ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
【課題】 微生物を用いてポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を効率よく合成することが出来る製造方法を提供する。
【解決手段】 下記式（１）
【化１】
（１）
（式中、Ｒ1は、フェニル構造を有する残基、チエニル構造を有する残基、シクロヘキシル構造を有する残基、ビニル基、ブロモ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの残基を表す。式中、ｎは、１〜８から選ばれた整数である。ただし、Ｒ1がシクロヘキシル構造を有する残基である場合、ｎは０でもよい。複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
で示される２−アルケン酸の少なくとも何れか一つを原料として、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物に、該ＰＨＡを生合成せしめる工程を含むＰＨＡの製造方法。
【解決手段】 下記式（１）
【化１】
（１）
（式中、Ｒ1は、フェニル構造を有する残基、チエニル構造を有する残基、シクロヘキシル構造を有する残基、ビニル基、ブロモ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの残基を表す。式中、ｎは、１〜８から選ばれた整数である。ただし、Ｒ1がシクロヘキシル構造を有する残基である場合、ｎは０でもよい。複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
で示される２−アルケン酸の少なくとも何れか一つを原料として、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物に、該ＰＨＡを生合成せしめる工程を含むＰＨＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエステルの一種であるポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を用いて製造する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物等の作用により分解可能な樹脂、即ち、生分解性樹脂の開発が進められており、例えば、ポリエステル構造を有する生分解性樹脂（ポリヒドロキシアルカノエート：以下略記する場合はＰＨＡと記載する）が多くの微生物により生産され、菌体内に蓄積されることが報告されている。
【０００３】
ＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することが出来る上に、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また 、生体適合性にも優れている。このような生分解性樹脂の利用については、医用材料の分野では既に実績がある。農業分野でも、マルチファイル、園芸資材、徐放性農薬、肥料等に実用化されている。さらに、レジャー分野においても、釣り糸、釣り用品、ゴルフ用品等に生分解性樹脂が用いられている。その他、日用品の包装材料として、生活用品の容器等で実用化されている。
【０００４】
ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られている。これまで主に、物性の改良という観点から、産生されるＰＨＡの組成や構造の制御に関する研究が行われてきた。
【０００５】
３−ヒドロキシ酪酸モノマーをはじめとする、比較的簡単な構造のモノマーを重合させたＰＨＡの生合成例として、特公平６−１５６０４号公報（特許文献１）には、アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ１６株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｕｓ Ｈ１６、ＡＴＣＣ Ｎｏ．１７６９９）及びその変異株が、その培養時の炭素源を変化させることによって、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシ吉草酸との共重合体を様々なユニット組成比で生産することが報告されている。
【０００６】
また、近年、炭素数が１２程度までの中鎖長（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ：ｍｃｌと略記）の３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーとして用いたＰＨＡについての研究が精力的に行なわれている。例えば、特許公報第２６４２９３７号明細書（特許文献２）には、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ２９３４７株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ ２９３４７）に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸のユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。
【０００７】
ところで、上記各例で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するユニットからなるＰＨＡ、即ち、「ｕｓｕａｌ ＰＨＡ」である。しかし、ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ、即ち、「ｕｎｕｓｕａｌ ＰＨＡ」が極めて有用であると期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの（フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等）や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド等が挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【０００８】
芳香環を有するＰＨＡとしては、特許第２９８９１７５号明細書（特許文献３）に、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）吉草酸ユニット或いは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットを含むＰＨＡに関する発明が開示されている。この特許文献には、発明の効果について、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることが出来る旨が開示されている。この特許文献では、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸とシクロヘキシル酪酸或いはシクロヘキシル吉草酸の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている。
【０００９】
これら置換基を側鎖に有したＰＨＡは、導入した置換基の特性に起因する、極めて有用な機能、特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開が期待出来る。生分解性に加えて、このような機能性を兼ね備えた優れたポリマーと、そのようなポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、そのような微生物を用いた当該ポリマーの効率的な生産方法の開発は、極めて有用かつ重要であると考えられる。
【００１０】
ところで、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡは、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例に示される通り、導入しようとする置換基を有したアルカン酸、例えば、フェニル基を有したアルカン酸である５−フェニル吉草酸を化学合成したのち、これを微生物に与えて培養し、生産されたＰＨＡを抽出する方法により製造することが出来る。
【特許文献１】特公平６−１５６０４号公報
【特許文献２】特許公報第２６４２９３７号
【特許文献３】特許公報第２９８９１７５号
【非特許文献１】生分解性プラスチック研究会編「生分解性プラスチックハンドブック」（株）エヌ・ティー・エス、１９９５年、ｐ．１７８−１９７
【非特許文献２】Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，３号，１９９１年、ｐ．４９２−４９４
【非特許文献３】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０号，１９９７、ｐ．１６１１−１６１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、アルカン酸を化学合成して微生物に与えることからなるＰＨＡの製造方法に於いては、導入しようとする置換基の種類や数、位置等によっては、アルカン酸を化学合成する上で大きな制約を受ける場合が数多くある。或いは、その化学合成における工程が数段階にも渡る化学反応を要する場合が多い。そのため、工業生産レベルでの合成が困難であったり、合成に多大な時間、手間及び費用を要したりすることなどの問題があった。
【００１２】
本発明は、この様な従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、微生物を用いて芳香環等の種々の置換基が導入されたＰＨＡを効率良く合成することが出来る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、置換脂肪酸と比較して合成或いは入手の容易な原料を用いた、ＰＨＡの製造方法を開発すべく、鋭意研究を重ねてきた結果、以下の発明に至った。
【００１４】
即ち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、
下記式（１）：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒ1は、フェニル構造を有する残基、チエニル構造を有する残基、シクロヘキシル構造を有する残基、ビニル基及びブロモ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの残基を表す。式中、ｎは、１〜８から選ばれた整数である。ただし、Ｒ1がシクロヘキシル構造を有する残基である場合、ｎは０でもよい。Ｒ1及びｎは、複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
で表わされるモノマーユニットを分子中に含んでなるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法において、
（Ａ）下記式（２）：
【００１７】
【化２】
【００１８】
（式中、Ｒ1及びｎは式（１）と同じ意味を表す。）
で表される２−アルケン酸を該２−アルケン酸をモノマーとしてポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物に作用させて該微生物内で前記式（１）で示されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを合成させる工程と、
（Ｂ）前記生産されたポリヒドロキシアルカノエートを有する微生物から、該ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程と、
を含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ポリヒドロキシアルカノエートを効率よく合成することが可能となった。とりわけ、機能性ポリマー等として有用な、フェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造を有する残基を含むモノマーユニットを分子中に含んでなるポリヒドロキシアルカノエートを効率良く合成することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
（２−アルケン酸）
本発明に於いては、ＰＨＡを製造する為の原料として、式（２）で表わされる２−アルケン酸の１種以上を少なくとも用いる。
【００２２】
式（２）のＲ1のフェニル構造を有する残基としては、以下の式（３）〜（８）からなる群から選ばれた１種が好ましい。
【００２３】
【化３】
【００２４】
(式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、Ｒ2はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'(Ｒ'はＨ、Ｎa、およびＫのいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ＝ＣＨ2基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【００２５】
【化４】
【００２６】
(式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、Ｒ3はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【００２７】
【化５】
【００２８】
(式中、Ｒ4は芳香環への置換基を示し、Ｒ4はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【００２９】
【化６】
【００３０】
(式中、Ｒ5は芳香環への置換基を示し、Ｒ5はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ':Ｈ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。）
【００３１】
【化７】
【００３２】
(式中、Ｒ6は芳香環への置換基を示し、Ｒ6はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ'はＨ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。）
【００３３】
【化８】
【００３４】
式（２）のＲ1のチエニル構造を有する残基としては、以下の式（９）〜（１１）からなる群から選ばれた１種が好ましい。
【００３５】
【化９】
【００３６】
【化１０】
【００３７】
【化１１】
【００３８】
式（２）のＲ1のシクロヘキシル構造を有する残基としては、以下の式（１２）または（１３）が好ましい。
【００３９】
【化１２】
【００４０】
（式中、Ｒ7はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ7はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【００４１】
【化１３】
【００４２】
（式中、Ｒ8 はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ8 はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2 基、ハロゲン原子、ＣＨ3 基、Ｃ2 Ｈ5 基、Ｃ3 Ｈ7 基、ＣＦ3 基、Ｃ2 Ｆ5 基またはＣ3 Ｆ7 基である。）
本発明で原料として用いる２−アルケン酸は一般に、通常ＰＨＡ製造の原料に用いられるアルカン酸と比較して、容易に化学合成することが可能である。例えば、下記化学式（１４）
【００４３】
【化１４】
【００４４】
で示されるモノマーユニットを分子中に含んでなるＰＨＡを、微生物を用いて製造する場合、下記化学式（１５）
【００４５】
【化１５】
【００４６】
で示される５−フェニル−２−ペンテン酸を原料として用いることが出来る。５−フェニル−２−ペンテン酸は、通常ＰＨＡの製造用原料として用いられる、下記化学式（１６）
【００４７】
【化１６】
【００４８】
で示される５−フェニル吉草酸を化学合成する際の前駆物質である。本発明は、式（１５）に示すような２−アルケン酸を原料として直接用いた場合での微生物において対応するモノマーユニットを含むＰＨＡが生産、蓄積される点を新たに見出したものである。従って、５−フェニル−２−ペンテン酸は５−フェニル吉草酸よりも簡便でかつ反応工程数の少ない方法で取得することが可能であり、より低いコストで取得することが可能である。
【００４９】
（ＰＨＡ）
本発明においては、上記式（２）の２−アルケン酸を原料として用いることによって、ＰＨＡ生産能を有する微生物によって上記式（１）で示されるＰＨＡが効率的に製造される。上記式（２）の２−アルケン酸におけるＲ１及びｎを適宜選択することで、対応したＲ１及びｎを有する式（１）のモノマーユニットが導入されたＰＨＡを得ることができる。
【００５０】
式（１）のＲ1がフェニル構造を有する残基であるＰＨＡとしては、Ｒ1 が前記の式（３）から式（８）のいずれかで示される基であるモノマーユニットを含むＰＨＡが好ましい。式（１）のＲ1がチエニル構造を有する残基であるＰＨＡとしては、Ｒ1が前記の式（９）から式（１１）で示される基のいずれかであるモノマーユニットを含むＰＨＡが好ましい。式（１）のＲ1がシクロアルキル構造を有する残基であるＰＨＡとしては、Ｒ1が前記式（１２）または（１３）で示される基であるモノマーユニットを含むＰＨＡが好ましい。
【００５１】
（ＰＨＡの製造方法）
本発明のＰＨＡの製造方法に用いる微生物は、前記式（２）の２−アルケン酸の少なくとも１種を含む培地中で培養した際、前記した対応するモノマーユニットを含むＰＨＡを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、如何なる微生物であっても良い。例えば、ＰＨＡ産生能を有するシュードモナス属に属する微生物が挙げられる。好適なシュードモナス属に属する微生物の一例としては、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）が挙げられる。
【００５２】
これらの微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。また、ＰＨＡ産生能を有する菌株として、既に、特開２００２−８０５７１号公報に記載されている微生物である。
【００５３】
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、例えば、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）等に属し、前記の２−アルケン酸を原料として、前記した対応するモノマーユニットを含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【００５４】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法は、原料の前記式（２）の２−アルケン酸を含む培地中で、前記したＰＨＡ産生能を有する微生物を培養することで、対応するモノマーユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【００５５】
微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作製、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキス等）や、栄養源を添加した合成培地等、如何なる種類の培地をも用いることが出来る。温度、通気、攪拌等の培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００５６】
一方、前記したＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とするモノマーユニットを含むＰＨＡを製造する際には、培地として、ＰＨＡ生産用の原料として、このモノマーユニットに対応する前記式（２）の２−アルケン酸に加えて、微生物の増殖用炭素源を少なくとも含んだ無機培地等を用いることが出来る。原料の前記２−アルケン酸は、培地当たり０．０１％〜１％（重量基準）の範囲、より好ましくは、０．０２％〜０．２％（重量基準）の範囲に初期の含有率を選択することが望ましい。後述するとおり、前記式（２）の２−アルケン酸は、その１種を単独で、あるいは必要に応じて２種以上を組み合わせて培地に添加することができる。複数の２−アルケン酸を用いる場合は、これらの合計量が上記の範囲とすることが好ましい。
【００５７】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質は、酵母エキスやポリペプトン、肉エキス、コーンスチープリカーといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類等から、用いる菌株に応じて、増殖基質としての有用性を考慮して、適宜選択することが出来る。
【００５８】
これら種々の増殖基質のうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用出来る。
【００５９】
原料化合物と共存させる、これらの増殖基質は、通常、培地あたり０．１％〜５％（重量基準）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（重量基準）の範囲にその含有率を選択することが望ましい。
【００６０】
また、複数種類のモノマーユニットをポリマー分子中に含むＰＨＡを生産させる場合、前記の培地中に、所望のモノマーユニットに対応する複数種類の２−アルケン酸を添加して培養する方法を採用することが可能であり、また、通常のＰＨＡ生産の原料として用いられるアルカン酸と２−アルケン酸とを組み合わせて使用することも可能である。
【００６１】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる培養方法としては、微生物を一旦十分に増殖させた後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【００６２】
より具体的には、（培養工程１）として、原料の２−アルケン酸、並びに増殖基質となる糖類を含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（培養工程２）として、原料の２−アルケン酸、並びに増殖基質となる糖類とを含む培地中（好ましくは窒素源を含まない）で、培養工程１で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行う方法等である。
【００６３】
培養温度は、上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。
【００６４】
また培養時のｐＨは、４．０〜１０．０の範囲が好ましい。
【００６５】
培養は、液体培養、固体培養等、利用する微生物が増殖し、培地中に含有される原料の２−アルケン酸から、前記モノマーユニットを含むＰＨＡを生産する培養方法ならば、如何なる培養方法をも用いることが出来る。さらには、原料、増殖基質、さらには酸素の供給が適正に行われるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。例えば、液体バッチ培養の形態としては、振盪フラスコによって振盪させて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００６６】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（リン酸塩等）、窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩等）等、微生物の増殖に必要な成分を含んでいる培地であれば如何なるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることが出来る。
【００６７】
例えば、後に述べる実施例において用いたＭ９培地の組成を以下に示す。
【００６８】
［Ｍ９培地］
Ｎａ2ＨＰＯ4：６．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4：３．０ｇ
ＮａＣｌ：０．５ｇ
ＮＨ4Ｃｌ：１．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
更に、良好な増殖と、それに伴うＰＨＡの生産の為には、上記の無機塩培地に、例えば、以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加して、必須微量元素を補うことが出来る。
【００６９】
［微量成分溶液］
ニトリロ三酢酸：１．５ｇ
ＭｇＳＯ4：３．０ｇ
ＭｎＳＯ4：０．５ｇ
ＮａＣｌ：１．０ｇ
ＦｅＳＯ4：０．１ｇ
ＣａＣｌ2：０．１ｇ
ＣｏＣｌ2：０．１ｇ
ＺｎＳＯ4：０．１ｇ
ＣｕＳＯ4：０．１ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ4）2 ０．１ｇ
Ｈ3ＢＯ3：０．１ｇ
Ｎａ2ＭｏＯ4：０．１ｇ
ＮｉＣｌ2：０．１ｇ
（溶液１リットル中、ｐＨ７．０）
本発明に用いる微生物は、前記の培養方法により、前記モノマーユニットを含むＰＨＡを産生し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のＰＨＡの製造方法では、培養後、その培養菌体から、目的とするＰＨＡを分離回収する工程を設ける。
【００７０】
この微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したＰＨＡを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることが出来る。通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、クロロホルム以外に、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等が用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理によって、ＰＨＡ以外の菌体内成分を可溶化・除去することによって、不溶性画分として、ＰＨＡのみを回収する方法を採ることも出来る。さらには、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破砕する処理を行って、細胞中に蓄積されたＰＨＡのみを分離、回収する方法を採ることも出来る。
【００７１】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法において、微生物の培養、その間における、培養される微生物におけるＰＨＡの生産と菌体への蓄積を行う工程、並びに、培養後、その菌体からのＰＨＡ回収を行う工程は、上記の方法に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。また、以下の配合における「部」は全て重量基準である。
【００７３】
実施例１
ポリペプトン（日本製薬株式会社製）０．５％、先に挙げた式(１５)で示される５−フェニル−２−ペンテン酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１００ストローク／分で振盪培養した。３８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを１０ｍｌクロロホルムに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収し真空乾燥した。その結果、０．１０ｇのＰＨＡが得られた。
【００７４】
得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
【００７５】
＜測定機器＞
ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００
共鳴周波数： 1Ｈ＝４００ＭＨｚ、13Ｃ＝１００ＭＨｚ
＜測定条件＞
測定核種：1Ｈ
使用溶媒：ＣＤＣｌ3
測定温度：室温
その結果、当該ＰＨＡは、先に挙げた式(１４)で示される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット９３．５モル％、その他のユニット(炭素数４〜１２の直鎖３−ヒドロキシアルカン酸ユニット等)６．５モル％を含むＰＨＡであることが確認された。
【００７６】
実施例２
ポリペプトン（日本製薬株式会社製）０．５％、Ｄ−グルコース０．５％、先に挙げた式(１５)で示される５−フェニル−２−ペンテン酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１００ストローク／分で振盪培養した。３８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して真空乾燥した。
【００７７】
この乾燥菌体ペレットを１０ｍｌクロロホルムに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収し真空乾燥した。その結果、０．１０ｇのＰＨＡが得られた。
【００７８】
得られたＰＨＡの構造を特定するため、実施例１と同様にしてＮＭＲ分析を行った。その結果、当該ＰＨＡは、先に挙げた式(１４)で示される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット８９．８モル％、その他のユニット(炭素数４〜１２の直鎖３−ヒドロキシアルカン酸ユニット等)１０．２モル％を含むＰＨＡであることが確認された。
【００７９】
実施例３
５−フェニル−２−ペンテン酸の替わりに、５−（２−チエニル）−２−ペンテン酸を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−（２−チエニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８０】
実施例４
５−フェニル−２−ペンテン酸の替わりに、４−シクロヘキシル−２−ブテン酸を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８１】
実施例５
５−フェニル−２−ペンテン酸の替わりに、６−ブロモ−２−ヘキセン酸を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８２】
実施例６
シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の替わりに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８３】
実施例７
シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の替わりに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８４】
実施例８
シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の替わりに、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエステルの一種であるポリヒドロキシアルカノエートを、微生物を用いて製造する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物等の作用により分解可能な樹脂、即ち、生分解性樹脂の開発が進められており、例えば、ポリエステル構造を有する生分解性樹脂（ポリヒドロキシアルカノエート：以下略記する場合はＰＨＡと記載する）が多くの微生物により生産され、菌体内に蓄積されることが報告されている。
【０００３】
ＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することが出来る上に、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また 、生体適合性にも優れている。このような生分解性樹脂の利用については、医用材料の分野では既に実績がある。農業分野でも、マルチファイル、園芸資材、徐放性農薬、肥料等に実用化されている。さらに、レジャー分野においても、釣り糸、釣り用品、ゴルフ用品等に生分解性樹脂が用いられている。その他、日用品の包装材料として、生活用品の容器等で実用化されている。
【０００４】
ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られている。これまで主に、物性の改良という観点から、産生されるＰＨＡの組成や構造の制御に関する研究が行われてきた。
【０００５】
３−ヒドロキシ酪酸モノマーをはじめとする、比較的簡単な構造のモノマーを重合させたＰＨＡの生合成例として、特公平６−１５６０４号公報（特許文献１）には、アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ１６株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｕｓ Ｈ１６、ＡＴＣＣ Ｎｏ．１７６９９）及びその変異株が、その培養時の炭素源を変化させることによって、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシ吉草酸との共重合体を様々なユニット組成比で生産することが報告されている。
【０００６】
また、近年、炭素数が１２程度までの中鎖長（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ：ｍｃｌと略記）の３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーとして用いたＰＨＡについての研究が精力的に行なわれている。例えば、特許公報第２６４２９３７号明細書（特許文献２）には、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ２９３４７株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ ２９３４７）に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸のユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。
【０００７】
ところで、上記各例で合成されているＰＨＡは、いずれも側鎖にアルキル基を有するユニットからなるＰＨＡ、即ち、「ｕｓｕａｌ ＰＨＡ」である。しかし、ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ、即ち、「ｕｎｕｓｕａｌ ＰＨＡ」が極めて有用であると期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの（フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等）や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド等が挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【０００８】
芳香環を有するＰＨＡとしては、特許第２９８９１７５号明細書（特許文献３）に、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）吉草酸ユニット或いは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットを含むＰＨＡに関する発明が開示されている。この特許文献には、発明の効果について、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性を与えることが出来る旨が開示されている。この特許文献では、シュードモナス・オレオボランスを、ノナン酸とシクロヘキシル酪酸或いはシクロヘキシル吉草酸の共存する培地中で培養すると、シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユニットを含むＰＨＡが得られている。
【０００９】
これら置換基を側鎖に有したＰＨＡは、導入した置換基の特性に起因する、極めて有用な機能、特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開が期待出来る。生分解性に加えて、このような機能性を兼ね備えた優れたポリマーと、そのようなポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、そのような微生物を用いた当該ポリマーの効率的な生産方法の開発は、極めて有用かつ重要であると考えられる。
【００１０】
ところで、様々な置換基を側鎖に導入したＰＨＡは、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例に示される通り、導入しようとする置換基を有したアルカン酸、例えば、フェニル基を有したアルカン酸である５−フェニル吉草酸を化学合成したのち、これを微生物に与えて培養し、生産されたＰＨＡを抽出する方法により製造することが出来る。
【特許文献１】特公平６−１５６０４号公報
【特許文献２】特許公報第２６４２９３７号
【特許文献３】特許公報第２９８９１７５号
【非特許文献１】生分解性プラスチック研究会編「生分解性プラスチックハンドブック」（株）エヌ・ティー・エス、１９９５年、ｐ．１７８−１９７
【非特許文献２】Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，３号，１９９１年、ｐ．４９２−４９４
【非特許文献３】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０号，１９９７、ｐ．１６１１−１６１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、アルカン酸を化学合成して微生物に与えることからなるＰＨＡの製造方法に於いては、導入しようとする置換基の種類や数、位置等によっては、アルカン酸を化学合成する上で大きな制約を受ける場合が数多くある。或いは、その化学合成における工程が数段階にも渡る化学反応を要する場合が多い。そのため、工業生産レベルでの合成が困難であったり、合成に多大な時間、手間及び費用を要したりすることなどの問題があった。
【００１２】
本発明は、この様な従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、微生物を用いて芳香環等の種々の置換基が導入されたＰＨＡを効率良く合成することが出来る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、置換脂肪酸と比較して合成或いは入手の容易な原料を用いた、ＰＨＡの製造方法を開発すべく、鋭意研究を重ねてきた結果、以下の発明に至った。
【００１４】
即ち、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、
下記式（１）：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒ1は、フェニル構造を有する残基、チエニル構造を有する残基、シクロヘキシル構造を有する残基、ビニル基及びブロモ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの残基を表す。式中、ｎは、１〜８から選ばれた整数である。ただし、Ｒ1がシクロヘキシル構造を有する残基である場合、ｎは０でもよい。Ｒ1及びｎは、複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
で表わされるモノマーユニットを分子中に含んでなるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法において、
（Ａ）下記式（２）：
【００１７】
【化２】
【００１８】
（式中、Ｒ1及びｎは式（１）と同じ意味を表す。）
で表される２−アルケン酸を該２−アルケン酸をモノマーとしてポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物に作用させて該微生物内で前記式（１）で示されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを合成させる工程と、
（Ｂ）前記生産されたポリヒドロキシアルカノエートを有する微生物から、該ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程と、
を含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ポリヒドロキシアルカノエートを効率よく合成することが可能となった。とりわけ、機能性ポリマー等として有用な、フェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造を有する残基を含むモノマーユニットを分子中に含んでなるポリヒドロキシアルカノエートを効率良く合成することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
（２−アルケン酸）
本発明に於いては、ＰＨＡを製造する為の原料として、式（２）で表わされる２−アルケン酸の１種以上を少なくとも用いる。
【００２２】
式（２）のＲ1のフェニル構造を有する残基としては、以下の式（３）〜（８）からなる群から選ばれた１種が好ましい。
【００２３】
【化３】
【００２４】
(式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、Ｒ2はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'(Ｒ'はＨ、Ｎa、およびＫのいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ＝ＣＨ2基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【００２５】
【化４】
【００２６】
(式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、Ｒ3はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【００２７】
【化５】
【００２８】
(式中、Ｒ4は芳香環への置換基を示し、Ｒ4はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【００２９】
【化６】
【００３０】
(式中、Ｒ5は芳香環への置換基を示し、Ｒ5はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ':Ｈ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。）
【００３１】
【化７】
【００３２】
(式中、Ｒ6は芳香環への置換基を示し、Ｒ6はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ'はＨ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。）
【００３３】
【化８】
【００３４】
式（２）のＲ1のチエニル構造を有する残基としては、以下の式（９）〜（１１）からなる群から選ばれた１種が好ましい。
【００３５】
【化９】
【００３６】
【化１０】
【００３７】
【化１１】
【００３８】
式（２）のＲ1のシクロヘキシル構造を有する残基としては、以下の式（１２）または（１３）が好ましい。
【００３９】
【化１２】
【００４０】
（式中、Ｒ7はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ7はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【００４１】
【化１３】
【００４２】
（式中、Ｒ8 はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ8 はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2 基、ハロゲン原子、ＣＨ3 基、Ｃ2 Ｈ5 基、Ｃ3 Ｈ7 基、ＣＦ3 基、Ｃ2 Ｆ5 基またはＣ3 Ｆ7 基である。）
本発明で原料として用いる２−アルケン酸は一般に、通常ＰＨＡ製造の原料に用いられるアルカン酸と比較して、容易に化学合成することが可能である。例えば、下記化学式（１４）
【００４３】
【化１４】
【００４４】
で示されるモノマーユニットを分子中に含んでなるＰＨＡを、微生物を用いて製造する場合、下記化学式（１５）
【００４５】
【化１５】
【００４６】
で示される５−フェニル−２−ペンテン酸を原料として用いることが出来る。５−フェニル−２−ペンテン酸は、通常ＰＨＡの製造用原料として用いられる、下記化学式（１６）
【００４７】
【化１６】
【００４８】
で示される５−フェニル吉草酸を化学合成する際の前駆物質である。本発明は、式（１５）に示すような２−アルケン酸を原料として直接用いた場合での微生物において対応するモノマーユニットを含むＰＨＡが生産、蓄積される点を新たに見出したものである。従って、５−フェニル−２−ペンテン酸は５−フェニル吉草酸よりも簡便でかつ反応工程数の少ない方法で取得することが可能であり、より低いコストで取得することが可能である。
【００４９】
（ＰＨＡ）
本発明においては、上記式（２）の２−アルケン酸を原料として用いることによって、ＰＨＡ生産能を有する微生物によって上記式（１）で示されるＰＨＡが効率的に製造される。上記式（２）の２−アルケン酸におけるＲ１及びｎを適宜選択することで、対応したＲ１及びｎを有する式（１）のモノマーユニットが導入されたＰＨＡを得ることができる。
【００５０】
式（１）のＲ1がフェニル構造を有する残基であるＰＨＡとしては、Ｒ1 が前記の式（３）から式（８）のいずれかで示される基であるモノマーユニットを含むＰＨＡが好ましい。式（１）のＲ1がチエニル構造を有する残基であるＰＨＡとしては、Ｒ1が前記の式（９）から式（１１）で示される基のいずれかであるモノマーユニットを含むＰＨＡが好ましい。式（１）のＲ1がシクロアルキル構造を有する残基であるＰＨＡとしては、Ｒ1が前記式（１２）または（１３）で示される基であるモノマーユニットを含むＰＨＡが好ましい。
【００５１】
（ＰＨＡの製造方法）
本発明のＰＨＡの製造方法に用いる微生物は、前記式（２）の２−アルケン酸の少なくとも１種を含む培地中で培養した際、前記した対応するモノマーユニットを含むＰＨＡを生産し、その細胞内に蓄積する微生物であれば、如何なる微生物であっても良い。例えば、ＰＨＡ産生能を有するシュードモナス属に属する微生物が挙げられる。好適なシュードモナス属に属する微生物の一例としては、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）が挙げられる。
【００５２】
これらの微生物は、寄託者として本願出願人を名義として、先に国内寄託され、その後、その原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へと移管され、国際寄託機関としての経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所よりそれぞれ、前記の受託番号を付与され、現在の、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。また、ＰＨＡ産生能を有する菌株として、既に、特開２００２−８０５７１号公報に記載されている微生物である。
【００５３】
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、例えば、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）等に属し、前記の２−アルケン酸を原料として、前記した対応するモノマーユニットを含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【００５４】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法は、原料の前記式（２）の２−アルケン酸を含む培地中で、前記したＰＨＡ産生能を有する微生物を培養することで、対応するモノマーユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【００５５】
微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作製、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキス等）や、栄養源を添加した合成培地等、如何なる種類の培地をも用いることが出来る。温度、通気、攪拌等の培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００５６】
一方、前記したＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とするモノマーユニットを含むＰＨＡを製造する際には、培地として、ＰＨＡ生産用の原料として、このモノマーユニットに対応する前記式（２）の２−アルケン酸に加えて、微生物の増殖用炭素源を少なくとも含んだ無機培地等を用いることが出来る。原料の前記２−アルケン酸は、培地当たり０．０１％〜１％（重量基準）の範囲、より好ましくは、０．０２％〜０．２％（重量基準）の範囲に初期の含有率を選択することが望ましい。後述するとおり、前記式（２）の２−アルケン酸は、その１種を単独で、あるいは必要に応じて２種以上を組み合わせて培地に添加することができる。複数の２−アルケン酸を用いる場合は、これらの合計量が上記の範囲とすることが好ましい。
【００５７】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質は、酵母エキスやポリペプトン、肉エキス、コーンスチープリカーといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類等から、用いる菌株に応じて、増殖基質としての有用性を考慮して、適宜選択することが出来る。
【００５８】
これら種々の増殖基質のうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用出来る。
【００５９】
原料化合物と共存させる、これらの増殖基質は、通常、培地あたり０．１％〜５％（重量基準）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（重量基準）の範囲にその含有率を選択することが望ましい。
【００６０】
また、複数種類のモノマーユニットをポリマー分子中に含むＰＨＡを生産させる場合、前記の培地中に、所望のモノマーユニットに対応する複数種類の２−アルケン酸を添加して培養する方法を採用することが可能であり、また、通常のＰＨＡ生産の原料として用いられるアルカン酸と２−アルケン酸とを組み合わせて使用することも可能である。
【００６１】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる培養方法としては、微生物を一旦十分に増殖させた後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【００６２】
より具体的には、（培養工程１）として、原料の２−アルケン酸、並びに増殖基質となる糖類を含む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（培養工程２）として、原料の２−アルケン酸、並びに増殖基質となる糖類とを含む培地中（好ましくは窒素源を含まない）で、培養工程１で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行う方法等である。
【００６３】
培養温度は、上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。
【００６４】
また培養時のｐＨは、４．０〜１０．０の範囲が好ましい。
【００６５】
培養は、液体培養、固体培養等、利用する微生物が増殖し、培地中に含有される原料の２−アルケン酸から、前記モノマーユニットを含むＰＨＡを生産する培養方法ならば、如何なる培養方法をも用いることが出来る。さらには、原料、増殖基質、さらには酸素の供給が適正に行われるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。例えば、液体バッチ培養の形態としては、振盪フラスコによって振盪させて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００６６】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（リン酸塩等）、窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩等）等、微生物の増殖に必要な成分を含んでいる培地であれば如何なるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることが出来る。
【００６７】
例えば、後に述べる実施例において用いたＭ９培地の組成を以下に示す。
【００６８】
［Ｍ９培地］
Ｎａ2ＨＰＯ4：６．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4：３．０ｇ
ＮａＣｌ：０．５ｇ
ＮＨ4Ｃｌ：１．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
更に、良好な増殖と、それに伴うＰＨＡの生産の為には、上記の無機塩培地に、例えば、以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加して、必須微量元素を補うことが出来る。
【００６９】
［微量成分溶液］
ニトリロ三酢酸：１．５ｇ
ＭｇＳＯ4：３．０ｇ
ＭｎＳＯ4：０．５ｇ
ＮａＣｌ：１．０ｇ
ＦｅＳＯ4：０．１ｇ
ＣａＣｌ2：０．１ｇ
ＣｏＣｌ2：０．１ｇ
ＺｎＳＯ4：０．１ｇ
ＣｕＳＯ4：０．１ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ4）2 ０．１ｇ
Ｈ3ＢＯ3：０．１ｇ
Ｎａ2ＭｏＯ4：０．１ｇ
ＮｉＣｌ2：０．１ｇ
（溶液１リットル中、ｐＨ７．０）
本発明に用いる微生物は、前記の培養方法により、前記モノマーユニットを含むＰＨＡを産生し、その菌体内に蓄積する。従って、本発明のＰＨＡの製造方法では、培養後、その培養菌体から、目的とするＰＨＡを分離回収する工程を設ける。
【００７０】
この微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、溶媒抽出法を利用して、可溶化したＰＨＡを細胞由来の不溶成分と分離し、回収する手段を用いることが出来る。通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、クロロホルム以外に、ジクロロメタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン等が用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理によって、ＰＨＡ以外の菌体内成分を可溶化・除去することによって、不溶性画分として、ＰＨＡのみを回収する方法を採ることも出来る。さらには、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法等の微生物細胞を破砕する処理を行って、細胞中に蓄積されたＰＨＡのみを分離、回収する方法を採ることも出来る。
【００７１】
なお、本発明のＰＨＡの製造方法において、微生物の培養、その間における、培養される微生物におけるＰＨＡの生産と菌体への蓄積を行う工程、並びに、培養後、その菌体からのＰＨＡ回収を行う工程は、上記の方法に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。また、以下の配合における「部」は全て重量基準である。
【００７３】
実施例１
ポリペプトン（日本製薬株式会社製）０．５％、先に挙げた式(１５)で示される５−フェニル−２−ペンテン酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１００ストローク／分で振盪培養した。３８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを１０ｍｌクロロホルムに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収し真空乾燥した。その結果、０．１０ｇのＰＨＡが得られた。
【００７４】
得られたＰＨＡの構造を特定するため、以下の条件でＮＭＲ分析を行った。
【００７５】
＜測定機器＞
ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００
共鳴周波数： 1Ｈ＝４００ＭＨｚ、13Ｃ＝１００ＭＨｚ
＜測定条件＞
測定核種：1Ｈ
使用溶媒：ＣＤＣｌ3
測定温度：室温
その結果、当該ＰＨＡは、先に挙げた式(１４)で示される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット９３．５モル％、その他のユニット(炭素数４〜１２の直鎖３−ヒドロキシアルカン酸ユニット等)６．５モル％を含むＰＨＡであることが確認された。
【００７６】
実施例２
ポリペプトン（日本製薬株式会社製）０．５％、Ｄ−グルコース０．５％、先に挙げた式(１５)で示される５−フェニル−２−ペンテン酸０．１％を含むＭ９培地２００ｍｌに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、１００ストローク／分で振盪培養した。３８時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して真空乾燥した。
【００７７】
この乾燥菌体ペレットを１０ｍｌクロロホルムに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収し真空乾燥した。その結果、０．１０ｇのＰＨＡが得られた。
【００７８】
得られたＰＨＡの構造を特定するため、実施例１と同様にしてＮＭＲ分析を行った。その結果、当該ＰＨＡは、先に挙げた式(１４)で示される３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット８９．８モル％、その他のユニット(炭素数４〜１２の直鎖３−ヒドロキシアルカン酸ユニット等)１０．２モル％を含むＰＨＡであることが確認された。
【００７９】
実施例３
５−フェニル−２−ペンテン酸の替わりに、５−（２−チエニル）−２−ペンテン酸を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−（２−チエニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８０】
実施例４
５−フェニル−２−ペンテン酸の替わりに、４−シクロヘキシル−２−ブテン酸を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８１】
実施例５
５−フェニル−２−ペンテン酸の替わりに、６−ブロモ−２−ヘキセン酸を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８２】
実施例６
シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の替わりに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８３】
実施例７
シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の替わりに、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【００８４】
実施例８
シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の替わりに、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株を用いる以外は、実施例１と同様にして、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡが得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
（式中、Ｒ1は、フェニル構造を有する残基、チエニル構造を有する残基、シクロヘキシル構造を有する残基、ビニル基及びブロモ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの残基を表す。式中、ｎは、１〜８から選ばれた整数である。ただし、Ｒ1がシクロヘキシル構造を有する残基である場合、ｎは０でもよい。Ｒ1及びｎは、複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
で表わされるモノマーユニットを分子中に含んでなるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法において、
（Ａ）下記式（２）：
【化２】
（式中、Ｒ1及びｎは式（１）と同じ意味を表す。）
で表される２−アルケン酸を該２−アルケン酸をモノマーとしてポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物に作用させて該微生物内で前記式（１）で示されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを合成させる工程と、
（Ｂ）前記生産されたポリヒドロキシアルカノエートを有する微生物から、該ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程と、
を含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項２】
前記Ｒ1が、下記式（３）〜（１３）で表わされる残基のいずれかである請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化３】
(式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、Ｒ2はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'(Ｒ'はＨ、Ｎa、およびＫのいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ＝ＣＨ2基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【化４】
(式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、Ｒ3はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【化５】
(式中、Ｒ4は芳香環への置換基を示し、Ｒ4はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【化６】
(式中、Ｒ5は芳香環への置換基を示し、Ｒ5はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ'はＨ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。)
【化７】
(式中、Ｒ6は芳香環への置換基を示し、Ｒ6はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ'はＨ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。)
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
（式中、Ｒ7はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ7はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【化１３】
（式中、Ｒ8 はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ8 はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2 基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカノエートを微生物に合成させる工程は、前記式（２）で示される２−アルケン酸の少なくとも１種を含む培地中で該微生物を培養することにより行なわれる請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）及びシュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）の１つ以上である請求項４に記載の製造方法。
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
（式中、Ｒ1は、フェニル構造を有する残基、チエニル構造を有する残基、シクロヘキシル構造を有する残基、ビニル基及びブロモ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの残基を表す。式中、ｎは、１〜８から選ばれた整数である。ただし、Ｒ1がシクロヘキシル構造を有する残基である場合、ｎは０でもよい。Ｒ1及びｎは、複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
で表わされるモノマーユニットを分子中に含んでなるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法において、
（Ａ）下記式（２）：
【化２】
（式中、Ｒ1及びｎは式（１）と同じ意味を表す。）
で表される２−アルケン酸を該２−アルケン酸をモノマーとしてポリヒドロキシアルカノエートを合成し得る微生物に作用させて該微生物内で前記式（１）で示されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを合成させる工程と、
（Ｂ）前記生産されたポリヒドロキシアルカノエートを有する微生物から、該ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程と、
を含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項２】
前記Ｒ1が、下記式（３）〜（１３）で表わされる残基のいずれかである請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化３】
(式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、Ｒ2はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'(Ｒ'はＨ、Ｎa、およびＫのいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ＝ＣＨ2基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【化４】
(式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、Ｒ3はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【化５】
(式中、Ｒ4は芳香環への置換基を示し、Ｒ4はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。)
【化６】
(式中、Ｒ5は芳香環への置換基を示し、Ｒ5はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ'はＨ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。)
【化７】
(式中、Ｒ6は芳香環への置換基を示し、Ｒ6はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ'、ＳＯ2Ｒ"(Ｒ'はＨ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3およびＣ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ"はＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、およびＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基である。)
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
（式中、Ｒ7はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ7はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基である。）
【化１３】
（式中、Ｒ8 はシクロヘキサン環への置換基を示し、Ｒ8 はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2 基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカノエートを微生物に合成させる工程は、前記式（２）で示される２−アルケン酸の少なくとも１種を含む培地中で該微生物を培養することにより行なわれる請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）及びシュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）の１つ以上である請求項４に記載の製造方法。
【公開番号】特開２００７−１４３００（Ｐ２００７−１４３００Ａ）
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２０１４１０（Ｐ２００５−２０１４１０）
【出願日】平成１７年７月１１日（２００５．７．１１）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１１日（２００５．７．１１）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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