マンノシルアルジトールリピッド及びその製造方法
【課題】糖構造の異なる種々のマンノシルアルジトールリピッド、及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化1】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)及びその製造方法。
【解決手段】下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化1】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)及びその製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マンノースと糖アルコールを構成要素とする二糖類と脂肪酸とが結合したマンノシルアルジトールリピッド、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖脂質は、脂質に1〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤(バイオサーファクタント)が利用されていた。近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となっている。現在、一般に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで考慮すると、数千種類にものぼる。親水基・疎水基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じでも分子量や立体構造の違いによって親水性疎水性バランス(HLB)の異なる同族体など、あらゆる化合物が開発されており、これらを単一種類で用いるだけでなく、混合して用いることで、幅広い産業分野において要求される性能に対応している。しかしながら、このような合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。従って、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性剤の開発が望まれている。
【0003】
微生物などが生産する界面活性物質であるバイオサーファクントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く応用することは、環境調和型の社会を実現し、高機能な製品を提供する上で極めて有意義である。また、バイオサーファクタントの幅広い普及を図るためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、20数種類と少なく、新規のバイオサーファクタントの発見が望まれている。さらに、構造・組成に多くのバリエーションを持たせ、これらを組み合わせて機能を緻密に制御することが極めて重要である。
【0004】
微生物が生産する界面活性物質は、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の5つに分類されている。なかでも、糖脂質系の界面活性物質については最もよく研究されており、酵母が生産する糖脂質系の界面活性物質としてソホロースリピッド(特許文献1参照)やマンノシルエリスリトールリピッド(下記非特許文献1から6参照)などが知られている。
【0005】
マンノシルエリスリトールリピッド(mannosyl erythritol lipid:MEL)は、界面活性能以外にも抗微生物活性、白血病細胞、神経系細胞などの細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など多様な機能が知られている。MELの生産はこれまで酵母を中心に多くの報告があり、生産量向上を目的として菌株の選択、培養条件、培地組成が検討されている(非特許文献1から6)。
【0006】
これまでMEL生産には、カンジダ(Candia属)酵母(非特許文献1から6、特許文献2)のほか、Pseudozyma aphidis(非特許文献7)、Pseudozyma rugulosa (非特許文献8)、Pseudozyma antarctica(非特許文献9)、Pseudozyma parantarctica(非特許文献10)などのシューザイマ(Pseudozyma)属酵母が利用されている。
【0007】
マンノシルアルジトールリピッドは糖骨格としてマンノースと糖アルコール及び脂肪酸誘導体から成る糖脂質の総称であり、上記のマンノシルエリスリトールリピッドはマンノシルアルジトールリピッドの一種である。マンノシルエリスリトールリピッドの他には、マンノシルマンニトールリピッドが報告されている(特許文献3参照)。しかしながら、マンノシルアルジトールリピッドの中で、生産効率が高く、実用化可能なものは、マンノシルエリスリトールリピッドに限られているのが現状である。
【0008】
上記のマンノシルエリスリトールリピッドの機能は、糖骨格の構造によるものと考えられている。従って、糖構造の異なるマンノシルアルジトールリピッドの製造技術の開発は、マンノシルアルジトールリピッドの新機能開拓及び応用分野の拡大に貢献するものとして期待される。
【0009】
【特許文献1】特開2002−45195公報
【特許文献2】特開2002−101847号公報
【特許文献3】特開2005−104837号公報
【非特許文献1】T. Nakahara,H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi:J. Ferment. Technol., 61, 19 (1983)
【非特許文献2】H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi:J. Ferment. Technol., 61, 143(1983)
【非特許文献3】D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi:Agric. Biol. Chem., 54, 31 (1990)
【非特許文献4】D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi:Agric. Biol. Chem., 54, 37 (1990)
【非特許文献5】D. Kitamoto, K. Fujishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T.Nakahara:Biotechnol. Lett., 14, 305 (1992)
【非特許文献6】金,伊炳大,桂樹徹,谷吉樹:平成10年日本生物工学会大会要旨,p.195
【非特許文献7】Rau U, Nguyen LA, Roeper H, Koch H, Lang S.: Appl Microbiol Biotechnol., 68(5),607-13 (2005)
【非特許文献8】T. Morita, M. Konishi, T. Fukuoka, T. Imura and D. Kitamota:Appl. Microbiol. Biotechnol., 73, 305 (2006)
【非特許文献9】D. Kitamoto, T. Ikegami, T.G. Suzuki, A. Sasaki, Y. Takeyama, N. Koura and H. Yanagishita:Biotechnol. Lett., 23, 1709 (2001)
【非特許文献10】T. Morita, M. Konishi, T. Fukuoka, T. Imura, H.K. Kitamoto and D. Kitamota:FEMS Yeast Res., 7, 286 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
従って、本発明の課題は、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、糖構造の異なる種々のマンノシルアルジトールリピッド、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、植物油脂等の油脂類と糖アルコールを含有する培地で、公知のマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルエリスリトールリピッド(MEL)を生産可能な微生物を培養することによって、マンノシルアルジトールリピッドの糖骨格を任意に制御することが可能であり、新規なマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルソルビトールリピッド、マンノシルリビトールリピッド、マンノシルアラビトールリピッド、また公知のマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルマンニトールリピッドを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【0013】
【化1】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)
【0014】
(2) 下記式(II)で表される、マンノースとソルビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化2】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0015】
(3) 下記式(III)で表される、マンノースとリビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化3】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0016】
(4) 下記式(IV)で表される、マンノースとアラビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化4】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0017】
(5) R1とR2が炭素数6〜20の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、(1)〜(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
(6) R1とR2が炭素数6〜20の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、(1)〜(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
(7) R1とR2が炭素数6〜20の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする、(1)〜(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
(8) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及び糖アルコールを加えた培地に培養し、培養物から(1)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(9) 培養開始時における、培地中の油脂類濃度が2〜20重量%、糖アルコール濃度が1〜20重量%である、(8)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(10) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂及びソルビトールを加えた培地に培養し、培養物から(2)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(11) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂及びリビトールを加えた培地に培養し、培養物から(3)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(12) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂及びアラビトールを加えた培地に培養し、培養物から(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(13) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)に属する微生物であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(14) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(15)シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ(Pseudozyma rugulosa)NBRC 10877株であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(16) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)JCM 10317株またはシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34 株(FERM P-20730) であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、公知のマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物を、植物油脂等の油脂類の他に、糖アルコールを含有する培地で培養することで、マンノースと培地中に含有する糖アルコールを構成要素とする二糖類(糖と糖アルコールから構成される二糖類)と脂肪酸が結合したマンノシルアルジトールリピッドを、効率よく製造できる。特に、シュードザイマ属に属する微生物であるシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株を使用する場合には、本発明の新規なマンノシルアルジトールリピッドの生産量が高く、かつ、培地含有の糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドと極性の類似するタイプのマンノシルエリスリトールの生産量が少ないため、結果として培地中に含有する糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドの分離精製に有利である。
【0019】
従って、本発明は、医薬等種々用途への使用が期待される糖脂質バイオサーファクタントの製造技術の発展に大いに貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0020】
以下、本発明を詳細に説明する。
1.マンノシルアルジトールリピッド
本発明のマンノシルアルジトールリピッドは、下記(1)〜(4)のマンノシルアルジトールリピッドであり、界面張力の低下能を有する新規構造のバイオサーファクタントである。
【0021】
(1)下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド:
【化5】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)
【0022】
(2)下記式(II)で表される、マンノースとソルビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド:
【化6】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0023】
(3)下記式(III)で表される、マンノースとリビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化7】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0024】
(4) 下記式(IV)で表される、マンノースとアラビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化8】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0025】
上記各式中、R1とR2の「炭素数6〜20の脂肪族アシル基」には、炭素数6〜20の直鎖飽和脂肪族アシル基、炭素数6〜20の直鎖不飽和脂肪族アシル基、炭素数6〜20の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物が含まれる。
【0026】
2.使用微生物
本発明のマンノシルアルジトールリピッド生産に使用する微生物は、マンノシルアルジトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ属に属する微生物が挙げられる。シュードザイマ属に属する微生物としては、例えば、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株、シュードザイマ・ルギュローサ(Pseudozyma rugulosa)NBRC 10877株、シュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)JCM 10317株、シュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34 株(FERM P-20730)などが挙げられ、なかでも、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株が好ましい。
【0027】
該微生物はマンノシルエリスリトールを高効率で生産可能な微生物として知られているもので、本発明者等により、本発明の新規なマンノシルアルジトールリピッドの製造に適していることが初めて確認されたものである。すなわち、このシュードザイマ・パラアンタクティカに属する微生物は、本発明の新規なマンノシルアルジトールリピッドの生産量が高く、かつ、培地含有の糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドと極性の類似するタイプのマンノシルエリスリトールの生産量が少ないため、結果として培地中に含有する糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドの分離精製に有利な培養物を生じる。
【0028】
3.マンノシルアルジトールリピッドの製造
上記微生物を、炭素源として油脂類と糖アルコールを含む培地にて培養することにより培養物中に前記式(I)〜(IV)で表されるマンノシルアルジトールリピッドを製造することができる。
上記培養に用いる培地には、炭素源として油脂類と糖アルコールを添加する以外については特に制限はなく、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、YPD培地(イーストイクストラクト10g、 ポリペプトン20g、及びグルコース100g)を挙げることができる。
【0029】
油脂類としては、前記式(I)〜(IV)で表されるマンノシルアルジトールリピッドのマンノース部分の水酸基とエステル結合しうる脂肪酸残基を提供できるものあれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。油脂類は、植物油脂または動物油脂等のいずれでもよく、植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、オリーブ油が好ましい。動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、1種を単独でまたは2種以上を適宜混合して用いてもよい。これらの油脂類のうち、植物油脂が好ましく、オリーブ油が特に好ましい。
また、油脂類に代えて、トリグリセリド、脂肪族炭化水素、脂肪酸を用いてもよい。
【0030】
上記トリグリセリドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、炭素数6〜24の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドが好ましい。
【0031】
上記脂肪族炭化水素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、炭素数が6〜24の脂肪族炭化水素が好ましく、さらにそれぞれの分子内に1〜3箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ドデカン、ヘキサデカン、オクタデカン等の飽和炭化水素、あるいは1−ペンタデセン(C15H30)、1−ヘプタデセン(C17H34)等の不飽和炭化水素、及びそれら混合物、好ましくは炭素数14〜20の飽和あるいは不飽和炭化水素及びそれらの混合物、さらに好ましくはオクタデカンを主成分とする混合物を用いることができる。
【0032】
脂肪酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、炭素数は6〜24の脂肪酸が好ましく、さらにそれぞれの分子内に1〜3箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸、あるいはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸及びそれら混合物、好ましくは炭素数14〜20の飽和または不飽和脂肪酸及びそれらの混合物、さらに好ましくはリノール酸及びリノール酸を主成分とする混合物を用いる。
【0033】
また、脂肪酸部分を構成する上記の炭素源以外に、通常の酵母の培養において栄養源なる炭素源、たとえば、炭水化物(グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等)、有機酸(酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等)を用いてもよい。
【0034】
一方、糖アルコールは、前記(II)から(IV)のマンノシルアルジトールリピッド生産に応じ、それぞれソルビトール、リビトール、アラビトールを用いる。
【0035】
本発明方法において、マンノシルアルジトールリピッドの生産量を増加させるためには培地に添加する糖アルコールや油脂類の供給量を増加させることが好ましいが、これは、生産物であるマンノシルアルジトールリピッドの前駆体物質となる糖アルコール、脂肪酸を、酵母が細胞内で新たに合成することなく、直接取り込んで利用できるためと考えられる。良好なマンノシルアルジトールリピッドの生産速度、生産量、及び収率を得る上で、培養開始時の培養液中の糖アルコール濃度は少なくとも1重量%以上、好ましくは1〜20重量%、より好ましくは5〜10重量%であり、また、培養開始時の培養液中の油脂類濃度は少なくとも2重量%以上、好ましくは2〜20重量%、よが好ましくは4〜10重量%である。また、必要に応じて、培養の途中で添加したり、一定濃度で制御する蓄次添加を行ってもよい。
【0036】
培地に添加する上記の炭素源以外の他の成分としては、当該技術分野で通常用いられる窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、またはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【0037】
培養温度は、20〜36℃、好ましくは26〜36℃、より好ましくは34℃である。培養日数としては、マンノシルアルジトールリピッド生産量に応じて適宜設定すればよいが、3〜20日間が好ましい。培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。良好な微生物の生育及びマンノシルアルジトールリピッドの生産のためには、培養液に酸素を供給することが好ましく、そのためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するか、振とう培養を行えばよい。
【0038】
本発明において、前記微生物菌株を用いてマンノシルアルジトールリピッドを生産する場合、増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりのマンノシルエリスリトールリピッド生産量が高くなるため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これを本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。例えば、種培養、本培養及びマンノシルアルジトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における、具体的な培地組成、培養条件を例示すると以下のとおりである。
【0039】
グルコース5〜40g/L、好ましくは20g/L、酵母エキス0.5〜2g/L、好ましくは1g/L、硝酸ナトリウム1〜5g/L、好ましくは3g/L、リン酸2水素カリウム0.1〜1g/L、好ましくは0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.1〜1g/L、好ましくは0.3g/Lの組成の液体培地2mLが入った試験管に、保存菌株を1白金耳接種し、26〜30℃で1〜3日振とう培養を行う(種培養)。次に、20〜300g/L、好ましくは40〜100g/Lの植物油脂等の油脂類、40〜200g/L、好ましくは80〜160g/Lの糖アルコールを加えた上記と同じ組成の液体培地30mLの入った坂口フラスコに上記の種培養を行った培養液を接種して、26〜36℃、好ましくは34℃で1〜7日間振とう培養を行う(本培養)。さらに、上記の本培養と同じ組成の液体培地0.5Lが入ったジャーファメンターに上記の本培養を行った培養液を接種して、26〜35℃、好ましくは34℃で1〜2L/分の通気速度と600〜1000rpmの撹拌速度で3〜20日間培養する(マンノシルアルジトールリピッド生産培養)。
【0040】
微生物菌株の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地1Lあたり、10〜200ml、好ましくは50〜100mlの種培養液あるいは本培養液中に含まれる量であればよい。
【0041】
本発明における培養は、培養液中の所望のマンノシルアルジトールリピッド生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中の目的とするマンノシルアルジトールリピッドをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。
【0042】
培養液中に蓄積されたマンノシルアルジトールリピッドは、培養終了後、培養液を抽出することによって取得できる。抽出は、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて行う。抽出は当該分野において通常行われる方法に従って行えばよく、例えば、培養液1Lあたり0.5〜1.5L程度の有機溶媒を用いて1〜数回抽出し、酢酸エチル層を合わせて溶媒を留去する。
【0043】
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物(例えば、菌体破砕物)などをいう。
【0044】
微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖(アセチルセルロース、アガロース)、無機物質(多孔質ガラス、金属酸化物)、合成高分子(ポリアクリルアミド、ポリスチレン)等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖(アルギン酸、カラギーナン)、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【0045】
前述のようにして培養液から単離精製したマンノシルアルジトールリピッドの構造決定は、TLCプレート上でアンスロン硫酸試薬にて青緑色に呈色することを確認後、13C NMR と1H NMR 解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知の下記式(V)で示されるマンノシルエリスリトールリピッドのスペクトルとを比較することより行うことができる。
【0046】
【化9】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0047】
また、マンノシルアルジトールリピッドの糖組成の決定は、NMR解析結果を、上記の従来型マンノシルエリスリトールリピッドと比較することにより行う。さらに、マンノシルアルジトールリピッドの脂質成分を3M塩酸中、80℃で分解後、水溶性成分を高速液体クロマトグラフィーで分析し、上記NMR解析の結果と合わせてその糖鎖部分の構造を確認する。
【実施例】
【0048】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0049】
(実施例1)マンノシルマンニトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を以下のようにして行った。
a)保存培地(麦芽エキス3g/L、酵母エキス3g/L、ペプトン5g/Lグルコース10g/L、寒天30g/L)に保存しておいたシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株を、グルコース20g/L、酵母エキス1g/L、硝酸ナトリウム3g/L、リン酸2水素カリウム0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.3g/Lの組成の液体培地2mLが入った試験管に1白金耳接種し、30℃で1日間振とう培養を行った。
b)続いて、得られた菌体培養液を、植物油脂としてオリーブ油50g/L、糖アルコールとしてマンニトール100g/L、酵母エキス1g/L、硝酸ナトリウム3g/L、リン酸2水素カリウム0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.3g/Lの組成の液体培地30mLの入った坂口フラスコに接種して、34℃で7日間培養を行った。
【0050】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。このとき、公知のマンノシルエリスリトールリピッド生産酵母である、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株、Pseudozyma antarctica JCM 10317株、Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) 株を上記と培養温度が30℃である以外は同じ条件で培養し、同様にして薄層クロマトグラフィーを行った。
結果を図1に示す。なお、図中、左端はマンノシルエリスリトールリピッドの標準であり、MEL-Aは、前記一般式(V)中、R1とR2が炭素原子数1〜14の脂肪酸残基、R3とR4がアセチル基である化合物、MEL-Bは、前記一般式(V)中、R1とR2が炭素原子数1〜14の脂肪酸残基、R3が水素原子、R4がアセチル基である化合物、MEL-Cは、前記一般式(V)中、R1とR2が炭素原子数1〜14の脂肪酸残基、R3がアセチル基、R4が水素原子である化合物を示す。
図1に示されるように、全ての酵母株がオリーブ油含有培地でマンノシルエリスリトールリピッド(MEL)を生産することが確認できた。さらに、MEL-Cの下方に構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に検出されていることがわかった。
【0051】
(3) 高速液体クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、そのマンノシルエリスリトールリピッド生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。結果を図2に示す。なお、図2は、培養液中の酢酸エチル可溶分を高速液体クロマトグラフィーで検出した結果である。図2に示されるうように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株は、MEL-Cより保持時間の長い構造不明のマンノシルアルジトールリピッドを生産することが確認できた。このとき、初発の培地中(30ml)には1.5 g のオリーブ油と3 g のマンニトールが含まれており、MEL-Aの検量線を用いて HPLC の結果からMEL-Aと構造不明のマンノシルアルジトールリピッドの生産量を算出したところ、MEL-Aの生産量は0.9g、構造不明のマンノシルアルジトールリピッドの生産量は0.3 gであった。
【0052】
(4) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図3、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図3に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR 解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は6個であり、培地中に含有するマンニトールに由来するものと考えられた。
【0053】
(5) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図4に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 11752の培養液抽出物には、マンノースとマンニトールが含まれていた。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された(図4C)。
【0054】
以上の解析結果から、Pseudozyma parantarctica JCM 11752が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルマンニトールリピッドであることがわかった。この構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、図1によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株、Pseudozyma antarctica JCM 10317株、Pseudozyma antarctica KM-34(FERM P-20730) 株の培養物にも確認できたので、これらの菌株もまた、マンノシルマンニトールリピッドを生産していることがわかった。なかでも、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株はMEL-Cの生産量が少ないため、マンノシルマンニトールリピッドの精製が容易であるといえる。
【0055】
(実施例2)植物油脂及び糖アルコールの濃度条件
実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を行ない、培養後、培養液を採取し、そのマンノシルマンニトールリピッド生産量を高速液体クロマトグラフィーで定量した。このとき、培養液中の植物油脂及び糖アルコールの濃度はそれぞれ図中に記載した通りである。結果を図5に示す。この結果によれば、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株によるマンノシルマンニトールリピッドの生産において、最適な植物油脂濃度は40g/L であり、最適なマンニトール濃度は80g/L である。
【0056】
(実施例3)マンノシルアラビトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
実施例1(1)(b)の培養を糖アルコールとしてアラビトール100g/Lを含む培地で行う以外は、実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica) JCM 11752株の培養を行った。
【0057】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。結果を図6に示す。図6に示されるように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica) JCM 11752株をオリーブ油とアラビトール含有培地で培養して得られた培養液中には、MEL-B様の構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に存在することが確認できた。
【0058】
(3) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図7、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図7に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR 解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は5個であり、培地中に含有するアラビトールに由来するものと考えられた。
【0059】
(4) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図8に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養液抽出物には、マンノースとアラビトールが含まれており、上記構造不明のマンノシルアルジトールリピッドがマンノシルアラビトールリピッドであることがわかった(図8C)。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された。また、塩酸処理における未分解物としてマンノシルエリスリトールが検出された。
【0060】
(実施例4)マンノシルリビトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
実施例1(1)(b)の培養を糖アルコールとしてリビトール100g/Lを含む培地で行う以外は、実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を行った。
【0061】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。結果を図9に示す。図9に示されるように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株をオリーブ油とリビトール含有培地で培養して得られた培養液中には、MEL-B様の構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に存在することが確認できた。
【0062】
(3) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図10、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図10に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は5個であり、培地中に含有するリビトールに由来するものと考えられた。
【0063】
(4) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図11に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養液抽出物には、マンノースとリビトールが含まれており、上記構造不明のマンノシルアルジトールリピッドがマンノシルリビトールリピッドであることがわかった(図11C)。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された。また、塩酸処理における未分解物としてマンノシルエリスリトールが検出された。
【0064】
(実施例5)マンノシルソルビトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
実施例1(1)(b)の培養を糖アルコールとしてソルビトール100g/Lを含む培地で行う以外は、実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を行った。
【0065】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。結果を図12に示す。図12に示されるように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株をオリーブ油とソルビトール含有培地で培養して得られた培養液中には、MEL-Cの下方にTLCのスポットを与える構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に存在することが確認できた。
【0066】
(3) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図13、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図13に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は6個であり、培地中に含有するソルビトールに由来するものと考えられた。
【0067】
(4) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図14に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 117522株の培養液抽出物には、マンノースとソルビトールが含まれており、上記構造不明のマンノシルアルジトールリピッドがマンノシルソルビトールリピッドであることがわかった(図14C)。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株、Pseudozyma antarctica KM-34(FERM P-20730) 株、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株、Pseudozyma antarctica JCM 10317株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図2】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての高速液体クロマトグラフィーの分析結果である。
【図3】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図4】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【図5】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株によるマンノシルマンニトールリピッドの生産に対する植物性油脂及びマンニトール濃度の影響を示すグラフである。
【図6】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びアラビトール含有培地でマンノシルアラビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図7】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びアラビトール含有培地でマンノシルアラビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図8】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びアラビトール含有培地でマンノシルアラビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【図9】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びリビトール含有培地でマンノシルリビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図10】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びリビトール含有培地でマンノシルリビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図11】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びリビトール含有培地でマンノシルリビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【図12】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びソルビトール含有培地でマンノシルソルビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図13】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びソルビトール含有培地でマンノシルソルビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図14】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びソルビトール含有培地でマンノシルソルビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【技術分野】
【0001】
本発明は、マンノースと糖アルコールを構成要素とする二糖類と脂肪酸とが結合したマンノシルアルジトールリピッド、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖脂質は、脂質に1〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤(バイオサーファクタント)が利用されていた。近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となっている。現在、一般に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで考慮すると、数千種類にものぼる。親水基・疎水基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じでも分子量や立体構造の違いによって親水性疎水性バランス(HLB)の異なる同族体など、あらゆる化合物が開発されており、これらを単一種類で用いるだけでなく、混合して用いることで、幅広い産業分野において要求される性能に対応している。しかしながら、このような合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。従って、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性剤の開発が望まれている。
【0003】
微生物などが生産する界面活性物質であるバイオサーファクントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く応用することは、環境調和型の社会を実現し、高機能な製品を提供する上で極めて有意義である。また、バイオサーファクタントの幅広い普及を図るためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、20数種類と少なく、新規のバイオサーファクタントの発見が望まれている。さらに、構造・組成に多くのバリエーションを持たせ、これらを組み合わせて機能を緻密に制御することが極めて重要である。
【0004】
微生物が生産する界面活性物質は、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の5つに分類されている。なかでも、糖脂質系の界面活性物質については最もよく研究されており、酵母が生産する糖脂質系の界面活性物質としてソホロースリピッド(特許文献1参照)やマンノシルエリスリトールリピッド(下記非特許文献1から6参照)などが知られている。
【0005】
マンノシルエリスリトールリピッド(mannosyl erythritol lipid:MEL)は、界面活性能以外にも抗微生物活性、白血病細胞、神経系細胞などの細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など多様な機能が知られている。MELの生産はこれまで酵母を中心に多くの報告があり、生産量向上を目的として菌株の選択、培養条件、培地組成が検討されている(非特許文献1から6)。
【0006】
これまでMEL生産には、カンジダ(Candia属)酵母(非特許文献1から6、特許文献2)のほか、Pseudozyma aphidis(非特許文献7)、Pseudozyma rugulosa (非特許文献8)、Pseudozyma antarctica(非特許文献9)、Pseudozyma parantarctica(非特許文献10)などのシューザイマ(Pseudozyma)属酵母が利用されている。
【0007】
マンノシルアルジトールリピッドは糖骨格としてマンノースと糖アルコール及び脂肪酸誘導体から成る糖脂質の総称であり、上記のマンノシルエリスリトールリピッドはマンノシルアルジトールリピッドの一種である。マンノシルエリスリトールリピッドの他には、マンノシルマンニトールリピッドが報告されている(特許文献3参照)。しかしながら、マンノシルアルジトールリピッドの中で、生産効率が高く、実用化可能なものは、マンノシルエリスリトールリピッドに限られているのが現状である。
【0008】
上記のマンノシルエリスリトールリピッドの機能は、糖骨格の構造によるものと考えられている。従って、糖構造の異なるマンノシルアルジトールリピッドの製造技術の開発は、マンノシルアルジトールリピッドの新機能開拓及び応用分野の拡大に貢献するものとして期待される。
【0009】
【特許文献1】特開2002−45195公報
【特許文献2】特開2002−101847号公報
【特許文献3】特開2005−104837号公報
【非特許文献1】T. Nakahara,H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi:J. Ferment. Technol., 61, 19 (1983)
【非特許文献2】H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi:J. Ferment. Technol., 61, 143(1983)
【非特許文献3】D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi:Agric. Biol. Chem., 54, 31 (1990)
【非特許文献4】D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi:Agric. Biol. Chem., 54, 37 (1990)
【非特許文献5】D. Kitamoto, K. Fujishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T.Nakahara:Biotechnol. Lett., 14, 305 (1992)
【非特許文献6】金,伊炳大,桂樹徹,谷吉樹:平成10年日本生物工学会大会要旨,p.195
【非特許文献7】Rau U, Nguyen LA, Roeper H, Koch H, Lang S.: Appl Microbiol Biotechnol., 68(5),607-13 (2005)
【非特許文献8】T. Morita, M. Konishi, T. Fukuoka, T. Imura and D. Kitamota:Appl. Microbiol. Biotechnol., 73, 305 (2006)
【非特許文献9】D. Kitamoto, T. Ikegami, T.G. Suzuki, A. Sasaki, Y. Takeyama, N. Koura and H. Yanagishita:Biotechnol. Lett., 23, 1709 (2001)
【非特許文献10】T. Morita, M. Konishi, T. Fukuoka, T. Imura, H.K. Kitamoto and D. Kitamota:FEMS Yeast Res., 7, 286 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
従って、本発明の課題は、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、糖構造の異なる種々のマンノシルアルジトールリピッド、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、植物油脂等の油脂類と糖アルコールを含有する培地で、公知のマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルエリスリトールリピッド(MEL)を生産可能な微生物を培養することによって、マンノシルアルジトールリピッドの糖骨格を任意に制御することが可能であり、新規なマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルソルビトールリピッド、マンノシルリビトールリピッド、マンノシルアラビトールリピッド、また公知のマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルマンニトールリピッドを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【0013】
【化1】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)
【0014】
(2) 下記式(II)で表される、マンノースとソルビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化2】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0015】
(3) 下記式(III)で表される、マンノースとリビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化3】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0016】
(4) 下記式(IV)で表される、マンノースとアラビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化4】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0017】
(5) R1とR2が炭素数6〜20の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、(1)〜(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
(6) R1とR2が炭素数6〜20の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、(1)〜(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
(7) R1とR2が炭素数6〜20の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする、(1)〜(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
(8) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及び糖アルコールを加えた培地に培養し、培養物から(1)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(9) 培養開始時における、培地中の油脂類濃度が2〜20重量%、糖アルコール濃度が1〜20重量%である、(8)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(10) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂及びソルビトールを加えた培地に培養し、培養物から(2)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(11) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂及びリビトールを加えた培地に培養し、培養物から(3)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(12) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂及びアラビトールを加えた培地に培養し、培養物から(4)に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(13) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)に属する微生物であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(14) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(15)シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ(Pseudozyma rugulosa)NBRC 10877株であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
(16) シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)JCM 10317株またはシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34 株(FERM P-20730) であることを特徴とする、(8)〜(12)に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、公知のマンノシルアルジトールリピッドであるマンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物を、植物油脂等の油脂類の他に、糖アルコールを含有する培地で培養することで、マンノースと培地中に含有する糖アルコールを構成要素とする二糖類(糖と糖アルコールから構成される二糖類)と脂肪酸が結合したマンノシルアルジトールリピッドを、効率よく製造できる。特に、シュードザイマ属に属する微生物であるシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株を使用する場合には、本発明の新規なマンノシルアルジトールリピッドの生産量が高く、かつ、培地含有の糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドと極性の類似するタイプのマンノシルエリスリトールの生産量が少ないため、結果として培地中に含有する糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドの分離精製に有利である。
【0019】
従って、本発明は、医薬等種々用途への使用が期待される糖脂質バイオサーファクタントの製造技術の発展に大いに貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0020】
以下、本発明を詳細に説明する。
1.マンノシルアルジトールリピッド
本発明のマンノシルアルジトールリピッドは、下記(1)〜(4)のマンノシルアルジトールリピッドであり、界面張力の低下能を有する新規構造のバイオサーファクタントである。
【0021】
(1)下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド:
【化5】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)
【0022】
(2)下記式(II)で表される、マンノースとソルビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド:
【化6】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0023】
(3)下記式(III)で表される、マンノースとリビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化7】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0024】
(4) 下記式(IV)で表される、マンノースとアラビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化8】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0025】
上記各式中、R1とR2の「炭素数6〜20の脂肪族アシル基」には、炭素数6〜20の直鎖飽和脂肪族アシル基、炭素数6〜20の直鎖不飽和脂肪族アシル基、炭素数6〜20の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物が含まれる。
【0026】
2.使用微生物
本発明のマンノシルアルジトールリピッド生産に使用する微生物は、マンノシルアルジトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ属に属する微生物が挙げられる。シュードザイマ属に属する微生物としては、例えば、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株、シュードザイマ・ルギュローサ(Pseudozyma rugulosa)NBRC 10877株、シュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)JCM 10317株、シュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34 株(FERM P-20730)などが挙げられ、なかでも、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株が好ましい。
【0027】
該微生物はマンノシルエリスリトールを高効率で生産可能な微生物として知られているもので、本発明者等により、本発明の新規なマンノシルアルジトールリピッドの製造に適していることが初めて確認されたものである。すなわち、このシュードザイマ・パラアンタクティカに属する微生物は、本発明の新規なマンノシルアルジトールリピッドの生産量が高く、かつ、培地含有の糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドと極性の類似するタイプのマンノシルエリスリトールの生産量が少ないため、結果として培地中に含有する糖アルコールを構成要素とするマンノシルアルジトールリピッドの分離精製に有利な培養物を生じる。
【0028】
3.マンノシルアルジトールリピッドの製造
上記微生物を、炭素源として油脂類と糖アルコールを含む培地にて培養することにより培養物中に前記式(I)〜(IV)で表されるマンノシルアルジトールリピッドを製造することができる。
上記培養に用いる培地には、炭素源として油脂類と糖アルコールを添加する以外については特に制限はなく、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、YPD培地(イーストイクストラクト10g、 ポリペプトン20g、及びグルコース100g)を挙げることができる。
【0029】
油脂類としては、前記式(I)〜(IV)で表されるマンノシルアルジトールリピッドのマンノース部分の水酸基とエステル結合しうる脂肪酸残基を提供できるものあれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。油脂類は、植物油脂または動物油脂等のいずれでもよく、植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、オリーブ油が好ましい。動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、1種を単独でまたは2種以上を適宜混合して用いてもよい。これらの油脂類のうち、植物油脂が好ましく、オリーブ油が特に好ましい。
また、油脂類に代えて、トリグリセリド、脂肪族炭化水素、脂肪酸を用いてもよい。
【0030】
上記トリグリセリドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、炭素数6〜24の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドが好ましい。
【0031】
上記脂肪族炭化水素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、炭素数が6〜24の脂肪族炭化水素が好ましく、さらにそれぞれの分子内に1〜3箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ドデカン、ヘキサデカン、オクタデカン等の飽和炭化水素、あるいは1−ペンタデセン(C15H30)、1−ヘプタデセン(C17H34)等の不飽和炭化水素、及びそれら混合物、好ましくは炭素数14〜20の飽和あるいは不飽和炭化水素及びそれらの混合物、さらに好ましくはオクタデカンを主成分とする混合物を用いることができる。
【0032】
脂肪酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、炭素数は6〜24の脂肪酸が好ましく、さらにそれぞれの分子内に1〜3箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸、あるいはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸及びそれら混合物、好ましくは炭素数14〜20の飽和または不飽和脂肪酸及びそれらの混合物、さらに好ましくはリノール酸及びリノール酸を主成分とする混合物を用いる。
【0033】
また、脂肪酸部分を構成する上記の炭素源以外に、通常の酵母の培養において栄養源なる炭素源、たとえば、炭水化物(グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等)、有機酸(酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等)を用いてもよい。
【0034】
一方、糖アルコールは、前記(II)から(IV)のマンノシルアルジトールリピッド生産に応じ、それぞれソルビトール、リビトール、アラビトールを用いる。
【0035】
本発明方法において、マンノシルアルジトールリピッドの生産量を増加させるためには培地に添加する糖アルコールや油脂類の供給量を増加させることが好ましいが、これは、生産物であるマンノシルアルジトールリピッドの前駆体物質となる糖アルコール、脂肪酸を、酵母が細胞内で新たに合成することなく、直接取り込んで利用できるためと考えられる。良好なマンノシルアルジトールリピッドの生産速度、生産量、及び収率を得る上で、培養開始時の培養液中の糖アルコール濃度は少なくとも1重量%以上、好ましくは1〜20重量%、より好ましくは5〜10重量%であり、また、培養開始時の培養液中の油脂類濃度は少なくとも2重量%以上、好ましくは2〜20重量%、よが好ましくは4〜10重量%である。また、必要に応じて、培養の途中で添加したり、一定濃度で制御する蓄次添加を行ってもよい。
【0036】
培地に添加する上記の炭素源以外の他の成分としては、当該技術分野で通常用いられる窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、またはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【0037】
培養温度は、20〜36℃、好ましくは26〜36℃、より好ましくは34℃である。培養日数としては、マンノシルアルジトールリピッド生産量に応じて適宜設定すればよいが、3〜20日間が好ましい。培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。良好な微生物の生育及びマンノシルアルジトールリピッドの生産のためには、培養液に酸素を供給することが好ましく、そのためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するか、振とう培養を行えばよい。
【0038】
本発明において、前記微生物菌株を用いてマンノシルアルジトールリピッドを生産する場合、増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりのマンノシルエリスリトールリピッド生産量が高くなるため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これを本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。例えば、種培養、本培養及びマンノシルアルジトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における、具体的な培地組成、培養条件を例示すると以下のとおりである。
【0039】
グルコース5〜40g/L、好ましくは20g/L、酵母エキス0.5〜2g/L、好ましくは1g/L、硝酸ナトリウム1〜5g/L、好ましくは3g/L、リン酸2水素カリウム0.1〜1g/L、好ましくは0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.1〜1g/L、好ましくは0.3g/Lの組成の液体培地2mLが入った試験管に、保存菌株を1白金耳接種し、26〜30℃で1〜3日振とう培養を行う(種培養)。次に、20〜300g/L、好ましくは40〜100g/Lの植物油脂等の油脂類、40〜200g/L、好ましくは80〜160g/Lの糖アルコールを加えた上記と同じ組成の液体培地30mLの入った坂口フラスコに上記の種培養を行った培養液を接種して、26〜36℃、好ましくは34℃で1〜7日間振とう培養を行う(本培養)。さらに、上記の本培養と同じ組成の液体培地0.5Lが入ったジャーファメンターに上記の本培養を行った培養液を接種して、26〜35℃、好ましくは34℃で1〜2L/分の通気速度と600〜1000rpmの撹拌速度で3〜20日間培養する(マンノシルアルジトールリピッド生産培養)。
【0040】
微生物菌株の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地1Lあたり、10〜200ml、好ましくは50〜100mlの種培養液あるいは本培養液中に含まれる量であればよい。
【0041】
本発明における培養は、培養液中の所望のマンノシルアルジトールリピッド生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中の目的とするマンノシルアルジトールリピッドをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。
【0042】
培養液中に蓄積されたマンノシルアルジトールリピッドは、培養終了後、培養液を抽出することによって取得できる。抽出は、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて行う。抽出は当該分野において通常行われる方法に従って行えばよく、例えば、培養液1Lあたり0.5〜1.5L程度の有機溶媒を用いて1〜数回抽出し、酢酸エチル層を合わせて溶媒を留去する。
【0043】
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物(例えば、菌体破砕物)などをいう。
【0044】
微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖(アセチルセルロース、アガロース)、無機物質(多孔質ガラス、金属酸化物)、合成高分子(ポリアクリルアミド、ポリスチレン)等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖(アルギン酸、カラギーナン)、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【0045】
前述のようにして培養液から単離精製したマンノシルアルジトールリピッドの構造決定は、TLCプレート上でアンスロン硫酸試薬にて青緑色に呈色することを確認後、13C NMR と1H NMR 解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知の下記式(V)で示されるマンノシルエリスリトールリピッドのスペクトルとを比較することより行うことができる。
【0046】
【化9】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【0047】
また、マンノシルアルジトールリピッドの糖組成の決定は、NMR解析結果を、上記の従来型マンノシルエリスリトールリピッドと比較することにより行う。さらに、マンノシルアルジトールリピッドの脂質成分を3M塩酸中、80℃で分解後、水溶性成分を高速液体クロマトグラフィーで分析し、上記NMR解析の結果と合わせてその糖鎖部分の構造を確認する。
【実施例】
【0048】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0049】
(実施例1)マンノシルマンニトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を以下のようにして行った。
a)保存培地(麦芽エキス3g/L、酵母エキス3g/L、ペプトン5g/Lグルコース10g/L、寒天30g/L)に保存しておいたシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株を、グルコース20g/L、酵母エキス1g/L、硝酸ナトリウム3g/L、リン酸2水素カリウム0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.3g/Lの組成の液体培地2mLが入った試験管に1白金耳接種し、30℃で1日間振とう培養を行った。
b)続いて、得られた菌体培養液を、植物油脂としてオリーブ油50g/L、糖アルコールとしてマンニトール100g/L、酵母エキス1g/L、硝酸ナトリウム3g/L、リン酸2水素カリウム0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.3g/Lの組成の液体培地30mLの入った坂口フラスコに接種して、34℃で7日間培養を行った。
【0050】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。このとき、公知のマンノシルエリスリトールリピッド生産酵母である、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株、Pseudozyma antarctica JCM 10317株、Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) 株を上記と培養温度が30℃である以外は同じ条件で培養し、同様にして薄層クロマトグラフィーを行った。
結果を図1に示す。なお、図中、左端はマンノシルエリスリトールリピッドの標準であり、MEL-Aは、前記一般式(V)中、R1とR2が炭素原子数1〜14の脂肪酸残基、R3とR4がアセチル基である化合物、MEL-Bは、前記一般式(V)中、R1とR2が炭素原子数1〜14の脂肪酸残基、R3が水素原子、R4がアセチル基である化合物、MEL-Cは、前記一般式(V)中、R1とR2が炭素原子数1〜14の脂肪酸残基、R3がアセチル基、R4が水素原子である化合物を示す。
図1に示されるように、全ての酵母株がオリーブ油含有培地でマンノシルエリスリトールリピッド(MEL)を生産することが確認できた。さらに、MEL-Cの下方に構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に検出されていることがわかった。
【0051】
(3) 高速液体クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、そのマンノシルエリスリトールリピッド生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。結果を図2に示す。なお、図2は、培養液中の酢酸エチル可溶分を高速液体クロマトグラフィーで検出した結果である。図2に示されるうように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株は、MEL-Cより保持時間の長い構造不明のマンノシルアルジトールリピッドを生産することが確認できた。このとき、初発の培地中(30ml)には1.5 g のオリーブ油と3 g のマンニトールが含まれており、MEL-Aの検量線を用いて HPLC の結果からMEL-Aと構造不明のマンノシルアルジトールリピッドの生産量を算出したところ、MEL-Aの生産量は0.9g、構造不明のマンノシルアルジトールリピッドの生産量は0.3 gであった。
【0052】
(4) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図3、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図3に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR 解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は6個であり、培地中に含有するマンニトールに由来するものと考えられた。
【0053】
(5) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図4に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 11752の培養液抽出物には、マンノースとマンニトールが含まれていた。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された(図4C)。
【0054】
以上の解析結果から、Pseudozyma parantarctica JCM 11752が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルマンニトールリピッドであることがわかった。この構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、図1によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株、Pseudozyma antarctica JCM 10317株、Pseudozyma antarctica KM-34(FERM P-20730) 株の培養物にも確認できたので、これらの菌株もまた、マンノシルマンニトールリピッドを生産していることがわかった。なかでも、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株はMEL-Cの生産量が少ないため、マンノシルマンニトールリピッドの精製が容易であるといえる。
【0055】
(実施例2)植物油脂及び糖アルコールの濃度条件
実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を行ない、培養後、培養液を採取し、そのマンノシルマンニトールリピッド生産量を高速液体クロマトグラフィーで定量した。このとき、培養液中の植物油脂及び糖アルコールの濃度はそれぞれ図中に記載した通りである。結果を図5に示す。この結果によれば、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株によるマンノシルマンニトールリピッドの生産において、最適な植物油脂濃度は40g/L であり、最適なマンニトール濃度は80g/L である。
【0056】
(実施例3)マンノシルアラビトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
実施例1(1)(b)の培養を糖アルコールとしてアラビトール100g/Lを含む培地で行う以外は、実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica) JCM 11752株の培養を行った。
【0057】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。結果を図6に示す。図6に示されるように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica) JCM 11752株をオリーブ油とアラビトール含有培地で培養して得られた培養液中には、MEL-B様の構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に存在することが確認できた。
【0058】
(3) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図7、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図7に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR 解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は5個であり、培地中に含有するアラビトールに由来するものと考えられた。
【0059】
(4) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図8に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養液抽出物には、マンノースとアラビトールが含まれており、上記構造不明のマンノシルアルジトールリピッドがマンノシルアラビトールリピッドであることがわかった(図8C)。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された。また、塩酸処理における未分解物としてマンノシルエリスリトールが検出された。
【0060】
(実施例4)マンノシルリビトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
実施例1(1)(b)の培養を糖アルコールとしてリビトール100g/Lを含む培地で行う以外は、実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を行った。
【0061】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。結果を図9に示す。図9に示されるように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株をオリーブ油とリビトール含有培地で培養して得られた培養液中には、MEL-B様の構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に存在することが確認できた。
【0062】
(3) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図10、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図10に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は5個であり、培地中に含有するリビトールに由来するものと考えられた。
【0063】
(4) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図11に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養液抽出物には、マンノースとリビトールが含まれており、上記構造不明のマンノシルアルジトールリピッドがマンノシルリビトールリピッドであることがわかった(図11C)。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された。また、塩酸処理における未分解物としてマンノシルエリスリトールが検出された。
【0064】
(実施例5)マンノシルソルビトールリピッドの生産
(1) 菌体の培養
実施例1(1)(b)の培養を糖アルコールとしてソルビトール100g/Lを含む培地で行う以外は、実施例1と同様にして、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株の培養を行った。
【0065】
(2) 薄層クロマトグラフィー分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、これを用いてマンノシルアルジトールリピッドの生産パターンを薄層クロマトグラフィーで確認した。結果を図12に示す。図12に示されるように、シュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株をオリーブ油とソルビトール含有培地で培養して得られた培養液中には、MEL-Cの下方にTLCのスポットを与える構造不明のマンノシルアルジトールリピッドが大量に存在することが確認できた。
【0066】
(3) 13C NMR と1H NMR分析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、13C NMR と1H NMRで生産物の構造解析を行った(図13、上段)。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図13に示されるように、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、13C NMR と1H NMR解析において、マンノシルエリスリトールリピッドと比較して、アルジトール由来のシグナルのみが異なり、他のシグナルは一致していた。当該構造不明のマンノシルアルジトールリピッドは、マンノシルエリスリトールリピッドとエリスリトール部分の炭素数以外は一致しており、エリスリトール部分にあたる糖骨格の炭素数は6個であり、培地中に含有するソルビトールに由来するものと考えられた。
【0067】
(4) 糖成分の解析
上記(1)の培養後、培養液を採取し、培養液中のマンノシルアルジトールリピッドを酢酸エチルで抽出し、シリカカラムで精製した。精製画分を3M塩酸中、80℃で3時間分解処理後、ヘキサンにて脂溶性成分を抽出除去し、水溶性画分をアンバーライトカラムで中和後、HPLCで構造不明のマンノシルアルジトールリピッドに由来する糖成分の解析を行った。結果を図14に示す(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。Pseudozyma parantarctica JCM 117522株の培養液抽出物には、マンノースとソルビトールが含まれており、上記構造不明のマンノシルアルジトールリピッドがマンノシルソルビトールリピッドであることがわかった(図14C)。なお、前記培養液抽出物にはシリカカラム精製の工程で MEL が混入してくるため、少量のエリスリトールが検出された。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株、Pseudozyma antarctica KM-34(FERM P-20730) 株、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株、Pseudozyma antarctica JCM 10317株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図2】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての高速液体クロマトグラフィーの分析結果である。
【図3】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図4】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びマンニトール含有培地でマンノシルマンニトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【図5】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株によるマンノシルマンニトールリピッドの生産に対する植物性油脂及びマンニトール濃度の影響を示すグラフである。
【図6】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びアラビトール含有培地でマンノシルアラビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図7】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びアラビトール含有培地でマンノシルアラビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図8】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びアラビトール含有培地でマンノシルアラビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【図9】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びリビトール含有培地でマンノシルリビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図10】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びリビトール含有培地でマンノシルリビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図11】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びリビトール含有培地でマンノシルリビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【図12】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びソルビトール含有培地でマンノシルソルビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図13】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びソルビトール含有培地でマンノシルソルビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物についての13C NMR と1H NMRによる構造解析の結果である。
【図14】Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が、オリーブ油及びソルビトール含有培地でマンノシルソルビトールリピッドを生産しうることを示す、該培養物分解物のHPLCによる糖アルコール成分分析結果である(A.糖標品、B.マンノシルエリスリトールリピッド、C.培養液抽出物)。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化1】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)
【請求項2】
下記式(II)で表される、マンノースとソルビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化2】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【請求項3】
下記式(III)で表される、マンノースとリビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化3】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【請求項4】
下記式(IV)で表される、マンノースとアラビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化4】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【請求項5】
R1とR2が炭素数6〜20の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項1〜4に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
【請求項6】
R1とR2が炭素数6〜20の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項1〜4に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
【請求項7】
R1とR2が炭素数6〜20の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする、請求項1〜4に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
【請求項8】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及び糖アルコールを加えた培地に培養し、培養物から請求項1に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項9】
培養開始時における、培地中の油脂類濃度が2〜20重量%、糖アルコール濃度が1〜20重量%である、請求項8に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項10】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及びソルビトールを加えた培地に培養し、培養物から請求項2に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項11】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及びリビトールを加えた培地に培養し、培養物から請求項3に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項12】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及びアラビトールを加えた培地に培養し、培養物から請求項4に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項13】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)に属する微生物であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項14】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項15】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ(Pseudozyma rugulosa)NBRC 10877株であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項16】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)JCM 10317株またはシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34 株(FERM P-20730) であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項1】
下記式(I)で表される、マンノースと糖アルコールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化1】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。nは3または4を示す。ただし、糖アルコールがマンニトールであるマンノシルアルジトールリピッドを除く。)
【請求項2】
下記式(II)で表される、マンノースとソルビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化2】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【請求項3】
下記式(III)で表される、マンノースとリビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化3】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【請求項4】
下記式(IV)で表される、マンノースとアラビトールと脂肪酸で構成されるマンノシルアルジトールリピッド。
【化4】
(式中、R1とR2は同一または異なって炭素数6〜20の脂肪族アシル基を、R3とR4は水素またはアセチル基を表す。)
【請求項5】
R1とR2が炭素数6〜20の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項1〜4に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
【請求項6】
R1とR2が炭素数6〜20の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項1〜4に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
【請求項7】
R1とR2が炭素数6〜20の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする、請求項1〜4に記載のマンノシルアルジトールリピッド。
【請求項8】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及び糖アルコールを加えた培地に培養し、培養物から請求項1に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項9】
培養開始時における、培地中の油脂類濃度が2〜20重量%、糖アルコール濃度が1〜20重量%である、請求項8に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項10】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及びソルビトールを加えた培地に培養し、培養物から請求項2に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項11】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及びリビトールを加えた培地に培養し、培養物から請求項3に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項12】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属し、マンノシルアルジトールリピッド生産能を有する微生物を油脂類及びアラビトールを加えた培地に培養し、培養物から請求項4に記載のマンノシルアルジトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項13】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)に属する微生物であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項14】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ(Pseudozyma parantarctica)JCM 11752株であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項15】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ(Pseudozyma rugulosa)NBRC 10877株であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【請求項16】
シュードザイマ(Pseudozyma)属に属する微生物がシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)JCM 10317株またはシュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34 株(FERM P-20730) であることを特徴とする、請求項8〜12に記載のマンノシルアルジトールリピッドの製造方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【公開番号】特開2008−260715(P2008−260715A)
【公開日】平成20年10月30日(2008.10.30)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−104632(P2007−104632)
【出願日】平成19年4月12日(2007.4.12)
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】(000003160)東洋紡績株式会社 (3,622)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成20年10月30日(2008.10.30)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年4月12日(2007.4.12)
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】(000003160)東洋紡績株式会社 (3,622)
【Fターム(参考)】
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