メチオニンにより官能基化された両親媒性ポリマー
本発明は、疎水性基及びメチオニン基を含む、新規な両親媒性ポリマーに関する。
本発明は、活性成分、特にその配列中に、酸化に敏感な少なくとも１のアミノ酸を含む活性成分、と非共有結合的に結合されたそのようなポリマーを含む、制御された放出プロフィールを有する組成物にもまた関する。
本発明は、活性成分、特にその配列中に、酸化に敏感な少なくとも１のアミノ酸を含む活性成分、と非共有結合的に結合されたそのようなポリマーを含む、制御された放出プロフィールを有する組成物にもまた関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性の骨格を有し、かつメチオニン基を含む疎水性基を有する、新規な両親媒性ポリマーに関する。
【０００２】
一般的に、両親媒性ポリマーはその化学構造に依存して、変化する大きさのナノ粒子を水性媒体中において形成することができる。即ち、その骨格が直鎖、親水性であり、かつ疎水性の側鎖基を有するポリマーは、水中において容易にナノ粒子を形成することができる。これらのナノ粒子は、その製造に使用されるベースの物質に依存して、生体適合性であり得、任意的に生分解性であってもよい。それらは、医薬品のベクター化のために、医薬品の分野において特に使用される。
【０００３】
この分野においては、本出願人の会社は、数十年間、種々の疎水性基を含み、Ｍｅｄｕｓａ（商標）として知られている、ポリアミノ酸に基づくナノ粒子系及びミクロ粒子系を開発してきている。
【背景技術】
【０００４】
すなわち、ＦＬＡＭＥＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳの特許出願、国際公開第２００３／１０４３０３号パンフレットは、水中においてインスリンを結合できるナノ粒子を形成するアルファ−トコフェロールグラフトを含むグルタミン酸ポリマーを記載している。刊行物ＹＰ．Ｃｈａｎらの「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．」２００７年、第４巻、第４号、４４１〜４５１頁は、これらのナノ粒子及びタンパク質、例えばインターフェロンアルファ又はインターロイキン２、と一緒に製造された配合物は、ヒトにおける皮下注射後に、少なくとも１週間に等しい期間の間、測定可能な細胞質濃度を得ることを可能にすることを記載している。同様に、プルランに基づき、かつコレステロールグラフトを含む両親媒性ポリマーは、水性媒体中で集合して、タンパク質例えばインスリンを可逆的に結合することのできるナノ粒子を形成することが公知である（アキヨシら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９８年、第５４巻、第３１３〜３２０頁）。キトサン又はデキストランに基づく他の類似のポリマーは、特にハイドロゲルフィルム又はインプラントを得るために開発されてきた（国際公開第００／１４１５５号パンフレット）。
【０００５】
上記から明らかなように、タンパク質及びペプチド配合物の分野における両親媒性ポリマーの使用はたくさんある。
【０００６】
不幸なことに、５℃において少なくとも２年の間、水性媒体中で安定である両親媒性ポリマー／タンパク質配合物を得ることは、特に、酸化に関してある種の治療用タンパク質の脆弱性に関して主要な挑戦のままである。
【０００７】
実際、ある種のアミノ酸、例えば多くのタンパク質又は酵素の成分であるメチオニン、システイン、ヒスチジン、又はトリプトファンは、後者の形成の間又は経時的にさえ、酸化することができる。明らかな理由から、この酸化現象は、これらのアミノ酸を含む活性成分の生物学的活性に有害な影響を有し得る（クリーランドら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９３年、第１０巻、第３０７〜３７７頁）ことは広く認識されている。
【０００８】
この所望されない酸化を防ぐために、タクリュリは１９９３年に、それらをメチオニンと一緒に配合することにより、メチオニンをその配列中に含むタンパク質又は酵素を使用することを提案した（米国特許第５，２７２，１３５号）。この概念は、タンパク質を含む配合物の安定性の分野において働く当業者には今、周知である。例えば、特許出願、国際公開第２００８／１４５３２３号パンフレットは、２〜７５ｍＭのメチオニンを含むインターフェロンアルファ配合物を記載し、米国特許出願公開第２００３／０１０４９９６号明細書はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）又はハイパーグリコシル化エリスロポイエチン（ＮＥＳＰ）の配合物であって、その分解は５０ｍＭまでの範囲の量のメチオニンの添加により制限される配合物を記載している。
【０００９】
それにもかかわらず、酸化を防止するためのこの選択肢は完全には満足できない。
【００１０】
即ち、後者のための酸化安定性を保証するために、タンパク質又は酵素と結合されるメチオニンの量は、もちろん、タンパク質の性質、その濃度、該配合物のｐＨ及び他の要素に依存して変化し得る。他方、このタンパク質又はこのペプチドは、前に定義された両親媒性ポリマーと結合された形ですでに使用されるとき、メチオニンの有効性は変化されることができる。最後に、そのような両親媒性ポリマーから得られるインプラント又はゲルの特定の場合には、添加されたメチオニンは該インプラント又はゲルに均一かつ永久的に分布されることができないので、その有効性を喪失し得る。
【００１１】
本発明は、上記の不十分さを正確に補うことを目的としている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
より正確には、本発明の目的は、活性成分、より特に、酸化現象に必然的に敏感であるタンパク質、ペプチド又は酵素のタイプのビヒクルとして使用されることができ、かつこの現象に対する安定性をそのような活性成分に正確に保証することのできる、新規なタイプの両親媒性ポリマーを提案することである。
【００１３】
本発明の別の本質的な目的は、これらのポリマーが、さらに活性成分を結合させる傾向を有し、従って、活性成分のベクターとして使用されることができ、従って、たくさんの活性成分と容易に結合して、それらを生体内で放出する能力を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
結果として、その特徴の一つに従うと、本発明は、親水性の骨格を含む両親媒性ポリマーにおいて、該骨格が少なくとも１のメチオニンの側鎖又はその誘導体の一つ及び該メチオニン又はその誘導体の一つと異なる複数の疎水性の側鎖を有することを特徴とする、該両親媒性ポリマーに関する。
【００１５】
好ましくは、一又は複数のメチオニン基及び／又は複数の疎水性基はランダムに配置されている。
【００１６】
その別の特徴に従うと、本発明は、上記のポリマーを活性成分（ＡＩ）、特に酸化に敏感であるタンパク質又はペプチドのベクター化のために使用する方法に関する。
【００１７】
その別の特徴に従うと、本発明は、活性剤と組み合わされている又は組み合わされていない、本発明に従う少なくとも１のポリマーを含むナノ粒子に関する。
【００１８】
そのさらに別の特徴に従うと、本発明は、本発明に従うポリマーを及び活性成分含み、ナノ粒子の状態に組織されている又はされていない組成物に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明の文脈において、用語「メチオニン」は、ほかに明記されなければ、メチオニン残基又は後者の誘導体、特に以下に定義されるもの、のいずれかを意味するために使用される。
【００２０】
本発明の意味内において、本開示の全体において、１以上の活性成分と本発明に従って考慮されているポリマーの相互作用を特定するために使用される、用語「組み合わせ」又は「組み合わせる」は、特に、一又は複数の活性成分がポリマーに特に疎水性及び／又は静電的相互作用により結合されている、及び／又は１又は複数のポリマーにより溶解されていることを意味する。
【００２１】
本発明の意味内において、用語「側鎖」は疎水性及びメチオニンの基がペンダント状の基又は直鎖の骨格上のグラフトとしてもまた見えるように配置されていることを意味する。
【００２２】
本発明の意味内において、「ランダムに」により、一又は複数のメチオニン基を有する本発明の両親媒性ポリマーの一又は複数のモノマー単位、及び一又は複数の疎水性の基を有する本発明の両親媒性ポリマーの一又は複数のモノマー単位が、親水性の骨格内に、隣接する単位の性質とは独立して、不規則な態様で分布されていることが意味される。
【００２３】
以下から明らかであるように、安定なナノ粒子系、及び一方では１以上のメチオニン側鎖グラフトを、他方ではメチオニンとは異なるいくつかの疎水性の側鎖を含む親水性の骨格を形成することができる両親媒性ポリマーの新規な群を開発してきたことは出願人の会社の名誉である。
【００２４】
書類国際公開第２００８／０９４１４４号パンフレットは、メチオニン及び／又はシステイングラフトを有するポリアスパラギン酸タイプの親水性ポリマーを既に記載している。しかし、このタイプのポリマーは、本発明に従って要求されるメチオニンとは異なる疎水性のグラフトがない。さらに、それは該パンフレットにおいては、ナノ粒子の表面処理の目的のためだけに提案されている。従って、この書類は、メチオニンの抗酸化活性には全く関係がなく、この現象に正確に敏感である活性成分の酸化安定性を保存することができるポリマー状のビヒクルを開発する目的のための、後者の潜在的な安定化（ｖａｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ）にもさらに関係ない。
【００２５】
すべての期待に反して、本発明者らは、両親媒性ポリマー上のグラフトの状態におけるメチオニンの存在は、一方では、活性成分と結合するその能力に、他方では、水性媒体と接触に至らせられたときに、ナノ粒子の状態で組織化される能力にさらに影響を与えることなく、該ポリマーに有意な抗酸化活性を与えることを可能にすることに注目した。
【００２６】
さらに、本発明に従って考慮されるポリマーは、有利には、メチオニンのグラフト速度に関して抗酸化活性について調節するのに有利に役立つ。メチオニングラフト化速度を改良するこの可能性は、該ポリマーによって安定化されなければならないタンパク質又はペプチドの酸化感受性の機能として、特にそれが本発明に従うポリマーの抗酸化活性を調節することを可能にするという事実に鑑みて特に重要である。
【００２７】
両親媒性ポリマー
− 親水性骨格
上記のように、本発明に従って考慮される両親媒性ポリマーは、親水性の骨格を有する。
【００２８】
有利には、本発明に従って考慮されるポリマーは、水に、特に、５〜８に含まれるｐＨにおいて、可溶であるポリマー状の骨格を有する。
【００２９】
この骨格は、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアクリレート又はポリメタクリレートのファミリーに属するポリマー又はコポリマーから特に選択されることができる。
【００３０】
従って、以下は全く特に適切である。
− ポリアミノ酸例えばポリ（グルタミン酸）（アルファ又はガンマタイプのもの）、ポリ（アスパラギン酸）（アルファ又はアルファ／ベータタイプのもの）、ポリリジン（アルファタイプのもの）又はこれらの同じアミノ酸の組み合わせにより形成されたコポリマー、
− ポリ（アクリル酸）又はポリ（メタクリル酸）、及び
− 多糖類、例えばデキストラン又はその誘導体例えばカルボキシメチルデキストラン又はヒドロキシエチルデキストラン又はプルラン。
【００３１】
特定の実施態様に従うと、本発明の両親媒性ポリマーの親水性骨格は、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリリジン又はそれらのコポリマーから選択されたポリアミノ酸である。
【００３２】
本発明に従って使用されることのできるある数のポリマー、例えば変化しえる質量のポリ（アルファ−Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（アルファ−Ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ガンマ−Ｌ−グルタミン酸）及びポリ（アルファ−Ｌ−リジン）タイプは、市販入手可能である。
【００３３】
さらに、本発明の両親媒性ポリマーの親水性の骨格を形成することのできるポリマーは、当業者に公知の方法により得られることができる。
【００３４】
例えば、アルファタイプのポリグルタミン酸ナトリウムの合成は、論文「バイオポリマー」、１９７６年、第１５巻、第１８６９頁及びＨ．Ｒ．クリヒェルドルフによる書籍「アルファ−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物及び関連するヘテロ環」、スプリンガー出版（１９８７年）に記載されているように、Ｎ−カルボキシ−アミノ酸無水物（ＮＣＡ）の重合により行われることができる。ＮＣＡの誘導体は好ましくはＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｒ３（Ｒ３＝メチル、エチル又はベンジル）である。次に、該ポリマーは適切な条件下、加水分解されて、その酸の形のポリマーを得る。これらの方法は、出願人の会社のフランス国特許第２８０１ ２２６号に与えられた記載に基づく。
【００３５】
これらのポリマーは、活性化可能な基として、カルボキシル、アミン又はアルコール官能基を有する。従って、それらのグラフトは困難なしに想定されることができる。
【００３６】
一般的に、親水性の骨格を有する直鎖のポリマーは、一又は複数の疎水性の基及びメチオニン又はメチオニン誘導体により同時に又は順番にグラフト化される。
【００３７】
−疎水性基及びメチオニン基
本発明の本質的な特徴に従うと、本発明のポリマーは、少なくとも１のメチオニン基（ＭＧ）及びペンダント状の、メチオニンとは異なる疎水性基（ＨＧ）でグラフト化される。
【００３８】
− メチオニン基（ＭＧ）
本発明の意味内において、表現「メチオニン誘導体」により、より特に置換誘導体体、特にメチオニンのアミン又はカルボキシル官能基のレベルにおける置換誘導体が意味される。
【００３９】
これらは例えば、メチオニンアミド又はメチオニンエチルエステルである。
【００４０】
これらの化合物は、メチオニンのアミン官能基によるカップリング反応を行うのに、より特に有利である。
【００４１】
メチオニンは、２つの反応性官能基、カルボン酸及び一級アミン、を含み、実行されるカップリング反応に依存して、該官能基の１又は他は保護されなければならないことは明らかである。
【００４２】
本発明のポリマーにおいて使用されることのできるメチオニンは、Ｌ、Ｄ配置又はラセミ体の混合物であることができる。
【００４３】
グラフトのタイプに依存して、結合官能基は、アミド又はエステルタイプである。メチオニン基は、一度、ポリマーにグラフトされると一般的に以下の３つの構造のうちの一を有する：
【００４４】
【化１】
【００４５】
ここで
− Ｒａはヒドロキシ基（任意的に脱プロトン化されていてもよい）、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＮＨＣＨ３又はＮ（ＣＨ３）２を表し、
− Ｒｂ及びＲｃは、独立して水素原子、メチル又はエチルを表し、
Ｒｂ及びＲｃ基のうちの一が水素原子であるときには、他の基はＣ１〜Ｃ６のアシル基を表し、メチオニンの配置はＬ、Ｄ又はラセミ混合物であることができる。
【００４６】
− 疎水性基（ＨＧ）
疎水性基は、実際には、そしてこれは制限的であることなしに、アルコール及びアミンを含む群から選択され、これらの化合物は、当業者により容易に官能基化されることができ、それらのグラフト化はメチオニン誘導体に要求されるものに類似の反応を行う。
【００４７】
好ましい特徴に従うと、疎水性基（ＨＧ）は、５〜３０の炭素原子を含む。
【００４８】
これらの疎水性基（ＨＧ）は、以下、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐状のＣ５〜Ｃ３０アルキル、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、
− 及び任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１０〜Ｃ３０（ポリ）環状物
を含む群から有利にかつ思慮深く選択される。
【００４９】
より特に、疎水性基（ＨＧ）は、例えば以下、
− ドデカノキシ、テトラデカノキシ、ヘキサデカノキシ、オクタデカノキシ、オレイロキシ、トコフェリル又はコレステリル、アミノヘキシル、アミノヘキサデシル及びアミノオクタデシル、
− ラウリル、ミリスチル、パルミチル及びステアリル、
− 疎水性アミノ酸例えばロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン又はその誘導体の一つ
を含む群から選択されることができる。
【００５０】
疎水性基がアミノ酸であるとき、それは以下の（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）の構造の一つに対応する誘導体であることができ、ここでＲａ、Ｒｂ及びＲｃは以前に与えられた定義に相当し、Ｒｄは、ポリマー及び実施されたグラフト反応のタイプに依存するアミノ酸残基に対応する。
【００５１】
【化２】
【００５２】
あるいは、一又は複数のメチオニン又はメチオニン誘導体及び／又は該疎水性基は、それらをポリマー鎖に結合させることを可能にするスペーサーによりポリマー状骨格に結合されることができる。このスペーサーは、有利には２価であり、特にアミノ酸単位、アミノアルコール誘導体、ジアミン誘導体、ジオール誘導体及びヒドロキシ酸誘導体を含む群に属する。
【００５３】
本発明の特定の実施態様に従うと、両親媒性ポリマーの親水性骨格はポリ（Ｌ）グルタミン酸ナトリウムであり、疎水性基は合成起源のトコフェリル基であり、好ましくはメチオニン誘導体はメチオニンアミド又はメチオニンエチルエステルである。
【００５４】
結果として、本発明の好ましい両親媒性ポリマーは以下の一連の一般式（Ｉ）により構成される事実により図式的に示されることができる。
【００５５】
【化３】
【００５６】
ここで、
− Ａは親水性ポリマー鎖の単量体単位を表し、
− ＭＧはメチオニン又はその誘導体の一つを表し、
− ＨＧは疎水性基を表し、そして
− Ｅ及びＥ'はそれぞれ０又は１を独立して示すｎ及びｐを有するスペーサー基を表し、
− ａ、ｂ、及びｃは、ゼロとは異なる整数であり、
− 疎水性基ＨＧ及びメチオニン基ｍｇはランダムに分布されている。
【００５７】
有利には、疎水性基のモル百分率は、ｃ／（ａ＋ｂ＋ｃ）の比により表され、メチオニン基のモル百分率は、ｂ／（ａ＋ｂ＋ｃ）比により表される。
【００５８】
本発明に従うポリマーにおける疎水性単位のモルグラフト率は、有利には２〜３０％、好ましくは５〜２０％の範囲である。
【００５９】
本発明に従うポリマーにおけるメチオニン単位のモルグラフト率は、０．５〜２０％の範囲である。
【００６０】
ａ／ａ＋ｂ＋ｃのモル比に関しては、それは４０〜９７．５％の範囲である。
【００６１】
有利には、本発明に従うポリマーは、２，０００〜２００，０００ｇ／モルに、好ましくは５，０００〜１００，０００ｇ／モルに設定されたモル質量を有する。
【００６２】
別の変形に従うと、本発明に従うポリマーは、ポリエチレングリコールタイプの少なくとも１のグラフトを有することもできる。
【００６３】
好ましくは、ポリエチレングリコールのモル質量は、１，０００〜５，０００Ｄａである。該ポリエチレングリコールタイプの基は、以下の構造の一つに従って、図式的に表されることができる。
【００６４】
【化４】
【００６５】
好ましくは、ポリエチレングリコールのモルグラフト百分率は１〜１０％の範囲である。この単位は、本発明に従うポリマーの親水性骨格に直接的に結合されていてもいなくてもよい。
【００６６】
両親媒性ポリマーの製造方法
【００６７】
メチオニンに関して、そのアミン官能基のグラフトは、カップリング剤、例えばカルボジイミド、及び触媒、例えばジメチルアミノピリジン、の存在において、アミン官能基を、両親媒性ポリマー骨格上に存在するカルボキシル官能基とカップリングさせることにより容易に実行されることができる。この反応は、有機溶媒又は水性相において実行されることができる。第二場合において、水溶性カルボジイミドが好ましくは使用される。カルボキシル官能基は、遊離のまま放置されるか、又はエステル又はアミド基を形成する基により保護されることができる。
【００６８】
即ち、ポリマーがアミン又はアルコール官能基を有するとき、メチオニンのグラフト化は、メチオニンのアミン官能基をアシル基で又はジメチル化により前もって保護しておき、カルボキシル基により行われる。これらの反応は、当業者に周知であり、例えば、ハーマンソンによる書籍（生体共役技術、第２版、２００８年、エルゼビア）がこれらの方法を記載している。
【００６９】
その部分については、ペンダント状の疎水性基（ＨＧ）は、ポリマーの活性化可能な官能基及びグラフトの活性化可能な官能基の性質に依存して、アミド、エステル、カーボネート、又はカルバメート官能基によりポリマーに結合されることができる。
【００７０】
好ましくは、メチオニン誘導体に関して、結合はアミド又はエステルタイプのものである。この場合、メチオニン誘導体及び疎水性基のグラフト化は、同時に行われることができる。
【００７１】
疎水性基でグラフト化されたポリアミノ酸を得るためには、縮合剤例えばジイソプロピルカルボジイミド及び触媒例えばジメチルアミノピリジンの存在において、反応性アミン又はアルコール官能基を含む疎水性基とカルボン酸官能基を含むポリマーの間で、カップリング反応が行われる。この反応は、溶媒例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）又はＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）において行われることができる。理想的には、メチオニンのグラフト化が同時に行われる。形成される結合はエステル又はアミド結合である。
【００７２】
カップリング試薬、例えばクロロ蟻酸エステルが、アミド結合の形成のためにもまた使用されることができる（カップリング剤の例は、例えばボダンスツキー「ペプチド合成の原則」スプリンガー出版、１９８４年を参照のこと）。グラフト率は、成分及び試薬の化学量論及び／又は反応時間により化学的に調整される。
【００７３】
アミン基を含むポリマー、例えばポリリジン、又はアルコール基をもまた含むデキストランの場合、考慮される疎水性基は、カルボン酸基を有する。カップリングの後に形成される結合は、特にエステル、アミド、カーボネート又はカルバメート結合である。
【００７４】
実施例として、我々は、疎水性基ＨＧ及びメチオニン基ＭＧの両方を含むことのできる両親媒性ポリマーのいくつかのタイプ及び文献に記載された手順に従ってそれらを得る方法を以下に記載する。
【００７５】
コレステロールでグラフト化されたプルランタイプのポリマーに関して、これは、米国特許第６，５６６，５１６号に記載された手順に従って合成されることができる。次に、反応性のイソシアネートを有する誘導体は、ジイソシアネートを、その酸官能基が−ＮＨ２（アミド）又は−ＯＭｅ（エステル）により保護されているメチオニンと反応させることにより製造される。この手順は標準的であり上記特許の実施例１に記載されている。グラフト化は、実施例２に記載された方法に従って行われることができる。
【００７６】
最後に、ラウロイル基及びメチオニン誘導体でグラフト化されたデキストランタイプのポリマーは、Ｎ−メチルピロリドン中で、デキストランポリマーをラウリル酸の酸塩化物及びＮ−アセチルメチオニンの酸塩化物と反応させることにより得られることができる。ラウロイル基でグラフト化されたデキストランを得るための手順は米国特許第５，７５０，６７８号（実施例１）に記載されている。
【００７７】
同様に、ステアリルアミン及びメチオニンアミドを含むポリアクリレートは、グラフト化段階の間、所望される量で存在するメチオニンアミドを有することにより、米国特許第６，６０７，７１４号に記載された手順に従って製造されることができる。
【００７８】
フェニルアラニンエステル及びメチオニンエステルを含むポリ（ガンマ）グルタメートは、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、第３３巻、第３９８〜３９９頁においてマツサキらにより記載されたプロトコルに従って製造されることができる。水溶性カルボジイミドの存在におけるメチオニンエチルエステル及びフェニルアラニンエチルエステルの混合物が、水中のポリ（ガンマ−グルタミン酸）に同時にグラフト化されることができる。
【００７９】
最後に、ステアロイル基、Ｎ−アセチルメチオニン及びポリエチレングリコール鎖を含むポリリジンは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、２０００年、第１１巻、第８８０〜８９１頁においてブラウンらにより記載された手順に従って製造されることができる。この実施態様において、ポリリジンにグラフト化されるべきメチオニン誘導体は、カルボキシレート上のヒドロキシサクシンイミド基及びアミン官能基上のアセチルを含む。
【００８０】
活性成分（ＡＩ）
本発明の好ましい実施態様に従うと、本発明に従うポリマーと組み合わされることのできる活性成分、ＡＩ、はタンパク質又はペプチド、すなわち酸化の現象に敏感であるＡＩから選択される。
【００８１】
より特に、これらは、その配列中に少なくとも１のメチオニンを含むこれらのペプチド又はタンパク質である。実際、メチオニンは、特に酸化に敏感である。
【００８２】
このカテゴリーにおいて、タンパク質例えば成長ホルモン、インターフェロン、凝固因子タンパク質例えば因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、及び因子ＩＸ、ＥＰＯ、ＧＣＳＦ、及びモノクロナール抗体は、容易に酸化されることが公知である。これらのたんぱく質は、任意的に少なくとも１のポリエチレングリコール鎖を含む。
【００８３】
１以上のＡＩを本発明に従う両親媒性ポリマーと組み合わせる技術は、特に米国特許第６，６３０，１７１号に記載されている。
【００８４】
上記技術は、１以上の活性成分を搭載された又は１以上の活性成分と組み合わされた本発明のポリマーを含む液状媒体において、少なくとも１の活性成分を取り込むことからなる。この取り込みは、以下のように行われることができる：水性溶液にポリマーを入れること、次に、固体の形又は水死溶液の活性成分の添加。
【００８５】
好ましくは、活性成分は、タンパク質、グリコタンパク質、１以上のポリアルキレングリコール鎖に結合されたタンパク質（好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：「ＰＥＧ化されたタンパク質」）を含む群から選択される。
【００８６】
ナノ粒子
有利には、ＡＩと組み合わされた又は組み合わされていない、本発明に従って考慮されるポリマー、特に上で定義されたもの、は、５〜８の範囲にｐＨを有する水性媒体、特に水、に分散されるとき、自発的にナノ粒子を形成することができる。
【００８７】
一般的に、ナノ粒子の形成は、ナノ領域において疎水性基の分離を有する多数のポリマー鎖の自己会合のためである。ナノ粒子は、１以上の疎水性のナノ領域を含むことができる。
【００８８】
ポリマー状ナノ粒子のサイズは、１〜１，０００ｎｍ、特に５〜５００ｎｍ、特に１０〜３００ｎｍ、より特に１０〜２００ ｎｍ、又は１０〜１００ｎｍさえであることができる。
【００８９】
用途
上記のように、本発明の両親媒性ポリマーは、疎水性基の性質、それらのメチオニンのモル百分率及びそれらの重合度に依存して複数の方法で使用され得る。本発明により参照される種々の形態の活性成分のカプセル化のためのポリマーを成形する方法は、当業者に公知である。
【００９０】
より詳細には、これらのいくつかの特に関連する参照文献が、例えば参考にされる。
− ナノ粒子又はミクロ粒子の形の疎水性基を含むポリアミノ酸を有するタンパク質の配合物：国際公開００／３０６１８号パンフレット、国際公開２００５／０５１４１８号パンフレット、国際公開２００７／１４１３４４号パンフレット、国際公開２００８／０２５４２５号パンフレット、国際公開２００８／１３５５６１号パンフレット、
− 疎水性基、例えばコレステロール、を含むプルランを有するタンパク質の配合物：米国特許第６，５６６，５１６号明細書。
【００９１】
その別の特徴に従うと、本発明は上記の少なくとも１のポリマー及び少なくとも１の活性成分、特に酸化に付されるもの、を含む組成物、特に医薬品、化粧料、食事療法の又は植物検疫の組成物に関する。これはより特にタンパク質、ペプチド又は酸化に敏感な酵素である。
【００９２】
特に、タンパク質、ペプチド、又は酵素は、その配列中に少なくとも１のメチオニンを含む。
【００９３】
一つの変形の実施態様に従うと、ＡＩと組み合わされた又は組み合わされていない、このポリマーはナノ粒子の状態であることができる。
【００９４】
一つの実施態様に従うと、本発明の組成物は、ゲル、溶液、懸濁物、エマルジョン、ミセル、ナノ粒子、ミクロ粒子、インプラント、粉末、懸濁物、結乾燥品（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）又はフィルム、好ましくはナノ粒子、ミクロ粒子、ゲル又はフィルムの形で提供されることができる。
【００９５】
有利には、時間の関数として制御される、該活性成分の放出プロフィールを保証することができる。
【００９６】
その特に好ましい形態に従うと、活性成分を搭載された又は搭載されていない組成物は、ナノ粒子及び／又はミクロ粒子の安定なコロイド状懸濁物及び／又は水性相中のミセルである。
【００９７】
ミクロ粒子は、種々の方法、例えば凝集剤（２価又は３価のイオン又はポリ電解質）の存在におけるコアセルベーション、ｐＨ又はイオン力の変化による沈殿、抽出／蒸発、アトマイゼーション、又は凍結乾燥、により得られることができる。
【００９８】
本発明に従う組成物は、それが医薬品であるときには、経口の、肺の、非経口の、鼻の、膣の、目の、皮下の、静脈の、筋肉内の、皮内の、腹腔内の、大脳内の、又は頬経路により投与されることができる。
【００９９】
別の実施態様に従うと、該組成物は、ｐＨ及び／又は浸透圧の調整のため及び／又は安定性を改善するため、及び／又は抗菌剤として、添加剤を任意的に含むことができる。これらの添加剤は当業者に公知である（文献、注射可能な医薬品の開発、Ｐ．Ｋ．グプタら、インターファーム出版、デンバー、コロラド、１９９９年を参照のこと）。
【０１００】
以下の実施例及び図は、実施例として提示され、本発明の分野の非制限的な例である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明に従う実施例１のポリマーを配合されたインターフェロンアルファ−２ｂの配合物（実施例５）、及びメチオニンを配合されたインターフェロンアルファ−２ｂの比較配合物（参照配合物）について、実施例５に従って５℃においてＴ０及び２か月後のＴ（２月）において測定された酸化されたタンパク質の図式的な提示。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０２】
実施例１
アルファトコフェロールとメチオニンのグラフトを含むポリグルタミン酸ナトリウムの合成
５％のラセミアルファトコフェロールで統計的にグラフトされたポリグルタメートが、国際公開第０３／１０４３０３号（実施例１）に記載された方法に従って合成される。ポリ酸の形におけるポリマー、５ｇが７０℃において７７ｍｌのＤＭＦに溶解される。該固体の溶解後、得られた溶液は０℃に冷却され、１０８ｍｌのクロロ蟻酸イソブチル及び９２ｍｌのＮ−メチルモルフォリンが添加され、その後、得られた白い懸濁物が０℃において１０分間撹拌される。平行して、５３６ｍｇのメチオニンエチルエステル塩酸塩（ＭｅｔＯＥｔＨＣｌ）が８．２ｍｌのＮＭＰに溶解され、その後、３４９ｍｌのトリエチルアミンが添加される。この混合物が活性化されたポリマーの懸濁物に添加され、反応混合物が０℃において１時間撹拌される。１ｍＬの濃ＨＣｌ（３５％）その後５０ｍｌの水の添加後、混合物は１Ｎのソーダで中和される。得られた溶液は、塩水（０．９％）に、次に水にダイアフィルターされ、約１５０ｍｌの体積まで濃縮される。該ポリマーの酸加水分解後にＨＰＬＣにより測定された、メチオニンエチルエステルのモルグラフト率は、１．７％のモノマー単位である。
【０１０３】
実施例２
アルファトコフェロールとメチオニンのグラフトを含むポリアクリル酸ナトリウムの合成
段階１：市販のポリアクリル酸（Ｄｅｇａｃｒｙｌ ４７７９Ｌ）の精製
７５ｇのＤＥＧＡＣＲＹＬ ４７７９Ｌ溶液（エボニックによる）が１４２５ｇの水で溶解され、次に８体積の水に対してダイアフィルターされる。得られた溶液はさらに凍結乾燥される。立体排除クロマトグラフィーにより測定された平均分子質量Ｍｎは、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）中で３３．６ｋＤａに等しく、多分散度指数は２．４である。
【０１０４】
段階２：アラニンα−トコフェロール（ＡｌａＶＥ）エステルの合成
２２ｍｌのＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）が、４００ｍＬのジクロロメタン中の２１．１ｇのＮ−Ｂｏｃアラニン、４０ｇのα−トコフェロール、及び０．５７ｇのジメチルアミノピリジン（ＤＮＡＰ）の溶液に一滴ずつ添加される。２０℃において２２時間の間、撹拌した後に、反応混合物は０．１ＮのＨＣｌ溶液、水、５％の重炭酸ナトリウム、そして最後に水で次々と洗浄される。有機相は乾燥するまで気化され、得られた油は、ジオキサン中の４ＭＨＣｌ溶液、４００ｍｌに溶解される。室温における４時間の撹拌後に、反応混合物は乾燥するまで気化され、エタノール中で結晶化される。このように製造されたＡｌａＶＥ塩酸塩（３３．８ｇの白色粉末）がＣＤＣｌ３中でプロトンＮＭＲにより分析され、その化学構造に従うスペクトルを示す。
【０１０５】
段階３：精製されたポリアクリル酸上へのＡｌａＶＥとメチオニンアミドのグラフト化
２．２５ｇのＡｌａＶＥが５８ｍＬのＤＭＦ及び０．５８ｍＬのトリエチルアミンに溶解される。平行して、１９ｍｇのメチオニンアミド塩酸塩が２ｍＬのＤＭＦ及び０．２７ｍＬのトリエチルアミンに溶解される。５ｇの精製されたＤＥＧＡＣＲＹＬ（段階１）が１２５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び０．２５ｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）に溶解される。この溶液は、１５℃において冷却され、ＡｌａＶＥ／トリエチルアミン懸濁物、ＭｅｔＮＨ２／ＮＥｔ３溶液、及び１．６６ｍＬのＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）が連続して添加される。反応混合物は、１５℃において一晩撹拌される。６ｍＬのＤＭＦに希釈されたＨＣｌの３５％溶液（０５６ｍＬ）の添加後に、反応混合物は２００ｍＬの水において１Ｎのソーダで中和される。得られた溶液はダイア濾過により精製され、約２００ｍＬの体積まで濃縮される。
【０１０６】
ＴＦＡ−ｄにおけるプロトンＮＭＲにより測定されたＡｌａＶＥの百分率は６％であり、加水分解後にＨＰＬＣにより測定されたグラフト化されたメチオニンアミドの百分率は５．５％のモノマー単位である。
【０１０７】
実施例３
オクタデシルアミン及びメチオニンのグラフトを含むポリグルタミン酸ナトリウムの合成
ＤＰ１００を有する５ｇのポリグルタメートが１１０ｍＬのＤＭＦに８０℃において溶解される。固体の溶解後、１ｍＬのＤＭＦ中の９５ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の溶液が添加され、混合物は８０℃において１８時間撹拌され、その後、１５℃において冷却される。２２０μＬのトリエチルアミンが５ｍＬのＤＭＦ中の２８６ｍｇのメチオニンアミド塩酸塩の溶液に添加され、該溶液は室温において撹拌される。１１ｍＬのＤＭＦ中の１．０４ｇのオクタデシルアミンの溶液、上記の溶液、１ｍＬのＤＭＦ中の１８９ｍｇのＤＭＡＰ、及び１．２６ｍＬのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）が、ＤＭＦ中のポリグルタメートの溶液に逐次的に添加される。反応混合物は１５℃において２４時間撹拌され、その後、該反応は、０．３ｍＬの濃ＨＣＬ（３５％）、０．３ｍＬの水及び５ｍＬのＤＭＦの溶液を添加することにより停止される。該溶液は５００ｍＬの水に注がれ、１Ｎのソーダで中和される。得られた溶液は塩水（０．９％）に、その後、水にダイアフィルターされ濃縮される。ＴＦＡ−ｄにおいてプロトンＮＭＲにより測定されたオクタデシルアミン及びメチオニンアミドのモルグラフト率は、それぞれ１０及び４％のモノマー単位である。
【０１０８】
実施例４
実施例１のポリマーと共に配合された成長ホルモンの安定性の調査
配合物が、ｐＨ及び浸透圧が、（ＨＣｌ又はＮａＯＨで）約ｐＨ７．０及び（ＮａＣｌで）３００ｍＯｓｍ／Ｋｇに調節されたポリマー溶液１と、タンパク質溶液との単純な混合により製造され、０．７ｍｇ／ｍＬの最終的な成長ホルモン濃度及び２２ ｍｇ／ｍＬのポリマー１濃度を得る。これらの条件下、ポリマー１を含む配合物は、約２．４ｍＭの当量メチオニン濃度を有する。ポリマー溶液は０．２μｍのフィルターを通して前もって濾過された。最終的に得られた配合物は環境温度において一晩撹拌され、それから分割され、一つの部は５℃における冷蔵庫に入れられる。試料中の酸化された成長ホルモンの比は、以下の条件に従って液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される：カラム対称性３００Ｃ１８（ウォーターズ；１５０ｘ４．６ｍｍ；３．５μｍ）、フローレート：０．８ｍＬ／分、ＵＶ検出：２２０ｎｍ、カラムの温度５５℃、リン酸カリウムバッファー２５ｍＭ ｐＨ＝６．５／溶出液としてのプロパノール−１。
【０１０９】
２つのメチオニン残基が成長ホルモンにおいて酸化に敏感である：位置１４におけるメチオニン及び位置１２５におけるメチオニン。これらの２つの分解生成物は酸化の定量において考慮に入れられる。
【０１１０】
５℃においてＴ０及び２月後（Ｔ（２月））において測定された、酸化されたタンパク質のレベルが、以下の表１に与えられる：
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
実施例５
実施例１のポリマーと配合されたインターフェロンアルファ−２ｂの安定性の調査
【０１１３】
配合物（配合物５）がｐＨ及び浸透圧において（約ｐＨ６．５及び３００ ｍＯｓｍ／Ｋｇに）調整された実施例１のポリマー溶液とタンパク質溶液との単純な混合により製造されて、０．３ｍｇ／ｍＬの最終的なインターフェロンアルファ２ｂの濃度及び２２ ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度を得る。これらの条件下、ポリマー１を含む配合物は、約２．４ｍＭの当量メチオニン濃度（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有する。ポリマー溶液は０．２μｍのフィルターを通して前もって濾過された。最終的に得られた配合物は環境温度において一晩撹拌され、それから５℃における冷蔵庫に入れられる。
【０１１４】
比較のために、当量メチオニン濃度を有するタンパク質の溶液が似た条件において製造される（参照配合物）。酸化された形の比（位置１１１におけるメチオニンの酸化に相当する）は、以下のクロマトグラフィー条件に従って液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される。カラムＹＭＣ Ｃ３０（インターシム；２５０ｘ４．６ｍｍ；３μｍ）、フローレート：１ｍＬ／分、蛍光検出：２８０ｎｍにおける励起及び３４０ｎｍにおける発光、カラムの温度２０℃、溶出液としての水／アセトニトリル／ＴＦＡ。
【０１１５】
５℃においてＴ０及び２月後、Ｔ（２月）、に測定された酸化されたタンパク質の比が図１に示される。
【０１１６】
実施例４及び５から、本発明に従うポリマーの使用は、配合の間に酸化されるタンパク質の割合をより効率的に減らすこと、及び／又は経時的に低い割合に維持することを可能にする。
【０１１７】
実施例６
実施例１のポリマー及び結合されたメチオニンを含まない先行技術のポリマーからのミクロ粒子の製造
いくつかの用途のためには、ポリマー及び活性成分のミクロ粒子を含む配合物の製造が好まれる（例えば、本出願人による出願、国際公開第２００７／１４１３４４号パンフレット）。ミクロ粒子配合物が出願、国際公開第２００７／１４１３４４号パンフレットの実施例１８に従って、言いかえると、アルファトコフェロール、ＩＦＮ、及び遊離の状態のメチオニンでグラフト化されたポリマーＰＯポリグルタメートから出発して製造される。
【０１１８】
ミクロ粒子配合物は、ＩＦＮ及び本発明に従う実施例１のポリマー（アルファトコフェロールのグラフト及びメチオニングラフトを含む）から出発して似た条件で製造される。
【０１１９】
ミクロ粒子におけるメチオニンの量が測定される。結果は下の表２に与えられる。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
これは、出願、国際公開第２００７／１４１３４４号パンフレットに従うミクロ粒子組成物では、メチオニンに重大な損失があり、該損失は、本発明に従うポリマー１が使用されるときは観察されないことを示す。さらに、本発明に従うポリマーの使用は、どのようなサイズであれ、粒子におけるメチオニンの均一な分布を可能にする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性の骨格を有し、かつメチオニン基を含む疎水性基を有する、新規な両親媒性ポリマーに関する。
【０００２】
一般的に、両親媒性ポリマーはその化学構造に依存して、変化する大きさのナノ粒子を水性媒体中において形成することができる。即ち、その骨格が直鎖、親水性であり、かつ疎水性の側鎖基を有するポリマーは、水中において容易にナノ粒子を形成することができる。これらのナノ粒子は、その製造に使用されるベースの物質に依存して、生体適合性であり得、任意的に生分解性であってもよい。それらは、医薬品のベクター化のために、医薬品の分野において特に使用される。
【０００３】
この分野においては、本出願人の会社は、数十年間、種々の疎水性基を含み、Ｍｅｄｕｓａ（商標）として知られている、ポリアミノ酸に基づくナノ粒子系及びミクロ粒子系を開発してきている。
【背景技術】
【０００４】
すなわち、ＦＬＡＭＥＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳの特許出願、国際公開第２００３／１０４３０３号パンフレットは、水中においてインスリンを結合できるナノ粒子を形成するアルファ−トコフェロールグラフトを含むグルタミン酸ポリマーを記載している。刊行物ＹＰ．Ｃｈａｎらの「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．」２００７年、第４巻、第４号、４４１〜４５１頁は、これらのナノ粒子及びタンパク質、例えばインターフェロンアルファ又はインターロイキン２、と一緒に製造された配合物は、ヒトにおける皮下注射後に、少なくとも１週間に等しい期間の間、測定可能な細胞質濃度を得ることを可能にすることを記載している。同様に、プルランに基づき、かつコレステロールグラフトを含む両親媒性ポリマーは、水性媒体中で集合して、タンパク質例えばインスリンを可逆的に結合することのできるナノ粒子を形成することが公知である（アキヨシら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９８年、第５４巻、第３１３〜３２０頁）。キトサン又はデキストランに基づく他の類似のポリマーは、特にハイドロゲルフィルム又はインプラントを得るために開発されてきた（国際公開第００／１４１５５号パンフレット）。
【０００５】
上記から明らかなように、タンパク質及びペプチド配合物の分野における両親媒性ポリマーの使用はたくさんある。
【０００６】
不幸なことに、５℃において少なくとも２年の間、水性媒体中で安定である両親媒性ポリマー／タンパク質配合物を得ることは、特に、酸化に関してある種の治療用タンパク質の脆弱性に関して主要な挑戦のままである。
【０００７】
実際、ある種のアミノ酸、例えば多くのタンパク質又は酵素の成分であるメチオニン、システイン、ヒスチジン、又はトリプトファンは、後者の形成の間又は経時的にさえ、酸化することができる。明らかな理由から、この酸化現象は、これらのアミノ酸を含む活性成分の生物学的活性に有害な影響を有し得る（クリーランドら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９３年、第１０巻、第３０７〜３７７頁）ことは広く認識されている。
【０００８】
この所望されない酸化を防ぐために、タクリュリは１９９３年に、それらをメチオニンと一緒に配合することにより、メチオニンをその配列中に含むタンパク質又は酵素を使用することを提案した（米国特許第５，２７２，１３５号）。この概念は、タンパク質を含む配合物の安定性の分野において働く当業者には今、周知である。例えば、特許出願、国際公開第２００８／１４５３２３号パンフレットは、２〜７５ｍＭのメチオニンを含むインターフェロンアルファ配合物を記載し、米国特許出願公開第２００３／０１０４９９６号明細書はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）又はハイパーグリコシル化エリスロポイエチン（ＮＥＳＰ）の配合物であって、その分解は５０ｍＭまでの範囲の量のメチオニンの添加により制限される配合物を記載している。
【０００９】
それにもかかわらず、酸化を防止するためのこの選択肢は完全には満足できない。
【００１０】
即ち、後者のための酸化安定性を保証するために、タンパク質又は酵素と結合されるメチオニンの量は、もちろん、タンパク質の性質、その濃度、該配合物のｐＨ及び他の要素に依存して変化し得る。他方、このタンパク質又はこのペプチドは、前に定義された両親媒性ポリマーと結合された形ですでに使用されるとき、メチオニンの有効性は変化されることができる。最後に、そのような両親媒性ポリマーから得られるインプラント又はゲルの特定の場合には、添加されたメチオニンは該インプラント又はゲルに均一かつ永久的に分布されることができないので、その有効性を喪失し得る。
【００１１】
本発明は、上記の不十分さを正確に補うことを目的としている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
より正確には、本発明の目的は、活性成分、より特に、酸化現象に必然的に敏感であるタンパク質、ペプチド又は酵素のタイプのビヒクルとして使用されることができ、かつこの現象に対する安定性をそのような活性成分に正確に保証することのできる、新規なタイプの両親媒性ポリマーを提案することである。
【００１３】
本発明の別の本質的な目的は、これらのポリマーが、さらに活性成分を結合させる傾向を有し、従って、活性成分のベクターとして使用されることができ、従って、たくさんの活性成分と容易に結合して、それらを生体内で放出する能力を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
結果として、その特徴の一つに従うと、本発明は、親水性の骨格を含む両親媒性ポリマーにおいて、該骨格が少なくとも１のメチオニンの側鎖又はその誘導体の一つ及び該メチオニン又はその誘導体の一つと異なる複数の疎水性の側鎖を有することを特徴とする、該両親媒性ポリマーに関する。
【００１５】
好ましくは、一又は複数のメチオニン基及び／又は複数の疎水性基はランダムに配置されている。
【００１６】
その別の特徴に従うと、本発明は、上記のポリマーを活性成分（ＡＩ）、特に酸化に敏感であるタンパク質又はペプチドのベクター化のために使用する方法に関する。
【００１７】
その別の特徴に従うと、本発明は、活性剤と組み合わされている又は組み合わされていない、本発明に従う少なくとも１のポリマーを含むナノ粒子に関する。
【００１８】
そのさらに別の特徴に従うと、本発明は、本発明に従うポリマーを及び活性成分含み、ナノ粒子の状態に組織されている又はされていない組成物に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明の文脈において、用語「メチオニン」は、ほかに明記されなければ、メチオニン残基又は後者の誘導体、特に以下に定義されるもの、のいずれかを意味するために使用される。
【００２０】
本発明の意味内において、本開示の全体において、１以上の活性成分と本発明に従って考慮されているポリマーの相互作用を特定するために使用される、用語「組み合わせ」又は「組み合わせる」は、特に、一又は複数の活性成分がポリマーに特に疎水性及び／又は静電的相互作用により結合されている、及び／又は１又は複数のポリマーにより溶解されていることを意味する。
【００２１】
本発明の意味内において、用語「側鎖」は疎水性及びメチオニンの基がペンダント状の基又は直鎖の骨格上のグラフトとしてもまた見えるように配置されていることを意味する。
【００２２】
本発明の意味内において、「ランダムに」により、一又は複数のメチオニン基を有する本発明の両親媒性ポリマーの一又は複数のモノマー単位、及び一又は複数の疎水性の基を有する本発明の両親媒性ポリマーの一又は複数のモノマー単位が、親水性の骨格内に、隣接する単位の性質とは独立して、不規則な態様で分布されていることが意味される。
【００２３】
以下から明らかであるように、安定なナノ粒子系、及び一方では１以上のメチオニン側鎖グラフトを、他方ではメチオニンとは異なるいくつかの疎水性の側鎖を含む親水性の骨格を形成することができる両親媒性ポリマーの新規な群を開発してきたことは出願人の会社の名誉である。
【００２４】
書類国際公開第２００８／０９４１４４号パンフレットは、メチオニン及び／又はシステイングラフトを有するポリアスパラギン酸タイプの親水性ポリマーを既に記載している。しかし、このタイプのポリマーは、本発明に従って要求されるメチオニンとは異なる疎水性のグラフトがない。さらに、それは該パンフレットにおいては、ナノ粒子の表面処理の目的のためだけに提案されている。従って、この書類は、メチオニンの抗酸化活性には全く関係がなく、この現象に正確に敏感である活性成分の酸化安定性を保存することができるポリマー状のビヒクルを開発する目的のための、後者の潜在的な安定化（ｖａｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ）にもさらに関係ない。
【００２５】
すべての期待に反して、本発明者らは、両親媒性ポリマー上のグラフトの状態におけるメチオニンの存在は、一方では、活性成分と結合するその能力に、他方では、水性媒体と接触に至らせられたときに、ナノ粒子の状態で組織化される能力にさらに影響を与えることなく、該ポリマーに有意な抗酸化活性を与えることを可能にすることに注目した。
【００２６】
さらに、本発明に従って考慮されるポリマーは、有利には、メチオニンのグラフト速度に関して抗酸化活性について調節するのに有利に役立つ。メチオニングラフト化速度を改良するこの可能性は、該ポリマーによって安定化されなければならないタンパク質又はペプチドの酸化感受性の機能として、特にそれが本発明に従うポリマーの抗酸化活性を調節することを可能にするという事実に鑑みて特に重要である。
【００２７】
両親媒性ポリマー
− 親水性骨格
上記のように、本発明に従って考慮される両親媒性ポリマーは、親水性の骨格を有する。
【００２８】
有利には、本発明に従って考慮されるポリマーは、水に、特に、５〜８に含まれるｐＨにおいて、可溶であるポリマー状の骨格を有する。
【００２９】
この骨格は、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアクリレート又はポリメタクリレートのファミリーに属するポリマー又はコポリマーから特に選択されることができる。
【００３０】
従って、以下は全く特に適切である。
− ポリアミノ酸例えばポリ（グルタミン酸）（アルファ又はガンマタイプのもの）、ポリ（アスパラギン酸）（アルファ又はアルファ／ベータタイプのもの）、ポリリジン（アルファタイプのもの）又はこれらの同じアミノ酸の組み合わせにより形成されたコポリマー、
− ポリ（アクリル酸）又はポリ（メタクリル酸）、及び
− 多糖類、例えばデキストラン又はその誘導体例えばカルボキシメチルデキストラン又はヒドロキシエチルデキストラン又はプルラン。
【００３１】
特定の実施態様に従うと、本発明の両親媒性ポリマーの親水性骨格は、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリリジン又はそれらのコポリマーから選択されたポリアミノ酸である。
【００３２】
本発明に従って使用されることのできるある数のポリマー、例えば変化しえる質量のポリ（アルファ−Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（アルファ−Ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ガンマ−Ｌ−グルタミン酸）及びポリ（アルファ−Ｌ−リジン）タイプは、市販入手可能である。
【００３３】
さらに、本発明の両親媒性ポリマーの親水性の骨格を形成することのできるポリマーは、当業者に公知の方法により得られることができる。
【００３４】
例えば、アルファタイプのポリグルタミン酸ナトリウムの合成は、論文「バイオポリマー」、１９７６年、第１５巻、第１８６９頁及びＨ．Ｒ．クリヒェルドルフによる書籍「アルファ−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物及び関連するヘテロ環」、スプリンガー出版（１９８７年）に記載されているように、Ｎ−カルボキシ−アミノ酸無水物（ＮＣＡ）の重合により行われることができる。ＮＣＡの誘導体は好ましくはＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｒ３（Ｒ３＝メチル、エチル又はベンジル）である。次に、該ポリマーは適切な条件下、加水分解されて、その酸の形のポリマーを得る。これらの方法は、出願人の会社のフランス国特許第２８０１ ２２６号に与えられた記載に基づく。
【００３５】
これらのポリマーは、活性化可能な基として、カルボキシル、アミン又はアルコール官能基を有する。従って、それらのグラフトは困難なしに想定されることができる。
【００３６】
一般的に、親水性の骨格を有する直鎖のポリマーは、一又は複数の疎水性の基及びメチオニン又はメチオニン誘導体により同時に又は順番にグラフト化される。
【００３７】
−疎水性基及びメチオニン基
本発明の本質的な特徴に従うと、本発明のポリマーは、少なくとも１のメチオニン基（ＭＧ）及びペンダント状の、メチオニンとは異なる疎水性基（ＨＧ）でグラフト化される。
【００３８】
− メチオニン基（ＭＧ）
本発明の意味内において、表現「メチオニン誘導体」により、より特に置換誘導体体、特にメチオニンのアミン又はカルボキシル官能基のレベルにおける置換誘導体が意味される。
【００３９】
これらは例えば、メチオニンアミド又はメチオニンエチルエステルである。
【００４０】
これらの化合物は、メチオニンのアミン官能基によるカップリング反応を行うのに、より特に有利である。
【００４１】
メチオニンは、２つの反応性官能基、カルボン酸及び一級アミン、を含み、実行されるカップリング反応に依存して、該官能基の１又は他は保護されなければならないことは明らかである。
【００４２】
本発明のポリマーにおいて使用されることのできるメチオニンは、Ｌ、Ｄ配置又はラセミ体の混合物であることができる。
【００４３】
グラフトのタイプに依存して、結合官能基は、アミド又はエステルタイプである。メチオニン基は、一度、ポリマーにグラフトされると一般的に以下の３つの構造のうちの一を有する：
【００４４】
【化１】
【００４５】
ここで
− Ｒａはヒドロキシ基（任意的に脱プロトン化されていてもよい）、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＮＨＣＨ３又はＮ（ＣＨ３）２を表し、
− Ｒｂ及びＲｃは、独立して水素原子、メチル又はエチルを表し、
Ｒｂ及びＲｃ基のうちの一が水素原子であるときには、他の基はＣ１〜Ｃ６のアシル基を表し、メチオニンの配置はＬ、Ｄ又はラセミ混合物であることができる。
【００４６】
− 疎水性基（ＨＧ）
疎水性基は、実際には、そしてこれは制限的であることなしに、アルコール及びアミンを含む群から選択され、これらの化合物は、当業者により容易に官能基化されることができ、それらのグラフト化はメチオニン誘導体に要求されるものに類似の反応を行う。
【００４７】
好ましい特徴に従うと、疎水性基（ＨＧ）は、５〜３０の炭素原子を含む。
【００４８】
これらの疎水性基（ＨＧ）は、以下、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐状のＣ５〜Ｃ３０アルキル、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、
− 及び任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１０〜Ｃ３０（ポリ）環状物
を含む群から有利にかつ思慮深く選択される。
【００４９】
より特に、疎水性基（ＨＧ）は、例えば以下、
− ドデカノキシ、テトラデカノキシ、ヘキサデカノキシ、オクタデカノキシ、オレイロキシ、トコフェリル又はコレステリル、アミノヘキシル、アミノヘキサデシル及びアミノオクタデシル、
− ラウリル、ミリスチル、パルミチル及びステアリル、
− 疎水性アミノ酸例えばロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン又はその誘導体の一つ
を含む群から選択されることができる。
【００５０】
疎水性基がアミノ酸であるとき、それは以下の（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）の構造の一つに対応する誘導体であることができ、ここでＲａ、Ｒｂ及びＲｃは以前に与えられた定義に相当し、Ｒｄは、ポリマー及び実施されたグラフト反応のタイプに依存するアミノ酸残基に対応する。
【００５１】
【化２】
【００５２】
あるいは、一又は複数のメチオニン又はメチオニン誘導体及び／又は該疎水性基は、それらをポリマー鎖に結合させることを可能にするスペーサーによりポリマー状骨格に結合されることができる。このスペーサーは、有利には２価であり、特にアミノ酸単位、アミノアルコール誘導体、ジアミン誘導体、ジオール誘導体及びヒドロキシ酸誘導体を含む群に属する。
【００５３】
本発明の特定の実施態様に従うと、両親媒性ポリマーの親水性骨格はポリ（Ｌ）グルタミン酸ナトリウムであり、疎水性基は合成起源のトコフェリル基であり、好ましくはメチオニン誘導体はメチオニンアミド又はメチオニンエチルエステルである。
【００５４】
結果として、本発明の好ましい両親媒性ポリマーは以下の一連の一般式（Ｉ）により構成される事実により図式的に示されることができる。
【００５５】
【化３】
【００５６】
ここで、
− Ａは親水性ポリマー鎖の単量体単位を表し、
− ＭＧはメチオニン又はその誘導体の一つを表し、
− ＨＧは疎水性基を表し、そして
− Ｅ及びＥ'はそれぞれ０又は１を独立して示すｎ及びｐを有するスペーサー基を表し、
− ａ、ｂ、及びｃは、ゼロとは異なる整数であり、
− 疎水性基ＨＧ及びメチオニン基ｍｇはランダムに分布されている。
【００５７】
有利には、疎水性基のモル百分率は、ｃ／（ａ＋ｂ＋ｃ）の比により表され、メチオニン基のモル百分率は、ｂ／（ａ＋ｂ＋ｃ）比により表される。
【００５８】
本発明に従うポリマーにおける疎水性単位のモルグラフト率は、有利には２〜３０％、好ましくは５〜２０％の範囲である。
【００５９】
本発明に従うポリマーにおけるメチオニン単位のモルグラフト率は、０．５〜２０％の範囲である。
【００６０】
ａ／ａ＋ｂ＋ｃのモル比に関しては、それは４０〜９７．５％の範囲である。
【００６１】
有利には、本発明に従うポリマーは、２，０００〜２００，０００ｇ／モルに、好ましくは５，０００〜１００，０００ｇ／モルに設定されたモル質量を有する。
【００６２】
別の変形に従うと、本発明に従うポリマーは、ポリエチレングリコールタイプの少なくとも１のグラフトを有することもできる。
【００６３】
好ましくは、ポリエチレングリコールのモル質量は、１，０００〜５，０００Ｄａである。該ポリエチレングリコールタイプの基は、以下の構造の一つに従って、図式的に表されることができる。
【００６４】
【化４】
【００６５】
好ましくは、ポリエチレングリコールのモルグラフト百分率は１〜１０％の範囲である。この単位は、本発明に従うポリマーの親水性骨格に直接的に結合されていてもいなくてもよい。
【００６６】
両親媒性ポリマーの製造方法
【００６７】
メチオニンに関して、そのアミン官能基のグラフトは、カップリング剤、例えばカルボジイミド、及び触媒、例えばジメチルアミノピリジン、の存在において、アミン官能基を、両親媒性ポリマー骨格上に存在するカルボキシル官能基とカップリングさせることにより容易に実行されることができる。この反応は、有機溶媒又は水性相において実行されることができる。第二場合において、水溶性カルボジイミドが好ましくは使用される。カルボキシル官能基は、遊離のまま放置されるか、又はエステル又はアミド基を形成する基により保護されることができる。
【００６８】
即ち、ポリマーがアミン又はアルコール官能基を有するとき、メチオニンのグラフト化は、メチオニンのアミン官能基をアシル基で又はジメチル化により前もって保護しておき、カルボキシル基により行われる。これらの反応は、当業者に周知であり、例えば、ハーマンソンによる書籍（生体共役技術、第２版、２００８年、エルゼビア）がこれらの方法を記載している。
【００６９】
その部分については、ペンダント状の疎水性基（ＨＧ）は、ポリマーの活性化可能な官能基及びグラフトの活性化可能な官能基の性質に依存して、アミド、エステル、カーボネート、又はカルバメート官能基によりポリマーに結合されることができる。
【００７０】
好ましくは、メチオニン誘導体に関して、結合はアミド又はエステルタイプのものである。この場合、メチオニン誘導体及び疎水性基のグラフト化は、同時に行われることができる。
【００７１】
疎水性基でグラフト化されたポリアミノ酸を得るためには、縮合剤例えばジイソプロピルカルボジイミド及び触媒例えばジメチルアミノピリジンの存在において、反応性アミン又はアルコール官能基を含む疎水性基とカルボン酸官能基を含むポリマーの間で、カップリング反応が行われる。この反応は、溶媒例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）又はＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）において行われることができる。理想的には、メチオニンのグラフト化が同時に行われる。形成される結合はエステル又はアミド結合である。
【００７２】
カップリング試薬、例えばクロロ蟻酸エステルが、アミド結合の形成のためにもまた使用されることができる（カップリング剤の例は、例えばボダンスツキー「ペプチド合成の原則」スプリンガー出版、１９８４年を参照のこと）。グラフト率は、成分及び試薬の化学量論及び／又は反応時間により化学的に調整される。
【００７３】
アミン基を含むポリマー、例えばポリリジン、又はアルコール基をもまた含むデキストランの場合、考慮される疎水性基は、カルボン酸基を有する。カップリングの後に形成される結合は、特にエステル、アミド、カーボネート又はカルバメート結合である。
【００７４】
実施例として、我々は、疎水性基ＨＧ及びメチオニン基ＭＧの両方を含むことのできる両親媒性ポリマーのいくつかのタイプ及び文献に記載された手順に従ってそれらを得る方法を以下に記載する。
【００７５】
コレステロールでグラフト化されたプルランタイプのポリマーに関して、これは、米国特許第６，５６６，５１６号に記載された手順に従って合成されることができる。次に、反応性のイソシアネートを有する誘導体は、ジイソシアネートを、その酸官能基が−ＮＨ２（アミド）又は−ＯＭｅ（エステル）により保護されているメチオニンと反応させることにより製造される。この手順は標準的であり上記特許の実施例１に記載されている。グラフト化は、実施例２に記載された方法に従って行われることができる。
【００７６】
最後に、ラウロイル基及びメチオニン誘導体でグラフト化されたデキストランタイプのポリマーは、Ｎ−メチルピロリドン中で、デキストランポリマーをラウリル酸の酸塩化物及びＮ−アセチルメチオニンの酸塩化物と反応させることにより得られることができる。ラウロイル基でグラフト化されたデキストランを得るための手順は米国特許第５，７５０，６７８号（実施例１）に記載されている。
【００７７】
同様に、ステアリルアミン及びメチオニンアミドを含むポリアクリレートは、グラフト化段階の間、所望される量で存在するメチオニンアミドを有することにより、米国特許第６，６０７，７１４号に記載された手順に従って製造されることができる。
【００７８】
フェニルアラニンエステル及びメチオニンエステルを含むポリ（ガンマ）グルタメートは、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、第３３巻、第３９８〜３９９頁においてマツサキらにより記載されたプロトコルに従って製造されることができる。水溶性カルボジイミドの存在におけるメチオニンエチルエステル及びフェニルアラニンエチルエステルの混合物が、水中のポリ（ガンマ−グルタミン酸）に同時にグラフト化されることができる。
【００７９】
最後に、ステアロイル基、Ｎ−アセチルメチオニン及びポリエチレングリコール鎖を含むポリリジンは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、２０００年、第１１巻、第８８０〜８９１頁においてブラウンらにより記載された手順に従って製造されることができる。この実施態様において、ポリリジンにグラフト化されるべきメチオニン誘導体は、カルボキシレート上のヒドロキシサクシンイミド基及びアミン官能基上のアセチルを含む。
【００８０】
活性成分（ＡＩ）
本発明の好ましい実施態様に従うと、本発明に従うポリマーと組み合わされることのできる活性成分、ＡＩ、はタンパク質又はペプチド、すなわち酸化の現象に敏感であるＡＩから選択される。
【００８１】
より特に、これらは、その配列中に少なくとも１のメチオニンを含むこれらのペプチド又はタンパク質である。実際、メチオニンは、特に酸化に敏感である。
【００８２】
このカテゴリーにおいて、タンパク質例えば成長ホルモン、インターフェロン、凝固因子タンパク質例えば因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、及び因子ＩＸ、ＥＰＯ、ＧＣＳＦ、及びモノクロナール抗体は、容易に酸化されることが公知である。これらのたんぱく質は、任意的に少なくとも１のポリエチレングリコール鎖を含む。
【００８３】
１以上のＡＩを本発明に従う両親媒性ポリマーと組み合わせる技術は、特に米国特許第６，６３０，１７１号に記載されている。
【００８４】
上記技術は、１以上の活性成分を搭載された又は１以上の活性成分と組み合わされた本発明のポリマーを含む液状媒体において、少なくとも１の活性成分を取り込むことからなる。この取り込みは、以下のように行われることができる：水性溶液にポリマーを入れること、次に、固体の形又は水死溶液の活性成分の添加。
【００８５】
好ましくは、活性成分は、タンパク質、グリコタンパク質、１以上のポリアルキレングリコール鎖に結合されたタンパク質（好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：「ＰＥＧ化されたタンパク質」）を含む群から選択される。
【００８６】
ナノ粒子
有利には、ＡＩと組み合わされた又は組み合わされていない、本発明に従って考慮されるポリマー、特に上で定義されたもの、は、５〜８の範囲にｐＨを有する水性媒体、特に水、に分散されるとき、自発的にナノ粒子を形成することができる。
【００８７】
一般的に、ナノ粒子の形成は、ナノ領域において疎水性基の分離を有する多数のポリマー鎖の自己会合のためである。ナノ粒子は、１以上の疎水性のナノ領域を含むことができる。
【００８８】
ポリマー状ナノ粒子のサイズは、１〜１，０００ｎｍ、特に５〜５００ｎｍ、特に１０〜３００ｎｍ、より特に１０〜２００ ｎｍ、又は１０〜１００ｎｍさえであることができる。
【００８９】
用途
上記のように、本発明の両親媒性ポリマーは、疎水性基の性質、それらのメチオニンのモル百分率及びそれらの重合度に依存して複数の方法で使用され得る。本発明により参照される種々の形態の活性成分のカプセル化のためのポリマーを成形する方法は、当業者に公知である。
【００９０】
より詳細には、これらのいくつかの特に関連する参照文献が、例えば参考にされる。
− ナノ粒子又はミクロ粒子の形の疎水性基を含むポリアミノ酸を有するタンパク質の配合物：国際公開００／３０６１８号パンフレット、国際公開２００５／０５１４１８号パンフレット、国際公開２００７／１４１３４４号パンフレット、国際公開２００８／０２５４２５号パンフレット、国際公開２００８／１３５５６１号パンフレット、
− 疎水性基、例えばコレステロール、を含むプルランを有するタンパク質の配合物：米国特許第６，５６６，５１６号明細書。
【００９１】
その別の特徴に従うと、本発明は上記の少なくとも１のポリマー及び少なくとも１の活性成分、特に酸化に付されるもの、を含む組成物、特に医薬品、化粧料、食事療法の又は植物検疫の組成物に関する。これはより特にタンパク質、ペプチド又は酸化に敏感な酵素である。
【００９２】
特に、タンパク質、ペプチド、又は酵素は、その配列中に少なくとも１のメチオニンを含む。
【００９３】
一つの変形の実施態様に従うと、ＡＩと組み合わされた又は組み合わされていない、このポリマーはナノ粒子の状態であることができる。
【００９４】
一つの実施態様に従うと、本発明の組成物は、ゲル、溶液、懸濁物、エマルジョン、ミセル、ナノ粒子、ミクロ粒子、インプラント、粉末、懸濁物、結乾燥品（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）又はフィルム、好ましくはナノ粒子、ミクロ粒子、ゲル又はフィルムの形で提供されることができる。
【００９５】
有利には、時間の関数として制御される、該活性成分の放出プロフィールを保証することができる。
【００９６】
その特に好ましい形態に従うと、活性成分を搭載された又は搭載されていない組成物は、ナノ粒子及び／又はミクロ粒子の安定なコロイド状懸濁物及び／又は水性相中のミセルである。
【００９７】
ミクロ粒子は、種々の方法、例えば凝集剤（２価又は３価のイオン又はポリ電解質）の存在におけるコアセルベーション、ｐＨ又はイオン力の変化による沈殿、抽出／蒸発、アトマイゼーション、又は凍結乾燥、により得られることができる。
【００９８】
本発明に従う組成物は、それが医薬品であるときには、経口の、肺の、非経口の、鼻の、膣の、目の、皮下の、静脈の、筋肉内の、皮内の、腹腔内の、大脳内の、又は頬経路により投与されることができる。
【００９９】
別の実施態様に従うと、該組成物は、ｐＨ及び／又は浸透圧の調整のため及び／又は安定性を改善するため、及び／又は抗菌剤として、添加剤を任意的に含むことができる。これらの添加剤は当業者に公知である（文献、注射可能な医薬品の開発、Ｐ．Ｋ．グプタら、インターファーム出版、デンバー、コロラド、１９９９年を参照のこと）。
【０１００】
以下の実施例及び図は、実施例として提示され、本発明の分野の非制限的な例である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明に従う実施例１のポリマーを配合されたインターフェロンアルファ−２ｂの配合物（実施例５）、及びメチオニンを配合されたインターフェロンアルファ−２ｂの比較配合物（参照配合物）について、実施例５に従って５℃においてＴ０及び２か月後のＴ（２月）において測定された酸化されたタンパク質の図式的な提示。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０２】
実施例１
アルファトコフェロールとメチオニンのグラフトを含むポリグルタミン酸ナトリウムの合成
５％のラセミアルファトコフェロールで統計的にグラフトされたポリグルタメートが、国際公開第０３／１０４３０３号（実施例１）に記載された方法に従って合成される。ポリ酸の形におけるポリマー、５ｇが７０℃において７７ｍｌのＤＭＦに溶解される。該固体の溶解後、得られた溶液は０℃に冷却され、１０８ｍｌのクロロ蟻酸イソブチル及び９２ｍｌのＮ−メチルモルフォリンが添加され、その後、得られた白い懸濁物が０℃において１０分間撹拌される。平行して、５３６ｍｇのメチオニンエチルエステル塩酸塩（ＭｅｔＯＥｔＨＣｌ）が８．２ｍｌのＮＭＰに溶解され、その後、３４９ｍｌのトリエチルアミンが添加される。この混合物が活性化されたポリマーの懸濁物に添加され、反応混合物が０℃において１時間撹拌される。１ｍＬの濃ＨＣｌ（３５％）その後５０ｍｌの水の添加後、混合物は１Ｎのソーダで中和される。得られた溶液は、塩水（０．９％）に、次に水にダイアフィルターされ、約１５０ｍｌの体積まで濃縮される。該ポリマーの酸加水分解後にＨＰＬＣにより測定された、メチオニンエチルエステルのモルグラフト率は、１．７％のモノマー単位である。
【０１０３】
実施例２
アルファトコフェロールとメチオニンのグラフトを含むポリアクリル酸ナトリウムの合成
段階１：市販のポリアクリル酸（Ｄｅｇａｃｒｙｌ ４７７９Ｌ）の精製
７５ｇのＤＥＧＡＣＲＹＬ ４７７９Ｌ溶液（エボニックによる）が１４２５ｇの水で溶解され、次に８体積の水に対してダイアフィルターされる。得られた溶液はさらに凍結乾燥される。立体排除クロマトグラフィーにより測定された平均分子質量Ｍｎは、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）中で３３．６ｋＤａに等しく、多分散度指数は２．４である。
【０１０４】
段階２：アラニンα−トコフェロール（ＡｌａＶＥ）エステルの合成
２２ｍｌのＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）が、４００ｍＬのジクロロメタン中の２１．１ｇのＮ−Ｂｏｃアラニン、４０ｇのα−トコフェロール、及び０．５７ｇのジメチルアミノピリジン（ＤＮＡＰ）の溶液に一滴ずつ添加される。２０℃において２２時間の間、撹拌した後に、反応混合物は０．１ＮのＨＣｌ溶液、水、５％の重炭酸ナトリウム、そして最後に水で次々と洗浄される。有機相は乾燥するまで気化され、得られた油は、ジオキサン中の４ＭＨＣｌ溶液、４００ｍｌに溶解される。室温における４時間の撹拌後に、反応混合物は乾燥するまで気化され、エタノール中で結晶化される。このように製造されたＡｌａＶＥ塩酸塩（３３．８ｇの白色粉末）がＣＤＣｌ３中でプロトンＮＭＲにより分析され、その化学構造に従うスペクトルを示す。
【０１０５】
段階３：精製されたポリアクリル酸上へのＡｌａＶＥとメチオニンアミドのグラフト化
２．２５ｇのＡｌａＶＥが５８ｍＬのＤＭＦ及び０．５８ｍＬのトリエチルアミンに溶解される。平行して、１９ｍｇのメチオニンアミド塩酸塩が２ｍＬのＤＭＦ及び０．２７ｍＬのトリエチルアミンに溶解される。５ｇの精製されたＤＥＧＡＣＲＹＬ（段階１）が１２５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び０．２５ｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）に溶解される。この溶液は、１５℃において冷却され、ＡｌａＶＥ／トリエチルアミン懸濁物、ＭｅｔＮＨ２／ＮＥｔ３溶液、及び１．６６ｍＬのＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）が連続して添加される。反応混合物は、１５℃において一晩撹拌される。６ｍＬのＤＭＦに希釈されたＨＣｌの３５％溶液（０５６ｍＬ）の添加後に、反応混合物は２００ｍＬの水において１Ｎのソーダで中和される。得られた溶液はダイア濾過により精製され、約２００ｍＬの体積まで濃縮される。
【０１０６】
ＴＦＡ−ｄにおけるプロトンＮＭＲにより測定されたＡｌａＶＥの百分率は６％であり、加水分解後にＨＰＬＣにより測定されたグラフト化されたメチオニンアミドの百分率は５．５％のモノマー単位である。
【０１０７】
実施例３
オクタデシルアミン及びメチオニンのグラフトを含むポリグルタミン酸ナトリウムの合成
ＤＰ１００を有する５ｇのポリグルタメートが１１０ｍＬのＤＭＦに８０℃において溶解される。固体の溶解後、１ｍＬのＤＭＦ中の９５ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の溶液が添加され、混合物は８０℃において１８時間撹拌され、その後、１５℃において冷却される。２２０μＬのトリエチルアミンが５ｍＬのＤＭＦ中の２８６ｍｇのメチオニンアミド塩酸塩の溶液に添加され、該溶液は室温において撹拌される。１１ｍＬのＤＭＦ中の１．０４ｇのオクタデシルアミンの溶液、上記の溶液、１ｍＬのＤＭＦ中の１８９ｍｇのＤＭＡＰ、及び１．２６ｍＬのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）が、ＤＭＦ中のポリグルタメートの溶液に逐次的に添加される。反応混合物は１５℃において２４時間撹拌され、その後、該反応は、０．３ｍＬの濃ＨＣＬ（３５％）、０．３ｍＬの水及び５ｍＬのＤＭＦの溶液を添加することにより停止される。該溶液は５００ｍＬの水に注がれ、１Ｎのソーダで中和される。得られた溶液は塩水（０．９％）に、その後、水にダイアフィルターされ濃縮される。ＴＦＡ−ｄにおいてプロトンＮＭＲにより測定されたオクタデシルアミン及びメチオニンアミドのモルグラフト率は、それぞれ１０及び４％のモノマー単位である。
【０１０８】
実施例４
実施例１のポリマーと共に配合された成長ホルモンの安定性の調査
配合物が、ｐＨ及び浸透圧が、（ＨＣｌ又はＮａＯＨで）約ｐＨ７．０及び（ＮａＣｌで）３００ｍＯｓｍ／Ｋｇに調節されたポリマー溶液１と、タンパク質溶液との単純な混合により製造され、０．７ｍｇ／ｍＬの最終的な成長ホルモン濃度及び２２ ｍｇ／ｍＬのポリマー１濃度を得る。これらの条件下、ポリマー１を含む配合物は、約２．４ｍＭの当量メチオニン濃度を有する。ポリマー溶液は０．２μｍのフィルターを通して前もって濾過された。最終的に得られた配合物は環境温度において一晩撹拌され、それから分割され、一つの部は５℃における冷蔵庫に入れられる。試料中の酸化された成長ホルモンの比は、以下の条件に従って液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される：カラム対称性３００Ｃ１８（ウォーターズ；１５０ｘ４．６ｍｍ；３．５μｍ）、フローレート：０．８ｍＬ／分、ＵＶ検出：２２０ｎｍ、カラムの温度５５℃、リン酸カリウムバッファー２５ｍＭ ｐＨ＝６．５／溶出液としてのプロパノール−１。
【０１０９】
２つのメチオニン残基が成長ホルモンにおいて酸化に敏感である：位置１４におけるメチオニン及び位置１２５におけるメチオニン。これらの２つの分解生成物は酸化の定量において考慮に入れられる。
【０１１０】
５℃においてＴ０及び２月後（Ｔ（２月））において測定された、酸化されたタンパク質のレベルが、以下の表１に与えられる：
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
実施例５
実施例１のポリマーと配合されたインターフェロンアルファ−２ｂの安定性の調査
【０１１３】
配合物（配合物５）がｐＨ及び浸透圧において（約ｐＨ６．５及び３００ ｍＯｓｍ／Ｋｇに）調整された実施例１のポリマー溶液とタンパク質溶液との単純な混合により製造されて、０．３ｍｇ／ｍＬの最終的なインターフェロンアルファ２ｂの濃度及び２２ ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度を得る。これらの条件下、ポリマー１を含む配合物は、約２．４ｍＭの当量メチオニン濃度（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有する。ポリマー溶液は０．２μｍのフィルターを通して前もって濾過された。最終的に得られた配合物は環境温度において一晩撹拌され、それから５℃における冷蔵庫に入れられる。
【０１１４】
比較のために、当量メチオニン濃度を有するタンパク質の溶液が似た条件において製造される（参照配合物）。酸化された形の比（位置１１１におけるメチオニンの酸化に相当する）は、以下のクロマトグラフィー条件に従って液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される。カラムＹＭＣ Ｃ３０（インターシム；２５０ｘ４．６ｍｍ；３μｍ）、フローレート：１ｍＬ／分、蛍光検出：２８０ｎｍにおける励起及び３４０ｎｍにおける発光、カラムの温度２０℃、溶出液としての水／アセトニトリル／ＴＦＡ。
【０１１５】
５℃においてＴ０及び２月後、Ｔ（２月）、に測定された酸化されたタンパク質の比が図１に示される。
【０１１６】
実施例４及び５から、本発明に従うポリマーの使用は、配合の間に酸化されるタンパク質の割合をより効率的に減らすこと、及び／又は経時的に低い割合に維持することを可能にする。
【０１１７】
実施例６
実施例１のポリマー及び結合されたメチオニンを含まない先行技術のポリマーからのミクロ粒子の製造
いくつかの用途のためには、ポリマー及び活性成分のミクロ粒子を含む配合物の製造が好まれる（例えば、本出願人による出願、国際公開第２００７／１４１３４４号パンフレット）。ミクロ粒子配合物が出願、国際公開第２００７／１４１３４４号パンフレットの実施例１８に従って、言いかえると、アルファトコフェロール、ＩＦＮ、及び遊離の状態のメチオニンでグラフト化されたポリマーＰＯポリグルタメートから出発して製造される。
【０１１８】
ミクロ粒子配合物は、ＩＦＮ及び本発明に従う実施例１のポリマー（アルファトコフェロールのグラフト及びメチオニングラフトを含む）から出発して似た条件で製造される。
【０１１９】
ミクロ粒子におけるメチオニンの量が測定される。結果は下の表２に与えられる。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
これは、出願、国際公開第２００７／１４１３４４号パンフレットに従うミクロ粒子組成物では、メチオニンに重大な損失があり、該損失は、本発明に従うポリマー１が使用されるときは観察されないことを示す。さらに、本発明に従うポリマーの使用は、どのようなサイズであれ、粒子におけるメチオニンの均一な分布を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性の骨格を含む両親媒性ポリマーにおいて、該骨格が、メチオニン又はその誘導体の一つの少なくとも１の側鎖基、及び該メチオニン又はその誘導体の一つと異なる複数の疎水性側鎖基を有することを特徴とする、該両親媒性ポリマー。
【請求項２】
一又は複数の該メチオニン基及び／又は複数の該疎水性基がランダムに配置されている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
該親水性の骨格が、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアクリレート又はポリメタクリレートの群に属するポリマー又はコポリマーであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリマー。
【請求項４】
該親水性骨格が、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリリジン又はそれらのコポリマーから選択されるポリアミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
０．５〜２０％の範囲の、メチオニンのモルグラフト率を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項６】
一又は複数のメチオニン基が以下の構造の一つを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリマー
ここで
− Ｒａはヒドロキシ基、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＮＨＣＨ３又はＮ（ＣＨ３）２基を表し、
− Ｒｂ及びＲｃは、独立して水素原子、メチル又はエチルを表し、
基Ｒｂ及びＲｃのうちの一つが水素原子であるときには他の基はＣ１〜Ｃ６のアシル基を表し、メチオニンの配置はＬ、Ｄ又はラセミ混合物であることができる。
【請求項７】
２〜３０％の範囲の、疎水性基のモルグラフト率を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項８】
疎水性基が、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐状のＣ５〜Ｃ３０アルキル、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１０〜Ｃ３０（ポリ）環状物
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項９】
該親水性骨格がポリ（Ｌ）グルタミン酸ナトリウムであり、及び疎水性基が、合成起源のトコフェリル基である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１０】
メチオニン誘導体がメチオニンアミド又はメチオニンエチルエステルであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１１】
ポリマーが、２，０００〜２００，０００ｇ／モル、好ましくは５，０００〜１００，０００ｇ／モルの範囲のモル質量を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１２】
ポリマーが、ポリエチレングリコールタイプの少なくとも１のグラフトをもまた持ち、より特に１〜１０％の範囲のグラフトのモル百分率である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１３】
ポリマーが、５〜８の範囲のｐＨを有する水性媒体、特に水、に分散されたときに、自発的にナノ粒子を形成することができることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマーのナノ粒子において、該ナノ粒子のサイズが、１〜１０００ｎｍ、特に５〜５００ｎｍ、特に１０〜３００ｎｍ、より特に１０〜２００ｎｍ又は１０〜１００ｎｍさえの範囲である、上記ナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマー、及び活性成分として酸化に敏感な少なくとも１のタンパク質又はペプチドを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１６】
タンパク質又はペプチドが、その配列中に少なくとも１のメチオニンを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ナノ粒子、ミクロ粒子、ゲル又はフィルムの形で提供されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
時間の関数として制御された、活性成分の放出プロフィールを保証することのできる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１】
親水性の骨格を含む両親媒性ポリマーにおいて、該骨格が、メチオニン又はその誘導体の一つの少なくとも１の側鎖基、及び該メチオニン又はその誘導体の一つと異なる複数の疎水性側鎖基を有することを特徴とする、該両親媒性ポリマー。
【請求項２】
一又は複数の該メチオニン基及び／又は複数の該疎水性基がランダムに配置されている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
該親水性の骨格が、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアクリレート又はポリメタクリレートの群に属するポリマー又はコポリマーであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリマー。
【請求項４】
該親水性骨格が、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリリジン又はそれらのコポリマーから選択されるポリアミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
０．５〜２０％の範囲の、メチオニンのモルグラフト率を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項６】
一又は複数のメチオニン基が以下の構造の一つを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリマー
ここで
− Ｒａはヒドロキシ基、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＮＨＣＨ３又はＮ（ＣＨ３）２基を表し、
− Ｒｂ及びＲｃは、独立して水素原子、メチル又はエチルを表し、
基Ｒｂ及びＲｃのうちの一つが水素原子であるときには他の基はＣ１〜Ｃ６のアシル基を表し、メチオニンの配置はＬ、Ｄ又はラセミ混合物であることができる。
【請求項７】
２〜３０％の範囲の、疎水性基のモルグラフト率を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項８】
疎水性基が、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐状のＣ５〜Ｃ３０アルキル、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、
− 任意的に少なくとも１の不飽和及び／又は少なくとも１のヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１０〜Ｃ３０（ポリ）環状物
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項９】
該親水性骨格がポリ（Ｌ）グルタミン酸ナトリウムであり、及び疎水性基が、合成起源のトコフェリル基である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１０】
メチオニン誘導体がメチオニンアミド又はメチオニンエチルエステルであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１１】
ポリマーが、２，０００〜２００，０００ｇ／モル、好ましくは５，０００〜１００，０００ｇ／モルの範囲のモル質量を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１２】
ポリマーが、ポリエチレングリコールタイプの少なくとも１のグラフトをもまた持ち、より特に１〜１０％の範囲のグラフトのモル百分率である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１３】
ポリマーが、５〜８の範囲のｐＨを有する水性媒体、特に水、に分散されたときに、自発的にナノ粒子を形成することができることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマーのナノ粒子において、該ナノ粒子のサイズが、１〜１０００ｎｍ、特に５〜５００ｎｍ、特に１０〜３００ｎｍ、より特に１０〜２００ｎｍ又は１０〜１００ｎｍさえの範囲である、上記ナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマー、及び活性成分として酸化に敏感な少なくとも１のタンパク質又はペプチドを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１６】
タンパク質又はペプチドが、その配列中に少なくとも１のメチオニンを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ナノ粒子、ミクロ粒子、ゲル又はフィルムの形で提供されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
時間の関数として制御された、活性成分の放出プロフィールを保証することのできる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５１５８０９（Ｐ２０１３−５１５８０９Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５５１９（Ｐ２０１２−５４５５１９）
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５６０４１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７７４０２
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１１０２５７６５）フラメル テクノロジーズ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５６０４１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７７４０２
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１１０２５７６５）フラメル テクノロジーズ (6)
【Ｆターム（参考）】
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