ポリアクリルアミドゲル上で分離される生体分子の分解能を改善するための組成物および方法
スタッキングゲル中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有する、ポリアクリルアミドゲルのようなゲルが提供される。スタッカー中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有する未変性ゲルは、タンパク質複合体のような生体分子複合体を分離するために使用することができる。前面プレートと背面プレートとの間の間隙幅が、カセットの上側エッジで５％より大きくは変動しないゲルカセットもまた提供される。ゲルカセットは、スタッカー中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有する未変性ゲルのような未変性ゲル上でのタンパク質およびタンパク質複合体の電気泳動による分離のために使用することができる。未変性ゲルは、少なくとも１つの試料および／または少なくとも１つの分子量標準を電気泳動するための複数個のウェルを有することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、「ポリアクリルアミドゲル上で分離される生体分子の分解能を改善するための組成物および方法」と題する、２００５年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／７５４，３２８号、および「ポリアクリルアミドゲル上で分離される生体分子の分解能を改善するための組成物および方法」と題する、２００６年１月２４日出願の米国特許仮出願第６０／７６１，３４２号に対する優先権の恩典を主張する。これらの特許出願の各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、電気泳動ゲルにおけるスカーティング（ｓｋｉｒｔｉｎｇ）効果を最少にするための電気泳動方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
ゲル電気泳動は、生体分子および分子複合体の分離、特性解析ならびに同定におけるその有用性から、生化学、分子生物学、および細胞生物学の基本的な技術となっている。ゲル電気泳動を最適に使用するためには、生体分子を高分解能で分離することが必要である。ゲル電気泳動を採用する生化学者が直面する１つの問題は、「スカーティング」である。これは、そのゲル上にロードされた試料の分子が、そのゲル自体を通ってではなく、そのゲルとゲルプレートとの間を移動することである。このことが起こると、そのゲル内で移動する生体分子または複合体の主要バンドよりも、素早く移動する影バンドが現れることになる。これによって、そのゲルの像が分析されるときの曖昧さが生み出される。なぜなら、そのようなバンドがアーチファクトであるのか、または存在量の少ない生体分子もしくは複合体の結果であるのかを知ることは困難だからである。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本明細書中に提供されるのは、ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するための電気泳動ゲル、カセットおよび方法である。例示的な実施形態では、本明細書中で提供される電気泳動ゲル、カセットおよび方法は、非変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用することができる。また、本明細書中で提供されるのは、変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用される電気泳動ゲル、カセットおよび方法である。
【０００５】
１つの局面では、本明細書中で提供されるのは、生体分子の分離のための電気泳動ゲルである。この電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルを有し、そしてこのスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。このような電気泳動ゲルの１つの実施形態では、この電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、上記スタッキングゲルおよび分離ゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、そしてこのスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このスタッキングゲルのアクリルアミド濃度は、約２％と約６％との間であるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルのアクリルアミド濃度は約２．５％と約５％との間である。さらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度は約０．００５％〜約１％であるが、さらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度は約０．０１％〜約０．５％である。なおさらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度は約０．０２％〜約０．１％である。他の実施形態では、上記分離ゲルは、直鎖状アクリルアミドを含まない。
【０００６】
この局面の他の実施形態では、上記電気泳動ゲルは、変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような変性ゲルは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する。
【０００７】
この局面の他の実施形態では、上記電気泳動ゲルは非変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、非変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような非変性ゲルは勾配ゲルであるが、他方、特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブ（Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ）ゲルである。
【０００８】
本明細書中で提供される別の局面は、電気泳動ゲル上で生体分子を分離するための方法である。このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲル部分および分離ゲル部分を備える電気泳動ゲルに適用する工程、ならびに次いでこの１つまたは複数の生体分子をこの電気泳動ゲル上で電気泳動により分離する工程を包含する。このスタッキングゲル部分は、直鎖状ポリアクリルアミドを含む。この局面の１つの実施形態では、上記分離ゲルは、直鎖状アクリルアミドを含まない。
【０００９】
この局面のさらなるまたは代替的は実施形態では、上記電気泳動ゲルは、変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような変性ゲルは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する。
【００１０】
この局面の他の実施形態では、上記電気泳動ゲルは非変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、非変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような非変性ゲルは勾配ゲルであるが、他方、特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブゲルである。
【００１１】
この局面の他の実施形態では、上記方法はまた、１つまたは複数の分子量マーカーセットを上記電気泳動ゲルに適用する工程を包含し、そしてさらなるまたは代替的な実施形態では、このような方法はまた、電気泳動ゲル上の電気泳動された１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程を包含する。
【００１２】
本明細書中で提供される別の局面は、ゲル電気泳動を実施するためのカセットである。このカセットは、その断面にわたって一定の間隙幅を有する。この局面の特定の実施形態では、このようなカセットは、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。この局面の特定の実施形態では、このようなカセットは、０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットの間隙幅は、５％未満で変動し、他の実施形態では、このようなカセットの間隙幅の変動は、２％以下である。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットは、ポリアクリルアミドゲルを含有する。他の実施形態では、このようなカセットは、非変性ゲル電気泳動を実施するために使用され、そしてこのゲルは非変性ゲルである。特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットに含有されるゲルは勾配ゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような勾配ゲルは、ポリアクリルアミド勾配ゲルである。
【００１３】
この局面のさらなるまたは代替的な実施形態では、このカセットはプラスチックから製作されるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、このプラスチックカセットは、前面プレートを背面プレートに一緒に溶接することにより製作される。さらなるまたは代替的な実施形態では、この前面プレートを背面プレートに溶接することで、一定の間隙幅をもったカセットが作り出される。
【００１４】
本明細書中に提供される別の局面は、電気泳動ゲル上で生体分子を分離するための方法である。この方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、一定の間隙幅をもったカセット中に含有される電気泳動ゲルに適用する工程、ならびに次いでこの１つまたは複数の生体分子をこの電気泳動ゲル上で電気泳動により分離する工程を包含する。
【００１５】
この局面の１つの実施形態では、このカセットは、その断面にわたって一定の間隙幅を有するが、他の実施形態では、このようなカセットは、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。この局面の特定の実施形態では、このようなカセットは、０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットの間隙幅は、５％未満で変動し、他方、他の実施形態では、このようなカセットの間隙幅の変動は、２％以下である。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットは、ポリアクリルアミドゲルを含有する。他の実施形態では、このようなカセットは、非変性ゲル電気泳動を実施するために使用され、そしてこのゲルは非変性ゲルである。特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットに含有されるゲルは勾配ゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような勾配ゲルは、ポリアクリルアミド勾配ゲルである。この局面の他の実施形態では、このようなカセットに含有される電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルを含有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなスタッキングゲルは直鎖状アクリルアミドを含有する。
【００１６】
このような方法のさらなるまたは代替的な実施形態では、上記方法はまた、１つまたは複数の分子量マーカーセットを上記電気泳動ゲルに適用する工程を包含する。さらなるまたは代替的な実施形態では、上記方法はまた、電気泳動ゲル上で電気泳動された１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程を包含する。このような方法のさらなるまたは代替的な実施形態では、上記方法はまた、上記ゲルを染色する工程を包含する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書中に開示されるのは、ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用される電気泳動ゲル、カセットおよび方法である。例示的な実施形態では、本明細書中で提供される電気泳動ゲル、カセットおよび方法は、非変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用することができるが、他方、他の実施形態では、本明細書中で提供される電気泳動ゲル、カセットおよび方法は、変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用することができる。
【００１８】
定義
別段の定義がされない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通に理解するのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書中で使用される命名法は、当該分野では周知であり、共通に採用されている。「上へ（ｕｐ）」および「下へ（ｄｏｗｎ）」、「上側（ｔｏｐ）」および「下側（ｂｏｔｔｏｍ）」、「上に（ａｂｏｖｅ）」および「下に（ｕｎｄｅｒｎｅａｔｈ）もしくは「上側の（ｕｐｐｅｒ）」もしくは「下側の（ｌｏｗｅｒ）」などのような方位を示す用語は、装置を使用するあいだの部品の方位についていう。用語が単数形で提供される場面では、発明者らは、その用語の複数形をも企図している。参考として援用される引用文献において使用される用語および定義において不一致が存在する場合には、本願において使用される用語は、本明細書中で与えられる定義を有するものとする。本開示全体を通して採用される場合、以下の用語は、そうではないと示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１９】
本明細書中で使用される場合の用語「周囲温度」は、２０℃〜２５℃の範囲の温度をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、生体高分子または生体分子は、核酸、タンパク質、多糖、脂質および他の高分子を含むが、これらに限定されない核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメントおよびアナログを含む。核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア核酸、葉緑体核酸、および別個の遺伝物質を有する他のオルガネラから誘導されてもよい。
【００２１】
用語「カオトロピック薬（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）」または「カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質および核酸の二次または三次構造を変える能力を有する任意の物質をいう。
【００２２】
用語「電気泳動ゲル」は、本明細書中で使用される場合、試料の電気泳動分離のために使用されるゲルをいう。電気泳動ゲルは、分離ゲルのみであってもよく、または電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルの両方を含有していてもよい。
【００２３】
用語「直鎖状ポリアクリルアミド」または「直鎖状アクリルアミド」は、本明細書中で使用される場合、アクリルアミドの直鎖状の非架橋のポリマーをいい、そしてまた単に「高分子量アクリルアミド」と呼ばれることもあり得る。直鎖状アクリルアミドは、直鎖状ポリマーの長さに対応して、１，０００ダルトン〜６，０００，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、乾燥した化学形態であってもよく、または液体形態（すなわち、重量／体積の溶液）であってもよい。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、タンパク質は、１つまたは複数の長い、折り畳まれたポリペプチド鎖を含む複雑な三次元的な物質である。そして、これらの鎖はアミノ酸と呼ばれる小さい化学単位を含む。すべてのアミノ酸は、炭素、水素、酸素および窒素を含有する。いくつかは、硫黄をも含有する。「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含有する化合物である。このアミノ酸は、線状に一緒に連結し、ペプチド鎖を形成する。２０種類の異なる天然アミノ酸が存在し、それらがペプチドの生物学的生産に関与する。そして、ペプチド鎖を形成するために、任意の数のそれら天然アミノ酸が任意の順序で連結されてもよい。ペプチドの生物学的生産に用いられる天然アミノ酸は、すべてＬ配置を有する。合成ペプチドは、慣用的な合成方法を採用し、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または２つの異なる配置のアミノ酸の種々の組合せを使用して調製することができる。いくつかのペプチド鎖は、いくつかのみのアミノ酸単位を含有する。例えば１０個よりも少ないアミノ酸単位を有する短いペプチド鎖は、「オリゴペプチド」と呼ばれることがある。この接頭辞「オリゴ」は、「いくつか（ｆｅｗ）」を意味する。他のペプチド鎖は、例えば１００までかそれより多い大きな数のアミノ酸単位を含有し、そしてそれらは「ポリペプチド」と呼ばれる。接頭辞「ポリ」は「多く（ｍａｎｙ）」を意味する。固定された数のアミノ酸単位を含有するさらに他のペプチド鎖は、その鎖中の単位の固定された数を意味する接頭辞を用いて、例えばオクタペプチドと呼ばれる。接頭辞「オクタ」は８を意味する。慣用的に、「ポリペプチド」は、３個以上のアミノ酸を含有する任意のペプチド鎖であると考えることができ、他方、「オリゴペプチド」は、通常は、特定のタイプの「短い」ポリペプチド鎖であると考えられる。従って、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」に言及するときはいつでもオリゴペプチドをも含んでいることが理解される。さらに、「ペプチド」に言及するときはいつでもポリペプチド、オリゴペプチドを含んでいる。アミノ酸形態の各々の異なる配列は、異なるポリペプチド鎖を形成する。特定の非限定的な例では、このポリペプチドは、４０と４０００との間のアミノ酸、５０と３０００との間のアミノ酸、または７５と２０００との間のアミノ酸を含有する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「核酸分子」は、一重鎖形態または二重鎖らせんのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、あるいはそれらのリン酸エステルアナログ（例えば、ホスホロチエオエートおよびチオエステル）のリン酸エステルポリマー形態をいう。二重鎖ＤＮＡ−ＤＮＡらせん、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡらせんおよび二重鎖ＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、その分子の一次構造および二次構造のみを指し、いずれかの特定の三次形態に限定するものではない。従って、この用語は、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドならびに染色体において見出される二重鎖ＤＮＡを含む。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際には、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５’−３’方向の配列のみを提示するという通常の慣用法に従って、本明細書中に配列が開示されることもあり得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）を受けたＤＮＡ分子である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、非変性ゲルは、変性剤（例えば、変性作用を有する界面活性剤、尿素、ホルムアミド、および他のカオトロープのようなもの）を含有しない電気泳動ゲルをいう。非変性（すなわち、「未変性」）ゲルは、「未変性」ゲル電気泳動において一般に使用され、この場合、ランニング緩衝液および試料緩衝液もまた変性剤を欠く。これらのゲルは、分子相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、などのようなもの）を調べることにおいて、そしてゲル内活性アッセイ（ｉｎ−ｇｅｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）を実施するために特に有用であり得る。
【００２７】
用語「ポリアクリルアミド」は、本明細書中で使用される場合、アクリルアミドモノマーとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（「ビス」または「ビスアクリルアミド」）との混合物をいい、このアクリルアミドおよびビスは、架橋されて分枝状の分子構造を形成する。
【００２８】
用語「試料」は、本明細書中で使用される場合、ゲル電気泳動を使用して分離することができる複数の独特の分子種の混合物をいう。例としてのみであるが、試料は、核酸の混合物、オリゴヌクレオチドの混合物、ＤＮＡの混合物、ＲＮＡの混合物、またはこれらの組合せであってもよい。さらに、例としてのみであるが、試料は、アミノ酸の混合物、ペプチドの混合物、タンパク質の混合物またはこれらの組合せであってもよい。
【００２９】
用語「分離ゲル」または、あるいは「分離ゲルの本体」は、生体分子の分離が起こり、そして電気泳動分離が行われたあとに目的の分離された生体分子が局在する、電気泳動ゲルの領域をいう。
【００３０】
用語「スカーティング」または「スカーティング効果」は、本明細書中で使用される場合、試料が電気泳動ゲルと、そのゲルを保持するか含有する上記カセットの壁、すなわちプラスチックプレートまたはガラスプレートとの間を移動することができるときをいう。上記ゲルと上記カセットの壁、すなわちプラスチックプレートまたはゲルプレートとの間を移動することができる試料の一部分は、その試料の残りの部分よりも速く移動し、それによって影バンド（ｓｈａｄｏｗ ｂａｎｄ）またはスカートバンド（ｓｋｉｒｔ ｂａｎｄ）の出現がもたらされる。
【００３１】
電気泳動におけるスカーティングアーチファクトを低減するための電気泳動ゲル、組成物およびゲルカセット
本明細書中に開示される組成物、ゲルカセットおよび方法で使用される電気泳動ゲルは、分離ゲルの本体を含み、そして必要に応じてスタッキングゲルを含む。このような分離ゲルは、試料成分（生体分子が挙げられるが、これに限定されない）を分離するために使用され、他方、スタッキングゲルは、分離ゲルへの移動の前に、その試料成分を狭いバンドへ集束させるのを補助するために使用される。この集束によって、近接して移動する試料成分の分解能を向上させることが可能になる。この分離ゲル中で生体分子が分離するプロセスとしては、大きさによる分離、電荷による分離、または大きさと電荷の組合せによる分離が挙げられるが、これらに限定されない。このような分離ゲルを使用して分離される生体分子は、（電気泳動の前か、電気泳動の後か、もしくは電気泳動の間に）目的の生体分子を死滅させるか、染色するかまたは標識するかし、そして電気泳動分離後に分離ゲル内でのそれらの位置を観察（可視化）することによって検出される。
【００３２】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬が、ロードの前にその試料に添加される。他の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、試料が分離ゲルまたはスタッキングゲル中に置かれたローディングウェルに添加される前に、このようなローディングウェルに添加される。他の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、試料が分離ゲルまたはスタッキングゲル中に置かれたローディングウェルに添加された後に、このローディングウェルに添加される。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルは、電気泳動が実行されたのちに、少なくとも１つの色素、染色剤、標識または他の指示薬に曝露される。これによって、試料成分は、このような色素、染色剤、標識または他の指示薬と会合するようになる。あるいは、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、分離ゲルに添加される。これにより、それらは、電気泳動の移動の間に、試料成分と会合するようになる。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のさらに他の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、試料成分に共有結合で結びつけられる。次いで、分離ゲル中の試料バンドの可視化が、その分離ゲルを適切な波長の光で照らして、その試料バンドと会合した色素、染色剤、標識または他の指示薬の観察を可能にすることにより達成される。
【００３３】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の分離ゲルは、ゲルを形成する任意の材料を含むことができる。ゲルを形成する材料としては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびそれらの組合せが上げられるが、これらに限定されない。このような合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミドおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような天然ポリマーとしては、アガロースのような多糖が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、このような分離ゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、このような分離ゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、この分離ゲルは、直鎖状アクリルアミドおよびアガロース、直鎖状アクリルアミドおよびポリアクリルアミド、または直鎖状アクリルアミドおよびアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。
【００３４】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のスタッキングゲルは、ゲルを形成する任意の材料を含むことができる。ゲルを形成する材料としては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびそれらの組合せが上げられるが、これらに限定されない。このような合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミドおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような天然ポリマーの例としては、アガロースのような多糖が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、このようなスタッキングゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、このスタッキングゲルは、直鎖状アクリルアミドおよびアガロース、直鎖状アクリルアミドおよびポリアクリルアミド、または直鎖状アクリルアミドおよびアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含む。
【００３５】
記載される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、この電気泳動ゲルは、分離ゲルおよびスタッキングゲルを含有し、ここでこのスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。このスタッキングゲル中に直鎖状アクリルアミドを含有させることで、スカーティングアーチファクトを最少化または防止する。
【００３６】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、ここでこのスタッキングゲルはまた、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、ここでこの分離ゲルはまた、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、ここでこの分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方が、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。
【００３７】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のポリアクリルアミドゲルは、モノマーのアクリルアミドとビスアクリルアミドとの混合物である「アクリルアミド」の溶液を使用して作製される。重合開始剤、および必要ならば触媒を使用するアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの重合によって、架橋ポリアクリルアミドゲルが製造される。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のポリアクリルアミドゲルを作製するために上記混合物中で使用される、ビスアクリルアミドに対するモノマーアクリルアミドの比は、約１５：１〜約５０：１の範囲である。例としてのみであるが、このようなポリアクリルアミドゲル中の（モノマー）アクリルアミド：ビスアクリルアミド比は、１５：１、１９：１、２４：１、２９：１、３７．５：１、４０：１、４５：１および５０：１であり得る。本明細書中で開示される特定の実施形態では、タンパク質およびタンパク質複合体の分析のための、ビスアクリルアミドに対する（モノマー）アクリルアミドの比は、約１９：１〜約４５：１の範囲である。
【００３８】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法で使用される電気泳動ゲルの特定の実施形態では、スタッキングゲルは、上記のようなアクリルアミドとビスアクリルアミドとの混合物を使用して作製されたポリアクリルアミドを含む。特定の実施形態では、このスタッキングゲルは、上記分離ゲルを作製するために使用されるアクリルアミド濃度よりも低いアクリルアミド濃度で作製される。例としてのみであるが、スタッキングゲルは、約２％〜約８％、約２．５％〜約７．５％のアクリルアミド、約３％〜約７％のアクリルアミド、約３．５％〜約６．５％のアクリルアミド、約４％〜約６％のアクリルアミド、約４．５％〜約５．５％のアクリルアミド、または約２．５％〜約６％のアクリルアミドの範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を有することができる。例としてのみであるが、スタッキングゲルは、２％〜８％、２．５％〜７．５％のアクリルアミド、３％〜７％のアクリルアミド、３．５％〜６．５％のアクリルアミド、４％〜６％のアクリルアミド、４．５％〜５．５％のアクリルアミド、または２．５％〜６％のアクリルアミドの範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を有することができる。
【００３９】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルの分離ゲルおよびスタッキングゲルは、（個々に、またはともに）直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。他の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルは、（個々に、またはともに）直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの（重量／体積）濃度は、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％，０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．２％、または０．０２％〜約０．１％の範囲であってもよい。例示的な実施形態では、このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの（重量／体積）濃度は、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％，０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％、または０．０２％〜０．１％の範囲であってもよい。さらに、このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの分子量は、約１，０００ダルトン〜約６，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約７５０，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約３００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２５，０００ダルトン、または約１，０００ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲であってもよい。さらに、このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの分子量は、１，０００ダルトン〜６，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜７５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜３００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜１００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２５，０００ダルトン、または１，０００ダルトン〜１０，０００ダルトンの範囲であってもよい。当業者は、種々の分子量範囲の直鎖状アクリルアミドを試験して、上記スタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドについての有用な分子量を決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約１０，０００ダルトンよりも大きい。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約１００，０００ダルトンよりも大きい。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約１００，０００ダルトンと約１，０００，０００ダルトンとの間である。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約６００，０００ダルトンと約１，０００，０００ダルトンとの間である。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、６００，０００ダルトンと１，０００，０００ダルトンとの間である。
【００４０】
特定の実施形態では、本明細書中で開示されるような、直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルは、少なくとも、以下の直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、および重合開始剤の混合物を含有する混合物の重合によって作製される。この混合物は、必要に応じて、触媒を含有してもよい。このような混合物の重合は、当業者に周知である任意の適切な手段で開始されてよく、その手段としては、適切な薬剤および随意の触媒を添加することによる化学的開始、光開始剤を使用して続いて適切な波長で照射することによる光化学的開始、熱開始、およびこれらの組合せが挙げられる。このような混合物の重合によって、上記直鎖状アクリルアミドが、上記重合ゲル中へ組込まれ、それにより上記ゲルが強靭化される。さらに、直鎖状アクリルアミドを上記スタッキングゲル中へ組込むことにより、スカーティング効果が低減するか、または排除される。
【００４１】
このような混合物の重合を開始するために使用することができる化学的開始剤としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸アンモニウムとテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）との混合物、過硫酸ナトリウム、過硫酸ナトリウムとテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）との混合物、過硫酸カリウム、過硫酸カリウムとテトラメチルエチレンジアミンとの混合物、過酸化物、過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル、アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ＨＣｌ（ＡＺＩＰ）、アゾビス（２−アミジノプロパン）ＨＣｌ（ＡＺＡＰ）、４，４’−アゾ−ビス−４−シアノペンタン酸、アゾビスイソブチルアミド；アゾビスイソブチルアミジン．２ＨＣｌ、２−２’−アゾ−ビス−２−（メチルカルボキシ）プロパン、２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、および２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパノンが挙げられるが、これらに限定されない。このような混合物の重合を開始するために使用することができる光開始剤としては、アセトフェノン、ベンゾフェノン、多環式のキノン、フルオレセイン、アゾビスニトリル、ベンゾキノン、キサントフェノン、ベンゾイン、キサントン、フルオレノン、アントロキノン、エオシン、エリトロシン、ニトロキシド、リボルフラビン、リボルフラビン５’−ホスフェート、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、ビスアクリルアミド架橋剤、開始剤、および随意の触媒を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される、直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、重合開始剤（、および随意の触媒の混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドの溶液に添加される。特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、ビスアクリルアミド架橋剤、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドの溶液に添加される。
【００４３】
特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、開始剤および随意の触媒を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される、直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、重合開始剤、および触媒の混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドおよびビスアクリルアミド架橋剤の溶液に添加される。特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドおよびビスアクリルアミド架橋剤の溶液に添加される。
【００４４】
特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、モノマーアクリルアミド溶液、ビスアクリルアミド架橋剤、開始剤および随意の触媒の溶液に添加され、これにより、本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される、直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、重合開始剤および随意の触媒の混合物が得られる。特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）の溶液に添加され、これにより、本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される混合物が得られる。
【００４５】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の電気泳動ゲルは、勾配分離ゲルであってもよく、ここで（任意の添加された直鎖状ポリマーの濃度は除いて）上記ポリマーの濃度は、分離ゲルの中で、一般に上記ゲル本体の上側の低濃度からゲル本体の下側の高濃度へ、変動する。このような勾配分離ゲル中の上記ポリマーの濃度範囲は、分離されるべき分子の適用、および特に大きさに依存する。特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのこのような分離ゲルは、約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配のあるポリアクリルアミド分離ゲルであってもよい。特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのこのような分離ゲルは、２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配のあるポリアクリルアミド分離ゲルであってもよい。
【００４６】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、勾配分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲルポリマーの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるポリマーの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低い。特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲルのアクリルアミドの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるアクリルアミドの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低い。他の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲル中のアクリルアミドの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるアクリルアミドの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低く、そしてこのスタッキングゲルは、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．２％または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。他の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲルのアクリルアミドの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるアクリルアミドの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低く、そしてこのスタッキングゲルは、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。別の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、４％〜１６％のポリアクリルアミド濃度を含む平板状の勾配のあるポリアクリルアミド分離ゲル、ならびに０．０５％（重量／体積）の直鎖状ポリアクリルアミドに加えて３％のポリアクリルアミド濃度を有するポリアクリルアミドスタッキングゲルを含有することができる。
【００４７】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される勾配分離ゲルはまた、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．１％、または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で存在する直鎖状ポリアクリルアミドを含有することができる。特定の実施形態では、このような勾配分離ゲルは、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．１％、または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で存在する直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。特定の実施形態では、このような勾配分離ゲルは、約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有するポリアクリルアミド勾配分離ゲルである。特定の実施形態では、このような勾配分離ゲルは、２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有するポリアクリルアミド勾配分離ゲルである。
【００４８】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのより具体的な局面では、この電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルを含み、ここで直鎖状アクリルアミドは、このスタッキングゲル中にのみ存在し、この分離ゲル中には存在しない。特定の実施形態では、このようなスタッキングゲルおよび分離ゲルはともに、ポリアクリルアミドを含むが、このスタッキングゲルのみが直鎖状アクリルアミドを含む。この分離ゲル中に直鎖状アクリルアミドを添加することは、潜在的には、この分離ゲルの透明性に影響を及ぼし得、それによってこの分離ゲル中に局在する試料バンドの検出に影響を及ぼし得る。このような影響は、「曇り効果」としても公知である。
【００４９】
特定の実施形態では、上記ポリアクリルアミドスタッキングゲルは、ポリアクリルアミド分離ゲルのアクリルアミド濃度範囲に関して、最低濃度のアクリルアミドを含有する。全アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド）濃度が約３．５％（重量／体積）未満である実施形態では、得られるポリアクリルアミドマトリクスは、破損しやすいことに加えて、スカーティングのアーチファクトをもたらすこともあり得る軟質ゲルである。このような低百分率のアクリルアミドスタッキングゲル中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有させることによって、ゲルの強度を改善することができ、そしてスカーティングのアーチファクトの発生を低減するかまたは排除することもできる。
【００５０】
上記組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、非変性ゲルである分離ゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような非変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような非変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルである。
【００５１】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、非変性ゲルであるスタッキングゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような非変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような非変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドスタッキングゲルである。
【００５２】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、非変性ゲルである分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含有することができる。特定の実施形態では、このような非変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような非変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルであり、ここでこのスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、このような非変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルである。
【００５３】
タンパク質およびタンパク質複合体を分離するために使用される非変性ゲルの例は、ブルーネイティブゲル（「ＢＮゲル」）である。このようなＢＮゲルは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９１）「Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ」 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１；Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈ，Ｃｒａｍｅｒ ＷＡ，およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９４）「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０；ならびにＳｃｈａｇｇｅｒ Ｈ（２００１）「Ｂｌｕｅ−ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６５： ２３１−２４４によって説明されている。これらの文献の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＢＮゲル中において、タンパク質は、そのタンパク質を変性することなくそのタンパク質に負電荷を付与するＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０で染色される。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０によるタンパク質のこの電荷シフトは、それらの大きさに基づいて、このような「ブルーネイティブゲル」上で分離されることをもたらす。これによって、未変性のタンパク質およびタンパク質複合体の正確な大きさの見積もりが可能となる。
【００５４】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルの特定の実施形態では、このような電気泳動ゲルは、スタッキングゲル中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有する非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲルであり、そしてタンパク質およびタンパク質複合体の分離のために使用される。他の実施形態では、ＢＮゲルを含む非変性ゲルは、約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配分離ゲルを含有する。他の実施形態では、ＢＮゲルを含む非変性ゲルは、２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配分離ゲルを含有する。さらに、このような非変性ゲルは、濃度が約１％〜約６％、約２％〜約５％、または約２．５％〜約４％のポリアクリルアミドのアクリルアミド（重量／体積）濃度を有するスタッキングゲルを含有する。さらに、このような非変性ゲルは、濃度が１％〜６％、２％〜５％、または２．５％〜４％のポリアクリルアミドのアクリルアミド（重量／体積）濃度を有するスタッキングゲルを含有する。このようなスタッキングゲルはまた、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、約０．０２％〜約０．２％、または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。特定の実施形態では、このようなスタッキングゲルはまた、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％、または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。
【００５５】
特定の実施形態では、上記分離ゲルは、勾配ゲルであってもよいが、それは直鎖状アクリルアミドを含有しない。
【００５６】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルであってもよく、ここでこのゲルは、界面活性剤、カオトロピック薬またはそれらの組合せを含有する。カオトロピック薬としては、トリフルオロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、尿素、塩化グアニジウムおよびグアニジンイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。変性作用を有する界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５７】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルである分離ゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルである。
【００５８】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルであるスタッキングゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドスタッキングゲルである。
【００５９】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルである分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含有することができる。特定の実施形態では、このような変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルであり、ここでこのスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、このような変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルである。
【００６０】
Ｂ．長さに沿って一定のプレート−プレート間隔を有するゲルカセット
本明細書中で開示される方法および組成物の別の局面は、前面プレートと背面プレートとの間に一定の内側間隙を有するゲルカセットである。図示の目的のために、図２は、中央で切り落とされたカセット（２１）を示しており、このカセットでは、背面プレート（２３）と前面プレート（２２）との間の間隙（２４）は、カセット（２７）の中央にあるカセットの上側エッジ（２５）に沿う点とカセット（２６）の外側エッジにあるカセットの上側エッジ（２５）に沿う点との間で、実質的に同一である。カセットの「前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙」は、上記ゲルを保持するカセット内の空間が、上記ゲルを含有する空間全体にわたって実質的に同一の前面−背面間深さを有することを意味する。すなわち、この空間の上側エッジ（櫛が挿入されてウェルが形成されるカセットの端部）での前面−背面間深さは、この空間の中央領域、この空間の下側領域、およびこの空間の外側エッジにおける前面−背面間深さと実質的に同一である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「実質的に同一」または「実質的に等しい」は、上記カセットの上側エッジにおける（櫛が挿入され得るカセットの端部における）プレート間の内側間隙幅が、上記カセットのエッジとそのカセットの中央領域との間の最大間隙幅の約５％より大きくは変動せず、そして好ましくは、上記カセットのエッジからカセットの中央領域までの２つのプレート間の内側幅の約２％より大きくは変動しないことを意味する。いくつかの好ましい実施形態では、前面プレートと背面プレートとの間の間隙幅は、上記カセットの頂部（または櫛が挿入されて試料ウェルが形成され得る場所に対応する、上記カセットの領域）にわたって約１％より大きくは変動しない。例えば、カセットは、厚さ１ｍｍのゲルを保持するように設計されてもよい。この厚さは、上記カセットの内側間隙幅に対応する。この場合、このカセットの内側空間の幅は、上記カセットの頂部（または櫛が挿入される場所に対応する、上記カセットの領域）にわたって約０．０５ｍｍ以下だけ、約０．０２ｍｍ以下だけ、または０．０１ｍｍ以下だけしか変動しない。別の例では、カセットは、厚さ１．５ｍｍのゲルを保持するように設計されてもよい。この場合、このカセットの内側空間の幅は、上記カセットの頂部（または櫛が挿入される場所に対応する、上記カセットの領域）にわたって約０．０７５ｍｍ以下だけ、約０．０３ｍｍ以下だけ、または０．０１５ｍｍ以下だけしか変動しない。
【００６２】
特定の実施形態では、上記ゲルカセットは、前面プレートと背面プレートとの間の内側距離がカセットの上側エッジに沿って実質的に変動しない、前面プレートと背面プレートとの間の内側間隙を有する。
【００６３】
ゲルカセットは、任意の適切な材料から構築される前面プレートおよび背面プレートを有することができ、この適切な材料としては、プラスチック、ポリマー、ガラス、セラミクス、または標準的な電気泳動条件下で流体に対して浸透性ではなく、かつ非伝導性である任意の材料が挙げられる。本明細書中で開示されるゲルカセットは、可視光に対して透明であるか、紫外線に対して透明であるか、赤外線に対して透明であるか、紫外線および赤外線の両方に対して透明であるポリマーから作製することができる。本明細書中で開示されるゲルカセットを作製するために使用されるポリマーの非限定的な例は、スチレン−アクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ベースのポリマー、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、グリコール変性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、ポリプロピレン、アセタール、およびこれらのコポリマーである。本明細書中で開示されるゲルカセットのプレートは、ゲルに面する側面が１つまたは複数のポリマー（例えば、例としてのみであるが、ラテックス）でコーティングされていてもよく、これにより電気泳動ののちゲルが取り除かれるべきときにゲルがこのプレートに固着することが防止される。本明細書中で開示されるゲルカセットまたはゲルカセットを形成するために取り付けられるプレートは、成形技術、熱エンボス加工方法、注型プロセス、熱成形方法、ステレオリソグラフィプロセス、機械加工方法および磨砕プロセスを使用して製作されてもよい。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような成形技術としては、射出成形および圧縮成形が挙げられる。
【００６４】
上記前面プレートおよび背面プレートは、任意の実行可能な手段により、互いに取り付けられてもよく（これによりゲルカセットが形成される）、この任意の実行可能な手段としては、その側面で前面プレートおよび背面プレートを連結するエッジ片とともに単一片として成形すること、一緒に溶接すること（例としてのみであるが、超音波溶接）、接着剤で一緒に固着すること、熱処理すること、または取り付け手段（ねじ、ピン、スナップ、またはクランプ）で保持することが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で開示されるゲルカセットの特定の実施形態では、カセットの前面プレートと背面プレートのいずれかまたはその両方は、例としてのみであるが、溶接によってこのカセットが取り付けられるエッジのまわりに一段高い境界を有する。この一段高い境界は、取付けられたプレート間の距離を確立するスペーサを提供する。いくつかの実施形態では、そのように設計されたプレートは、カセットのプレート間の距離を確立するスペーサの厚みが、そのカセットの上側エッジに沿ってそのカセットの外側エッジから少なくともそのカセットの中点まで実質的に同一であるような仕様で、一緒に溶接される。
【００６５】
本明細書中で開示されるゲルカセットは、任意の電気泳動システムにおいて使用される任意の大きさであり得る。一定の間隙幅を有するゲルカセットの寸法は限定的ではなく、そしてそのゲルカセットとしては、幅が約５ｃｍ〜約３０ｃｍ、長さが約５ｃｍ〜６０ｃｍ、そしてプレート厚さが１ｍｍ〜５ｍｍの前面プレートおよび背面プレートを有するカセットが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、上記ゲルカセットのプレートは、厚さ約４ｍｍ以下、厚さ３ｍｍ以下、厚さ約２．５ｍｍ以下、厚さ約２ｍｍ以下、厚さ約１．５ｍｍ以下、または厚さ１ｍｍ以下であってもよい。他の実施形態では、カセットの背面プレートは、上記ゲルを含有する領域で厚さが２．５ｍｍと３ｍｍとの間であり、そしてカセットの前面プレートは、上記ゲルを含有する領域で厚さが１．５ｍｍと２ｍｍとの間である。
【００６６】
本明細書中で開示されるゲルカセットでは、前面プレートと背面プレートとが、等しい寸法であることは必要ではない。さらに、前面プレート、背面プレート、またはその両方は、例えば例としてのみであるが、差し込まれているか湾曲しているかの外側エッジの部分を少なくとも有することにより、１つまたは複数の側面に沿って不規則な形状になっていてもよい。組立てられたカセットのプレート間の間隙幅は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約３ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約２．５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約２．５ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約１ｍｍであり得る。例示的な実施形態では、組立てられたカセットのプレート間の間隙幅は、０．１ｍｍ〜１０ｍｍ、０．１ｍｍ〜５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜３ｍｍ、０．２５ｍｍ〜２．５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜２ｍｍ、０．２５ｍｍ〜１．５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜１ｍｍ、０．５ｍｍ〜５ｍｍ、０．５ｍｍ〜３ｍｍ、０．５ｍｍ〜２．５ｍｍ、０．５ｍｍ〜２ｍｍ、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ、または０．５ｍｍ〜１ｍｍである。上記間隙幅は、上記プレートの外側エッジ（頂部および下側）に沿うプレート間のスペーサによるか、または溶接方法（例としてのみであるが、超音波溶接）、熱処理、接着剤、ガスケット、クランプ、またはファスナーを使用して一緒に固着することができるプレートの境界領域（頂部および下側）により確立することができる。特定の実施形態では、カセットプレートは、１つまたは複数のプラスチック（例えば）から作製され、そして背面プレートまたは前面プレートのうちの１つもしくはその両方は、相手のプレートに溶接または熱融着されたに一段高い境界を有する。そして、溶接プロセスは、上記カセットの溶接または熱融着されたプレート間に留まる境界領域の厚さを決定することによって、一部は、上記間隙幅を決定する。
【００６７】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの非限定的な例は、１０ｃｍ×１０ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートは厚さが約１．７５ｍｍであり、背面プレートは厚さ約２．５５ｍｍであり、この２つのプレートは、櫛が挿入されてウェルを形成することになっている領域におけるカセットの間隙幅が約１ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００６８】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの別の非限定的な例は、１０ｃｍ×１０ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートおよび背面プレートは、それぞれ、厚さが約１．７５ｍｍおよび約２．５ｍｍであり、プレートは、カセットの間隙幅が約１．５ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００６９】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの別の非限定的な例は、１５ｃｍ×１５ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートおよび背面プレートは、それぞれ、厚さが約１．７５ｍｍおよび約２．５５ｍｍであり、この２つのプレートは、櫛が挿入されてウェルを形成することになっている領域におけるカセットの間隙幅が約１ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００７０】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの別の非限定的な例は、１５ｃｍ×１５ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートおよび背面プレートは、それぞれ、厚さ約１．７５ｍｍおよび約２．５５ｍｍであり、この２つのプレートは、櫛が挿入されてウェルを形成することになっている領域におけるカセットの間隙幅が約１．５ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００７１】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットのこれらの例は、例示の目的のためのみのものであり、決して限定することを意図しているわけではない。
【００７２】
本明細書中で開示されるゲルカセットとしては、試料のローディングが起こるカセットの上側エッジにわたる一定の間隙幅を有するゲルカセットも挙げられ、ここでこの間隙幅は、約５％未満、いくつかの好ましい実施形態では、わずかに約２％以下、またはわずかに約１％以下変動する。
【００７３】
本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセットは、任意の適切なゲル形成ポリマーを含むゲルを含有することができる。そしてこのゲル形成ポリマーとしては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミドまたはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような天然ポリマーの例としては、アガロースのような多糖が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、このようなゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。
【００７４】
本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセットは、本明細書中で開示される任意のスタッキングゲルおよび／または分離ゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このゲルカセットは、本明細書中に記載されるように、直鎖状アクリルアミドを含有するゲルを含有する。スタッカー（ｓｔａｃｋｅｒ）を含有するゲル中に存在する場合は、直鎖状アクリルアミドは、このスタッカー中に存在することができ、そして分離ゲル中には存在しないことができる。代替的な実施形態では、直鎖状アクリルアミドは、このスタッカー中にも、分離ゲル中にも存在することができる。このゲルは、本明細書中で開示されるような任意のポリマー濃度を有することができ、この濃度としては、例としてのみであるが、アガロースの場合は約０．３％〜約３％、または約１％〜約３０％のアクリルアミドが挙げられる。存在する場合には、上記直鎖状アクリルアミドは、本明細書中で開示される任意の（重量／体積）濃度で存在することができ、この濃度としては、約０．００５％〜約１％および約０．０１％〜約０．５％が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセット中の分離ゲルは、本明細書中で開示されるような勾配ゲルであってもよい。本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセット中の分離ゲルは、必要に応じて、本明細書中で開示されるようなスタッキングゲルを含有することができ、ここでこのスタッキングゲルは、分離ゲル中の濃度よりも低い濃度のゲルポリマーを有する。組合せのゲルを使用する場合には、各成分の最適の濃度を、経験的に、または刊行されたプロトコルを案内役として決定することができる。
【００７５】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲルはまた、以下の、１つまたは複数の緩衝液、塩、還元剤、酸化剤、アルキル化剤、変性剤、キレート剤、ポリマーまたは界面活性剤のうちの少なくとも１つを含有することができる。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、核酸の分離のために使用されるべきゲルである。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、ポリペプチドの電気泳動のために使用されるべきゲルである。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、電気泳動の前または電気泳動のあいだタンパク質およびタンパク質複合体が変性されない、タンパク質の未変性電気泳動のために使用される。他の実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、ポリペプチドの電気泳動のために使用されるべきゲルである。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、電気泳動の前または電気泳動のあいだタンパク質およびタンパク質複合体が変性されず、しかも上記ゲルおよび上記ランニング緩衝液が変性剤（例えば、変性作用を有する界面活性剤、尿素、ホルムアミド、カオトロープなどが挙げられるが、これらに限定されない）を含有しない、タンパク質の未変性電気泳動のために使用される。非限定的な例では、ブルーネイティブゲルは、本明細書中に記載される一定の内側間隙幅を有するカセットにおいて使用される。特定の実施形態では、ブルーネイティブゲルは、スタッキングゲルを有する。他の実施形態では、ブルーネイティブゲルは、直鎖状アクリルアミドを含有するスタッキングゲルを有する。
【００７６】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液は、任意の電気泳動緩衝液であってよく、その例としては、双性イオン性の緩衝液が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において５と９との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において６と８．５との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において６と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において６と７との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において７と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において５と９との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において６と８．５との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において６と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において７と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において６と７との間のｐＨを有する。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液は、周囲温度において約５と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約６と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約６と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約６と約７との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約７と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約５と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約６と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約６と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約６と約７との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約７と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。
【００７８】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液としては、スクシネート、シトレート、ボレート、マレエート、カコジレート、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（Ｔｒｉｓ）、トリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、グリシン、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス（ＢｉｓＴｒｉｓ））またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このようなゲル緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有することができる。
【００７９】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ〜約１．５Ｍであり得る。特定の実施形態では、その濃度は約１０ｍＭと約１Ｍとの間であり得る。特定の実施形態では、その濃度は約２０ｍＭと約５００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭと約３００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約１０ｍＭと約２００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約１０ｍＭと約５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭと約２００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭと約５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約５ｍＭと約２００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約５ｍＭと約５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約５ｍＭと約１Ｍとの間であり得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液の濃度は、１０ｍＭ〜１．５Ｍであり得る。特定の実施形態では、その濃度は１０ｍＭと１Ｍとの間であり得る。特定の実施形態では、その濃度は２０ｍＭと５００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は５０ｍＭと３００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は１０ｍＭと２００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は１０ｍＭと５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は５０ｍＭと２００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は５０ｍＭと５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は５ｍＭと２００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は５ｍＭと５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は５ｍＭと１Ｍの間であり得る。
【００８０】
種々のゲルカセットが、米国特許第７，１２２，１０４号、同第６，５６２，２１３号、同第５，５８２，７０２号、同第５，８６５，９７４号、同第６，３７９，５１６号、米国特許出願第１１／４７０，３０８号および同第１０／０５６，０５０号に記載されている。これらの特許および特許出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。このようなカセット（マルチウェル型カセットが挙げられるが、これに限定されない）は、本明細書中で開示される電気泳動ゲルを含有することができ、そして本明細書中に記載される組成物および方法において使用することができる。
【００８１】
本明細書中に記載される電気泳動ゲルは、試料（分離している生体分子が挙げられるが、これに限定されない）の構成成分を分離するために使用することができる。このような電気泳動ゲル上で試料成分を分離する方法は、１つまたは複数の試料を電気泳動ゲルに適用する工程、およびこの電気泳動ゲル上で試料成分を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を分離ゲルを含む電気泳動ゲルに適用する工程、およびこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、直鎖状ポリアクリルアミドを含む分離ゲルを含む電気泳動ゲルに適用する工程、およびこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含む電気泳動ゲルに適用する工程、ならびにこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、直鎖状ポリアクリルアミドを含むスタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含む電気泳動ゲルに適用する工程、ならびにこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の他の実施形態では、このような方法としては、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲルおよび分離ゲルの両方が直鎖状ポリアクリルアミドを含むスタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含有する電気泳動ゲルに適用し、そしてこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離することが挙げられるが、これに限定されない。
【００８２】
上記スタッキングゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む本発明の方法を実行する際には、分離ゲル上でのスカーティングバンドの出現が低減される。上記分離ゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む本発明の方法を実行する際には、分離ゲル上でのスカーティングバンドの出現が低減される。上記スタッキングゲルおよび上記分離ゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む本発明の方法を実行する際には、分離ゲル上でのスカーティングバンドの出現が低減される。「低減される」という表現は、同一条件下で実行され、そして（直鎖状ポリアクリルアミドを有することを除いて）同一組成を有する場合に、スカーティングバンドの外観、強度、または幅が、直鎖状ポリアクリルアミドを含まない電気泳動ゲル中よりも、直鎖状ポリアクリルアミドを有する電気泳動ゲル上でのほうがより少ないことを意味する。
【００８３】
このような方法において使用されるゲルは、本明細書中に記載される任意の電気泳動ゲルであることができる。特定の実施形態では、そのゲルはポリアクリルアミドゲルである。他の実施形態では、そのゲルはアガロースゲルであるが、他方、他の実施形態では、そのゲルはアクリルアミドおよびアガロースの両方を含む。このような方法において使用されるゲルは、本明細書中で開示される変性ゲルであってもよく、その例としては、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルが挙げられるが、これに限定されない。このような方法において使用されるゲルは、本明細書中で開示される非変性ゲルであってもよく、その例としては、ブルーネイティブ（ＢＮ）ゲルが挙げられるが、これに限定されない。このような方法において使用される分離ゲルは、任意の適切な組成を有していてよい。いくつかの実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。他の実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有しない。特定の実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルはポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、ポリアクリルアミドおよび直鎖状ポリアクリルアミドの両方を含む。いくつかの実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、勾配ゲルである。特定の実施形態では、このような方法において使用される電気泳動ゲルは、マルチウェル型ゲルであり、そこでは２つ以上の試料、１つまたは複数の試料、または同一の試料の多数回のローディングが同時に電気泳動される。特定の実施形態では、このような方法において使用される電気泳動ゲルは、マルチウェル型ゲルであり、そこでは２つ以上の試料、１つまたは複数の試料、または同一の試料の多数回のローディングとともに１つまたは複数の分子量標準が同時に電気泳動される。
【００８４】
本明細書中で開示される方法において使用される未変性ゲルまたは非変性ゲルは、上記ゲル中またはランニング緩衝液の中を、変性剤（例えば、タンパク質変成作用を有する界面活性剤、またはカオトロープのようなもの）なしで実行される。本明細書中で開示される方法において使用される未変性ゲルとしては、ブルーネイティブ（ＢＮ）ゲルが挙げられるが、これに限定されない。陰極緩衝液、タンパク質試料緩衝液、またはその両方がＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０を含有するブルーネイティブゲルを使用することは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９１）「Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１；Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈ，Ｃｒａｍｅｒ ＷＡ，およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９４）「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０；ならびにＳｃｈａｇｇｅｒ Ｈ（２００１）「Ｂｌｕｅ−ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：２３１−２４４に記載されている。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０は、タンパク質とその未変性状態で結合し、それによりそのタンパク質に負電荷を付与する。負に帯電したＣｏｏｍａｓｓｉｅで染色されたタンパク質は、次いで、その電荷および分子量に比例した速度で陽極に移動する。
【００８５】
本明細書中に記載される電気泳動ゲル上で、そして本明細書中に記載される方法を使用して分離される生体分子は、任意の生体分子（タンパク質、核酸、多糖、脂質、および他の高分子が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される電気泳動ゲル上で、そして本明細書中に記載される方法を使用して分離される生体分子は、タンパク質、核酸、またはタンパク質もしくは核酸を含有する生体分子複合体である。例としてのみであるが、このような生体分子複合体は、会合したタンパク質、ペプチド、核酸および多糖の任意の組合せであり得る。例示的な実施形態では、上記ゲルのスタッキング部分に直鎖状ポリアクリルアミドを含む電気泳動ゲル上で分離される生体分子または複合体は、タンパク質またはタンパク質を含有する分子複合体である。特定の実施形態では、上記電気泳動ゲルは、少なくとも２つの標準の電気泳動のため、または少なくとも１つの試料と少なくとも１つの分子量標準の電気泳動のための２つ以上のウェルを有する。例示的な実施形態では、本明細書中で開示されるような一定の内部間隙を有するゲルカセット中に含有される電気泳動ゲル上で分離される生体分子または複合体は、タンパク質またはタンパク質を含有する分子複合体である。
【００８６】
上記電気泳動ゲルに適用された、１つまたは複数の試料、または同一の試料の２つ以上の複製物は、生体分子を含有する任意の試料であり得、そして環境試料、組織試料、細胞抽出物または画分であり得る。この試料は、溶菌液、分画された試料、あるいは部分的にかもしくは実質的に加工されたかまたは精製された試料のような、粗試料であってもよい。電気泳動ゲル上のローディングの前に、試料を、可溶化剤、還元剤、変性剤もしくは処理剤、界面活性剤、カオトロピック薬、または他の試料調製剤で処理することができる。ブルーネイティブゲルでの電気泳動の場合には、タンパク質およびタンパク質複合体は、電気泳動の前に変性されないが、これらを、例えば、非変性界面活性剤のような可溶化剤に曝露してもよい。
【００８７】
本明細書中に記載される方法、ゲルおよびゲルカセットは、生体分子および／または生体分子複合体を電気泳動により分離するために使用することができる。しかしながら、一般的な電気泳動法およびパラメータ（例えば、試料のローディングおよび電気泳動の実行時間）は、当業者に公知であり、そして十分に当業者の能力の範囲内である。さらに、電気泳動の間、ゲルアセンブリ、ゲルカセットおよびランニング緩衝液を保持するように設計された装置は、当業者には周知であり、広く市販されている。このような装置としては、ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられるが、これに限定されない。このような装置は、本明細書中に記載される方法、ゲルおよびゲルカセットとともに使用することができる。
【００８８】
しかしながら、電気泳動の条件は、当該分野で公知のプロトコルに基づいて、従事者により決定され得る。本明細書中で開示される電気泳動分離は、一定電圧、パルス電圧、段階勾配電圧、一定電流、パルス電流、段階勾配電流、一定電力、段階勾配電力またはパルス電力を使用して達成することができる。次いで、本明細書中で開示された方法における印加電場（Ｖ／ｃｍ）は、一定でもパルス型であってもよい。以下に提供される電場範囲を達成するための印加電圧、印加電流または印加電力の強さは、上記電気泳動カセットの寸法および緩衝液の伝導率に依存して変動することが理解される。例としてのみであるが、この印加電圧は、５Ｖ〜２０００Ｖの範囲に及ぶことができ、特定の実施形態では、この印加電圧は、５Ｖ〜１０００Ｖ、５Ｖ〜５００Ｖ、５Ｖ〜２５０Ｖ、または５Ｖ〜１００Ｖの範囲に及ぶことができる。他の実施形態では、この印加電圧は、約１０Ｖ〜約１，０００Ｖ、約２５Ｖ〜約７５０Ｖ、または４０Ｖ〜３００Ｖの範囲に及ぶことができる。例としてのみであるが、上記印加電流は、５ｍＡ〜４００ｍＡの範囲に及ぶことができ、特定の実施形態では、上記印加電流は、５ｍＡ〜２００ｍＡ、５ｍＡ〜１００ｍＡ、５ｍＡ〜５０ｍＡ、または５ｍＡ〜２５ｍＡの範囲に及ぶことができる。１つの実施形態では、印加電流は、１５ｍＡとすることができる。例としてのみであるが、上記印加電流は、５ｍＡ〜４００ｍＡの範囲に及ぶことができ、特定の実施形態では、上記印加電力は、２５ｍＷ〜４００Ｗ、２５ｍＷ〜１００Ｗ、２５ｍＷ〜５０Ｗ、または２５ｍＷ〜２５Ｗの範囲に及ぶことができる。１つの実施形態では、印加電力は、４．５Ｗすることができる。さらに、上記印加電圧（一定またはパルス型）の極性は、正であっても負であってもよく、上記印加電流（一定またはパルス型）の極性は、正であっても負であってもよい。
【００８９】
特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１００Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと５０Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと２５Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１５Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１０Ｖ／ｃｍとの間である。
【００９０】
段階勾配電圧の印加のために、段階プロフィールは、１段階、２段階または２段階より多くてもよい。この段階電圧は、ベースライン電圧を印加することにより確立される、一定のベースラインの電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜１０００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜５００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜２００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜１００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜５０Ｖであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜１０Ｖである。このベースライン電圧に印加される電圧段階の強さは、１０Ｖ〜２０００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、この電圧段階は、１０Ｖ〜１０００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電圧に印加される電圧段階の強さは、１０Ｖ〜５００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、この電圧段階の強さは、１０Ｖ〜２００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電場に印加される電圧段階の強さは、１０Ｖ〜１００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、この電圧段階の強さは、１０Ｖ〜５０Ｖである。多段階（例えば、２段階以上）のために、各段階の強さは、対称的（すなわち、同一）とすることができ、または各段階の強さは、非対称的（すなわち、異なる）とすることができる。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の５０Ｖの段階が印加され、次いで別の５０Ｖの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の５０Ｖの段階が印加され、次いで４５０Ｖの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の５０Ｖの段階が印加され、次いで５００Ｖの段階が印加される。他の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の７５Ｖの段階が印加され、次いで１７５Ｖの段階が印加される。他の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の７５Ｖの段階が印加され、次いで２５０Ｖの段階が印加される。１段階は、または多段階勾配の各段階は独立して、上記印加電圧の強さに依存して、約５分間〜約５００分間、実行され得る。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１５０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１００分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約６０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約３０分とすることができる。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は４５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６５分間印加される。
【００９１】
段階勾配電流プロフィールの印加のために、段階プロフィールは、１段階、２段階または２段階より多くてもよい。この段階電流は、ベースライン電流を印加することにより確立される、一定のベースラインの電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜１０ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜５ｍＡである。特定の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜２ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜１ｍＡである。特定の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜０．５ｍＡである。ベースライン電流に印加される電流段階の強さは、０．５ｍＡ〜１００ｍＡとすることができるが、他方、他の実施形態では、この電流段階は、０．５ｍＡ〜５０ｍＡである。特定の実施形態では、ベースライン電流に印加される電流段階の強さは、０．５ｍＡ〜２５ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、この電流段階は、０．５ｍＡ〜１０ｍＡである。特定の実施形態では、ベースライン電流に印加される電流段階の強さは、０．５ｍＡ〜５ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、この電流段階は、０．５ｍＡ〜２ｍＡである。多段階（例えば、２段階以上）のために、各段階の強さは、対称的（すなわち、同一）とすることができ、または各段階の強さは、非対称的（すなわち、異なる）とすることができる。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階電流電流プロフィールでは、０ｍＡベースラインに最初の７ｍＡの段階が印加され、次いで別の７ｍＡの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電流プロフィールでは、０ｍＡベースラインに最初の１ｍＡの段階が印加され、次いで１４ｍＡの段階が印加される。１段階は、または多段階勾配の各段階は独立して、上記印加電流の強さに依存して、約５分間〜約５００分間、実行され得る。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１５０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１００分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約６０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約３０分とすることができる。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は４５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６５分間印加される。
【００９２】
段階勾配電力プロフィールの印加のために、段階プロフィールは、１段階、２段階または２段階より多くてもよい。この段階電流は、ベースライン電力レベルを印加することにより確立される、一定のベースライン電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜１０Ｗであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜５Ｗである。特定の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜２Ｗであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜１Ｗである。特定の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜０．５Ｗである。ベースラインに印加される電力段階の強さは、０．５Ｗ〜１０Ｗであってよいが、他方、他の実施形態では、この電力段階は、０．５Ｗ〜５Ｗである。特定の実施形態では、ベースラインに印加される電力段階の強さは、０．５Ｗ〜２Ｗであってよいが、他方、他の実施形態では、この電力段階の強さは、０．５ｍＡ〜１Ｗである。多段階（例えば、２段階以上）のために、各段階の強さは、対称的（すなわち、同一）とすることができ、または各段階の強さは、非対称的（すなわち、異なる）とすることができる。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｗベースラインに最初の１．５Ｗの段階が印加され、次いで別の１．５Ｗの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０ｍＡベースラインに最初の０．５Ｗの段階が印加され、次いで３Ｗの段階が印加される。１段階は、または多段階勾配の各段階は独立して、上記印加電流の強さに依存して、約５分間〜約５００分間、実行され得る。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１５０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１００分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約６０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約３０分とすることができる。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は４５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６５分間印加される。
【００９３】
パルス型電場（印加電圧、電流または電力）のプロフィールは、矩形波、三角波または正弦波であってよく、このようなプロフィールは、対称的または非対称的であってよい。パルス型電場は、一定ベースライン電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１００Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと５０Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと２５Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１０Ｖ／ｃｍとの間である。
【００９４】
対称的な矩形波であるパルス型電場について、ベースライン電場に加えてこのパルス型電場が印加される（オン）時間は、このパルス型電場が印加されない（オフ）時間と同一である。特定の実施形態では、オン時間およびオフ時間は、１ｍｓと６０秒との間である。非対称的な矩形波であるパルス型電場について、ベースライン電場に加えてこのパルス型電場が印加される（オン）時間は、このパルス型電場が印加されない（オフ）時間と同一ではない。特定の実施形態では、オン時間は、独立に１ｍｓと６０秒との間であり、そしてオフ時間は、独立に１ｍｓと６０秒との間である。
【００９５】
対称的な三角波であるパルス型電場について、印加される最大電場までの電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）は、電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）が印加されるベースライン電場まで下がる時間と同一である。特定の実施形態では、上向きの電圧傾斜および下向きの電圧傾斜は、１０ｍＶ／ｓと１００Ｖ／ｓとの間である。非対称的な三角波であるパルス型電場について、印加される最大電場までの電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）は、電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）が印加されるベースライン電場まで下がる時間と同一ではない。特定の実施形態では、上向きの電圧傾斜は、独立に１０ｍＶ／ｓと１００Ｖ／ｓとの間であり、そして下向きの電圧傾斜は、独立に１０ｍＶ／ｓと１００Ｖ／ｓとの間との間である。
【００９６】
対称的な正弦波であるパルス型電場について、周期および周波数は一定であり、この正弦波の最少電場は、印加されるベースライン電場と同一である。非対称的な正弦波であるパルス型電場について、周期および周波数は変調され、この正弦波の最少電場は、印加されるベースライン電場と同一である。
【００９７】
本明細書中で開示される方法の電気泳動の行程は、室温、周囲温度、またはより高温もしくはより低温で実施することができる。例としてのみであるが、使用者が、予め冷却された緩衝液を用いて冷蔵室で、または予め冷却された緩衝液を用いて室温でゲルを実行することが望ましいかも知れない。特定の実施形態では、上記電気泳動の行程は、より低温で実施される。このより低温としては、約１℃〜約１０℃の温度が挙げられるが、これらに限定されない。低温での行程について、その行程の最後により高い電圧でゲルを実行することが好ましい場合があり得る。
【００９８】
本明細書中で開示される方法はまた、生体分子を含む電気泳動されたゲル上で１つまたは複数のバンドを検出する工程を包含する。１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体は、当該分野で周知の技術を使用して、電気泳動の前、電気泳動の間、電気泳動の後に染色するかまたは標識することができる。これらのバンドは、ライトボックス、スキャナーを使用して、または特別の設備を用いずに裸眼で観察することができる。必要に応じて、試料の１つまたは複数のバンドの移動距離を定量することができる。必要に応じて、１つまたは複数の試料とともにゲル上で１つまたは複数の組の分子量マーカーを電気泳動に適用することにより、分子量マーカーを、試料が電気泳動されるのと同一のゲル上で電気泳動することができる。試料に由来する１つまたは複数のバンドの分子量は、そのバンドの移動を分子量マーカーの１つまたは複数のバンドの移動と比較することにより、見積もるかまたは計算することができる。この１つまたは複数のバンドは、例えば、タンパク質、タンパク質複合体、核酸、または核酸−タンパク質複合体を表すことができる。
【００９９】
上記電気泳動ゲル中で上記試料バンドを可視化することは、その分離ゲルを適切な波長の光で照らして、その試料バンドと会合した色素、染色剤または他の指示薬の観察を可能にすることにより達成される。本明細書中で開示される方法において使用される可視化方法の特定の実施形態では、色素、染色剤または他の指示薬は、上記電気泳動ゲル中のローディングの前に上記試料に添加される。他の実施形態では、上記色素、染色剤または他の指示薬は、上記試料を上記電気泳動ゲルのローディングウェルに添加する前にローディングウェルに添加されるが、他方、他の実施形態では、上記色素、染色剤または他の指示薬は、上記試料を上記電気泳動ゲルのローディングウェルに添加した後にローディングウェルに添加される。あるいは、本明細書中で開示される方法において使用される可視化方法の特定の実施形態では、色素、染色剤または他の指示薬は、上記電気泳動ゲルに添加される。これにより、それらは、電気泳動による移動の間に試料成分と会合するようになる。本明細書中で開示される方法において使用される可視化方法のさらに他の実施形態では、色素、染色剤または他の指示薬は、試料成分に共有結合で結びつけられる。
【０１００】
可視化のために使用されるシステム、色素および染色剤は、蛍光性であってもよく、または非蛍光性であってもよい。本明細書中で開示される方法において使用されるシステム、色素および染色剤の非限定的な例は、銀染色またはＣｏｕｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色である。
【０１０１】
可視化のために使用される光は、単色性であっても多色性であってもよい。例としてのみであるが、多色性光は、白色光、ＵＶ光または赤外光であってよく、他方、単色光は、レーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用するか、または白色光、ＵＶ光または赤外光のような光源から特定の分光学的フィルタリングにより、達成することができる。このような単色光の所望の波長は、使用される色素または染色剤の特定の分光特性に依存し、そして当業者は、このような単色光を入手するための方法を知っていることが理解される。
【０１０２】
特定の実施形態では、可視化は、独立型の「ライトボックス」中で実施される。このライトボックスの中に、上記試料の電気泳動による分離の間または後に、上記電気泳動カセットが置かれる。このようなライトボックスの中で、上記電気泳動カセットは、上から、または下から照らされる。ＣＣＤカメラもしくはビデオカメラを使用すること、または使用者の直接観察により、モニタリングすることができる。このような可視化の他の実施形態では、モニタリング手段（ＣＣＤカメラもしくはビデオカメラ、または直接観察）および電場を印加するための手段が１つの装置に組み合わされている電気泳動／モニタリング装置が使用される。
【０１０３】
図１は、直鎖状アクリルアミドをスタッカー中に含有するゲルおよび直鎖状アクリルアミドをスタッカー中に含有しないゲル上でのタンパク質およびタンパク質複合体の電気泳動による分離を比較する。使用した電気泳動ゲルは、直鎖状アクリルアミドをスタッキングゲル中に含まない（上側ゲル）、または０．０５％の直鎖状アクリルアミドをスタッキングゲル中に含む（下側ゲル）３〜１２％ブルーネイティブ勾配ゲルであった。ゲルを、５０ｍＭ ビストリス、５０ｍＭ トリシンランニング緩衝液（陰極緩衝液においてのみ、０．０２％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０）を使用して、９０分間、１５０Ｖで実行し、そしてコロイド状Ｃｏｏｍａｓｓｉｅで染色した。レーン１、５および１０に、５ｕＬの未染色の未変性標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をロードし、レーン２、４、７および９に１％ドデシルマルトシド中に可溶化したウシのミトコンドリア抽出物４ｕＬをロードした。矢印は、スカーティングアーチファクト（上側ゲルにのみ存在する）を示す。直鎖状アクリルアミドをスタッキングゲル中に含まない電気泳動ゲルで観察されるように、スタッキングゲル中に直鎖状アクリルアミドが存在すると、スカーティング効果が低減される。
【０１０４】
実施例
実施例１：未変性タンパク質／タンパク質複合体のゲル電気泳動
ゲルおよびカセット：
ビストリス−Ｃｌ、ｐＨ ７．０および０．３ｍＭ ＣＨＡＰＳ界面活性剤中にアクリルアミド／ビスアクリルアミドを２５．５：１で含む、３〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを注ぎこんだ。スタッカーは、３％のアクリルアミド／ビスアクリルアミド（２５．５：１の比）、および０．０５％ 重量／体積の直鎖状アクリルアミド（６００，０００〜１，０００，０００ダルトン）であった。第１のゲルを、上側エッジに沿ったカセットの中央における間隙の測定値が０．９２３ｍｍであるカセットに注ぎ、そして第２のゲルを、上側エッジに沿ったカセットの中央において０．９９１ｍｍの間隙を有するカセットに注いだ。これらのカセットの左側エッジおよび右側エッジにおけるプレート間間隙は、１．０１ｍｍと１．０２ｍｍとの間であった。それゆえ、この第１のゲルカセットは、この第２のゲルカセットと比較してより狭い中央領域を有する。
【０１０５】
試料調製：
ウシのミトコンドリアを、以前（Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｍ．およびＲｉｃｋｗｏｏｄ Ｄ．の編集による「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中の１０７−１１５頁、Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｅ．およびＬｉｎｄｓａｙ，Ｊ．Ｇ．（２００２）「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」）に記載されたとおりに単離した。ＴＥＳＳ緩衝液（２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭ スクシネート、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４℃においてｐＨ７．８）中に単離されたミトコンドリアを、２５０ｕＬのアリコートで−８０℃で保存した。アリコートを氷上で解凍してから、１％ ドデシルマルトシドまたは２％ ジギトニン、５０ｍＭ ビストリス−ＣＬ、ｐＨ，７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％重量／体積 グリセロールおよび０．００１％ Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓを含有する、冷たい１×試料緩衝液中でミトコンドリアタンパク質を抽出した。黄色いピペット先を通して吸上げ吸出しすることにより、そして上下反転させることにより、ミトコンドリアを緩衝液中に溶解した。氷上で１５分間インキュベーションしたのち、ミトコンドリア抽出物を、４℃、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清をアリコートに分けて、使用するまで−８０℃で保存した。上記ゲルにロードする前に、５％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０および２０．１％ ＮＤＳＢ２０１を含有する５％ Ｇ−２５０試料添加物を、Ｇ−２５０の最終濃度が上記試料中の界面活性剤濃度の１／４であるように、上記試料に添加した。５％ Ｇ−２５０試料添加物を、試料が氷上にある間であって、ゲルにロードする直前に上記試料に添加した。界面活性剤を含有しない試料については、５％ Ｇ−２５０試料添加物を使用しなかった。
【０１０６】
ＩｇＭ、アポフェリチン、Ｂ−フィコエリトリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミンおよびダイズトリプシンインヒビターを含む、５マイクロリットルの未染色の未変性タンパク質標準を、上記ゲル上の分子量マーカーとして使用した。
【０１０７】
Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（商標）ゲル上への試料のローディング：
櫛およびテープを取り除き、次いで試料ウェルを陰極緩衝液で１回リンスし、次いで陰極緩衝液でこの試料ウェルを再び満たすことにより、試料の適用のための未変性のゲルを調製した。試料を、ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の外側か、そのミニセルの中かのいずれかで、上記ゲル上へロードし、その後ランニング緩衝液を添加した。その試料を、できるだけ薄い層で上記ウェルの底部に試料を送達することにより陰極の下にその試料を置くことによって、試料をロードした。上記ゲル上へ試料をロードするのと電気泳動を開始するのとの間の時間を最少にすることにも心掛けた。
【０１０８】
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ゲルのランニング：
ランニング緩衝液を、以下の表に示すとおりに調製した。
【０１０９】
（表１）未変性ゲル電気泳動のためのランニング緩衝液
２０×ランニング緩衝液は、１Ｍ ビストリス、１Ｍ トリシン、ｐＨ ７．５〜７．６５であった。陰極添加剤は０．４％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０の水溶液であった。
【０１１０】
使用した陰極緩衝液の型は、実施した適用に応じて変更した。表２は、使用した種々の陰極緩衝液を詳細に示す。例としてのみであるが、濃青色の陰極緩衝液は、０．０２％のＧ−２５０を含有しており、そして、図３に示すように、それを界面活性剤を含有する試料を使用した未変性電気泳動行程で使用した。０．００２％ Ｇ−２５０を含有する淡青色の陰極緩衝液を、試料が界面活性剤を含有しない場合、または濃青色の陰極緩衝液が下流の適用と干渉する場合の未変性電気泳動行程で使用した。淡青色の陰極緩衝液を使用することで利益を得る下流の適用は、ウエスタンブロット法、銀染色、および二次元未変性ＳＤＳ ＰＡＧＥである。淡青色の陰極緩衝液を必要とする下流プロセッシングのために意図した、界面活性剤を含有する試料の未変性電気泳動行程については、この行程を濃青色の陰極緩衝液を用いて開始し、色素移動前線がそのゲルの下の１／３となったのちに、その行程を休止し、この濃青色の陰極緩衝液を血清ピペットで取り除き、そして名青色の陰極緩衝液に置換してからその行程を再開した。
【０１１１】
（表２）未変性ゲル電気泳動のための陰極緩衝液
【０１１２】
電気泳動を１５０Ｖで実施した。電流限界を、ゲル１つあたり１５ｍＡにセットした。室温の緩衝液を用いて室温で実行する場合、３〜１２％のゲルに対する実行時間は、代表的には９０〜１００分であり、４〜１６％のゲルに対する実行時間は、代表的には１０５〜１２０分であった。
【０１１３】
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ゲルの染色：
未変性ゲルのランニング後は、そのゲルは深い青色であり、いくつかの非常にタンパク質に富んだバンドが目で見えた。しかし、このゲルのさらなる染色が必要であった。この行程の最後では、すべてのタンパク質は、未だ、未変性の折り畳まれた状態にあり、そして最も鋭敏な染色を提供するために、そのタンパク質を少なくとも部分的に変性して、以下の方法に従う色素結合のために、より疎水的な部位を曝露させた。
【０１１４】
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０長期プロトコル、高感度染色：
上記ゲルを、１００ｍＬの定着液（４０％メタノール、１０％酢酸）中に置き、４５秒間、マイクロ波処理して、１５〜３０分間振盪した。この定着ステップを、３〜１２％ゲルについては１回繰返した。この定着液を傾瀉し、そして１００ｍＬの染色溶液をＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ；５５ｍＬ 水、２０ｍＬ メタノール、２０ｍＬ 染色剤Ａ、５ｍＬ 染色剤Ｂ）から添加し、そしてこのゲルを浸透しながら一晩インキュベーションした。染色溶液を傾瀉し、そして１００ｍＬの８％酢酸を添加した。このゲルを、攪拌しながら５分間インキュベーションした（これにより、ゲルまたは染色容器の表面上に沈殿した任意のＧ−２５０が取り除かれる）。次いで、この酢酸を傾瀉し、そして１００ｍＬの蒸留水を添加して、所望のバックグラウンドレベルが得られるまでこのゲルを振盪した。
【０１１５】
図３は代表的な結果を示しており、図３は、上側の間隙の測定値と類似の中央の間隙の測定値を備えたカセットが、スカーティングがないゲルを生成したが、他方で、上側の間隙の測定値よりも有意に小さい中央の間隙の測定値を備えたカセットが、スカーティングゲルを生成したことを示す。ゲルＡにおけるスカーティングアーチファクトを、矢印で示す。
【０１１６】
本発明が例示的な実施形態と関連させて開示されたが、本発明の範囲を示された特定の形態に限定することは意図されておらず、逆に、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の趣旨および範囲内に包含され得るような代替物、改変物、および等価物を網羅することが意図されている。
【０１１７】
上記の説明は本発明の例示にすぎないことを理解するべきである。見出しは便宜のためのみであり、見出しのもとに入る開示をその見出しのみに限定することは意図されていない。種々の代替物および改変物が、本発明から逸脱することなく当業者によって考案され得る。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るすべてのそのような代替物、改変物および変態物を包含することが意図されている。
【０１１８】
本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個別の刊行物、特許および特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されると示されたのと同程度に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】スタッキングゲル中に０．０５％の直鎖状アクリルアミドを含まないで（上側ゲル）、または含んで（下側ゲル）作製した３〜１２％ブルーネイティブ勾配ゲルを示す。
【図２】中央で切り落とされたカセット（２１）の模式図を示し、この図においてこのカセットは、前面プレート（２２）および背面プレート（２３）、ならびにその間の間隙（２４）を有する。
【図３】プレート間に一定の間隙幅を有さなかったカセット中で実行されたゲル上（Ａ）、ならびにプレート間に一定の間隙幅を有したカセット中で実行されたゲル上（Ｂ）で分離された試料のタンパク質／タンパク質複合体およびマーカータンパク質を図示する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、「ポリアクリルアミドゲル上で分離される生体分子の分解能を改善するための組成物および方法」と題する、２００５年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／７５４，３２８号、および「ポリアクリルアミドゲル上で分離される生体分子の分解能を改善するための組成物および方法」と題する、２００６年１月２４日出願の米国特許仮出願第６０／７６１，３４２号に対する優先権の恩典を主張する。これらの特許出願の各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、電気泳動ゲルにおけるスカーティング（ｓｋｉｒｔｉｎｇ）効果を最少にするための電気泳動方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
ゲル電気泳動は、生体分子および分子複合体の分離、特性解析ならびに同定におけるその有用性から、生化学、分子生物学、および細胞生物学の基本的な技術となっている。ゲル電気泳動を最適に使用するためには、生体分子を高分解能で分離することが必要である。ゲル電気泳動を採用する生化学者が直面する１つの問題は、「スカーティング」である。これは、そのゲル上にロードされた試料の分子が、そのゲル自体を通ってではなく、そのゲルとゲルプレートとの間を移動することである。このことが起こると、そのゲル内で移動する生体分子または複合体の主要バンドよりも、素早く移動する影バンドが現れることになる。これによって、そのゲルの像が分析されるときの曖昧さが生み出される。なぜなら、そのようなバンドがアーチファクトであるのか、または存在量の少ない生体分子もしくは複合体の結果であるのかを知ることは困難だからである。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本明細書中に提供されるのは、ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するための電気泳動ゲル、カセットおよび方法である。例示的な実施形態では、本明細書中で提供される電気泳動ゲル、カセットおよび方法は、非変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用することができる。また、本明細書中で提供されるのは、変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用される電気泳動ゲル、カセットおよび方法である。
【０００５】
１つの局面では、本明細書中で提供されるのは、生体分子の分離のための電気泳動ゲルである。この電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルを有し、そしてこのスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。このような電気泳動ゲルの１つの実施形態では、この電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、上記スタッキングゲルおよび分離ゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、そしてこのスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このスタッキングゲルのアクリルアミド濃度は、約２％と約６％との間であるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルのアクリルアミド濃度は約２．５％と約５％との間である。さらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度は約０．００５％〜約１％であるが、さらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度は約０．０１％〜約０．５％である。なおさらなるまたは代替的な実施形態では、上記スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度は約０．０２％〜約０．１％である。他の実施形態では、上記分離ゲルは、直鎖状アクリルアミドを含まない。
【０００６】
この局面の他の実施形態では、上記電気泳動ゲルは、変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような変性ゲルは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する。
【０００７】
この局面の他の実施形態では、上記電気泳動ゲルは非変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、非変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような非変性ゲルは勾配ゲルであるが、他方、特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブ（Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ）ゲルである。
【０００８】
本明細書中で提供される別の局面は、電気泳動ゲル上で生体分子を分離するための方法である。このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲル部分および分離ゲル部分を備える電気泳動ゲルに適用する工程、ならびに次いでこの１つまたは複数の生体分子をこの電気泳動ゲル上で電気泳動により分離する工程を包含する。このスタッキングゲル部分は、直鎖状ポリアクリルアミドを含む。この局面の１つの実施形態では、上記分離ゲルは、直鎖状アクリルアミドを含まない。
【０００９】
この局面のさらなるまたは代替的は実施形態では、上記電気泳動ゲルは、変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような変性ゲルは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する。
【００１０】
この局面の他の実施形態では、上記電気泳動ゲルは非変性ゲルであるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、この電気泳動ゲルは、非変性ゲルであるポリアクリルアミドゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような非変性ゲルは勾配ゲルであるが、他方、特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブゲルである。
【００１１】
この局面の他の実施形態では、上記方法はまた、１つまたは複数の分子量マーカーセットを上記電気泳動ゲルに適用する工程を包含し、そしてさらなるまたは代替的な実施形態では、このような方法はまた、電気泳動ゲル上の電気泳動された１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程を包含する。
【００１２】
本明細書中で提供される別の局面は、ゲル電気泳動を実施するためのカセットである。このカセットは、その断面にわたって一定の間隙幅を有する。この局面の特定の実施形態では、このようなカセットは、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。この局面の特定の実施形態では、このようなカセットは、０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットの間隙幅は、５％未満で変動し、他の実施形態では、このようなカセットの間隙幅の変動は、２％以下である。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットは、ポリアクリルアミドゲルを含有する。他の実施形態では、このようなカセットは、非変性ゲル電気泳動を実施するために使用され、そしてこのゲルは非変性ゲルである。特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットに含有されるゲルは勾配ゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような勾配ゲルは、ポリアクリルアミド勾配ゲルである。
【００１３】
この局面のさらなるまたは代替的な実施形態では、このカセットはプラスチックから製作されるが、他方、さらなるまたは代替的な実施形態では、このプラスチックカセットは、前面プレートを背面プレートに一緒に溶接することにより製作される。さらなるまたは代替的な実施形態では、この前面プレートを背面プレートに溶接することで、一定の間隙幅をもったカセットが作り出される。
【００１４】
本明細書中に提供される別の局面は、電気泳動ゲル上で生体分子を分離するための方法である。この方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、一定の間隙幅をもったカセット中に含有される電気泳動ゲルに適用する工程、ならびに次いでこの１つまたは複数の生体分子をこの電気泳動ゲル上で電気泳動により分離する工程を包含する。
【００１５】
この局面の１つの実施形態では、このカセットは、その断面にわたって一定の間隙幅を有するが、他の実施形態では、このようなカセットは、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。この局面の特定の実施形態では、このようなカセットは、０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットの間隙幅は、５％未満で変動し、他方、他の実施形態では、このようなカセットの間隙幅の変動は、２％以下である。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットは、ポリアクリルアミドゲルを含有する。他の実施形態では、このようなカセットは、非変性ゲル電気泳動を実施するために使用され、そしてこのゲルは非変性ゲルである。特定の実施形態では、このような非変性ゲルは、ブルーネイティブゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなカセットに含有されるゲルは勾配ゲルである。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような勾配ゲルは、ポリアクリルアミド勾配ゲルである。この局面の他の実施形態では、このようなカセットに含有される電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルを含有する。さらなるまたは代替的な実施形態では、このようなスタッキングゲルは直鎖状アクリルアミドを含有する。
【００１６】
このような方法のさらなるまたは代替的な実施形態では、上記方法はまた、１つまたは複数の分子量マーカーセットを上記電気泳動ゲルに適用する工程を包含する。さらなるまたは代替的な実施形態では、上記方法はまた、電気泳動ゲル上で電気泳動された１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程を包含する。このような方法のさらなるまたは代替的な実施形態では、上記方法はまた、上記ゲルを染色する工程を包含する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書中に開示されるのは、ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用される電気泳動ゲル、カセットおよび方法である。例示的な実施形態では、本明細書中で提供される電気泳動ゲル、カセットおよび方法は、非変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用することができるが、他方、他の実施形態では、本明細書中で提供される電気泳動ゲル、カセットおよび方法は、変性ゲル電気泳動で見られるスカーティング効果を低減するために使用することができる。
【００１８】
定義
別段の定義がされない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通に理解するのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書中で使用される命名法は、当該分野では周知であり、共通に採用されている。「上へ（ｕｐ）」および「下へ（ｄｏｗｎ）」、「上側（ｔｏｐ）」および「下側（ｂｏｔｔｏｍ）」、「上に（ａｂｏｖｅ）」および「下に（ｕｎｄｅｒｎｅａｔｈ）もしくは「上側の（ｕｐｐｅｒ）」もしくは「下側の（ｌｏｗｅｒ）」などのような方位を示す用語は、装置を使用するあいだの部品の方位についていう。用語が単数形で提供される場面では、発明者らは、その用語の複数形をも企図している。参考として援用される引用文献において使用される用語および定義において不一致が存在する場合には、本願において使用される用語は、本明細書中で与えられる定義を有するものとする。本開示全体を通して採用される場合、以下の用語は、そうではないと示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１９】
本明細書中で使用される場合の用語「周囲温度」は、２０℃〜２５℃の範囲の温度をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、生体高分子または生体分子は、核酸、タンパク質、多糖、脂質および他の高分子を含むが、これらに限定されない核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメントおよびアナログを含む。核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア核酸、葉緑体核酸、および別個の遺伝物質を有する他のオルガネラから誘導されてもよい。
【００２１】
用語「カオトロピック薬（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）」または「カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質および核酸の二次または三次構造を変える能力を有する任意の物質をいう。
【００２２】
用語「電気泳動ゲル」は、本明細書中で使用される場合、試料の電気泳動分離のために使用されるゲルをいう。電気泳動ゲルは、分離ゲルのみであってもよく、または電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルの両方を含有していてもよい。
【００２３】
用語「直鎖状ポリアクリルアミド」または「直鎖状アクリルアミド」は、本明細書中で使用される場合、アクリルアミドの直鎖状の非架橋のポリマーをいい、そしてまた単に「高分子量アクリルアミド」と呼ばれることもあり得る。直鎖状アクリルアミドは、直鎖状ポリマーの長さに対応して、１，０００ダルトン〜６，０００，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、乾燥した化学形態であってもよく、または液体形態（すなわち、重量／体積の溶液）であってもよい。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、タンパク質は、１つまたは複数の長い、折り畳まれたポリペプチド鎖を含む複雑な三次元的な物質である。そして、これらの鎖はアミノ酸と呼ばれる小さい化学単位を含む。すべてのアミノ酸は、炭素、水素、酸素および窒素を含有する。いくつかは、硫黄をも含有する。「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含有する化合物である。このアミノ酸は、線状に一緒に連結し、ペプチド鎖を形成する。２０種類の異なる天然アミノ酸が存在し、それらがペプチドの生物学的生産に関与する。そして、ペプチド鎖を形成するために、任意の数のそれら天然アミノ酸が任意の順序で連結されてもよい。ペプチドの生物学的生産に用いられる天然アミノ酸は、すべてＬ配置を有する。合成ペプチドは、慣用的な合成方法を採用し、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または２つの異なる配置のアミノ酸の種々の組合せを使用して調製することができる。いくつかのペプチド鎖は、いくつかのみのアミノ酸単位を含有する。例えば１０個よりも少ないアミノ酸単位を有する短いペプチド鎖は、「オリゴペプチド」と呼ばれることがある。この接頭辞「オリゴ」は、「いくつか（ｆｅｗ）」を意味する。他のペプチド鎖は、例えば１００までかそれより多い大きな数のアミノ酸単位を含有し、そしてそれらは「ポリペプチド」と呼ばれる。接頭辞「ポリ」は「多く（ｍａｎｙ）」を意味する。固定された数のアミノ酸単位を含有するさらに他のペプチド鎖は、その鎖中の単位の固定された数を意味する接頭辞を用いて、例えばオクタペプチドと呼ばれる。接頭辞「オクタ」は８を意味する。慣用的に、「ポリペプチド」は、３個以上のアミノ酸を含有する任意のペプチド鎖であると考えることができ、他方、「オリゴペプチド」は、通常は、特定のタイプの「短い」ポリペプチド鎖であると考えられる。従って、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」に言及するときはいつでもオリゴペプチドをも含んでいることが理解される。さらに、「ペプチド」に言及するときはいつでもポリペプチド、オリゴペプチドを含んでいる。アミノ酸形態の各々の異なる配列は、異なるポリペプチド鎖を形成する。特定の非限定的な例では、このポリペプチドは、４０と４０００との間のアミノ酸、５０と３０００との間のアミノ酸、または７５と２０００との間のアミノ酸を含有する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「核酸分子」は、一重鎖形態または二重鎖らせんのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、あるいはそれらのリン酸エステルアナログ（例えば、ホスホロチエオエートおよびチオエステル）のリン酸エステルポリマー形態をいう。二重鎖ＤＮＡ−ＤＮＡらせん、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡらせんおよび二重鎖ＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、その分子の一次構造および二次構造のみを指し、いずれかの特定の三次形態に限定するものではない。従って、この用語は、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドならびに染色体において見出される二重鎖ＤＮＡを含む。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際には、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５’−３’方向の配列のみを提示するという通常の慣用法に従って、本明細書中に配列が開示されることもあり得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）を受けたＤＮＡ分子である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、非変性ゲルは、変性剤（例えば、変性作用を有する界面活性剤、尿素、ホルムアミド、および他のカオトロープのようなもの）を含有しない電気泳動ゲルをいう。非変性（すなわち、「未変性」）ゲルは、「未変性」ゲル電気泳動において一般に使用され、この場合、ランニング緩衝液および試料緩衝液もまた変性剤を欠く。これらのゲルは、分子相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、などのようなもの）を調べることにおいて、そしてゲル内活性アッセイ（ｉｎ−ｇｅｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）を実施するために特に有用であり得る。
【００２７】
用語「ポリアクリルアミド」は、本明細書中で使用される場合、アクリルアミドモノマーとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（「ビス」または「ビスアクリルアミド」）との混合物をいい、このアクリルアミドおよびビスは、架橋されて分枝状の分子構造を形成する。
【００２８】
用語「試料」は、本明細書中で使用される場合、ゲル電気泳動を使用して分離することができる複数の独特の分子種の混合物をいう。例としてのみであるが、試料は、核酸の混合物、オリゴヌクレオチドの混合物、ＤＮＡの混合物、ＲＮＡの混合物、またはこれらの組合せであってもよい。さらに、例としてのみであるが、試料は、アミノ酸の混合物、ペプチドの混合物、タンパク質の混合物またはこれらの組合せであってもよい。
【００２９】
用語「分離ゲル」または、あるいは「分離ゲルの本体」は、生体分子の分離が起こり、そして電気泳動分離が行われたあとに目的の分離された生体分子が局在する、電気泳動ゲルの領域をいう。
【００３０】
用語「スカーティング」または「スカーティング効果」は、本明細書中で使用される場合、試料が電気泳動ゲルと、そのゲルを保持するか含有する上記カセットの壁、すなわちプラスチックプレートまたはガラスプレートとの間を移動することができるときをいう。上記ゲルと上記カセットの壁、すなわちプラスチックプレートまたはゲルプレートとの間を移動することができる試料の一部分は、その試料の残りの部分よりも速く移動し、それによって影バンド（ｓｈａｄｏｗ ｂａｎｄ）またはスカートバンド（ｓｋｉｒｔ ｂａｎｄ）の出現がもたらされる。
【００３１】
電気泳動におけるスカーティングアーチファクトを低減するための電気泳動ゲル、組成物およびゲルカセット
本明細書中に開示される組成物、ゲルカセットおよび方法で使用される電気泳動ゲルは、分離ゲルの本体を含み、そして必要に応じてスタッキングゲルを含む。このような分離ゲルは、試料成分（生体分子が挙げられるが、これに限定されない）を分離するために使用され、他方、スタッキングゲルは、分離ゲルへの移動の前に、その試料成分を狭いバンドへ集束させるのを補助するために使用される。この集束によって、近接して移動する試料成分の分解能を向上させることが可能になる。この分離ゲル中で生体分子が分離するプロセスとしては、大きさによる分離、電荷による分離、または大きさと電荷の組合せによる分離が挙げられるが、これらに限定されない。このような分離ゲルを使用して分離される生体分子は、（電気泳動の前か、電気泳動の後か、もしくは電気泳動の間に）目的の生体分子を死滅させるか、染色するかまたは標識するかし、そして電気泳動分離後に分離ゲル内でのそれらの位置を観察（可視化）することによって検出される。
【００３２】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬が、ロードの前にその試料に添加される。他の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、試料が分離ゲルまたはスタッキングゲル中に置かれたローディングウェルに添加される前に、このようなローディングウェルに添加される。他の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、試料が分離ゲルまたはスタッキングゲル中に置かれたローディングウェルに添加された後に、このローディングウェルに添加される。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルは、電気泳動が実行されたのちに、少なくとも１つの色素、染色剤、標識または他の指示薬に曝露される。これによって、試料成分は、このような色素、染色剤、標識または他の指示薬と会合するようになる。あるいは、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、分離ゲルに添加される。これにより、それらは、電気泳動の移動の間に、試料成分と会合するようになる。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のさらに他の実施形態では、色素、染色剤、標識または他の指示薬は、試料成分に共有結合で結びつけられる。次いで、分離ゲル中の試料バンドの可視化が、その分離ゲルを適切な波長の光で照らして、その試料バンドと会合した色素、染色剤、標識または他の指示薬の観察を可能にすることにより達成される。
【００３３】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の分離ゲルは、ゲルを形成する任意の材料を含むことができる。ゲルを形成する材料としては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびそれらの組合せが上げられるが、これらに限定されない。このような合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミドおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような天然ポリマーとしては、アガロースのような多糖が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、このような分離ゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、このような分離ゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、この分離ゲルは、直鎖状アクリルアミドおよびアガロース、直鎖状アクリルアミドおよびポリアクリルアミド、または直鎖状アクリルアミドおよびアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。
【００３４】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のスタッキングゲルは、ゲルを形成する任意の材料を含むことができる。ゲルを形成する材料としては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびそれらの組合せが上げられるが、これらに限定されない。このような合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミドおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような天然ポリマーの例としては、アガロースのような多糖が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、このようなスタッキングゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、このスタッキングゲルは、直鎖状アクリルアミドおよびアガロース、直鎖状アクリルアミドおよびポリアクリルアミド、または直鎖状アクリルアミドおよびアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含む。
【００３５】
記載される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、この電気泳動ゲルは、分離ゲルおよびスタッキングゲルを含有し、ここでこのスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。このスタッキングゲル中に直鎖状アクリルアミドを含有させることで、スカーティングアーチファクトを最少化または防止する。
【００３６】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、ここでこのスタッキングゲルはまた、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、ここでこの分離ゲルはまた、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の特定の実施形態では、分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミドゲルであり、ここでこの分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方が、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。
【００３７】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のポリアクリルアミドゲルは、モノマーのアクリルアミドとビスアクリルアミドとの混合物である「アクリルアミド」の溶液を使用して作製される。重合開始剤、および必要ならば触媒を使用するアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの重合によって、架橋ポリアクリルアミドゲルが製造される。本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法のポリアクリルアミドゲルを作製するために上記混合物中で使用される、ビスアクリルアミドに対するモノマーアクリルアミドの比は、約１５：１〜約５０：１の範囲である。例としてのみであるが、このようなポリアクリルアミドゲル中の（モノマー）アクリルアミド：ビスアクリルアミド比は、１５：１、１９：１、２４：１、２９：１、３７．５：１、４０：１、４５：１および５０：１であり得る。本明細書中で開示される特定の実施形態では、タンパク質およびタンパク質複合体の分析のための、ビスアクリルアミドに対する（モノマー）アクリルアミドの比は、約１９：１〜約４５：１の範囲である。
【００３８】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法で使用される電気泳動ゲルの特定の実施形態では、スタッキングゲルは、上記のようなアクリルアミドとビスアクリルアミドとの混合物を使用して作製されたポリアクリルアミドを含む。特定の実施形態では、このスタッキングゲルは、上記分離ゲルを作製するために使用されるアクリルアミド濃度よりも低いアクリルアミド濃度で作製される。例としてのみであるが、スタッキングゲルは、約２％〜約８％、約２．５％〜約７．５％のアクリルアミド、約３％〜約７％のアクリルアミド、約３．５％〜約６．５％のアクリルアミド、約４％〜約６％のアクリルアミド、約４．５％〜約５．５％のアクリルアミド、または約２．５％〜約６％のアクリルアミドの範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を有することができる。例としてのみであるが、スタッキングゲルは、２％〜８％、２．５％〜７．５％のアクリルアミド、３％〜７％のアクリルアミド、３．５％〜６．５％のアクリルアミド、４％〜６％のアクリルアミド、４．５％〜５．５％のアクリルアミド、または２．５％〜６％のアクリルアミドの範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を有することができる。
【００３９】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルの分離ゲルおよびスタッキングゲルは、（個々に、またはともに）直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。他の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルは、（個々に、またはともに）直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの（重量／体積）濃度は、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％，０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．２％、または０．０２％〜約０．１％の範囲であってもよい。例示的な実施形態では、このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの（重量／体積）濃度は、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％，０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％、または０．０２％〜０．１％の範囲であってもよい。さらに、このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの分子量は、約１，０００ダルトン〜約６，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約７５０，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約３００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２５，０００ダルトン、または約１，０００ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲であってもよい。さらに、このようなゲルに含有される直鎖状アクリルアミドの分子量は、１，０００ダルトン〜６，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜１，０００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜７５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜３００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜１００，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜２５，０００ダルトン、または１，０００ダルトン〜１０，０００ダルトンの範囲であってもよい。当業者は、種々の分子量範囲の直鎖状アクリルアミドを試験して、上記スタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドについての有用な分子量を決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約１０，０００ダルトンよりも大きい。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約１００，０００ダルトンよりも大きい。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約１００，０００ダルトンと約１，０００，０００ダルトンとの間である。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、約６００，０００ダルトンと約１，０００，０００ダルトンとの間である。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのスタッキングゲルにおいて使用される直鎖状ポリアクリルアミドの分子量は、６００，０００ダルトンと１，０００，０００ダルトンとの間である。
【００４０】
特定の実施形態では、本明細書中で開示されるような、直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルは、少なくとも、以下の直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、および重合開始剤の混合物を含有する混合物の重合によって作製される。この混合物は、必要に応じて、触媒を含有してもよい。このような混合物の重合は、当業者に周知である任意の適切な手段で開始されてよく、その手段としては、適切な薬剤および随意の触媒を添加することによる化学的開始、光開始剤を使用して続いて適切な波長で照射することによる光化学的開始、熱開始、およびこれらの組合せが挙げられる。このような混合物の重合によって、上記直鎖状アクリルアミドが、上記重合ゲル中へ組込まれ、それにより上記ゲルが強靭化される。さらに、直鎖状アクリルアミドを上記スタッキングゲル中へ組込むことにより、スカーティング効果が低減するか、または排除される。
【００４１】
このような混合物の重合を開始するために使用することができる化学的開始剤としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸アンモニウムとテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）との混合物、過硫酸ナトリウム、過硫酸ナトリウムとテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）との混合物、過硫酸カリウム、過硫酸カリウムとテトラメチルエチレンジアミンとの混合物、過酸化物、過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル、アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ＨＣｌ（ＡＺＩＰ）、アゾビス（２−アミジノプロパン）ＨＣｌ（ＡＺＡＰ）、４，４’−アゾ−ビス−４−シアノペンタン酸、アゾビスイソブチルアミド；アゾビスイソブチルアミジン．２ＨＣｌ、２−２’−アゾ−ビス−２−（メチルカルボキシ）プロパン、２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、および２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパノンが挙げられるが、これらに限定されない。このような混合物の重合を開始するために使用することができる光開始剤としては、アセトフェノン、ベンゾフェノン、多環式のキノン、フルオレセイン、アゾビスニトリル、ベンゾキノン、キサントフェノン、ベンゾイン、キサントン、フルオレノン、アントロキノン、エオシン、エリトロシン、ニトロキシド、リボルフラビン、リボルフラビン５’−ホスフェート、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、ビスアクリルアミド架橋剤、開始剤、および随意の触媒を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される、直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、重合開始剤（、および随意の触媒の混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドの溶液に添加される。特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、ビスアクリルアミド架橋剤、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドの溶液に添加される。
【００４３】
特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、開始剤および随意の触媒を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される、直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、重合開始剤、および触媒の混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドおよびビスアクリルアミド架橋剤の溶液に添加される。特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加して、これにより本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される混合物を得る前に、モノマーアクリルアミドおよびビスアクリルアミド架橋剤の溶液に添加される。
【００４４】
特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、モノマーアクリルアミド溶液、ビスアクリルアミド架橋剤、開始剤および随意の触媒の溶液に添加され、これにより、本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される、直鎖状アクリルアミド、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、重合開始剤および随意の触媒の混合物が得られる。特定の実施形態では、上記直鎖状アクリルアミドは、モノマーアクリルアミド、ビスアクリルアミド架橋剤、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）の溶液に添加され、これにより、本明細書中で開示されるような直鎖状アクリルアミドを含有するポリアクリルアミド分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルを作製するために使用される混合物が得られる。
【００４５】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法の電気泳動ゲルは、勾配分離ゲルであってもよく、ここで（任意の添加された直鎖状ポリマーの濃度は除いて）上記ポリマーの濃度は、分離ゲルの中で、一般に上記ゲル本体の上側の低濃度からゲル本体の下側の高濃度へ、変動する。このような勾配分離ゲル中の上記ポリマーの濃度範囲は、分離されるべき分子の適用、および特に大きさに依存する。特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのこのような分離ゲルは、約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配のあるポリアクリルアミド分離ゲルであってもよい。特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのこのような分離ゲルは、２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配のあるポリアクリルアミド分離ゲルであってもよい。
【００４６】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、勾配分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲルポリマーの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるポリマーの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低い。特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲルのアクリルアミドの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるアクリルアミドの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低い。他の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲル中のアクリルアミドの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるアクリルアミドの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低く、そしてこのスタッキングゲルは、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．２％または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。他の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、ポリアクリルアミド勾配分離ゲルおよびポリアクリルアミドスタッキングゲルの両方を含有することができ、ここでこのスタッキングゲルのアクリルアミドの濃度は、この勾配分離ゲルにおいて使用されるアクリルアミドの最低濃度と等しいか、またはそれよりも低く、そしてこのスタッキングゲルは、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。別の実施形態では、本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、４％〜１６％のポリアクリルアミド濃度を含む平板状の勾配のあるポリアクリルアミド分離ゲル、ならびに０．０５％（重量／体積）の直鎖状ポリアクリルアミドに加えて３％のポリアクリルアミド濃度を有するポリアクリルアミドスタッキングゲルを含有することができる。
【００４７】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される勾配分離ゲルはまた、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、０．０２％〜約０．１％、または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で存在する直鎖状ポリアクリルアミドを含有することができる。特定の実施形態では、このような勾配分離ゲルは、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．１％、または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で存在する直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。特定の実施形態では、このような勾配分離ゲルは、約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有するポリアクリルアミド勾配分離ゲルである。特定の実施形態では、このような勾配分離ゲルは、２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有するポリアクリルアミド勾配分離ゲルである。
【００４８】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルのより具体的な局面では、この電気泳動ゲルは、スタッキングゲルおよび分離ゲルを含み、ここで直鎖状アクリルアミドは、このスタッキングゲル中にのみ存在し、この分離ゲル中には存在しない。特定の実施形態では、このようなスタッキングゲルおよび分離ゲルはともに、ポリアクリルアミドを含むが、このスタッキングゲルのみが直鎖状アクリルアミドを含む。この分離ゲル中に直鎖状アクリルアミドを添加することは、潜在的には、この分離ゲルの透明性に影響を及ぼし得、それによってこの分離ゲル中に局在する試料バンドの検出に影響を及ぼし得る。このような影響は、「曇り効果」としても公知である。
【００４９】
特定の実施形態では、上記ポリアクリルアミドスタッキングゲルは、ポリアクリルアミド分離ゲルのアクリルアミド濃度範囲に関して、最低濃度のアクリルアミドを含有する。全アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド）濃度が約３．５％（重量／体積）未満である実施形態では、得られるポリアクリルアミドマトリクスは、破損しやすいことに加えて、スカーティングのアーチファクトをもたらすこともあり得る軟質ゲルである。このような低百分率のアクリルアミドスタッキングゲル中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有させることによって、ゲルの強度を改善することができ、そしてスカーティングのアーチファクトの発生を低減するかまたは排除することもできる。
【００５０】
上記組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、非変性ゲルである分離ゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような非変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような非変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルである。
【００５１】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、非変性ゲルであるスタッキングゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような非変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような非変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドスタッキングゲルである。
【００５２】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、非変性ゲルである分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含有することができる。特定の実施形態では、このような非変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような非変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルであり、ここでこのスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、このような非変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルである。
【００５３】
タンパク質およびタンパク質複合体を分離するために使用される非変性ゲルの例は、ブルーネイティブゲル（「ＢＮゲル」）である。このようなＢＮゲルは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９１）「Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ」 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１；Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈ，Ｃｒａｍｅｒ ＷＡ，およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９４）「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０；ならびにＳｃｈａｇｇｅｒ Ｈ（２００１）「Ｂｌｕｅ−ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６５： ２３１−２４４によって説明されている。これらの文献の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＢＮゲル中において、タンパク質は、そのタンパク質を変性することなくそのタンパク質に負電荷を付与するＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０で染色される。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０によるタンパク質のこの電荷シフトは、それらの大きさに基づいて、このような「ブルーネイティブゲル」上で分離されることをもたらす。これによって、未変性のタンパク質およびタンパク質複合体の正確な大きさの見積もりが可能となる。
【００５４】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルの特定の実施形態では、このような電気泳動ゲルは、スタッキングゲル中に直鎖状ポリアクリルアミドを含有する非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲルであり、そしてタンパク質およびタンパク質複合体の分離のために使用される。他の実施形態では、ＢＮゲルを含む非変性ゲルは、約２％〜約３０％、約２．５％〜２５％、約３％〜約２０％、約３％〜約８％、約４％〜約１６％、約３％〜約１２％、約４％〜約２０％、または約５％〜約２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配分離ゲルを含有する。他の実施形態では、ＢＮゲルを含む非変性ゲルは、２％〜３０％、２．５％〜２５％、３％〜２０％、３％〜８％、４％〜１６％、３％〜１２％、４％〜２０％、または５％〜２０％の範囲の（重量／体積）アクリルアミド濃度を伴う濃度勾配を有する勾配分離ゲルを含有する。さらに、このような非変性ゲルは、濃度が約１％〜約６％、約２％〜約５％、または約２．５％〜約４％のポリアクリルアミドのアクリルアミド（重量／体積）濃度を有するスタッキングゲルを含有する。さらに、このような非変性ゲルは、濃度が１％〜６％、２％〜５％、または２．５％〜４％のポリアクリルアミドのアクリルアミド（重量／体積）濃度を有するスタッキングゲルを含有する。このようなスタッキングゲルはまた、約０．００５％〜約１％、０．００５％〜約０．７５％、０．００５％〜約０．５％、０．００５％〜約０．１％、０．０１％〜約１％、０．０１％〜約０．７５％、０．０１％〜約０．５％、０．０１％〜約０．１％、０．０２％〜約１％、０．０２％〜約０．７５％、０．０２％〜約０．５％、約０．０２％〜約０．２％、または０．０２％〜約０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。特定の実施形態では、このようなスタッキングゲルはまた、０．００５％〜１％、０．００５％〜０．７５％、０．００５％〜０．５％、０．００５％〜０．１％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．７５％、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．１％、０．０２％〜１％、０．０２％〜０．７５％、０．０２％〜０．５％、０．０２％〜０．２％、または０．０２％〜０．１％の（重量／体積）濃度で直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。
【００５５】
特定の実施形態では、上記分離ゲルは、勾配ゲルであってもよいが、それは直鎖状アクリルアミドを含有しない。
【００５６】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルであってもよく、ここでこのゲルは、界面活性剤、カオトロピック薬またはそれらの組合せを含有する。カオトロピック薬としては、トリフルオロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、尿素、塩化グアニジウムおよびグアニジンイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。変性作用を有する界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５７】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルである分離ゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような変性分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルである。
【００５８】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルであるスタッキングゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このような変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような変性スタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドスタッキングゲルである。
【００５９】
本明細書中で開示される組成物、ゲルカセットおよび方法において使用される電気泳動ゲルは、変性ゲルである分離ゲルおよびスタッキングゲルの両方を含有することができる。特定の実施形態では、このような変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、ポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルであり、ここでこのスタッキングゲルは直鎖状ポリアクリルアミドを含む。他の実施形態では、このような変性分離ゲルおよびスタッキングゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミド分離ゲルおよびスタッキングゲルである。
【００６０】
Ｂ．長さに沿って一定のプレート−プレート間隔を有するゲルカセット
本明細書中で開示される方法および組成物の別の局面は、前面プレートと背面プレートとの間に一定の内側間隙を有するゲルカセットである。図示の目的のために、図２は、中央で切り落とされたカセット（２１）を示しており、このカセットでは、背面プレート（２３）と前面プレート（２２）との間の間隙（２４）は、カセット（２７）の中央にあるカセットの上側エッジ（２５）に沿う点とカセット（２６）の外側エッジにあるカセットの上側エッジ（２５）に沿う点との間で、実質的に同一である。カセットの「前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙」は、上記ゲルを保持するカセット内の空間が、上記ゲルを含有する空間全体にわたって実質的に同一の前面−背面間深さを有することを意味する。すなわち、この空間の上側エッジ（櫛が挿入されてウェルが形成されるカセットの端部）での前面−背面間深さは、この空間の中央領域、この空間の下側領域、およびこの空間の外側エッジにおける前面−背面間深さと実質的に同一である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「実質的に同一」または「実質的に等しい」は、上記カセットの上側エッジにおける（櫛が挿入され得るカセットの端部における）プレート間の内側間隙幅が、上記カセットのエッジとそのカセットの中央領域との間の最大間隙幅の約５％より大きくは変動せず、そして好ましくは、上記カセットのエッジからカセットの中央領域までの２つのプレート間の内側幅の約２％より大きくは変動しないことを意味する。いくつかの好ましい実施形態では、前面プレートと背面プレートとの間の間隙幅は、上記カセットの頂部（または櫛が挿入されて試料ウェルが形成され得る場所に対応する、上記カセットの領域）にわたって約１％より大きくは変動しない。例えば、カセットは、厚さ１ｍｍのゲルを保持するように設計されてもよい。この厚さは、上記カセットの内側間隙幅に対応する。この場合、このカセットの内側空間の幅は、上記カセットの頂部（または櫛が挿入される場所に対応する、上記カセットの領域）にわたって約０．０５ｍｍ以下だけ、約０．０２ｍｍ以下だけ、または０．０１ｍｍ以下だけしか変動しない。別の例では、カセットは、厚さ１．５ｍｍのゲルを保持するように設計されてもよい。この場合、このカセットの内側空間の幅は、上記カセットの頂部（または櫛が挿入される場所に対応する、上記カセットの領域）にわたって約０．０７５ｍｍ以下だけ、約０．０３ｍｍ以下だけ、または０．０１５ｍｍ以下だけしか変動しない。
【００６２】
特定の実施形態では、上記ゲルカセットは、前面プレートと背面プレートとの間の内側距離がカセットの上側エッジに沿って実質的に変動しない、前面プレートと背面プレートとの間の内側間隙を有する。
【００６３】
ゲルカセットは、任意の適切な材料から構築される前面プレートおよび背面プレートを有することができ、この適切な材料としては、プラスチック、ポリマー、ガラス、セラミクス、または標準的な電気泳動条件下で流体に対して浸透性ではなく、かつ非伝導性である任意の材料が挙げられる。本明細書中で開示されるゲルカセットは、可視光に対して透明であるか、紫外線に対して透明であるか、赤外線に対して透明であるか、紫外線および赤外線の両方に対して透明であるポリマーから作製することができる。本明細書中で開示されるゲルカセットを作製するために使用されるポリマーの非限定的な例は、スチレン−アクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ベースのポリマー、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、グリコール変性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、ポリプロピレン、アセタール、およびこれらのコポリマーである。本明細書中で開示されるゲルカセットのプレートは、ゲルに面する側面が１つまたは複数のポリマー（例えば、例としてのみであるが、ラテックス）でコーティングされていてもよく、これにより電気泳動ののちゲルが取り除かれるべきときにゲルがこのプレートに固着することが防止される。本明細書中で開示されるゲルカセットまたはゲルカセットを形成するために取り付けられるプレートは、成形技術、熱エンボス加工方法、注型プロセス、熱成形方法、ステレオリソグラフィプロセス、機械加工方法および磨砕プロセスを使用して製作されてもよい。さらなるまたは代替的な実施形態では、このような成形技術としては、射出成形および圧縮成形が挙げられる。
【００６４】
上記前面プレートおよび背面プレートは、任意の実行可能な手段により、互いに取り付けられてもよく（これによりゲルカセットが形成される）、この任意の実行可能な手段としては、その側面で前面プレートおよび背面プレートを連結するエッジ片とともに単一片として成形すること、一緒に溶接すること（例としてのみであるが、超音波溶接）、接着剤で一緒に固着すること、熱処理すること、または取り付け手段（ねじ、ピン、スナップ、またはクランプ）で保持することが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で開示されるゲルカセットの特定の実施形態では、カセットの前面プレートと背面プレートのいずれかまたはその両方は、例としてのみであるが、溶接によってこのカセットが取り付けられるエッジのまわりに一段高い境界を有する。この一段高い境界は、取付けられたプレート間の距離を確立するスペーサを提供する。いくつかの実施形態では、そのように設計されたプレートは、カセットのプレート間の距離を確立するスペーサの厚みが、そのカセットの上側エッジに沿ってそのカセットの外側エッジから少なくともそのカセットの中点まで実質的に同一であるような仕様で、一緒に溶接される。
【００６５】
本明細書中で開示されるゲルカセットは、任意の電気泳動システムにおいて使用される任意の大きさであり得る。一定の間隙幅を有するゲルカセットの寸法は限定的ではなく、そしてそのゲルカセットとしては、幅が約５ｃｍ〜約３０ｃｍ、長さが約５ｃｍ〜６０ｃｍ、そしてプレート厚さが１ｍｍ〜５ｍｍの前面プレートおよび背面プレートを有するカセットが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、上記ゲルカセットのプレートは、厚さ約４ｍｍ以下、厚さ３ｍｍ以下、厚さ約２．５ｍｍ以下、厚さ約２ｍｍ以下、厚さ約１．５ｍｍ以下、または厚さ１ｍｍ以下であってもよい。他の実施形態では、カセットの背面プレートは、上記ゲルを含有する領域で厚さが２．５ｍｍと３ｍｍとの間であり、そしてカセットの前面プレートは、上記ゲルを含有する領域で厚さが１．５ｍｍと２ｍｍとの間である。
【００６６】
本明細書中で開示されるゲルカセットでは、前面プレートと背面プレートとが、等しい寸法であることは必要ではない。さらに、前面プレート、背面プレート、またはその両方は、例えば例としてのみであるが、差し込まれているか湾曲しているかの外側エッジの部分を少なくとも有することにより、１つまたは複数の側面に沿って不規則な形状になっていてもよい。組立てられたカセットのプレート間の間隙幅は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約３ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約２．５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約０．２５ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約２．５ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約１ｍｍであり得る。例示的な実施形態では、組立てられたカセットのプレート間の間隙幅は、０．１ｍｍ〜１０ｍｍ、０．１ｍｍ〜５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜３ｍｍ、０．２５ｍｍ〜２．５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜２ｍｍ、０．２５ｍｍ〜１．５ｍｍ、０．２５ｍｍ〜１ｍｍ、０．５ｍｍ〜５ｍｍ、０．５ｍｍ〜３ｍｍ、０．５ｍｍ〜２．５ｍｍ、０．５ｍｍ〜２ｍｍ、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ、または０．５ｍｍ〜１ｍｍである。上記間隙幅は、上記プレートの外側エッジ（頂部および下側）に沿うプレート間のスペーサによるか、または溶接方法（例としてのみであるが、超音波溶接）、熱処理、接着剤、ガスケット、クランプ、またはファスナーを使用して一緒に固着することができるプレートの境界領域（頂部および下側）により確立することができる。特定の実施形態では、カセットプレートは、１つまたは複数のプラスチック（例えば）から作製され、そして背面プレートまたは前面プレートのうちの１つもしくはその両方は、相手のプレートに溶接または熱融着されたに一段高い境界を有する。そして、溶接プロセスは、上記カセットの溶接または熱融着されたプレート間に留まる境界領域の厚さを決定することによって、一部は、上記間隙幅を決定する。
【００６７】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの非限定的な例は、１０ｃｍ×１０ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートは厚さが約１．７５ｍｍであり、背面プレートは厚さ約２．５５ｍｍであり、この２つのプレートは、櫛が挿入されてウェルを形成することになっている領域におけるカセットの間隙幅が約１ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００６８】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの別の非限定的な例は、１０ｃｍ×１０ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートおよび背面プレートは、それぞれ、厚さが約１．７５ｍｍおよび約２．５ｍｍであり、プレートは、カセットの間隙幅が約１．５ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００６９】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの別の非限定的な例は、１５ｃｍ×１５ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートおよび背面プレートは、それぞれ、厚さが約１．７５ｍｍおよび約２．５５ｍｍであり、この２つのプレートは、櫛が挿入されてウェルを形成することになっている領域におけるカセットの間隙幅が約１ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００７０】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットの別の非限定的な例は、１５ｃｍ×１５ｃｍである前面プレートおよび背面プレートを有し、ここでこの前面プレートおよび背面プレートは、それぞれ、厚さ約１．７５ｍｍおよび約２．５５ｍｍであり、この２つのプレートは、櫛が挿入されてウェルを形成することになっている領域におけるカセットの間隙幅が約１．５ｍｍで一定であるように、一緒に溶接されている。
【００７１】
前面プレートと背面プレートとの間の一定の内側間隙を有するゲルカセットのこれらの例は、例示の目的のためのみのものであり、決して限定することを意図しているわけではない。
【００７２】
本明細書中で開示されるゲルカセットとしては、試料のローディングが起こるカセットの上側エッジにわたる一定の間隙幅を有するゲルカセットも挙げられ、ここでこの間隙幅は、約５％未満、いくつかの好ましい実施形態では、わずかに約２％以下、またはわずかに約１％以下変動する。
【００７３】
本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセットは、任意の適切なゲル形成ポリマーを含むゲルを含有することができる。そしてこのゲル形成ポリマーとしては、合成ポリマー、天然ポリマーおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような合成ポリマーの例としては、直鎖状ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミドまたはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような天然ポリマーの例としては、アガロースのような多糖が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、このようなゲルは、アガロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースとポリアクリルアミドとの組合せを含むことができる。
【００７４】
本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセットは、本明細書中で開示される任意のスタッキングゲルおよび／または分離ゲルを含有することができる。特定の実施形態では、このゲルカセットは、本明細書中に記載されるように、直鎖状アクリルアミドを含有するゲルを含有する。スタッカー（ｓｔａｃｋｅｒ）を含有するゲル中に存在する場合は、直鎖状アクリルアミドは、このスタッカー中に存在することができ、そして分離ゲル中には存在しないことができる。代替的な実施形態では、直鎖状アクリルアミドは、このスタッカー中にも、分離ゲル中にも存在することができる。このゲルは、本明細書中で開示されるような任意のポリマー濃度を有することができ、この濃度としては、例としてのみであるが、アガロースの場合は約０．３％〜約３％、または約１％〜約３０％のアクリルアミドが挙げられる。存在する場合には、上記直鎖状アクリルアミドは、本明細書中で開示される任意の（重量／体積）濃度で存在することができ、この濃度としては、約０．００５％〜約１％および約０．０１％〜約０．５％が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセット中の分離ゲルは、本明細書中で開示されるような勾配ゲルであってもよい。本明細書中で開示される一定の間隙幅を有するゲルカセット中の分離ゲルは、必要に応じて、本明細書中で開示されるようなスタッキングゲルを含有することができ、ここでこのスタッキングゲルは、分離ゲル中の濃度よりも低い濃度のゲルポリマーを有する。組合せのゲルを使用する場合には、各成分の最適の濃度を、経験的に、または刊行されたプロトコルを案内役として決定することができる。
【００７５】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲルはまた、以下の、１つまたは複数の緩衝液、塩、還元剤、酸化剤、アルキル化剤、変性剤、キレート剤、ポリマーまたは界面活性剤のうちの少なくとも１つを含有することができる。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、核酸の分離のために使用されるべきゲルである。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、ポリペプチドの電気泳動のために使用されるべきゲルである。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、電気泳動の前または電気泳動のあいだタンパク質およびタンパク質複合体が変性されない、タンパク質の未変性電気泳動のために使用される。他の実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、ポリペプチドの電気泳動のために使用されるべきゲルである。いくつかの実施形態では、このようなカセット中に含有されるゲルは、電気泳動の前または電気泳動のあいだタンパク質およびタンパク質複合体が変性されず、しかも上記ゲルおよび上記ランニング緩衝液が変性剤（例えば、変性作用を有する界面活性剤、尿素、ホルムアミド、カオトロープなどが挙げられるが、これらに限定されない）を含有しない、タンパク質の未変性電気泳動のために使用される。非限定的な例では、ブルーネイティブゲルは、本明細書中に記載される一定の内側間隙幅を有するカセットにおいて使用される。特定の実施形態では、ブルーネイティブゲルは、スタッキングゲルを有する。他の実施形態では、ブルーネイティブゲルは、直鎖状アクリルアミドを含有するスタッキングゲルを有する。
【００７６】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液は、任意の電気泳動緩衝液であってよく、その例としては、双性イオン性の緩衝液が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において５と９との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において６と８．５との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において６と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において６と７との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、周囲温度において７と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において５と９との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において６と８．５との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において６と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において７と８との間のｐＨを有する。特定の実施形態では、このゲル緩衝液は、２５℃において６と７との間のｐＨを有する。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液は、周囲温度において約５と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約６と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約６と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約６と約７との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、周囲温度において約７と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約５と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約６と約８．５との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約６と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約６と約７との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。特定の実施形態では、上記ゲル緩衝液は、２５℃において約７と約８との間のｐＫａを有する緩衝液を含む。
【００７８】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液としては、スクシネート、シトレート、ボレート、マレエート、カコジレート、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（Ｔｒｉｓ）、トリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、グリシン、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス（ＢｉｓＴｒｉｓ））またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このようなゲル緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有することができる。
【００７９】
本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ〜約１．５Ｍであり得る。特定の実施形態では、その濃度は約１０ｍＭと約１Ｍとの間であり得る。特定の実施形態では、その濃度は約２０ｍＭと約５００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭと約３００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約１０ｍＭと約２００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約１０ｍＭと約５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭと約２００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭと約５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約５ｍＭと約２００ｍＭとの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は約５ｍＭと約５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は約５ｍＭと約１Ｍとの間であり得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載されるようなゲルカセット中に含有されるゲル中に含有される緩衝液の濃度は、１０ｍＭ〜１．５Ｍであり得る。特定の実施形態では、その濃度は１０ｍＭと１Ｍとの間であり得る。特定の実施形態では、その濃度は２０ｍＭと５００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は５０ｍＭと３００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は１０ｍＭと２００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は１０ｍＭと５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は５０ｍＭと２００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は５０ｍＭと５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は５ｍＭと２００ｍＭの間であり得、そして他の実施形態では、その濃度は５ｍＭと５００ｍＭとの間である。特定の実施形態では、その濃度は５ｍＭと１Ｍの間であり得る。
【００８０】
種々のゲルカセットが、米国特許第７，１２２，１０４号、同第６，５６２，２１３号、同第５，５８２，７０２号、同第５，８６５，９７４号、同第６，３７９，５１６号、米国特許出願第１１／４７０，３０８号および同第１０／０５６，０５０号に記載されている。これらの特許および特許出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。このようなカセット（マルチウェル型カセットが挙げられるが、これに限定されない）は、本明細書中で開示される電気泳動ゲルを含有することができ、そして本明細書中に記載される組成物および方法において使用することができる。
【００８１】
本明細書中に記載される電気泳動ゲルは、試料（分離している生体分子が挙げられるが、これに限定されない）の構成成分を分離するために使用することができる。このような電気泳動ゲル上で試料成分を分離する方法は、１つまたは複数の試料を電気泳動ゲルに適用する工程、およびこの電気泳動ゲル上で試料成分を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を分離ゲルを含む電気泳動ゲルに適用する工程、およびこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、直鎖状ポリアクリルアミドを含む分離ゲルを含む電気泳動ゲルに適用する工程、およびこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含む電気泳動ゲルに適用する工程、ならびにこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の実施形態では、このような方法は、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、直鎖状ポリアクリルアミドを含むスタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含む電気泳動ゲルに適用する工程、ならびにこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離する工程を包含するが、これらの工程に限定されない。特定の他の実施形態では、このような方法としては、１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲルおよび分離ゲルの両方が直鎖状ポリアクリルアミドを含むスタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含有する電気泳動ゲルに適用し、そしてこの分離ゲル上で１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体を電気泳動により分離することが挙げられるが、これに限定されない。
【００８２】
上記スタッキングゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む本発明の方法を実行する際には、分離ゲル上でのスカーティングバンドの出現が低減される。上記分離ゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む本発明の方法を実行する際には、分離ゲル上でのスカーティングバンドの出現が低減される。上記スタッキングゲルおよび上記分離ゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む本発明の方法を実行する際には、分離ゲル上でのスカーティングバンドの出現が低減される。「低減される」という表現は、同一条件下で実行され、そして（直鎖状ポリアクリルアミドを有することを除いて）同一組成を有する場合に、スカーティングバンドの外観、強度、または幅が、直鎖状ポリアクリルアミドを含まない電気泳動ゲル中よりも、直鎖状ポリアクリルアミドを有する電気泳動ゲル上でのほうがより少ないことを意味する。
【００８３】
このような方法において使用されるゲルは、本明細書中に記載される任意の電気泳動ゲルであることができる。特定の実施形態では、そのゲルはポリアクリルアミドゲルである。他の実施形態では、そのゲルはアガロースゲルであるが、他方、他の実施形態では、そのゲルはアクリルアミドおよびアガロースの両方を含む。このような方法において使用されるゲルは、本明細書中で開示される変性ゲルであってもよく、その例としては、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルが挙げられるが、これに限定されない。このような方法において使用されるゲルは、本明細書中で開示される非変性ゲルであってもよく、その例としては、ブルーネイティブ（ＢＮ）ゲルが挙げられるが、これに限定されない。このような方法において使用される分離ゲルは、任意の適切な組成を有していてよい。いくつかの実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有する。他の実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、直鎖状ポリアクリルアミドを含有しない。特定の実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルはポリアクリルアミドを含むが、他方、他の実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、ポリアクリルアミドおよび直鎖状ポリアクリルアミドの両方を含む。いくつかの実施形態では、このような方法において使用される分離ゲルは、勾配ゲルである。特定の実施形態では、このような方法において使用される電気泳動ゲルは、マルチウェル型ゲルであり、そこでは２つ以上の試料、１つまたは複数の試料、または同一の試料の多数回のローディングが同時に電気泳動される。特定の実施形態では、このような方法において使用される電気泳動ゲルは、マルチウェル型ゲルであり、そこでは２つ以上の試料、１つまたは複数の試料、または同一の試料の多数回のローディングとともに１つまたは複数の分子量標準が同時に電気泳動される。
【００８４】
本明細書中で開示される方法において使用される未変性ゲルまたは非変性ゲルは、上記ゲル中またはランニング緩衝液の中を、変性剤（例えば、タンパク質変成作用を有する界面活性剤、またはカオトロープのようなもの）なしで実行される。本明細書中で開示される方法において使用される未変性ゲルとしては、ブルーネイティブ（ＢＮ）ゲルが挙げられるが、これに限定されない。陰極緩衝液、タンパク質試料緩衝液、またはその両方がＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０を含有するブルーネイティブゲルを使用することは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９１）「Ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１；Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈ，Ｃｒａｍｅｒ ＷＡ，およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ Ｇ（１９９４）「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０；ならびにＳｃｈａｇｇｅｒ Ｈ（２００１）「Ｂｌｕｅ−ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：２３１−２４４に記載されている。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０は、タンパク質とその未変性状態で結合し、それによりそのタンパク質に負電荷を付与する。負に帯電したＣｏｏｍａｓｓｉｅで染色されたタンパク質は、次いで、その電荷および分子量に比例した速度で陽極に移動する。
【００８５】
本明細書中に記載される電気泳動ゲル上で、そして本明細書中に記載される方法を使用して分離される生体分子は、任意の生体分子（タンパク質、核酸、多糖、脂質、および他の高分子が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される電気泳動ゲル上で、そして本明細書中に記載される方法を使用して分離される生体分子は、タンパク質、核酸、またはタンパク質もしくは核酸を含有する生体分子複合体である。例としてのみであるが、このような生体分子複合体は、会合したタンパク質、ペプチド、核酸および多糖の任意の組合せであり得る。例示的な実施形態では、上記ゲルのスタッキング部分に直鎖状ポリアクリルアミドを含む電気泳動ゲル上で分離される生体分子または複合体は、タンパク質またはタンパク質を含有する分子複合体である。特定の実施形態では、上記電気泳動ゲルは、少なくとも２つの標準の電気泳動のため、または少なくとも１つの試料と少なくとも１つの分子量標準の電気泳動のための２つ以上のウェルを有する。例示的な実施形態では、本明細書中で開示されるような一定の内部間隙を有するゲルカセット中に含有される電気泳動ゲル上で分離される生体分子または複合体は、タンパク質またはタンパク質を含有する分子複合体である。
【００８６】
上記電気泳動ゲルに適用された、１つまたは複数の試料、または同一の試料の２つ以上の複製物は、生体分子を含有する任意の試料であり得、そして環境試料、組織試料、細胞抽出物または画分であり得る。この試料は、溶菌液、分画された試料、あるいは部分的にかもしくは実質的に加工されたかまたは精製された試料のような、粗試料であってもよい。電気泳動ゲル上のローディングの前に、試料を、可溶化剤、還元剤、変性剤もしくは処理剤、界面活性剤、カオトロピック薬、または他の試料調製剤で処理することができる。ブルーネイティブゲルでの電気泳動の場合には、タンパク質およびタンパク質複合体は、電気泳動の前に変性されないが、これらを、例えば、非変性界面活性剤のような可溶化剤に曝露してもよい。
【００８７】
本明細書中に記載される方法、ゲルおよびゲルカセットは、生体分子および／または生体分子複合体を電気泳動により分離するために使用することができる。しかしながら、一般的な電気泳動法およびパラメータ（例えば、試料のローディングおよび電気泳動の実行時間）は、当業者に公知であり、そして十分に当業者の能力の範囲内である。さらに、電気泳動の間、ゲルアセンブリ、ゲルカセットおよびランニング緩衝液を保持するように設計された装置は、当業者には周知であり、広く市販されている。このような装置としては、ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられるが、これに限定されない。このような装置は、本明細書中に記載される方法、ゲルおよびゲルカセットとともに使用することができる。
【００８８】
しかしながら、電気泳動の条件は、当該分野で公知のプロトコルに基づいて、従事者により決定され得る。本明細書中で開示される電気泳動分離は、一定電圧、パルス電圧、段階勾配電圧、一定電流、パルス電流、段階勾配電流、一定電力、段階勾配電力またはパルス電力を使用して達成することができる。次いで、本明細書中で開示された方法における印加電場（Ｖ／ｃｍ）は、一定でもパルス型であってもよい。以下に提供される電場範囲を達成するための印加電圧、印加電流または印加電力の強さは、上記電気泳動カセットの寸法および緩衝液の伝導率に依存して変動することが理解される。例としてのみであるが、この印加電圧は、５Ｖ〜２０００Ｖの範囲に及ぶことができ、特定の実施形態では、この印加電圧は、５Ｖ〜１０００Ｖ、５Ｖ〜５００Ｖ、５Ｖ〜２５０Ｖ、または５Ｖ〜１００Ｖの範囲に及ぶことができる。他の実施形態では、この印加電圧は、約１０Ｖ〜約１，０００Ｖ、約２５Ｖ〜約７５０Ｖ、または４０Ｖ〜３００Ｖの範囲に及ぶことができる。例としてのみであるが、上記印加電流は、５ｍＡ〜４００ｍＡの範囲に及ぶことができ、特定の実施形態では、上記印加電流は、５ｍＡ〜２００ｍＡ、５ｍＡ〜１００ｍＡ、５ｍＡ〜５０ｍＡ、または５ｍＡ〜２５ｍＡの範囲に及ぶことができる。１つの実施形態では、印加電流は、１５ｍＡとすることができる。例としてのみであるが、上記印加電流は、５ｍＡ〜４００ｍＡの範囲に及ぶことができ、特定の実施形態では、上記印加電力は、２５ｍＷ〜４００Ｗ、２５ｍＷ〜１００Ｗ、２５ｍＷ〜５０Ｗ、または２５ｍＷ〜２５Ｗの範囲に及ぶことができる。１つの実施形態では、印加電力は、４．５Ｗすることができる。さらに、上記印加電圧（一定またはパルス型）の極性は、正であっても負であってもよく、上記印加電流（一定またはパルス型）の極性は、正であっても負であってもよい。
【００８９】
特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１００Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと５０Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと２５Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１５Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、印加される一定電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１０Ｖ／ｃｍとの間である。
【００９０】
段階勾配電圧の印加のために、段階プロフィールは、１段階、２段階または２段階より多くてもよい。この段階電圧は、ベースライン電圧を印加することにより確立される、一定のベースラインの電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜１０００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜５００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜２００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜１００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜５０Ｖであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電圧の強さは、０Ｖ〜１０Ｖである。このベースライン電圧に印加される電圧段階の強さは、１０Ｖ〜２０００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、この電圧段階は、１０Ｖ〜１０００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電圧に印加される電圧段階の強さは、１０Ｖ〜５００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、この電圧段階の強さは、１０Ｖ〜２００Ｖである。特定の実施形態では、このベースライン電場に印加される電圧段階の強さは、１０Ｖ〜１００Ｖであるが、他方、他の実施形態では、この電圧段階の強さは、１０Ｖ〜５０Ｖである。多段階（例えば、２段階以上）のために、各段階の強さは、対称的（すなわち、同一）とすることができ、または各段階の強さは、非対称的（すなわち、異なる）とすることができる。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の５０Ｖの段階が印加され、次いで別の５０Ｖの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の５０Ｖの段階が印加され、次いで４５０Ｖの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の５０Ｖの段階が印加され、次いで５００Ｖの段階が印加される。他の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の７５Ｖの段階が印加され、次いで１７５Ｖの段階が印加される。他の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｖベースラインに最初の７５Ｖの段階が印加され、次いで２５０Ｖの段階が印加される。１段階は、または多段階勾配の各段階は独立して、上記印加電圧の強さに依存して、約５分間〜約５００分間、実行され得る。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１５０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１００分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約６０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約３０分とすることができる。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は４５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電圧プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６５分間印加される。
【００９１】
段階勾配電流プロフィールの印加のために、段階プロフィールは、１段階、２段階または２段階より多くてもよい。この段階電流は、ベースライン電流を印加することにより確立される、一定のベースラインの電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜１０ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜５ｍＡである。特定の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜２ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜１ｍＡである。特定の実施形態では、このベースライン電流の強さは、０ｍＡ〜０．５ｍＡである。ベースライン電流に印加される電流段階の強さは、０．５ｍＡ〜１００ｍＡとすることができるが、他方、他の実施形態では、この電流段階は、０．５ｍＡ〜５０ｍＡである。特定の実施形態では、ベースライン電流に印加される電流段階の強さは、０．５ｍＡ〜２５ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、この電流段階は、０．５ｍＡ〜１０ｍＡである。特定の実施形態では、ベースライン電流に印加される電流段階の強さは、０．５ｍＡ〜５ｍＡであるが、他方、他の実施形態では、この電流段階は、０．５ｍＡ〜２ｍＡである。多段階（例えば、２段階以上）のために、各段階の強さは、対称的（すなわち、同一）とすることができ、または各段階の強さは、非対称的（すなわち、異なる）とすることができる。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階電流電流プロフィールでは、０ｍＡベースラインに最初の７ｍＡの段階が印加され、次いで別の７ｍＡの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の非対称的な段階勾配電流プロフィールでは、０ｍＡベースラインに最初の１ｍＡの段階が印加され、次いで１４ｍＡの段階が印加される。１段階は、または多段階勾配の各段階は独立して、上記印加電流の強さに依存して、約５分間〜約５００分間、実行され得る。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１５０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１００分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約６０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約３０分とすることができる。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は４５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電流プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６５分間印加される。
【００９２】
段階勾配電力プロフィールの印加のために、段階プロフィールは、１段階、２段階または２段階より多くてもよい。この段階電流は、ベースライン電力レベルを印加することにより確立される、一定のベースライン電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜１０Ｗであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜５Ｗである。特定の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜２Ｗであるが、他方、他の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜１Ｗである。特定の実施形態では、このベースライン電力の強さは、０Ｗ〜０．５Ｗである。ベースラインに印加される電力段階の強さは、０．５Ｗ〜１０Ｗであってよいが、他方、他の実施形態では、この電力段階は、０．５Ｗ〜５Ｗである。特定の実施形態では、ベースラインに印加される電力段階の強さは、０．５Ｗ〜２Ｗであってよいが、他方、他の実施形態では、この電力段階の強さは、０．５ｍＡ〜１Ｗである。多段階（例えば、２段階以上）のために、各段階の強さは、対称的（すなわち、同一）とすることができ、または各段階の強さは、非対称的（すなわち、異なる）とすることができる。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０Ｗベースラインに最初の１．５Ｗの段階が印加され、次いで別の１．５Ｗの段階が印加される。特定の実施形態では、２段階の対称的な段階勾配電圧プロフィールでは、０ｍＡベースラインに最初の０．５Ｗの段階が印加され、次いで３Ｗの段階が印加される。１段階は、または多段階勾配の各段階は独立して、上記印加電流の強さに依存して、約５分間〜約５００分間、実行され得る。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１５０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約１００分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約６０分とすることができる。特定の実施形態では、前記段階の実行時間は、約５分〜約３０分とすることができる。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は４５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は５５分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６０分間印加される。２段階の非対称的段階勾配電力プロフィールについての特定の実施形態では、第１段階は、１５分間印加され、そして第２段階は６５分間印加される。
【００９３】
パルス型電場（印加電圧、電流または電力）のプロフィールは、矩形波、三角波または正弦波であってよく、このようなプロフィールは、対称的または非対称的であってよい。パルス型電場は、一定ベースライン電場に印加され、そしてこのベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜５０Ｖ／ｃｍである。このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍである。このベースライン電場の強さは、０Ｖ／ｃｍ〜１０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１００Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと５０Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと２５Ｖ／ｃｍとの間である。特定の実施形態では、このベースライン電場に加えて印加されるパルス型電場の強さは、１Ｖ／ｃｍと１０Ｖ／ｃｍとの間である。
【００９４】
対称的な矩形波であるパルス型電場について、ベースライン電場に加えてこのパルス型電場が印加される（オン）時間は、このパルス型電場が印加されない（オフ）時間と同一である。特定の実施形態では、オン時間およびオフ時間は、１ｍｓと６０秒との間である。非対称的な矩形波であるパルス型電場について、ベースライン電場に加えてこのパルス型電場が印加される（オン）時間は、このパルス型電場が印加されない（オフ）時間と同一ではない。特定の実施形態では、オン時間は、独立に１ｍｓと６０秒との間であり、そしてオフ時間は、独立に１ｍｓと６０秒との間である。
【００９５】
対称的な三角波であるパルス型電場について、印加される最大電場までの電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）は、電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）が印加されるベースライン電場まで下がる時間と同一である。特定の実施形態では、上向きの電圧傾斜および下向きの電圧傾斜は、１０ｍＶ／ｓと１００Ｖ／ｓとの間である。非対称的な三角波であるパルス型電場について、印加される最大電場までの電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）は、電圧傾斜速度（Ｖ／ｓ）が印加されるベースライン電場まで下がる時間と同一ではない。特定の実施形態では、上向きの電圧傾斜は、独立に１０ｍＶ／ｓと１００Ｖ／ｓとの間であり、そして下向きの電圧傾斜は、独立に１０ｍＶ／ｓと１００Ｖ／ｓとの間との間である。
【００９６】
対称的な正弦波であるパルス型電場について、周期および周波数は一定であり、この正弦波の最少電場は、印加されるベースライン電場と同一である。非対称的な正弦波であるパルス型電場について、周期および周波数は変調され、この正弦波の最少電場は、印加されるベースライン電場と同一である。
【００９７】
本明細書中で開示される方法の電気泳動の行程は、室温、周囲温度、またはより高温もしくはより低温で実施することができる。例としてのみであるが、使用者が、予め冷却された緩衝液を用いて冷蔵室で、または予め冷却された緩衝液を用いて室温でゲルを実行することが望ましいかも知れない。特定の実施形態では、上記電気泳動の行程は、より低温で実施される。このより低温としては、約１℃〜約１０℃の温度が挙げられるが、これらに限定されない。低温での行程について、その行程の最後により高い電圧でゲルを実行することが好ましい場合があり得る。
【００９８】
本明細書中で開示される方法はまた、生体分子を含む電気泳動されたゲル上で１つまたは複数のバンドを検出する工程を包含する。１つまたは複数の生体分子または生体分子複合体は、当該分野で周知の技術を使用して、電気泳動の前、電気泳動の間、電気泳動の後に染色するかまたは標識することができる。これらのバンドは、ライトボックス、スキャナーを使用して、または特別の設備を用いずに裸眼で観察することができる。必要に応じて、試料の１つまたは複数のバンドの移動距離を定量することができる。必要に応じて、１つまたは複数の試料とともにゲル上で１つまたは複数の組の分子量マーカーを電気泳動に適用することにより、分子量マーカーを、試料が電気泳動されるのと同一のゲル上で電気泳動することができる。試料に由来する１つまたは複数のバンドの分子量は、そのバンドの移動を分子量マーカーの１つまたは複数のバンドの移動と比較することにより、見積もるかまたは計算することができる。この１つまたは複数のバンドは、例えば、タンパク質、タンパク質複合体、核酸、または核酸−タンパク質複合体を表すことができる。
【００９９】
上記電気泳動ゲル中で上記試料バンドを可視化することは、その分離ゲルを適切な波長の光で照らして、その試料バンドと会合した色素、染色剤または他の指示薬の観察を可能にすることにより達成される。本明細書中で開示される方法において使用される可視化方法の特定の実施形態では、色素、染色剤または他の指示薬は、上記電気泳動ゲル中のローディングの前に上記試料に添加される。他の実施形態では、上記色素、染色剤または他の指示薬は、上記試料を上記電気泳動ゲルのローディングウェルに添加する前にローディングウェルに添加されるが、他方、他の実施形態では、上記色素、染色剤または他の指示薬は、上記試料を上記電気泳動ゲルのローディングウェルに添加した後にローディングウェルに添加される。あるいは、本明細書中で開示される方法において使用される可視化方法の特定の実施形態では、色素、染色剤または他の指示薬は、上記電気泳動ゲルに添加される。これにより、それらは、電気泳動による移動の間に試料成分と会合するようになる。本明細書中で開示される方法において使用される可視化方法のさらに他の実施形態では、色素、染色剤または他の指示薬は、試料成分に共有結合で結びつけられる。
【０１００】
可視化のために使用されるシステム、色素および染色剤は、蛍光性であってもよく、または非蛍光性であってもよい。本明細書中で開示される方法において使用されるシステム、色素および染色剤の非限定的な例は、銀染色またはＣｏｕｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色である。
【０１０１】
可視化のために使用される光は、単色性であっても多色性であってもよい。例としてのみであるが、多色性光は、白色光、ＵＶ光または赤外光であってよく、他方、単色光は、レーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用するか、または白色光、ＵＶ光または赤外光のような光源から特定の分光学的フィルタリングにより、達成することができる。このような単色光の所望の波長は、使用される色素または染色剤の特定の分光特性に依存し、そして当業者は、このような単色光を入手するための方法を知っていることが理解される。
【０１０２】
特定の実施形態では、可視化は、独立型の「ライトボックス」中で実施される。このライトボックスの中に、上記試料の電気泳動による分離の間または後に、上記電気泳動カセットが置かれる。このようなライトボックスの中で、上記電気泳動カセットは、上から、または下から照らされる。ＣＣＤカメラもしくはビデオカメラを使用すること、または使用者の直接観察により、モニタリングすることができる。このような可視化の他の実施形態では、モニタリング手段（ＣＣＤカメラもしくはビデオカメラ、または直接観察）および電場を印加するための手段が１つの装置に組み合わされている電気泳動／モニタリング装置が使用される。
【０１０３】
図１は、直鎖状アクリルアミドをスタッカー中に含有するゲルおよび直鎖状アクリルアミドをスタッカー中に含有しないゲル上でのタンパク質およびタンパク質複合体の電気泳動による分離を比較する。使用した電気泳動ゲルは、直鎖状アクリルアミドをスタッキングゲル中に含まない（上側ゲル）、または０．０５％の直鎖状アクリルアミドをスタッキングゲル中に含む（下側ゲル）３〜１２％ブルーネイティブ勾配ゲルであった。ゲルを、５０ｍＭ ビストリス、５０ｍＭ トリシンランニング緩衝液（陰極緩衝液においてのみ、０．０２％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０）を使用して、９０分間、１５０Ｖで実行し、そしてコロイド状Ｃｏｏｍａｓｓｉｅで染色した。レーン１、５および１０に、５ｕＬの未染色の未変性標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をロードし、レーン２、４、７および９に１％ドデシルマルトシド中に可溶化したウシのミトコンドリア抽出物４ｕＬをロードした。矢印は、スカーティングアーチファクト（上側ゲルにのみ存在する）を示す。直鎖状アクリルアミドをスタッキングゲル中に含まない電気泳動ゲルで観察されるように、スタッキングゲル中に直鎖状アクリルアミドが存在すると、スカーティング効果が低減される。
【０１０４】
実施例
実施例１：未変性タンパク質／タンパク質複合体のゲル電気泳動
ゲルおよびカセット：
ビストリス−Ｃｌ、ｐＨ ７．０および０．３ｍＭ ＣＨＡＰＳ界面活性剤中にアクリルアミド／ビスアクリルアミドを２５．５：１で含む、３〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを注ぎこんだ。スタッカーは、３％のアクリルアミド／ビスアクリルアミド（２５．５：１の比）、および０．０５％ 重量／体積の直鎖状アクリルアミド（６００，０００〜１，０００，０００ダルトン）であった。第１のゲルを、上側エッジに沿ったカセットの中央における間隙の測定値が０．９２３ｍｍであるカセットに注ぎ、そして第２のゲルを、上側エッジに沿ったカセットの中央において０．９９１ｍｍの間隙を有するカセットに注いだ。これらのカセットの左側エッジおよび右側エッジにおけるプレート間間隙は、１．０１ｍｍと１．０２ｍｍとの間であった。それゆえ、この第１のゲルカセットは、この第２のゲルカセットと比較してより狭い中央領域を有する。
【０１０５】
試料調製：
ウシのミトコンドリアを、以前（Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｍ．およびＲｉｃｋｗｏｏｄ Ｄ．の編集による「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中の１０７−１１５頁、Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｅ．およびＬｉｎｄｓａｙ，Ｊ．Ｇ．（２００２）「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ」）に記載されたとおりに単離した。ＴＥＳＳ緩衝液（２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭ スクシネート、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４℃においてｐＨ７．８）中に単離されたミトコンドリアを、２５０ｕＬのアリコートで−８０℃で保存した。アリコートを氷上で解凍してから、１％ ドデシルマルトシドまたは２％ ジギトニン、５０ｍＭ ビストリス−ＣＬ、ｐＨ，７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％重量／体積 グリセロールおよび０．００１％ Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓを含有する、冷たい１×試料緩衝液中でミトコンドリアタンパク質を抽出した。黄色いピペット先を通して吸上げ吸出しすることにより、そして上下反転させることにより、ミトコンドリアを緩衝液中に溶解した。氷上で１５分間インキュベーションしたのち、ミトコンドリア抽出物を、４℃、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清をアリコートに分けて、使用するまで−８０℃で保存した。上記ゲルにロードする前に、５％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０および２０．１％ ＮＤＳＢ２０１を含有する５％ Ｇ−２５０試料添加物を、Ｇ−２５０の最終濃度が上記試料中の界面活性剤濃度の１／４であるように、上記試料に添加した。５％ Ｇ−２５０試料添加物を、試料が氷上にある間であって、ゲルにロードする直前に上記試料に添加した。界面活性剤を含有しない試料については、５％ Ｇ−２５０試料添加物を使用しなかった。
【０１０６】
ＩｇＭ、アポフェリチン、Ｂ−フィコエリトリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミンおよびダイズトリプシンインヒビターを含む、５マイクロリットルの未染色の未変性タンパク質標準を、上記ゲル上の分子量マーカーとして使用した。
【０１０７】
Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（商標）ゲル上への試料のローディング：
櫛およびテープを取り除き、次いで試料ウェルを陰極緩衝液で１回リンスし、次いで陰極緩衝液でこの試料ウェルを再び満たすことにより、試料の適用のための未変性のゲルを調製した。試料を、ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の外側か、そのミニセルの中かのいずれかで、上記ゲル上へロードし、その後ランニング緩衝液を添加した。その試料を、できるだけ薄い層で上記ウェルの底部に試料を送達することにより陰極の下にその試料を置くことによって、試料をロードした。上記ゲル上へ試料をロードするのと電気泳動を開始するのとの間の時間を最少にすることにも心掛けた。
【０１０８】
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ゲルのランニング：
ランニング緩衝液を、以下の表に示すとおりに調製した。
【０１０９】
（表１）未変性ゲル電気泳動のためのランニング緩衝液
２０×ランニング緩衝液は、１Ｍ ビストリス、１Ｍ トリシン、ｐＨ ７．５〜７．６５であった。陰極添加剤は０．４％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０の水溶液であった。
【０１１０】
使用した陰極緩衝液の型は、実施した適用に応じて変更した。表２は、使用した種々の陰極緩衝液を詳細に示す。例としてのみであるが、濃青色の陰極緩衝液は、０．０２％のＧ−２５０を含有しており、そして、図３に示すように、それを界面活性剤を含有する試料を使用した未変性電気泳動行程で使用した。０．００２％ Ｇ−２５０を含有する淡青色の陰極緩衝液を、試料が界面活性剤を含有しない場合、または濃青色の陰極緩衝液が下流の適用と干渉する場合の未変性電気泳動行程で使用した。淡青色の陰極緩衝液を使用することで利益を得る下流の適用は、ウエスタンブロット法、銀染色、および二次元未変性ＳＤＳ ＰＡＧＥである。淡青色の陰極緩衝液を必要とする下流プロセッシングのために意図した、界面活性剤を含有する試料の未変性電気泳動行程については、この行程を濃青色の陰極緩衝液を用いて開始し、色素移動前線がそのゲルの下の１／３となったのちに、その行程を休止し、この濃青色の陰極緩衝液を血清ピペットで取り除き、そして名青色の陰極緩衝液に置換してからその行程を再開した。
【０１１１】
（表２）未変性ゲル電気泳動のための陰極緩衝液
【０１１２】
電気泳動を１５０Ｖで実施した。電流限界を、ゲル１つあたり１５ｍＡにセットした。室温の緩衝液を用いて室温で実行する場合、３〜１２％のゲルに対する実行時間は、代表的には９０〜１００分であり、４〜１６％のゲルに対する実行時間は、代表的には１０５〜１２０分であった。
【０１１３】
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ゲルの染色：
未変性ゲルのランニング後は、そのゲルは深い青色であり、いくつかの非常にタンパク質に富んだバンドが目で見えた。しかし、このゲルのさらなる染色が必要であった。この行程の最後では、すべてのタンパク質は、未だ、未変性の折り畳まれた状態にあり、そして最も鋭敏な染色を提供するために、そのタンパク質を少なくとも部分的に変性して、以下の方法に従う色素結合のために、より疎水的な部位を曝露させた。
【０１１４】
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０長期プロトコル、高感度染色：
上記ゲルを、１００ｍＬの定着液（４０％メタノール、１０％酢酸）中に置き、４５秒間、マイクロ波処理して、１５〜３０分間振盪した。この定着ステップを、３〜１２％ゲルについては１回繰返した。この定着液を傾瀉し、そして１００ｍＬの染色溶液をＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ；５５ｍＬ 水、２０ｍＬ メタノール、２０ｍＬ 染色剤Ａ、５ｍＬ 染色剤Ｂ）から添加し、そしてこのゲルを浸透しながら一晩インキュベーションした。染色溶液を傾瀉し、そして１００ｍＬの８％酢酸を添加した。このゲルを、攪拌しながら５分間インキュベーションした（これにより、ゲルまたは染色容器の表面上に沈殿した任意のＧ−２５０が取り除かれる）。次いで、この酢酸を傾瀉し、そして１００ｍＬの蒸留水を添加して、所望のバックグラウンドレベルが得られるまでこのゲルを振盪した。
【０１１５】
図３は代表的な結果を示しており、図３は、上側の間隙の測定値と類似の中央の間隙の測定値を備えたカセットが、スカーティングがないゲルを生成したが、他方で、上側の間隙の測定値よりも有意に小さい中央の間隙の測定値を備えたカセットが、スカーティングゲルを生成したことを示す。ゲルＡにおけるスカーティングアーチファクトを、矢印で示す。
【０１１６】
本発明が例示的な実施形態と関連させて開示されたが、本発明の範囲を示された特定の形態に限定することは意図されておらず、逆に、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の趣旨および範囲内に包含され得るような代替物、改変物、および等価物を網羅することが意図されている。
【０１１７】
上記の説明は本発明の例示にすぎないことを理解するべきである。見出しは便宜のためのみであり、見出しのもとに入る開示をその見出しのみに限定することは意図されていない。種々の代替物および改変物が、本発明から逸脱することなく当業者によって考案され得る。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るすべてのそのような代替物、改変物および変態物を包含することが意図されている。
【０１１８】
本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個別の刊行物、特許および特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されると示されたのと同程度に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】スタッキングゲル中に０．０５％の直鎖状アクリルアミドを含まないで（上側ゲル）、または含んで（下側ゲル）作製した３〜１２％ブルーネイティブ勾配ゲルを示す。
【図２】中央で切り落とされたカセット（２１）の模式図を示し、この図においてこのカセットは、前面プレート（２２）および背面プレート（２３）、ならびにその間の間隙（２４）を有する。
【図３】プレート間に一定の間隙幅を有さなかったカセット中で実行されたゲル上（Ａ）、ならびにプレート間に一定の間隙幅を有したカセット中で実行されたゲル上（Ｂ）で分離された試料のタンパク質／タンパク質複合体およびマーカータンパク質を図示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタッキングゲルおよび分離ゲルを含み、前記スタッキングゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む、生体分子の分離のためのポリアクリルアミドゲル。
【請求項２】
スタッキングゲルのアクリルアミド濃度が２％と６％との間である、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項３】
スタッキングゲルのアクリルアミド濃度が２．５％と５％との間である、請求項２記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項４】
スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度が０．００５％〜１％である、請求項２記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項５】
スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度が０．０１％〜０．５％である、請求項４記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項６】
スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度が０．０２％〜０．１％である、請求項５記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項７】
分離ゲルが直鎖状アクリルアミドを含まない、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項８】
変性ゲルである、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項９】
ＳＤＳを含む、請求項８記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１０】
非変性ゲルである、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１１】
非変性ゲルが勾配ゲルである、請求項１０記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１２】
非変性ゲルがブルーネイティブ（Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ）ゲルである、請求項１０記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１３】
以下の工程を含む、電気泳動ゲル上で生体分子を分離する方法：
１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含むアクリルアミドゲルに適用する工程であって、前記スタッキングゲル部分は、直鎖状ポリアクリルアミドを含む、工程；ならびに
１つまたは複数の生体分子を前記ゲル上で電気泳動により分離する工程。
【請求項１４】
分離ゲル部分が直鎖状アクリルアミドを含まない、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
電気泳動ゲルが変性ゲルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
電気泳動ゲルが非変性ゲルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
非変性ゲルがブルーネイティブゲルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
非変性ゲルが勾配ゲルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数の分子量マーカーセットを電気泳動ゲルに適用する工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
電気泳動ゲル上の１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
未変性ゲル電気泳動を実施するためのカセットであって、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する、カセット。
【請求項２２】
その上側エッジにわたって０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の間隙幅を有する、請求項２１記載のカセット。
【請求項２３】
間隙幅が、５％未満で変動する、請求項２１記載のカセット。
【請求項２４】
間隙幅の変動が２％以下である、請求項２３記載のカセット。
【請求項２５】
ポリアクリルアミドを含むゲルを含有する、請求項２３記載のカセット。
【請求項２６】
ゲルが非変性ゲルである、請求項２５記載のカセット。
【請求項２７】
ゲルがブルーネイティブゲルである、請求項２６記載のカセット。
【請求項２８】
ゲルが勾配ゲルである、請求項２６記載のカセット。
【請求項２９】
プラスチックを含む、請求項２１記載のカセット。
【請求項３０】
前面プレートを背面プレートに溶接することにより作製される、請求項２９記載のカセット。
【請求項３１】
以下の工程を含む、電気泳動ゲル上で生体分子を分離するための方法：
１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有するカセット内のゲルに適用する工程；ならびに
１つまたは複数の生体分子を前記ゲル上で電気泳動により分離する工程。
【請求項３２】
カセットがその上側エッジにわたって、０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の間隙幅を有する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ゲルがマルチウェル型ゲルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
電気泳動ゲルが非変性ゲルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
非変性ゲルがブルーネイティブゲルである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
非変性ゲルが勾配ゲルである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
ゲルがスタッキングゲルおよび分離ゲルを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
スタッキングゲルが直鎖状アクリルアミドを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
１つまたは複数の分子量マーカーセットを電気泳動ゲルに適用する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
電気泳動ゲル上の分離された１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ゲルを染色する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項１】
スタッキングゲルおよび分離ゲルを含み、前記スタッキングゲルが直鎖状ポリアクリルアミドを含む、生体分子の分離のためのポリアクリルアミドゲル。
【請求項２】
スタッキングゲルのアクリルアミド濃度が２％と６％との間である、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項３】
スタッキングゲルのアクリルアミド濃度が２．５％と５％との間である、請求項２記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項４】
スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度が０．００５％〜１％である、請求項２記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項５】
スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度が０．０１％〜０．５％である、請求項４記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項６】
スタッキングゲルの直鎖状アクリルアミド濃度が０．０２％〜０．１％である、請求項５記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項７】
分離ゲルが直鎖状アクリルアミドを含まない、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項８】
変性ゲルである、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項９】
ＳＤＳを含む、請求項８記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１０】
非変性ゲルである、請求項１記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１１】
非変性ゲルが勾配ゲルである、請求項１０記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１２】
非変性ゲルがブルーネイティブ（Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ）ゲルである、請求項１０記載のポリアクリルアミドゲル。
【請求項１３】
以下の工程を含む、電気泳動ゲル上で生体分子を分離する方法：
１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、スタッキングゲル部分および分離ゲル部分を含むアクリルアミドゲルに適用する工程であって、前記スタッキングゲル部分は、直鎖状ポリアクリルアミドを含む、工程；ならびに
１つまたは複数の生体分子を前記ゲル上で電気泳動により分離する工程。
【請求項１４】
分離ゲル部分が直鎖状アクリルアミドを含まない、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
電気泳動ゲルが変性ゲルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
電気泳動ゲルが非変性ゲルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
非変性ゲルがブルーネイティブゲルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
非変性ゲルが勾配ゲルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数の分子量マーカーセットを電気泳動ゲルに適用する工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
電気泳動ゲル上の１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
未変性ゲル電気泳動を実施するためのカセットであって、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有する、カセット。
【請求項２２】
その上側エッジにわたって０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の間隙幅を有する、請求項２１記載のカセット。
【請求項２３】
間隙幅が、５％未満で変動する、請求項２１記載のカセット。
【請求項２４】
間隙幅の変動が２％以下である、請求項２３記載のカセット。
【請求項２５】
ポリアクリルアミドを含むゲルを含有する、請求項２３記載のカセット。
【請求項２６】
ゲルが非変性ゲルである、請求項２５記載のカセット。
【請求項２７】
ゲルがブルーネイティブゲルである、請求項２６記載のカセット。
【請求項２８】
ゲルが勾配ゲルである、請求項２６記載のカセット。
【請求項２９】
プラスチックを含む、請求項２１記載のカセット。
【請求項３０】
前面プレートを背面プレートに溶接することにより作製される、請求項２９記載のカセット。
【請求項３１】
以下の工程を含む、電気泳動ゲル上で生体分子を分離するための方法：
１つまたは複数の生体分子を含む１つまたは複数の試料を、その上側エッジにわたって一定の間隙幅を有するカセット内のゲルに適用する工程；ならびに
１つまたは複数の生体分子を前記ゲル上で電気泳動により分離する工程。
【請求項３２】
カセットがその上側エッジにわたって、０．１ミリメートル〜５ミリメートルの範囲の間隙幅を有する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ゲルがマルチウェル型ゲルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
電気泳動ゲルが非変性ゲルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
非変性ゲルがブルーネイティブゲルである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
非変性ゲルが勾配ゲルである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
ゲルがスタッキングゲルおよび分離ゲルを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
スタッキングゲルが直鎖状アクリルアミドを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
１つまたは複数の分子量マーカーセットを電気泳動ゲルに適用する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
電気泳動ゲル上の分離された１つまたは複数の生体分子もしくは生体分子複合体の分子量を見積もるかまたは計算する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ゲルを染色する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５２２５５４（Ｐ２００９−５２２５５４Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４８８２４（Ｐ２００８−５４８８２４）
【出願日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６２５１４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７６４５２
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６２５１４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７６４５２
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
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