ミミズ体液の製造方法及びミミズ乾燥粉末の製造方法
【課題】遠心分離や濾過工程における清澄液収量率を向上することができるばかりでなく、乾燥工程におけるスプレードライヤーの使用を可能にし、製造工程の削減且つ作業労力を低減することができ、品質的且つ経済性に優れたミミズ体液の製造方法及びミミズ乾燥粉末の製造方法を提供する。
【解決手段】生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物を４０℃〜６０℃、保温時間１０分間〜２０時間でインキュベーションしてミミズの自己消化を促し、線溶活性物質を含有した清澄なミミズ体液を得る。その際、前記生ミミズ又はミミズ破砕物に、ネギ科植物のペースト又は搾汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加する。また、ミミズを抗菌砂中に混ぜ込んで接触処理しミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去する。
【解決手段】生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物を４０℃〜６０℃、保温時間１０分間〜２０時間でインキュベーションしてミミズの自己消化を促し、線溶活性物質を含有した清澄なミミズ体液を得る。その際、前記生ミミズ又はミミズ破砕物に、ネギ科植物のペースト又は搾汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加する。また、ミミズを抗菌砂中に混ぜ込んで接触処理しミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、血栓症や血栓形成に対する血栓溶解治療剤等として使用される清澄なミミズ体液及びミミズ乾燥粉末の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ミミズに含有される線溶活性物質を抽出して血栓溶解治療剤等に使用する技術が種々提案されている。この線溶活性物質を抽出する方法としては、例えば、生ミミズをミンチ機で粉砕したり、ホモゲナイズする方法がある。
【０００３】
これらの方法で得られる処理液は通常はペースト状であり、ミミズ躯体の非水溶性物質が微細に粉砕混合されているため、清澄なミミズ体液を得るために、さらに遠心分離機や濾過器具を使用した工程を要するばかりでなく、この遠心分離工程や濾過工程に起因する有効成分の損失によりミミズ体液収量が低下するという問題があった。
【０００４】
従って、従来のミミズを原料とする血圧調整剤や抗高脂血症剤等の製造方法（例えば、特許文献１〜特許文献５参照。）においては、分離濾過工程の手間や清澄液収量の歩留まりの悪さの点から遠心分離機や濾過機を利用することができず、ミミズの皮膚等の比較的大きな非水溶性部位を除去するのが限界であり、非水溶性物質を多量に含んだまま乾燥粉末にして提供されていたのが実状であった。
【０００５】
また、ミミズ体液を粉末化するための乾燥工程においては、コストが低廉で済むスプレードライヤーを用いることが好ましいが、前記非水溶性物質によってアトマイザーが目詰まりを起すといった不具合が発生するため、スプレードライヤーを採用することができず、凍結乾燥のような煩雑且つコストが嵩む手法を採用せざるを得ないという問題があった。また、非水溶性物質中には大腸菌群、一般細菌、黴類、酵母類といった雑菌が多く、重金属含有量が多いという問題があった。すなわち、土中生物であるミミズの消化器官内は無論のこと体表も雑菌の棲息部位となっており、常法、例えば除菌フィルターも目詰まりを起こしてしまい非水溶性物質を含んだままでの除菌フィルターによる濾過が困難で、工業的生産には適さないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平７−３９３４９号公報
【特許文献２】特公平７−８０７７７号公報
【特許文献３】特公平７−８８３０８号公報
【特許文献４】特許第３０３７３５５号公報
【特許文献５】特開２００６−９６６７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上述べたように、従来の生ミミズから線溶活性物質を含んだ清澄液を得る方法は、いずれも品質的且つ作業効率及び経済性に乏しく、工業的生産効率が低いものであった。
【０００８】
本発明は、前記従来技術の課題に鑑み、濾過工程における清澄液収量率を向上することができるばかりでなく、乾燥工程におけるスプレードライヤーの使用を可能にし、雑菌数を極めて少なくでき、製造工程の削減且つ作業労力を低減することができ、品質的且つ経済性に優れたミミズ体液の製造方法及びミミズ乾燥粉末の製造方法を提供することを目的とするものである。また、従来の雑菌数の抑制方法は、作業環境温度を低くすることにより行われていた。その場合一般細菌数は減少することはないが、本発明の製造方法によれば減少させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、請求項１の発明は、生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物をインキュベーションして自己消化を促し、線溶活性物質を含有したミミズ体液を得ることを特徴とするミミズ体液の製造方法に係る。
【００１０】
請求項２の発明は、請求項１において、生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物に、ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加して、インキュベーションすることを特徴とする。
【００１１】
請求項３の発明は、請求項１または請求項２において、得られたミミズ体液から非水溶物の除去を行うことを特徴とする。
【００１２】
請求項４の発明は、請求項１乃至請求項３のいずれか一項において、原料として、凍結した生ミミズ又はその破砕物をそのまま、又は解凍して用いることを特徴とする。
【００１３】
請求項５の発明は、請求項１乃至請求項４のいずれか一項において、インキュベーションの条件として、温度が２０℃〜６５℃、保温時間が約１０分間〜２０時間であることを特徴とする。
【００１４】
請求項６の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか一項において生ミミズを抗菌砂に混ぜ込んで接触処理させて、当該ミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去することを特徴とする。
【００１５】
請求項７の発明は、請求項１乃至請求項６のいずれか一項の方法によって製造されたミミズ体液を乾燥してミミズ乾燥粉末とすることを特徴とするミミズ乾燥粉末の製造方法に係る。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１の発明によれば、生ミミズ又はその破砕物をインキュベーションすることにより、ミミズの自己消化が促進され、線溶活性物質を含有したミミズ体液が自然に滲出してくるため、この体液を採取することによりミミズ体液を効率良く得ることができる。尚、ミミズを破砕する工程を削減した場合、破砕によって生じる微細な粉砕物が抽出液に含まれないため、濾過器具における目詰まりが解消し、遠心分離工程における上清液の回収効率が向上し、ミミズ体液の収量が増加するのに加えて作業性も良好となる。
【００１７】
本発明者は、生ミミズ又はその破砕物をインキュベーションすることにより、ミミズ体液が自然に滲出することを、次の観点から知得した。ミミズ養殖場や圃場において、生活環境が劣悪になってくるとミミズの姿が消失することがしばしば観察された。この現象はミミズがより良い餌場を求めて移動するのではないかと予想する意見もあったが、本発明者は、餌を捕食できなくなったために生じるミミズの自己消化に起因するのではないかと考察した。そして、鋭意実験を行なった結果、生ミミズ又はその破砕物をインキュベーションすることによって、ミミズの自己消化が促進され、非水溶性物が除去されたミミズ体液が簡便に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
請求項２の発明によれば、生ミミズ又はその破砕物に、ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加してインキュベーションを行なうことにより、ミミズ体液中の大腸菌群や黴類、酵母類の常温菌を減じることができる。
【００１９】
請求項３の発明によれば、得られたミミズ処理液は微細な非水溶物を含まないため、濾過工程が簡便になり、例えば、フィルタープレスを使用した場合の液収量は９０％を越える。これにより、アトマイザーの目詰まりを解消でき、スプレードライヤーによる乾燥工程を採用できるばかりでなく、重金属類の含有率の低いミミズ体液を得ることができる。
【００２０】
請求項４の発明によれば、原料として、凍結した生ミミズ又はその破砕物をそのまま、又は解凍したものを使用できる。この場合、生きたミミズを用いる場合に比べて自己消化温度を広範囲に採ることができるという利点がある。すなわち、凍結した生ミミズを用いると、常温域は勿論のこと、低温域における自己消化工程を採用することもできる。さらに、生きたミミズを扱うよりも、凍結ミミズの方が、運搬や製造計画を図る際に利便性がある。すなわち、生きたミミズの場合には、運搬中の死亡による腐敗の惧れがあるため、注意を払う必要があるばかりでなく、ミミズの搬入後は速やかに作業を行なう必要があり、作業計画がミミズの搬入状況により制約を受けるという不具合が発生するが、凍結ミミズを使用することによって係る問題を解消することができる。
【００２１】
請求項５の記載によれば、インキュベーション温度が２０℃〜６５℃、保温時間が約１０分間〜２０時間であるため、線溶活性を損なうことなく抽出液を効率良く滲出させることができる。これは、本発明者が観察した結果知得した現象であり、生きミミズに給餌することなくミミズの生活温度帯に放置すると、ミミズは飢餓寸前まで痩身しながらも生きており、自己消化時間は長くなる一方、得られる自己消化液の収量が悪くなると共に、品質も低下することが判明した。そのため、ミミズ体液の生産性を考慮すれば、自己消化の速度を早める方策が必要となる。そこで、本発明者は、インキュベーションの際の温度を検討したところ、ミミズの生活帯温度以上に加温すれば、ミミズの自己消化時間を短縮することができることを知得した。しなしながら、確かにインキュベーション温度を高くすればするほど自己消化の速度は早まるが、加温温度は線溶活性の安定性領域を超えないことが要求されることから、生ミミズをそのまま用いる場合のインキュベーション温度は、２０℃から６５℃以下が好ましく、さらに好ましくは４０℃から６０℃以下、またさらに、一般細菌の増殖も抑制するには４５℃から５５℃以下が好ましい。尚、破砕ミミズや凍結ミミズを用いる場合のインキュベーション温度は３０℃以下でも良い。また、インキュベーション温度の設定に際しては、中温菌の殺菌効果を加味することもできる。例えば、大腸菌群を死滅させることを加味するのであれば、一般的には６０℃〜６５℃で３０分以上加熱殺菌を要すると言われているが、ミミズ体液の場合は、４５℃〜６０℃の加熱が好ましい。
【００２２】
請求項６の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか一項において生ミミズを抗菌砂に接触させて当該ミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去する。例えば、市販されているペット排泄用の砂（いわゆる猫砂）等の抗菌砂中に混ぜ込んで接触処理することでミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去する。これにより、除菌フィルター等による濾過操作がなくても菌数を低減したミミズ体液を得ることができる。
【００２３】
請求項７の発明によれば、請求項１乃至請求項６のミミズ体液の製造方法によって得られた非水溶物を除去した抽出液を乾燥させてミミズ乾燥粉末としているため、効率良く、且つ品質に優れたミミズ乾燥粉末を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明が本実施形態に限定されないことは言うまでもない。
【００２５】
本発明におけるミミズ体液の製造方法は、生ミミズをそのまま又はその破砕物をインキュベーションして、線溶活性物質としての抽出液を得るものである。また、ミミズ粉末の製造方法は、本発明のミミズ体液製造方法によって得られたミミズ体液を乾燥するものである。
【００２６】
本発明に係るミミズ体液の原料となるミミズは、生きている生ミミズ、凍結した生ミミズ、生ミミズをミンチやホモゲナイズしたペースト状のものである。ミミズの品種はとくに制限されない。例えば、アカミミズ、シマミミズ、ツリミミズ、ハタケミミズ、フツウミミズ等を挙げることができる。また、養殖ミミズ、天然ミミズの何れでも良い。生ミミズは、水中に所定時間浸漬する等して消化官内の糞土を吐出させたものを使用するのが好ましい。凍結したミミズを用いる場合、生ミミズを−１０℃以下に凍結させるのが好ましい。ペースト状にする方法は、公知の手段を用いて行なうことができる。例えば、磨砕機や擂潰し器、ホモゲナイザー、ホモミキサー等を用いて行なうことができる。
【００２７】
本発明でいうインキュベーションとは、生ミミズ又はその破砕物、あるいは凍結ミミズやその解凍物を所定の容器に投入し、必要に応じて攪拌を行い、所定温度で保温しながら所定時間放置することによって行う。このインキュベーション温度は、高いほど抽出に要する時間を短縮することができるが、ミミズ酵素は高すぎるとミミズ体液の線溶活性が損なわれるため、線溶活性の安定領域を超えない温度（６５℃以下）とする必要があり、２０℃から６５℃の範囲が好ましい。また、インキュベーション温度を４５℃以上にすることにより、常温菌の殺菌効果も期待できる。
【００２８】
インキュベーション時間は、適宜設定することができ、放置時間が長いほど線溶活性には好ましいが、雑菌が繁殖し易くなる。作業性を考慮して一夜（１０時間以上）のインキュベーション時間も採用できる。また、ホモゲナイズやミンチにしたミミズを使用する場合は、インキュベーション時間を更に短縮することができる。通常、インキュベーション時間は、約１０分〜７時間の範囲で適宜設定される。インキュベーション温度が高いほどインキュベーション時間を短縮することができる。例えば、インキュベーション温度が３０℃〜４５℃の場合、１時間〜２０時間、インキュベーション温度が４５℃〜６５℃の場合は、０．５時間〜７時間とすることができる。尚、濾過性の改善のみを目的とするならば、ごく短時間の加温で充分であり、例えば、生ミミズを用いる場合は４５℃で０．５時間以内のインキュベーション時間で良く、ペースト状にしたミミズであれば温度やインキュベーション時間を更に下げることができる。また、清澄液の回収率向上や雑菌の除去を重視するのであれば、加温時間を延長するか、加温温度を高くすれば良い。例えば、凍結ミミズを使用するのであれば、５０℃到達後３時間前後のインキュベーションを行えば良い。
【００２９】
生ミミズ又はその破砕物には、殺菌作用を有するネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加してインキュベーションするのが好ましい。これにより、大腸菌群や黴類、酵母類の常温菌を減じることができる。特に、前記インキュベーション温度が４５℃以下の場合に効果的である。尚、前記ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものは、インキュベーション後のミミズ体液に添加するものでも良い。適用できるネギ科植物群としては、ニンニク、タマネギ、ネギ、ラッキョウ、ワケギ、ニラ等を挙げることができ、これらの群から選択される少なくとも一種以上を単独、または複合して使用することができる。また、生ミミズ又はその破砕物との混合比率は、重量比で９５：５から５：９５の範囲で適宜設定できるが、９５：５から４０：６０の範囲がより好ましい。
【００３０】
前記インキュベーションによって得られたミミズ体液からは非水溶物の除去を行なうのが好ましい。非水溶物の除去は、遠心分離や濾過処理等によって行なうことができる。尚、とくにミミズを粉砕しない場合はフィルタープレス等の圧窄装置を使用してミミズ体液の濾過を簡便に行なうことができ、非水溶物及び重金属類の含有率の低い製品を提供することができる。また、フィルタープレスを使用した場合は９０％を越える高い体液回収率を得ることができる。
【００３１】
本発明の製造方法によって得られた清澄なミミズ体液は、その後乾燥されてミミズ乾燥粉末とされる。ミミズ乾燥粉末は機能性食品や血栓症治療薬の原料の一つとして利用される。ミミズ体液の乾燥は、ミミズ体液に乾燥助剤（例えば、乳糖、デキストリン、セルロースパウダーのような糖類、ゼラチンやカゼイン分解物、牛血清アルブミンのようなタンパク質類）を必要に応じて加え、公知の凍結乾燥あるいはスプレードライヤーを使用して常法によって行なうことができる。
【００３２】
インキュベーションにより得られるミミズ体液の線溶活性と大腸菌群について、以下に記述する試験を行った。尚、線溶活性はプロアテーゼ活性で代替試験した。プロアテーゼ活性の測定方法と大腸菌群の測定方法は以下のとおりである。
【００３３】
[プロアテーゼ活性の測定方法]
予め３７℃に加温した１％ミルクカゼイン溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）２．９ｍｌに、適宜希釈した試料溶液を０．１ｍｌ加えて混和し、３７℃で１５分間反応させる。１５分後に４％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液を３ｍｌ加えてよく混和し、１０分以上３７℃で放置した後、遠心分離して上清液を得た。この上清液の２８０ｎｍ吸光度を測定し、以下の計算により活性表示を行なった。尚、ブランク値は反応０時間について同様の操作を行なって求めた。
活性＝（酵素反応液のＡ２８０ｎｍ−ブランクのＡ２８０ｎｍ）×（酵素の希釈度）
【００３４】
[大腸菌群の測定方法]
デオキシコレート寒天培地（ＯＸＯＩＤ）を、所定の方法によって溶解し、ミミズ乾燥粉末の１０％水溶液または適宜希釈したミミズ体液の１ｍｌをシャーレに投入し、そこへ溶解した寒天培地を１５ｍｌから２０ｍｌ加えて混和した。恒温槽内で３７℃、４８時間インキュベートした後、出現したコロニー数をカウントし、希釈倍数を乗じて大乗菌群数とした。
【００３５】
ここで、加温温度と加温時間と大腸菌群との関係を説明すると、
（１）一般に大腸菌の生育温度は０〜４５℃と言われている。
（２）食品中の大腸菌群を殺菌する一般的な条件としては、６０〜６５℃で３０分と言われている。
（３）この大腸菌群を殺菌する条件をミミズ酵素の乾燥粉末製造工程に使用することはできない。何故ならば、この条件はミミズ酵素の不安定性領域であるので、製造ラインではその制御が困難である。
（４）そこで、ミミズ酵素を製造できるより実用的な殺菌条件を検討した結果、従来言われている条件よりも緩やかな条件でミミズ体液を処理することができ、ミミズ酵素を損なうことなく大腸菌群を死滅させることができる。
【００３６】
[試験例１] インキュベート温度３５℃
凍結生ミミズ２００ｇをビニール袋に収容し、袋の開口を閉じて３７℃の恒温水槽に投入して加温し、加温時間の任意の経時点毎に１８ｍｌずつサンプリングし、その半分の９ｍｌを、予め擂り下ろしたニンニク３ｇを入れておいた蓋付きチューブ（商品名：ＳＵＭＩＬＩＯＮ、１５ｍｌ遠心チューブ）に投入してよく混和し、密栓後、恒温水槽（３７℃）に再度投入して加温し続けた（全２４時間）。サンプリングした残り半分の９ｍｌにはニンニクを添加せず分析日まで冷凍保存した。尚、プロアテーゼ活性の測定試料は上記加温液を遠心分離機（１００００Ｇ）によって上清液を得てこれを供した。遠沈管の底に貯留した非水溶物量は、無加温時に６割強であったのに比して、６時間加温後は２割程度に減少した。試験結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１の試験結果から明らかなように、インキュベーション温度を大腸菌群が増殖し易い温度で行なう場合は、ニンニクの添加を必要とすることが分かる。
【００３９】
[試験例２] インキュベーション温度５２℃
恒温水槽の温度を５２℃にした以外は、試験例１と同様に試験し、同様の手法で分析した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２の試験結果から明らかなように、大腸菌群が増殖できない温度をインキュベーション温度として採用することにより、ニンニクを添加しなくても大腸菌群を減じることができ、インキュベーション温度が高い方が線溶活性が短時間で高値になることが分かった。
【００４２】
[試験例３] インキュベーション時の加温効果試験
インキュベーション時における加温の効果を、次のようにして遠心分離した上清液量の収得量で判定した。糞土を除去したミミズを一夜放置することにより腸内内容物を吐出させ、洗浄した生ミミズ１００ｇを軽くミキサーで粉砕してペースト状にしたものをビーカーに入れ、３０℃の恒温水槽で加温してインキュベーションしたところ、１時間後にはペースト状ではなくなり、液状となっていた。これを３時間後に（２４０００Ｇ）遠心分離し、採取した上清液量を測定したところ７６ｍｌであった。一方、ペースト状に破砕したものを、そのまま加温することなく遠心分離した場合の上清液量は１８ｍｌであった。このことから、インキュベーション時に加温することによってミミズ体液の収量が増加することが分かる。
【実施例１】
【００４３】
糞土を除去したミミズを一夜放置することにより腸内内容物を吐出させ、その後洗浄して凍結させたミミズ５ｋｇをビニール袋に収容し、擂り下ろしたニンニク２００ｇを加えて封止したものを５個作成し、５０℃から５５℃の恒温槽に投入して解凍した。凍結部分がなくなってから３時間後に、解凍ミミズから滲出したミミズ体液をビニール袋から取り出し、珪藻土を２重量％添加した後、フィルタープレス機にて濾過し、非水溶物を除去した。濾過性能は非常に良く、プロアテーゼ活性が１．０１／ｍｌのミミズ体液の濾過液４．６ｋｇを得た。
【実施例２】
【００４４】
実施例１で得られた濾過液４ｋｇをバケツに投入し、前記濾過液４ｋｇに乾燥補助剤としてパインデックス＃１００（商品名：松谷化学製）を１．６ｋｇ加え、乾燥室容積０．８ｍ３のスプレードライヤーを用いて乾燥し、ミミズ乾燥粉末２．２７ｋｇを得た。
乾燥条件：入口温度；１４０℃、出口温度；８０℃から８５℃、液投入速度；２．６リットル／時
【００４５】
得られたミミズ乾燥粉末について、重金属試験、雑菌試験、線溶活性の代替測定としてのプロアテーゼ活性を測定した。プロアテーゼ活性の回収率は８５％であった。また、黴・酵母類は下記の測定方法では検知できず、大腸菌群数も検知できなかった。重金属類の測定を外部機関に委託したところ、総水銀、鉛、カドミウムは測定限界濃度以下であり、砒素は１ｐｐｍであった。
【００４６】
[黴・酵母類の測定]
ツアペック・ドッグス寒天培地（日水製薬製）を所定の方法に従って溶解、殺菌する。予め殺菌生理食塩水で作製した乾燥粉末の２０％溶液の１ｍｌをプレートに加えた後、上記殺菌培地１０ｍｌ（５０℃以下）を加えて混和し、３０℃で５日間培養した後に出現した黴のコロニー数をカウントした。
【００４７】
酵母類の測定は、ＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ）にストレプトマイシンを３０ｐｐｍ（終濃度）加えた培地を用いた以外は上記の方法に準じて行なった。
【００４８】
また、ｐＨ処理を行い単位重量当たりの比活性を高めることにより、錠剤は無論のこと、ハードカプセル、ソフトカプセル製剤の小型化が可能になり、また、臭気を軽減できるので液状剤の製造が可能になる。
【００４９】
[試験例４] ｐＨ処理効果試験
未加温の生ミミズから得たペーストを遠心分離機により非水溶物を除いて上清液を得る。この上清液（ｐＨ６）を１Ｎ塩酸溶液でｐＨを４〜５に調整する。不溶物が発生するのでそれを遠心分離機で除き、上清液のカゼイン分解活性を測定した。続いて、このｐＨ調整して除沈した液を凍結乾燥して活性を測定した結果、下記の表の結果を得た。
【００５０】
【表３】
【００５１】
表３より明らかなように、ミミズペーストをｐＨ処理して沈殿除去することにより、ミミズペーストの除沈液を凍結乾燥した粉末より２割弱の高活性な凍結乾燥粉末を得ることができる。また、ミミズペーストをそのまま凍結乾燥した粉末と比較すると、約５割以上の高い活性を有する凍結乾燥粉末を得ることができる。
【実施例３】
【００５２】
泥を吐かせて洗浄し、凍結保存してある生ミミズ１Ｋｇを軽くミキサーにかけてミミズペーストを得た。このペーストを１Ｎ Ｈｃｌを用いてゆっくりとｐＨ４．５に調整した後、ろ過助剤として４０ｇのケイソウ土を加えてよく混合し、吸引瓶で濾過した。水で押し出しして９１０ｍｌの濾液を得、それを凍結乾燥機にかけ、１０６ｇの粉末を得た。プロアテーゼ活性を測定した結果、△Ａ２８０ｎｍ ８．１／ｇであった。
【００５３】
[試験例５]
上記の実施例と同じ方法で得られた濾液（ｐＨ未調整）を加温温度と時間を変えて処理し、一般細菌数と大腸菌群数を測定した。方法は、前者は日水製薬株式会社製標準寒天培地を、後者は日水製薬株式会社製デオキシコレート培地を使用し、それぞれの使用法に従って実施した。その結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】
表４から下記のことが分かる。
（１）ミミズに生息する大腸菌群は４３℃で生育は止まっているようで、４６℃になると生育停止から死滅へと移行するが、完全死滅にはいたらない。それには４９℃、２時間以上の加温を行う必要がある。
（２）一般細菌は４６℃以上の加温で少なくなるが、４９℃５時間の加温処理でも全滅させることは不可能である。やはり除菌フィルターのような除菌操作が必要である。
【実施例４】
【００５６】
泥を吐かせて洗浄して凍結保存してある生ミミズ１Ｋｇを三角フラスコに取り、５５℃の恒温水槽につけ、攪拌しながら内容物が４９℃になるのを待つ。４９度に達したら、恒温水槽の温度を５０℃に落とし、三角フラスコの口をラップしてそのまま放置した。３時間後にフラスコを取り出し、ろ過助剤であるケイソウ土（殺菌済み）を２０ｇ加え、よく攪拌した後吸引ろ過した。水で押し出して９８０ｍｌの濾液を得、その１ｍｌを日水製薬株式会社製ＢＧＬＢ培地で培養して大腸菌群の存在を検査したところ、陰性であった。尚、濾過以降に使用した容器類は全て煮沸殺菌した。
【００５７】
前記実施例で得られた濾液を冷却し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に調整後、１０ｇのケイソウ土を加えて混合し、吸引濾過によって濾液を得、その濾液３００ｍｌを凍結乾燥により粉末化した。プロアテーゼ活性が９．２（△Ａ２８０ｎｍ／ｇ）で、一般細菌数２，６００個／ｇ、大腸菌群陰性（ＢＧＬＢ培地）の粉末３．２ｇを得た。尚、試験に使用した容器類は煮沸殺菌した。
【００５８】
[抗菌砂：抗菌性銀担持体の検討]
銀を担持させた抗菌砂（抗菌性担体）が市販されている。これに生ミミズを混ぜ込んで接触処理することにより、本発明者らはミミズに存在する一般細菌を減少させることができるのではないかと考え試験した。試験に供した銀担持体はキッズサンド（商品名：アイニック株式会社製）、ノバロン(商品名：東亞合成株式会社製)である。その結果、一般細菌数を大きく減少させることができた。また、抗菌性銀担持体の単独使用ではミミズ体液を粉末にした場合の目標値である一般細菌数３０００個／g以下を達成できないことが判ったが、加温処理と併用することにより、より確実にミミズ乾燥粉末の雑菌数を減じることができた。
【００５９】
[試験例６]
泥を吐かせたミミズ１００gを抗菌性銀担持体４００gに混ぜ込み、一夜放置する。その後、ミミズをより分け、１リットルの水道水にミミズを泳がせてミミズ体表に付着している土等を軽く洗い落とした後、ミキサーでペーストにした。このペーストを適当に希釈して一般細菌数を測定した結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
【実施例５】
【００６１】
水を含ませたキッズサンド２Ｋｇを入れたバット（３００×２５０ｍｍ）に泥を吐かせた生ミミズ３００ｇを投入し、上から布を被せてミミズが逃げ出さないようにして一夜放置した。その後、ミミズを水道水でよく洗浄し、三角フラスコに移して５５℃の恒温水槽に浸し、時々攪拌しながら内容物が４９℃になるのを待つ。４９℃に達したら、恒温水槽の温度を５０℃に落とし、三角フラスコの口をラップしてそのまま放置した。３時間後にフラスコを取り出し、濾過助剤であるケイソウ土（殺菌済み）を９g加え、よく攪拌した後、吸引濾過した。水で押し出しして２６０ｍｌの濾液を得て凍結乾燥を行ったところ粉末２．９ｇを得た。この粉末の大腸菌群は陰性（ＢＧＬＢ培地）で、一般細菌数は＜１０００個／ｇであった。尚、粉末の銀含量をＩＰＣ発光分析法で測定したが測定限界以下（０．１ｐｐｍ未満）であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、血栓症や血栓形成に対する血栓溶解治療剤等として使用される清澄なミミズ体液及びミミズ乾燥粉末の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ミミズに含有される線溶活性物質を抽出して血栓溶解治療剤等に使用する技術が種々提案されている。この線溶活性物質を抽出する方法としては、例えば、生ミミズをミンチ機で粉砕したり、ホモゲナイズする方法がある。
【０００３】
これらの方法で得られる処理液は通常はペースト状であり、ミミズ躯体の非水溶性物質が微細に粉砕混合されているため、清澄なミミズ体液を得るために、さらに遠心分離機や濾過器具を使用した工程を要するばかりでなく、この遠心分離工程や濾過工程に起因する有効成分の損失によりミミズ体液収量が低下するという問題があった。
【０００４】
従って、従来のミミズを原料とする血圧調整剤や抗高脂血症剤等の製造方法（例えば、特許文献１〜特許文献５参照。）においては、分離濾過工程の手間や清澄液収量の歩留まりの悪さの点から遠心分離機や濾過機を利用することができず、ミミズの皮膚等の比較的大きな非水溶性部位を除去するのが限界であり、非水溶性物質を多量に含んだまま乾燥粉末にして提供されていたのが実状であった。
【０００５】
また、ミミズ体液を粉末化するための乾燥工程においては、コストが低廉で済むスプレードライヤーを用いることが好ましいが、前記非水溶性物質によってアトマイザーが目詰まりを起すといった不具合が発生するため、スプレードライヤーを採用することができず、凍結乾燥のような煩雑且つコストが嵩む手法を採用せざるを得ないという問題があった。また、非水溶性物質中には大腸菌群、一般細菌、黴類、酵母類といった雑菌が多く、重金属含有量が多いという問題があった。すなわち、土中生物であるミミズの消化器官内は無論のこと体表も雑菌の棲息部位となっており、常法、例えば除菌フィルターも目詰まりを起こしてしまい非水溶性物質を含んだままでの除菌フィルターによる濾過が困難で、工業的生産には適さないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平７−３９３４９号公報
【特許文献２】特公平７−８０７７７号公報
【特許文献３】特公平７−８８３０８号公報
【特許文献４】特許第３０３７３５５号公報
【特許文献５】特開２００６−９６６７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上述べたように、従来の生ミミズから線溶活性物質を含んだ清澄液を得る方法は、いずれも品質的且つ作業効率及び経済性に乏しく、工業的生産効率が低いものであった。
【０００８】
本発明は、前記従来技術の課題に鑑み、濾過工程における清澄液収量率を向上することができるばかりでなく、乾燥工程におけるスプレードライヤーの使用を可能にし、雑菌数を極めて少なくでき、製造工程の削減且つ作業労力を低減することができ、品質的且つ経済性に優れたミミズ体液の製造方法及びミミズ乾燥粉末の製造方法を提供することを目的とするものである。また、従来の雑菌数の抑制方法は、作業環境温度を低くすることにより行われていた。その場合一般細菌数は減少することはないが、本発明の製造方法によれば減少させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、請求項１の発明は、生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物をインキュベーションして自己消化を促し、線溶活性物質を含有したミミズ体液を得ることを特徴とするミミズ体液の製造方法に係る。
【００１０】
請求項２の発明は、請求項１において、生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物に、ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加して、インキュベーションすることを特徴とする。
【００１１】
請求項３の発明は、請求項１または請求項２において、得られたミミズ体液から非水溶物の除去を行うことを特徴とする。
【００１２】
請求項４の発明は、請求項１乃至請求項３のいずれか一項において、原料として、凍結した生ミミズ又はその破砕物をそのまま、又は解凍して用いることを特徴とする。
【００１３】
請求項５の発明は、請求項１乃至請求項４のいずれか一項において、インキュベーションの条件として、温度が２０℃〜６５℃、保温時間が約１０分間〜２０時間であることを特徴とする。
【００１４】
請求項６の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか一項において生ミミズを抗菌砂に混ぜ込んで接触処理させて、当該ミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去することを特徴とする。
【００１５】
請求項７の発明は、請求項１乃至請求項６のいずれか一項の方法によって製造されたミミズ体液を乾燥してミミズ乾燥粉末とすることを特徴とするミミズ乾燥粉末の製造方法に係る。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１の発明によれば、生ミミズ又はその破砕物をインキュベーションすることにより、ミミズの自己消化が促進され、線溶活性物質を含有したミミズ体液が自然に滲出してくるため、この体液を採取することによりミミズ体液を効率良く得ることができる。尚、ミミズを破砕する工程を削減した場合、破砕によって生じる微細な粉砕物が抽出液に含まれないため、濾過器具における目詰まりが解消し、遠心分離工程における上清液の回収効率が向上し、ミミズ体液の収量が増加するのに加えて作業性も良好となる。
【００１７】
本発明者は、生ミミズ又はその破砕物をインキュベーションすることにより、ミミズ体液が自然に滲出することを、次の観点から知得した。ミミズ養殖場や圃場において、生活環境が劣悪になってくるとミミズの姿が消失することがしばしば観察された。この現象はミミズがより良い餌場を求めて移動するのではないかと予想する意見もあったが、本発明者は、餌を捕食できなくなったために生じるミミズの自己消化に起因するのではないかと考察した。そして、鋭意実験を行なった結果、生ミミズ又はその破砕物をインキュベーションすることによって、ミミズの自己消化が促進され、非水溶性物が除去されたミミズ体液が簡便に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
請求項２の発明によれば、生ミミズ又はその破砕物に、ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加してインキュベーションを行なうことにより、ミミズ体液中の大腸菌群や黴類、酵母類の常温菌を減じることができる。
【００１９】
請求項３の発明によれば、得られたミミズ処理液は微細な非水溶物を含まないため、濾過工程が簡便になり、例えば、フィルタープレスを使用した場合の液収量は９０％を越える。これにより、アトマイザーの目詰まりを解消でき、スプレードライヤーによる乾燥工程を採用できるばかりでなく、重金属類の含有率の低いミミズ体液を得ることができる。
【００２０】
請求項４の発明によれば、原料として、凍結した生ミミズ又はその破砕物をそのまま、又は解凍したものを使用できる。この場合、生きたミミズを用いる場合に比べて自己消化温度を広範囲に採ることができるという利点がある。すなわち、凍結した生ミミズを用いると、常温域は勿論のこと、低温域における自己消化工程を採用することもできる。さらに、生きたミミズを扱うよりも、凍結ミミズの方が、運搬や製造計画を図る際に利便性がある。すなわち、生きたミミズの場合には、運搬中の死亡による腐敗の惧れがあるため、注意を払う必要があるばかりでなく、ミミズの搬入後は速やかに作業を行なう必要があり、作業計画がミミズの搬入状況により制約を受けるという不具合が発生するが、凍結ミミズを使用することによって係る問題を解消することができる。
【００２１】
請求項５の記載によれば、インキュベーション温度が２０℃〜６５℃、保温時間が約１０分間〜２０時間であるため、線溶活性を損なうことなく抽出液を効率良く滲出させることができる。これは、本発明者が観察した結果知得した現象であり、生きミミズに給餌することなくミミズの生活温度帯に放置すると、ミミズは飢餓寸前まで痩身しながらも生きており、自己消化時間は長くなる一方、得られる自己消化液の収量が悪くなると共に、品質も低下することが判明した。そのため、ミミズ体液の生産性を考慮すれば、自己消化の速度を早める方策が必要となる。そこで、本発明者は、インキュベーションの際の温度を検討したところ、ミミズの生活帯温度以上に加温すれば、ミミズの自己消化時間を短縮することができることを知得した。しなしながら、確かにインキュベーション温度を高くすればするほど自己消化の速度は早まるが、加温温度は線溶活性の安定性領域を超えないことが要求されることから、生ミミズをそのまま用いる場合のインキュベーション温度は、２０℃から６５℃以下が好ましく、さらに好ましくは４０℃から６０℃以下、またさらに、一般細菌の増殖も抑制するには４５℃から５５℃以下が好ましい。尚、破砕ミミズや凍結ミミズを用いる場合のインキュベーション温度は３０℃以下でも良い。また、インキュベーション温度の設定に際しては、中温菌の殺菌効果を加味することもできる。例えば、大腸菌群を死滅させることを加味するのであれば、一般的には６０℃〜６５℃で３０分以上加熱殺菌を要すると言われているが、ミミズ体液の場合は、４５℃〜６０℃の加熱が好ましい。
【００２２】
請求項６の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか一項において生ミミズを抗菌砂に接触させて当該ミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去する。例えば、市販されているペット排泄用の砂（いわゆる猫砂）等の抗菌砂中に混ぜ込んで接触処理することでミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去する。これにより、除菌フィルター等による濾過操作がなくても菌数を低減したミミズ体液を得ることができる。
【００２３】
請求項７の発明によれば、請求項１乃至請求項６のミミズ体液の製造方法によって得られた非水溶物を除去した抽出液を乾燥させてミミズ乾燥粉末としているため、効率良く、且つ品質に優れたミミズ乾燥粉末を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明が本実施形態に限定されないことは言うまでもない。
【００２５】
本発明におけるミミズ体液の製造方法は、生ミミズをそのまま又はその破砕物をインキュベーションして、線溶活性物質としての抽出液を得るものである。また、ミミズ粉末の製造方法は、本発明のミミズ体液製造方法によって得られたミミズ体液を乾燥するものである。
【００２６】
本発明に係るミミズ体液の原料となるミミズは、生きている生ミミズ、凍結した生ミミズ、生ミミズをミンチやホモゲナイズしたペースト状のものである。ミミズの品種はとくに制限されない。例えば、アカミミズ、シマミミズ、ツリミミズ、ハタケミミズ、フツウミミズ等を挙げることができる。また、養殖ミミズ、天然ミミズの何れでも良い。生ミミズは、水中に所定時間浸漬する等して消化官内の糞土を吐出させたものを使用するのが好ましい。凍結したミミズを用いる場合、生ミミズを−１０℃以下に凍結させるのが好ましい。ペースト状にする方法は、公知の手段を用いて行なうことができる。例えば、磨砕機や擂潰し器、ホモゲナイザー、ホモミキサー等を用いて行なうことができる。
【００２７】
本発明でいうインキュベーションとは、生ミミズ又はその破砕物、あるいは凍結ミミズやその解凍物を所定の容器に投入し、必要に応じて攪拌を行い、所定温度で保温しながら所定時間放置することによって行う。このインキュベーション温度は、高いほど抽出に要する時間を短縮することができるが、ミミズ酵素は高すぎるとミミズ体液の線溶活性が損なわれるため、線溶活性の安定領域を超えない温度（６５℃以下）とする必要があり、２０℃から６５℃の範囲が好ましい。また、インキュベーション温度を４５℃以上にすることにより、常温菌の殺菌効果も期待できる。
【００２８】
インキュベーション時間は、適宜設定することができ、放置時間が長いほど線溶活性には好ましいが、雑菌が繁殖し易くなる。作業性を考慮して一夜（１０時間以上）のインキュベーション時間も採用できる。また、ホモゲナイズやミンチにしたミミズを使用する場合は、インキュベーション時間を更に短縮することができる。通常、インキュベーション時間は、約１０分〜７時間の範囲で適宜設定される。インキュベーション温度が高いほどインキュベーション時間を短縮することができる。例えば、インキュベーション温度が３０℃〜４５℃の場合、１時間〜２０時間、インキュベーション温度が４５℃〜６５℃の場合は、０．５時間〜７時間とすることができる。尚、濾過性の改善のみを目的とするならば、ごく短時間の加温で充分であり、例えば、生ミミズを用いる場合は４５℃で０．５時間以内のインキュベーション時間で良く、ペースト状にしたミミズであれば温度やインキュベーション時間を更に下げることができる。また、清澄液の回収率向上や雑菌の除去を重視するのであれば、加温時間を延長するか、加温温度を高くすれば良い。例えば、凍結ミミズを使用するのであれば、５０℃到達後３時間前後のインキュベーションを行えば良い。
【００２９】
生ミミズ又はその破砕物には、殺菌作用を有するネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加してインキュベーションするのが好ましい。これにより、大腸菌群や黴類、酵母類の常温菌を減じることができる。特に、前記インキュベーション温度が４５℃以下の場合に効果的である。尚、前記ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものは、インキュベーション後のミミズ体液に添加するものでも良い。適用できるネギ科植物群としては、ニンニク、タマネギ、ネギ、ラッキョウ、ワケギ、ニラ等を挙げることができ、これらの群から選択される少なくとも一種以上を単独、または複合して使用することができる。また、生ミミズ又はその破砕物との混合比率は、重量比で９５：５から５：９５の範囲で適宜設定できるが、９５：５から４０：６０の範囲がより好ましい。
【００３０】
前記インキュベーションによって得られたミミズ体液からは非水溶物の除去を行なうのが好ましい。非水溶物の除去は、遠心分離や濾過処理等によって行なうことができる。尚、とくにミミズを粉砕しない場合はフィルタープレス等の圧窄装置を使用してミミズ体液の濾過を簡便に行なうことができ、非水溶物及び重金属類の含有率の低い製品を提供することができる。また、フィルタープレスを使用した場合は９０％を越える高い体液回収率を得ることができる。
【００３１】
本発明の製造方法によって得られた清澄なミミズ体液は、その後乾燥されてミミズ乾燥粉末とされる。ミミズ乾燥粉末は機能性食品や血栓症治療薬の原料の一つとして利用される。ミミズ体液の乾燥は、ミミズ体液に乾燥助剤（例えば、乳糖、デキストリン、セルロースパウダーのような糖類、ゼラチンやカゼイン分解物、牛血清アルブミンのようなタンパク質類）を必要に応じて加え、公知の凍結乾燥あるいはスプレードライヤーを使用して常法によって行なうことができる。
【００３２】
インキュベーションにより得られるミミズ体液の線溶活性と大腸菌群について、以下に記述する試験を行った。尚、線溶活性はプロアテーゼ活性で代替試験した。プロアテーゼ活性の測定方法と大腸菌群の測定方法は以下のとおりである。
【００３３】
[プロアテーゼ活性の測定方法]
予め３７℃に加温した１％ミルクカゼイン溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）２．９ｍｌに、適宜希釈した試料溶液を０．１ｍｌ加えて混和し、３７℃で１５分間反応させる。１５分後に４％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液を３ｍｌ加えてよく混和し、１０分以上３７℃で放置した後、遠心分離して上清液を得た。この上清液の２８０ｎｍ吸光度を測定し、以下の計算により活性表示を行なった。尚、ブランク値は反応０時間について同様の操作を行なって求めた。
活性＝（酵素反応液のＡ２８０ｎｍ−ブランクのＡ２８０ｎｍ）×（酵素の希釈度）
【００３４】
[大腸菌群の測定方法]
デオキシコレート寒天培地（ＯＸＯＩＤ）を、所定の方法によって溶解し、ミミズ乾燥粉末の１０％水溶液または適宜希釈したミミズ体液の１ｍｌをシャーレに投入し、そこへ溶解した寒天培地を１５ｍｌから２０ｍｌ加えて混和した。恒温槽内で３７℃、４８時間インキュベートした後、出現したコロニー数をカウントし、希釈倍数を乗じて大乗菌群数とした。
【００３５】
ここで、加温温度と加温時間と大腸菌群との関係を説明すると、
（１）一般に大腸菌の生育温度は０〜４５℃と言われている。
（２）食品中の大腸菌群を殺菌する一般的な条件としては、６０〜６５℃で３０分と言われている。
（３）この大腸菌群を殺菌する条件をミミズ酵素の乾燥粉末製造工程に使用することはできない。何故ならば、この条件はミミズ酵素の不安定性領域であるので、製造ラインではその制御が困難である。
（４）そこで、ミミズ酵素を製造できるより実用的な殺菌条件を検討した結果、従来言われている条件よりも緩やかな条件でミミズ体液を処理することができ、ミミズ酵素を損なうことなく大腸菌群を死滅させることができる。
【００３６】
[試験例１] インキュベート温度３５℃
凍結生ミミズ２００ｇをビニール袋に収容し、袋の開口を閉じて３７℃の恒温水槽に投入して加温し、加温時間の任意の経時点毎に１８ｍｌずつサンプリングし、その半分の９ｍｌを、予め擂り下ろしたニンニク３ｇを入れておいた蓋付きチューブ（商品名：ＳＵＭＩＬＩＯＮ、１５ｍｌ遠心チューブ）に投入してよく混和し、密栓後、恒温水槽（３７℃）に再度投入して加温し続けた（全２４時間）。サンプリングした残り半分の９ｍｌにはニンニクを添加せず分析日まで冷凍保存した。尚、プロアテーゼ活性の測定試料は上記加温液を遠心分離機（１００００Ｇ）によって上清液を得てこれを供した。遠沈管の底に貯留した非水溶物量は、無加温時に６割強であったのに比して、６時間加温後は２割程度に減少した。試験結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１の試験結果から明らかなように、インキュベーション温度を大腸菌群が増殖し易い温度で行なう場合は、ニンニクの添加を必要とすることが分かる。
【００３９】
[試験例２] インキュベーション温度５２℃
恒温水槽の温度を５２℃にした以外は、試験例１と同様に試験し、同様の手法で分析した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２の試験結果から明らかなように、大腸菌群が増殖できない温度をインキュベーション温度として採用することにより、ニンニクを添加しなくても大腸菌群を減じることができ、インキュベーション温度が高い方が線溶活性が短時間で高値になることが分かった。
【００４２】
[試験例３] インキュベーション時の加温効果試験
インキュベーション時における加温の効果を、次のようにして遠心分離した上清液量の収得量で判定した。糞土を除去したミミズを一夜放置することにより腸内内容物を吐出させ、洗浄した生ミミズ１００ｇを軽くミキサーで粉砕してペースト状にしたものをビーカーに入れ、３０℃の恒温水槽で加温してインキュベーションしたところ、１時間後にはペースト状ではなくなり、液状となっていた。これを３時間後に（２４０００Ｇ）遠心分離し、採取した上清液量を測定したところ７６ｍｌであった。一方、ペースト状に破砕したものを、そのまま加温することなく遠心分離した場合の上清液量は１８ｍｌであった。このことから、インキュベーション時に加温することによってミミズ体液の収量が増加することが分かる。
【実施例１】
【００４３】
糞土を除去したミミズを一夜放置することにより腸内内容物を吐出させ、その後洗浄して凍結させたミミズ５ｋｇをビニール袋に収容し、擂り下ろしたニンニク２００ｇを加えて封止したものを５個作成し、５０℃から５５℃の恒温槽に投入して解凍した。凍結部分がなくなってから３時間後に、解凍ミミズから滲出したミミズ体液をビニール袋から取り出し、珪藻土を２重量％添加した後、フィルタープレス機にて濾過し、非水溶物を除去した。濾過性能は非常に良く、プロアテーゼ活性が１．０１／ｍｌのミミズ体液の濾過液４．６ｋｇを得た。
【実施例２】
【００４４】
実施例１で得られた濾過液４ｋｇをバケツに投入し、前記濾過液４ｋｇに乾燥補助剤としてパインデックス＃１００（商品名：松谷化学製）を１．６ｋｇ加え、乾燥室容積０．８ｍ３のスプレードライヤーを用いて乾燥し、ミミズ乾燥粉末２．２７ｋｇを得た。
乾燥条件：入口温度；１４０℃、出口温度；８０℃から８５℃、液投入速度；２．６リットル／時
【００４５】
得られたミミズ乾燥粉末について、重金属試験、雑菌試験、線溶活性の代替測定としてのプロアテーゼ活性を測定した。プロアテーゼ活性の回収率は８５％であった。また、黴・酵母類は下記の測定方法では検知できず、大腸菌群数も検知できなかった。重金属類の測定を外部機関に委託したところ、総水銀、鉛、カドミウムは測定限界濃度以下であり、砒素は１ｐｐｍであった。
【００４６】
[黴・酵母類の測定]
ツアペック・ドッグス寒天培地（日水製薬製）を所定の方法に従って溶解、殺菌する。予め殺菌生理食塩水で作製した乾燥粉末の２０％溶液の１ｍｌをプレートに加えた後、上記殺菌培地１０ｍｌ（５０℃以下）を加えて混和し、３０℃で５日間培養した後に出現した黴のコロニー数をカウントした。
【００４７】
酵母類の測定は、ＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ）にストレプトマイシンを３０ｐｐｍ（終濃度）加えた培地を用いた以外は上記の方法に準じて行なった。
【００４８】
また、ｐＨ処理を行い単位重量当たりの比活性を高めることにより、錠剤は無論のこと、ハードカプセル、ソフトカプセル製剤の小型化が可能になり、また、臭気を軽減できるので液状剤の製造が可能になる。
【００４９】
[試験例４] ｐＨ処理効果試験
未加温の生ミミズから得たペーストを遠心分離機により非水溶物を除いて上清液を得る。この上清液（ｐＨ６）を１Ｎ塩酸溶液でｐＨを４〜５に調整する。不溶物が発生するのでそれを遠心分離機で除き、上清液のカゼイン分解活性を測定した。続いて、このｐＨ調整して除沈した液を凍結乾燥して活性を測定した結果、下記の表の結果を得た。
【００５０】
【表３】
【００５１】
表３より明らかなように、ミミズペーストをｐＨ処理して沈殿除去することにより、ミミズペーストの除沈液を凍結乾燥した粉末より２割弱の高活性な凍結乾燥粉末を得ることができる。また、ミミズペーストをそのまま凍結乾燥した粉末と比較すると、約５割以上の高い活性を有する凍結乾燥粉末を得ることができる。
【実施例３】
【００５２】
泥を吐かせて洗浄し、凍結保存してある生ミミズ１Ｋｇを軽くミキサーにかけてミミズペーストを得た。このペーストを１Ｎ Ｈｃｌを用いてゆっくりとｐＨ４．５に調整した後、ろ過助剤として４０ｇのケイソウ土を加えてよく混合し、吸引瓶で濾過した。水で押し出しして９１０ｍｌの濾液を得、それを凍結乾燥機にかけ、１０６ｇの粉末を得た。プロアテーゼ活性を測定した結果、△Ａ２８０ｎｍ ８．１／ｇであった。
【００５３】
[試験例５]
上記の実施例と同じ方法で得られた濾液（ｐＨ未調整）を加温温度と時間を変えて処理し、一般細菌数と大腸菌群数を測定した。方法は、前者は日水製薬株式会社製標準寒天培地を、後者は日水製薬株式会社製デオキシコレート培地を使用し、それぞれの使用法に従って実施した。その結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】
表４から下記のことが分かる。
（１）ミミズに生息する大腸菌群は４３℃で生育は止まっているようで、４６℃になると生育停止から死滅へと移行するが、完全死滅にはいたらない。それには４９℃、２時間以上の加温を行う必要がある。
（２）一般細菌は４６℃以上の加温で少なくなるが、４９℃５時間の加温処理でも全滅させることは不可能である。やはり除菌フィルターのような除菌操作が必要である。
【実施例４】
【００５６】
泥を吐かせて洗浄して凍結保存してある生ミミズ１Ｋｇを三角フラスコに取り、５５℃の恒温水槽につけ、攪拌しながら内容物が４９℃になるのを待つ。４９度に達したら、恒温水槽の温度を５０℃に落とし、三角フラスコの口をラップしてそのまま放置した。３時間後にフラスコを取り出し、ろ過助剤であるケイソウ土（殺菌済み）を２０ｇ加え、よく攪拌した後吸引ろ過した。水で押し出して９８０ｍｌの濾液を得、その１ｍｌを日水製薬株式会社製ＢＧＬＢ培地で培養して大腸菌群の存在を検査したところ、陰性であった。尚、濾過以降に使用した容器類は全て煮沸殺菌した。
【００５７】
前記実施例で得られた濾液を冷却し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に調整後、１０ｇのケイソウ土を加えて混合し、吸引濾過によって濾液を得、その濾液３００ｍｌを凍結乾燥により粉末化した。プロアテーゼ活性が９．２（△Ａ２８０ｎｍ／ｇ）で、一般細菌数２，６００個／ｇ、大腸菌群陰性（ＢＧＬＢ培地）の粉末３．２ｇを得た。尚、試験に使用した容器類は煮沸殺菌した。
【００５８】
[抗菌砂：抗菌性銀担持体の検討]
銀を担持させた抗菌砂（抗菌性担体）が市販されている。これに生ミミズを混ぜ込んで接触処理することにより、本発明者らはミミズに存在する一般細菌を減少させることができるのではないかと考え試験した。試験に供した銀担持体はキッズサンド（商品名：アイニック株式会社製）、ノバロン(商品名：東亞合成株式会社製)である。その結果、一般細菌数を大きく減少させることができた。また、抗菌性銀担持体の単独使用ではミミズ体液を粉末にした場合の目標値である一般細菌数３０００個／g以下を達成できないことが判ったが、加温処理と併用することにより、より確実にミミズ乾燥粉末の雑菌数を減じることができた。
【００５９】
[試験例６]
泥を吐かせたミミズ１００gを抗菌性銀担持体４００gに混ぜ込み、一夜放置する。その後、ミミズをより分け、１リットルの水道水にミミズを泳がせてミミズ体表に付着している土等を軽く洗い落とした後、ミキサーでペーストにした。このペーストを適当に希釈して一般細菌数を測定した結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
【実施例５】
【００６１】
水を含ませたキッズサンド２Ｋｇを入れたバット（３００×２５０ｍｍ）に泥を吐かせた生ミミズ３００ｇを投入し、上から布を被せてミミズが逃げ出さないようにして一夜放置した。その後、ミミズを水道水でよく洗浄し、三角フラスコに移して５５℃の恒温水槽に浸し、時々攪拌しながら内容物が４９℃になるのを待つ。４９℃に達したら、恒温水槽の温度を５０℃に落とし、三角フラスコの口をラップしてそのまま放置した。３時間後にフラスコを取り出し、濾過助剤であるケイソウ土（殺菌済み）を９g加え、よく攪拌した後、吸引濾過した。水で押し出しして２６０ｍｌの濾液を得て凍結乾燥を行ったところ粉末２．９ｇを得た。この粉末の大腸菌群は陰性（ＢＧＬＢ培地）で、一般細菌数は＜１０００個／ｇであった。尚、粉末の銀含量をＩＰＣ発光分析法で測定したが測定限界以下（０．１ｐｐｍ未満）であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物をインキュベーションして自己消化を促し、線溶活性物質を含有したミミズ体液を得ることを特徴とするミミズ体液の製造方法。
【請求項２】
生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物に、ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加して、インキュベーションすることを特徴とする請求項１記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項３】
得られた線溶活性物質含有液から非水溶物の除去を行うことを特徴とする請求項１又は請求項２記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項４】
原料として、凍結した生ミミズ又はその破砕物をそのまま、又は解凍して用いることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項５】
インキュベーションの条件として加温温度が２０℃〜６５℃、保温時間が約１０分間〜２０時間であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項６】
生ミミズを抗菌砂に接触させて当該ミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか一項の方法によって製造されたミミズ体液を乾燥してミミズ乾燥粉末とすることを特徴とするミミズ乾燥粉末の製造方法。
【請求項１】
生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物をインキュベーションして自己消化を促し、線溶活性物質を含有したミミズ体液を得ることを特徴とするミミズ体液の製造方法。
【請求項２】
生ミミズ又は当該生ミミズ破砕物に、ネギ科植物のペースト又は窄汁あるいはこれらの物質から非水溶物を除去したものを添加して、インキュベーションすることを特徴とする請求項１記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項３】
得られた線溶活性物質含有液から非水溶物の除去を行うことを特徴とする請求項１又は請求項２記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項４】
原料として、凍結した生ミミズ又はその破砕物をそのまま、又は解凍して用いることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項５】
インキュベーションの条件として加温温度が２０℃〜６５℃、保温時間が約１０分間〜２０時間であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項６】
生ミミズを抗菌砂に接触させて当該ミミズの体表及び消化器官の雑菌類を除去することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載のミミズ体液の製造方法。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか一項の方法によって製造されたミミズ体液を乾燥してミミズ乾燥粉末とすることを特徴とするミミズ乾燥粉末の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−２７５２５１（Ｐ２０１０−２７５２５１Ａ）
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３１００４（Ｐ２００９−１３１００４）
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【出願人】（５０３１１７７７１）有限会社美原エルアール研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【出願人】（５０３１１７７７１）有限会社美原エルアール研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
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