌ−グルタミン酸を約5g/L/6日で生産できることが開示されている。
【０００８】
一方、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、近年のゲノム解読の結果からは、細胞増殖／分裂、代謝、核酸合成、情報伝達に関わる遺伝子群、さらに多くの機能未知の遺伝子群が存在することが明らかにされている。一方で、工業的な有用物質生産に微生物を用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され、安定に生存できる環境が与えられるため、ゲノム上にコードにされる上記のような遺伝子のなかには有用物質の生産にとっては不要な或いは有害な働きをする遺伝子も存在するものと考えられる。
【０００９】
そこで、不要な或いは有害な働きをすると考えられる遺伝子を欠失又は不活性化することによって、有用物質（例えば異種タンパク質）の生産性を向上させるといった試みが行われているが（特許文献７及び８参照）、それらはリボソーム依存的に生産されるタンパク質の生産性に係わる報告例が多く、リボソーム非依存的に生産されるPGAやその他のポリ-アミノ酸に関して、宿主として用いる微生物菌株に遺伝子組換え技術を用いて変異導入を行ない、具体的には、特定の遺伝子を欠失又は不活性化することによりPGAを効率的に生産させるといった試みについての報告例はあまりない。
【００１０】
以上のことから、目的に応じた種々の分子量のPGAを効率良く生産するために必要な技術は開示されておらず、また、これまでにPGAの生産法として、宿主として用いる微生物菌株に積極的に変異導入を行ない、具体的には特定の遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物を用いて、目的に応じて種々の分子量を調整したPGAを効率的に生産させるといった試みはなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ashiuchi，M.，et al.:Appl．Microbiol．Biotechnol.，59，pp.9-14(2002)
【非特許文献２】Ashiuchi，M.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，70，pp.1794-1797(2006)
【非特許文献３】Urushibata，Y.，et al.:J．Bacteriol.，184，pp.337-343(2002)
【非特許文献４】芦内誠ほか:未来材料，3，pp.44-50(2003)
【非特許文献５】Ashiuchi，M.，et al.:Eur．J．Biochem.，268，pp.5321-5328(2001)
【非特許文献６】Ashiuchi，M.，et al.:Biochem．Biophys．Res．Commun.，263,pp.6-12(1999)
【非特許文献７】Jiang，H.，et al.:Biotechnol．Lett.，28，pp.1241-1246(2006)
【非特許文献８】Presecan，E.，et al.:Microbiology，143，pp.3313-3328(1997)
【非特許文献９】Itaya，M.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，63，pp.2034-2037(1999)
【非特許文献１０】今中忠行ほか:微生物利用の大展開，第１章4節，pp.657-663(2002)
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−１７１８２号公報
【特許文献２】特公昭４３−２４４７２号公報
【特許文献３】特開平１−１７４３９７号公報
【特許文献４】特開平３−４７０８７号公報
【特許文献５】特許第３０８１９０１号明細書
【特許文献６】特開２００６−４２６１７号公報
【特許文献７】特開２００５−３４８６４１号公報
【特許文献８】特開２００７−１３００１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、組換え微生物を用いたPGAの分子量調整方法、当該分子量調整方法を用いたPGAの製造方法及び組換え微生物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前述のような実情に鑑み、PGAの分子量の調整方法等について鋭意検討した結果、PGA合成に関与するpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を全てを宿主微生物に導入することでPGAの生産が可能であると云う従来の知見に反し、pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を特定の遺伝子を欠失又は不活性化して得られる宿主微生物に導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入せずに得られる組換え微生物を用いることで、分子量の異なったPGAが得られること、すなわちPGAの分子量を調整することができるという知見を見出し、本発明を完成するに至った。
ここで、「PGAの分子量調整」とは、本発明の遺伝子導入によって、導入前の微生物が生産するPGAの分子量に比較して、導入後の微生物が生産するPGAを高分子化又は低分子化して、その分子量を調整することである。また、ここで分子量と重量平均分子量は同義である。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。尚当該発明において、相当する遺伝子とは、対象となる遺伝子がコードする特定の機能を有するタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子などを意味する。
【００１６】
１） 微生物を用いてPGAを生産する方法において、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物に、PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入しないことを特徴とする、PGAの分子量調整方法。
【００１７】
２） 枯草菌におけるackA遺伝子、acoR遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、phrE遺伝子、proB遺伝子、rocF遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて、PGAを高分子化することを特徴とする上記（１）のPGAの分子量調整方法。
【００１８】
３） 枯草菌におけるacoA遺伝子、ahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、gapB遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて、PGAを低分子化することを特徴とする上記（１）のPGAの分子量調整方法。
【００１９】
４） 上記組換え微生物を用いることを特徴とするPGAの分子量調整方法。
５） 上記PGAの分子量調整方法を用いて、生成されたPGAを取得することを特徴とするPGAの製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るPGAの分子量調整方法を用いれば、目的に応じて種々の分子量のPGAを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】PGAの合成に関与する遺伝子群のクローニング工程の一例を説明するための、PGA組換え生産用ベクターの構築フローである。
【図２】製造例６における、SOE-PCR断片を用いた２回交差法による標的遺伝子欠失手順を説明するためのフローである。
【図３】製造例２及び３におけるPGAの合成に関与する遺伝子群のクローニング工程を説明するための、PGA組換え生産用ベクターの構築フローである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法[Lipman,DJ.,Pearson.WR.：Science, 227, 1435-1441 (1985)]によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００２３】
本発明において、遺伝子の上流／下流とは、翻訳開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００２４】
本明細書において、転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するShine-Dalgarno（SD）配列[Shine,J.,Dalgarno,L.：Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 71, 1342-1346, (1974)]に相当する部位である。
【００２５】
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、国際コンソーシアムの成果として報告され［Kunst,F., et al.：Nature, 390, 249-256 （1997）］、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2006年1月18日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００２６】
本発明に係る組換え微生物は、後述する特定の遺伝子を欠失又は不活性化して得られる宿主微生物に、PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を除く、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入して得られるものであって、PGA産生能を有するものである。
【００２７】
ここで、PGA合成に関与する遺伝子群とは、枯草菌においては、pgsB遺伝子（BG12531:ywsC遺伝子、またはcapB遺伝子と別称される）、pgsC遺伝子（BG12532:ywtA遺伝子、またはcapC遺伝子と別称される）及びpgsA遺伝子（BG12533:ywtB遺伝子、またはcapA遺伝子と別称される）から構成されている。遺伝子組換えの宿主微生物として広く利用されているBacillus subtilis Marburg No.168系統株は、これらpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を染色体上に有しているが、PGA生産能を有していない。同じく、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）は、これらpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を染色体（ゲノム）上に有しているが、PGA生産能を有している。
【００２８】
pgsB遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、pgsB遺伝子によってコードされるPgsBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
尚、本発明においてpgsB遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、また配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、グルタミン酸を基質とするアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２９】
また、本発明において、pgsB遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３０】
また、本発明においてpgsB遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列に対して60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、上記アミドリガーゼ活性は、グルタミン酸及びATP又はGTPを基質とし、これに塩化マンガン加えたものを反応溶液として用いた場合に、反応溶液中にPGAの生成を確認することにより測定することができる［Urushibata，Y.，et al.:J．Bacteriol.，184，pp.337-343(2002)］。
【００３１】
さらに、本発明においてpgsB遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)］記載の条件が挙げられる。例えば、6×SSC（1×SSCの組成：0.15M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、5×デンハート及び100mg／mL ニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。尚、後述する「ストリンジェントな条件下」についてはこれと同義である。
【００３２】
また、前述したアミドリガーゼ活性とは、pgsC遺伝子とともに宿主微生物に導入された際に菌体外にPGAを生産する能力を意味する。所定の微生物におけるPGA生産能の評価は、例えばグルタミン酸又はその塩を含有するPGA生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法、SDS-PAGEによってPGAを検出する方法［Yamaguchi，F.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem．60，pp.255-258(1996)］、或いは酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法［Ogawa，Y.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，61，pp.1684-1687(1997)］、培養液から精製し乾燥重量を求める定量法［、Ashiuchi，M.，et al.:Biochem．Biophys．Res．Commun.，263:pp.6-12(1999)］、ゲルろ過カラムを用いたHPLC（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法［Kubota，H.，et al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，57，pp.1212-1213(1993)］によって行うことができる。
【００３３】
pgsC遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、pgsC遺伝子によってコードされるPgsCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
尚、本発明においてpgsC遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
また、本発明においてpgsC遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３４】
また、本発明においてpgsC遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列に対して55％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３５】
さらに、本発明においてpgsC遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは上記と同じ定義を用いる。
【００３６】
また、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成するといったPgsCタンパク質の機能とは、宿主微生物にてpgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた際にPGAを生産する能力を意味する。このことは、pgsB遺伝子を単独で発現させた宿主微生物ではPGAが生産されず、pgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた場合に、PGAが生産されるといった本発明者らが見出した知見に基づいている。
【００３７】
因みに、pgsA遺伝子の塩基配列を配列番号５に示し、pgsA遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
前述のとおり、pgsA遺伝子にコードされるタンパク質の機能は明確にされていないが、PGAの菌体外排出に関与するタンパク質であることが示唆されており、PGA生産には必須であると考えられている。一方で、後述するが、本発明に係る組換え微生物は、pgsA遺伝子を導入していないにも拘わらず、PGAの生産性に優れるといった特徴を有している。
【００３８】
本発明においてpgsA遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、また配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００３９】
また、本発明においてpgsA遺伝子は、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００４０】
また、本発明においてpgsA遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列に対して45％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは65％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列を含み、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで「塩基配列の同一性」は前述と同じ定義である。
さらに、本発明においてpgsA遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、PgsB及びPgsCと共存してPGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは前述と同じ定義を用いる。
【００４１】
また、宿主微生物に導入する遺伝子は、前述したような枯草菌由来のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子に限定されず、例えば枯草菌以外の微生物に由来するPGA合成関連遺伝子を構成する遺伝子群のうち、pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子に相当する遺伝子であっても良い。
【００４２】
尚、pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子、又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子は、PGAを生産することが知られている微生物から常法に従って単離／同定することができる。PGA生産能を有する微生物としては、Bacillus subtilisの他に、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus haloduransや、Oceanobacillus iheyensis、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができ、これら微生物からpgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子を単離／同定することができる。
上記遺伝子を単離／同定する方法としては、例えば、上記の微生物からゲノムDNAを抽出し、前述した配列番号１、３又は５などに示した塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってpgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子について単離することができる。さらに、近年の急速なゲノム解読の進展によりPGA非生産微生物であってもそのゲノム配列情報を基に、Oceanobacillus iheyensis等から前述のように定義した枯草菌pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子を単離／同定することができる。
【００４３】
前述の枯草菌のpgsB遺伝子と同等の機能を有する遺伝子のアミノ酸配列と50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の100％未満の同一性を有する、又は、pgsB遺伝子の塩基配列と塩基配列において60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の100％未満の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌及びOceanobacillus属細菌、より好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、pgsB遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
より具体的には、枯草菌168株のpgsB遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との同一性は塩基配列において、それぞれ79％、82％及び62％であり、またそのアミノ酸配列において、それぞれ90％、93％及び55％であり、これらは相当する遺伝子と考えられる。
【００４４】
前述の枯草菌のpgsC遺伝子と同等の機能を有する遺伝子のアミノ酸配列と50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、又は、pgsC遺伝子の塩基配列と塩基配列において55％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌及びOceanobacillus属細菌、より好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、pgsC遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
より具体的には、枯草菌168株のpgsC遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との同一性は塩基配列において、それぞれ78％、84％及び59％であり、またそのアミノ酸配列において、それぞれ90％、94％及び51％であり、これらは相当する遺伝子と考えられる。
【００４５】
前述の枯草菌のpgsA遺伝子と同等の機能を有する遺伝子のアミノ酸配列と30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、又は、pgsA遺伝子の塩基配列と塩基配列において45％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは65％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、98％以上、より好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌及びOceanobacillus属細菌、より好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、pgsA遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
より具体的には、枯草菌168株のpgsA遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との同一性は塩基配列において、それぞれ69％、75％及び49％であり、またそのアミノ酸配列において、それぞれ67％、79％及び30％であり、これらは相当する遺伝子と考えられる。
【００４６】
これら各遺伝子に相当する遺伝子の好適なものとして、表１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子や塩基配列からなる遺伝子などが挙げられる。
具体的には、pgsB遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、グルタミン酸を基質とするアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号１２、１８、２４又は３０など）が挙げられる。
また、pgsC遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１５，２１、２７又は３３に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号１４，２０、２６又は３２など）が挙げられる。
また、pgsA遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１７、２３、２９又は３５に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号１６、２２、２８又は３４など）が挙げられる。
【００４７】
本発明に係る組換え微生物は、前述のpgsB遺伝子又はpgsB相同遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC相同遺伝子を後述する特定の各遺伝子及びこれら各遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物に導入することで作製される。
尚、上記pgsBC遺伝子を導入した親微生物のゲノム上の後述の特定の遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化しても良いし、ゲノム上の当該特定の遺伝子などから選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した親微生物に上記pgsBC遺伝子を導入して組換え微生物を作製してもよく、遺伝子の導入や失活・不活化の時期は特に限定されない。
【００４８】
本発明に係る組換え微生物は、前述したpgsB遺伝子又はpgsB遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC遺伝子に相当する遺伝子を、後述する特定の各遺伝子及びこれら各遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物に導入することで作製される。
尚、上記pgsBC遺伝子を導入した親微生物のゲノム上の後述の特定の遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化しても良く、或いはゲノム上の後述の特定の遺伝子などから選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活性化した親微生物に上記pgsBC遺伝子を導入して組換え微生物を作製しても良く、対象遺伝子の導入や当該遺伝子の失活・不活化の時期は特に限定されない。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ここで、本発明の宿主微生物を構築するための親微生物は、具体的には、野生型でPGA生産能を有するBacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis 等のバチルス（Bacillus）属細菌や、遺伝子組み換えによりPGA生産能を付与したクロストリジウム(Clostridium)属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、大腸菌（Escherichia coli）或いは酵母等が挙げられる。なかでも、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、宿主微生物として安全かつ且つ優良と認められた微生物菌株として開発されている点から、Bacillus属細菌のなかでも特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。さらに、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、宿主微生物として安全且つ優良と認められた微生物菌株として開発されている点から、特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００５１】
また、選択される宿主微生物は、本来的にPGA生産能を有している微生物であっても良いし、本来的にPGA生産能を有していない微生物であっても良い。すなわち、pgsBCA遺伝子を染色体（ゲノム）上に有し、且つPGA生産能を有する微生物、pgsBCA遺伝子を染色体上に有しているが、PGA生産能を有していない微生物、pgsBCA遺伝子を有していない微生物の何れでも良い。PGA生産能を有している微生物に前述したpgsB遺伝子又はpgsB遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC遺伝子に相当する遺伝子を導入した場合には、PGA生産能を強化及び／又はPGAを高分子量化することになる。一方で、PGA生産能を有しない微生物に前述したpgsB遺伝子又はpgsB遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsC遺伝子に相当する遺伝子を導入した場合には、PGA生産能を付与することとなる。
【００５２】
尚、宿主微生物としては、染色体（ゲノム）上に有している枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、後述するような微生物において機能を有する転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域を導入すること等によってPGA生産能を有する微生物を用いることもできる。
【００５３】
本発明において、失活又は不活性化の対象となる枯草菌のackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子は、それぞれAckA、AcoA、AcoR、AhrC、ArgC、ArgD、ArgF、ArgJ,AsnO、CarA、CodY、ComP、ComQ、ComX、DhaS、GapB、GlcK、GlcP、GlpP、GltB、LicR 、OppABCDF、PhrA、PhrE、PhrI、PhrK、ProB、RocA、RocF、SigE、SigF、SigG、SigH、SigK、SkfA、YgaC 、YqfN、YrzL、YuzB、YwpGをコードする遺伝子である。
【００５４】
上記遺伝子のうち、ackA遺伝子、acoA遺伝子、acoB遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argE遺伝子、argF遺伝子、argG遺伝子、argJ遺伝子、asnH遺伝子、asnO遺伝子、carA遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltA遺伝子、gltB遺伝子、proA遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、ansZ遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、codY遺伝子、gltR遺伝子、licR遺伝子は糖、有機酸、アミノ酸の代謝に関わる遺伝子群であり、上記遺伝子のうち、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、codY遺伝子、gltR遺伝子、licR遺伝子はそれら代謝に関わる遺伝子の発現制御に関与する遺伝子群である。また、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrG遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子は細胞間の情報伝達に関わる遺伝子群である。さらに、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子は胞子形成に関与する遺伝子群である。またさらに、ygaC遺伝子、yhaJ遺伝子、yqfN遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子、yjbM遺伝子、yrzL遺伝子は前述のデータベース上では機能未知遺伝子であったが、これら機能未知遺伝子のなかで、yjbM遺伝子はGTPピロホスホキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしていること［Nanamiya,H., et al. ：Mol.Microbiol., 67, 291-304(2008)］、yrzL遺伝子はtRNAメチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていること［Roovers,M., et al.：Nucleic Acids Res., 36, 3252-3262(2008)］が近年報告されている。尚、上記遺伝子がコードするタンパク質は下記表２に記載されている各種機能を有するものである。
【００５５】
【表２−１】
【００５６】
【表２−２】
【００５７】
また、表２に示される枯草菌の各遺伝子と実質的に同じ機能を有する、好ましくは、これら各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、これら遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失又は不活性化すべき遺伝子に含まれる。
【００５８】
これら欠失又は不活性化される遺伝子は、上記各遺伝子単独の欠失又は不活化でも良いし、２種以上組み合わせても良い。
PGAを高分子化できる点から、親微生物の枯草菌におけるackA遺伝子、acoR遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、phrE遺伝子、proB遺伝子、rocF遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させることが好ましく、野生株を宿主微生物として用いた場合よりもPGAを150％以上に高分子化する際には、親微生物のackA遺伝子、argC遺伝子、acoR遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させて得られる宿主微生物を用いるのが好ましい。
またPGAを低分子化できる点から、親微生物のacoA遺伝子、ahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、gapB遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させることが好ましく、野生株を宿主微生物として用いた場合よりもPGAを70％以下に低分子化する際には、親微生物のsigH遺伝子、codY遺伝子、glpP遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化させて得られる宿主微生物を用いるのが好ましい。
尚、遺伝子の欠失や不活性化には、当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。
【００５９】
また、更なる生産性向上に対してより大きな効果を図るべく、上記特定の遺伝子以外の遺伝子の欠失又は不活性化を併せて行っても良い。
例えば、変異株のなかでも、PGA分解酵素をコードする遺伝子（PGA分解酵素遺伝子）を欠失又は不活性化させた変異株を宿主として使用することで、より良好な効果が期待できる。枯草菌におけるPGA分解酵素遺伝子としては、ggt遺伝子などが知られている［Kimura，K.，et al.:Microbiology，150，pp.4115-4123(2004)］。ggt遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示し、ggt遺伝子によりコードされるPGA分解酵素のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。 また、枯草菌以外の微生物を宿主として使用する場合にも、ggt遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活化させた変異株を使用することが好ましい。
本発明においてggt遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されず、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、また配列番号１１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、数個とは、例えば好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜3個である。
また、本発明においてggt遺伝子とは、配列番号１０に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
さらに、本発明においてggt遺伝子とは、配列番号１１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは前述と同じ定義を用いる。
また、枯草菌のggt遺伝子と同じ機能を有する、好ましくは当該遺伝子の塩基配列と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物（好ましくはBacillus属細菌）由来の遺伝子は、ggt遺伝子に相当する遺伝子と考えられる。
【００６０】
本発明の遺伝子の欠失又は不活性化は、各遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、或いは、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行なうことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させることがより望ましい。
【００６１】
上記遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、当該遺伝子（標的とする遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００６２】
標的とする遺伝子或いはその相同遺伝子等を欠失又は不活性化させる方法としては、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、特定の各遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である［Leenhouts，K.，et al.:Mol．Gen．Genet.，253，pp.217-224(1996)］。
【００６３】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり［Itaya，M.，Tanaka，T.:Mol．Gen．Genet.，223，pp.268-272(1990)］、このような方法を繰り返すことによって、目的の宿主微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法としては、変異誘発剤の使用や親微生物への紫外線、ガンマ線等の照射によっても実施可能である。この場合、標的とする構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、または標的遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。さらに、より効率的な手法として、標的とする遺伝子の上流、下流領域を含むが標的とする遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE（splicing by overlap extension）-PCR法［Horton，RM.，et al.:Gene，77，pp.61-68(1989)］によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノム上の標的とする遺伝子の外側の２箇所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的とする遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である（図２参照）。
【００６４】
また、本発明に係る組換え微生物は、導入したpgsB遺伝子又はpgsBに相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsCに相当する遺伝子が、その上流に、宿主細胞内において機能を有しており正的に発現制御を受ける転写開始制御領域、翻訳開始制御領域が結合されたものであることが好ましい。当該制御領域は、結合した下流遺伝子を発現させ、当該遺伝子の発現を宿主細胞内において高めることができるものであることがより好ましく、下流遺伝子を構成的に発現又は／及び高発現させるものが特に好ましい。このような制御領域として、バチルス（Bacillus）属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、rapA遺伝子の制御領域、Bacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域などが例示されるが特に限定されない。
【００６５】
前述したBacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点上流0.4〜1.0kb領域由来の制御領域の塩基配列を配列番号７に示す。また当該制御領域としては、配列番号７に示す塩基配列に限定されず、例えば配列番号７に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列の意味である。
【００６６】
また、枯草菌に由来するrapA遺伝子（BG10652）の当該制御領域の塩基配列を配列番号８に示す。また、当該制御領域としては、配列番号８に示す塩基配列に限定されず、例えば配列番号８に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列の意味である。
【００６７】
さらに、枯草菌に由来するspoVG遺伝子（BG10112）の当該制御領域の塩基配列を配列番号９に示す。当該制御領域としては、配列番号９に示す塩基配列に限定されず、例えば配列番号９に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列の意味である。
【００６８】
前述したpgsB遺伝子又はpgsBに相当する遺伝子とpgsC遺伝子又はpgsCに相当する遺伝子を宿主微生物に導入する際は、通常のプラスミド（ベクター）を使用することができる。また、プラスミドは、遺伝子導入対象の宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。枯草菌を宿主とする場合、例えば、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等を例示することができる。選択されるプラスミドは、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミドであることが好ましく、そのプラスミドが多コピーであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム（染色体）に対し、2以上100コピー以下であれば良く、好ましくは2以上50コピー以下、より好ましくは2以上30コピー以下であれば良い。また、発現ベクターを用いた形質転換には、通常の手法、例えばプロトプラスト法［Chamg，S.，Cohen，SH.:Mol．Gen．Genet.，168，pp.111-115(1979)］やコンピテントセル法［Young，FE.，Spizizen，J.:J. Bacteriol.，86，pp.392-400(1963)］を適用することができる。
【００６９】
後述の実施例に示すように、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_S237/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のackA遺伝子、argC遺伝子、phrE遺伝子、argD遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、proB遺伝子、skfA遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を有する枯草菌pgsBC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入することにより、分子量を105〜240％に高分子化したPGAが得られる。一方、枯草菌株のahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、asnO遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株を用いた場合、分子量を60〜95％に低分子化したPGAが得られる。
【００７０】
また、前述の枯草菌spoVG遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_spoVG/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のackA遺伝子、acoR遺伝子、asnO遺伝子、phrA遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入することにより、分子量を110〜330％に高分子化したPGAが得られる。一方、枯草菌株のacoA遺伝子、ahrC遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glpP遺伝子、glcK遺伝子、rocA遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、skfA遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入した場合、分子量を40〜95％に低分子化したPGAが得られる。
【００７１】
また、前述の枯草菌rapA遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_rapA/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のackA遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、glcK遺伝子、rocA遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入することにより、分子量を110〜240％に高分子化したPGAが得られる。一方、枯草菌株のcarA遺伝子、codY遺伝子、gapB遺伝子、glpP遺伝子、phrA遺伝子、sigH遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に同様のpgsBC遺伝子を導入した場合、分子量を70〜95％に低分子化したPGAが得られる。
【００７２】
また、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を枯草菌pgsBC遺伝子の上流に有する組換えプラスミド（pHY-P_S237/pgsBC）を枯草菌株に導入した条件を対照条件として、この対照条件で得られるPGAの分子量を100％とした場合に、枯草菌株のsigH遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活化した枯草菌変異株に、前述のBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を有するBacillus amyloliquefaciens NBRC3022株由来pgsBC遺伝子、Bacillus licheniformis ATCC9945a株由来pgsBC遺伝子、Bacillus licheniformis AHU1371株由来pgsBC遺伝子又はOceanobacillus iheyensis HTE831株由来pgsBC遺伝子を導入することにより、分子量を15〜60％に低分子化したPGAが得られることから、上記のような枯草菌pgsBC遺伝子に相当する遺伝子を用いても同様の効果が得られる。
【００７３】
すなわち、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、yqga遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌変異株を宿主微生物として用い、当該宿主微生物に、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入せず、且つ、枯草菌におけるpgsBC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入すれば、PGAの分子量を調整でき、目的に応じて種々の分子量のPGAを効率良く生産できる。
【００７４】
以上で説明した本発明に係る組換え微生物を用いることによって、目的に応じて種々の分子量のPGAを効率よく製造することができる。製造されたPGAは、化粧品、医薬品、食品、水質浄化剤、保水材料、増粘剤等の様々な用途に使用することができる。特に本発明に係る組換え微生物においては、従来の遺伝子組換え技術によるPGA生産法と比較して優れた生産性が得られることから上記用途で利用されるPGAの生産コストを大幅に低減することができる。
【００７５】
尚、本発明に係る組換え微生物を用いてPGAを製造する際には、先ず、適切な培地において当該組換え微生物を培養し、菌体外に生産されたPGAを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。また、培地としては合成培地でも良いし、天然培地でも良い。
【００７６】
PGAの生産性を向上させる点から、培養対象の組換え微生物が生育に必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地を使用することが好ましい。具体的には培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは0.005〜600g/L、より好ましくは0.05〜500g/L、より好ましくは0.1〜400g/L、より好ましくは0.5〜300g/Lとする。培地中のグルタミン酸は組換え微生物の生育に消費されるのでPGAの生産性を向上させる点から、グルタミン酸濃度0.005g/L以上が好ましく、また、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度600g/L以下が好ましい。
【００７７】
培養条件として、至適温度は、好ましくは10〜40℃であり、より好ましくは30〜40℃である。至適pHは、好ましくはpH4〜8であり、より好ましくは5〜8である。また、培養日数は、種菌接種後、好ましくは1〜10日間であり、より好ましくは2〜5日間である。培養は、特に限定されないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。
【００７８】
培地中に蓄積されたPGAを回収する際には、PGAを生産させた微生物菌体を除去する必要があるが、これには遠心分離による方法、限外濾過膜を用いる方法、電気透析法、pHをPGAの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法等が挙げられ、さらに上記手法を組み合わせて用いることも可能である。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。表３及び４には、本実施例で使用したプライマーの名称、その塩基配列及び配列番号をまとめて示した。尚、表３に示す塩基配列において、下線部分は付加した制限酵素認識配列を示している。
【００８０】
〔製造例１〕ベクターの構築（１）
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した（図１参照）。
先ず、Bacillus sp．KSM-366株（FERM BP-6262）から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したP-S237/BSpgsB atg FW（配列番号３６）及びHindIII_BSpgsBCA RV（配列番号３７）のプライマーセットを用いてpgsBCA遺伝子2.9kbのDNA断片（BCA）、同様にP-S237/BSpgsB atg FW（配列番号３６）及びHindIII_BSpgsBC RV（配列番号３８）のプライマーセットを用いてpgsBC遺伝子1.7kbのDNA断片（BC）をそれぞれ調製した。尚、Bacillus sp．KSM-366株のpgsB遺伝子の塩基配列を配列番号１２に、上記pgsB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に、pgsC遺伝子の塩基配列を配列番号１４に、上記pgsC遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に、pgsA遺伝子の塩基配列を配列番号１６に、上記pgsA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。さらに、Bacillus sp．KSM-S237株（FERM BP-7875）から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したCm_S237 FW（配列番号３９）とP_S237-RV（配列番号４０）のプライマーセットを用いて、KSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報参照）プロモーター領域0.6kbのDNA断片（P_S237）を調製した。
【００８１】
次に、断片（P_S237）及び（BCA）を鋳型とし、Cm_S237 FWとHindIII_BSpgsBCA RVとのプライマーセットを用いたSOE−PCR法にて（P_S237）及び（BCA）を１断片化した3.5kbのDNA断片（P_BCA）、同様に断片（P_S237）及び（BC）を鋳型とし、Cm_S237 FWとHindIII_BSpgsBC RVとのプライマーセットを用いたSOE−PCR法にて（P_S237）及び（BC）を１断片化した2.3kbのDNA断片（P_BC）を得た。続いて、このDNA断片（P_BCA）及び（P_BC）を制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、それぞれを同様の制限酵素処理を施したプラスミドベクターpHY300PLK（Takara）とDNA Ligation kit Ver.2（Takara）を用いてライゲーション反応（結合化）を行なった。
【００８２】
上記ライゲーション試料を用いて、大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、テトラサイクリン-塩酸塩（SIGMA-ALDRICH）を15ppm添加したLB寒天培地（LBTc寒天培地）上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュア プラスミドアイソレーションキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス）を用い組換えプラスミドを調製した。これらを制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上のBamHI及びHindIII制限酵素認識部位に目的とする上記DNA断片（P_BC）が挿入していることを確認した。
【００８３】
本製造例において、DNA断片（P_BC）の挿入が確認できた組換えプラスミドをそれぞれPGA組換え生産用ベクターpHY-P_S237/pgsBCとした。尚、PCR反応はGeneAmp9700（PE Applied Biosystems）とTaKaRa LA Taq（Takara）を用い、キット添付のプロトコールに従い実施した。
【００８４】
〔製造例２〕ベクターの構築（２）
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した（図３参照）。
先ず、Bacillus subtilis Marburg No.168株（枯草菌168株）から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したP_spoVG FW2（配列番号４１）とP_spoVG/Cm R（配列番号４２）のプライマーセットを用いて、spoVG遺伝子ORFより約0.6kb上流にプラスミドpC194［例えば、Horinouchi，S.，Weisblum，B.:J．Bacteriol.,150，pp.815-825(1982)参照]由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Cmr）を挿入するための上流側0.9kbのDNA断片（spoVG-UP）を調製した。同様に、表３に示したP_spoVG/Cm F（配列番号４３）とP_spoVG RV（配列番号４４）のプライマーセットを用いて、下流側0.6kbのDNA断片（spoVG-DW）を調製した（尚、この際にP_spoVG RVのプライマーはspoVG遺伝子ORFの開始コドンgtgをatgに変更するようにデザインした）。また、プラスミドpC194を鋳型とし、表３に示したcomp_Cm FW（配列番号４５）とcomp_Cm RV（配列番号４６）のプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子0.9kbのDNA断片（comp_Cm）を調製した。
【００８５】
次に、得られた断片（spoVG-UP）、（spoVG-DW）及び（comp_Cm）を鋳型とし、P_spoVGFW2とP_spoVG RVとのプライマーセットを用いて、SOE−PCR法にて上記3断片を1断片化した2.4kbのDNA断片（Cm-P_spoVG）を得た。さらに、このようにして得られたDNA断片を用いてコンピテントセル法（前述）により枯草菌168株の形質転換を行ない、クロラムフェニコール（SIGMA-ALDRICH）を10ppm添加したLB寒天培地（LBCm寒天培地）上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００８６】
次に、得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示したcomp_Cm FWとP_spoVG RVのプライマーセットを用いたPCRによってクロラムフェニコール耐性遺伝子とspoVG遺伝子プロモーター領域からなる1.5kbのDNA断片（P-spoVG-Cm2）を調製した。さらに、comp_P-spoVG R/BSpgsB atg FW（配列番号４７）とpgsC FW（配列番号４８）のプライマーセットを用いて、枯草菌168株から調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRによってpgsB遺伝子1.2kbのDNA断片（pgsB1）を、pgsB/Cm F（配列番号４９）とpgsB RV（配列番号５０）のプライマーセットを用いてpgsB遺伝子ORFの上流側1.1kbのDNA断片（pgsB-UP）を調製した。さらに、得られた上記（pgsB1）、（P-spoVG-Cm2）及び（pgsB-UP）の3断片を鋳型として、pgsC FWとpgsB RVのプライマーセットを用いて、SOE-PCRにより3.6kbのDNA断片を調製した。
【００８７】
続いて、このようにして得られたDNA断片を用いてコンピテントセル法にて枯草菌168株の形質転換を行い、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、HindIII_BSpgsBC RVとBamHI_PspoVG FW（配列番号５１）のプライマーセットを用いて、枯草菌pgsBC遺伝子の上流に枯草菌spoVG遺伝子プロモーターを有する2.3kbのDNA断片（P_spoVG/pgsBC）を調製した。さらに、得られたDNA断片を製造例１と同様の手順にてプラスミドベクターにクローニングし、取得したPGA組換え生産用ベクターをpHY-P_spoVG/pgsBCとした。
【００８８】
〔製造例３〕ベクターの構築（３）
本製造例には、製造例２と同様にPGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した（図３参照）。
枯草菌168株から調製した染色体DNAを鋳型とし、表３に示したrapA FW（配列番号５２）とP_rapA/Cm R（配列番号５３）のプライマーセットを用いて、rapA遺伝子ORFより約0.5kb上流にプラスミドpC194由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入するための上流側0.5kbのDNA断片（rapA-UP）を調製した。同様に、表３に示したP_rapA/Cm F（配列番号５４）とP_rapA RV（配列番号５５）のプライマーセットを用いて、下流側0.5kbのDNA断片（rapA-DW）を調製した（尚、この際にP_rapA RVのプライマーはrapA遺伝子ORFの開始コドンttgをatgに変更するようにデザインした）。
【００８９】
次に、得られた断片（rapA-UP）、（rapA-DW）及び製造例２にて調製したDNA断片（comp_Cm）を鋳型とし、rapA FWとP_rapA RVとのプライマーセットを用いて、SOE−PCR法にて上記3断片を1断片化した1.9kbのDNA断片（Cm-P_rapA）を得た。さらに、このようにして得られたDNA断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００９０】
次に、得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示したcomp_CmFWとP_rapA RVのプライマーセットを用いたPCRにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子とrapA遺伝子プロモーター領域からなる1.4kbのDNA断片（P-rapA-Cm2）を調製した。また、comp_P-rapA R/BSpgsB atg FW（配列番号５６）とpgsC FWのプライマーセットを用いて、枯草菌168株から調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRによってpgsB遺伝子1.2kbのDNA断片（pgsB2）を調製した。さらに、得られた上記（pgsB2）、（P-rapA-Cm2）及び製造例２にて調製したDNA断片（pgsB-UP）の3断片を鋳型として、pgsC FWとpgsB RVのプライマーセットを用いて、SOE-PCRにより3.5kbのDNA断片を調製した。
【００９１】
続いて、製造例２と同様の手順により得られたDNA断片を用いて、コンピテントセル法にて枯草菌168株の形質転換を行なった。得られた形質転換体からゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型としてHindIII_BSpgsBC RVとBamHI_PrapA FW（配列番号５７）のプライマーセットを用いて、枯草菌pgsBC遺伝子の上流に枯草菌rapA遺伝子プロモーターを有する2.2kbのDNA断片（P_rapA/pgsBC）を調製した。さらに、得られたDNA断片を製造例１と同様の手順にてプラスミドベクターにクローニングし、得られた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクターpHY-P_rapA/pgsBCとした。
【００９２】
〔製造例４〕ベクターの構築（４）
本製造例には、PGA合成に関与する枯草菌pgsBC遺伝子に相当する遺伝子群のクローニング方法を示した。
Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP−7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子DNA断片（約3.1kb）がプラスミドベクターpHY300PLK（Takara） のBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237［特開2007-130013号公報］を制限酵素XbaIにて処理し、この線状化したプラスミドDNAを鋳型とし、表３に示したP_S237-RV（配列番号４０）とINFU_pHY-HindIII FW（配列番号５８）のプライマーセットを用いKSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子プロモーター領域とプラスミドベクターpHY300PLKからなる5.5kb のDNA断片（pHY-P_S237）を調製した。続いて、Bacillus amyloliquefaciens NBRC3022株）から調製した染色体DNAを鋳型として、表３に示したINFU_P-S237 RV/BAL pgsB atg FW（配列番号５９）とINFU_pHY-HindIII/BAL pgsC RV（配列番号６２）のプライマーセットを用い、Bacillus amyloliquefaciens由来pgsBC遺伝子1.7kbのDNA断片（BALpgsBC-3022）を調製した。さらに、上記DNA断片を組み合わせ（pHY-P_S237及びBALpgsBC-3022）を基質としてIn-Fusion PCR Cloning Kit（Takara）にて結合反応を行なった。得られた結合試料を用いて大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、LBTc寒天培地上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュア プラスミドアイソレーションキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス）にて組換えプラスミドを調製した。得られたプラスミドを制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上に目的とする上記DNA断片（BALpgsBC-3022）が挿入していることを確認し、本製造例において得られた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター（pHY-P_S237/BALpgsBC-3022）とした。尚、本製造例で用いるプライマー配列のデザイン及び実験条件等はキット添付のプロトコールに従い実施した。
【００９３】
〔製造例５〕ベクターの構築（５）
本製造例には、製造例５と同様にPGA合成に関与する枯草菌pgsBC遺伝子に相当する遺伝子群のクローニング方法を示した。
Bacillus licheniformis ATCC9945a株及びAHU1371株から調製した染色体DNAをそれぞれ鋳型として、表３に示したINFU_P-S237 RV/BLi pgsB atg FW（配列番号６０）とINFU_pHY-HindIII/BAL pgsC RV（配列番号６３）のプライマーセットを用い、Bacillus licheniformis由来pgsBC遺伝子の1.7kbのDNA断片（BLipgsBC-9945、BLipgsBC-1371）、また、Oceanobacillus iheyensis HTE831株から調製した染色体DNAを鋳型として、表３に示したINFU_P-S237 RV/OBi pgsB atg FW（配列番号６１）とINFU_pHY-HindIII/OBi pgsC RV（配列番号６４）のプライマーセットを用い、Oceanobacillus iheyensis由来pgsBC遺伝子の1.7kbのDNA断片（OBipgsBC-831）をそれぞれ調製した。続いて、前述の製造例４により得られたDNA断片（pHY-P_S237）と上記DNA断片を各々組み合わせ（pHY-P_S237及びBLipgsBC-9945、pHY-P_S237及びBLipgsBC-1371、pHY-P_S237及びOBipgsBC-831）、In-Fusion PCR Cloning Kit（Takara）を用いて結合反応を行なった。得られた結合試料を用いて大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、前述の製造例４と同様の手順にて組換えプラスミドを調製した。得られたプラスミドに目的とするDNA断片（BLipgsBC-9945、BLipgsBC-1371、OBipgsBC-831）が挿入していることを確認し、本製造例において得られた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター（pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371、pHY-P_S237/OBipgsBC-831）とした。
【００９４】
【表３−１】
【００９５】
【表３−２】
【００９６】
〔製造例６〕枯草菌改変体の作製（１）
本製造例では、製造例１〜３で得られたベクターを導入するための枯草菌変異株の作製方法を示した（図２参照）。
枯草菌168株から調製したゲノムDNAを鋳型とし、表４に示したackA-FW（配列番号７１）とackA/Cm-R（配列番号７２）とのプライマーセットを用いてゲノム上のackA遺伝子の下流に隣接する1.0kbのDNA断片（ackA-UP）、ackA/Cm-F（配列番号７３）とackA-RV（配列番号７４）とのプライマーセットを用いてゲノム上のackA遺伝子の上流に隣接する1.0kbのDNA断片（ackA-DW）をそれぞれ調製した。また、プラスミドpC194由来を鋳型として、表４に示したCmFW（配列番号６９）とCmRV（配列番号７０）のプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子含む0.9kbのDNA断片（Cmr）を調製した。
【００９７】
次に、得られたDNA断片（ackA-UP）、（ackA-DW）及び（Cmr）を混合して鋳型とし、ackA-FWとacoA-RVとのプライマーセットを用いたSOE−PCRにて3断片を（ackA-UP）-（Cmr）-（ackA-DW）の順になる様に結合し、2.9kbの遺伝子欠失用DNA断片を得た。次に、この遺伝子欠失用DNA断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってackA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子（断片Cmr）と置換した目的とする枯草菌変異株（以下、ΔackA株とする）であることを確認した。以下、その他の遺伝子欠失株の調製も同様に、表４に示した遺伝子名-FWと遺伝子名/Cm-Rとのプライマーセット、及び遺伝子名/Cm-Fと遺伝子名-RVとのプライマーセットを用いて調製を行ない、得られた枯草菌変異株には、記号「Δ」を欠失遺伝子名に付し、変異株名とした。
【００９８】
【表４−１】
【００９９】
【表４−２】
【０１００】
【表４−３】
【０１０１】
【表４−４】
【０１０２】
【表４−５】
【０１０３】
【表４−６】
【０１０４】
【表４−７】
【０１０５】
〔製造例７〕プラスミド導入による形質転換
本製造例では、宿主となる枯草菌株及びその変異株の形質転換法を示した。野生株である枯草菌（Bacillus subtilis Marburg No.168株）、製造例６で作製した枯草菌変異株に対し、製造例１〜５で得られたPGA組換え生産用ベクター（pHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_spoVG/pgsBC、pHY-P_rapA/pgsBC pHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371及びpHY-P_S237/OBipgsBC-831）を用い、形質転換を行なった。上記野生株及び変異体からリゾチーム処理により調製したプロトプラスト105〜106個に上記プラスミドDNA 20〜100ngを供し、プラスミド導入を行なった。テトラサイクリン-塩酸塩30ppmを添加したDM3プロトプラスト再生培地（DM3培地）上に生育したコロニーを、プラスミドを導入した目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
【０１０６】
〔実施例１〕生産性評価（１）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_S237/pgsBCを導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、その相対値を表５に示した。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５に示したように、pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株及び枯草菌変異株において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_S237/pgsBCを導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量は大きく変化し、PGAの分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１０９】
〔実施例２〕生産性評価（２）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_spoVG/pgsBCを導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、評価結果を表６に示した。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
表６に示したように、pHY-P_spoVG/pgsBCを導入した枯草菌168株及び枯草菌変異株において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_spoVG/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_spoVG/pgsBCを導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量は大きく変化し、PGAの分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１１２】
〔実施例３〕生産性評価（３）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_rapA/pgsBCを導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、評価結果を表７に示した。
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
表７に示したように、pHY-P_rapA/pgsBCを導入した枯草菌168株及び枯草菌変異株において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_rapA/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_rapA/pgsBCを導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量は大きく変化し、PGAの分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１１５】
〔実施例４〕生産性評価（４）
枯草菌168株を対照として、製造例７において調製したpHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371又はpHY-P_S237/OBipgsBC-831を導入して得られた形質転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後に、このLBTc寒天培地上に生育した枯草菌形質転換体を改変2xL/Maltose+MSG培地（2.0％トリプトン、1.0％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム、7.5％マルトース、8.0％グルタミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩）中で攪拌／懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/Maltose+MSG培地に1％（v/v）接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養（TB-20R-3F、高崎科学機器）を行なった。評価培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてPGA分子量を測定し、評価結果を表７に示した。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
表８に示したように、pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株及びpHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371又はpHY-P_S237/OBipgsBC-831を導入した枯草菌変異株（ΔsigH株）において生産されたPGAの分子量を比較した。pHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌168株のPGAの分子量を100とした場合において、pHY-P_S237/BALpgsBC-3022、pHY-P_S237/BLipgsBC-9945、pHY-P_S237/BLipgsBC-1371又はpHY-P_S237/OBipgsBC-831を導入した各枯草菌変異株のPGAの分子量はいずれも大きく変化（低分子化）し、PGA分子量の調整が出来ることが明らかとなった。
【０１１８】
〔測定例〕PGAの定量及び分子量測定法
実施例１〜４に示した評価培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間遠心分離（商品名himacCF15RX、日立工機）に供し、遠心分離にて得られた培養液上清中の組換えPGA生産量の測定を行なった。上清試料中のPGA検出はYamaguchiらの方法（前述）に準じ、試料をアガロースゲル電気泳動に供した後、メチレンブルーによるゲルの染色を行ない、PGAに由来する染色物質の有無による組換えPGA生産を確認した。さらに、組換えPGAが検出された試料については、TSKGel G4000PWXL及びTSKGel G6000PWXLゲルろ過カラム（商品名、東ソー）を用いたHPLC分析を実施した。尚、分析条件は溶離液に0.1M硫酸ナトリウムを使用し、流速1.0mL/分、カラム温度50℃、UV検出波長を210nmとした。また、濃度検定には分子量80万のPGA（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。さらに、分子量検定にはプルラン（Shodex STANDRD P-82、商品名、昭和電工）を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸［和光純薬工業（162-21411、162-21401）、SIGMA-ALDRICH（P-4886、P-4761）、明治フードマテリアル（分子量88万）］を用いた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物に、ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入していないことを特徴とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項２】
枯草菌におけるackA遺伝子、acoR遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、phrE遺伝子、proB遺伝子、rocF遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物を用いて、ポリ−ガンマグルタミン酸を高分子化することを特徴とする請求項１記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項３】
枯草菌におけるacoA遺伝子、ahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、gapB遺伝子、glcP遺伝子、、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物を用いて、ポリ−ガンマグルタミン酸を低分子化することを特徴とする請求項１記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項４】
pgsB遺伝子が以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜３の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と50％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
pgsB遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである請求項１〜３の何れか１項記載記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
。
【請求項６】
pgsC遺伝子が以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜５の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の存在下でポリ−ガンマ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と50％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項７】
pgsC遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１５、２１、２７又は３３に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の存在下でポリ−ガンマ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするものである請求項１〜５の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項８】
pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、上記微生物の宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド（ベクター）に組み込まれていることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法
【請求項９】
pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、その上流に、微生物において機能を有する転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領域を有する請求項１〜８の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１０】
上記宿主微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、請求項１〜９の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１１】
上記バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項１０記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項記載の組換え微生物を用いることを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法を用いて、生成されたポリ−ガンマ−グルタミン酸を取得することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
【請求項１】
微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるackA遺伝子、acoA遺伝子、acoR遺伝子、ahrC遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子,asnO遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、comX遺伝子、dhaS遺伝子、gapB遺伝子、glcK遺伝子、glcP遺伝子、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrA遺伝子、phrE遺伝子、phrI遺伝子、phrK遺伝子、proB遺伝子、rocA遺伝子、rocF遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、sigK遺伝子（spoIVCB〜spoIIIC遺伝子）、skfA遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物に、ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入し、且つ、枯草菌におけるpgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入していないことを特徴とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項２】
枯草菌におけるackA遺伝子、acoR遺伝子、argC遺伝子、argD遺伝子、phrE遺伝子、proB遺伝子、rocF遺伝子、ywpG遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物を用いて、ポリ−ガンマグルタミン酸を高分子化することを特徴とする請求項１記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項３】
枯草菌におけるacoA遺伝子、ahrC遺伝子、argF遺伝子、argJ遺伝子、carA遺伝子、codY遺伝子、comP遺伝子、comQ遺伝子、gapB遺伝子、glcP遺伝子、、glpP遺伝子、gltB遺伝子、licR遺伝子、oppA-F遺伝子（oppABCDF遺伝子オペロン）、phrI遺伝子、phrK遺伝子、sigE遺伝子、sigF遺伝子、sigG遺伝子、sigH遺伝子、ygaC遺伝子、yqfN遺伝子、yrzL遺伝子、yuzB遺伝子及びこれら遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させて得られる宿主微生物を用いて、ポリ−ガンマグルタミン酸を低分子化することを特徴とする請求項１記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項４】
pgsB遺伝子が以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜３の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と50％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
pgsB遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである請求項１〜３の何れか１項記載記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
。
【請求項６】
pgsC遺伝子が以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜５の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の存在下でポリ−ガンマ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と50％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項７】
pgsC遺伝子に相当する遺伝子が、配列番号１５、２１、２７又は３３に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の存在下でポリ−ガンマ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするものである請求項１〜５の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項８】
pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、上記微生物の宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド（ベクター）に組み込まれていることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法
【請求項９】
pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、その上流に、微生物において機能を有する転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領域を有する請求項１〜８の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１０】
上記宿主微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である、請求項１〜９の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１１】
上記バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項１０記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項記載の組換え微生物を用いることを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法を用いて、生成されたポリ−ガンマ−グルタミン酸を取得することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２１３６６５（Ｐ２０１０−２１３６６５Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６７０８７（Ｐ２００９−６７０８７）
【出願日】平成２１年３月１８日（２００９．３．１８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１８日（２００９．３．１８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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