マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド
【課題】新規ポリヌクレオチド、および真菌における挿入突然変異誘発および遺伝子標識のためのこれらのポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】特徴づけられたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの、真菌のゲノム内へのランダム挿入による、真菌における突然変異体のコレクションの生成を可能にする効率的突然変異誘発のための新規手段、および、得られた突然変異体。
【解決手段】特徴づけられたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの、真菌のゲノム内へのランダム挿入による、真菌における突然変異体のコレクションの生成を可能にする効率的突然変異誘発のための新規手段、および、得られた突然変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリヌクレオチド、および真菌における挿入突然変異誘発および遺伝子標識のためのこれらのポリヌクレオチドの用途に関する。本発明はまた、これらの真菌のゲノム内へのフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のインパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンのランダム挿入により得られた真菌突然変異体のコレクションに関する。これらの突然変異体のコレクションは、真菌における遺伝子の機能を研究するための有効な遺伝的手段の１つである。
【背景技術】
【０００２】
トランスポゾンは、２つのＤＮＡ配列間を移動しうる可動性遺伝子因子として定義されうる。それらは遺伝子（エキソン、イントロン、調節領域）内に挿入されうるため、それらは突然変異の原因となりうる。このため、それらは、ゲノム内に寄生体として存在して該ゲノムの進化に寄与する。トランスポゾンは、それらの増幅様態に応じて２つのグループに分類されている（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，１９８９；Ｃａｐｙら，１９９８）。
【０００３】
・クラスＩ因子（レトロ因子（ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ））は、逆転写酵素によりＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ中間体を介して転位する。このクラスは、ＬＴＲ（長末端反復配列）に隣接していることも隣接していないこともあるレトロトランスポゾンまたはレトロ因子に細分される。該ＬＴＲレトロ因子としては、ｇｙｐｓｙファミリーの因子、およびｃｏｐｉａファミリーの因子が挙げられる。それらは、レトロウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に相同でｐｏｌ遺伝子の種々の機能的ドメインの体制が異なる遺伝子を有する。また、ｇｙｐｓｙファミリーは、レトロウイルスにおいてその感染に寄与するｅｎｖに相同な遺伝子を有する。非ＬＴＲレトロ要素のなかでは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子ならびにポリＡ配列を有するＬＩＮＥが区別され、また、ポリＡテイルも有するがｇａｇおよびｐｏｌ配列を欠くＳＩＮＥが区別される。それは、先のＬＩＮＥ因子に由来すると考えられる（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，１９９２；ＯｋａｄａおよびＨａｍａｄａ，１９９７）。
【０００４】
・クラスＩＩ因子は、トランスポゾンＤＮＡ配列の切除および再挿入のメカニズムを介して転位する。その全体的構造は、該因子の転位に必要なトランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームに隣接する２つの逆方向反復配列（ＩＴＲ）よりなる。これらの因子は、そのトランスポザーゼおよび／またはＩＴＲの配列相同性に基づき、まとめていくつかのスーパーファミリーに分類されており、それらには、Ｔｃ１／マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）因子のスーパーファミリー（Ｄｏａｋら，１９９４）、Ｆｏｔ１／Ｐｏｇｏ要素のスーパーファミリー（Ｃａｐｙら，１９９８；ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ，１９９６）、ｈＡＴ因子のスーパーファミリー（Ｃａｌｖｉら，１９９１）、Ｐ因子のスーパーファミリー（Ｋｉｄｗｅｌｌ，１９９４）またはＣＡＣＴＡ因子のスーパーファミリー（Ｇｉｅｒｌ １９９６）が含まれる。
【０００５】
真菌トランスポゾンの同定および研究は、特に、挿入突然変異誘発のための手段を開発しようとする場合（Ｂｒｏｗｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３９０−４，１９９８）、さらにまた、これらの真菌のゲノムを研究しようとする場合（Ｄｏｂｉｎｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１：３４８−３６５２，１９９３）に、非常に重要である。
【０００６】
したがって、真菌のゲノムにおいてトランスポゾンを同定するためには、種々の方法が実施されている。第１および第２の方法は、既に特徴づけられている因子から導かれた知見を利用するものである。これは、高度に保存されたドメイン（例えば、ＬＴＲレトロ因子逆転写酵素のもの）に由来するオリゴヌクレオチドを使用するサザンハイブリダイゼーション実験または増幅において使用する異種プローブの使用を含む。第３の方法は、反復ＤＮＡ配列を特徴づけることにある。この場合、ゲノムＤＮＡとリボソームプローブとの間のディファレンシャルハイブリダイゼーションが必要である。このようにして、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ゲノムにおいて、Ｆｏｔ１ファミリーのトランスポゾンが同定されている（Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３１：３６１−３６９，１９９７；Ｆａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５１：６７５−６８１ １９９６；Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４５：３３９−３４８，１９９４）。最後の方法は、前記の３つの方法とは異なり、機能的および活性な因子の同定を可能にする。これは、トランスポゾン捕捉（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｔｒａｐ）である。この方法はマーカー遺伝子の不活性化を用いるものであり、この方法においては、該因子の挿入により生じた突然変異が陽性スクリーニングにより同定されうる。このようにして、ａｍ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子は、ニューロスパラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）においてＴａｄレトロ因子（これは、ＬＩＮＥ型のものである）を、この遺伝子内へのその再挿入後に特徴づけることを可能にした（ＫｉｎｓｅｙおよびＨｅｌｂｅｒ，１９８９）。また、トランスポゾンを捕捉するために、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）遺伝子が使用されている。特に、この遺伝子を不活性化する突然変異はクロラート耐性を付与する。このようにして、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｇｅｎｅｔｉｃａ ９３：４９−５９，１１９４）およびアスペルギルス（米国特許第５，９８５，５７０号）において種々のトランスポゾンが同定されている。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のクラスＩＩ因子であるＦｏｔ１は、ｎｉａＤ遺伝子の不活性化を用いて同定された最初のトランスポゾンであった（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９９２）。また、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）におけるｎｉａＤ遺伝子の使用は、Ｔｃ１／マリナー型因子のスーパーファミリーに属するインパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンを捕捉することを可能にした（Ｌｉｎｇｉｎら，１９９５）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においては、種々のインパラトランスポゾンスーパーファミリーが同定されている（Ｈｕｎ−Ｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５９：３５４−３６２，１９９８）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においては、インパラ因子の転位が研究されている。与えられた遺伝子のイントロンまたはプロモーター内にインパラトランスポゾンが組込まれた場合には、それはついで、この遺伝子の発現を不活性化しうる。一方、インパラトランスポゾンの転位後、該遺伝子は再活性化され、これは、該転位事象の陽性対照を構成する。該転位を同定するためのそのような方法が、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）遺伝子のプロモーター調節配列内に組込まれたインパラトランスポゾンを含む構築物を使用して、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）において行われている（Ｈｕａ−Ｖａｎ，１９９８）。
【０００７】
現在のところ、他の真菌、より詳しくはマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／インパラ遺伝子構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）を使用してインパラの転位を証明することは、挿入突然変異誘発手段の開発に不適合な非常に低い比率で可能であるにすぎない。これらの観察は、ｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／インパラ構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）、より詳しくはインパラトランスポゾン自体が、他の真菌、特にエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）において機能的でないことを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，９８５，５７０号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｉｎｎｅｇａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１９８９，５，１０３−１０７
【非特許文献２】Ｃａｐｙら，Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ． Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９８
【非特許文献３】Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．，１９９２，４，４３０−４４０
【非特許文献４】ＯｋａｄａおよびＨａｍａｄａ，Ｊ． Ｍｏｌ. Ｅｖｏｌ．１９９７，Ｓ５２−５６
【非特許文献５】Ｄｏａｋら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９４，９１，９４２−９４６
【非特許文献６】ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９６，９３，１４４３−１４４８
【非特許文献７】Ｃａｌｖｉら，Ｃｅｌｌ，１９９１，６６，４６５−４７
【非特許文献８】Ｋｉｄｗｅｌｌ，Ｊ． Ｈｅｒｅｄ．，１９９４，８５，３３９−３４６
【非特許文献９】Ｇｉｅｒｌ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，２０４，１４５−１５９
【非特許文献１０】Ｂｒｏｗｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３９０−４，１９９８
【非特許文献１１】Ｄｏｂｉｎｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１：３４８−３６５２，１９９３
【非特許文献１２】Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３１：３６１−３６９，１９９７
【非特許文献１３】Ｆａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５１：６７５−６８１ １９９６
【非特許文献１４】Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４５：３３９−３４８，１９９４
【非特許文献１５】Ｋｉｎｓｅｙ ａｎｄ Ｈｅｌｂｅｒ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９８９，８６，１９２９−１９３３
【非特許文献１６】Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｇｅｎｅｔｉｃａ ９３：４９−５９，１１９４
【非特許文献１７】Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，２３２，１２−１６
【非特許文献１８】Ｌａｎｇｉｎら，１９９５
【非特許文献１９】Ｈｕｎ−Ｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９８，２５９，３５４−３６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
真菌ゲノム（より詳しくは病原性糸状菌のゲノム）における挿入突然変異体のコレクションを作製するためのそのような手段は、それらのゲノムの研究およびそれらの遺伝子の機能の研究に今や不可欠である。ヒトまたは動物における真菌性病態の治療用または農業用に使用されうる新規抗真菌化合物を見出すためには、真菌遺伝子の機能の分析が不可欠である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的でありインパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなる新規ポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、挿入突然変異誘発手段の開発に適した転位率で、真菌におけるインパラ因子の転位を示すことを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、真菌突然変異体の製造方法であって、そのゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入することによる製造方法、および関心のある表現型に関連した真菌遺伝子を同定するための方法である。最後に、本発明は、真菌挿入突然変異体のコレクションおよびその用途に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐＮｉ１６０プラスミドのマッピング。
【図２】ｐＮｉＬ１６０プラスミド（Ａ）およびｐＡＮ３０１プラスミド（Ｂ）の、それを構築するために用いたマッピング。
【図３】ｐＮｉ１６０およびｐＣＢ１１７９ベクターを使用してＢａｍＨＩ ＲＥＭＩにより得られた同時形質転換体の分子分析。
【図４】ｎｉａ＋復帰突然変異体Ｃ１４−１およびＣ１４−２の分子分析。 Ａ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分析。 Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変異体の分析。
【図５】ｐＮｉＬ１６０ベクターを保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。
【図６】非病原性復帰突然変異体Ｒｅｖ７７におけるインパラの挿入により遮断されたＯＲＦの概要図。
【図７】ｐＣＩＴｎプラスミドのマッピング。
【図８】ｐＮｉＨＹＧ構築物を保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。
【図９】ｐＨＩＮプラスミドのマッピング。
【図１０】ｐＥＯ６プラスミドのマッピング。
【図１１】ｐＨＮｉＬプラスミドのマッピング。
【図１２】ｐＢＮｉＬプラスミドのマッピング。
【図１３】ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドのマッピング。
【図１４】該２成分系を用いた形質転換後に得られたＤ１同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の記載）
ポリヌクレオチド
したがって、本発明は、インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結された、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ Ｇｒｉｓｅａ）において機能的なプロモーター調節配列を転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド、特に、単離または精製されたポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドでの真菌の形質転換および該トランスポゾンの切除は、該マーカー遺伝子の発現につながる。したがって、該マーカー遺伝子の発現の検出は、該転位事象のモニターおよび該挿入突然変異体の選択を可能にする。該突然変異体の選択は、第１マーカーとは異なる第２マーカー遺伝子で該トランスポゾンを標識することにより改良されうる。この第２マーカー遺伝子は、該真菌のゲノム内への該トランスポゾンの再挿入のモニターを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、前記のポリヌクレオチドである。
【００１５】
使用するマーカー遺伝子は、簡便なスクリーニングによる転位事象の選択に適したものである。本発明においては、表現型スクリーニングで真菌内での発現が検出されうる任意のマーカー遺伝子を使用することができる。「マーカー遺伝子」なる語は、異なる起源の遺伝要素を含むキメラ遺伝子をも意味すると理解される。したがって、本発明のマーカー遺伝子は、真菌由来のプロモーター配列と、真菌由来でないマーカー遺伝子のコード配列との両方を有しうる。
【００１６】
本発明においては、「マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列」なる表現は、あるコード配列に機能的に連結されたポリヌクレオチドのうち、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における該コード配列の発現を可能にする任意のポリヌクレオチドを意味すると意図される。プロモーター配列がマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるか否かを判定することを可能にする技術は、当業者に公知である。例えば、潜在的プロモーター配列とレポーター遺伝子とを転写の方向に含むポリヌクレオチドでマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）を形質転換することができる。該ポリヌクレオチドで形質転換された真菌における該レポーター遺伝子の発現のモニターは、このプロモーター配列がマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的であるか否かの判定を可能にする。したがって、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における機能を判定するために、任意のプロモーター配列を試験することができる。該プロモーター調節配列は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来の遺伝子のプロモーター調節配列であることが可能であり、あるいは別の真菌、さらに詳しくは別の糸状菌に由来することが可能である。マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列は、真菌ｎｉａ（硝酸レダクターゼ）またはｇｐｄ遺伝子のプロモーター調節配列よりなることが有利である。好ましくは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）またはｇｐｄＡ遺伝子（Ｐｕｎｔら，１９９０）の、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的なプロモーター調節配列よりなる。マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的であるためには、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列は、好ましくは、３３７ｂｐより長く、０．４ｋｂより長く、０．５ｋｂより長く、０．６ｋｂより長く、０．７ｋｂより長く、０．８ｋｂより長く、０．９ｋｂより長く、より好ましくは、約１ｋｂより長いか又はそれに等しい。本発明の好ましい実施形態においては、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ５８２９１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら，Ｇｅｎｅ ９０：１８１−１９２，１９９０；Ｐｕｎｔら，１９９５）由来のｎｉａＤおよびｎｉｉＡ遺伝子の遺伝子間断片に相当する１．３ｋｂのポリヌクレオチドよりなる。それ自体は機能的ではないが、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）プロモーターの下流へのランダムな組込みにより該マーカー遺伝子の発現を可能にする部分的機能的調節配列は、本発明においては、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的な調節配列ではないと理解される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子のコード配列は、発現が容易に測定されるレポーター遺伝子、特にＧＵＳ（米国特許第５，２６８，４６３号、米国特許第５，５９９，６７０号）またはＧＦＰ（米国特許第５，４９１，０８４号、米国特許第５，７４１，６６８号）のコード配列、抗生物質または除草剤に対する耐性に関する遺伝子、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ：Ｐｕｎｔら，１９８７）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ：Ｄｒｏｃｏｕｒｔ，１９９０）、除草剤ビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）耐性遺伝子（Ｂａｒ：ＰａｌｌおよびＢｒｕｎｅｌｌｉ，１９９３）またはスルホニル尿素耐性遺伝子（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のコード配列から選ばれる。本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子は、真菌において機能的である、酵素をコードする遺伝子の配列から選ばれる。好ましくは、該マーカー遺伝子は硝酸レダクターゼ遺伝子である。本発明の断片がｎｉａ−真菌内に組込まれた場合、この構築物で形質転換された株は突然変異体表現型を維持する。最少培地（唯一の窒素源としてのＮａＮＯ３）上のｎｉａ＋コロニーの出現は、ｎｉａＤ遺伝子の発現を可能にするインパラトランスポゾンの切除を示す。これらのｎｉａ＋復帰突然変異体は、ｎｉａ−コロニーの低く平らな表現型とは異なるそれらの密集性かつ気生性（ａｅｒｉａｌ）の表現型により、この培地上で選択されうる。マーカーとしてのｎｉａＤ遺伝子の使用は、ｎｉａ−真菌の使用を要する。ｎｉａ−真菌の同定方法は当業者によく知られている。特に、Ｄａｂｏｕｓｓｉら（１９８９）により記載されている方法が挙げられる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、インパラトランスポゾン（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５；Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）の挿入により不活性化された前記のマーカー遺伝子を含む。該インパラトランスポゾンは、逆方向反復配列（ＩＴＲ）に隣接した機能的トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む。それは、ＴＡジヌクレオチドにおいて挿入され、これは重複状態となる。インパラの切除は曖昧なものであり、ごく一般的には、該挿入中に重複したＴＡジヌクレオチドに加えて、該因子の左または右末端に対応する３ヌクレオチドの足跡（フットプリント）を残す。したがって、切除後に残存フットプリントが該マーカー遺伝子の発現を妨げないよう、該マーカー遺伝子内への該インパラトランスポゾンの挿入点が選択される必要がある。好ましくは、該インパラトランスポゾンは、該プロモーター配列内または該マーカー遺伝子のイントロン内に挿入される。インパラのいくつかのコピーがフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）において同定されており、それらの配列の比較は、種々の長さおよび配列のＩＴＲを有する３つのサブファミリーを定めることを可能にした（Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、インパラ１６０トランスポゾンを含む。該インパラ１６０因子は１ ２８０ｂｐを含み、それは、３４０アミノ酸のトランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを囲む２７ｂｐの２つの逆方向反復配列に隣接する（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５；Ｇｅｎｂａｎｋ Ｓ７５１０６）。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子の１．３ｋｂのプロモーターと、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパラ１６０トランスポゾンとを含む。本発明の特に有利な実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドはｐＮｉＬ１６０プラスミドを含む。これらの構築物を使用して、ｎｉａ−真菌を形質転換し、インパラ因子の転位から得られた挿入突然変異体を、それらのｎｉａ＋表現型に関して最少培地上で選択する。もう１つの好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ハイグロマイシンに耐性に関するｈｐｈ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｇｐｄ遺伝子のプロモーターと、該ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパラ１６０トランスポゾンとを含む。これらのポリヌクレオチドを使用して、真菌を形質転換し、該インパラ因子の転位から得られたハイグロマイシン耐性挿入突然変異体を選択する。
【００１９】
本発明の構築物および方法においては、任意のインパラトランスポゾンを使用することができる。「インパラトランスポゾン」なる語は修飾インパラトランスポゾンをも意味すると理解される。これらの修飾としては、特に、インパラトランスポゾン内へのマーカー遺伝子またはアクチベーター配列の挿入、または欠損インパラトランスポゾンを得るためのトランスポザーゼの不活性化が挙げられる。これらの修飾トランスポゾンの構築では、当業者によく知られた通常の分子生物学技術を用いる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、真菌の挿入突然変異体を得るために優先的に用いられる。遺伝子内へのインパラトランスポゾンの挿入は、一般には、この遺伝子の全体的または部分的不活性化を引き起こす。一方、アクチベーター配列を含むインパラトランスポゾンの使用は、過剰発現突然変異体を得ることを可能にする。したがって、該トランスポゾン修飾では、挿入突然変異誘発の種々の方法を用いることができる（Ｂａｎｃｒｏｆｔら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３：４４９−４６１，１９９２；ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＤｅａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：６５-６７，１９９３；Ｌｏｎｇら，ＰＮＡＳ ９０：１０３７０−１０３７４，１９９３）。
【００２１】
したがって、本発明はまた、トランスポザーゼの機能に影響を及ぼすことなく転位性因子の２つのＩＴＲの間にマーカー遺伝子が挿入されて自律的標識因子を有することが可能となったインパラトランスポゾンを含む前記のポリヌクレオチドに関する。また、本発明の好ましい実施形態において該トランスポゾンを標識するためには、インパラトランスポゾンの切除を観察するために使用することが予想されるすべてのマーカー遺伝子を使用することができる。好ましくは、該マーカー遺伝子は、該トランスポザーゼをコードする配列の下流、かつ、左ＬＴＲの上流（ＮｈｅＩ部位において）に挿入される。インパラトランスポゾン内へのマーカー遺伝子の挿入は、該挿入突然変異体の、より良好な選択を可能にする。別法として、トランケート化マーカー遺伝子をインパラトランスポゾン内に挿入することができる。プロモーターを欠くマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチドをプロモータートラップとして使用することを可能にする。トランケート化プロモーターを含むマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチドをアクチベーター配列用のトラップとして使用することを可能にする。
【００２２】
最後に、本発明は、欠損インパラトランスポゾン（すなわち、特に、突然変異により、または欠失により、またはマーカー遺伝子の挿入により、またはマーカー遺伝子での置換により、インパラ因子のトランスポザーゼが不活性化されているトランスポゾン）を含む前記のポリヌクレオチドに関する。この欠損インパラ因子の転位は、本発明の挿入突然変異誘発においては、より容易に制御される。トランスポザーゼが不活性化された欠損インパラ因子の構築には、当業者に公知の通常の分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用いる。本発明の１つの実施形態においては、インパラ因子のトランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーターの制御下で発現されるマーカー遺伝子で置換する。該トランスポザーゼのコード配列は、例えば、真菌において機能的である異種プロモーターの制御下で発現される、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子またはＧＦＰ遺伝子で置換することができる。該欠損インパラトランスポゾンはこれらの挿入配列（ＩＴＲ）を維持し、したがって、その転位は、例えば複製型プラスミド上に配置されたトランスポザーゼを利用してトランスで活性化されうる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクター内に挿入される。このベクターは、例えば細菌などの宿主生物を形質転換するために及びこの宿主生物内で本発明のポリヌクレオチドを複製するために使用することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、真菌を形質転換するためにベクター内に挿入される。これらのベクターは、これらのポリヌクレオチドを複製するために又は該ポリヌクレオチドを真菌のゲノム内に組込むために使用される。ポリヌクレオチドの複製および宿主生物内へのその組込みを可能にするベクターは、当業者によく知られている。
【００２４】
挿入突然変異誘発および遺伝的標識
本発明はまた、真菌の挿入突然変異体を製造するための及びこれらの真菌のゲノムを研究するための、前記のポリヌクレオチドの用途に関する。
【００２５】
したがって、本発明の対象はまた、真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
・マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内へのその再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化された該マーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法である。
【００２６】
本発明の方法においては、該インパラトランスポゾンを修飾すること、特に、マーカー遺伝子または活性化配列の挿入によりそれを修飾することが可能であると理解される。好ましい実施形態においては、該インパラトランスポゾンは、マーカー遺伝子を含み、それらの２つのマーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を選択する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドで任意の真菌を形質転換して、この真菌の挿入突然変異体を製造することができる。特に、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類が挙げられる。好ましくは、本発明は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌に関する。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げられる。好ましくは、本発明は、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌に関する。より好ましくは、本発明は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種の真菌に関する。より一層好ましくは、本発明はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に関する。
【００２８】
真菌を形質転換するための技術は当業者によく知られている。特に、ＰＥＧを使用するプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での形質転換（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：８３９−８４２，１９９８）またはパーティクル銃を使用する射撃の方法（Ｃｈａｕｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２０５−２０７，２０００）が挙げられる。
【００２９】
ついで、インパラ因子の転位から生じた挿入突然変異体を同定または選択するために、マーカー遺伝子の発現に関して形質転換体をスクリーニングする。本発明のポリヌクレオチドのマーカー遺伝子は、表現型スクリーニングにより挿入突然変異体を同定または選択することを可能にする。例えば、このスクリーニングは、抗生物質に対する耐性、化合物に対する耐性、またはレポーター遺伝子の発現レベルの測定によるものでありうる。種々のマーカー遺伝子が、前記において更に詳しく説明されている。ｎｉａ−真菌におけるマーカー遺伝子としてｎｉａＤ遺伝子を使用する場合には、唯一の窒素源としてＮａＮＯ３を含有する最少培地上で、該挿入突然変異体を、それらの密集性かつ気生性の外観により選択する。
【００３０】
このようにして得られた挿入突然変異体を分析するためには、新たな転位を避けるためにトランスポゾンを安定化させるのが有利かもしれない。該転位因子の転位率に近い又はそれ未満の相補点（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において該突然変異体を試験する場合には、該トランスポゾンの新たな再挿入のこの制御は無視されうる。該トランスポゾンの切除を制御するために、２成分系を調製することができる（Ｈｕｎ−Ｖａｎ，１９９８；ＫｅｍｐｋｅｎおよびＫｕｃｋ，１９９８）。後者は、トランスポザーゼが特に突然変異により又は欠失により又はマーカー遺伝子での置換により不活性化された欠損インパラ因子の構築を含む。この場合、該欠損インパラトランスポゾンは、発現が厳密に制御されており該インパラ因子の安定化を可能にするトランスポザーゼを用いて可動される。
【００３１】
したがって、本発明の対象はまた、真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
・欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
・該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入およびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用いて、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、
・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法である。
【００３２】
真菌におけるインパラ因子トランスポザーゼ遺伝子などの遺伝子の発現の制御を可能にする方法は、当業者によく知られている。特定の実施形態においては、該真菌を２つのポリヌクレオチドで形質転換する。その第１ポリヌクレオチドは該欠損インパラトランスポゾンを含み、第２ポリヌクレオチドは、インパラ因子トランスポザーゼのコード配列を、それ自身のプロモーターの制御下または異種プロモーターの制御下で含む。該トランスポザーゼのコード配列は、複製型プラスミド上または組込みプラスミド上に配置することができる。該トランスポザーゼの発現を制御するために、後者を、誘導プロモーターの制御下に配置することができる。該トランスポザーゼの発現の誘導は、該欠損インパラ因子の転位および挿入突然変異体の調製を可能にし、ついで、該トランスポザーゼがもはや発現されなくなった際に該トランスポゾンは安定化される。本発明の方法においては、真菌において機能的である任意の誘導プロモーターを使用することができる。特に、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターを使用することができる。特に、このプロモーターは、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下の最少培地上でのｎｉａ遺伝子の発現を可能にし、一方、この遺伝子の発現は、アンモニウムの存在下では完全に抑制される（ＬａｕおよびＨａｍｍｅｒ，１９９６）。あるいは、該トランスポザーゼを、例えば、選択マーカーを保持する複製型プラスミド（このプラスミドは、選択圧が存在しない場合には維持されない）上に配置する。この場合、該トランスポザーゼは、構成プロモーターまたはそれ自身のプロモーターの制御下で発現されうる。選択圧の存在下、該複製型プラスミドの維持は該トランスポザーゼの発現を可能にし、今度はこれが、インパラ因子の転位および挿入突然変異体の産生を可能にする。複製型プラスミドの維持を可能にする選択圧の不存在下では、該トランスポザーゼは失われ、該トランスポゾンは該突然変異体内で安定化される。そのようなプラスミドの製造に必要な手段は当業者によく知られている。例えば、該トランスポザーゼを、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）由来のテロメア末端を含有するｐＦＡＣ１複製型ベクター（Ｂａｒｒｅａｕら，１９９８）内に配置することができる。
【００３３】
挿入突然変異誘発は、関心のある新規遺伝子を同定するための及びそれらの機能を研究するための非常に有効な手段である。好ましい実施形態においては、挿入突然変異体のコレクションを、関心のある表現型に関してスクリーニングする。本発明の挿入突然変異体においては、任意の検出可能な表現型が探索されうる。特に、真菌の生物学、生理学、発生および生化学に関する表現型が挙げられる。好ましくは、病原性真菌の挿入突然変異体が調製され、これらの突然変異体において探索される表現型はこれらの真菌の病原性に関するものである。該表現型スクリーニングは、該真菌の直接的観察、酵素活性の測定、殺真菌剤に対する感受性の測定、または該真菌のビルレンスの研究に基づくものでありうる。関心のある表現型を有する挿入突然変異体を同定したら、インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する。該インパラ因子の挿入によりこのようにして標識された関心のある遺伝子は、当業者によく知られた分子生物学的技術を用いて単離する。用いる技術としては、特に、ポリヌクレオチドの一方の末端の配列のみが既知の場合に該ポリヌクレオチドの増幅を可能にする増幅技術が挙げられる（この場合、該トランスポゾンの配列は該ゲノム内に組込まれる）。これらの技術には、特に、逆ＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０：６２１−６２３，１９８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：７６２−７６９，１９８９）、ベクトレットＰＣＲ（ＡｒｎｏｌｄおよびＨｏｄｇｓｏｎ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：３９−４２，１９９１）およびパンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）ＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．２：１９７−２０３，１９９３）が含まれる。これらの技術は、真菌のゲノム内のインパラトランスポゾンに隣接する配列の増幅、クローニングおよび配列決定を可能にする。ついでこれらの隣接配列を使用して、該トランスポゾンの挿入により不活性化された全遺伝子を単離する。
【００３４】
したがって、本発明は、真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同定方法であって、
・前記の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、
・この検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し、
・該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工程を含んでなる方法に関する。
【００３５】
宿主生物
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主生物に関する。本発明における「宿主生物」なる語は、特に、任意の単細胞生物または多細胞生物（これは下等または高等生物でありうる）を意味し、特に、細菌および真菌から選ばれると意図される。該細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から選ばれるのが好都合である。好ましい実施形態においては、本発明は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された真菌に関する。好ましくは、該真菌は、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類から選ばれる。好ましくは、該真菌は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌から選ばれる。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げられる。好ましくは、該真菌は、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から選ばれる。より好ましくは、該真菌は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム・ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種から選ばれる。特に有利な態様においては、該宿主生物はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）である。
【００３６】
該ポリヌクレオチドは、該真菌のゲノム内に組込まれたり、あるいは複製型プラスミド上に配置されうる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組込まれた真菌に関する。本発明はまた、該インパラトランスポゾンがゲノム内に組込まれたマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突然変異体に関する。
【００３７】
該真菌のゲノム内へのインパラの再挿入は、この真菌の挿入突然変異体のコレクションの生成を可能にする。このようにして得られた突然変異体を、糸状菌のゲノムの研究に使用することができる。
【００３８】
後記実施例は、本発明を例示しうるが、本発明の範囲を限定するものではない。これらの後記実施例に記載の方法または操作は、例示として記載されており、同じ結果を得るために利用されうる種々の方法から選ばれる１つの選択肢に相当する。この選択肢は、結果の質に関連したものではなく、そのため、当業者は、同じ結果を得るために任意の適当な方法を用いることができる。ＤＮＡ断片を操作するための方法のほとんどは、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” 第１巻および第２巻，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら又はＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載されている。
【００３９】
（図面の記載）
図１：ｐＮｉ１６０プラスミドのマッピング。
【００４０】
図２：ｐＮｉＬ１６０プラスミド（Ａ）およびｐＡＮ３０１プラスミド（Ｂ）の、それを構築するために用いたマッピング。
【００４１】
図３：ｐＮｉ１６０およびｐＣＢ１１７９ベクターを使用してＢａｍＨＩ ＲＥＭＩにより得られた同時形質転換体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより該ＤＮＡ断片が示される。
【００４２】
図４：ｎｉａ＋復帰突然変異体Ｃ１４−１およびＣ１４−２の分子分析。該復帰突然変異体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、サザンハイブリダイゼーションにより該ＤＮＡ断片が示される。
【００４３】
Ａ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分析。
【００４４】
Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変異体の分析。Ｃ１４−１復帰突然変異体（レーン３および４）およびＣ１４−２復帰突然変異体（レーン５および６）のプロフィールをＣ１４ｎｉａ−同時形質転換体由来のプロフィール（レーン１および２）と比較する。使用したプローブは、インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する。
【００４５】
図５：ｐＮｉＬ１６０ベクターを保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。レーン１：同時形質転換体８のＤＮＡ；レーン２〜７：同時形質転換体８の復帰突然変異体のＤＮＡ；レーン８：同時形質転換体６のＤＮＡ；レーン９〜１１：同時形質転換体６の復帰突然変異体のＤＮＡ。
【００４６】
図６：非病原性復帰突然変異体Ｒｅｖ７７におけるインパラの挿入により遮断されたＯＲＦの概要図。
【００４７】
図７：ｐＣＩＴｎプラスミドのマッピング。
【００４８】
図８：ｐＮｉＨＹＧ構築物を保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。３つの別個の復帰突然変異体のＤＮＡ（レーン１〜３）を抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。星印の位置は転位性因子の再挿入を示す。
【００４９】
図９：ｐＨＩＮプラスミドのマッピング。
【００５０】
図１０：ｐＥＯ６プラスミドのマッピング。
【００５１】
図１１：ｐＨＮｉＬプラスミドのマッピング。
【００５２】
図１２：ｐＢＮｉＬプラスミドのマッピング。
【００５３】
図１３：ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドのマッピング。
【００５４】
図１４：該２成分系を用いた形質転換後に得られたＤ１同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該復帰突然変異体ＤＮＡ（レーン１〜４）のＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、ｈｐｈ遺伝子から増幅された断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。
【００５５】
（実施例）
【実施例１】
【００５６】
実施例Ｉ
インパラの自律性コピーでの挿入突然変異誘発
１．入手可能な構築物
ｐＮｉ１６０プラスミドは、ＡＴＧコドンから１０ｐｂの位置に、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域内に組込まれたインパラ１６０のコピーを含有する。その構築物は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９９２）を含有するｐＡＮ３０１プラスミド（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）で形質転換されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＦ２４株において得られたトランスポゾン捕捉に由来する。ｎｉａＤ遺伝子の自然突然変異の選択は、ｐＡＮ３０１の単一のコピーを保持するＴＲ７形質転換体における１．３ｋｂの挿入の特徴づけを可能にする。この挿入は、ｐＡＮ３０１の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ領域内に存在し、その効果は、４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の生成にある。部分ゲノムライブラリーを構築し、ｐＡＮ３０１由来の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片でスクリーニングした後（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）、この断片をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。それと平行して、該ｎｉａＤ遺伝子の下流に位置する７．８ｋｂ ＮｄｅＩ断片、そしてまた、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーターの大部分に相当する１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠失させることにより、ｐ１１ΔＮｄｅＩプラスミドをｐＡＮ３０１から構築した（Ｌａｎｇｉｎら，１９９０）。インパラ１６０因子および硝酸レダクターゼの２．７ｋｂの断片を含む４ｋｂの断片で、ｐ１１ΔＮｄｅＩ中に存在する２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を置換することにより、この場合は０．３ｋｂ長であるｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域内に該因子が挿入されたｐＮｉ１６０プラスミドが得られうる（図１）。
【００５７】
２．調製した構築物
ｐＮｉＬ１６０プラスミドは、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子のプロモーターの１ｋｂの断片の付加によりｐＮｉ１６０プラスミドから誘導される。これを行なうために、１．３ｋｂのｎｉａＤプロモーターを含有するｐＡＮ３０１プラスミドを、この遺伝子の下流に存在する７．８ｋｂのＮｄｅＩ断片から欠失させて、中間体プラスミドｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩを得た。ついで、その１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を、該１ｋｂの断片と同じｎｉａＤ遺伝子部分とインパラ１６０因子とを含有しｐＮｉ１６０プラスミドに由来する２．３ｋｂのＢａｍＨｉ−ＡｐａＩ断片で置換した（図２）。
【００５８】
３．マグナポルセ・グリセアの形質転換
マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のＧ１１．１７４株は、ｎｉａ−表現型をもたらす硝酸レダクターゼ遺伝子内の点突然変異を有する。この株の製造は、Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９８９の文献に記載されている。それを、米粉に基づく固形培地上で継代培養し、それにより、該真菌から分生子が収穫されうる。Ｔａｎａｋａ（Ｏｕら，１９８５）の培地Ｂに基づき調製したＴＮＫＹＥ液体培地は、Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９０）およびＳｗｅｉｇａｒｄら（１９９２）に記載のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出するための又はプロトプラストを得るための菌糸の収穫を可能にしうる。酵母エキスを欠くＴＮＫ寒天培地（超高純度アガロース、８ｇ．１−１）（ＭＮＯ３培地）は、ｎｉａ＋ Ｇ１１．２５株からｎｉａ− Ｇ１１．１７４株を識別するのを可能にする。前者は、低く平らで糸状の表現型を有するが、後者は密集性かつ気生性である。
【００５９】
３．１ ｐＮｉ１６０プラスミドでの形質転換
Ｇ１１．１７４株のプロトプラストを、ｐＮｉ１６０プラスミド（インパラ１６０を導入するもの）と、ハイグロマイシン耐性を付与するｐＣＢ１１７９プラスミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）とで同時形質転換した。該形質転換方法はＳｗｅｉｇａｒｄら，１９９２に記載されており、４単位のＢａｍＨＩ酵素（ＲＥＭＩ：制限酵素媒介組込み；Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９８）および１μｇの各プラスミドの存在下で行なった。該プロトプラストは、グルコースがスクロース（４００μｇ．１−１）で置換され２４０μｇ．１−１の比率のハイグロマイシンで補足されたＴＮＫＹＥ培地上で選択される。該同時形質転換体を選択するために、この抗生物質に耐性なコロニーを、それらのゲノムＤＮＡの抽出後、インパラトランスポゾンに特異的であり５７３ｂｐの増幅産物を与えるＳＰＥ５（５’ＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧ３’）およびＳＰＥ３（５’ＴＣＣＧＧＧＣＣＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧ３’）プライマーを使用する増幅により分析した。該同時形質転換体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（２．７ｋｂプローブ）をプローブとして使用するサザンブロット（図３）で分析した（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）。この研究は、ｐＮｉ１６０を介して導入されたアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の実質的にすべてのｎｉａ遺伝子に相当する少なくとも１つの４ｋｂバンドを有する３５個の形質転換体の選択を可能にした。これらの同時形質転換体を、米粉に基づく固形培地上で１０〜１４日培養し、該胞子を水中に収穫した。計数後、それらを、ディッシュ当たり胞子１０５〜１０６個の比率でＭＮＯ３寒天培地上に播いた。ｎｉａ＋復帰形質転換体を選択するためのこの工程を再現する実験を行なった。こうして、本発明者らは、野生型（Ｇ１１．２５）胞子１０個をｎｉａ− Ｇ１１．１７４突然変異体の胞子１０６と混合し２６℃で１４日間インキュベートした場合に、該ＭＮＯ３培地がｎｉａ＋コロニーの検出を可能にすることを観察した。２６℃で１ヵ月培養した後、１個の同時形質転換体（同時形質転換体Ｃ１４）だけが、気生性表現型を有する２個のコロニー（Ｃ１４−１およびＣ１４−２）を得ることを可能にした。これらの復帰突然変異体コロニーを回収し、ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内のインパラ１６０挿入部位を囲むＣ１（５’ＣＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＴ３’）およびｎｉａＸ（５’ＣＴＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＧ３’）プライマーを使用するＰＣＲにより分析した。２００ｂｐの産物の増幅は、該トランスポゾンの切除が生じた核の存在を示している。均一なコロニーを得るために、Ｃ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変異体の分生子を双眼顕微鏡下で単離し、別々に培養した。インパラのＯＲＦに相当するプローブを使用したサザンブロットによるその分析により、それらの２つの復帰突然変異体における該因子の再挿入が示されうる（図４）。ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に２００ｂｐのＰＣＲ産物をクローニングした後、該トランスポゾンの切除により残されたフットプリントを配列決定した。Ｃ１４−１復帰突然変異体のフットプリントはＣＴＧＴＡであり、Ｃ１４−２のフットプリントはＣＡＧＴＡである。これらのフットプリントは、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においてインパラが切除された場合にごく一般的に残されるフットプリント（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）と同一である。ＭＮＯ３寒天培地上での培養においては、これらの復帰突然変異体は、Ｇ１１．１７４株とＧ１１．２５株との間の中間的な表現型を有し、このことは、ｐＮｉ１６０構築物中に存在するｎｉａＤ遺伝子がＧ１１．１７４株の突然変異の最適な相補を許容しないことを示唆している。この仮定を試験するために、この株由来のプロトプラストを、ｐＣＢ１１７９（３μｇ）の存在下および１．３ｋｂのプロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩ（３μｇ）ベクターまたはｐＡＮ３０１（３μｇ）ベクターで形質転換した。グルコースがスクロース（４００μｇ．ｌ−１）で置換されハイグロマイシン（２４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＭＮＯ３培地上で該プロトプラストをプレーティングし、３０℃で１０日間インキュベートした後、ｎｉａ＋表現型を有するコロニーが出現する。一方、０．３ｋｂのプロモーター断片の制御下（ｐＮｉ１６０の場合と同様）でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐ１１ΔＮｄｅＩベクターを使用した場合には、相補性は認められなかった。
【００６０】
これらの実験は、ｐＮｉ１６０中に存在するトランケート化プロモーターがＧ１１．１７４株の突然変異を相補しえないことを示している。この構築物での２つの復帰突然変異体（Ｃ１４−１およびＣ１４−２）の選択は、該０．３ｋｂ プロモーター断片の固有活性によるものではなく、Ｃ１４同時形質転換体においては、アクチベーター配列から利益が得られる領域内にｎｉａＤ遺伝子が挿入されたと考えられるのではないかと説明されうる。このことは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のアクチベーター領域を検出するためにｐ１１ΔＮｄｅＩを使用しうることを示唆している。
【００６１】
３．２ ｐＮｉＬ１６０（本発明のもの）での形質転換
Ｇ１１．１７４株由来のプロトプラストを、４０単位のＮｄｅＩ酵素の存在下、１．３ｋｂの全プロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有する新規構築物ｐＮｉＬ１６０（１μｇ）およびｐＣＢ１１７９（１μｇ）で同時形質転換した。該同時形質転換体を、ＳＰＥ５およびＳＰＥ３プライマーを使用する増幅によりスクリーニングし、ついで米培地上に播いて分生子を得た。復帰突然変異体を同定するために、後者をＭＮＯ３培地（ディッシュ当たり胞子約１０５〜１０６個）上でプレーティングした。１９個の同時形質転換体に関して行なった実験は、それらの場合の１００％において復帰突然変異体を得ることを可能にした。いくつかは、２６℃で１０日の培養から生じた。復帰突然変異体の数は、考慮される同時形質転換体に応じて２〜８３の様々な数となる。８個の異なる同時形質転換体に属する５３個の復帰突然変異体を、インパラの全コード領域に相当するプローブを使用するサザンブロットにより分析した。図５は、９個の無作為に選ばれた復帰突然変異体におけるインパラトランスポゾンの移動度を示す。この実験から得られたエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）におけるインパラ再挿入の割合（％）は７４％に達する。これらの再挿入体のうち、それらの９５％は異なる。より詳しくは、再挿入体のすべてが異なる１００％の再挿入を与える同時形質転換体を同定した。
【００６２】
これらの結果は、ｐＮｉＬ１６０構築物が、ｐＮｉ１６０とは異なり、該トランスポゾンの新規挿入を有する多数の復帰突然変異体がマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において選択されることを可能にすることを示している。
【実施例２】
【００６３】
実施例ＩＩ
マグナポルセ・グリセアにおける挿入突然変異体の製造
ｐＮＬｉ１６０プラスミドの単一のコピーを保持する同時形質転換体６（ＣＴＲＦ６）から得られた１８個のｎｉａ＋復帰突然変異体のサザンブロット分析は、それらの１００％が、該ゲノム内に再挿入されたインパラを有することを示した。３５０個のｎｉａ＋復帰突然変異体のコレクションを得るために、この同時形質転換体を選択した。該同時形質転換体を米培地上で１４日間培養する。該胞子を、ペトリ皿当たり３ｍｌの蒸留水中に収穫し、菌糸残渣の除去のために半融ガラス上で濾過して、ディッシュ（１２×１２ｃｍの形態）当たり胞子１０６個の比率でＮａＮＯ３培地上にプレーティングする。該ディッシュを２６℃でインキュベートする。１６〜２１日後にｎｉａ＋復帰突然変異体が出現する。それらをＮａＮＯ３培地上で継代培養し、１４日間培養し、該胞子を寒天−水培地（Ｈ２０中の２％アガロース）上にプレーティングする。２６℃で８時間後、各復帰突然変異体からの１個の胞子を個々にＮａＮＯ３培地上で継代培養して、該復帰突然変異体を精製し、そのｎｉａ＋表現型を確認する。
【実施例３】
【００６４】
実施例ＩＩＩ
インパラトランスポゾンを保持する挿入突然変異体の特徴づけ
ＣＴＲＦ６から生成した３５０個の復帰突然変異体の観察は、ＣＴＲＦ６ほどには有意でない成長および該同時形質転換体の灰色とは異なる暗褐色を米培地およびＮａＮＯ３培地上で示す復帰突然変異体（Ｒｅｖ２）の検出を可能にした。インパラ挿入に隣接する配列を特徴づけるために、３μｇのＲｅｖ２ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、逆ＰＣＲにより分析した。消化後、該ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出工程に付し、ついで７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈殿させる。このようにして得られたペレットを４０μｌのＭｉｌｌｉＱ水中に採取する。８μｌの消化ＤＮＡ上で連結を行ない、該ＤＮＡを、前記のとおりに、フェノール／クロロホルム抽出に付し、７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈殿させる。該ＤＮＡを１０μｌ中に採取し、それらのすべてを、インパラトランスポゾンの配列上で選択される及び発散的に位置するＩｍｐＥ５’（５’ＧＧＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＴＣＣＣ３’）およびＩｍｐＥ３’（５’ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ３’）プライマーを使用するＰＣＲ工程に使用する。該ＩＰＣＲ産物の配列決定は、オープンリーディングフレーム内の重複したＴＡジヌクレオチドにおいて該トランスポゾンが挿入されうことを示すことを可能にした。ｔｂｌａｓｔｘプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用してデータバンクを調べることにより、この突然変異配列とＤＮＡ修復に関与するタンパク質ファミリーとの間で、さらに詳しくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＬＨ１タンパク質（Ｐｒｏｌｌａら，１９９４）に対して、非常に強い相同性が示された。
【００６５】
それと平行して、病原性突然変異体に関して探索するために、該コレクションの３５０個の復帰突然変異体を米葉および大麦葉上で試験した。該復帰突然変異体を米培地上で１４日間培養する。生成した胞子を、３ｍｌの水の存在下、菌糸を擦り取ることにより収穫し、ついでＴｈｏｍａｓセル下で計数する。該胞子懸濁液を１０５胞子／ｍｌにまで調節し、キネチン（エタノール中の２ｍｇ／ｍｌのストック溶液の１ｍｌ／ｌ）で補足された寒天培地（１％寒天）上に生存条件中で配置された数片の米（品種Ｓａｒｉｃｅｌｔｉｋ）の葉および大麦（品種Ｅｘｐｒｅｓｓ）の葉上に、原綿の芽（ｃｏｔｔｏｎ ｗｏｏｌ ｂｕｄ）を使用して塗布する。２６℃で４日間インキュベートした後、該徴候を、野生型Ｇ１１．１７４株で生じた徴候と比較する。復帰突然変異体７７は非病原性であることが判明した。この突然変異体中のインパラ挿入に隣接した配列を、ＢａｍＨＩでの該ゲノムＤＮＡの消化の後、前記の条件下、逆ＰＣＲにより回収した。回収された産物は、この場合もまた、オープンリーディングフレーム内に位置する重複したＴＡジヌクレオチドにおける該トランスポゾンの挿入を証明した。この産物の配列で該データバンクを調べたところ、有意な相同性は示されなかった。この産物を使用して、エム・グリセエア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドライブラリーをプローブした。該増幅産物にハイブリダイズするコスミドをクローニングし、マッピングし、部分的に配列決定した。したがって、考慮するリーディングフレームに応じて２つの潜在的ＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）内にインパラトランスポゾンは挿入されるらしい（図６）。このコスミドのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を、ビアロフォス耐性を付与するＢａｒ遺伝子を保持するｐＣＢ１５３１ベクター（ｐＣＢ１５３１＊ベクター）（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）内にサブクローニングした。Ｒｅｖ７７プロトプラストを得、３μｇのｐＣＢ１５３１＊プラスミドまたは対照としての３μｇのｐＣＢ１５３１プラスミドで形質転換し、ビアロフォス（３０〜４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥショ糖（４００ｇ．１−１）培地上に配置した。該耐性コロニーを、ビアラフォス（３０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥグルコース上で培養し、米培地上で１４日間、胞子形成させる。該胞子を収穫し、該懸濁液を胞子１０５個．ｍｌ−１で補正し、ついで、前記のとおりにそれらの病原性に関して試験する。予想どおり、ｐＣＢ１５３１を保持する形質転換体は、Ｒｅｖ７７と同様に、非病原性のままであり、一方、ｐＣＢ１５３１＊を保持するコロニーは再び病原性となる。これらの結果は、インパラトランスポゾンが、エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の感染力に関与する遺伝子を標識することを可能にしたことを示している。
【実施例４】
【００６６】
実施例ＩＶ
ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内へのインパラトランスポゾンの組込み
ハイグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子（ｈｐｈ）の発現を制御するプロモーター内へのインパラのクローニングを可能にするプラスミドを構築した。ｐＡＮ７．１ベクター（Ｐｕｎｔら，１９８７）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化は、ｇｐｄ遺伝子のその１３７塩基対から欠失したプロモーターおよびＴｒｐＣ遺伝子のターミネーターおよびｈｐｈ遺伝子のコード領域をコードする全ＯＲＦを含有する３９８８ｂｐ断片の遊離を可能にする。この断片の付着末端を、ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑末端内に形質転換した。ついでこの断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドに由来し複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を保持する２．５ｋｂのＰｖｕＩＩ断片に連結した。それから得られたプラスミドは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において、ハイグロマイシン耐性形質転換体を得ることを可能にする。ｐＣＩＴｎ（図７）として公知のこのベクターは、インパラまたは他の任意のトランスポゾンがクローニングされうる、転写＋１点の３０ｂｐ上流に位置する唯一のＰｖｕＩＩ部位を有する。
【実施例５】
【００６７】
実施例Ｖ
自律的および標識コピーでの挿入突然変異誘発
インパラトランスポゾンが再挿入された復帰突然変異体を表現型スクリーニングにより選択するのを可能にする自律的因子を得るために、トランスポザーゼをコードするリーディングフレームの終結コドンの下流の該因子の２つのＩＴＲの間にハイグロマイシン耐性遺伝子をクローニングした。これを行なうために、該ハイグロマイシン耐性カセットを、ＳａｌＩ消化によりｐＣＢ１００４プラスミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）から回収し、該末端をクレノウでの処理により平滑化した。このカセットを、ＮｈｅＩ部位で線状化されクレノウで処理されたｐＮｉ１６０プラスミドに連結する。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ酵素で消化する。修飾されたインパラトランスポゾンを含有する２２８５ｂｐの断片を回収し、これらの同じ酵素で消化されたｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩの７３９７ｂｐの断片に連結する。これは、ｎｉａＤの転写の方向（ｐＮｉＨＹＧプラスミド）または逆方向（ｐＮｉＧＹＨプラスミド）に挿入された、ハイグロマイシン耐性カセットで標識されたインパラトランスポゾンが硝酸レダクターゼ開始コドンの８ｂｐ上流に挿入された１．３ｋｂ長のｎｉａＤプロモーターを保持する９６８２ｂｐのプラスミドを与える。
【００６８】
エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のＧ１１．１７４株由来のプロトプラストを３μｇのｐＮｉＨＹＧプラスミドまたは３μｇのｐＮｉＧＹＨプラスミドで形質転換した。これらの形質転換体について、既に記載されている条件下でｎｉａ＋復帰突然変異体の選択を行なった。サザンブロットによる同じ同時形質転換体の３個のｎｉａ＋復帰突然変異体の分析は、このようにして標識されたインパラトランスポゾンが自律性のままであること、すなわち、それが、ｎｉａＤ遺伝子から独立して存在し該ゲノム内に再挿入されうることを示している（図８）。
【実施例６】
【００６９】
実施例ＶＩ
インパラの欠損および可動性コピーでの挿入突然変異誘発
２成分突然変異誘発系を利用するためには、該転位性因子がトランスで活性化されうることを示すことが必要である。このためには、まず、該トランスポザーゼを構成的プロモーターの制御下に配置する。ついで、該欠損因子の安定化は、構成的プロモーターまたはそれ自体のプロモーターの制御下でトランスポザーゼを保持する複製型プラスミドまたはトランスポザーゼの発現を制御する誘導プロモーターの使用を要する。硝酸レダクターゼをコードするマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）遺伝子のプロモーターの、誘導プロモーターとしての使用が特に示されているようである。ＬａｕおよびＨａｍｅｒ（１９９６）は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子を含有するクローンに相当するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーションにより、それが、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下では発現され、一方、それがグルタミンの存在下では完全に抑制されることを示している。マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来のｎｉａ遺伝子のプロモーターの制御下にインパラトランスポザーゼを配置することにより、該酵素が合成され、ついで、該欠損因子が、該復帰突然変異体の選択のための条件下（ＭＮＯ３培地）で切除され、豊富な培地（アンモニウムまたはグルタミンの存在下）上でそれを培養した場合に該復帰突然変異体が得られたら、その産生が抑制されうるはずである。
【００７０】
１．入手可能な構築物
ｐＨＩＮプラスミドはｐＮｉ１６０から誘導される。そのプラスミドにおいては、インパラ因子にコードされたトランスポザーゼが、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＴｒｐＣ遺伝子の制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ遺伝子）で置換されている。その構築はＨｕａ−Ｖａｎ，１９９８に記載されている。該トランスポゾンのＩＴＲ中のｈｐｈ遺伝子の存在は、得られた復帰突然変異体のゲノム内への該欠損因子の組込みを保証しうる。
【００７１】
ｐＥＯ６プラスミドは、ＮｃｏＩ部位を含有するプライマーを使用するＰＣＲにより得られたインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦで、β−グルクロニダーゼをコードするＯＲＦを置換した後に、ｐＮＯＭ１０２プラスミドから誘導される。このプラスミドは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の構成的ｇｐｄプロモーターおよびＴｒｐＣターミネーターの制御下でのトランスポザーゼの発現を可能にする（図１０）。
【００７２】
２．調製する構築物
ｐＨＮｉＬプラスミドはｐＨＩＮプラスミドから誘導される。それは、ｈｐｈで標識された欠損インパラコピーを導入するｐＨＩＮ由来の２．８ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片でｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩの１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を置換することにより構築した。ｐＮｉＬ１６０の場合と同様に、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）は、その１．３ｋｂ長のプロモーターの制御下にある（図１１）。本発明者らの結果によれば、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における硝酸レダクターゼ活性を回復させることにより該欠損因子の切除を選択するためにはこのプラスミドを構築することが必要である。
【００７３】
また、ｐＢＮｉＬプラスミドは、この場合にはＢａｒ遺伝子で標識された欠損因子を含有する。このベクターを構築するためには、ｎｉａＤ遺伝子の配列に隣接するインパラトランスポゾンを含有するｐＮｉＬ１６０のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片（２４７２ｂｐ）を、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片（２２９８ｂｐ）であって該プラスミドの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを保持するものに連結する。インパラトランスポザーゼの一部に対応する８９１ｂｐの ＸｈｏＩ／ＳｔｙＩ断片をこのプラスミド上で欠失させる。このようにして線状化された該プラスミドの末端をクレノウで平滑化し、ｐＣＢ１６３５プラスミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のＳａｌＩ消化およびクレノウにより得られたビアラフォス耐性遺伝子（Ｔｒｐｃプロモーター：：Ｂａｒ，９４０ｂｐ）に連結する。それから得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで消化し、ｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩプラスミドの７３９７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ断片に連結する。これにより、該トランスポゾンが欠損性でありＢａｒ遺伝子で標識されておりｎｉａＤ遺伝子のプロモーター（１．３ｋｂ）内に挿入されたｐＢＮｉＬプラスミドが得られる（図１２）。
【００７４】
ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドはインパラトランスポゾンをその右ＩＴＲ内に保持しており、それはもはや転位できず該トランスポザーゼ源のままである。該因子をＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ二重消化によりｐＮｉ１６０プラスミドから切除し、該末端をクレノウで平滑化し、該断片をｐＦＡＣ１のＢｇｌＩＩ部位においてクローニングする（図１３）。
【００７５】
３．マグナポルセ・グリセアにおけるこれらのプラスミドの用途
マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）Ｇ１１．１７４由来のプロトプラストをｐＨＮｉＬプラスミドで形質転換するか、またはｐＨＮｉＬおよびｐＥＯ６プラスミドで同時形質転換した。該形質転換方法はＳｗｅｉｇａｒｄら（１９９２）に記載されており、１μｇの各プラスミドで行なった。該プロトプラストを、グルコースがスクロース（４００μｇ．１−１）で置換され２４０μｇ．ｍｌ−１の比率でハイグロマイシンで補足されたＴＮＫＹＥ培地上で選択する。該ｐＨＮｉＬ形質転換体を、該欠損因子中の該耐性マーカーの存在に基づき直接的に選択する。該同時形質転換体を、それらのゲノムＤＮＡの抽出後、ＩＶ．３に記載のＳＰＥ５プライマーを使用する増幅によりハイグロマイシン耐性コロニーから単離する。１２個のハイグロマイシン耐性コロニー上で行なったこの研究は、ｐＥＯ６を同様に保持する４個のコロニーの単離を可能にした。米粉に基づく固形培地上での胞子形成後、ＩＶ．３に記載のとおりにｎｉａ＋復帰突然変異体を選択するために、これらの同時形質転換体の及びｐＨＮｉＬを保持する６個の形質転換体の胞子（１０５〜１０６個）をＭＮＯ３培地上でプレーティングした。ｐＨＮｉＬを保持する６個の形質転換体はいずれも、そのような復帰突然変異体を与えなかった。これは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に内因性のインパラの欠損コピーが、トランスポゾンにより可動しえないことを示している。それらの４個のｐＨＮｉＬ／ｐＥＯ６同時形質転換体のうちの２個が気生性コロニーを与える（同時形質転換体Ｄ１およびＤ９）。Ｄ１同時形質転換体由来の６個の復帰突然変異体のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｈｙｇ１（５’ＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧ３’）およびｈｙｇ４（５’ＣＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣ３’）プライマーの使用により得られたｈｐｈ遺伝子由来の８６８ｂｐのプローブでハイブリダイズさせた後の該復帰突然変異体のサザン分析は、それらの４個に関する該欠損因子の再挿入の特徴づけを可能にする（図１４）。後者のうちの２個の復帰突然変異体は、該因子の２個の挿入を含有する。この分析は、トランスで与えられたインパラトランスポザーゼにより該欠損因子がマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において可動されうることを示しうる。
【００７６】
４．他の構築物
第１に、それは、インパラトランスポザーゼが、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてクローニングされたｎｉａ遺伝子のプロモーターの制御下にあるプラスミド（ｐＮｉａＩ）を構築することを含む。このプラスミドは、ｐＨＩＮＬと共に又はそれに由来する他の任意のプラスミド（該欠損因子の挿入により不活性化されたアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤプロモーターが、該復帰突然変異体の選択に使用するマーカー遺伝子の発現を制御するもの）と共に使用される。該同時形質転換体の選択を促進するために、該因子の欠損コピーを保持するプラスミド中に存在するものとは異なる耐性マーカーをｐＮｉａＩに付加すべきである。
【００７７】
第２に、該トランスポザーゼは、構成的プロモーターの制御下、より厳密には、ｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターの制御下、該欠損因子中またはｐＨＮｉＬプラスミド中に存在するものとは異なる選択マーカーを保持するｐＦＡＣ１ベクター中にクローニングすることができる。
【００７８】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリヌクレオチド、および真菌における挿入突然変異誘発および遺伝子標識のためのこれらのポリヌクレオチドの用途に関する。本発明はまた、これらの真菌のゲノム内へのフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のインパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンのランダム挿入により得られた真菌突然変異体のコレクションに関する。これらの突然変異体のコレクションは、真菌における遺伝子の機能を研究するための有効な遺伝的手段の１つである。
【背景技術】
【０００２】
トランスポゾンは、２つのＤＮＡ配列間を移動しうる可動性遺伝子因子として定義されうる。それらは遺伝子（エキソン、イントロン、調節領域）内に挿入されうるため、それらは突然変異の原因となりうる。このため、それらは、ゲノム内に寄生体として存在して該ゲノムの進化に寄与する。トランスポゾンは、それらの増幅様態に応じて２つのグループに分類されている（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，１９８９；Ｃａｐｙら，１９９８）。
【０００３】
・クラスＩ因子（レトロ因子（ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ））は、逆転写酵素によりＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ中間体を介して転位する。このクラスは、ＬＴＲ（長末端反復配列）に隣接していることも隣接していないこともあるレトロトランスポゾンまたはレトロ因子に細分される。該ＬＴＲレトロ因子としては、ｇｙｐｓｙファミリーの因子、およびｃｏｐｉａファミリーの因子が挙げられる。それらは、レトロウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に相同でｐｏｌ遺伝子の種々の機能的ドメインの体制が異なる遺伝子を有する。また、ｇｙｐｓｙファミリーは、レトロウイルスにおいてその感染に寄与するｅｎｖに相同な遺伝子を有する。非ＬＴＲレトロ要素のなかでは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子ならびにポリＡ配列を有するＬＩＮＥが区別され、また、ポリＡテイルも有するがｇａｇおよびｐｏｌ配列を欠くＳＩＮＥが区別される。それは、先のＬＩＮＥ因子に由来すると考えられる（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，１９９２；ＯｋａｄａおよびＨａｍａｄａ，１９９７）。
【０００４】
・クラスＩＩ因子は、トランスポゾンＤＮＡ配列の切除および再挿入のメカニズムを介して転位する。その全体的構造は、該因子の転位に必要なトランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームに隣接する２つの逆方向反復配列（ＩＴＲ）よりなる。これらの因子は、そのトランスポザーゼおよび／またはＩＴＲの配列相同性に基づき、まとめていくつかのスーパーファミリーに分類されており、それらには、Ｔｃ１／マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）因子のスーパーファミリー（Ｄｏａｋら，１９９４）、Ｆｏｔ１／Ｐｏｇｏ要素のスーパーファミリー（Ｃａｐｙら，１９９８；ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ，１９９６）、ｈＡＴ因子のスーパーファミリー（Ｃａｌｖｉら，１９９１）、Ｐ因子のスーパーファミリー（Ｋｉｄｗｅｌｌ，１９９４）またはＣＡＣＴＡ因子のスーパーファミリー（Ｇｉｅｒｌ １９９６）が含まれる。
【０００５】
真菌トランスポゾンの同定および研究は、特に、挿入突然変異誘発のための手段を開発しようとする場合（Ｂｒｏｗｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３９０−４，１９９８）、さらにまた、これらの真菌のゲノムを研究しようとする場合（Ｄｏｂｉｎｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１：３４８−３６５２，１９９３）に、非常に重要である。
【０００６】
したがって、真菌のゲノムにおいてトランスポゾンを同定するためには、種々の方法が実施されている。第１および第２の方法は、既に特徴づけられている因子から導かれた知見を利用するものである。これは、高度に保存されたドメイン（例えば、ＬＴＲレトロ因子逆転写酵素のもの）に由来するオリゴヌクレオチドを使用するサザンハイブリダイゼーション実験または増幅において使用する異種プローブの使用を含む。第３の方法は、反復ＤＮＡ配列を特徴づけることにある。この場合、ゲノムＤＮＡとリボソームプローブとの間のディファレンシャルハイブリダイゼーションが必要である。このようにして、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）ゲノムにおいて、Ｆｏｔ１ファミリーのトランスポゾンが同定されている（Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３１：３６１−３６９，１９９７；Ｆａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５１：６７５−６８１ １９９６；Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４５：３３９−３４８，１９９４）。最後の方法は、前記の３つの方法とは異なり、機能的および活性な因子の同定を可能にする。これは、トランスポゾン捕捉（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｔｒａｐ）である。この方法はマーカー遺伝子の不活性化を用いるものであり、この方法においては、該因子の挿入により生じた突然変異が陽性スクリーニングにより同定されうる。このようにして、ａｍ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子は、ニューロスパラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）においてＴａｄレトロ因子（これは、ＬＩＮＥ型のものである）を、この遺伝子内へのその再挿入後に特徴づけることを可能にした（ＫｉｎｓｅｙおよびＨｅｌｂｅｒ，１９８９）。また、トランスポゾンを捕捉するために、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）遺伝子が使用されている。特に、この遺伝子を不活性化する突然変異はクロラート耐性を付与する。このようにして、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｇｅｎｅｔｉｃａ ９３：４９−５９，１１９４）およびアスペルギルス（米国特許第５，９８５，５７０号）において種々のトランスポゾンが同定されている。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のクラスＩＩ因子であるＦｏｔ１は、ｎｉａＤ遺伝子の不活性化を用いて同定された最初のトランスポゾンであった（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９９２）。また、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）におけるｎｉａＤ遺伝子の使用は、Ｔｃ１／マリナー型因子のスーパーファミリーに属するインパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンを捕捉することを可能にした（Ｌｉｎｇｉｎら，１９９５）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においては、種々のインパラトランスポゾンスーパーファミリーが同定されている（Ｈｕｎ−Ｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５９：３５４−３６２，１９９８）。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においては、インパラ因子の転位が研究されている。与えられた遺伝子のイントロンまたはプロモーター内にインパラトランスポゾンが組込まれた場合には、それはついで、この遺伝子の発現を不活性化しうる。一方、インパラトランスポゾンの転位後、該遺伝子は再活性化され、これは、該転位事象の陽性対照を構成する。該転位を同定するためのそのような方法が、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）遺伝子のプロモーター調節配列内に組込まれたインパラトランスポゾンを含む構築物を使用して、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）において行われている（Ｈｕａ−Ｖａｎ，１９９８）。
【０００７】
現在のところ、他の真菌、より詳しくはマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／インパラ遺伝子構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）を使用してインパラの転位を証明することは、挿入突然変異誘発手段の開発に不適合な非常に低い比率で可能であるにすぎない。これらの観察は、ｐＮｉ１６０プラスミドのｎｉａＤ／インパラ構築物（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）、より詳しくはインパラトランスポゾン自体が、他の真菌、特にエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）において機能的でないことを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，９８５，５７０号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｉｎｎｅｇａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１９８９，５，１０３−１０７
【非特許文献２】Ｃａｐｙら，Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ． Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９８
【非特許文献３】Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．，１９９２，４，４３０−４４０
【非特許文献４】ＯｋａｄａおよびＨａｍａｄａ，Ｊ． Ｍｏｌ. Ｅｖｏｌ．１９９７，Ｓ５２−５６
【非特許文献５】Ｄｏａｋら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９４，９１，９４２−９４６
【非特許文献６】ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９６，９３，１４４３−１４４８
【非特許文献７】Ｃａｌｖｉら，Ｃｅｌｌ，１９９１，６６，４６５−４７
【非特許文献８】Ｋｉｄｗｅｌｌ，Ｊ． Ｈｅｒｅｄ．，１９９４，８５，３３９−３４６
【非特許文献９】Ｇｉｅｒｌ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，２０４，１４５−１５９
【非特許文献１０】Ｂｒｏｗｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３９０−４，１９９８
【非特許文献１１】Ｄｏｂｉｎｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１：３４８−３６５２，１９９３
【非特許文献１２】Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３１：３６１−３６９，１９９７
【非特許文献１３】Ｆａｒｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５１：６７５−６８１ １９９６
【非特許文献１４】Ｋａｃｈｒｏｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４５：３３９−３４８，１９９４
【非特許文献１５】Ｋｉｎｓｅｙ ａｎｄ Ｈｅｌｂｅｒ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９８９，８６，１９２９−１９３３
【非特許文献１６】Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｇｅｎｅｔｉｃａ ９３：４９−５９，１１９４
【非特許文献１７】Ｄａｂｏｕｓｓｉら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，２３２，１２−１６
【非特許文献１８】Ｌａｎｇｉｎら，１９９５
【非特許文献１９】Ｈｕｎ−Ｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９８，２５９，３５４−３６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
真菌ゲノム（より詳しくは病原性糸状菌のゲノム）における挿入突然変異体のコレクションを作製するためのそのような手段は、それらのゲノムの研究およびそれらの遺伝子の機能の研究に今や不可欠である。ヒトまたは動物における真菌性病態の治療用または農業用に使用されうる新規抗真菌化合物を見出すためには、真菌遺伝子の機能の分析が不可欠である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的でありインパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなる新規ポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、挿入突然変異誘発手段の開発に適した転位率で、真菌におけるインパラ因子の転位を示すことを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、真菌突然変異体の製造方法であって、そのゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入することによる製造方法、および関心のある表現型に関連した真菌遺伝子を同定するための方法である。最後に、本発明は、真菌挿入突然変異体のコレクションおよびその用途に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐＮｉ１６０プラスミドのマッピング。
【図２】ｐＮｉＬ１６０プラスミド（Ａ）およびｐＡＮ３０１プラスミド（Ｂ）の、それを構築するために用いたマッピング。
【図３】ｐＮｉ１６０およびｐＣＢ１１７９ベクターを使用してＢａｍＨＩ ＲＥＭＩにより得られた同時形質転換体の分子分析。
【図４】ｎｉａ＋復帰突然変異体Ｃ１４−１およびＣ１４−２の分子分析。 Ａ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分析。 Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変異体の分析。
【図５】ｐＮｉＬ１６０ベクターを保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。
【図６】非病原性復帰突然変異体Ｒｅｖ７７におけるインパラの挿入により遮断されたＯＲＦの概要図。
【図７】ｐＣＩＴｎプラスミドのマッピング。
【図８】ｐＮｉＨＹＧ構築物を保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。 Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。 Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。
【図９】ｐＨＩＮプラスミドのマッピング。
【図１０】ｐＥＯ６プラスミドのマッピング。
【図１１】ｐＨＮｉＬプラスミドのマッピング。
【図１２】ｐＢＮｉＬプラスミドのマッピング。
【図１３】ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドのマッピング。
【図１４】該２成分系を用いた形質転換後に得られたＤ１同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の記載）
ポリヌクレオチド
したがって、本発明は、インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結された、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ Ｇｒｉｓｅａ）において機能的なプロモーター調節配列を転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド、特に、単離または精製されたポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドでの真菌の形質転換および該トランスポゾンの切除は、該マーカー遺伝子の発現につながる。したがって、該マーカー遺伝子の発現の検出は、該転位事象のモニターおよび該挿入突然変異体の選択を可能にする。該突然変異体の選択は、第１マーカーとは異なる第２マーカー遺伝子で該トランスポゾンを標識することにより改良されうる。この第２マーカー遺伝子は、該真菌のゲノム内への該トランスポゾンの再挿入のモニターを可能にする。したがって、本発明の対象はまた、インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、前記のポリヌクレオチドである。
【００１５】
使用するマーカー遺伝子は、簡便なスクリーニングによる転位事象の選択に適したものである。本発明においては、表現型スクリーニングで真菌内での発現が検出されうる任意のマーカー遺伝子を使用することができる。「マーカー遺伝子」なる語は、異なる起源の遺伝要素を含むキメラ遺伝子をも意味すると理解される。したがって、本発明のマーカー遺伝子は、真菌由来のプロモーター配列と、真菌由来でないマーカー遺伝子のコード配列との両方を有しうる。
【００１６】
本発明においては、「マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列」なる表現は、あるコード配列に機能的に連結されたポリヌクレオチドのうち、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における該コード配列の発現を可能にする任意のポリヌクレオチドを意味すると意図される。プロモーター配列がマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるか否かを判定することを可能にする技術は、当業者に公知である。例えば、潜在的プロモーター配列とレポーター遺伝子とを転写の方向に含むポリヌクレオチドでマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）を形質転換することができる。該ポリヌクレオチドで形質転換された真菌における該レポーター遺伝子の発現のモニターは、このプロモーター配列がマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的であるか否かの判定を可能にする。したがって、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における機能を判定するために、任意のプロモーター配列を試験することができる。該プロモーター調節配列は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来の遺伝子のプロモーター調節配列であることが可能であり、あるいは別の真菌、さらに詳しくは別の糸状菌に由来することが可能である。マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列は、真菌ｎｉａ（硝酸レダクターゼ）またはｇｐｄ遺伝子のプロモーター調節配列よりなることが有利である。好ましくは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）またはｇｐｄＡ遺伝子（Ｐｕｎｔら，１９９０）の、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的なプロモーター調節配列よりなる。マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）において機能的であるためには、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列は、好ましくは、３３７ｂｐより長く、０．４ｋｂより長く、０．５ｋｂより長く、０．６ｋｂより長く、０．７ｋｂより長く、０．８ｋｂより長く、０．９ｋｂより長く、より好ましくは、約１ｋｂより長いか又はそれに等しい。本発明の好ましい実施形態においては、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーター調節配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ５８２９１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら，Ｇｅｎｅ ９０：１８１−１９２，１９９０；Ｐｕｎｔら，１９９５）由来のｎｉａＤおよびｎｉｉＡ遺伝子の遺伝子間断片に相当する１．３ｋｂのポリヌクレオチドよりなる。それ自体は機能的ではないが、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）プロモーターの下流へのランダムな組込みにより該マーカー遺伝子の発現を可能にする部分的機能的調節配列は、本発明においては、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的な調節配列ではないと理解される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子のコード配列は、発現が容易に測定されるレポーター遺伝子、特にＧＵＳ（米国特許第５，２６８，４６３号、米国特許第５，５９９，６７０号）またはＧＦＰ（米国特許第５，４９１，０８４号、米国特許第５，７４１，６６８号）のコード配列、抗生物質または除草剤に対する耐性に関する遺伝子、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ：Ｐｕｎｔら，１９８７）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ：Ｄｒｏｃｏｕｒｔ，１９９０）、除草剤ビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）耐性遺伝子（Ｂａｒ：ＰａｌｌおよびＢｒｕｎｅｌｌｉ，１９９３）またはスルホニル尿素耐性遺伝子（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のコード配列から選ばれる。本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該マーカー遺伝子は、真菌において機能的である、酵素をコードする遺伝子の配列から選ばれる。好ましくは、該マーカー遺伝子は硝酸レダクターゼ遺伝子である。本発明の断片がｎｉａ−真菌内に組込まれた場合、この構築物で形質転換された株は突然変異体表現型を維持する。最少培地（唯一の窒素源としてのＮａＮＯ３）上のｎｉａ＋コロニーの出現は、ｎｉａＤ遺伝子の発現を可能にするインパラトランスポゾンの切除を示す。これらのｎｉａ＋復帰突然変異体は、ｎｉａ−コロニーの低く平らな表現型とは異なるそれらの密集性かつ気生性（ａｅｒｉａｌ）の表現型により、この培地上で選択されうる。マーカーとしてのｎｉａＤ遺伝子の使用は、ｎｉａ−真菌の使用を要する。ｎｉａ−真菌の同定方法は当業者によく知られている。特に、Ｄａｂｏｕｓｓｉら（１９８９）により記載されている方法が挙げられる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、インパラトランスポゾン（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５；Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）の挿入により不活性化された前記のマーカー遺伝子を含む。該インパラトランスポゾンは、逆方向反復配列（ＩＴＲ）に隣接した機能的トランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む。それは、ＴＡジヌクレオチドにおいて挿入され、これは重複状態となる。インパラの切除は曖昧なものであり、ごく一般的には、該挿入中に重複したＴＡジヌクレオチドに加えて、該因子の左または右末端に対応する３ヌクレオチドの足跡（フットプリント）を残す。したがって、切除後に残存フットプリントが該マーカー遺伝子の発現を妨げないよう、該マーカー遺伝子内への該インパラトランスポゾンの挿入点が選択される必要がある。好ましくは、該インパラトランスポゾンは、該プロモーター配列内または該マーカー遺伝子のイントロン内に挿入される。インパラのいくつかのコピーがフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）において同定されており、それらの配列の比較は、種々の長さおよび配列のＩＴＲを有する３つのサブファミリーを定めることを可能にした（Ｈｕａ−Ｖａｎら，１９９８）。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、インパラ１６０トランスポゾンを含む。該インパラ１６０因子は１ ２８０ｂｐを含み、それは、３４０アミノ酸のトランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを囲む２７ｂｐの２つの逆方向反復配列に隣接する（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５；Ｇｅｎｂａｎｋ Ｓ７５１０６）。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子の１．３ｋｂのプロモーターと、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパラ１６０トランスポゾンとを含む。本発明の特に有利な実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドはｐＮｉＬ１６０プラスミドを含む。これらの構築物を使用して、ｎｉａ−真菌を形質転換し、インパラ因子の転位から得られた挿入突然変異体を、それらのｎｉａ＋表現型に関して最少培地上で選択する。もう１つの好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、ハイグロマイシンに耐性に関するｈｐｈ遺伝子のコード配列に機能的に連結された、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｇｐｄ遺伝子のプロモーターと、該ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内に挿入されたインパラ１６０トランスポゾンとを含む。これらのポリヌクレオチドを使用して、真菌を形質転換し、該インパラ因子の転位から得られたハイグロマイシン耐性挿入突然変異体を選択する。
【００１９】
本発明の構築物および方法においては、任意のインパラトランスポゾンを使用することができる。「インパラトランスポゾン」なる語は修飾インパラトランスポゾンをも意味すると理解される。これらの修飾としては、特に、インパラトランスポゾン内へのマーカー遺伝子またはアクチベーター配列の挿入、または欠損インパラトランスポゾンを得るためのトランスポザーゼの不活性化が挙げられる。これらの修飾トランスポゾンの構築では、当業者によく知られた通常の分子生物学技術を用いる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、真菌の挿入突然変異体を得るために優先的に用いられる。遺伝子内へのインパラトランスポゾンの挿入は、一般には、この遺伝子の全体的または部分的不活性化を引き起こす。一方、アクチベーター配列を含むインパラトランスポゾンの使用は、過剰発現突然変異体を得ることを可能にする。したがって、該トランスポゾン修飾では、挿入突然変異誘発の種々の方法を用いることができる（Ｂａｎｃｒｏｆｔら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３：４４９−４６１，１９９２；ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＤｅａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：６５-６７，１９９３；Ｌｏｎｇら，ＰＮＡＳ ９０：１０３７０−１０３７４，１９９３）。
【００２１】
したがって、本発明はまた、トランスポザーゼの機能に影響を及ぼすことなく転位性因子の２つのＩＴＲの間にマーカー遺伝子が挿入されて自律的標識因子を有することが可能となったインパラトランスポゾンを含む前記のポリヌクレオチドに関する。また、本発明の好ましい実施形態において該トランスポゾンを標識するためには、インパラトランスポゾンの切除を観察するために使用することが予想されるすべてのマーカー遺伝子を使用することができる。好ましくは、該マーカー遺伝子は、該トランスポザーゼをコードする配列の下流、かつ、左ＬＴＲの上流（ＮｈｅＩ部位において）に挿入される。インパラトランスポゾン内へのマーカー遺伝子の挿入は、該挿入突然変異体の、より良好な選択を可能にする。別法として、トランケート化マーカー遺伝子をインパラトランスポゾン内に挿入することができる。プロモーターを欠くマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチドをプロモータートラップとして使用することを可能にする。トランケート化プロモーターを含むマーカー遺伝子の使用は、本発明のポリヌクレオチドをアクチベーター配列用のトラップとして使用することを可能にする。
【００２２】
最後に、本発明は、欠損インパラトランスポゾン（すなわち、特に、突然変異により、または欠失により、またはマーカー遺伝子の挿入により、またはマーカー遺伝子での置換により、インパラ因子のトランスポザーゼが不活性化されているトランスポゾン）を含む前記のポリヌクレオチドに関する。この欠損インパラ因子の転位は、本発明の挿入突然変異誘発においては、より容易に制御される。トランスポザーゼが不活性化された欠損インパラ因子の構築には、当業者に公知の通常の分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を用いる。本発明の１つの実施形態においては、インパラ因子のトランスポザーゼをコードするオープンリーディングフレームを、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であるプロモーターの制御下で発現されるマーカー遺伝子で置換する。該トランスポザーゼのコード配列は、例えば、真菌において機能的である異種プロモーターの制御下で発現される、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子またはＧＦＰ遺伝子で置換することができる。該欠損インパラトランスポゾンはこれらの挿入配列（ＩＴＲ）を維持し、したがって、その転位は、例えば複製型プラスミド上に配置されたトランスポザーゼを利用してトランスで活性化されうる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクター内に挿入される。このベクターは、例えば細菌などの宿主生物を形質転換するために及びこの宿主生物内で本発明のポリヌクレオチドを複製するために使用することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、真菌を形質転換するためにベクター内に挿入される。これらのベクターは、これらのポリヌクレオチドを複製するために又は該ポリヌクレオチドを真菌のゲノム内に組込むために使用される。ポリヌクレオチドの複製および宿主生物内へのその組込みを可能にするベクターは、当業者によく知られている。
【００２４】
挿入突然変異誘発および遺伝的標識
本発明はまた、真菌の挿入突然変異体を製造するための及びこれらの真菌のゲノムを研究するための、前記のポリヌクレオチドの用途に関する。
【００２５】
したがって、本発明の対象はまた、真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
・マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内へのその再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化された該マーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法である。
【００２６】
本発明の方法においては、該インパラトランスポゾンを修飾すること、特に、マーカー遺伝子または活性化配列の挿入によりそれを修飾することが可能であると理解される。好ましい実施形態においては、該インパラトランスポゾンは、マーカー遺伝子を含み、それらの２つのマーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を選択する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドで任意の真菌を形質転換して、この真菌の挿入突然変異体を製造することができる。特に、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類が挙げられる。好ましくは、本発明は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌に関する。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げられる。好ましくは、本発明は、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌に関する。より好ましくは、本発明は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種の真菌に関する。より一層好ましくは、本発明はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に関する。
【００２８】
真菌を形質転換するための技術は当業者によく知られている。特に、ＰＥＧを使用するプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での形質転換（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：８３９−８４２，１９９８）またはパーティクル銃を使用する射撃の方法（Ｃｈａｕｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２０５−２０７，２０００）が挙げられる。
【００２９】
ついで、インパラ因子の転位から生じた挿入突然変異体を同定または選択するために、マーカー遺伝子の発現に関して形質転換体をスクリーニングする。本発明のポリヌクレオチドのマーカー遺伝子は、表現型スクリーニングにより挿入突然変異体を同定または選択することを可能にする。例えば、このスクリーニングは、抗生物質に対する耐性、化合物に対する耐性、またはレポーター遺伝子の発現レベルの測定によるものでありうる。種々のマーカー遺伝子が、前記において更に詳しく説明されている。ｎｉａ−真菌におけるマーカー遺伝子としてｎｉａＤ遺伝子を使用する場合には、唯一の窒素源としてＮａＮＯ３を含有する最少培地上で、該挿入突然変異体を、それらの密集性かつ気生性の外観により選択する。
【００３０】
このようにして得られた挿入突然変異体を分析するためには、新たな転位を避けるためにトランスポゾンを安定化させるのが有利かもしれない。該転位因子の転位率に近い又はそれ未満の相補点（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において該突然変異体を試験する場合には、該トランスポゾンの新たな再挿入のこの制御は無視されうる。該トランスポゾンの切除を制御するために、２成分系を調製することができる（Ｈｕｎ−Ｖａｎ，１９９８；ＫｅｍｐｋｅｎおよびＫｕｃｋ，１９９８）。後者は、トランスポザーゼが特に突然変異により又は欠失により又はマーカー遺伝子での置換により不活性化された欠損インパラ因子の構築を含む。この場合、該欠損インパラトランスポゾンは、発現が厳密に制御されており該インパラ因子の安定化を可能にするトランスポザーゼを用いて可動される。
【００３１】
したがって、本発明の対象はまた、真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
・欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含む本発明のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
・該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入およびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用いて、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、
・該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法である。
【００３２】
真菌におけるインパラ因子トランスポザーゼ遺伝子などの遺伝子の発現の制御を可能にする方法は、当業者によく知られている。特定の実施形態においては、該真菌を２つのポリヌクレオチドで形質転換する。その第１ポリヌクレオチドは該欠損インパラトランスポゾンを含み、第２ポリヌクレオチドは、インパラ因子トランスポザーゼのコード配列を、それ自身のプロモーターの制御下または異種プロモーターの制御下で含む。該トランスポザーゼのコード配列は、複製型プラスミド上または組込みプラスミド上に配置することができる。該トランスポザーゼの発現を制御するために、後者を、誘導プロモーターの制御下に配置することができる。該トランスポザーゼの発現の誘導は、該欠損インパラ因子の転位および挿入突然変異体の調製を可能にし、ついで、該トランスポザーゼがもはや発現されなくなった際に該トランスポゾンは安定化される。本発明の方法においては、真菌において機能的である任意の誘導プロモーターを使用することができる。特に、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターを使用することができる。特に、このプロモーターは、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下の最少培地上でのｎｉａ遺伝子の発現を可能にし、一方、この遺伝子の発現は、アンモニウムの存在下では完全に抑制される（ＬａｕおよびＨａｍｍｅｒ，１９９６）。あるいは、該トランスポザーゼを、例えば、選択マーカーを保持する複製型プラスミド（このプラスミドは、選択圧が存在しない場合には維持されない）上に配置する。この場合、該トランスポザーゼは、構成プロモーターまたはそれ自身のプロモーターの制御下で発現されうる。選択圧の存在下、該複製型プラスミドの維持は該トランスポザーゼの発現を可能にし、今度はこれが、インパラ因子の転位および挿入突然変異体の産生を可能にする。複製型プラスミドの維持を可能にする選択圧の不存在下では、該トランスポザーゼは失われ、該トランスポゾンは該突然変異体内で安定化される。そのようなプラスミドの製造に必要な手段は当業者によく知られている。例えば、該トランスポザーゼを、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）由来のテロメア末端を含有するｐＦＡＣ１複製型ベクター（Ｂａｒｒｅａｕら，１９９８）内に配置することができる。
【００３３】
挿入突然変異誘発は、関心のある新規遺伝子を同定するための及びそれらの機能を研究するための非常に有効な手段である。好ましい実施形態においては、挿入突然変異体のコレクションを、関心のある表現型に関してスクリーニングする。本発明の挿入突然変異体においては、任意の検出可能な表現型が探索されうる。特に、真菌の生物学、生理学、発生および生化学に関する表現型が挙げられる。好ましくは、病原性真菌の挿入突然変異体が調製され、これらの突然変異体において探索される表現型はこれらの真菌の病原性に関するものである。該表現型スクリーニングは、該真菌の直接的観察、酵素活性の測定、殺真菌剤に対する感受性の測定、または該真菌のビルレンスの研究に基づくものでありうる。関心のある表現型を有する挿入突然変異体を同定したら、インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する。該インパラ因子の挿入によりこのようにして標識された関心のある遺伝子は、当業者によく知られた分子生物学的技術を用いて単離する。用いる技術としては、特に、ポリヌクレオチドの一方の末端の配列のみが既知の場合に該ポリヌクレオチドの増幅を可能にする増幅技術が挙げられる（この場合、該トランスポゾンの配列は該ゲノム内に組込まれる）。これらの技術には、特に、逆ＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０：６２１−６２３，１９８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：７６２−７６９，１９８９）、ベクトレットＰＣＲ（ＡｒｎｏｌｄおよびＨｏｄｇｓｏｎ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：３９−４２，１９９１）およびパンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）ＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．２：１９７−２０３，１９９３）が含まれる。これらの技術は、真菌のゲノム内のインパラトランスポゾンに隣接する配列の増幅、クローニングおよび配列決定を可能にする。ついでこれらの隣接配列を使用して、該トランスポゾンの挿入により不活性化された全遺伝子を単離する。
【００３４】
したがって、本発明は、真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同定方法であって、
・前記の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、
・この検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し、
・該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工程を含んでなる方法に関する。
【００３５】
宿主生物
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主生物に関する。本発明における「宿主生物」なる語は、特に、任意の単細胞生物または多細胞生物（これは下等または高等生物でありうる）を意味し、特に、細菌および真菌から選ばれると意図される。該細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から選ばれるのが好都合である。好ましい実施形態においては、本発明は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された真菌に関する。好ましくは、該真菌は、子嚢菌類、担子菌類および卵菌類から選ばれる。好ましくは、該真菌は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウドンコ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、コタマカビ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポリウム（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）およびウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の真菌から選ばれる。また、ゲウマンノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属の真菌が挙げられる。好ましくは、該真菌は、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から選ばれる。より好ましくは、該真菌は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム・ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）およびスタゴノスポラ・ノドラム（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ）種から選ばれる。特に有利な態様においては、該宿主生物はマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）である。
【００３６】
該ポリヌクレオチドは、該真菌のゲノム内に組込まれたり、あるいは複製型プラスミド上に配置されうる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組込まれた真菌に関する。本発明はまた、該インパラトランスポゾンがゲノム内に組込まれたマグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突然変異体に関する。
【００３７】
該真菌のゲノム内へのインパラの再挿入は、この真菌の挿入突然変異体のコレクションの生成を可能にする。このようにして得られた突然変異体を、糸状菌のゲノムの研究に使用することができる。
【００３８】
後記実施例は、本発明を例示しうるが、本発明の範囲を限定するものではない。これらの後記実施例に記載の方法または操作は、例示として記載されており、同じ結果を得るために利用されうる種々の方法から選ばれる１つの選択肢に相当する。この選択肢は、結果の質に関連したものではなく、そのため、当業者は、同じ結果を得るために任意の適当な方法を用いることができる。ＤＮＡ断片を操作するための方法のほとんどは、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” 第１巻および第２巻，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら又はＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載されている。
【００３９】
（図面の記載）
図１：ｐＮｉ１６０プラスミドのマッピング。
【００４０】
図２：ｐＮｉＬ１６０プラスミド（Ａ）およびｐＡＮ３０１プラスミド（Ｂ）の、それを構築するために用いたマッピング。
【００４１】
図３：ｐＮｉ１６０およびｐＣＢ１１７９ベクターを使用してＢａｍＨＩ ＲＥＭＩにより得られた同時形質転換体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより該ＤＮＡ断片が示される。
【００４２】
図４：ｎｉａ＋復帰突然変異体Ｃ１４−１およびＣ１４−２の分子分析。該復帰突然変異体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、サザンハイブリダイゼーションにより該ＤＮＡ断片が示される。
【００４３】
Ａ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する（レーン１）またはインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する（レーン２）放射性プローブを使用したＣ１４−１復帰突然変異体の分析。
【００４４】
Ｂ：ｎｉａ＋単胞子を単離することにより精製された後のＣ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変異体の分析。Ｃ１４−１復帰突然変異体（レーン３および４）およびＣ１４−２復帰突然変異体（レーン５および６）のプロフィールをＣ１４ｎｉａ−同時形質転換体由来のプロフィール（レーン１および２）と比較する。使用したプローブは、インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する。
【００４５】
図５：ｐＮｉＬ１６０ベクターを保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該同時形質転換体ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。レーン１：同時形質転換体８のＤＮＡ；レーン２〜７：同時形質転換体８の復帰突然変異体のＤＮＡ；レーン８：同時形質転換体６のＤＮＡ；レーン９〜１１：同時形質転換体６の復帰突然変異体のＤＮＡ。
【００４６】
図６：非病原性復帰突然変異体Ｒｅｖ７７におけるインパラの挿入により遮断されたＯＲＦの概要図。
【００４７】
図７：ｐＣＩＴｎプラスミドのマッピング。
【００４８】
図８：ｐＮｉＨＹＧ構築物を保持する２つの同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。３つの別個の復帰突然変異体のＤＮＡ（レーン１〜３）を抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、Ａ：インパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦに相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、Ｂ：ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。星印の位置は転位性因子の再挿入を示す。
【００４９】
図９：ｐＨＩＮプラスミドのマッピング。
【００５０】
図１０：ｐＥＯ６プラスミドのマッピング。
【００５１】
図１１：ｐＨＮｉＬプラスミドのマッピング。
【００５２】
図１２：ｐＢＮｉＬプラスミドのマッピング。
【００５３】
図１３：ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドのマッピング。
【００５４】
図１４：該２成分系を用いた形質転換後に得られたＤ１同時形質転換体に由来するｎｉａ＋復帰突然変異体の分子分析。該復帰突然変異体ＤＮＡ（レーン１〜４）のＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化し、１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上にローディングする（５μｇ／レーン）。泳動およびポジティブナイロンメンブレン上へのトランスファーの後、ｈｐｈ遺伝子から増幅された断片に相当する放射性プローブに対するサザンハイブリダイゼーションにより、該ＤＮＡ断片が示される。
【００５５】
（実施例）
【実施例１】
【００５６】
実施例Ｉ
インパラの自律性コピーでの挿入突然変異誘発
１．入手可能な構築物
ｐＮｉ１６０プラスミドは、ＡＴＧコドンから１０ｐｂの位置に、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域内に組込まれたインパラ１６０のコピーを含有する。その構築物は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子（Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９９２）を含有するｐＡＮ３０１プラスミド（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）で形質転換されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＦ２４株において得られたトランスポゾン捕捉に由来する。ｎｉａＤ遺伝子の自然突然変異の選択は、ｐＡＮ３０１の単一のコピーを保持するＴＲ７形質転換体における１．３ｋｂの挿入の特徴づけを可能にする。この挿入は、ｐＡＮ３０１の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ領域内に存在し、その効果は、４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の生成にある。部分ゲノムライブラリーを構築し、ｐＡＮ３０１由来の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片でスクリーニングした後（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）、この断片をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。それと平行して、該ｎｉａＤ遺伝子の下流に位置する７．８ｋｂ ＮｄｅＩ断片、そしてまた、該ｎｉａＤ遺伝子のプロモーターの大部分に相当する１ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠失させることにより、ｐ１１ΔＮｄｅＩプラスミドをｐＡＮ３０１から構築した（Ｌａｎｇｉｎら，１９９０）。インパラ１６０因子および硝酸レダクターゼの２．７ｋｂの断片を含む４ｋｂの断片で、ｐ１１ΔＮｄｅＩ中に存在する２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を置換することにより、この場合は０．３ｋｂ長であるｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域内に該因子が挿入されたｐＮｉ１６０プラスミドが得られうる（図１）。
【００５７】
２．調製した構築物
ｐＮｉＬ１６０プラスミドは、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子のプロモーターの１ｋｂの断片の付加によりｐＮｉ１６０プラスミドから誘導される。これを行なうために、１．３ｋｂのｎｉａＤプロモーターを含有するｐＡＮ３０１プラスミドを、この遺伝子の下流に存在する７．８ｋｂのＮｄｅＩ断片から欠失させて、中間体プラスミドｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩを得た。ついで、その１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を、該１ｋｂの断片と同じｎｉａＤ遺伝子部分とインパラ１６０因子とを含有しｐＮｉ１６０プラスミドに由来する２．３ｋｂのＢａｍＨｉ−ＡｐａＩ断片で置換した（図２）。
【００５８】
３．マグナポルセ・グリセアの形質転換
マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のＧ１１．１７４株は、ｎｉａ−表現型をもたらす硝酸レダクターゼ遺伝子内の点突然変異を有する。この株の製造は、Ｄａｂｏｕｓｓｉら，１９８９の文献に記載されている。それを、米粉に基づく固形培地上で継代培養し、それにより、該真菌から分生子が収穫されうる。Ｔａｎａｋａ（Ｏｕら，１９８５）の培地Ｂに基づき調製したＴＮＫＹＥ液体培地は、Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９０）およびＳｗｅｉｇａｒｄら（１９９２）に記載のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出するための又はプロトプラストを得るための菌糸の収穫を可能にしうる。酵母エキスを欠くＴＮＫ寒天培地（超高純度アガロース、８ｇ．１−１）（ＭＮＯ３培地）は、ｎｉａ＋ Ｇ１１．２５株からｎｉａ− Ｇ１１．１７４株を識別するのを可能にする。前者は、低く平らで糸状の表現型を有するが、後者は密集性かつ気生性である。
【００５９】
３．１ ｐＮｉ１６０プラスミドでの形質転換
Ｇ１１．１７４株のプロトプラストを、ｐＮｉ１６０プラスミド（インパラ１６０を導入するもの）と、ハイグロマイシン耐性を付与するｐＣＢ１１７９プラスミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）とで同時形質転換した。該形質転換方法はＳｗｅｉｇａｒｄら，１９９２に記載されており、４単位のＢａｍＨＩ酵素（ＲＥＭＩ：制限酵素媒介組込み；Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９８）および１μｇの各プラスミドの存在下で行なった。該プロトプラストは、グルコースがスクロース（４００μｇ．１−１）で置換され２４０μｇ．１−１の比率のハイグロマイシンで補足されたＴＮＫＹＥ培地上で選択される。該同時形質転換体を選択するために、この抗生物質に耐性なコロニーを、それらのゲノムＤＮＡの抽出後、インパラトランスポゾンに特異的であり５７３ｂｐの増幅産物を与えるＳＰＥ５（５’ＡＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧ３’）およびＳＰＥ３（５’ＴＣＣＧＧＧＣＣＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧ３’）プライマーを使用する増幅により分析した。該同時形質転換体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＡＮ３０１中に存在するｎｉａＤ遺伝子の２．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（２．７ｋｂプローブ）をプローブとして使用するサザンブロット（図３）で分析した（Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９）。この研究は、ｐＮｉ１６０を介して導入されたアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の実質的にすべてのｎｉａ遺伝子に相当する少なくとも１つの４ｋｂバンドを有する３５個の形質転換体の選択を可能にした。これらの同時形質転換体を、米粉に基づく固形培地上で１０〜１４日培養し、該胞子を水中に収穫した。計数後、それらを、ディッシュ当たり胞子１０５〜１０６個の比率でＭＮＯ３寒天培地上に播いた。ｎｉａ＋復帰形質転換体を選択するためのこの工程を再現する実験を行なった。こうして、本発明者らは、野生型（Ｇ１１．２５）胞子１０個をｎｉａ− Ｇ１１．１７４突然変異体の胞子１０６と混合し２６℃で１４日間インキュベートした場合に、該ＭＮＯ３培地がｎｉａ＋コロニーの検出を可能にすることを観察した。２６℃で１ヵ月培養した後、１個の同時形質転換体（同時形質転換体Ｃ１４）だけが、気生性表現型を有する２個のコロニー（Ｃ１４−１およびＣ１４−２）を得ることを可能にした。これらの復帰突然変異体コロニーを回収し、ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター内のインパラ１６０挿入部位を囲むＣ１（５’ＣＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＴ３’）およびｎｉａＸ（５’ＣＴＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＧ３’）プライマーを使用するＰＣＲにより分析した。２００ｂｐの産物の増幅は、該トランスポゾンの切除が生じた核の存在を示している。均一なコロニーを得るために、Ｃ１４−１およびＣ１４−２復帰突然変異体の分生子を双眼顕微鏡下で単離し、別々に培養した。インパラのＯＲＦに相当するプローブを使用したサザンブロットによるその分析により、それらの２つの復帰突然変異体における該因子の再挿入が示されうる（図４）。ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に２００ｂｐのＰＣＲ産物をクローニングした後、該トランスポゾンの切除により残されたフットプリントを配列決定した。Ｃ１４−１復帰突然変異体のフットプリントはＣＴＧＴＡであり、Ｃ１４−２のフットプリントはＣＡＧＴＡである。これらのフットプリントは、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）においてインパラが切除された場合にごく一般的に残されるフットプリント（Ｌａｎｇｉｎら，１９９５）と同一である。ＭＮＯ３寒天培地上での培養においては、これらの復帰突然変異体は、Ｇ１１．１７４株とＧ１１．２５株との間の中間的な表現型を有し、このことは、ｐＮｉ１６０構築物中に存在するｎｉａＤ遺伝子がＧ１１．１７４株の突然変異の最適な相補を許容しないことを示唆している。この仮定を試験するために、この株由来のプロトプラストを、ｐＣＢ１１７９（３μｇ）の存在下および１．３ｋｂのプロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩ（３μｇ）ベクターまたはｐＡＮ３０１（３μｇ）ベクターで形質転換した。グルコースがスクロース（４００μｇ．ｌ−１）で置換されハイグロマイシン（２４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＭＮＯ３培地上で該プロトプラストをプレーティングし、３０℃で１０日間インキュベートした後、ｎｉａ＋表現型を有するコロニーが出現する。一方、０．３ｋｂのプロモーター断片の制御下（ｐＮｉ１６０の場合と同様）でｎｉａＤ遺伝子を含有するｐ１１ΔＮｄｅＩベクターを使用した場合には、相補性は認められなかった。
【００６０】
これらの実験は、ｐＮｉ１６０中に存在するトランケート化プロモーターがＧ１１．１７４株の突然変異を相補しえないことを示している。この構築物での２つの復帰突然変異体（Ｃ１４−１およびＣ１４−２）の選択は、該０．３ｋｂ プロモーター断片の固有活性によるものではなく、Ｃ１４同時形質転換体においては、アクチベーター配列から利益が得られる領域内にｎｉａＤ遺伝子が挿入されたと考えられるのではないかと説明されうる。このことは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）のゲノム内のアクチベーター領域を検出するためにｐ１１ΔＮｄｅＩを使用しうることを示唆している。
【００６１】
３．２ ｐＮｉＬ１６０（本発明のもの）での形質転換
Ｇ１１．１７４株由来のプロトプラストを、４０単位のＮｄｅＩ酵素の存在下、１．３ｋｂの全プロモーターの制御下でｎｉａＤ遺伝子を含有する新規構築物ｐＮｉＬ１６０（１μｇ）およびｐＣＢ１１７９（１μｇ）で同時形質転換した。該同時形質転換体を、ＳＰＥ５およびＳＰＥ３プライマーを使用する増幅によりスクリーニングし、ついで米培地上に播いて分生子を得た。復帰突然変異体を同定するために、後者をＭＮＯ３培地（ディッシュ当たり胞子約１０５〜１０６個）上でプレーティングした。１９個の同時形質転換体に関して行なった実験は、それらの場合の１００％において復帰突然変異体を得ることを可能にした。いくつかは、２６℃で１０日の培養から生じた。復帰突然変異体の数は、考慮される同時形質転換体に応じて２〜８３の様々な数となる。８個の異なる同時形質転換体に属する５３個の復帰突然変異体を、インパラの全コード領域に相当するプローブを使用するサザンブロットにより分析した。図５は、９個の無作為に選ばれた復帰突然変異体におけるインパラトランスポゾンの移動度を示す。この実験から得られたエム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）におけるインパラ再挿入の割合（％）は７４％に達する。これらの再挿入体のうち、それらの９５％は異なる。より詳しくは、再挿入体のすべてが異なる１００％の再挿入を与える同時形質転換体を同定した。
【００６２】
これらの結果は、ｐＮｉＬ１６０構築物が、ｐＮｉ１６０とは異なり、該トランスポゾンの新規挿入を有する多数の復帰突然変異体がマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において選択されることを可能にすることを示している。
【実施例２】
【００６３】
実施例ＩＩ
マグナポルセ・グリセアにおける挿入突然変異体の製造
ｐＮＬｉ１６０プラスミドの単一のコピーを保持する同時形質転換体６（ＣＴＲＦ６）から得られた１８個のｎｉａ＋復帰突然変異体のサザンブロット分析は、それらの１００％が、該ゲノム内に再挿入されたインパラを有することを示した。３５０個のｎｉａ＋復帰突然変異体のコレクションを得るために、この同時形質転換体を選択した。該同時形質転換体を米培地上で１４日間培養する。該胞子を、ペトリ皿当たり３ｍｌの蒸留水中に収穫し、菌糸残渣の除去のために半融ガラス上で濾過して、ディッシュ（１２×１２ｃｍの形態）当たり胞子１０６個の比率でＮａＮＯ３培地上にプレーティングする。該ディッシュを２６℃でインキュベートする。１６〜２１日後にｎｉａ＋復帰突然変異体が出現する。それらをＮａＮＯ３培地上で継代培養し、１４日間培養し、該胞子を寒天−水培地（Ｈ２０中の２％アガロース）上にプレーティングする。２６℃で８時間後、各復帰突然変異体からの１個の胞子を個々にＮａＮＯ３培地上で継代培養して、該復帰突然変異体を精製し、そのｎｉａ＋表現型を確認する。
【実施例３】
【００６４】
実施例ＩＩＩ
インパラトランスポゾンを保持する挿入突然変異体の特徴づけ
ＣＴＲＦ６から生成した３５０個の復帰突然変異体の観察は、ＣＴＲＦ６ほどには有意でない成長および該同時形質転換体の灰色とは異なる暗褐色を米培地およびＮａＮＯ３培地上で示す復帰突然変異体（Ｒｅｖ２）の検出を可能にした。インパラ挿入に隣接する配列を特徴づけるために、３μｇのＲｅｖ２ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、逆ＰＣＲにより分析した。消化後、該ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出工程に付し、ついで７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈殿させる。このようにして得られたペレットを４０μｌのＭｉｌｌｉＱ水中に採取する。８μｌの消化ＤＮＡ上で連結を行ない、該ＤＮＡを、前記のとおりに、フェノール／クロロホルム抽出に付し、７．５Ｍ酢酸アンモニウムで沈殿させる。該ＤＮＡを１０μｌ中に採取し、それらのすべてを、インパラトランスポゾンの配列上で選択される及び発散的に位置するＩｍｐＥ５’（５’ＧＧＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＴＣＣＣ３’）およびＩｍｐＥ３’（５’ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ３’）プライマーを使用するＰＣＲ工程に使用する。該ＩＰＣＲ産物の配列決定は、オープンリーディングフレーム内の重複したＴＡジヌクレオチドにおいて該トランスポゾンが挿入されうことを示すことを可能にした。ｔｂｌａｓｔｘプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用してデータバンクを調べることにより、この突然変異配列とＤＮＡ修復に関与するタンパク質ファミリーとの間で、さらに詳しくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＬＨ１タンパク質（Ｐｒｏｌｌａら，１９９４）に対して、非常に強い相同性が示された。
【００６５】
それと平行して、病原性突然変異体に関して探索するために、該コレクションの３５０個の復帰突然変異体を米葉および大麦葉上で試験した。該復帰突然変異体を米培地上で１４日間培養する。生成した胞子を、３ｍｌの水の存在下、菌糸を擦り取ることにより収穫し、ついでＴｈｏｍａｓセル下で計数する。該胞子懸濁液を１０５胞子／ｍｌにまで調節し、キネチン（エタノール中の２ｍｇ／ｍｌのストック溶液の１ｍｌ／ｌ）で補足された寒天培地（１％寒天）上に生存条件中で配置された数片の米（品種Ｓａｒｉｃｅｌｔｉｋ）の葉および大麦（品種Ｅｘｐｒｅｓｓ）の葉上に、原綿の芽（ｃｏｔｔｏｎ ｗｏｏｌ ｂｕｄ）を使用して塗布する。２６℃で４日間インキュベートした後、該徴候を、野生型Ｇ１１．１７４株で生じた徴候と比較する。復帰突然変異体７７は非病原性であることが判明した。この突然変異体中のインパラ挿入に隣接した配列を、ＢａｍＨＩでの該ゲノムＤＮＡの消化の後、前記の条件下、逆ＰＣＲにより回収した。回収された産物は、この場合もまた、オープンリーディングフレーム内に位置する重複したＴＡジヌクレオチドにおける該トランスポゾンの挿入を証明した。この産物の配列で該データバンクを調べたところ、有意な相同性は示されなかった。この産物を使用して、エム・グリセエア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）コスミドライブラリーをプローブした。該増幅産物にハイブリダイズするコスミドをクローニングし、マッピングし、部分的に配列決定した。したがって、考慮するリーディングフレームに応じて２つの潜在的ＯＲＦ（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）内にインパラトランスポゾンは挿入されるらしい（図６）。このコスミドのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を、ビアロフォス耐性を付与するＢａｒ遺伝子を保持するｐＣＢ１５３１ベクター（ｐＣＢ１５３１＊ベクター）（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）内にサブクローニングした。Ｒｅｖ７７プロトプラストを得、３μｇのｐＣＢ１５３１＊プラスミドまたは対照としての３μｇのｐＣＢ１５３１プラスミドで形質転換し、ビアロフォス（３０〜４０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥショ糖（４００ｇ．１−１）培地上に配置した。該耐性コロニーを、ビアラフォス（３０μｇ．ｍｌ−１）で補足されたＴＮＫＹＥグルコース上で培養し、米培地上で１４日間、胞子形成させる。該胞子を収穫し、該懸濁液を胞子１０５個．ｍｌ−１で補正し、ついで、前記のとおりにそれらの病原性に関して試験する。予想どおり、ｐＣＢ１５３１を保持する形質転換体は、Ｒｅｖ７７と同様に、非病原性のままであり、一方、ｐＣＢ１５３１＊を保持するコロニーは再び病原性となる。これらの結果は、インパラトランスポゾンが、エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）の感染力に関与する遺伝子を標識することを可能にしたことを示している。
【実施例４】
【００６６】
実施例ＩＶ
ｇｐｄ遺伝子のプロモーター内へのインパラトランスポゾンの組込み
ハイグロマイシンに対する耐性に関する遺伝子（ｈｐｈ）の発現を制御するプロモーター内へのインパラのクローニングを可能にするプラスミドを構築した。ｐＡＮ７．１ベクター（Ｐｕｎｔら，１９８７）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化は、ｇｐｄ遺伝子のその１３７塩基対から欠失したプロモーターおよびＴｒｐＣ遺伝子のターミネーターおよびｈｐｈ遺伝子のコード領域をコードする全ＯＲＦを含有する３９８８ｂｐ断片の遊離を可能にする。この断片の付着末端を、ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑末端内に形質転換した。ついでこの断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドに由来し複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を保持する２．５ｋｂのＰｖｕＩＩ断片に連結した。それから得られたプラスミドは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において、ハイグロマイシン耐性形質転換体を得ることを可能にする。ｐＣＩＴｎ（図７）として公知のこのベクターは、インパラまたは他の任意のトランスポゾンがクローニングされうる、転写＋１点の３０ｂｐ上流に位置する唯一のＰｖｕＩＩ部位を有する。
【実施例５】
【００６７】
実施例Ｖ
自律的および標識コピーでの挿入突然変異誘発
インパラトランスポゾンが再挿入された復帰突然変異体を表現型スクリーニングにより選択するのを可能にする自律的因子を得るために、トランスポザーゼをコードするリーディングフレームの終結コドンの下流の該因子の２つのＩＴＲの間にハイグロマイシン耐性遺伝子をクローニングした。これを行なうために、該ハイグロマイシン耐性カセットを、ＳａｌＩ消化によりｐＣＢ１００４プラスミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）から回収し、該末端をクレノウでの処理により平滑化した。このカセットを、ＮｈｅＩ部位で線状化されクレノウで処理されたｐＮｉ１６０プラスミドに連結する。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ酵素で消化する。修飾されたインパラトランスポゾンを含有する２２８５ｂｐの断片を回収し、これらの同じ酵素で消化されたｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩの７３９７ｂｐの断片に連結する。これは、ｎｉａＤの転写の方向（ｐＮｉＨＹＧプラスミド）または逆方向（ｐＮｉＧＹＨプラスミド）に挿入された、ハイグロマイシン耐性カセットで標識されたインパラトランスポゾンが硝酸レダクターゼ開始コドンの８ｂｐ上流に挿入された１．３ｋｂ長のｎｉａＤプロモーターを保持する９６８２ｂｐのプラスミドを与える。
【００６８】
エム・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）のＧ１１．１７４株由来のプロトプラストを３μｇのｐＮｉＨＹＧプラスミドまたは３μｇのｐＮｉＧＹＨプラスミドで形質転換した。これらの形質転換体について、既に記載されている条件下でｎｉａ＋復帰突然変異体の選択を行なった。サザンブロットによる同じ同時形質転換体の３個のｎｉａ＋復帰突然変異体の分析は、このようにして標識されたインパラトランスポゾンが自律性のままであること、すなわち、それが、ｎｉａＤ遺伝子から独立して存在し該ゲノム内に再挿入されうることを示している（図８）。
【実施例６】
【００６９】
実施例ＶＩ
インパラの欠損および可動性コピーでの挿入突然変異誘発
２成分突然変異誘発系を利用するためには、該転位性因子がトランスで活性化されうることを示すことが必要である。このためには、まず、該トランスポザーゼを構成的プロモーターの制御下に配置する。ついで、該欠損因子の安定化は、構成的プロモーターまたはそれ自体のプロモーターの制御下でトランスポザーゼを保持する複製型プラスミドまたはトランスポザーゼの発現を制御する誘導プロモーターの使用を要する。硝酸レダクターゼをコードするマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）遺伝子のプロモーターの、誘導プロモーターとしての使用が特に示されているようである。ＬａｕおよびＨａｍｅｒ（１９９６）は、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子を含有するクローンに相当するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーションにより、それが、唯一の窒素源としての硝酸塩の存在下では発現され、一方、それがグルタミンの存在下では完全に抑制されることを示している。マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）由来のｎｉａ遺伝子のプロモーターの制御下にインパラトランスポザーゼを配置することにより、該酵素が合成され、ついで、該欠損因子が、該復帰突然変異体の選択のための条件下（ＭＮＯ３培地）で切除され、豊富な培地（アンモニウムまたはグルタミンの存在下）上でそれを培養した場合に該復帰突然変異体が得られたら、その産生が抑制されうるはずである。
【００７０】
１．入手可能な構築物
ｐＨＩＮプラスミドはｐＮｉ１６０から誘導される。そのプラスミドにおいては、インパラ因子にコードされたトランスポザーゼが、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＴｒｐＣ遺伝子の制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ遺伝子）で置換されている。その構築はＨｕａ−Ｖａｎ，１９９８に記載されている。該トランスポゾンのＩＴＲ中のｈｐｈ遺伝子の存在は、得られた復帰突然変異体のゲノム内への該欠損因子の組込みを保証しうる。
【００７１】
ｐＥＯ６プラスミドは、ＮｃｏＩ部位を含有するプライマーを使用するＰＣＲにより得られたインパラトランスポザーゼをコードするＯＲＦで、β−グルクロニダーゼをコードするＯＲＦを置換した後に、ｐＮＯＭ１０２プラスミドから誘導される。このプラスミドは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の構成的ｇｐｄプロモーターおよびＴｒｐＣターミネーターの制御下でのトランスポザーゼの発現を可能にする（図１０）。
【００７２】
２．調製する構築物
ｐＨＮｉＬプラスミドはｐＨＩＮプラスミドから誘導される。それは、ｈｐｈで標識された欠損インパラコピーを導入するｐＨＩＮ由来の２．８ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片でｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩの１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片を置換することにより構築した。ｐＮｉＬ１６０の場合と同様に、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）は、その１．３ｋｂ長のプロモーターの制御下にある（図１１）。本発明者らの結果によれば、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）における硝酸レダクターゼ活性を回復させることにより該欠損因子の切除を選択するためにはこのプラスミドを構築することが必要である。
【００７３】
また、ｐＢＮｉＬプラスミドは、この場合にはＢａｒ遺伝子で標識された欠損因子を含有する。このベクターを構築するためには、ｎｉａＤ遺伝子の配列に隣接するインパラトランスポゾンを含有するｐＮｉＬ１６０のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片（２４７２ｂｐ）を、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩＩ断片（２２９８ｂｐ）であって該プラスミドの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを保持するものに連結する。インパラトランスポザーゼの一部に対応する８９１ｂｐの ＸｈｏＩ／ＳｔｙＩ断片をこのプラスミド上で欠失させる。このようにして線状化された該プラスミドの末端をクレノウで平滑化し、ｐＣＢ１６３５プラスミド（Ｓｗｅｉｇａｒｄら，１９９７）のＳａｌＩ消化およびクレノウにより得られたビアラフォス耐性遺伝子（Ｔｒｐｃプロモーター：：Ｂａｒ，９４０ｂｐ）に連結する。それから得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで消化し、ｐＡＮ３０１ΔＮｄｅＩプラスミドの７３９７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ断片に連結する。これにより、該トランスポゾンが欠損性でありＢａｒ遺伝子で標識されておりｎｉａＤ遺伝子のプロモーター（１．３ｋｂ）内に挿入されたｐＢＮｉＬプラスミドが得られる（図１２）。
【００７４】
ｐＦＡＣＩｍｐプラスミドはインパラトランスポゾンをその右ＩＴＲ内に保持しており、それはもはや転位できず該トランスポザーゼ源のままである。該因子をＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ二重消化によりｐＮｉ１６０プラスミドから切除し、該末端をクレノウで平滑化し、該断片をｐＦＡＣ１のＢｇｌＩＩ部位においてクローニングする（図１３）。
【００７５】
３．マグナポルセ・グリセアにおけるこれらのプラスミドの用途
マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）Ｇ１１．１７４由来のプロトプラストをｐＨＮｉＬプラスミドで形質転換するか、またはｐＨＮｉＬおよびｐＥＯ６プラスミドで同時形質転換した。該形質転換方法はＳｗｅｉｇａｒｄら（１９９２）に記載されており、１μｇの各プラスミドで行なった。該プロトプラストを、グルコースがスクロース（４００μｇ．１−１）で置換され２４０μｇ．ｍｌ−１の比率でハイグロマイシンで補足されたＴＮＫＹＥ培地上で選択する。該ｐＨＮｉＬ形質転換体を、該欠損因子中の該耐性マーカーの存在に基づき直接的に選択する。該同時形質転換体を、それらのゲノムＤＮＡの抽出後、ＩＶ．３に記載のＳＰＥ５プライマーを使用する増幅によりハイグロマイシン耐性コロニーから単離する。１２個のハイグロマイシン耐性コロニー上で行なったこの研究は、ｐＥＯ６を同様に保持する４個のコロニーの単離を可能にした。米粉に基づく固形培地上での胞子形成後、ＩＶ．３に記載のとおりにｎｉａ＋復帰突然変異体を選択するために、これらの同時形質転換体の及びｐＨＮｉＬを保持する６個の形質転換体の胞子（１０５〜１０６個）をＭＮＯ３培地上でプレーティングした。ｐＨＮｉＬを保持する６個の形質転換体はいずれも、そのような復帰突然変異体を与えなかった。これは、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に内因性のインパラの欠損コピーが、トランスポゾンにより可動しえないことを示している。それらの４個のｐＨＮｉＬ／ｐＥＯ６同時形質転換体のうちの２個が気生性コロニーを与える（同時形質転換体Ｄ１およびＤ９）。Ｄ１同時形質転換体由来の６個の復帰突然変異体のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｈｙｇ１（５’ＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧ３’）およびｈｙｇ４（５’ＣＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣ３’）プライマーの使用により得られたｈｐｈ遺伝子由来の８６８ｂｐのプローブでハイブリダイズさせた後の該復帰突然変異体のサザン分析は、それらの４個に関する該欠損因子の再挿入の特徴づけを可能にする（図１４）。後者のうちの２個の復帰突然変異体は、該因子の２個の挿入を含有する。この分析は、トランスで与えられたインパラトランスポザーゼにより該欠損因子がマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において可動されうることを示しうる。
【００７６】
４．他の構築物
第１に、それは、インパラトランスポザーゼが、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）においてクローニングされたｎｉａ遺伝子のプロモーターの制御下にあるプラスミド（ｐＮｉａＩ）を構築することを含む。このプラスミドは、ｐＨＩＮＬと共に又はそれに由来する他の任意のプラスミド（該欠損因子の挿入により不活性化されたアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤプロモーターが、該復帰突然変異体の選択に使用するマーカー遺伝子の発現を制御するもの）と共に使用される。該同時形質転換体の選択を促進するために、該因子の欠損コピーを保持するプラスミド中に存在するものとは異なる耐性マーカーをｐＮｉａＩに付加すべきである。
【００７７】
第２に、該トランスポザーゼは、構成的プロモーターの制御下、より厳密には、ｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターの制御下、該欠損因子中またはｐＨＮｉＬプラスミド中に存在するものとは異なる選択マーカーを保持するｐＦＡＣ１ベクター中にクローニングすることができる。
【００７８】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であり該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）または別の真菌、特に糸状菌由来の遺伝子のプロモーター調節配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該プロモーター調節配列が真菌性ｎｉａＤまたはｇｐｄＡ遺伝子のプロモーター調節配列よりなる、請求項１および２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的である、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列が０．４ｋｂを超える長さである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
マーカー遺伝子のコード配列が、レポーター遺伝子、特にＧＵＳまたはＧＦＰのコード配列、抗生物質または除草剤に対する耐性に関する遺伝子、特にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）または除草剤ビアラフォス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、またはスルホニル尿素耐性遺伝子のコード配列から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
該マーカー遺伝子が、真菌において機能的である酵素、特に硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）またはニトリラーゼをコードする遺伝子から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
該マーカー遺伝子が、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
該インパラトランスポゾンが、前記請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのプロモーター調節配列内に組込まれている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
該インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
該インパラトランスポゾンが欠損性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
ａ）マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内へのその再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化された該マーカー遺伝子を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
ｂ）該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法。
【請求項１３】
真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
ａ）請求項１１に記載の欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
ｂ）該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入およびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用いて、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、
ｃ）該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法。
【請求項１４】
真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同定方法であって、
ａ）請求項１２または１３に記載の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、
ｂ）前記の検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し、
ｃ）該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工程を含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主生物。
【請求項１６】
該宿主生物が真菌である、請求項１５に記載の宿主生物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドがゲノム内に組込まれている真菌。
【請求項１８】
該マーカー遺伝子が真菌硝酸レダクターゼ遺伝子であり、該真菌がｎｉａ−である、請求項１７に記載の真菌。
【請求項１９】
インパラトランスポゾンがゲノム内に組込まれた、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突然変異体。
【請求項１】
インパラ（Ｉｍｐａｌａ）トランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的であり該マーカー遺伝子のコード配列に機能的に連結されたプロモーター調節配列を転写の方向に含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）または別の真菌、特に糸状菌由来の遺伝子のプロモーター調節配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該プロモーター調節配列が真菌性ｎｉａＤまたはｇｐｄＡ遺伝子のプロモーター調節配列よりなる、請求項１および２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
該プロモーター調節配列が、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）において機能的である、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｎｉａＤ遺伝子のプロモーター調節配列が０．４ｋｂを超える長さである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
マーカー遺伝子のコード配列が、レポーター遺伝子、特にＧＵＳまたはＧＦＰのコード配列、抗生物質または除草剤に対する耐性に関する遺伝子、特にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）または除草剤ビアラフォス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、またはスルホニル尿素耐性遺伝子のコード配列から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
該マーカー遺伝子が、真菌において機能的である酵素、特に硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）またはニトリラーゼをコードする遺伝子から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
該マーカー遺伝子が、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の硝酸レダクターゼ遺伝子である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
該インパラトランスポゾンが、前記請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのプロモーター調節配列内に組込まれている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
該インパラトランスポゾンがマーカー遺伝子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
該インパラトランスポゾンが欠損性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
ａ）マーカー遺伝子のインパラトランスポゾンの切除および該真菌のゲノム内へのその再挿入を可能にする条件下、インパラトランスポゾンの挿入により不活性化された該マーカー遺伝子を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
ｂ）該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法。
【請求項１３】
真菌の挿入突然変異体の製造方法であって、
ａ）請求項１１に記載の欠損インパラトランスポゾンの挿入により不活性化されたマーカー遺伝子を含むポリヌクレオチドで該真菌を形質転換し、
ｂ）該欠損インパラトランスポゾンの切除、該真菌のゲノムにおけるその再挿入およびその安定化を可能にする条件下、発現が制御されたトランスポザーゼを用いて、該欠損インパラトランスポゾンを可動させ、
ｃ）該マーカー遺伝子を発現する挿入突然変異体を同定する工程を含んでなる製造方法。
【請求項１４】
真菌における検出可能な表現型に関連した遺伝子の同定方法であって、
ａ）請求項１２または１３に記載の製造方法の１つに従い、該真菌のゲノム内にインパラトランスポゾンを挿入することにより、挿入突然変異体を製造し、
ｂ）前記の検出可能な表現型を有する少なくとも１つの挿入突然変異体を選択し、
ｃ）該インパラトランスポゾンが内部に又は近傍に挿入された遺伝子を単離する工程を含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主生物。
【請求項１６】
該宿主生物が真菌である、請求項１５に記載の宿主生物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドがゲノム内に組込まれている真菌。
【請求項１８】
該マーカー遺伝子が真菌硝酸レダクターゼ遺伝子であり、該真菌がｎｉａ−である、請求項１７に記載の真菌。
【請求項１９】
インパラトランスポゾンがゲノム内に組込まれた、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌から選ばれる糸状菌の挿入突然変異体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−８７５９６（Ｐ２０１１−８７５９６Ａ）
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８８１９５（Ｐ２０１０−２８８１９５）
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２０００−６０６７６１（Ｐ２０００−６０６７６１）の分割
【原出願日】平成１２年３月２２日（２０００．３．２２）
【出願人】（５１００８７９３３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２０００−６０６７６１（Ｐ２０００−６０６７６１）の分割
【原出願日】平成１２年３月２２日（２０００．３．２２）
【出願人】（５１００８７９３３）
【Ｆターム（参考）】
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