ポリグルロン酸の製造方法、ポリマンヌロン酸の製造方法、ポリグルロン酸、及びポリマンヌロン酸
【課題】質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００以上で、所望の分子量を有する高純度のポリグルロン酸及び、質量平均分子量（Ｍｗ）が５，０００以上で、所望の分子量を有する高純度のポリマンヌロン酸、並びに該ポリグルロン酸及び該ポリマンヌロン酸を製造する方法の提供。
【解決手段】二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離することを特徴とするポリグルロン酸の製造方法。
【解決手段】二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離することを特徴とするポリグルロン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸加水分解物として得られる多糖類である、ポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸の製造方法、並びに該製造方法を用いて得られるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸性多糖類の一種であるアルギン酸は、褐藻の細胞壁及び細胞間に充填物質として存在する多糖類であり、その構成単位をα-Ｌ-グルロン酸（Ｇ）、β-Ｄ-マンヌロン酸（Ｍ）とするコポリマーである。
【０００３】
アルギン酸は食品添加物（安定化剤、ゲル化剤）としての利用の他に、医薬品、化粧品、印刷、染色、歯科材料、水処理等の分野にも使用されている。また、免疫賦活作用、抗肥満作用、血中コレステロール上昇抑制作用、高血圧抑制作用などの生理活性も報告されており、健康食品としても注目されている。一般に、酸性多糖類の特性や生理活性等は、その構造や分子量によって異なると考えられるが、アルギン酸を構成する構成単位のＧとＭのそれぞれの量、構成比等の関係が前記アルギン酸の特性や生理活性等にどのように作用しているかは、明らかにされていない。また、明らかにするためには構造解析や分子量を制御するための手法の確立が必要となる。そのため、純度が高く、分子量分布が狭いポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸の出現が強く求められている。
【０００４】
アルギン酸中のＧとＭの構成比は、一般的にM／G比により表され、１３Ｃ ＮＭＲや１Ｈ ＮＭＲを測定して求める方法が知られている（非特許文献１，２）。褐藻由来のアルギン酸のM／G比は、原産地や褐藻の抽出部位の違いによって異なる。
【０００５】
従来、ポリグルロン酸を得るためには、強酸性である塩酸の水溶液中でアルギン酸を加水分解する不均一酸性加水分解法や、弱酸性であるクエン酸水溶液中でアルギン酸を加水分解する均一酸性加水分解法等が知られている。しかし、いずれの方法においても、原料であるアルギン酸の水に対する溶解度が低い（０．２〜０．５質量％程度）ために、加水分解反応の制御が困難であり、所望の分子量を有するポリグルロン酸又はポリマンヌロン酸を得ることができないという問題がある。
さらに、前記不均一酸性加水分解法や、均一酸性加水分解法では、加水分解によってポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を得られたとしても、その分子量は広範囲のものを含むこととなる。
【０００６】
有機塩基を含む水溶液中にアルギン酸塩を溶解した場合には、０．５質量％を超える濃度で溶解することができ、重合度が２０未満であり、且つグルロン酸含有率９２％以上のポリグルロン酸を得る方法が、特許文献１に開示されている。
しかし、この方法によっても、重合度が２０以上（質量平均分子量４，０００以上）の場合においては、所望の分子量を有するポリグルロン酸又はポリマンヌロン酸を得ることはできていないという問題がある。
さらに精製工程で有機塩基類の除去工程が必要になることからコストの上昇要因となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Grasdalen, H.; Larsen, B.; Smidsrod, O. Carbohydrate Research 1977, 56, C11.
【非特許文献２】Grasdalen, H. Carbohydrate Research 1983, 118, 255.
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−３４３０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、所望の分子量を有し、かつ高純度で分子量分布が狭いポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を製造する方法の提供、並びに、その方法によって得られるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１に記載のポリグルロン酸の製造方法は、二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離することを特徴とする。
本発明の請求項２に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１において、前記水溶液をｐＨ２．０〜４．０に調整することによって、ポリグルロン酸を優先的に析出させることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１又は２において、前記加水分解によって、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせることを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１〜３のいずれか一項において、前記加熱処理時の温度が７０〜１４０℃であることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１〜４のいずれか一項において、前記加水分解における加熱処理前の初期圧力を０．１〜６ＭＰａとすることを特徴とする。
本発明の請求項６に記載のポリマンヌロン酸の製造方法は、二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、溶解度の低い成分を析出させて分離し、当該溶解度の低い成分を回収した後の回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とする。
本発明の請求項７に記載のポリマンヌロン酸の製造方法は、請求項６において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とする。
本発明の請求項８に記載のポリマンヌロン酸の製造方法は、請求項６において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離することを特徴とする。
本発明の請求項９に記載のポリグルロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００であることを特徴とする。
本発明の請求項１０に記載のポリマンヌロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリグルロン酸の製造方法によれば、質量平均分子量が４，０００〜１７０，０００の範囲で所望の質量平均分子量を有する多糖類（アルギン酸加水分解物）を調製し、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、該多糖類からポリグルロン酸を分離することによって、所望の質量平均分子量を有する、純度の高いポリグルロン酸を得ることができる。
本発明において、特に明記しない限り、純度とは前記ポリグルロン酸又は前記ポリマンヌロン酸を構成するグルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位のうち、グルロン酸（Ｇ）単位又はマンヌロン酸（Ｍ）単位が構成する割合のことを言う。
本発明のポリマンヌロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００であるという、従来のポリマンヌロン酸にはない特徴を有するものである。
【００１２】
また、本発明のポリグルロン酸の製造方法によれば、加水分解にＣＯ２を用いることによって、アルギン酸を１０質量％程度まで均一に溶解することが可能となり、反応制御も比較的容易となるため生産効率が向上し、さらに、従来に比べて高純度のポリグルロン酸を得ることができる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記水溶液をｐＨ２．０〜４．０に調整することが好ましい。これにより、前記所望の質量平均分子量を有する多糖類から、所望の分子量のポリグルロン酸を優先的に析出させることができる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせることが好ましい。これにより、得られるポリグルロン酸の質量平均分子量を４，０００〜６８，０００とすることができる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加熱処理において温度を７０〜１４０℃とすることが好ましい。この範囲の下限値以上にすることによって、加水分解反応の速度を速めることができ、この範囲の上限値以下にすることによって、過分解物の生成を低減できる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、加熱処理前の初期圧力を０．１〜６ＭＰａとすることが好ましい。この範囲の下限値以上にすることによって、加水分解反応を効率よく行なうことができ、この範囲の上限値以下にすることによって、過分解物の生成を低減できる。
【００１３】
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法によれば、質量平均分子量が４，０００〜１７０，０００の範囲で所望の質量平均分子量を有する多糖類（アルギン酸加水分解物）を調製し、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、溶解度の低い成分を析出させて分離し、当該溶解度の低い成分を回収した後の回収液に含まれる該多糖類からポリマンヌロン酸を分離することによって、所望の質量平均分子量を有する、純度の高いポリマンヌロン酸を得ることができる。また、加水分解にＣＯ２を用いることによって、アルギン酸を１０質量％程度まで均一に溶解することが可能となり、反応制御も比較的容易となるため生産効率が向上し、さらに、従来に比べて高純度のポリマンヌロン酸を得ることができる。
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成するグルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することが好ましい。これにより、ポリグルロン酸が比較的多く含まれる多糖類からでもポリマンヌロン酸を高純度で得ることができる。
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成するグルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離することが好ましい。これにより、高純度のポリマンヌロン酸を収率良く得ることができる。
本発明のポリグルロン酸が有する、「グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００である」という特徴は、従来のポリグルロン酸にはないものである。
本発明のポリマンヌロン酸が有する、「グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００である」という特徴は、従来のポリマンヌロン酸にはないものである。
【００１４】
本発明により得られた所望のＭｗを有するポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸は、従来技術を用いて得られたものに比べ高純度且つ分子量分布が狭いため、ポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸のＭｗに依存して発現される機能（例えば生理活性等）を調べるためのサンプルとすることができる。このような分析用途のサンプルとする場合は、サンプルの純度は高ければ高いほど分析精度が高くなり、好ましいことはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】本発明の製造方法に使用することができる反応装置の一例を示す概略図である。
【図３】ＨＧを加水分解した際の、反応温度、反応時間、及び加水分解物の質量平均分子量の関係を示すグラフである。
【図４】ＨＭを加水分解した際の、反応温度、反応時間、及び加水分解物の質量平均分子量の関係を示すグラフである。
【図５】ＨＧの加水分解時の反応温度と過分解物の生成との関係を示す１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、詳細に説明する。なお、本発明において、特に明記しない限り分子量の単位としてＤａ（ダルトン）を用いる。
【００１７】
＜ポリグルロン酸の製造方法＞
本発明のポリグルロン酸の製造方法は、二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させる方法である。
【００１８】
［加水分解処理］
前記溶液の溶媒としては、不純物が除かれた水が好ましい。前記水は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等を加えた中性の塩類水溶液としてもよい。塩類水溶液を使用することによって、原料のアルギン酸の溶解度を調節することができる。
【００１９】
前記溶液は、前記溶媒に二酸化炭素（ＣＯ２）をバブリングしたものであることが好ましい。例えば、ＣＯ２飽和水溶液（炭酸水）が好ましい。
アルギン酸のｐＫａ値は３．６前後であるため、ＣＯ２を用いることによって、アルギン酸を１０質量％程度まで均一に溶解させることが可能である。このため、反応制御が比較的容易となり、生産効率も向上する。
【００２０】
また、アルギン酸を構成するＧ同士の結合（Ｇ−Ｇ結合）、ＧとＭの結合（Ｇ−Ｍ結合）、Ｍ同士の結合(Ｍ−Ｍ結合)の結合エネルギーを比較すると、Ｇ−Ｇ結合に比べてＧ−Ｍ結合、Ｍ−Ｍ結合の結合エネルギーが小さい。本発明においては、ＣＯ２は結合エネルギーが大きなＧ−Ｇ結合以外の結合を優先的に加水分解することができ、従来に比べて高純度のポリグルロン酸が得られる、という新しい知見を得、この知見を大いに利用している。
【００２１】
前記アルギン酸としては、Ｇ、Ｍを含むものであれば特に制限されないが、加水分解処理における取り扱いが容易となることから、その質量平均分子量（Ｍｗ）が５０万以下のものが好ましい。一方、質量平均分子量（Ｍｗ）が５０万を超えるものを使用すると、溶液の粘度が高くなり、取り扱いが不便であると共に、所望の分子量を有する加水分解物となるまでの加水分解反応の時間が不当に長くなる。
【００２２】
前記アルギン酸としては、前記溶媒としての水へのアルギン酸の溶解度を高める観点から、アルギン酸塩が好ましく、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、及びアルギン酸アンモニウムがより好ましく、アルギン酸ナトリウムがさらに好ましい。
前記アルギン酸塩は、一種を単独で使用してもよいし、二種以上を使用してもよい。
【００２３】
前記アルギン酸としては、市販品を使用することが可能である。例えば、株式会社キミカ製のキミカアルギンＨｉｇｈ・ＧシリーズＩ−１Ｇ（以下、ＨＧと呼ぶことがある。）や、株式会社キミカ製のキミカアルギンＨｉｇｈ・ＭシリーズＩＬ−６Ｍ（以下、ＨＭと呼ぶことがある。）が好適なものとして挙げられる。
【００２４】
前記ＨＧは、グルロン酸含有率が高く（６７％以上、M／G比＜０．４９）、分子量（質量平均分子量：Ｍｗ）が５０万以下のアルギン酸ナトリウムである。
前記ＨＭは、マンヌロン酸含有率が高く（５６％以上、M／G比＞１．２８）、分子量（質量平均分子量：Ｍｗ）が５０万以下のアルギン酸ナトリウムである。
【００２５】
本発明において、前記アルギン酸は、不純物が少ない高純度のものを用いることが好ましい。
前記ＨＧ、前記ＨＭは、海草（褐藻）由来のアルギン酸をイオン交換法によって精製して得られたアルギン酸ナトリウムであり、元来Ｇ又はＭを多く含むため、本発明のアルギン酸として好適に用いることができる。アルギン酸を精製する方法としては、イオン交換法の他に、酸を使用した方法（酸法）が知られている（特許文献１参照）。本発明に用いる前記アルギン酸は、前記酸法によって精製されたものであってもよい。
【００２６】
上記海藻としては特に限定されないが、スジメやアイヌワカメ、ウガノモクなどを挙げることができる。スジメは春頃にM／G比が高いアルギン酸、秋頃にM／G比が低いアルギン酸を得ることができ、アイヌワカメは春頃にM／G比が低いアルギン酸を得ることができ、秋頃にM／G比が高いアルギン酸を得ることができる。ウガノモクからは秋頃にM／G比が特に低いアルギン酸を得ることができる。
【００２７】
加水分解に供する前記アルギン酸の濃度としては、０．０５〜１０．０質量％が好ましく、０．１〜５．０質量％がより好ましく、０．２〜２．０質量％がさらに好ましい。
上記範囲の下限値以上であることにより、生成物であるポリグルロン酸の収率を高めることができ、上記範囲の上限値以下であることにより、溶液中に溶解しないアルギン酸の量を低減することができ、製造プロセス上好ましい。
【００２８】
前記加熱処理における温度としては、生成物であるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸が過分解する割合が少ない温度範囲であれば特に制限されないが、７０〜１４０℃の範囲が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応の速度を高める観点からは、上記範囲のうち、より高温側が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応中に、副生成物が発生する割合を低減する観点からは、上記範囲のうち、より低温側が好ましい。
【００２９】
本発明においては、前記二酸化炭素とアルギン酸を含む溶液を加圧することが好ましい。
前記加圧処理における初期圧力は加水分解反応開始前に室温下、二酸化炭素で反応容器内を加圧したときの圧力（ゲージ圧）のことである。
前記初期圧力としては生成物であるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸が過分解する割合が少ない圧力範囲であれば特に制限されないが、０．１〜６ＭＰａの範囲が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応の速度を高める観点からは、上記範囲のうち、より高圧力側が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応中に、副生成物が発生する割合を低減する観点からは、上記範囲のうち、より低圧力側が好ましい。
【００３０】
前記溶液を加熱処理すること、又は前記溶液の初期圧力を加圧処理により高めた後で加熱処理することによって、前記アルギン酸を加水分解することができる。通常、当該アルギン酸の加水分解速度は、加水分解時の温度と初期圧力に依存するので、前記温度及び／又は前記初期圧力を適宜設定して、前記加熱処理をすることによって、当該アルギン酸を所望の質量平均分子量（Ｍｗ）となるように、加水分解することができる。
【００３１】
前記加熱処理による加水分解の時間は、使用するアルギン酸のＭｗ、加水分解の温度、前記初期圧力にもよるが、通常４８時間以内に、加水分解物のＭｗを１０，０００程度まで加水分解することができる。所望の分子量の加水分解物を得るためには、予め定めた条件で加水分解した場合の、反応時間、反応温度、及び加水分解物のＭｗの相関関係を予め求めておけばよい。例えば、図３及び図４を参考にできる。
【００３２】
本発明における前記溶液を加水分解処理した場合、得られるアルギン酸加水分解物（ポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を含む多糖類）のＭｗは、反応時間に応じて、４，０００〜１７０，０００の範囲で所望の分子量とすることができる。
【００３３】
なお、前記加水分解反応によれば、前記多糖類のＭｗの下限値は約４，０００であり、反応時間を延長したとしても、Ｍｗが４，０００よりも大きく下がることはない。
【００３４】
前記加水分解後の反応液は、凍結乾燥することによって該反応液の体積を減らした後、純水を用いて透析することによって、過分解物等の副生成物や不要な塩類を除去することが好ましい。
前記凍結乾燥で溶媒を完全に留去して、固形状の前記多糖類を得た後、これを純水に溶解した水溶液を、さらに純水を用いて透析する方法を採用してもよい。
前記透析処理を行った後の、前記多糖類を溶解した水溶液に沈殿や析出物等の不溶物が観察される場合は、フィルターろ過等によって除くことが好ましい。
【００３５】
［ｐＨ調整処理］
つぎに、前記多糖類を溶解した前記水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離する。
前記多糖類を溶解する溶媒としては、水が好ましい。ｐＨ調整が容易であり、ポリグルロン酸を十分に析出させることができる。
【００３６】
前記水溶液のｐＨを調整する方法としては、該水溶液中の多糖類を過分解するような方法でなければ特に制限されない。例えば、０．１ｍｏｌ／Ｌの希塩酸を滴下する方法が好適である。
【００３７】
ｐＨ調整した後の前記水溶液のｐＨとしては、ｐＨ２．０〜４．０の範囲が好ましい。この範囲に調整することによって、前記水溶液中の多糖類のうち、ポリグルロン酸をより優先的に析出させることができる。
【００３８】
前記ｐＨ調整処理後の水溶液を、低温条件下で一定時間静置することで、ポリグルロン酸が析出し易くなり、収率が向上することとなる。静置の温度及び静置時間は特に限定されないが、例えば、それぞれ1℃〜１０℃、６時間〜２４時間であることが好ましい。前記条件であれば家庭用冷蔵庫を利用することができる。
【００３９】
このｐＨ調整によるポリグルロン酸とポリマンヌロン酸との分離は、グルロン酸のｐＫａ（３．３８）とマンヌロン酸のｐＫａ（３．６５）との相違、すなわちｐＨ調整した後の水溶液における溶解度の違いを利用した方法である。
【００４０】
本発明のポリグルロン酸とポリマンヌロン酸の製造方法において、使用する前記多糖類はＭｗが４，０００以上のポリマーであり、このような多糖類を用いてポリグルロン酸とポリマンヌロン酸とをｐＨ調整によって分離できることを見出したのは、本発明者らが初めてである。
【００４１】
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが１０，０００〜２７，０００の多糖類を生じさせると、製造するポリグルロン酸のＭｗを概ね１４，０００〜３５，０００の範囲とすることができる。
前記ｐH調整において、前記多糖類に含まれるポリグルロン酸の中でも、溶解度が低い（分子量の大きい）ものから析出し、かつ、そのポリグルロン酸の分子量分布（分散度：Ｍｗ/Ｍｎ）が前記多糖類の分子量分布よりも狭いため、前記多糖類より前記ポリグルロン酸のＭｗが大きくなる。
【００４２】
例えば、前記多糖類のＭｗが１４，０００である場合には、前記水溶液のｐＨを２．００〜３．５０の範囲とすることが好ましい。この範囲にｐＨ調整することによって、Ｍｗが１７，０００〜１９，０００のポリグルロン酸を、収率が４〜６３％の範囲、純度（Ｇ％）が８７〜１００％の範囲で得ることができる。
【００４３】
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが４，０００〜１０，０００の多糖類を生じさせると、製造するポリグルロン酸のＭｗを概ね４，０００〜１４，０００の範囲とすることができる。
【００４４】
例えば、前記多糖類のＭｗが６，０００である場合には、前記水溶液のｐＨを２．００〜３．００の範囲とすることが好ましい。この範囲にｐＨ調整することによって、Ｍｗが１０，０００〜１１，０００のポリグルロン酸を、収率が７〜１２％の範囲で、純度（Ｇ％）が９２〜９９％で得ることができる。
【００４５】
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが２７，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせると、製造するポリグルロン酸のＭｗを概ね３５，０００〜６８，０００の範囲とすることができる。
【００４６】
例えば、前記多糖類のＭｗが４０，０００である場合には、前記水溶液のｐＨを２．８５〜３．５０の範囲とすることが好ましい。この範囲にｐＨ調整することによって、Ｍｗが５１，０００〜５５，０００のポリグルロン酸を、収率が９〜５１％の範囲、純度（Ｇ％）が８０〜８４％の範囲で得ることができる。
【００４７】
このように、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨ調整を行うことにより、当該水溶液中のポリグルロン酸を優先的に析出させることができる。
析出したポリグルロン酸を回収して得る方法は特に制限されず、例えば、遠心分離によってポリグルロン酸を沈殿物として回収する方法や、フィルターろ過によってフィルター上にポリグルロン酸を回収する方法等が挙げられる。
【００４８】
析出したポリグルロン酸を回収した後の溶液（回収液）にはポリマンヌロン酸が溶解した状態で含まれている。また、前記ｐＨ調整の操作後でも析出していないポリグルロン酸が含まれている場合がある。
【００４９】
前記溶解した状態のポリマンヌロン酸、又は前記析出していないポリグルロン酸を回収する方法は特に制限されず、溶液を中和し、それを凍結乾燥して固体を得る方法等が挙げられる。
【００５０】
＜ポリマンヌロン酸の製造方法＞
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法は、前記ポリグルロン酸の製造方法において、ｐＨ調整によって溶解度の低い多糖類（ポリグルロン酸高含有成分）を析出させ、析出したものを分離回収した後に得られる、前記回収液を出発材料とする。
前記回収液のｐＨをさらに下げて、前記回収液に含まれるポリマンヌロン酸を前記回収液から分離する。この分離方法としては、例えば次の二通りを挙げることができる。
【００５１】
第一の分離方法は、ポリグルロン酸が、前記ｐＨ調整の操作後でも析出しきらずに前記回収液中に溶存している場合、前記回収液のｐＨをさらに下げることによって、前記ポリグルロン酸を析出させて当該回収液から除去し、ポリマンヌロン酸を当該回収液に溶解した状態で得る方法である。
第二の分離方法は、ポリグルロン酸が、前記ｐＨ調整の操作後に析出し、前記回収液中にはほとんど溶存していない場合、前記回収液のｐＨをさらに下げることによって、ポリマンヌロン酸を当該回収液中に析出させて、得る方法である。
上記二通りの分離方法のどちらを用いるかは、概ね前記加水分解反応後に得られる多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）で判断すればよく、Ｍ／Ｇ比が１．８未満の場合は第一の分離方法、Ｍ／Ｇ比が１．８以上の場合は第二の分離方法を用いることが好ましい。
【００５２】
前記第一の分離方法において、当該回収液からの析出物は、高純度のポリグルロン酸として得られる場合がある。ここで得られるポリグルロン酸のＭｗは、前段のｐＨ調整における水溶液から得られるポリグルロン酸のＭｗよりも、低分子量である傾向がある。
【００５３】
前記第一、第二の分離方法において、当該回収液のｐＨをさらに下げる場合、そのｐＨを１とすると、前記pＨ調整の操作で析出しなかった多糖類を効率的に析出させることができ、好ましい。
【００５４】
前記回収液のｐＨをさらに下げる方法としては、該水溶液中の多糖類を過分解するような方法でなければ特に制限されない。例えば、塩酸を少量滴下する方法が好適である。
【００５５】
前記第一の分離方法としては、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離する方法が好ましい。
前記第二の分離方法としては、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離する方法が好ましい。
Ｍ／Ｇ比＝２．３を基準とすることによって、分子量分布が狭く、純度の高いポリマンヌロン酸をより高い収率で製造できる。
【００５６】
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが５，０００〜５６，０００の多糖類を生じさせることが好ましい。製造するポリマンヌロン酸のＭｗを概ね５，０００〜５５，０００の範囲とすることができる。
前記出発原料とした回収液には、前記ｐＨ調整によって析出した溶解度が低い多糖類、つまり、ポリグルロン酸高含有成分の中でも分子量の大きなものを分離回収した後の、残りの多糖類が多く含まれているため、前記ポリマンヌロン酸の分子量は前記加水分解によって生じさせた多糖類の分子量よりも小さくなる傾向がある。
【００５７】
＜ポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸＞
本発明のポリグルロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００である。
本発明のポリマンヌロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００である。
本発明のポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸は、前述の製造方法によって得られる。
本発明のポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を構成するグルロン酸（Ｇ）単位及びマンヌロン酸（Ｍ）単位の構成比率（％）は、ＮＭＲによって調べられる。例えば、ポリグルロン酸が１００個の構成単位からなり、そのうち８０個がグルロン酸（Ｇ）単位で残りの２０個がマンヌロン酸（Ｍ）単位である場合、このポリグルロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位を８０％含み、マンヌロン酸（Ｍ）単位を２０％含むものである。
【００５８】
＜製造方法のフローチャート＞
本発明にかかるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸の製造方法は、例えば図１に示すフローチャートに従って行うことができる。以下に、フローチャートに沿って説明する。
【００５９】
まず、原料となるアルギン酸を準備し、これをＣＯ２飽和水溶液に投入する。この溶液を加熱処理することによって、前記アルギン酸を所望の質量平均分子量となるまで加水分解する（加水分解工程）。このとき、加熱処理前にＣＯ２で加圧することが好ましい。この後、得られた加水分解反応液に含まれるＣＯ２及び溶媒を凍結乾燥法によって留去して、固形状の加水分解物を得る（凍結乾燥工程）。この加水分解物に一部残存している低分子量のタンパク質や金属イオンを除去するためには、この加水分解物を水に溶解して、純水を用いて透析することが好ましい。
【００６０】
次に、透析した前記加水分解物を水に溶解して水溶液とし、前記水溶液に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を滴下して所定のｐＨ（ｐＨ2.0~4.0）に調製することによって、ポリグルロン酸を優先的に析出させる（ｐＨ調製工程）。続いて前記ｐH調整処理後の水溶液を４℃で１２時間冷蔵保温した後、遠心分離する（遠心分離工程）。その後、該水溶液中に析出した沈殿物を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、凍結乾燥することによって溶媒成分を留去して、ポリグルロン酸を沈殿１として得ることができる。一方、前記沈殿物を回収した後の上澄み液（回収液１）には、ポリマンヌロン酸及び前記操作で析出しなかったポリグルロン酸が溶解している。
【００６１】
前記回収液１のｐHを１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いてさらに下げて（ｐＨ1.00）、得られた溶液（第二の析出溶液）において析出した加水分解物を沈殿物として回収することによって残余のポリグルロン酸を除去し、ポリマンヌロン酸が溶解した状態の回収液(回収液２)を得ることができる。また、回収された該沈殿物を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、凍結乾燥することによって溶媒成分を留去して、沈殿２とする。
【００６２】
なお、前記沈殿２は、ポリグルロン酸高含有の沈殿物又はポリマンヌロン酸高含有の沈殿物として得られる場合がある。例えば、原料としてＨＧを用い、加水分解後の多糖類の質量平均分子量を１４，０００とし、続くｐＨ調整においてｐＨを３．５０〜４．００に調整する場合はポリグルロン酸高含有の沈殿物が得られ、原料としてＨＭを用い、加水分解後の多糖類の質量平均分子量を１１，０００とし、続くｐＨ調整においてｐＨを２．００〜３．００に調整する場合はポリマンヌロン酸高含有の沈殿物が得られる。
その後、前記回収液２を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで中和し、凍結乾燥することによって溶媒成分を留去して、固形状のポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸（回収物３）が得られる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００６４】
［実施例１］
（加水分解処理）
図２に記載の反応装置「ハイパーグラスター」（耐圧ガラス工業株式会社製）の反応容器に、ＨＧ（株式会社キミカ製：Ｍｗ＝３６０，０００）１０ｇと、１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液５００ｍＬとを投入した溶液Ａを得た。この反応容器を密閉し、溶液Ａを脱気して溶存空気を取り除き、次いで反応容器を開放系にすると共にＣＯ２ガスを溶液Ａに２０分間バブリングすることによって、ＣＯ２が飽和した溶液Ｂを調製した。
【００６５】
つぎに、前記反応容器を密閉し、ＣＯ２で初期圧力０．３ＭＰａに加圧した。続いて、前記反応容器内の前記溶液Ｂを１２０℃に加熱して、ＨＧの加水分解を８時間行った。
加水分解後に得られた加水分解反応液全てを、排除限界１０００（ＭＷＣＯ＝１０００、Spectrumu Laboratories Inc.製）の透析膜を使用して、超純水を用いて透析した。透析液である超純水は適宜交換した。
【００６６】
前記透析後のサンプルを凍結乾燥機ＦＤＵ−１１００（東京理科器械株式会社製）によって凍結乾燥して、固形状の加水分解物を得た。得られた加水分解物をＨＰＬＣ（Agilent 1100、Agilent Technologies, inc.製）によって分析し、質量平均分子量（Ｍｗ）が１４，０００であることを確認した。また、得られた加水分解物のＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求め、Ｍ／Ｇ比が０．３２であることを確認した。
【００６７】
（ｐＨ調整処理）
前記固形状の加水分解物７．０ｇを超純水２０．０ｇに完全に溶解させ、それを六等分した各水溶液に０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを滴下することによって、ｐＨを２．００、２．５０、２．８５、３．００、３．５０、４．００にそれぞれ調整した水溶液Ｃ１〜Ｃ６とし、沈殿物を析出させた。
さらに前記水溶液Ｃ１〜Ｃ６をそれぞれ４℃で１２時間静置した。
各ｐＨに調整した水溶液Ｃ１〜Ｃ６中に析出した沈殿物を、３５００ｒｐｍ、９０分の条件で遠心分離することによって、各水溶液Ｃ１〜Ｃ６から沈殿物を回収した。遠心分離後の上澄みである回収液Ｄ１〜Ｄ６（回収液１）中に残った少量の浮遊する沈殿物を、吸引ろ過によって回収した。ここで、前記遠心分離後の沈殿物と、吸引濾過によって回収した沈殿物とをそれぞれ合わせ、さらに５０ｍＬの水に溶解し、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、生成物Ｅ１〜Ｅ６（沈殿１）とした。
【００６８】
つぎに、回収液Ｄ１〜Ｄ６に、塩酸をそれぞれ滴下してｐＨ１に調整したのち、それぞれ４℃で１２時間冷蔵保温した。
ｐＨ１に調整した各回収液中に析出した析出物を、３５００ｒｐｍ、９０分の条件で遠心分離することによって、回収した。遠心分離後の回収液Ｆ１〜Ｆ６（回収液２）中に残った少量の浮遊する沈殿物を、吸引ろ過によって回収した。ここで、前記遠心分離後の沈殿物と、吸引濾過によって回収した沈殿物とをそれぞれ合わせて、さらに５０ｍＬの水に溶解し、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｇ１〜Ｇ６（沈殿２）とした。
【００６９】
さらに、回収液Ｆ１〜Ｆ６（回収液２）を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）を得た。
【００７０】
（分析評価）
生成物Ｅ１~Ｅ６（沈殿１）、回収物Ｇ１~Ｇ６（沈殿２）、回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、沈殿１、沈殿２、回収物３のＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。これらの結果を表１に示す。
【００７１】
なお、表１中、ｐＨの欄に記載の２．００〜４．００の数値は、上記ｐＨ調整によって得られた水溶液Ｃ１〜Ｃ６の段階におけるｐＨを意味する。また、「−」は分子量を測定するための十分なサンプル量が得られなかったことを意味する。
【００７２】
また、ＮＭＲ分析の結果、沈殿１、沈殿２はほぼグルロン酸又はマンヌロン酸で構成されており、それ以外の不純物は僅か（０．６〜３．０％以下）であった。
【００７３】
本明細書において、沈殿１の収率（質量%）とは、アルギン酸の加水分解物のうち、沈殿1を得るために使用した加水分解物の質量に対する沈殿１の質量が占める百分率である。同様に、沈殿２、回収物３、回収物４の各収率（質量％）は、沈殿1を得るために使用した加水分解物の質量に対する、沈殿２、回収物３、回収物４の質量が占める各百分率を意味する。
また本発明において、遠心分離等の実験操作による影響や、得られた加水分解物に含まれる僅かな水の影響で１〜２％収率に誤差が生じる場合がある。
【００７４】
【表１】
【００７５】
以上に示す結果から、ＨＧ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝１４，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が８７％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１７，０００〜１９，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
さらに、純度が８５％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１７，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを３．５０〜４．００とした場合）。
また、純度が６３％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝８，０００〜９，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった。
【００７６】
［実施例２］
加水分解の反応温度を１３０℃に変更した以外は、実施例１と同じ条件で、ＨＧの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行った。
この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、６，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は０．３４であった。
【００７７】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｇ１〜G６（沈殿２）、及び回収物Ｈ１〜H６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表２に示す。なお、表２の記載様式は、表１と同様である。
【００７８】
【表２】
【００７９】
以上に示す結果から、ＨＧ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝６，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が９０％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１０，０００〜１１，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった。
さらに、純度が８０％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝８，０００〜９，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを２．８５〜４．００とした場合）。
さらに、純度が７２％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝４，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを２．００〜３．５０とした場合）。
【００８０】
［実施例３］
加水分解の反応温度を１００℃、反応時間を１２時間に変更した以外は実施例１と同様にしてＨＧの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行い、沈殿１を得た。さらに、回収液Ｄ１〜Ｄ６を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）とした。この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、４０，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は０．４９であった。
【００８１】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表３に示す。なお、表３の記載様式は、表１と同様にｐＨの欄に記載の２．００〜４．００の数値は、上記ｐＨ調整によって得られた水溶液Ｃ１〜Ｃ６の段階におけるｐＨを意味している。また、表３中の「※」はデータが存在しないため空欄となっている。
【００８２】
【表３】
【００８３】
以上に示す結果から、ＨＧ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝４０，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が７１％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝４７，０００〜５５，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった。
【００８４】
［実施例４］
原料としてＨＭを使用し、初期圧力０．３ＭＰａ、温度１２０℃で、８時間の加水分解反応を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で、ＨＭの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行った。
この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、１１，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は２．２７であった。
【００８５】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｇ１〜Ｇ６（沈殿２）、及び回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表４に示す。なお、表４の記載様式は、表１と同様である。
【００８６】
【表４】
【００８７】
以上に示す結果から、ＨＭ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝１１，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が８５％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１７，０００〜１８，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
また、純度が７１％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝１６，０００〜１８，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
さらに、純度が８１％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝８，０００〜９，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった。
【００８８】
［実施例５］
加水分解の温度を１３０℃、反応時間を８時間に変更した以外は、実施例４と同じ条件で、ＨＭの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行った。
この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、６，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は１．２８であった。
【００８９】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｇ１〜Ｇ６（沈殿２）、及び回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表５に示す。なお、表５の記載様式は、表１と同様である。
【００９０】
【表５】
【００９１】
以上に示す結果から、ＨＭ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝６，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が９０％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１１，０００〜１３，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
さらに、純度が８７％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝９，０００〜１１，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．８５〜４．００とした場合）。
また、純度が６８％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝５，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった。
【００９２】
［実施例６］
加水分解の反応温度を１００℃、反応時間を９時間に変更した以外は実施例１と同様にしてＨＭの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行い、沈殿１を得た。さらに、回収液Ｄ１〜Ｄ６を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）とした。この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、４１，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は１．９８であった。
【００９３】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表６に示す。なお、表６の記載様式は、表３と同様である。
【００９４】
【表６】
【００９５】
以上に示す結果から、ＨＭ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝４１，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が８４％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝５４，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．８５〜３．００とした場合）。
さらに、純度が７０％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝３４，０００〜４０，０００）を、回収物４として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．５０〜３．００とした場合）。
【００９６】
［参考例１］
（加水分解時の反応温度と、加水分解物のMwとの関係）
反応温度を、８０〜１３０℃の範囲で１０℃刻みで設定し、各反応温度に対して、反応時間を２，６，１２，２４時間とした以外は、実施例１と同じ条件でＨＧの加水分解を行った。得られた加水分解物を、それぞれＨＰＬＣ分析して、質量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。その結果を図３に示す。
【００９７】
［参考例２］
（加水分解時の反応温度と、加水分解物のMwとの関係）
反応温度を、８０〜１３０℃の範囲で１０℃刻みで設定し、各反応温度に対して、反応時間を２，６，１２，２４時間とした以外は、実施例１と同じ条件でＨＭの加水分解を行った。得られた加水分解物を、それぞれＨＰＬＣ分析して、質量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。その結果を図４に示す。
【００９８】
参考例１及び２の結果から、加水分解反応時の温度と、反応時間を適宜制御することによって、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の範囲で所望のアルギン酸加水分解物を調整できることは明らかである。
また、参考例１及び２の結果から外挿すると、加水分解時の温度を７０℃未満にした場合、前記アルギン酸を所望の分子量にするためには長時間を要することとなる。
【００９９】
［参考例３］
（加水分解時の反応温度と過分解物の生成との関係）
加水分解時の反応温度と反応時間を以下の条件（ア）〜（ウ）とした以外は、実施例１と同様にＨＧの加水分解を行った。得られた加水分解物の１Ｈ ＮＭＲの測定結果を、図５に示す。
・条件（ア）；温度＝１２０℃、初期圧力＝０．３ＭＰａ、反応時間＝８時間、得られた加水分解物のＭｗ＝１４，３００
・条件（イ）；温度＝１００℃、初期圧力＝０．３ＭＰａ、反応時間＝７２時間、得られた加水分解物のＭｗ＝１２，７００
・条件（ウ）；温度＝８０℃、初期圧力＝０．３ＭＰａ、反応時間＝１２０時間、得られた加水分解物のＭｗ＝１３，０００
【０１００】
図５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルのピーク（８．５ｐｐｍ）が過分解物の存在を示している。つまり、条件（ア）及び（イ）では過分解物が僅かに生成しており、条件（ウ）では過分解物の生成が抑制されていることが明らかである。
【０１０１】
以上のことから、本発明のポリグルロン酸の製造方法において、アルギン酸を加水分解して、特定のＭｗを有する加水分解物（前記多糖類）を得る際には、加水分解時の温度を低めに設定して長時間で反応させる方が、加水分解時の温度を高めに設定して短時間で反応させるよりも、過分解物の生成を抑制できる。
【０１０２】
［参考例４］
（加水分解時の初期圧力と、加水分解物のＭｗとの関係）
加水分解時の初期圧力をそれぞれ０、０．３、１．０、５．０ＭＰａ、温度を１１０℃に変更した以外は、実施例１と同様の条件でＨＧの加水分解を行った。
得られた加水分解物をＨＰＬＣによって分析し、Ｍｗを求めた。その結果を表７に示す。
この結果から、加水分解時の初期圧力が高いほど、得られる加水分解物のＭｗが小さくなることが明らかである。
【０１０３】
【表７】
【０１０４】
［参考例５］
（加水分解前のアルギン酸濃度の影響）
加水分解前のＨＧの量を１０ｇ（アルギン酸濃度２．５％）、２５ｇ（アルギン酸濃度５．０％）とし、ｐＨ調整処理においてｐＨを２．００としたこと以外は、実施例１と同様の条件でＨＧの加水分解・グルロン酸の製造を行なった。得られた沈殿１のＨＰＬＣ分析をそれぞれ行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表８に示す。
この結果から、加水分解前のアルギン酸濃度が５％以上の場合でも、ポリグルロン酸の収率及び純度がほぼ変わらないことが明らかである。
【０１０５】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上説明したように、本発明によって得られるポリグルロン酸やポリマンヌロン酸は、高純度且つ分子量分布が狭いものである。これらの多糖類の分子量に依存して発現する生理活性等の機能を効果的に発現させるために有用である。本発明によって得られた前記ポリグルロン酸及び前記ポリマンヌロン酸は、前記生理活性を利用した高機能食品等への利用が期待されるほか、生分解性プラスチックの原料としても利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸加水分解物として得られる多糖類である、ポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸の製造方法、並びに該製造方法を用いて得られるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸性多糖類の一種であるアルギン酸は、褐藻の細胞壁及び細胞間に充填物質として存在する多糖類であり、その構成単位をα-Ｌ-グルロン酸（Ｇ）、β-Ｄ-マンヌロン酸（Ｍ）とするコポリマーである。
【０００３】
アルギン酸は食品添加物（安定化剤、ゲル化剤）としての利用の他に、医薬品、化粧品、印刷、染色、歯科材料、水処理等の分野にも使用されている。また、免疫賦活作用、抗肥満作用、血中コレステロール上昇抑制作用、高血圧抑制作用などの生理活性も報告されており、健康食品としても注目されている。一般に、酸性多糖類の特性や生理活性等は、その構造や分子量によって異なると考えられるが、アルギン酸を構成する構成単位のＧとＭのそれぞれの量、構成比等の関係が前記アルギン酸の特性や生理活性等にどのように作用しているかは、明らかにされていない。また、明らかにするためには構造解析や分子量を制御するための手法の確立が必要となる。そのため、純度が高く、分子量分布が狭いポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸の出現が強く求められている。
【０００４】
アルギン酸中のＧとＭの構成比は、一般的にM／G比により表され、１３Ｃ ＮＭＲや１Ｈ ＮＭＲを測定して求める方法が知られている（非特許文献１，２）。褐藻由来のアルギン酸のM／G比は、原産地や褐藻の抽出部位の違いによって異なる。
【０００５】
従来、ポリグルロン酸を得るためには、強酸性である塩酸の水溶液中でアルギン酸を加水分解する不均一酸性加水分解法や、弱酸性であるクエン酸水溶液中でアルギン酸を加水分解する均一酸性加水分解法等が知られている。しかし、いずれの方法においても、原料であるアルギン酸の水に対する溶解度が低い（０．２〜０．５質量％程度）ために、加水分解反応の制御が困難であり、所望の分子量を有するポリグルロン酸又はポリマンヌロン酸を得ることができないという問題がある。
さらに、前記不均一酸性加水分解法や、均一酸性加水分解法では、加水分解によってポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を得られたとしても、その分子量は広範囲のものを含むこととなる。
【０００６】
有機塩基を含む水溶液中にアルギン酸塩を溶解した場合には、０．５質量％を超える濃度で溶解することができ、重合度が２０未満であり、且つグルロン酸含有率９２％以上のポリグルロン酸を得る方法が、特許文献１に開示されている。
しかし、この方法によっても、重合度が２０以上（質量平均分子量４，０００以上）の場合においては、所望の分子量を有するポリグルロン酸又はポリマンヌロン酸を得ることはできていないという問題がある。
さらに精製工程で有機塩基類の除去工程が必要になることからコストの上昇要因となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Grasdalen, H.; Larsen, B.; Smidsrod, O. Carbohydrate Research 1977, 56, C11.
【非特許文献２】Grasdalen, H. Carbohydrate Research 1983, 118, 255.
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−３４３０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、所望の分子量を有し、かつ高純度で分子量分布が狭いポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を製造する方法の提供、並びに、その方法によって得られるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１に記載のポリグルロン酸の製造方法は、二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離することを特徴とする。
本発明の請求項２に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１において、前記水溶液をｐＨ２．０〜４．０に調整することによって、ポリグルロン酸を優先的に析出させることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１又は２において、前記加水分解によって、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせることを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１〜３のいずれか一項において、前記加熱処理時の温度が７０〜１４０℃であることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載のポリグルロン酸の製造方法は、請求項１〜４のいずれか一項において、前記加水分解における加熱処理前の初期圧力を０．１〜６ＭＰａとすることを特徴とする。
本発明の請求項６に記載のポリマンヌロン酸の製造方法は、二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、溶解度の低い成分を析出させて分離し、当該溶解度の低い成分を回収した後の回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とする。
本発明の請求項７に記載のポリマンヌロン酸の製造方法は、請求項６において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とする。
本発明の請求項８に記載のポリマンヌロン酸の製造方法は、請求項６において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離することを特徴とする。
本発明の請求項９に記載のポリグルロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００であることを特徴とする。
本発明の請求項１０に記載のポリマンヌロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリグルロン酸の製造方法によれば、質量平均分子量が４，０００〜１７０，０００の範囲で所望の質量平均分子量を有する多糖類（アルギン酸加水分解物）を調製し、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、該多糖類からポリグルロン酸を分離することによって、所望の質量平均分子量を有する、純度の高いポリグルロン酸を得ることができる。
本発明において、特に明記しない限り、純度とは前記ポリグルロン酸又は前記ポリマンヌロン酸を構成するグルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位のうち、グルロン酸（Ｇ）単位又はマンヌロン酸（Ｍ）単位が構成する割合のことを言う。
本発明のポリマンヌロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００であるという、従来のポリマンヌロン酸にはない特徴を有するものである。
【００１２】
また、本発明のポリグルロン酸の製造方法によれば、加水分解にＣＯ２を用いることによって、アルギン酸を１０質量％程度まで均一に溶解することが可能となり、反応制御も比較的容易となるため生産効率が向上し、さらに、従来に比べて高純度のポリグルロン酸を得ることができる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記水溶液をｐＨ２．０〜４．０に調整することが好ましい。これにより、前記所望の質量平均分子量を有する多糖類から、所望の分子量のポリグルロン酸を優先的に析出させることができる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせることが好ましい。これにより、得られるポリグルロン酸の質量平均分子量を４，０００〜６８，０００とすることができる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加熱処理において温度を７０〜１４０℃とすることが好ましい。この範囲の下限値以上にすることによって、加水分解反応の速度を速めることができ、この範囲の上限値以下にすることによって、過分解物の生成を低減できる。
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、加熱処理前の初期圧力を０．１〜６ＭＰａとすることが好ましい。この範囲の下限値以上にすることによって、加水分解反応を効率よく行なうことができ、この範囲の上限値以下にすることによって、過分解物の生成を低減できる。
【００１３】
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法によれば、質量平均分子量が４，０００〜１７０，０００の範囲で所望の質量平均分子量を有する多糖類（アルギン酸加水分解物）を調製し、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、溶解度の低い成分を析出させて分離し、当該溶解度の低い成分を回収した後の回収液に含まれる該多糖類からポリマンヌロン酸を分離することによって、所望の質量平均分子量を有する、純度の高いポリマンヌロン酸を得ることができる。また、加水分解にＣＯ２を用いることによって、アルギン酸を１０質量％程度まで均一に溶解することが可能となり、反応制御も比較的容易となるため生産効率が向上し、さらに、従来に比べて高純度のポリマンヌロン酸を得ることができる。
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成するグルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することが好ましい。これにより、ポリグルロン酸が比較的多く含まれる多糖類からでもポリマンヌロン酸を高純度で得ることができる。
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法において、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成するグルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離することが好ましい。これにより、高純度のポリマンヌロン酸を収率良く得ることができる。
本発明のポリグルロン酸が有する、「グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００である」という特徴は、従来のポリグルロン酸にはないものである。
本発明のポリマンヌロン酸が有する、「グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００である」という特徴は、従来のポリマンヌロン酸にはないものである。
【００１４】
本発明により得られた所望のＭｗを有するポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸は、従来技術を用いて得られたものに比べ高純度且つ分子量分布が狭いため、ポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸のＭｗに依存して発現される機能（例えば生理活性等）を調べるためのサンプルとすることができる。このような分析用途のサンプルとする場合は、サンプルの純度は高ければ高いほど分析精度が高くなり、好ましいことはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】本発明の製造方法に使用することができる反応装置の一例を示す概略図である。
【図３】ＨＧを加水分解した際の、反応温度、反応時間、及び加水分解物の質量平均分子量の関係を示すグラフである。
【図４】ＨＭを加水分解した際の、反応温度、反応時間、及び加水分解物の質量平均分子量の関係を示すグラフである。
【図５】ＨＧの加水分解時の反応温度と過分解物の生成との関係を示す１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、詳細に説明する。なお、本発明において、特に明記しない限り分子量の単位としてＤａ（ダルトン）を用いる。
【００１７】
＜ポリグルロン酸の製造方法＞
本発明のポリグルロン酸の製造方法は、二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させる方法である。
【００１８】
［加水分解処理］
前記溶液の溶媒としては、不純物が除かれた水が好ましい。前記水は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等を加えた中性の塩類水溶液としてもよい。塩類水溶液を使用することによって、原料のアルギン酸の溶解度を調節することができる。
【００１９】
前記溶液は、前記溶媒に二酸化炭素（ＣＯ２）をバブリングしたものであることが好ましい。例えば、ＣＯ２飽和水溶液（炭酸水）が好ましい。
アルギン酸のｐＫａ値は３．６前後であるため、ＣＯ２を用いることによって、アルギン酸を１０質量％程度まで均一に溶解させることが可能である。このため、反応制御が比較的容易となり、生産効率も向上する。
【００２０】
また、アルギン酸を構成するＧ同士の結合（Ｇ−Ｇ結合）、ＧとＭの結合（Ｇ−Ｍ結合）、Ｍ同士の結合(Ｍ−Ｍ結合)の結合エネルギーを比較すると、Ｇ−Ｇ結合に比べてＧ−Ｍ結合、Ｍ−Ｍ結合の結合エネルギーが小さい。本発明においては、ＣＯ２は結合エネルギーが大きなＧ−Ｇ結合以外の結合を優先的に加水分解することができ、従来に比べて高純度のポリグルロン酸が得られる、という新しい知見を得、この知見を大いに利用している。
【００２１】
前記アルギン酸としては、Ｇ、Ｍを含むものであれば特に制限されないが、加水分解処理における取り扱いが容易となることから、その質量平均分子量（Ｍｗ）が５０万以下のものが好ましい。一方、質量平均分子量（Ｍｗ）が５０万を超えるものを使用すると、溶液の粘度が高くなり、取り扱いが不便であると共に、所望の分子量を有する加水分解物となるまでの加水分解反応の時間が不当に長くなる。
【００２２】
前記アルギン酸としては、前記溶媒としての水へのアルギン酸の溶解度を高める観点から、アルギン酸塩が好ましく、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、及びアルギン酸アンモニウムがより好ましく、アルギン酸ナトリウムがさらに好ましい。
前記アルギン酸塩は、一種を単独で使用してもよいし、二種以上を使用してもよい。
【００２３】
前記アルギン酸としては、市販品を使用することが可能である。例えば、株式会社キミカ製のキミカアルギンＨｉｇｈ・ＧシリーズＩ−１Ｇ（以下、ＨＧと呼ぶことがある。）や、株式会社キミカ製のキミカアルギンＨｉｇｈ・ＭシリーズＩＬ−６Ｍ（以下、ＨＭと呼ぶことがある。）が好適なものとして挙げられる。
【００２４】
前記ＨＧは、グルロン酸含有率が高く（６７％以上、M／G比＜０．４９）、分子量（質量平均分子量：Ｍｗ）が５０万以下のアルギン酸ナトリウムである。
前記ＨＭは、マンヌロン酸含有率が高く（５６％以上、M／G比＞１．２８）、分子量（質量平均分子量：Ｍｗ）が５０万以下のアルギン酸ナトリウムである。
【００２５】
本発明において、前記アルギン酸は、不純物が少ない高純度のものを用いることが好ましい。
前記ＨＧ、前記ＨＭは、海草（褐藻）由来のアルギン酸をイオン交換法によって精製して得られたアルギン酸ナトリウムであり、元来Ｇ又はＭを多く含むため、本発明のアルギン酸として好適に用いることができる。アルギン酸を精製する方法としては、イオン交換法の他に、酸を使用した方法（酸法）が知られている（特許文献１参照）。本発明に用いる前記アルギン酸は、前記酸法によって精製されたものであってもよい。
【００２６】
上記海藻としては特に限定されないが、スジメやアイヌワカメ、ウガノモクなどを挙げることができる。スジメは春頃にM／G比が高いアルギン酸、秋頃にM／G比が低いアルギン酸を得ることができ、アイヌワカメは春頃にM／G比が低いアルギン酸を得ることができ、秋頃にM／G比が高いアルギン酸を得ることができる。ウガノモクからは秋頃にM／G比が特に低いアルギン酸を得ることができる。
【００２７】
加水分解に供する前記アルギン酸の濃度としては、０．０５〜１０．０質量％が好ましく、０．１〜５．０質量％がより好ましく、０．２〜２．０質量％がさらに好ましい。
上記範囲の下限値以上であることにより、生成物であるポリグルロン酸の収率を高めることができ、上記範囲の上限値以下であることにより、溶液中に溶解しないアルギン酸の量を低減することができ、製造プロセス上好ましい。
【００２８】
前記加熱処理における温度としては、生成物であるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸が過分解する割合が少ない温度範囲であれば特に制限されないが、７０〜１４０℃の範囲が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応の速度を高める観点からは、上記範囲のうち、より高温側が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応中に、副生成物が発生する割合を低減する観点からは、上記範囲のうち、より低温側が好ましい。
【００２９】
本発明においては、前記二酸化炭素とアルギン酸を含む溶液を加圧することが好ましい。
前記加圧処理における初期圧力は加水分解反応開始前に室温下、二酸化炭素で反応容器内を加圧したときの圧力（ゲージ圧）のことである。
前記初期圧力としては生成物であるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸が過分解する割合が少ない圧力範囲であれば特に制限されないが、０．１〜６ＭＰａの範囲が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応の速度を高める観点からは、上記範囲のうち、より高圧力側が好ましい。
前記アルギン酸の加水分解反応中に、副生成物が発生する割合を低減する観点からは、上記範囲のうち、より低圧力側が好ましい。
【００３０】
前記溶液を加熱処理すること、又は前記溶液の初期圧力を加圧処理により高めた後で加熱処理することによって、前記アルギン酸を加水分解することができる。通常、当該アルギン酸の加水分解速度は、加水分解時の温度と初期圧力に依存するので、前記温度及び／又は前記初期圧力を適宜設定して、前記加熱処理をすることによって、当該アルギン酸を所望の質量平均分子量（Ｍｗ）となるように、加水分解することができる。
【００３１】
前記加熱処理による加水分解の時間は、使用するアルギン酸のＭｗ、加水分解の温度、前記初期圧力にもよるが、通常４８時間以内に、加水分解物のＭｗを１０，０００程度まで加水分解することができる。所望の分子量の加水分解物を得るためには、予め定めた条件で加水分解した場合の、反応時間、反応温度、及び加水分解物のＭｗの相関関係を予め求めておけばよい。例えば、図３及び図４を参考にできる。
【００３２】
本発明における前記溶液を加水分解処理した場合、得られるアルギン酸加水分解物（ポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を含む多糖類）のＭｗは、反応時間に応じて、４，０００〜１７０，０００の範囲で所望の分子量とすることができる。
【００３３】
なお、前記加水分解反応によれば、前記多糖類のＭｗの下限値は約４，０００であり、反応時間を延長したとしても、Ｍｗが４，０００よりも大きく下がることはない。
【００３４】
前記加水分解後の反応液は、凍結乾燥することによって該反応液の体積を減らした後、純水を用いて透析することによって、過分解物等の副生成物や不要な塩類を除去することが好ましい。
前記凍結乾燥で溶媒を完全に留去して、固形状の前記多糖類を得た後、これを純水に溶解した水溶液を、さらに純水を用いて透析する方法を採用してもよい。
前記透析処理を行った後の、前記多糖類を溶解した水溶液に沈殿や析出物等の不溶物が観察される場合は、フィルターろ過等によって除くことが好ましい。
【００３５】
［ｐＨ調整処理］
つぎに、前記多糖類を溶解した前記水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離する。
前記多糖類を溶解する溶媒としては、水が好ましい。ｐＨ調整が容易であり、ポリグルロン酸を十分に析出させることができる。
【００３６】
前記水溶液のｐＨを調整する方法としては、該水溶液中の多糖類を過分解するような方法でなければ特に制限されない。例えば、０．１ｍｏｌ／Ｌの希塩酸を滴下する方法が好適である。
【００３７】
ｐＨ調整した後の前記水溶液のｐＨとしては、ｐＨ２．０〜４．０の範囲が好ましい。この範囲に調整することによって、前記水溶液中の多糖類のうち、ポリグルロン酸をより優先的に析出させることができる。
【００３８】
前記ｐＨ調整処理後の水溶液を、低温条件下で一定時間静置することで、ポリグルロン酸が析出し易くなり、収率が向上することとなる。静置の温度及び静置時間は特に限定されないが、例えば、それぞれ1℃〜１０℃、６時間〜２４時間であることが好ましい。前記条件であれば家庭用冷蔵庫を利用することができる。
【００３９】
このｐＨ調整によるポリグルロン酸とポリマンヌロン酸との分離は、グルロン酸のｐＫａ（３．３８）とマンヌロン酸のｐＫａ（３．６５）との相違、すなわちｐＨ調整した後の水溶液における溶解度の違いを利用した方法である。
【００４０】
本発明のポリグルロン酸とポリマンヌロン酸の製造方法において、使用する前記多糖類はＭｗが４，０００以上のポリマーであり、このような多糖類を用いてポリグルロン酸とポリマンヌロン酸とをｐＨ調整によって分離できることを見出したのは、本発明者らが初めてである。
【００４１】
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが１０，０００〜２７，０００の多糖類を生じさせると、製造するポリグルロン酸のＭｗを概ね１４，０００〜３５，０００の範囲とすることができる。
前記ｐH調整において、前記多糖類に含まれるポリグルロン酸の中でも、溶解度が低い（分子量の大きい）ものから析出し、かつ、そのポリグルロン酸の分子量分布（分散度：Ｍｗ/Ｍｎ）が前記多糖類の分子量分布よりも狭いため、前記多糖類より前記ポリグルロン酸のＭｗが大きくなる。
【００４２】
例えば、前記多糖類のＭｗが１４，０００である場合には、前記水溶液のｐＨを２．００〜３．５０の範囲とすることが好ましい。この範囲にｐＨ調整することによって、Ｍｗが１７，０００〜１９，０００のポリグルロン酸を、収率が４〜６３％の範囲、純度（Ｇ％）が８７〜１００％の範囲で得ることができる。
【００４３】
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが４，０００〜１０，０００の多糖類を生じさせると、製造するポリグルロン酸のＭｗを概ね４，０００〜１４，０００の範囲とすることができる。
【００４４】
例えば、前記多糖類のＭｗが６，０００である場合には、前記水溶液のｐＨを２．００〜３．００の範囲とすることが好ましい。この範囲にｐＨ調整することによって、Ｍｗが１０，０００〜１１，０００のポリグルロン酸を、収率が７〜１２％の範囲で、純度（Ｇ％）が９２〜９９％で得ることができる。
【００４５】
本発明のポリグルロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが２７，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせると、製造するポリグルロン酸のＭｗを概ね３５，０００〜６８，０００の範囲とすることができる。
【００４６】
例えば、前記多糖類のＭｗが４０，０００である場合には、前記水溶液のｐＨを２．８５〜３．５０の範囲とすることが好ましい。この範囲にｐＨ調整することによって、Ｍｗが５１，０００〜５５，０００のポリグルロン酸を、収率が９〜５１％の範囲、純度（Ｇ％）が８０〜８４％の範囲で得ることができる。
【００４７】
このように、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨ調整を行うことにより、当該水溶液中のポリグルロン酸を優先的に析出させることができる。
析出したポリグルロン酸を回収して得る方法は特に制限されず、例えば、遠心分離によってポリグルロン酸を沈殿物として回収する方法や、フィルターろ過によってフィルター上にポリグルロン酸を回収する方法等が挙げられる。
【００４８】
析出したポリグルロン酸を回収した後の溶液（回収液）にはポリマンヌロン酸が溶解した状態で含まれている。また、前記ｐＨ調整の操作後でも析出していないポリグルロン酸が含まれている場合がある。
【００４９】
前記溶解した状態のポリマンヌロン酸、又は前記析出していないポリグルロン酸を回収する方法は特に制限されず、溶液を中和し、それを凍結乾燥して固体を得る方法等が挙げられる。
【００５０】
＜ポリマンヌロン酸の製造方法＞
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法は、前記ポリグルロン酸の製造方法において、ｐＨ調整によって溶解度の低い多糖類（ポリグルロン酸高含有成分）を析出させ、析出したものを分離回収した後に得られる、前記回収液を出発材料とする。
前記回収液のｐＨをさらに下げて、前記回収液に含まれるポリマンヌロン酸を前記回収液から分離する。この分離方法としては、例えば次の二通りを挙げることができる。
【００５１】
第一の分離方法は、ポリグルロン酸が、前記ｐＨ調整の操作後でも析出しきらずに前記回収液中に溶存している場合、前記回収液のｐＨをさらに下げることによって、前記ポリグルロン酸を析出させて当該回収液から除去し、ポリマンヌロン酸を当該回収液に溶解した状態で得る方法である。
第二の分離方法は、ポリグルロン酸が、前記ｐＨ調整の操作後に析出し、前記回収液中にはほとんど溶存していない場合、前記回収液のｐＨをさらに下げることによって、ポリマンヌロン酸を当該回収液中に析出させて、得る方法である。
上記二通りの分離方法のどちらを用いるかは、概ね前記加水分解反応後に得られる多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）で判断すればよく、Ｍ／Ｇ比が１．８未満の場合は第一の分離方法、Ｍ／Ｇ比が１．８以上の場合は第二の分離方法を用いることが好ましい。
【００５２】
前記第一の分離方法において、当該回収液からの析出物は、高純度のポリグルロン酸として得られる場合がある。ここで得られるポリグルロン酸のＭｗは、前段のｐＨ調整における水溶液から得られるポリグルロン酸のＭｗよりも、低分子量である傾向がある。
【００５３】
前記第一、第二の分離方法において、当該回収液のｐＨをさらに下げる場合、そのｐＨを１とすると、前記pＨ調整の操作で析出しなかった多糖類を効率的に析出させることができ、好ましい。
【００５４】
前記回収液のｐＨをさらに下げる方法としては、該水溶液中の多糖類を過分解するような方法でなければ特に制限されない。例えば、塩酸を少量滴下する方法が好適である。
【００５５】
前記第一の分離方法としては、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離する方法が好ましい。
前記第二の分離方法としては、前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離する方法が好ましい。
Ｍ／Ｇ比＝２．３を基準とすることによって、分子量分布が狭く、純度の高いポリマンヌロン酸をより高い収率で製造できる。
【００５６】
本発明のポリマンヌロン酸の製造方法において、前記加水分解によって、Ｍｗが５，０００〜５６，０００の多糖類を生じさせることが好ましい。製造するポリマンヌロン酸のＭｗを概ね５，０００〜５５，０００の範囲とすることができる。
前記出発原料とした回収液には、前記ｐＨ調整によって析出した溶解度が低い多糖類、つまり、ポリグルロン酸高含有成分の中でも分子量の大きなものを分離回収した後の、残りの多糖類が多く含まれているため、前記ポリマンヌロン酸の分子量は前記加水分解によって生じさせた多糖類の分子量よりも小さくなる傾向がある。
【００５７】
＜ポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸＞
本発明のポリグルロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００である。
本発明のポリマンヌロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００である。
本発明のポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸は、前述の製造方法によって得られる。
本発明のポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸を構成するグルロン酸（Ｇ）単位及びマンヌロン酸（Ｍ）単位の構成比率（％）は、ＮＭＲによって調べられる。例えば、ポリグルロン酸が１００個の構成単位からなり、そのうち８０個がグルロン酸（Ｇ）単位で残りの２０個がマンヌロン酸（Ｍ）単位である場合、このポリグルロン酸は、グルロン酸（Ｇ）単位を８０％含み、マンヌロン酸（Ｍ）単位を２０％含むものである。
【００５８】
＜製造方法のフローチャート＞
本発明にかかるポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸の製造方法は、例えば図１に示すフローチャートに従って行うことができる。以下に、フローチャートに沿って説明する。
【００５９】
まず、原料となるアルギン酸を準備し、これをＣＯ２飽和水溶液に投入する。この溶液を加熱処理することによって、前記アルギン酸を所望の質量平均分子量となるまで加水分解する（加水分解工程）。このとき、加熱処理前にＣＯ２で加圧することが好ましい。この後、得られた加水分解反応液に含まれるＣＯ２及び溶媒を凍結乾燥法によって留去して、固形状の加水分解物を得る（凍結乾燥工程）。この加水分解物に一部残存している低分子量のタンパク質や金属イオンを除去するためには、この加水分解物を水に溶解して、純水を用いて透析することが好ましい。
【００６０】
次に、透析した前記加水分解物を水に溶解して水溶液とし、前記水溶液に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を滴下して所定のｐＨ（ｐＨ2.0~4.0）に調製することによって、ポリグルロン酸を優先的に析出させる（ｐＨ調製工程）。続いて前記ｐH調整処理後の水溶液を４℃で１２時間冷蔵保温した後、遠心分離する（遠心分離工程）。その後、該水溶液中に析出した沈殿物を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、凍結乾燥することによって溶媒成分を留去して、ポリグルロン酸を沈殿１として得ることができる。一方、前記沈殿物を回収した後の上澄み液（回収液１）には、ポリマンヌロン酸及び前記操作で析出しなかったポリグルロン酸が溶解している。
【００６１】
前記回収液１のｐHを１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いてさらに下げて（ｐＨ1.00）、得られた溶液（第二の析出溶液）において析出した加水分解物を沈殿物として回収することによって残余のポリグルロン酸を除去し、ポリマンヌロン酸が溶解した状態の回収液(回収液２)を得ることができる。また、回収された該沈殿物を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、凍結乾燥することによって溶媒成分を留去して、沈殿２とする。
【００６２】
なお、前記沈殿２は、ポリグルロン酸高含有の沈殿物又はポリマンヌロン酸高含有の沈殿物として得られる場合がある。例えば、原料としてＨＧを用い、加水分解後の多糖類の質量平均分子量を１４，０００とし、続くｐＨ調整においてｐＨを３．５０〜４．００に調整する場合はポリグルロン酸高含有の沈殿物が得られ、原料としてＨＭを用い、加水分解後の多糖類の質量平均分子量を１１，０００とし、続くｐＨ調整においてｐＨを２．００〜３．００に調整する場合はポリマンヌロン酸高含有の沈殿物が得られる。
その後、前記回収液２を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで中和し、凍結乾燥することによって溶媒成分を留去して、固形状のポリグルロン酸及びポリマンヌロン酸（回収物３）が得られる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００６４】
［実施例１］
（加水分解処理）
図２に記載の反応装置「ハイパーグラスター」（耐圧ガラス工業株式会社製）の反応容器に、ＨＧ（株式会社キミカ製：Ｍｗ＝３６０，０００）１０ｇと、１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液５００ｍＬとを投入した溶液Ａを得た。この反応容器を密閉し、溶液Ａを脱気して溶存空気を取り除き、次いで反応容器を開放系にすると共にＣＯ２ガスを溶液Ａに２０分間バブリングすることによって、ＣＯ２が飽和した溶液Ｂを調製した。
【００６５】
つぎに、前記反応容器を密閉し、ＣＯ２で初期圧力０．３ＭＰａに加圧した。続いて、前記反応容器内の前記溶液Ｂを１２０℃に加熱して、ＨＧの加水分解を８時間行った。
加水分解後に得られた加水分解反応液全てを、排除限界１０００（ＭＷＣＯ＝１０００、Spectrumu Laboratories Inc.製）の透析膜を使用して、超純水を用いて透析した。透析液である超純水は適宜交換した。
【００６６】
前記透析後のサンプルを凍結乾燥機ＦＤＵ−１１００（東京理科器械株式会社製）によって凍結乾燥して、固形状の加水分解物を得た。得られた加水分解物をＨＰＬＣ（Agilent 1100、Agilent Technologies, inc.製）によって分析し、質量平均分子量（Ｍｗ）が１４，０００であることを確認した。また、得られた加水分解物のＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求め、Ｍ／Ｇ比が０．３２であることを確認した。
【００６７】
（ｐＨ調整処理）
前記固形状の加水分解物７．０ｇを超純水２０．０ｇに完全に溶解させ、それを六等分した各水溶液に０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを滴下することによって、ｐＨを２．００、２．５０、２．８５、３．００、３．５０、４．００にそれぞれ調整した水溶液Ｃ１〜Ｃ６とし、沈殿物を析出させた。
さらに前記水溶液Ｃ１〜Ｃ６をそれぞれ４℃で１２時間静置した。
各ｐＨに調整した水溶液Ｃ１〜Ｃ６中に析出した沈殿物を、３５００ｒｐｍ、９０分の条件で遠心分離することによって、各水溶液Ｃ１〜Ｃ６から沈殿物を回収した。遠心分離後の上澄みである回収液Ｄ１〜Ｄ６（回収液１）中に残った少量の浮遊する沈殿物を、吸引ろ過によって回収した。ここで、前記遠心分離後の沈殿物と、吸引濾過によって回収した沈殿物とをそれぞれ合わせ、さらに５０ｍＬの水に溶解し、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、生成物Ｅ１〜Ｅ６（沈殿１）とした。
【００６８】
つぎに、回収液Ｄ１〜Ｄ６に、塩酸をそれぞれ滴下してｐＨ１に調整したのち、それぞれ４℃で１２時間冷蔵保温した。
ｐＨ１に調整した各回収液中に析出した析出物を、３５００ｒｐｍ、９０分の条件で遠心分離することによって、回収した。遠心分離後の回収液Ｆ１〜Ｆ６（回収液２）中に残った少量の浮遊する沈殿物を、吸引ろ過によって回収した。ここで、前記遠心分離後の沈殿物と、吸引濾過によって回収した沈殿物とをそれぞれ合わせて、さらに５０ｍＬの水に溶解し、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｇ１〜Ｇ６（沈殿２）とした。
【００６９】
さらに、回収液Ｆ１〜Ｆ６（回収液２）を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）を得た。
【００７０】
（分析評価）
生成物Ｅ１~Ｅ６（沈殿１）、回収物Ｇ１~Ｇ６（沈殿２）、回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、沈殿１、沈殿２、回収物３のＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。これらの結果を表１に示す。
【００７１】
なお、表１中、ｐＨの欄に記載の２．００〜４．００の数値は、上記ｐＨ調整によって得られた水溶液Ｃ１〜Ｃ６の段階におけるｐＨを意味する。また、「−」は分子量を測定するための十分なサンプル量が得られなかったことを意味する。
【００７２】
また、ＮＭＲ分析の結果、沈殿１、沈殿２はほぼグルロン酸又はマンヌロン酸で構成されており、それ以外の不純物は僅か（０．６〜３．０％以下）であった。
【００７３】
本明細書において、沈殿１の収率（質量%）とは、アルギン酸の加水分解物のうち、沈殿1を得るために使用した加水分解物の質量に対する沈殿１の質量が占める百分率である。同様に、沈殿２、回収物３、回収物４の各収率（質量％）は、沈殿1を得るために使用した加水分解物の質量に対する、沈殿２、回収物３、回収物４の質量が占める各百分率を意味する。
また本発明において、遠心分離等の実験操作による影響や、得られた加水分解物に含まれる僅かな水の影響で１〜２％収率に誤差が生じる場合がある。
【００７４】
【表１】
【００７５】
以上に示す結果から、ＨＧ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝１４，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が８７％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１７，０００〜１９，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
さらに、純度が８５％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１７，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを３．５０〜４．００とした場合）。
また、純度が６３％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝８，０００〜９，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった。
【００７６】
［実施例２］
加水分解の反応温度を１３０℃に変更した以外は、実施例１と同じ条件で、ＨＧの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行った。
この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、６，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は０．３４であった。
【００７７】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｇ１〜G６（沈殿２）、及び回収物Ｈ１〜H６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表２に示す。なお、表２の記載様式は、表１と同様である。
【００７８】
【表２】
【００７９】
以上に示す結果から、ＨＧ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝６，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が９０％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１０，０００〜１１，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった。
さらに、純度が８０％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝８，０００〜９，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを２．８５〜４．００とした場合）。
さらに、純度が７２％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝４，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった（水溶液ＣのｐＨを２．００〜３．５０とした場合）。
【００８０】
［実施例３］
加水分解の反応温度を１００℃、反応時間を１２時間に変更した以外は実施例１と同様にしてＨＧの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行い、沈殿１を得た。さらに、回収液Ｄ１〜Ｄ６を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）とした。この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、４０，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は０．４９であった。
【００８１】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表３に示す。なお、表３の記載様式は、表１と同様にｐＨの欄に記載の２．００〜４．００の数値は、上記ｐＨ調整によって得られた水溶液Ｃ１〜Ｃ６の段階におけるｐＨを意味している。また、表３中の「※」はデータが存在しないため空欄となっている。
【００８２】
【表３】
【００８３】
以上に示す結果から、ＨＧ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝４０，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が７１％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝４７，０００〜５５，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった。
【００８４】
［実施例４］
原料としてＨＭを使用し、初期圧力０．３ＭＰａ、温度１２０℃で、８時間の加水分解反応を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で、ＨＭの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行った。
この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、１１，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は２．２７であった。
【００８５】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｇ１〜Ｇ６（沈殿２）、及び回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表４に示す。なお、表４の記載様式は、表１と同様である。
【００８６】
【表４】
【００８７】
以上に示す結果から、ＨＭ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝１１，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が８５％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１７，０００〜１８，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
また、純度が７１％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝１６，０００〜１８，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
さらに、純度が８１％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝８，０００〜９，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった。
【００８８】
［実施例５］
加水分解の温度を１３０℃、反応時間を８時間に変更した以外は、実施例４と同じ条件で、ＨＭの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行った。
この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、６，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は１．２８であった。
【００８９】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｇ１〜Ｇ６（沈殿２）、及び回収物Ｈ１〜Ｈ６（回収物３）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表５に示す。なお、表５の記載様式は、表１と同様である。
【００９０】
【表５】
【００９１】
以上に示す結果から、ＨＭ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝６，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が９０％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝１１，０００〜１３，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．００〜３．００とした場合）。
さらに、純度が８７％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝９，０００〜１１，０００）を、沈殿２として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．８５〜４．００とした場合）。
また、純度が６８％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝５，０００）を、回収物３として得られることが明らかとなった。
【００９２】
［実施例６］
加水分解の反応温度を１００℃、反応時間を９時間に変更した以外は実施例１と同様にしてＨＭの加水分解処理と、それに続くｐＨ調整処理を行い、沈殿１を得た。さらに、回収液Ｄ１〜Ｄ６を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨで中和した後、凍結乾燥を行い、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）とした。この加水分解処理で得られた加水分解物の質量平均分子量（Ｍｗ）は、４１，０００であった。また、得られた加水分解物のＭ／Ｇ比は１．９８であった。
【００９３】
（分析評価）
得られた、生成物Ｅ１〜E６（沈殿１）、回収物Ｉ１〜Ｉ６（回収物４）のＨＰＬＣ分析を行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表６に示す。なお、表６の記載様式は、表３と同様である。
【００９４】
【表６】
【００９５】
以上に示す結果から、ＨＭ（Ｍｗ＝３６０，０００）を使用して、Ｍｗ＝４１，０００となるまで反応させて得られた加水分解物の水溶液を、ｐＨ調整することによって、純度が８４％以上のポリグルロン酸（Ｍｗ＝５４，０００）を、沈殿１として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．８５〜３．００とした場合）。
さらに、純度が７０％以上のポリマンヌロン酸（Ｍｗ＝３４，０００〜４０，０００）を、回収物４として得られることが明らかとなった（水溶液Ｃ１〜C６のｐＨを２．５０〜３．００とした場合）。
【００９６】
［参考例１］
（加水分解時の反応温度と、加水分解物のMwとの関係）
反応温度を、８０〜１３０℃の範囲で１０℃刻みで設定し、各反応温度に対して、反応時間を２，６，１２，２４時間とした以外は、実施例１と同じ条件でＨＧの加水分解を行った。得られた加水分解物を、それぞれＨＰＬＣ分析して、質量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。その結果を図３に示す。
【００９７】
［参考例２］
（加水分解時の反応温度と、加水分解物のMwとの関係）
反応温度を、８０〜１３０℃の範囲で１０℃刻みで設定し、各反応温度に対して、反応時間を２，６，１２，２４時間とした以外は、実施例１と同じ条件でＨＭの加水分解を行った。得られた加水分解物を、それぞれＨＰＬＣ分析して、質量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。その結果を図４に示す。
【００９８】
参考例１及び２の結果から、加水分解反応時の温度と、反応時間を適宜制御することによって、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の範囲で所望のアルギン酸加水分解物を調整できることは明らかである。
また、参考例１及び２の結果から外挿すると、加水分解時の温度を７０℃未満にした場合、前記アルギン酸を所望の分子量にするためには長時間を要することとなる。
【００９９】
［参考例３］
（加水分解時の反応温度と過分解物の生成との関係）
加水分解時の反応温度と反応時間を以下の条件（ア）〜（ウ）とした以外は、実施例１と同様にＨＧの加水分解を行った。得られた加水分解物の１Ｈ ＮＭＲの測定結果を、図５に示す。
・条件（ア）；温度＝１２０℃、初期圧力＝０．３ＭＰａ、反応時間＝８時間、得られた加水分解物のＭｗ＝１４，３００
・条件（イ）；温度＝１００℃、初期圧力＝０．３ＭＰａ、反応時間＝７２時間、得られた加水分解物のＭｗ＝１２，７００
・条件（ウ）；温度＝８０℃、初期圧力＝０．３ＭＰａ、反応時間＝１２０時間、得られた加水分解物のＭｗ＝１３，０００
【０１００】
図５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルのピーク（８．５ｐｐｍ）が過分解物の存在を示している。つまり、条件（ア）及び（イ）では過分解物が僅かに生成しており、条件（ウ）では過分解物の生成が抑制されていることが明らかである。
【０１０１】
以上のことから、本発明のポリグルロン酸の製造方法において、アルギン酸を加水分解して、特定のＭｗを有する加水分解物（前記多糖類）を得る際には、加水分解時の温度を低めに設定して長時間で反応させる方が、加水分解時の温度を高めに設定して短時間で反応させるよりも、過分解物の生成を抑制できる。
【０１０２】
［参考例４］
（加水分解時の初期圧力と、加水分解物のＭｗとの関係）
加水分解時の初期圧力をそれぞれ０、０．３、１．０、５．０ＭＰａ、温度を１１０℃に変更した以外は、実施例１と同様の条件でＨＧの加水分解を行った。
得られた加水分解物をＨＰＬＣによって分析し、Ｍｗを求めた。その結果を表７に示す。
この結果から、加水分解時の初期圧力が高いほど、得られる加水分解物のＭｗが小さくなることが明らかである。
【０１０３】
【表７】
【０１０４】
［参考例５］
（加水分解前のアルギン酸濃度の影響）
加水分解前のＨＧの量を１０ｇ（アルギン酸濃度２．５％）、２５ｇ（アルギン酸濃度５．０％）とし、ｐＨ調整処理においてｐＨを２．００としたこと以外は、実施例１と同様の条件でＨＧの加水分解・グルロン酸の製造を行なった。得られた沈殿１のＨＰＬＣ分析をそれぞれ行い、収率、質量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）を求めた。また、ＮＭＲ分析を行い、グルロン酸の含有率（Ｇ％）、マンヌロン酸の含有率（Ｍ％）を求めた。
これらの結果を表８に示す。
この結果から、加水分解前のアルギン酸濃度が５％以上の場合でも、ポリグルロン酸の収率及び純度がほぼ変わらないことが明らかである。
【０１０５】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上説明したように、本発明によって得られるポリグルロン酸やポリマンヌロン酸は、高純度且つ分子量分布が狭いものである。これらの多糖類の分子量に依存して発現する生理活性等の機能を効果的に発現させるために有用である。本発明によって得られた前記ポリグルロン酸及び前記ポリマンヌロン酸は、前記生理活性を利用した高機能食品等への利用が期待されるほか、生分解性プラスチックの原料としても利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離することを特徴とするポリグルロン酸の製造方法。
【請求項２】
前記水溶液をｐＨ２．０〜４．０に調整することによって、ポリグルロン酸を優先的に析出させることを特徴とする請求項１に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項３】
前記加水分解によって、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項４】
前記加熱処理時の温度が７０〜１４０℃であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項５】
前記加水分解における加熱処理前の初期圧力を０．１〜６ＭＰａとすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項６】
二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、溶解度の低い成分を析出させて分離し、当該溶解度の低い成分を回収した後の回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とするポリマンヌロン酸の製造方法。
【請求項７】
前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とする請求項６に記載のポリマンヌロン酸の製造方法。
【請求項８】
前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離することを特徴とする請求項６に記載のポリマンヌロン酸の製造方法。
【請求項９】
グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００であることを特徴とするポリグルロン酸。
【請求項１０】
グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００であることを特徴とするポリマンヌロン酸。
【請求項１】
二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、ポリグルロン酸を優先的に析出させて分離することを特徴とするポリグルロン酸の製造方法。
【請求項２】
前記水溶液をｐＨ２．０〜４．０に調整することによって、ポリグルロン酸を優先的に析出させることを特徴とする請求項１に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項３】
前記加水分解によって、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜５３，０００の多糖類を生じさせることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項４】
前記加熱処理時の温度が７０〜１４０℃であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項５】
前記加水分解における加熱処理前の初期圧力を０．１〜６ＭＰａとすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリグルロン酸の製造方法。
【請求項６】
二酸化炭素及びアルギン酸を含む溶液を、加熱処理することにより、前記アルギン酸を加水分解し、質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を生じさせ、前記多糖類を溶解した水溶液のｐＨを調整することにより、前記多糖類のうち、溶解度の低い成分を析出させて分離し、当該溶解度の低い成分を回収した後の回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とするポリマンヌロン酸の製造方法。
【請求項７】
前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８未満の場合、前記回収液のｐＨを１に下げて析出した析出物を除去し、前記回収液に溶解しているポリマンヌロン酸を分離することを特徴とする請求項６に記載のポリマンヌロン酸の製造方法。
【請求項８】
前記質量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜１７０，０００の多糖類を構成する構成単位であるグルロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）の構成比（Ｍ／Ｇ比）が１．８以上の場合、前記回収液のｐＨを１に下げることによって、ポリマンヌロン酸を析出させて分離することを特徴とする請求項６に記載のポリマンヌロン酸の製造方法。
【請求項９】
グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち８０％以上がグルロン酸（Ｇ）単位で構成され、質量平均分子量が４，０００〜６８，０００であることを特徴とするポリグルロン酸。
【請求項１０】
グルロン酸（Ｇ）単位とマンヌロン酸（Ｍ）単位を９５％以上含み、且つ前記グルロン酸（Ｇ）単位と前記マンヌロン酸（Ｍ）単位のうち７０％以上がマンヌロン酸（Ｍ）単位で構成され、質量平均分子量が５，０００〜５５，０００であることを特徴とするポリマンヌロン酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１２１９６３（Ｐ２０１２−１２１９６３Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７２６８８（Ｐ２０１０−２７２６８８）
【出願日】平成２２年１２月７日（２０１０．１２．７）
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月７日（２０１０．１２．７）
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【Ｆターム（参考）】
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