モノテルペン及び／又はセスキテルペンを蓄積する形質転換植物
本発明は、導入遺伝子を発現する植物及び遺伝子の付加的なコピーを含んでなるように形質転換された植物に関するものであり、前記の遺伝子は、少なくともＨＭＧＲ−ＣｏＡ還元酵素及びテルペンシンターゼをコードする。本発明はさらに植物を製造する方法、及びテルペンを生産する方法の保護を請求する。故に本発明は、興味のあるいずれかのテルペン、特にいずれかのモノテルペン及び／又はセスキテルペンを生産するための信頼できかつ費用対効果が大きい基盤を提供する。例えば、当業者は、本発明の植物中でそれぞれのセスキテルペンを蓄積するためにセスキテルペンシンターゼをコードするいずれかの遺伝子を使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、形質転換植物に関する。特に、モノテルペン及び／又はセスキテルペンを蓄積する形質転換植物。前記植物は形質転換されて、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）、及び、場合により、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）をコードする付加的な遺伝子を、過剰発現するか又は含んでなる。本発明はさらに、前記植物を製造する方法、植物中の特定のテルペンの含量を改変する方法、テルペンを生産する方法及び形質転換植物を生産するための前記の遺伝子の使用に関する。
【０００２】
発明の背景及び解決すべき課題
テルペン及びテルペノイドは、たいていの生物中に見出される。それらの常に増大している重要な商業的価値は、異なるテルペンにより包含される生理活性(bioactivities)及び官能性の多岐にわたる範囲に結び付いている。それに応じて、多くのビタミン、ホルモン、昆虫忌避剤、医薬、フレーバー及びフレグランスは、この極めて多くの部類の化合物の中で見出されており、これら全てが、イソプレン単位と呼ばれる５個の炭素の単位から出発して製造される。
【０００３】
テルペンは、それらの構造中に存在しているイソプレン単位の数により分類されることができる：モノテルペン（Ｃ10）、セスキテルペン（Ｃ15）、ジテルペン（Ｃ20）、トリテルペン（Ｃ30）、テトラテルペン（Ｃ40）及びポリテルペン（Ｃn、ｎ≧４５）。植物界は、多数の異なる構造を表すモノテルペン及びセスキテルペンの高い多様性を有する。
【０００４】
高級テルペン、例えばセスキテルペンの化学合成は極めて複雑であり、かつ環境的に受け入れることができるそれらの製造方法はまだ実現されていない。故に、本発明の第一の対象は、特定のテルペンを効率的に製造するか又は蓄積する一方で、多段階の化学合成を回避する方法を提供することである。
【０００５】
テルペンの生合成の経路に関する研究は、全てのテルペンへの共通のＣ5−前駆物質がイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）であることを明らかにした。ＩＰＰ生合成のための２つの別個の経路が植物中に同時に存在する。メバロン酸経路（ＭＶＡ）は、サイトゾル中に小胞体に関連して見出され、かつデオキシキシルロース又はメチル−Ｄ−エリトリトールリン酸経路（ＤＯＸＰ／ＭＥＰ）とも呼ばれる非メバロン酸経路は、高等植物の色素体中に見出される。出発産物、介在される酵素及び触媒反応は双方の経路で異なり、かつ、高等植物の細胞中でこれらは並行して働き、かつ互いに補完する。それに応じて、細胞質中のＭＶＡ経路は、ステロール、セスキテルペン及びポリテルペンの生合成の要因であるのに対し、色素体（ＭＥＰ経路）は、モノテルペン、ジテルペン、例えばカウレン（Ｃ20）、及びポリテルペン、例えばカロテノイド（Ｃ40）及びプラストキノン−９（Ｃ45）の合成のためのＣ5−単位を提供する。
【０００６】
ＩＰＰの合成に続いて、これはプレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）により繰り返して縮合されて、各部類のテルペンのためのテルペン前駆物質である非環状プレニル二リン酸、すなわち、モノテルペンのためのゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）及びセスキテルペンのためのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が形成される。これらの前駆物質はそしてまた、テルペンシンターゼ又はシクラーゼのための基質として利用され、これらは、テルペン、例えばモノテルペン、及びセスキテルペンシンターゼの各部類に特異的である。テルペンシンターゼは、複雑な多段階環化を触媒して、テルペン化合物の炭素骨格の大きな多様性を形成することができる。
【０００７】
特定のテルペンシンターゼを単離することが試みられており、かつ国際公開(WO)第2004/031376号パンフレットには、クベボール、バレンセン及びゲルマクレンシンターゼをコードする遺伝子の単離が報告されている。エシェリキア コリ(E. coli)細胞が、これらの遺伝子を有するプラスミドで形質転換された場合に、相応するフレグランス化合物は、培養基中に見出されることができた。一般的に、テルペンシンターゼの異種発現と関係がある先行技術を鑑みて、一対象は、なおより高い量で特定のテルペンを蓄積する手段及び方法を提供することである。
【０００８】
米国特許(US)第5,589,619号明細書、米国特許(US)第5,365,017号明細書、米国特許(US)第5,349,126号明細書及び米国特許(US)第5,349,126号明細書には、トランスジェニック植物中でのスクアレン及びステロール蓄積を増加させる方法が開示されている。しかしながら、これらの参照文献は、どのようにしてその他の部類のテルペン、例えばモノテルペン及びセスキテルペンの蓄積が増加されることができたかについて言及しない。
【０００９】
トランスジェニック植物の製造は、米国特許(US)第6,841,717号明細書の対象でもあり、前記明細書はＭＥＰ経路に関連した遺伝子に関する。この参照文献は、葉緑体輸送ペプチドに結合され、故にトランスジェニック植物を生産するのに使用されたＨＭＢＰＰシンターゼ（ＧＣＰＥタンパク質）をコードするＤＮＡ分子を教示する。この参照文献はトコフェロール基質の蓄積を扱う一方で、どのようにしてその他のテルペン化合物が有効に蓄積されることができるかを言及しない。
【００１０】
本発明者らは、選択された特定のテルペンを生産するか又は蓄積するという問題に取り組む。好ましくは、予め決定されただけでなく、興味のあるいずれかのテルペンも生産するのに適している方法が提供される。故に、前記対象は、例えば、上記で示されたいずれかのセスキテルペン、例えばクベボール、バレンセン、ゲルマクレン、パチュロールの蓄積を可能にするが、しかし、その他のテルペン、特にモノテルペンを蓄積するのにも適している系を提供することである。この問題はこれまで先行技術により解決されておらず、後者は基本的に、ＭＶＡ又はＭＥＰ経路において変性された性質を有する組換え生物を示唆しており、かつ特定のテルペン最終産物が蓄積されることを観察している。
【００１１】
本発明のさらなる対象は、選択されたいずれかのテルペン、好ましくはセスキテルペンを、立体化学的に純粋な形で及び信頼できかつ費用対効果が大きい生産基盤を伴って、生産する手段を提供することである。
【００１２】
発明の要約
注目に値することに、本発明者らは、テルペンシンターゼ（ＴＳ）及びレギュレーションされていない形のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）を発現するように生物を形質転換するのに成功し、かつＴＳにより合成される高収率のテルペンを得た。意外なことに、ＴＳをコードする異種の遺伝子単独で形質転換された植物中で、テルペン蓄積は、検出可能であったが、しかし僅かであり、かつＴＳタンパク質発現レベルと相互に関係していなかった。本発明の重要な利点は、所望のいずれかのテルペンが、選択されたテルペンのシンターゼをコードするヌクレオチド配列が知られているか又は定型的に単離されることができる場合に、いずれかの植物中で蓄積されることができることである。これは、好ましくは植物のサイトゾルへ、ＨＭＧＲ及びテルペンを合成することのできる酵素、すなわちＴＳである少なくとも２つの遺伝子産物をターゲティングすることにより可能である。
【００１３】
それに応じて、本発明は、第一の態様において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）をコードする導入遺伝子を発現する植物を提供する。
【００１４】
第二の態様において、本発明は、付加的な遺伝子を含んでなるように形質転換された植物を提供し、前記遺伝子は少なくともＨＭＧＲ及びＴＳをコードする。
【００１５】
第三の態様において、本発明は、少なくとも１つのＰＲＴ及び／又は少なくとも１つのＴＳをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを提供する。
【００１６】
第四の態様において、本発明は、形質転換植物を製造する方法を提供し、前記方法は、付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、前記の付加的な遺伝子はＨＭＧＲ及びＴＳをコードし、及び前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる。
【００１７】
第五の態様において、本発明は、本請求の範囲及び明細書に詳細に説明される通り、形質転換植物を製造するさらなる方法を提供する。
【００１８】
さらなる一態様において、本発明は、植物中のテルペンの含量を改変する方法を提供し、前記方法は植物を形質転換する方法の段階を含んでなる。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、テルペンを生産する方法を提供し、前記方法は、本発明の植物又は形質転換植物を製造する方法により得ることができる植物からテルペンを単離する段階を含んでなる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、改変されたテルペン含量を有する植物を生産するための、ＨＭＧＲ及びＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子の使用を提供する。
【００２１】
図面の簡単な説明
図中で、
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、部分Ａ及びＢ中で、対照タバコ系統（部分Ｂ）、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）及びセスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）をコードする導入遺伝子の双方で形質転換されたもの、部分Ａ、のＧＣ−ＭＳ分析を示す。クロマトグラムＡ中のピーク１０は、部分Ｃ中でＭＳにより分析され、かつ基準パチュロール（Ｄ）との比較によりパチュロールと同定されることができた。ピーク３を内標準（３−α−セドレン）として使用した。
【００２２】
図２は、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）、セスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）、又は双方を過剰発現する再生産されたトランスジェニック植物系統中のｍＲＮＡ発現レベルを定量的に示す。
【００２３】
図３は、再生産されたトランスジェニック植物中での免疫学的検出により測定された通りの、トランスジェニック植物中のパチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）及び融合タンパク質ＦＰＳ−ＰＴＳタンパク質のタンパク質発現レベル（ウェスタンブロッティング）を示す。
【００２４】
図４は、異なる構成体で形質転換された植物の葉中のパチュロール含量を示す。比較は、高収率のパチュロール（新鮮な葉ＦＷ ＞５００ng/g）が、トランスジェニックＨＭＧＲ及びＰＴＳの双方を発現する植物（８ＰＴＳ）中で蓄積されたことを明らかにする。トランスジェニックＰＴＳのみを発現する植物（２ＰＴＳ）は典型的に、パチュロール５００ng/g未満を蓄積する。
【００２５】
図５は、植物のアグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)媒介形質転換に適しているベクター（"ｐＢＤＯＮ"）の体制を示しており、この中で、ａｔｔｐ２配列とａｔｔｐ１配列（ｃｍ ｃｃｄＢ）との間の領域は、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び場合によりＰＲＴを保有する(harbour)ために試験管内で及び部位−特異的に再結合されることができる。前記ベクターは、実施例においてさらに詳細に論じられる通り、植物の形質転換のための境界配列領域、プロモーター、ターミネーター及びａｔｔｐ１／２組換え配列を含んでなる。
【００２６】
図６Ａ及び図６Ｂは、図５のベクターｐＢＤＯＮ中への部位−特異的な組換えにより挿入されるべき、ａｔｔｐ２とａｔｔｐ１配列との間に、それぞれ、１つ又は２つの遺伝子を含んでなるヘルパーベクター（"ｐＴＭＯＮ"及び"ｐＴＤＵＡＬ"）を示す。図６Ａは、ｐＢＤＯＮベクター中へ一回で１つの遺伝子を挿入するのに適しているヘルパーベクターを示すのに対し、図６Ｂは、ｐＢＤＯＮ中へ一回で２つの遺伝子を挿入するのに適しているヘルパーベクターを示す。前記ベクターは、実施例においてさらに詳細に論じられる通り、プロモーター、ターミネーター、ａｔｔＢ１／２組換え及びプレースホルダー配列"遺伝子１"及び"遺伝子２"を含んでなる。
【００２７】
図７は、異なる植物形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の体制を示す。ＨＰＴ領域は、ハイグロマイシン耐性を提供し、ＰＴＳは、セスキテルペン（パチュロール）シンターゼをコードし、ＬＩＳは、モノテルペン（リモネン）シンターゼをコードし、ＦＰＳ及びＧＰＳは、プレニルトランスフェラーゼ（それぞれファルネシル二リン酸シンターゼ及びゲラニル二リン酸シンターゼ）をコードする。前記ベクターはさらに、適したプロモーター及びターミネーター配列を含んでなる。
【００２８】
図８は、ｐＢＤＯＮベクター（図５）の構成を略示的に示す。
【００２９】
図９は、ｐＴＭＯＮヘルパーベクター（図６Ａ）の構成を略示的に示す。
【００３０】
図１０部分Ｉ及び図１０部分ＩＩは、ｐＴＤＵＡＬヘルパーベクター（図６Ｂ）の構成を略示的に示す。
【００３１】
図１１は、トランスジェニック植物における過剰発現のための（Ａ）リモネンシンターゼ（ＬＩＳ）及び（Ｂ）リモネンシンターゼ＋ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）発現ベクターの構成を略示的に示す。
【００３２】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、トランスジェニック植物中でのパチュロール蓄積への、ＰＴＳ及びＦＰＳの過剰発現との組合せでの、切断された(truncated)形のＨＭＧＲの過剰発現の寄与を説明する。部分Ａは、ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ又はＰＴＳ−ＦＰＳ遺伝子融合で最初に遺伝子操作された(engineered)植物と、切断されたＨＭＧＲ（ΔＨＭＧＲ）遺伝子で遺伝子操作された植物との間で実施された遺伝子交雑を説明する。部分Ｂは、生じた後代植物のパチュロール蓄積についての評価の結果を示す。親系統（白色で示されている）中のパチュロールレベル（μg/g新鮮な質量）は、相応する後代系統（相反交雑−黒色及び灰色）に対して示されており、グラフの上部の数は、ＨＭＧＲ遺伝子の添加によるパチュロール蓄積における平均した倍量の改善を示す。ΔＨＭＧＲ親系統（Ｐ２）は、少しもパチュロールを蓄積しなかった。
【００３３】
図１３Ａは、［１−13Ｃ］−グルコース上で成長した実生中でＭＥＰ又はＭＶＡ経路を経て生合成されたパチュロールにおける予測される13Ｃ標識パターンを示す。
【００３４】
図１３Ｂは、12Ｃ−グルコースが供給された植物により合成されたパチュロール（上部のパネル）、対、［１−13Ｃ］−グルコースからサイトゾル（真ん中）又は色素体（下部）の生合成に関して遺伝子操作された植物による合成について、ＭＳ親イオンを比較する。
【００３５】
図１４は、モノテルペン（リモネン）シンターゼ（ＬＩＳ）をコードする導入遺伝子で形質転換された植物、及び更に加えてゲラニル二リン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を有する系統１ｄ及び３ａ中でのリモネン生産を示す。
【００３６】
配列表は、本発明の形質転換植物の製造において使用されるヌクレオチド配列を示す。配列番号１は、パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）をコードする配列を示す。この配列の、例えばＨｉｓタグをコードするヌクレオチド配列と融合された、変異体も使用された。配列番号２は、鳥類のファルネシル二リン酸（ＦＰＳ）をコードするヌクレオチド配列である。配列番号３は、９ｂｐリンカー配列（ｂｐ１１３５−１１４３）を含む、ＰＴＳ（ｂｐ１１４４−２８０２）と融合された鳥類のＦＰＳ（ｂｐ１−１１３４）、（ＦＰＳ−ＰＴＳ）のヌクレオチド配列を示す。配列番号４は、色素体ターゲティング信号が除去されている、柑橘類由来のリモネンシンターゼ（ＬＩＳ）をコードするヌクレオチド配列である。配列番号５は、色素体ターゲティング信号が除去されている、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）をコードするヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号６〜４８は、本発明のために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号４９〜５７は、ポリクローナル抗体、すなわちそれぞれ、ＰＴＳ（５０〜５４）及びＦＰＳ（５５〜４８）のための抗体を製造するのに使用されるペプチド配列である。
【００３９】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）をコードする導入遺伝子を発現する植物を提供する。
【００４０】
この植物は、いずれの植物であってよく、好ましくは、本発明により形質転換されるのに適している植物である。好ましくは、前記植物は、本来、高い量のテルペンを生産する植物である。例えば、前記植物は、ナス科(Solanaceae)、イネ科(Poaceae)又はシソ科(Lamiaceae)のファミリーから選択される。例えば、前記植物は、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、モロコシ属(Sorghum)、アラビドプシス(Arabidopsis)、ウマゴヤシ属(Medicago)（アルファルファ）、ワタ(Gossypium)（木綿）、アブラナ属(Brassica)（セイヨウアブラナ）の属から選択される。好ましくは、前記植物は、タバコ(Nicotiana tabacum)の種に属する。
【００４１】
"発現する"、"発現"等、例えば"遺伝子を発現する"という用語は、遺伝子がｍＲＮＡに転写され、かつ発現された遺伝子によりコードされるタンパク質が植物中に見出される事実を呼ぶ。"発現する"という用語はまた、"過剰発現"を包含し、後者は、非トランスジェニック植物中で測定される以上のｍＲＮＡ、タンパク質及び／又は酵素活性のレベルを呼ぶ。
【００４２】
"導入遺伝子"という用語は、外来生物、一般的に導入遺伝子を含んでなる植物以外の種類又は種から単離される遺伝子を含んでなるヌクレオチド配列を呼ぶ。
【００４３】
"導入遺伝子"という言葉中に存在するような、"遺伝子"という用語は、例えば、本発明の植物によって、示された活性を有するタンパク質、例えばテルペンシンターゼに翻訳されることができるヌクレオチド配列を呼ぶ。本発明のためには、"遺伝子"という用語は、植物中で発現される最終的なタンパク質構成体が、上述の活性を示す限りは、非コード領域も含みうる。
【００４４】
それに応じて、酵素、例えばＨＭＧＲをコードする遺伝子は、例えば導入遺伝子を含めて、少なくとも１つのポリペプチドの製造のための情報を含んでなるヌクレオチド配列を呼ぶ。
【００４５】
本発明はさらに、付加的な遺伝子を含んでなるように形質転換された植物を提供し、前記遺伝子は少なくともＨＭＧＲ及びＴＳをコードする。
【００４６】
"形質転換された"、例えば形質転換植物という用語は、植物が遺伝子操作にかけられている事実を呼ぶ。"形質転換植物"は、形質転換されている個々の植物の無性（栄養性）及び有性で誘導された後代を含む。例えば、非形質転換植物で個々に形質転換されている植物を交雑することにより得られた植物は、後代が、本発明により必要とされる通りの付加的な遺伝子及び／又は導入遺伝子を含有する場合に、本発明により包含される。
【００４７】
本明細書の範囲内で"含んでなる(comprises)"という言葉は、"とりわけ、含む"ことを意味するとみなされる。"から専らなる"と解釈されることを意図するものではない。
【００４８】
"付加的な遺伝子"を含んでなるように形質転換された植物という用語は、遺伝子操作前にこの位置に存在しなかった、植物の全ゲノムのいずれかの位置（核、ミトコンドリア及び色素体）中へ挿入された新しい又は外来ＤＮＡ（例えば、遺伝子）を、遺伝子操作のために含んでなる植物を呼ぶ。
【００４９】
本発明の植物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする遺伝子を含んでなる。ＨＭＧＲは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａをメバロン酸に還元的脱アシル化するのを触媒することのできる酵素である。ＨＭＧＲという用語は、ＨＭＧＲの全ての部類、特に部類Ｉ及びＩＩを包含する。ＨＭＲＧという用語は、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．３４を有する酵素を包含する。ＨＭＧＲ類は、全ての真核生物中並びに多くの細菌中に存在する。
【００５０】
本発明は、特定のＨＭＧＲをコードする特定のヌクレオチド配列に限定されるものではなく、しばしばそれとは反対に、いずれかのＨＭＧＲが、本発明のために選択されることができる。故に、当業者は、文献からか又は公的データベースからＨＭＧＲをコードするいずれかの生物から単離されるいずれかの遺伝子を選択することができる。それに加えて、当業者は、ＨＭＧＲ類をコードする新規遺伝子を、例えば、いずれかの生物から、定型的に単離することができる。多様な生物由来のＨＭＧＲ類をコードする６０を上回るヌクレオチド配列が、既に単離されており、かつ当業者に容易に入手可能であることを考慮すれば、特定のＨＭＧＲ類の一覧は本明細書で提供される必要はない。
【００５１】
好ましくは、ＨＭＧＲ遺伝子は、本発明の植物とは異種である。より好ましくは、非植物ＨＭＧＲであり、例えば動物から単離されるＨＭＧＲ遺伝子が使用される。
【００５２】
好ましくは、前記遺伝子は、可溶性の及び膜結合されていないＨＭＧＲをコードする。これは、ヌクレオチド配列によりコードされる膜−結合領域を切断し、かつ膜結合領域を欠いているＨＭＧＲをコードするヌクレオチド配列を使用することにより達成されることができる。選択的に、膜ドメインを欠くＨＭＧＲをコードする遺伝子は、大形リーシュマニア(Leishmania major)から単離されており、かつ本発明のために使用されることもできる。
【００５３】
好ましくは、ＨＭＧＲをコードする遺伝子は、強い、レギュレーションされていない構成性プロモーターの指示の下にある。
【００５４】
ＨＭＧＲをコードする及び／又はＨＭＧＲを過剰発現する付加的な遺伝子を含んでなるタバコ植物は、例えば、米国特許(US)第5,306,862号明細書、米国特許(US)第5,349,126号明細書、米国特許(US)第5365,017号明細書、米国特許(US)第5,589,619号明細書に開示されており、これらの全てが、参照により本明細書に明示的に取り込まれる。これらの植物は、本発明のために使用されることができ、かつＴＳをコードする少なくとも導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子のコピーを含んでなるように形質転換されることができる。
【００５５】
本発明の植物は、ＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる。ＴＳ類は、与えられた前駆物質化合物からのテルペンの形成を触媒する酵素である。好ましい一実施態様によれば、ＴＳは、モノテルペンシンターゼ及び／又はセスキテルペンシンターゼである。モノテルペンシンターゼは、前駆物質としてのゲラニル二リン酸を用いてモノテルペン（Ｃ10−化合物）の形成を触媒する酵素である。セスキテルペンシンターゼは、ファルネシル二リン酸からのセスキテルペン（Ｃ15）の形成を触媒することのできる酵素である。
【００５６】
故に、常にメバロン酸を産生するＨＭＧＲ類とは対照的に、本発明のＴＳは、異なる反応生成物を有する異なる酵素から選択されることができる。それに応じて、ＴＳという用語は、全体で多数の異なるテルペン化合物を合成することのできる多くの異なるＴＳ類を呼ぶ。
【００５７】
故に、本発明の重要な利点は、所望のいずれかのＴＳを選択するという大きな選択権である。当業者が生産したいか又は本発明の植物中に蓄積させたいテルペンに応じて、それぞれのテルペンを合成することのできるヌクレオチド配列が自由に選択されることができる。このようにして、本発明は、興味のあるいずれかのテルペンの生産のための費用効率的な基盤を提供する。
【００５８】
本発明の原理を説明するために、遺伝情報が入手可能である幾つかのＴＳは、例として提供される：モノテルペンシンターゼの例は、リモネンシンターゼ（ＬＳ）（Ohara他, 2003）及びＳ−リナロールシンターゼ（ＬＩＳ）である。（Lucker他, 2001）。
【００５９】
好ましい一実施態様によれば、前記ＴＳは、セスキテルペンシンターゼである。多数のセスキテルペンがこれまで記載されていることを考慮すれば、相応する数のセスキテルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼをコードする遺伝子が選択されることができるプールとして利用されることができる。それに応じて、セスキテルペンシンターゼをコードする遺伝子は、公的に利用できるデータベースからか、文献からか、又は当業者が定型的な実験及び十分知られた単離手順によって生物から容易に単離することができるこれまで未発見の遺伝子から、選択されることができる。例えば、ＴＳは、β−カリオフィレン、α−フムレン、ゲルマクレンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、バレンセン、アリストロケン、ベチスピラジエン、パチュロール、クベボール、γ−クルクメン、（−）−ゲルマクレンＤ、（＋）−ゲルマクレンＤ、ビシクロ−ゲルマクレン及び／又はδ−カジネンシンターゼを合成することができる。上記セスキテルペンを合成することのできる一部のＴＳ類の遺伝子は、国際出願PCT/IB/2004/003836号及び国際公開(WO)第2004/031376号パンフレットに開示されている。
【００６０】
例えば、ＴＳにより合成されることができるテルペンは、フレグランス、フレーバー、医薬、殺虫剤、殺真菌剤及び／又は除草剤である。好ましくは、フレグランスである。
【００６１】
"テルペン"は、環状又は非環状であってよい、イソプレン単位（Ｃ5Ｈ8）をベースとするか又はこれから構成された炭化水素である。本発明のためには、"テルペン"、"モノテルペン"、"ジテルペン"及び／又は"セスキテルペン"という用語は、テルペン誘導体、例えばテルペノイドも含み、これらは、例えば、ヒドロキシル化、異性化、酸化還元反応、ジメチル化又はアシル化のような官能化の１つ又はそれ以上の段階を経験した炭化水素を含む。
【００６２】
ＨＭＧＲ及びＴＳをコードする遺伝子は、例えば、ＴＳ及びＨＭＧＲ活性の双方を有する融合タンパク質をコードする１つの単一遺伝子の形で存在していてよい。
【００６３】
好ましい一実施態様によれば、本発明の植物はさらに、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）をコードする導入遺伝子を発現するか、又はＰＲＴをコードする付加的な遺伝子を含んでなるように形質転換される。
【００６４】
ポリプレニル二リン酸シンターゼ又はポリプレニルピロリン酸シンターゼとも呼ばれるプレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及び１つ又はそれ以上のＩＰＰ残基、例えばファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又は他のものを含むアルキル化段階を触媒する酵素である。ＰＲＴという用語はまた、多様なテルペノイドファミリーのためのポリプレニル二リン酸前駆物質をもたらす一反応又は一連の反応を触媒することのできる１つ又は幾つかの別個の酵素を含む。故に、ＰＲＴをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、本発明のためには、単量体、二量体、三量体、四量体及び低重合体のタンパク質のホモ混合物及びヘテロ混合物を含んでなる四次構造を有するポリペプチドをコードする配列を包含する。特に、ＰＲＴは、単量体、ヘテロ二量体及び／又はホモ二量体であってよい。ペパーミント(Mentha piperita)の油胞由来のゲラニル二リン酸シンターゼは、本発明により包含されるある特定のＰＲＴ類の複雑な遺伝子体制のための例として利用されることができる、それというのも、この酵素は精製されており、かつヘテロ二量体であることが判明しており、その際に双方のサブユニットは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆物質からＧＰＰを生産するのに必要とされる。
【００６５】
好ましくは、ＰＲＴ類は、例えば、ＥＣ番号ＥＣ２．５．１の下に分類される酵素を包含する。
【００６６】
好ましい一実施態様において、ＰＲＴをコードする少なくとも１つの遺伝子は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）シンターゼ及び／又はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）である。ＧＰＰ及びＦＰＰは、それぞれ、モノテルペン及びセスキテルペンのための前駆物質である。
【００６７】
ジメチル−アリル−トランストランスフェラーゼとも呼ばれるゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）は、ＰＲＴ類の例である。
【００６８】
好ましい一実施態様によれば、ＰＲＴはファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）である。ＦＰＳ類は、例えば、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）とＩＰＰとの縮合によりファルネシル二リン酸に変換するのを触媒する酵素である。好ましくは、ＦＰＳは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を、アリル性二リン酸、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）と、ついで生じたゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）と順次縮合させて最終生成物ファルネシル二リン酸に変換するのを触媒することができる。
【００６９】
好ましくは、遺伝子ＰＲＴは、本発明の植物中の選択されたＴＳのための前駆物質を提供するように選択される。例えば、植物が、セスキテルペンシンターゼをコードする付加的な遺伝子を含んでなる場合には、これはさらに、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする付加的な遺伝子を含んでなる。
【００７０】
ＨＭＧＲ類及びＴＳ類をコードする遺伝子に類似して、ＰＲＴ類をコードする遺伝子は、公的に入手可能であり、かつ多様な起源から当業者により選択されることができる。ＨＭＧＲ類、ＰＲＴ類及び／又はＴＳをコードするヌクレオチド配列を得るために適している公的に入手可能なデータベースは、例えば、European Bioinformatics Instituteのデータベース、（http://www.ebi.ac.uk/swissprot/index.html）、ＥＸＰＡＳＹデータベース（http://www.expasy.org/enzyme/）、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）及び多数のその他のものである。本発明のために使用されることができる、当業者に入手可能なＦＰＳ類の多数の可能性を説明する単なる目的のために、イプス ピニ(Ips pini)から単離されたゲラニル二リン酸シンターゼ（NCBI受入れ番号(AN): AY 953508.1）、ビブリオ フィシェリ(Vibrio fischeri)から単離されたファルネシル二リン酸シンターゼ（NCBI AN: YP 203660）、及びTarshis他(1994)により報告された鳥類のファルネシル二リン酸シンターゼが引用されることができる。もちろん、その他のいずれかのＰＲＴが、いずれかのデータベース又は起源から選択されることができる。
【００７１】
好ましい実施態様によれば、付加的な遺伝子及び／又は遺伝子の産物は、植物の細胞のサイトゾルに向けられている。遺伝子産物は、多様な手段によって植物のサイトゾルに向けられていてよい。例えば、植物は、核染色体中の遺伝子のコピーを含んでなるように形質転換されることができ、その際に前記遺伝子は、いずれの色素体ターゲティング配列、及び／又はその他のいずれの細胞小器官ターゲティング情報を含まない。これは、例えば、しばしば色素体−ターゲティング配列を含んでなる知られたモノテルペンシンターゼの多くについては関連性があり、その際に活性のそれらの原理部位は色素体である。この場合に、色素体ターゲティング配列は、ＴＳ及び／又はＰＲＴをコードする付加的な遺伝子及び／又は導入遺伝子から、植物をそれで形質転換する前に、除去されるべきである。それに応じて、好ましい一実施態様において、前記の遺伝子及び／又は導入遺伝子は、植物の核中で発現される。好ましくは、それらは植物染色体の一部である。
【００７２】
好ましくは、本発明の植物中に存在する付加的な遺伝子及び／又は導入遺伝子によりコードされる遺伝子産物（ＴＳ、ＨＭＧＲ、場合によりＰＴＲ）は、活性である。好ましくは、それらは、生体内で及び／又は試験管内で活性である。標準アッセイは、形質転換植物中の酵素の活性を決定するのに使用されることができる。形質転換植物中のＨＭＧＲ活性を定量的に評価するためのアッセイは、米国特許（ＵＳ）第5,349,126号明細書、例２に開示されており、その際にChappell他, Plant Physiol., 85:469-473 (1987)の方法が参照される。国際公開(WO)第04/031376号パンフレット、例４には、セスキテルペンシンターゼのための酵素機能アッセイが開示されている。上記参照文献に開示された双方のアッセイは、参照により本明細書に取り込まれる。ＰＲＴ活性を評価するためのアッセイは、文献にも見出されることができる。
【００７３】
好ましい一実施態様において、本発明の植物は、自然のままの非形質転換植物に比較した場合に、導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子によりコードされるＴＳにより合成されることができるテルペンの少なくとも１．２倍を蓄積する。好ましくは、形質転換植物は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、より好ましくは少なくとも４倍及び最も好ましくは少なくとも６倍だけ特定のテルペンを蓄積する。
【００７４】
本発明の別の実施態様によれば、形質転換植物は、導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子によりコードされたＴＳにより合成されることができるテルペンを、新鮮な葉１gあたり少なくとも４００ng蓄積する。好ましくは、形質転換植物は、形質転換植物中に存在する組換えＴＳにより合成されることができる特定のテルペン少なくとも５００ng、より好ましくは少なくとも８００ng、一層より好ましくは少なくとも１０００ng、さらにより好ましくは少なくとも２０００ng、一層より好ましくは少なくとも５０００ng、さらにより好ましくは７０００ng及びなおさらにより好ましくは少なくとも８μgを蓄積する。最も好ましくは、形質転換植物は、新鮮な葉１gあたり、特定のテルペンを少なくとも１００００ng又はそれ以上ですら蓄積する。例えば、形質転換植物は、新鮮な葉１gあたりテルペン２〜１６μg、好ましくは４〜１２μgを蓄積する。特定のテルペンの量は、乾物の質量で表現されることもできる。この場合に、乾物の植物材料及び特に葉は、新鮮な質量についての値の約１０％に相応する。それに応じて、乾燥した葉１gあたりテルペン少なくとも４、５、８、１０、２０、５０、７０又は１００μgが蓄積される。
【００７５】
自然のままの非形質転換植物が既に、ＴＳにより合成されることができる特定のテルペンを生産する場合に、形質転換植物に妥当な値は、非形質転換植物中に本来存在する特定のテルペンの量に付け加えられる。
【００７６】
本発明の植物中の特定のテルペンの含量の決定のために、テルペンを生産するか又は蓄積するいずれかの植物器官が参照として採取されることができる。好ましくは、同じ齢を有する緑色の葉（好ましくは成熟した葉）は、それぞれ、形質転換植物及び非形質転換植物から比較のために採取される。分析は、好ましくは、実施例に概説されたプロトコル"テルペン分析"に従って実施される。好ましくは、新鮮な葉は、植物から切り取った直後に分析される。葉は収穫後に冷凍されてよく、かつ冷凍した状態で分析されてよい。
【００７７】
好ましい一実施態様によれば、本発明による形質転換植物は、試料呼称"８ｈｓＰＴＳ−１０"及びＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０６でＡＴＣＣに寄託された形質転換されたタバコ(Nicotiana tabacum cv Xanthi)である。
【００７８】
好ましくは、形質転換植物は、選択された野生型遺伝子中にノックアウト、ダウンレギュレーション、欠失又はその他の形の有害突然変異を含んでなっていてよく、これらは炭素フラックスを、従来のテルペンから本発明のＴＳの経路へ逸脱するのに適しているテルペン生合成の経路に関与する。好ましくは、これらの従来の、その他のテルペン経路は、ダウンレギュレーションされる。例えば、本発明の植物は、ステロール、ポリプレノイド、フィトール及びカロテノイドの合成をもたらすＦＰＰ、ＧＰＰ及び／又はＧＧＰＰシンターゼをコードする遺伝子の下流に、１つ又はそれ以上の非官能性又は減少された官能性の遺伝子を有していてよい。このようにして、炭素フラックスは、特定のテルペンの合成の方へより効率的に向けられることができる。
【００７９】
本発明は、少なくとも１つのＰＲＴ及び／又は少なくとも１つのＴＳをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターはさらに、ＨＭＧＲをコードする遺伝子を含んでなるヌクレオチド配列を含んでなる。好ましくは、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴからなる群から選択される１つ、２つ又は全てをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターは、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴに結合された色素体ターゲティング配列を含まない。
【００８０】
好ましくは、前記ベクターはさらに、色素体ターゲティング配列及びそれぞれ、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴのための遺伝子を含むヌクレオチド配列の好ましくは上流及び下流に、プロモーター及びターミネーター配列を含んでなる。好ましくは、前記ベクターは、強い構成性プロモーターを含んでなる。プロモーターの商業的に入手可能な例は、ＦＭＶ、ゴマノハグサモザイクウイルス、ＡＣＴ２、アクチン、ＭＡＳ、マンノピンシンターゼ及びＮＯＳプロモーターである。好ましくは、前記プロモーターは、形質転換されていない宿主植物の対照及び／又はフィードバックレギュレーション機構から独立して選択される。好ましくは、組換えＨＭＧＲ及びＴＳは、上流のプロモーター配列を有する。より好ましくは、それらは各々異なるプロモーター配列を有する。
【００８１】
場合により、前記ベクターは、抗体結合に適しているタグ、例えばＨｉｓ−タグ及び／又はｍｙｃタグをさらに含んでなることができる。
【００８２】
好ましくは、本発明のベクターはさらに、形質転換植物を選択するのに適しているマーカーを含んでなる。例えば、前記ベクターは、ハイグロマイシン又はカナマイシン耐性を付与する遺伝子、又は首尾良く形質転換植物を選択するのに適しているその他のいずれかの種類のマーカーを含んでなっていてよい。
【００８３】
好ましくは、本発明のベクターはさらに、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び場合によりＰＲＴに隣接し、任意のプロモーター、ターミネーター及び／又はタギング配列を含む、左側及び右側のＴ−ＤＮＡ境界配列領域、並びに構造遺伝子を植物核ゲノム中へ移転する及び組み込むのを促進するための植物耐性マーカーを含んでなる。
【００８４】
それに応じて、本発明のベクターは好ましくは、ＨＭＧＲ、ＰＲＴ及び／又はＴＳをコードする構造遺伝子、及び植物ゲノム中への挿入を促進する左側及び右側の境界配列領域により挟まれた、形質転換植物の選択のためのマーカーを含んでなる。
【００８５】
好ましくは、前記ベクターはさらに、左側及び右側境界配列領域の外側に、ベクターを含んでなる細菌をクローニングするために使用されるか又は植物の形質転換のために使用されるポジティブ細菌形質転換体（アグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)）を選択するためのマーカーを含んでなる。
【００８６】
好ましい実施態様において、本発明のベクターは、試料参照"ｐＢｈｓＰＴＳ"及びＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６７０７でＡＴＣＣに寄託されたプラスミドである。
【００８７】
一態様において、本発明は、形質転換植物を製造する方法に関するものであり、前記方法は、付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、前記の付加的な遺伝子はＨＭＧＲ及びＴＳをコードし、及び前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる。
【００８８】
植物材料を形質転換する段階のために、植物を本発明の遺伝子で形質転換するいずれかの方法が使用されることができる。例えば、保護細胞壁をはがした植物細胞は、ある特定の膜−作用物質で又は電気穿孔法で処理された場合に、純粋なＤＮＡを吸収する。ＤＮＡは、極めて薄いガラス針を用いてターゲット植物細胞中へマイクロインジェクションされることができる。植物形質転換の最近開発された方法である、バイオリスティック(biolistics)は、静電パルス、空気圧又は黒色火薬衝撃を用いて、ＤＮＡでコーティングされたタングステン又は金の極めて小さい粒子を細胞中へ加速することを含む。
【００８９】
本発明者らは、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換で良好な結果を得た。好ましくは、植物核染色体ＤＮＡ中への構造遺伝子の組み込みを可能にするヌクレオチド配列により挟まれた、本発明の構造遺伝子の少なくとも１つを含んでなるプラスミド構成体（ベクター）、例えば上記で開示されたものが使用される。
【００９０】
それに応じて、本発明の植物、方法又は使用の一実施態様において、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び存在する場合にはＰＲＴをコードする遺伝子は、好ましくは色素体ターゲティング配列を欠いている、核遺伝子である。これらの遺伝子は好ましくは、本発明の植物の核染色体中に存在する。
【００９１】
例えばＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ構成体での植物材料の形質転換は、標準法により実施されることができ、Schardl他, Gene (1987) 6: 61:1-11; Berger他, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:8402-8406;及びHorsch他, Science (1985) 27:1229-1231参照、後者の方法は、タバコ(Nicotiana tabacum)を形質転換するのに特に適している"葉片法"を記載する。
【００９２】
本発明の方法はさらに、形質転換植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる。形質転換植物材料から植物全体を再生産する方法は、当業者により定型的に適用される。例えば、Horsch他(1985)により開示された方法が使用されることができる。一般的に、アグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)を有する挿入ＤＮＡにより接種された葉のセグメントは、カルス及び再生産される植物シュートが明らかになるまで、選択培地中で成長されてよい。サイズが１〜３cmのシュートは、根発生を刺激するために抗生物質を含有するＴ−培地（Schardl, 1987）に移されてよい。一度根系が定着されれば、小さな植物は、商業的に入手可能な鉢植え用土に移されてよく、かつ温室中で繁殖させてよい。それに応じて、好ましい一実施態様において、形質転換植物を製造する方法はさらに、形質転換植物を培養する段階を含んでなる。
【００９３】
一態様において、本発明は、形質転換植物を製造するさらなる方法を提供し、前記方法は、ＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体で一番目の植物材料を形質転換する段階、ＨＭＧＲをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる少なくとも１つのＤＮＡ構成体で二番目の植物材料を形質転換する段階、それぞれ、一番目及び二番目の形質転換植物材料から一番目及び二番目の植物を再生産する段階、一番目及び二番目の植物を交雑する段階及び、交雑により得られた後代から、ＴＳをコードする遺伝子及びＨＭＧＲをコードする遺伝子の双方を含んでなる植物について選択する段階を含んでなる。
【００９４】
好ましい一実施態様において、ＴＳをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体が、又はＨＭＧＲをコードする遺伝子を含んでなる遺伝子構成体が、さらにＰＲＴを含んでなる。
【００９５】
上記の方法は、本発明の形質転換植物を得る選択的な方法であり、前記方法において、異なる植物材料が、ＨＭＧＲ又はＴＳをコードする構造遺伝子で別個に形質転換され、かつ少なくとも２つの組換え遺伝子の１つのみを含んでなる形質転換植物が再生産される。
【００９６】
次の段階において、有性で誘導された後代は、組換え型の、異種の及び／又はトランスジェニックのＨＭＧＲ ＤＮＡを有する植物を、組換え型の、異種の及び／又はトランスジェニックのＴＳ ＤＮＡを含んでなる植物と交雑することから得られる。好ましくは、交雑は、メンデル交雑とも呼ばれる遺伝交雑を呼ぶ。これは典型的に、他家受粉により行われることができる。後代の中では、組換えＰＲＴ並びにＴＳの双方を発現する個体が選択される。例えば、既にＨＭＧＲを過剰発現する植物、例えば米国特許(US)第5306862号明細書、米国特許(US)第5349126号明細書、米国特許(US)第5365017号明細書及び米国特許(US)第5589619号明細書に開示されたものは、例えば、ＴＳをコードする導入遺伝子を含んでなるように形質転換された植物と交雑されてよい。同じ方法で（メンデル交雑）、ＰＲＴをコードする導入遺伝子が導入されることができる。
【００９７】
それに応じて、一実施態様において、前記方法はさらに、一番目及び／又は二番目の再生産された植物、又は一番目及び二番目の再生産された植物を交雑することから得られた植物を、ＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなるように形質転換された植物と交雑する段階を提供する。
【００９８】
選択的に、ＰＲＴをコードする付加的な導入遺伝子は、既にＨＭＧＲを過剰発現する及び／又は付加的な遺伝子を含んでなる及び／又はＴＳをコードする導入遺伝子を、ＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体と共に発現する植物を形質転換することにより、導入されることができる。
【００９９】
形質転換植物を製造する本発明の方法は、形質転換植物中の所望のテルペンの蓄積を得るという目的を有する。故に、形質転換植物は、好ましくは、植物中に高い量のテルペンを蓄積する形質転換体に関してスクリーニングされる。故に、形質転換植物を製造する方法の段階は、植物中のテルペンの含量を改変する方法として同様に適しており、その後者の方法は、本発明のさらに好ましい実施態様を表す。類似して、上記で開示された方法及び植物はまた、本発明の一態様を説明し、これは、改変されたテルペン含量、及び好ましくは増加された含量の特定のテルペンを有する植物を製造するための、ＨＭＧＲ及び／又はＴＳをコードする遺伝子、及び、場合によりＰＲＴをコードするさらに少なくとも１つの遺伝子の使用である。
【０１００】
本発明はさらに、テルペンを生産する方法に関するものであり、前記方法は、本発明の植物からか、又は形質転換植物を製造する方法により得ることができる植物から、テルペンを単離する段階を含んでなる。形質転換植物は、好ましくは十分に高い収率で及び／又は十分に大きな規模で培養及び収穫されることができ、本方法を経済的に好都合にすることができる。本発明の特定のテルペンは、有機溶剤抽出又は蒸留を含めた当工業界において使用されるいずれかの方法により単離されることができ、かつガスクロマトグラフィー（ＧＣ）−質量分析法（ＭＳ）により定量化及び／又は同定されることができる。
【０１０１】
実施例
次の例は、本発明を説明するためのものであり、結果として範囲を限定するものではない。実施例の方法及びプロトコルは、特定の材料又はキットの製造者により供給される標準プロトコルに従って、又はSambrook他(1989)及びAusubel他(1987)により定義された次の十分確立されたプロトコルにより一般的に実施される。
【０１０２】
使用された全てのプライマーは、添付された配列表に一覧にされている。一部の方法又はプロトコル段階のために文献が参照され、この文献は以下により詳細にさらに一覧にされており、かつ参照により本明細書に明示的に取り込まれる。
【０１０３】
例１：植物材料の選択
以下１４−８と呼ぶ、切断されたハムスターヒドロキシメチル−グルタリル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を含有するタバコ(Nicotiana tobacum)‘Xanthi’系統のホモ接合系統、及び以下１４−２と呼ぶ、導入遺伝子の欠いているＦ２分離同胞系統を、Chappell他(1995)により及び米国特許(US)第5306862号明細書、米国特許(US)第5349126号明細書、米国特許(US)第5365017号明細書に記載された通りに発生させた。簡単に言えば、最初にChin他(1984)により特性決定されたハムスター遺伝子を、ヌクレオチド２８〜１０２３を除去することにより改変して、δ−２２７ ＨＭＧＲと呼ばれる遺伝子の切断された形を生産した。切断されたＨＭＧＲ ｃＤＮＡのＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１フラグメントを単離し、中間体プラスミドベクターであるｐＫＹＬＸ ６１中へ挿入し、その構成体のＥｃｏＲ１／Ｃｌａ１フラグメントを、その後にｐＫＹＬＸ７１の相応する部位中へ挿入して、ｐＫＹＬＸ７１−切断されたＨＭＧＲ遺伝子構成体を生産した。Ｔｉ−プラスミド系列ｐＫＹＬＸ６１及び７１を、Schardl他（1987）により発生させた。
【０１０４】
ｐＫＹＬＸ７１−ＨＭＧＲプラスミドを、無力化した(disarmed)ＴｉプラスミドＧＶ３８５０を保有するアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)中へ、標準トリペアレンタルメイティング手順（Schardl他, 1987）を用いて起動した。タバコ(Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi)の葉片を植物材料として使用し、ｐＫＹＬＸ７１−ＨＭＧＲ構成体を有するアグロバクテリウム(Agrobacterium)で接種し、トランスジェニック植物をSchardl他(1987)及びHorsch他(1985)に記載された標準の形質転換及び再生産プロトコルを用いて再生産した。
【０１０５】
最初に形質転換され、かつ再生産された植物（Ｒ０世代）を、成長させ、自家受粉させ、その後の種を収集した（Ｒ１世代）。Ｒ１種子を、標準の温室条件下に個々の植物として成長させ、自家受粉させ、Ｒ２種子世代を収集した。その後に、Ｒ２種子世代を、ＨＭＧＲ導入遺伝子の存在に関してスクリーニングした。
【０１０６】
ＨＭＧＲ導入遺伝子構成体の存在に関するスクリーニングは初めに、ｐＫＹＬＸ７１−ＨＭＧＲ構成体の部分として植物中へ遺伝子操作されたカナマイシン耐性マーカーの存在に基づいていた（Chappell他, 1995）。カナマイシン１００mg/Lを含有する発芽培地上にプレーティングした種を、光退色を示す発芽された実生（全て白色の実生、カナマイシン耐性マーカーの欠けているもの及び故に導入遺伝子構成体の欠けているホモ接合系統）対全ての緑色の実生（カナマイシン耐性マーカーを保有する緑色の実生、及び故に導入遺伝子構成体を有するホモ接合系統）について記録した。これらの同定された系統からの種を、その後に温室中で繁殖させ（カナマイシン選択を有しない）、ステロールに関する化学分析により遺伝子操作したＨＭＧＲ構成体の存在に関してスクリーニングした（Chappell他, 1995）。系統１４−８は、対照植物よりも２〜１０倍高いステロールレベルを示し、かつ全ての実生がカナマイシンの存在で正常に成長したのに対し、系統１４−２は、形質転換されていない対照植物に匹敵しうるステロールレベルを有し、かつカナマイシンの存在で発芽された実生は全て光退色された白色であった。
【０１０７】
植物系統１４−８（ＨＭＧＲ−過剰発現）及び１４−２（対照）を、その後の全ての形質転換作業において使用した。
【０１０８】
例２〜５．組換え及び植物形質転換ベクターの構成
ハイグロマイシン選択マーカー（Hajdukiewicz他, 1994）を、形質転換植物のための選択マーカーを作り出すために選んだ。新しいベクターを、Hartley他(2000)により記載された通り、適切な組換えクローニング部位を用いて遺伝子操作した。
【０１０９】
例２：ｐＢＤＯＮベクターの発生
ｐＢＩ１０１ベクター（Invitrogen、カールズバッド、CA）を制限酵素Ｓｐｈ１及びＳｓｔ１で消化し、プラスミドベクターに相応するＤＮＡフラグメント（ＲＢ境界配列及びＮＰＴＩＩ遺伝子カセットを含まない）を、アガロースゲル精製により単離した（Sambrook他, 1989）、図８中（１）。並行して、ｃｃｄｂ遺伝子及びクロロアムフェニカル(chloroamphenical)耐性遺伝子を含むａｔｔｐ組換えカセットを、ｐＤＯＮ２２１ベクター（Invitrogen、カールズバッド、CA）から、プライマーＡｔｔｐ１−ＳｓｔＩ−ＦＷ及びＡｔｔｐ２−ＳｐｈＩ−ＲＶで標準ＰＣＲ条件を用いて増幅させた（２）。ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントをＳｐｈ１／Ｓｓｔ１酵素で制限し、ゲル精製し、前記の類似して消化したｐＢＩ１０１ベクターの相応する部位中へ連結して、中間体ｐＢａｔｔｐベクターが生じた（３）。
【０１１０】
ハイグロマイシン遺伝子カセットを２段階プロセスで製造した。最初に、ハイグロマイシン遺伝子（ＨＰＴ）及びＣａＵＴＲ（終止配列）を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（Cambia、キャンベラ、AU）ベクターから、ＰＣＲプライマーＨＰＴ−ＮｏｔＩ−ＦＤ及びＨＰＴ−Ｘｂａ１−ＲＶを用いてＰＣＲ増幅させ、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen、マディソン、WI）中へＴ／Ａクローニングして（ＰＣＲ反応混合物から直接的にＴａｑ−増幅されたＰＣＲ産物）、ｐＴＨＰＴが生じた（４）。右側境界配列（ＲＢ）及びＮＯＳ−プロモーター（Ｐ−ＮＯＳ）領域を、ＰＣＲプライマーＴＢ−ＳｐｈＩ−ＦＤ及びＴＢ−ＮｏｔＩ−ＲＶを用いてｐＢＩ１０１から増幅させ（５）、ついでｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中へＴ／Ａクローニングして、ベクターｐＴＲＢＰが生じた（６）。ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを、ベクターｐＴＨＰＴから、Ｎｏｔ１／Ｘｂａ１での消化を経て放出し（７）、類似して消化されたｐＴＲＢＰベクター中へクローニングして、ベクターｐＴＲＢＰＨＰＴＴが生じた（８）。ＮＯＳプロモーター−ハイグロマイシン−ＣａＵＴＲカセットを、ついで、このベクターから、プライマーＴＢ−ＳｐｈＩ−ＦＤ及びＨＰＴ−ＳｐｈＩ−Ｒを用いて増幅させた（９）。増幅させた産物をＳｐｈ１で消化し、ｐＢａｔｔｐの相応する部位中へ連結し、ｐＢＤＯＮベクターが生じた（１０）。
【０１１１】
ｐＢＤＯＮ Ｔｉ−ベクター（図５、９）は、細菌中の選択のためのＴ−ＤＮＡ領域及び植物形質転換選択のためのハイグロマイシン遺伝子（ＨＰＴ）の外側に、ＮＰＴＩＩ選択マーカーを含有する。それゆえ、埋め込まれたａｔｔｐカセットは、ｐＢＤＯＮベクター中へのａｔｔＢ部位で挟まれたターゲット遺伝子構成体の簡単な挿入を提供する。
【０１１２】
ａｔｔＢ部位を有するヘルパーベクターの発生：
２つの異なるａｔｔＢヘルパーベクターを、図９及び１０に与えられたプロトコルに従って構成した。ｐＢＤＯＮベクター中への、一方は単一遺伝子挿入（ｐＴＭＯＮ、図６Ａ）について及び他方は２つのターゲット遺伝子挿入（ｐＴＤＵＡＬ、図６Ｂ）。
【０１１３】
例３：ｐＴＭＯＮベクターの生産（図９）
ｐＴＭＯＮベクターを、改変されたｐＢＩ１０１ベクターから、Ｎｄｅ１制限部位及びプライマーＣＳＭＶ−ＡＴＴＢ１−ＳＧＦＩ−ＦＤ中へ埋め込まれたａｔｔＢ１配列を含有する前方のＰＣＲプライマー、及びＥｃｏＲ１部位を含有するリバースプライマーＣＳＭＶ−ＥＣＯＲＩ−ＲＶで、カッサバモザイクウイルス（Ｐｃｖ）プロモーターを最初に増幅することにより構成した（１１）。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター（Promega、マディソン、WI）中へＴ／Ａクローニングし（１２）、ついでＮｄｅ１／ＥｃｏＲ１消化産物として再単離した。単離された消化産物（１３）を、ｐＥＣＶＳベクター、任意のプレースホルダー遺伝子、"遺伝子１"、ＮＣＢＩ受入れ番号ＣＱ８１３５０８）を保有するｐＥＴ２８ａ誘導体の相応する制限部位中へ連結して、ｐＥＰＣＶＳを生産した（１４）。
【０１１４】
並行して、ｐＢＩ１０１のＮＯＳターミネーター（ＴＮＯＳ）配列を、前方のプライマーＴｎｏｓ−ＸｈｏＩ−ＦＷ及びリバースプライマーＴｎｏｓ−ａｔｔＢ２−ＲＶで増幅して、ａｔｔＢ２組換え部位をＴＮＯＳ配列の下流で組み込んだ。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中へＴ／Ａクローニングし、ｐＴＴＮＯＳベクターが生じた（１５）。ｐＥＰＣＶＳ（１６）のＮｄｅ１／Ｘｈｏ１消化フラグメントをその後に、ｐＴＴＮＯＳの相応する部位中へ連結して、ｐＴＭＯＮ（１７）を生産した（図６Ａ、９）。
【０１１５】
ｐＴＭＯＮベクターを、カッサバモザイクウイルスプロモーター（Ｐｃｖ）（Frey他, 2001）の後ろに単一ターゲット遺伝子の挿入のために構成し、Ｎｏｓターミネーター配列が続いた。
【０１１６】
一部の場合に、Ｈｉｓタグ配列を、ＥｃｏＲ１での消化によりｐＴＭＯＮベクター中へ遺伝子操作し、プライマーペアＨｉｓ−ＥｃｏＦ及びＨｉｓ−ＥｃｏＲでのリンカー／ライゲーションが続いた。その後の突然変異を、Ｈｉｓ−タグオープンリーディングフレーム配列を完全に破壊するが、しかし都合のよいＡｓｃ１及びＥｃｏＲ１制限部位を維持するように設計した。これは、プライマーｍＨｉｓＰＴＳ−Ｆ及びｍＨｉｓＰＴＳ−Ｒでの標準ＰＣＲ反応条件を用いて達成され、ＰＣＲ反応産物を細菌中へ形質転換して、突然変異したｐＴＭＯＮプラスミドを回収した。
【０１１７】
例４：ｐＴＤＵＡＬベクターの生産（図１０ Ｉ及びＩＩ）
ｐＴＤＵＡＬベクターを多段階プロセスで構成した（図１０、部分１及び２）。最初に、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（Ｐｃａ）（Benfy他, 1990）を、ｐＢＩ１２１ベクター(Invitrogen)から、プライマーＰＣａＭＶ−ＸｂａＩ−ＦＷ及びＰＣａＭＶ−ＳｐｅＩ−ＲＶを用いて増幅させ、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中へＴ／Ａクローニングした（１８）。プロモーター要素をその後に、このベクターからＸｂａ１及びＳｐｅ１での消化により放出した（１９）。並行して、任意のプレースホルダー遺伝子（"遺伝子２"）を、エリシター処理された細胞培養物（PCT/US06/02265）から得られたヒオシアムス ムチクス(Hyoscyamus muticus) ｃＤＮＡライブラリーから、プライマー７１２０Ｄ−ＳｐｅＩ−ＦＷ及び７１２０Ｄ−ＫｐｎＩ−ＲＶで増幅させ、Ｓｐｅ１／Ｋｐｎ１での消化及びｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの相応する部位中へのライゲーションが続き、ｐＴＨＰＯが生じる（２０）。ｐＴＨＰＯをついでＸｂａ１／Ｓｐｅ１で消化し、類似してｐＴＰＣａから放出されたＣａＭＶプロモーターフラグメントを一緒に連結して、ｐＴＰＨＰＯを得た（２１）。
【０１１８】
ｐＴＰＨＰＯを形成するために並行して、ＮＯＳターミネーター配列を、ｐＧＴＮＯＳベクターからプライマーＴｎｏｓ−ＫｐｎＩ−ＦＷ及びＴｎｏｓ−ａｔｔＢ２−ＲＶ３で増幅させ、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター（２２）中へＴ／Ａクローニングし、Ｋｐｎ１及びＳａｃ１でのｐＧＴＮＯＳＫプラスミドの消化によるその後のフラグメントの再単離が続いた（２３）。このフラグメントを、ついで、ｐＴＰＨＰＯの相応する制限部位中へクローニングし、ｐＴＰＨＰＯＴを生じさせた（図１０の部分１）（２４）。
【０１１９】
ｐＴＤＵＡＬベクターを構成する最終段階において、ａｔｔＢ１部位から、挿入されたテルペンシンターゼ遺伝子の下流のｎｏｓ−ターミネーター配列にわたるｐＴＭＯＮベクターのフラグメント（２５）を、標準ＰＣＲ条件を用いて増幅させた。増幅産物がプライマーＣｓＭＶ−ａｔｔＢ１−Ｓｇｆ Ｉ−ＦＤ及びＴＮＯＳ−ＸｂａＩ−ＲＶを有して得られ、これをまた、フラグメント上の末端Ｓｐｈ１及びＸｂａ１部位を遺伝子操作した。ＰＣＲフラグメントを、消化し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの相応するＳｐｈ１／Ｘｂａ１部位中へ連結して、ｐＴＰＣＶＳＴが生じた（２６）。最後に、ｐＴＰＨＰＯＴからのＸｂａ１ないしＳａｃ１消化フラグメント（２７）を、ｐＴＰＣＶＳＴの相応する部位中へ連結して、ｐＴＤＵＡＬベクター（２５）を生じさせ、これは、強い構成性発現プロモーターの下流の２遺伝子配列の挿入を可能にする（図１０、部分２）。
【０１２０】
ｐＴＤＵＡＬベクター（図６Ｂ）を、トランスジェニック植物中へ２つの遺伝子を挿入するために設計した。一番目の遺伝子の発現は、カッサバモザイクウイルスプロモーター(Frey他, 2001)により向けられるのに対し、二番目の遺伝子の発現は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター(Benfey他, 1990)により向けられる。
【０１２１】
前記のｐＴＭＯＮ構成体になされた改変に類似して、一部の場合にＨｉｓタグ配列を、ＥｃｏＲ１での消化、引き続きプライマーペアＨｉｓ−ＥｃｏＦ及びＨｉｓ−ＥｃｏＲでのリンカー／ライゲーションにより、ｐＴＤＵＡＬベクター中へ遺伝子操作した。その後の突然変異を、Ｈｉｓタグオープンリーディングフレーム配列を完全に破壊するが、しかし都合のよいＡｓｃ１及びＥｃｏＲ１制限部位を維持するようにも設計した。これを、プライマーｍＨｉｓＰＴＳ−Ｆ及びｍＨｉｓＰＴＳ−Ｒでの標準ＰＣＲ反応条件を用いて達成され、ＰＣＲ反応産物を細菌中へ形質転換して、突然変異したｐＴＤＵＡＬプラスミドを回収した。
【０１２２】
例５：パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）及びパチュロールシンターゼ＋ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰ）過剰発現ベクターの構成
ＰＴＳ及びＰＴＳ＋ＦＰＳ発現ベクターの生産は、ｐＴＭＯＮ、ｐＴＤＵＡＬ及びｐＢＤＯＮベクターと関連している適切な組換えクローニング部位によって大いに促進された。ＰＴＳ（国際公開(WO)第2004/031376号パンフレット）又はＦＰＳ遺伝子（Tarshis他, 1994）を、それぞれ、プライマーペアＰＴＳ−ＡｓｃＦ及びＰＴＳ−ＸｈｏＲ、又はＦＰＰ−ＳｐｅＦＷ及びＦＰＰ−ＫｐｎＲＶで増幅させ、Ａｓｃ１／Ｘｈｏ１又はＳｐｅ１／Ｋｐｎ１のいずれかで消化し、ついで、ｐＴＭＯＮ又はｐＴＤＵＡＬベクターの相応する部位中へ連結した。ＦＰＳ−ＰＴＳ遺伝子融合を、ＦＰＳ遺伝子をプライマーＦＰＳ−ＡｓｃＦ及びＦＰＳ−ＡｓｃＲで増幅し、生じたＰＣＲフラグメントをＡｓｃ１で消化し、このフラグメントをｐＴＭＯＮ及びｐＴＤＵＡＬベクター中のＰＴＳ遺伝子に対して５′に見出される相応するＡｓｃ１部位中へ連結することによって生成させた。生じたプラスミドを、ついで、相応するＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ及びＦＰＳ−ＰＴＳ遺伝子カセットを標準組換えクローニング（Hartley他, 2000）によりｐＢＤＯＮベクター中へ起動するために使用して、Ｔｉ−プラスミドベクターのファミリーを生じさせた（図７）。図７に示された一番目のカセットに相応するＨｉｓタグを有し、ＰＴＳをコードする遺伝子を含んでなるプラスミドｐＢＤＯＮベクターを寄託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０７で寄託した。
【０１２３】
例６：植物形質転換及び再生産
個々のｐＢＤＯＮベクター構成体（図５、７）を、電気穿孔法によるアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)系統ＧＶ３８５０（Mersereau他, 1990）及びカナマイシン耐性について選択された形質転換体中へ形質転換した。選択されたコロニーを、限定されたＤＮＡ配列決定法により導入遺伝子構成体について検証し、その後に、カナマイシン１００mg/Lを含有するＬＢ培地５０mL中で成長させた。０．６〜０．８に等しいＯＤ６００を有する一晩の培養物を、遠心分離により濃縮し、新鮮なＬＢ培地３０mL（抗生物質を有しない）中に再懸濁させ、前に記載された通り葉外植片の接種のために使用した（Chappell他, 1995; Horsch他, 1985）。簡単に言えば、無菌条件下で成長した植物からの葉を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)培養物中へ入れ、約１cmセグメントに切断し、葉セグメントを非選択的培地プレート上にプレーティングした（Murashige及びSkoog, 1962）。３日後、葉外植片を、ハイグロマイシン１５μg/mL（Invitrogen、カールズバッド、CA）及びセホタキシム５００μg/mL（Bioworld、ダブリン、OH）を含有する培地プレートに及びその後に一週間同じ選択培地に、カルス及び再生産された植物シュートが明らかになるまで、移した。サイズが１〜３cmのシュートを、ついで、根発生を刺激するためにＴ−培地（Murashige及びSkoog、1962）（同じ抗生物質を含有する）へ移した。一度根系が定着されれば、小さな植物を商業的に入手可能な鉢植え用土に移し、温室中で繁殖させた。
【０１２４】
例７：テルペン分析
例６において得られた形質転換植物の葉材料から抽出されたセスキテルペンを、同定し、ＧＣ−ＭＳ分析により定量した。２００〜５００mgの冷凍した葉試料を、液体窒素中で粉砕し、ついで、外標準としてα−セドレン２００ngを含有するヘキサン：酢酸エチル混合物３mL（ｖ／ｖ ８５：１５）で抽出した。抽出物を、酢酸エチル：ヘキサンの同じ８５：１５混合物で溶離されるシリカカラム上に試料を流すことにより部分的に精製した。溶離液を、アリコート１μLをＧＣ−ＭＳにより分析する前に、窒素流下に、３０μL濃縮した（Takahashi S, 2005）。試料を、Restec Rtx-5キャピラリーカラム（３０m×０．３２mm、相厚さ０．２５μm）を備えたTrace GC-MS(ThermoFinnigan、サマセット、NJ)上へ注入し、スプリットレスモードで２５０℃のインジェクタ温度で及び７０℃の初期オーブン温度で１min、引き続き１minあたり４℃勾配で２３０℃まで操作した。マススペクトルを、３５から３００までの原子質量単位にわたり、７０eVで記録し、検証のためにライブラリー標準（ＮＩＳＴライブラリー）及び基準の標準と比較した。
【０１２５】
パチュロールの量の評価は、パチュロール及び内標準についての全イオンモニタリングにより得られたピーク面積の比に基づいていた。α−セドレン及びパチュロールの応答因子を、相応する標準の同じ量の同時注入により計算し、かつ生じた較正因子を計算に含めた。同じ方法を、リモネン及びその他のテルペン分子の定量化に使用した。
【０１２６】
図１は、セスキテルペン含量についての、対照タバコ系統（ＷＴ）及びＨＭＧＲ及びＰＴＳ遺伝子構成体で形質転換されたもののテルペン分析の結果を示す。図１中で、ＨｉｓＰＴＳ遺伝子構成体で形質転換されたＨＭＧＲ過剰発現系統についての全イオンクロマトグラム（図１Ａ）は、対照植物（ＨＭＧＲのみで形質転換された）のそれと比較される（図１Ｂ）。ピークを、入手可能な標準とのそれらのマススペクトルの比較によるか、又はＮＩＳＴライブラリーにおいて入手可能なスペクトルマッチにより、同定した。例えば、ピーク１２についてのＭＳ（Ｃ）は、基準パチュロールについてのＭＳ（Ｄ）と比較される。その他のピーク同定：１−β−パチュレン；２−β−エレメン；３−α−セドレン（内標準）；４−カリオフィレン；５−α−グアイエン；６−未知；７−α−パチュレン；８−セイケレン；９−未知、１０−δ−グアイエン；１１−グロブロール；及び１２−パチュロール。
【０１２７】
図１は、ＧＣ−ＭＣ分析の結果であり、かつ興味のある特定のサイトゾル標的テルペン（パチュロール）シンターゼ及びＨＭＧＲをコードする遺伝子で特異的に形質転換された植物（Ａ）が、野生型（Ｂ）と比較した場合に改変されたテルペン含量及び同じパチュロールシンターゼにより合成されたその他のテルペンに加えて蓄積されたパチュロールを有していたことを説明する。
【０１２８】
図４は、ＰＴＳをコードする組換え遺伝子で形質転換された植物の葉中のセスキテルペン（パチュロール）含量の定量分析であり、この際に"ＰＴＳ"単独では、ＰＴＳをコードする組換え遺伝子を保有する形質転換体と呼び、"ＦＰＳ−ＰＴＳ"は、ＰＴＳをコードする遺伝子に融合されたＦＰＳをコードする遺伝子を呼び、かつ"ＦＰＳ＋ＰＴＳ"は、ＰＴＳ及びＦＰＳをコードする分離した遺伝子を呼ぶ。１４−８＋ＰＴＳ（８ＰＴＳ）は、本発明によるＨＭＧＲ遺伝子を過剰発現する植物を呼ぶのに対し、１４−２＋ＰＴＳ植物（２ＰＴＳ、２ＦＰＳ−ＰＴＳ、２ＰＴＳ＋ＦＰＳ）はＨＭＧＲを過剰発現しない。図４中の植物８ＰＴＳ １０の種子を、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０６で寄託した。
【０１２９】
図４において、ＴＳ（ＰＴＳ）をコードする遺伝子単独での植物の形質転換により、タンパク質の検出可能な発現が観察され、かつタンパク質発現レベルと相互に関係していたが、しかしパチュロール蓄積は僅かであったことがわかる。ＴＳをＦＰＳと同時発現させることにより、パチュロールの蓄積は中程度に増加した。対照的に、１４−８系統中のＰＴＳの発現（ＨＭＧＲ過剰発現） 高いパチュロールレベルは、図４中の同じ系統と比較して、ＰＴＳタンパク質発現レベル（図３中の系統１０）と直接的に相互に関係していることが観察される。このことは、テルペン蓄積へのＨＭＧＲの強い寄与を明らかに証明することになる。
【０１３０】
例８：本発明の植物を得るためのメンデル交雑
１４−８系統を有する形質転換植物を得るのが困難であるために、古典的なメンデル交雑を、ＰＴＳ単独で（ＰＴＳ）、ＦＰＰシンターゼを有するＰＴＳ（ＰＴＳ＋ＦＰＳ）を、又はＨＭＧＲと共にＦＰＰシンターゼを有する融合タンパク質（ＦＰＳ−ＰＴＳ）として、過剰発現する植物系統を生産するために使用した。ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ又はＦＰＳ−ＰＴＳのいずれかを発現させるために遺伝子操作したトランスジェニック植物系統を、ハイグロマイシン（１５mg/L）の存在で初めに発芽させ、抗生物質耐性植物（所望の構成体を含んでなる）のみを成長させた（親系統Ｐ１）。親系統Ｐ２は、切断されたＨＭＧＲ遺伝子（１４−８）についてホモ接合であり（Chappell他、1995）、選択せずに発芽させ、かつ成長させた。相反交雑（２つの親系統の間での花粉交換）によりＦ１後代種が生じ、これらを、カナマイシン（５０mg/L）及びハイグロマイシン（１５mg/L）の存在で発芽させ、生じた耐性植物を例７で前記の通りパチュロール蓄積について評価した。これらの二重耐性植物は、図１２（部分Ａ）中に説明される通り、切断されたＨＭＧＲをコードする一番目の構成体及びＰＴＳ、ＦＰＳ＋ＰＴＳ又はＦＰＳ−ＰＴＳのいずれかをコードする二番目の構成体の二重挿入を有する。
【０１３１】
生じた後代植物であるＦ１世代植物を、ついで、ＧＣ−ＭＳによるパチュロールのそこでの蓄積について評価した。図１２の部分Ｂ中に、親系統（白色で示されている）中のパチュロールレベルは、相応する後代系統（相反交雑 − 黒色及び灰色）に対して示されている。ΔＨＭＧＲ親系統（Ｐ２）は、少しもパチュロールを蓄積しなかった。以下の第１表は、同じ評価の数値を示す。結果は、サイトゾル中でのパチュロール生合成の遺伝子操作が、レギュレーションされていない形のＨＭＧＲの同時の遺伝子操作により有意に高められていることを証明する。交雑から生じた全ての後代植物について、パチュロール生産の１．５〜１５倍の増加が観察された。
【０１３２】
第１表：異なる形質転換植物及び遺伝子交雑に続く後代中のパチュロール含量
【表１】
【０１３３】
例９：ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
各系統の全ＲＮＡを、Trizol試薬を用いて製造者（Invitrogen Life Technologies、カールズバッド、CA）に従い若葉５００mgから単離した。ファーストストランドｃＤＮＡを、反応緩衝液中の全ＲＮＡ５μg、オリゴｄＴ１２−１６プライマー２００ng及び逆転写酵素（Superscript II、Invitrogen Life Technologies）を有する２０μL反応及び製造者により推奨された通りの条件中で合成した。ＲＮａｓｅ Ｈ １μLをその後に、ｃＤＮＡ調製物に添加し、３７℃で１時間定温保持して、相補的ＲＮＡを除去した。
【０１３４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を、異なるトランスジェニック系統中でのｍＲＮＡレベルを決定するのに使用した。リニアＰＣＲ増幅のための最適濃度を、添加したｃＤＮＡ鋳型の量を変え、かつＰＣＲサイクルの数（１０、１５、２０、２５及び３０）を用いることにより決定した。プライマーＰＴＳ−８Ｆ及びＰＴＳ−１６０Ｒを、ＰＴＳ遺伝子を増幅させるのに使用したのに対し、ＦＰＰ−１Ｆ及びＦＰＰ−１６０Ｒを、ＦＰＳ遺伝子のために使用した。他のプライマー対であるＲＢＣＳ−ＦＷ及びＲＢＣＳ−ＲＶを、内標準としてのＲＵＢｉｓＣＯスモールサブユニット遺伝子を増幅させるのに使用した。典型的なＰＣＲ条件は、混合物２５μLの合計で、１×Ｔａｑ緩衝液（製造者により供給された通り）、ＭｇＣｌ2 １．５mM、ｄＮＴＰ混合物 ０．２mM、各プライマー０．５μM、ｃＤＮＡ １．２５μL及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位からなっていた。ＰＣＲ増幅を２０温度サイクルにわたって実施し、それぞれ、９４℃で３０secの変性、６０℃で３０secのアニール、及び７２℃で６０secの延長からなっていた。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色し、撮影した。
【０１３５】
ＰＴＳ及びＦＰＳ ｍＲＮＡ分析の結果は、図２に示されている。前記図は、パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）遺伝子を有する構成体、又はパチュロールシンターゼ及びＦＰＳ遺伝子（ＰＴＳ＋ＦＰＳ）を有する構成体、又はＦＰＳ及びＰＴＳの融合タンパク質（ＦＰＳ−ＰＴＳ）をコードする構成体で形質転換された植物から単離されたｍＲＮＡから誘導されたＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。ＲＢＣＳは、ＲｕｂｉｓｃｏスモールサブユニットｍＲＮＡから誘導されたＲＴ−ＰＣＲ産物であり、野生型（ＷＴ）及びトランスジェニック植物中に存在し、かつ内標準として利用される。
【０１３６】
野生型（ＷＴ）植物はＰＴＳ又はＦＰＳを発現しなかったことがわかる。ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ及びＰＴＳ−ＦＰＳ構成体を保有する系統の大部分が、に検出可能なレベルのＰＴＳ ｍＲＮＡを発現したが、しかし、パチュロール蓄積は、ＰＴＳ ｍＲＮＡ発現レベルと相対的に乏しく相互に関係していた。
【０１３７】
例１０：ウェスタンブロッティング分析
４〜５の合成されたペプチドの混合物を、ＰＴＳ及びＦＰＳの抗体を製造するための抗原として使用した。抗原ペプチドを、フリーソフトウエア(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)により予測し、ＦＰＳについて直接的な３Ｄ構造分析（ＰＤＢ：１ＦＰＳ）又はＰＴＳについて入手可能な構造ＥＡＳ（ＰＤＢ：５ＥＡＳ）とのホモロジーモデル比較により選択した。ＰＴＳについて５つの抗原ペプチド（ＰＴＳ４６：ＥＥＬＫＶＥＬ；ＰＴＳ１０８：ＨＡＴＡＬＳＦＲＬＬＲＱＨＧＹＲＶＳＣＥ；ＰＴＳ３５３：ＤＥＥＬＩＫＬＧＡＰＹＲＡ；ＰＴＳ４６２：ＨＶＲＴＡＶＥＣＹＭＥ；ＰＴＳ４７５：ＫＶＧＫＱＥＶＶＳＥ）、及びＦＰＳについて４つの抗原ペプチド（ＦＰＰ４１：ＥＦＶＧＦＦＰＱＩＶＲ；ＦＰＰ５９：ＧＨＰＥＶＧＤＡＶＡＲＬＫＥＶＬＱＹ；ＦＰＰ２１８：ＹＫＡＩＶＫＹＫＴＡＦ−ＹＳＦＹＬＰＶＡＡ；ＦＰＰ３２０：ＰＥＫＶＡＫＶＫＥＬＹＥＡ）を設計した。全てのペプチドを、Sigma-Genosys（The Woodland、TX）により免疫学的グレードで１０mgスケールで合成した。それぞれのペプチド混合物を、ついで、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）キャリヤータンパク質に接合させ、Strategic Biosolutions（Windham、ME）によりウサギ中へ注入した。ＰＴＳ及びＦＰＳのためのポリクローナル抗体を、精製したＰＴＳ又はＦＰＳタンパク質と結合されるＣＮＢＲ−活性化セファロース４Ｂ樹脂を用いて製造された分取用抗原アフィニティーカラムにより製造者の指示書に従い（Amersham Biosciences、バッキンガムシア、英国）さらに精製した。
【０１３８】
トランスジェニック植物材料中のＰＴＳ及びＦＰＳタンパク質レベルを測定するために、若葉材料１００mgを、液体窒素中で粉砕し、ついで８００μLの８０mMリン酸カリウム（ｐＨ ７．０）、１０％グリセリン、１０mMメタ重亜硫酸ナトリウム、１５mM ＭｇＣｌ2、１０mMアスコルビン酸ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン及び１４mM β−メルカプトエタノールで抽出した。粗製タンパク質抽出物を、卓上型小型遠心機中で４℃で最高速度で２０min遠心分離し、生じた上澄みをタンパク質源として使用した。上澄みタンパク質４０μgを含有する試料を、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロース膜(BIO-RAD、Hercules、CA)中へブロッティングした。膜を、精製したＰＴＳ又はＦＰＳ抗体を添加する前に、５％乾燥乳を含有する標準Tween 80／トリス−緩衝液処理塩水（ＴＴＢＳ）遮断溶液で遮断した。膜を、ついで、振とうしながら室温で３〜７時間定温保持し、ＴＴＢＳで３回洗浄し、ついで、ヤギペルオキシダーゼ標識付けした抗ウサギＩｇＧ（Kirkegaard and Perry Laboratories、ゲーサーズバーグ、MD）と共にＴＴＢＳ遮断溶液中で室温でさらに３時間定温保持した。二次抗体の化学ルミネセンス検出を、ＥＣＬ試薬キットを用いて製造者の指示書に従い実施した（Amersham Biosciences、バッキンガムシア、英国）。
【０１３９】
トランスジェニック植物中のパチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）及びファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）タンパク質の発現レベルは、図３に示されている。図３中のレーン上部の数は、パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）遺伝子、又はパチュロールシンターゼ及びＦＰＳ遺伝子を含有する構成体（ＰＴＳ＋ＦＰＳ）、又はＦＰＳ及びＰＴＳの融合タンパク質をコードする構成体（ＦＰＳ−ＰＴＳ）を含有するように遺伝子操作された独立したトランスジェニック植物系統を表す。結果は、テルペンシンターゼ遺伝子（パチュロールシンターゼ）単独で（２ＰＴＳ）又は融合タンパク質をコードする遺伝子（２ＰＴＳ−ＦＰＳ）での形質転換により得られたトランスジェニック植物について、及びテルペンシンターゼ遺伝子での形質転換により得られ、かつさらにトランスジェニックＨＭＧＲ遺伝子（８ＰＴＳ）を含んでなるか又はさらにトランスジェニックＦＰＰシンターゼ（２ＰＴＳ＋ＦＰＳ）を含んでなる植物について、示されている。使用されたポジティブコントロールは、ＰＴＳ及びＦＰＳタンパク質（それぞれレーンＰＴＳ及びＦＰＳ）であり、これらのタンパク質を過剰発現するように形質転換された細菌から精製されたものである。レーンＷＴ１は、野生型植物の葉から抽出する。レーンＷＴ１は、ＨＭＧＲ遺伝子を発現する植物のみの葉から抽出する。パネルＡは、ＰＴＳ抗体を用いて試験した膜を示し、かつパネルＢは、ＦＰＳ抗体を用いて試験した膜を示す。
【０１４０】
図３において、タンパク質が野生型植物中で免疫学的に検出されなかったことがわかる。分析されたトランスジェニック系統の大部分については、ＰＴＳ及び／又はＦＰＳタンパク質は、葉抽出物中で検出されることができ、かつ葉中の組換えタンパク質の発現レベルは、テルペン（パチュロール）蓄積のレベルと相互に関係していた。
【０１４１】
例１１：本発明の植物中でのテルペン合成に使用される経路を示すための［１−13Ｃ］−グルコース標識
蓄積されたパチュロール中の炭素の生合成起源を決定するために、標識実験を実施し、かつ本発明の植物を、パチュロールの色素体生産について遺伝子操作した植物(PCT/IB2006/051198)と比較した。８ＰＴＳ１０（サイトゾル中でＰＴＳを発現するトランスジェニック植物系統）及び２ｔｐＰＴＳ＋ｔｐＦＰＳ１２（色素体）の種を、ハイグロマイシン（１５mg/l）を添加した固体ＭＳ培地上で発芽させた。
【０１４２】
ＧＣ−ＭＳ分析のためには、３４週齢実生を、その後に、スクロースを有しない液体ＭＳ培地５mlを含有する２５mlフラスコ中へ移し、暗所で穏やかに振とうしながら（１２５rpm）、定温保持した。１日後、［１−13Ｃ］−グルコース(Sigma) １００mgを培地中へ添加し、植物材料を毎日収集した。ＧＣ分析のために、試料１００mgを、例７に記載された通りに抽出した。
【０１４３】
ＮＭＲ分析のためには、上記の２つのトランスジェニック系統の１０００実生を使用し、その際に１００実生を、［１−13Ｃ］−グルコース１gを添加した液体ＭＳ培地５０mlを含有する２５０mlフラスコ中で成長させた。全ての標識付けした実生を１週間後に収集し、上記の通り抽出した。濃縮した抽出物（３ml）を、ついで、シリカＴＬＣプレート及び展開溶剤としてヘキサン：酢酸エチル（９：１）を用いる分取ＴＬＣ分離により精製した。
【０１４４】
系統２ｔｐＰＴＳ＋ｔｐＦＰＳ１２からの精製した13Ｃ−標識付けしたパチュロール２５０μg及び８ＰＴＳ１０からの５００μgを、その後に、１３Ｃ−ＮＭＲ（７５０mHz、ＣＤＣｌ3、University of Illinois、シャンペーン、ILのChemistry DepartmentにおけるBob Coatesによる）により分析した。炭素の位置及び豊富化を、対照植物から精製された標識付けしていないパチュロールに対して割り当てた。
【０１４５】
図１３Ａは、［１−13Ｃ］−グルコースが供給されたトランスジェニック実生中での、それぞれ、ＭＶＡ及びＭＥＰ経路から出現するＩＰＰから合成されたパチュロール中の予測された13Ｃ標識パターンを示している。ＭＶＡ経路のＩＰＰから合成されたパチュロールは、位置１、３、５、７、９、１２、１３、１４及び１５で９個の13Ｃ−炭素を有することが予測されるのに対し、ＭＥＰ経路からのその対応物は、単に６個の13Ｃ−炭素、すなわち位置２、６、８、１２、１３及び１５で有することが予想される。
【０１４６】
ＧＣ−ＭＳ分析の結果は、図１３Ｂに示されており、この中で、図ｂは、12Ｃ−グルコースが供給された植物（対照）により合成されたパチュロール、及び図ｃ及びｄは、（サイトゾル）ＭＶＡ及び（色素体）ＭＥＰ経路により13Ｃ−グルコースが供給された植物が製造するパチュロールについてのＭＳ親イオンを、それぞれ示す。13Ｃが供給された植物から出現するパチュロールはより重いイオンを有し、その際に、効果は、色素体パチュロールではあまり顕著ではないことがわかる：サイトゾル経路が遺伝子操作された場合に、主要な親イオンのマスが２２２から２２５にシフトし、かつＭ＋８マス親イオンが観察されることができ；及び葉緑体経路が遺伝子操作された場合に、主要な親イオンのマスが２２４にシフトし、かつＭ＋６マス親イオンが観察されることができる。これらの観察は、標識予測と一致している。ＮＭＲ分析の結果は、以下の第２表に示されている。
【０１４７】
第２表：１−Ｃ13−グルコースからサイトゾルＭＶＡ及び色素体ＭＥＰ経路により合成されるパチュロール中への13Ｃ豊富化
【表２】
【０１４８】
図１３に示された予測された標識パターンに従って、第２表は、サイトゾル中に発現されるＰＴＳを有する植物からのパチュロール中に、炭素原子１、３、５、７、９、１２、１３、１４及び１５が１３Ｃで豊富化されることを示している。標識は故に、セスキテルペンが、ＭＶＡ経路から生じるＩＰＰから実際に合成され、かつ色素体経路の寄与が目下存在することを示している。
【０１４９】
例１２：植物中でのサイトゾルのモノテルペン生合成の遺伝子操作。
【０１５０】
図７に示された発現ベクターを、ＰＴＳ遺伝子についてシトラスリモネンシンターゼ遺伝子（ＬＩＳ）（GenBank受入れAF514287）、及びＦＰＳ遺伝子についてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子（ＧＰＳ）（GenBank受入れＡＴＨ１７３７６）を、原ＰＴＳ及びＦＰＳ発現ベクター中へ置換クローニングすることにより、図１１に説明されている通り生産した。ＬＩＳ及びＧＰＳ遺伝子は、それぞれ、レモンフルーツ又はアラビドプシス(Arabidopsis)植物から単離されたＲＮＡ由来のそれぞれの遺伝子の逆転写−ＰＣＲ増幅により得られた。ＲＮＡを、ＲＮＡ-Trizol(invitrogen)試薬を用いて製造者プロトコルに従い抽出し、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを用いてファーストストランドｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲ増幅を、ＧＰＳの増幅のためのＡｔＧＰＳ−ＳｐｅＦ及びＡｔＧＰＳ−ＫｐｎＲプライマー組合せ及びＬＩＳの増幅のためのＬＩＳ−ＡｓｃＦ及びＬＩＳ−ＸｈｏＲプライマー組合せを用いて実施した（３０、３１）。これらのプライマーを、色素体ターゲティング信号をコードするヌクレオチド配列を除去し、開始コドンを導入し、かつ制限酵素認識部位を導入するように設計した。ＬＩＳ遺伝子を含有するＰＣＲ産物（３２）をＸｈｏＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された原ＰＴＳ発現ベクター（３３）の相応する部位中へ連結した（３４）。生じたベクター（３５）を、植物中でのＬＩＳ発現に使用した。ＬＩＳ及びＧＰＳ発現ベクターの構成のために、前記の通り得られたＧＰＳ遺伝子（３６）を含有するＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化されたＰＴＳ＋ＦＰＳ発現ベクター（３７）中へ連結して（３８）、ベクター３９が得られた（図１１）。ＬＩＳ遺伝子を有し、かつＸｈｏＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で消化したＰＣＲ産物（３２）を前記の通り得て、同じ酵素で最初に消化されたベクター４０中へ連結した（４２）。生じたベクター（４１）を、植物中でＬＩＳ及びＧＰＳを発現するのに使用した。
【０１５１】
植物を例６に従って形質転換し、例７に従ってリモネン蓄積について評価した。図１５において、リモネンが、サイトゾル経路について遺伝子操作された植物中に蓄積され、かつ一部の植物についてはＧＰＳとＬＩＳとの同時発現がリモネンの蓄積を増加させたことがわかる。
【０１５２】
参照文献
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (1987) Current Protocols in Molecular Biology.
Benfey PN, Chua NH (1990) The Cauliflower Mosaic Virus-35s Promoter - Combinatorial Regulation Of Transcription In Plants. Science 250: 959-966
Chappell J, WoIf F, Proulx J, Cuellar R, Saunders C (1995) Is The Reaction Catalyzed By 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme- A Reductase A Rate-Limiting Step For Isoprenoid Biosynthesis In Plants. Plant Physiology 109: 1337-1343
Chin DJ, Gil G, Russell DW, Liscum L, Luskey KL, Basu SK, Okayama H, Berg P, Goldstein JL, Brown MS (1984) Nucleotide- Sequence Of 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl Coenzyme- A Reductase, A Glycoprotein Of Endoplasmic-Reticulum. Nature 308: 613-617
Frey PM, Scharer-Hernandez NG, Futterer J, Potrykus I, Puonti-Kaerlas J (2001) Simultaneous analysis of the bidirectional African cassava mosaic virus promoter activity using two different luciferase genes. Virus Genes 22: 231-242
Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The Small, Versatile Ppzp Family Of Agrobacterium Binary Vectors For Plant Transformation. Plant Molecular Biology 25: 989-994
Hartley JL, Temple GF, Brasch MA (2000) DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research 10: 1788-1795
Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) A Simple And General-Method For Transferring Genes Into Plants. Science 227: 1229-1231
Lucker他(2001) Expression of Clarkia S-linalool synthase in transgenic petunia plants results in the accumulation of S-linalyl-beta-D-glucopyranoside; Plant J. (4):315-24
Mau CJ, West CA (1994) Cloning of casbene synthase cDNA: evidence for conserved structural features among terpenoid cyclases in plants Proc Natl Acad Sci USA; 91(18):8497-501.
Mersereau M, Pazour GJ, Das A (1990) Efficient Transformation Of Agrobacterium-Tumefaciens By Electroporation. Gene 90: 149-151
Murashige T, Skoog F (1962) A Revised Medium For Rapid Growth And Bio Assays With Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum 15: 473 -&
Ohara他(2003) Limonene production in tobacco with Perilla limonene synthase cDNA. J. Exp. Bot.
Peters他 (2000) Biochemistry;39(50): 15592-602
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning - a laboratory manual (2nd Edition). Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY Schardl CL, Byrd AD, Benzion G, Altschuler MA, Hildebrand DF, Hunt AG (1987)
Design And Construction Of A Versatile System For The Expression Of Foreign Genes In Plants. Gene 61: 1-11
Shirai, K., Masuda, K. and Oosawa, K. 2002. Cloning and Sequencing of Ent-kKaurene Synthase CDNA from Cucumber. Acta Hort. (ISHS) 588:317-320
Takahashi S, Zhao Y, O'Maille PE, Greenhagen BT, Noel JP, Coates RM, Chappell J (2005) Kinetic and molecular analysis of 5-epiaristolochene-1,3-dihydroxylase, a cytochrome P450 enzyme catalyzing successvie hydroxylations of sesquiterpenes. Journal of Biological Chemistry 280: 3686-3696
Tarshis LC, Yan MJ, Poulter CD, Sacchettini JC (1994) Crystal-Structure Of Recombinant Farnesyl Diphosphate Synthase At 2.6-Angstrom Resolution. Biochemistry 33: 10871-10877
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１Ａ】ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）及びセスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）をコードする導入遺伝子の双方で形質転換された系統のＧＣ−ＭＳ分析を示す図。
【図１Ｂ】対照タバコ系統のＧＣ−ＭＳ分析を示す図。
【図１Ｃ】クロマトグラムＡ中のピーク１０のＭＳによる分析を示す図。
【図１Ｄ】基準パチュロール（Ｄ）のＭＳによる分析を示す図。
【図２】ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）、セスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）、又は双方を過剰発現する再生産されたトランスジェニック植物系統中のｍＲＮＡ発現レベルを定量的に示す図。
【図３】再生産されたトランスジェニック植物中での免疫学的検出により測定された通りの、トランスジェニック植物中のパチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）及び融合タンパク質ＦＰＳ−ＰＴＳタンパク質のタンパク質発現レベル（ウェスタンブロッティング）を示す図。
【図４】異なる構成体で形質転換された植物の葉中のパチュロール含量を示す図。
【図５】植物のアグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)媒介形質転換に適しているベクター（"ｐＢＤＯＮ"）の体制を示す図。
【図６Ａ】図５のベクターｐＢＤＯＮ中への部位−特異的な組換えにより挿入されるべき、ａｔｔｐ２とａｔｔｐ１配列との間に、１つの遺伝子を含んでなるヘルパーベクター（"ｐＴＭＯＮ"）を示す図。
【図６Ｂ】図５のベクターｐＢＤＯＮ中への部位−特異的な組換えにより挿入されるべき、ａｔｔｐ２とａｔｔｐ１配列との間に、それぞれ、２つの遺伝子を含んでなるヘルパーベクター（"ｐＴＤＵＡＬ"）を示す図。
【図７】異なる植物形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の体制を示す図。
【図８】ｐＢＤＯＮベクター（図５）の構成を略示的に示す図。
【図９】ｐＴＭＯＮヘルパーベクター（図６Ａ）の構成を略示的に示す図。
【図１０−Ｉ】ｐＴＤＵＡＬヘルパーベクター（図６Ｂ）の構成を略示的に示す図。
【図１０−ＩＩ】ｐＴＤＵＡＬヘルパーベクター（図６Ｂ）の構成を略示的に示す図。
【図１１】トランスジェニック植物における過剰発現のための（Ａ）リモネンシンターゼ（ＬＩＳ）及び（Ｂ）リモネンシンターゼ＋ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）発現ベクターの構成を略示的に示す図。
【図１２Ａ】ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ又はＰＴＳ−ＦＰＳ遺伝子融合で最初に遺伝子操作された(engineered)植物と、切断されたＨＭＧＲ（ΔＨＭＧＲ）遺伝子で遺伝子操作された植物との間で実施された遺伝子交雑を説明する図。
【図１２Ｂ】トランスジェニック植物中でのパチュロール蓄積への、ＰＴＳ及びＦＰＳの過剰発現との組合せでの、切断された(truncated)形のＨＭＧＲの過剰発現の寄与を説明する図。
【図１３Ａ】［１−13Ｃ］−グルコース上で成長した実生中でＭＥＰ又はＭＶＡ経路を経て生合成されたパチュロールにおける予測される13Ｃ標識パターンを示す図。
【図１３Ｂ】12Ｃ−グルコースが供給された植物により合成されたパチュロール（上部のパネル）、対、［１−13Ｃ］−グルコースからサイトゾル（真ん中）又は色素体（下部）の生合成に関して遺伝子操作された植物による合成について、ＭＳ親イオンを比較する図。
【図１４】モノテルペン（リモネン）シンターゼ（ＬＩＳ）をコードする導入遺伝子で形質転換された植物、及び更に加えてゲラニル二リン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を有する系統１ｄ及び３ａ中でのリモネン生産を示す図。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、形質転換植物に関する。特に、モノテルペン及び／又はセスキテルペンを蓄積する形質転換植物。前記植物は形質転換されて、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）、及び、場合により、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）をコードする付加的な遺伝子を、過剰発現するか又は含んでなる。本発明はさらに、前記植物を製造する方法、植物中の特定のテルペンの含量を改変する方法、テルペンを生産する方法及び形質転換植物を生産するための前記の遺伝子の使用に関する。
【０００２】
発明の背景及び解決すべき課題
テルペン及びテルペノイドは、たいていの生物中に見出される。それらの常に増大している重要な商業的価値は、異なるテルペンにより包含される生理活性(bioactivities)及び官能性の多岐にわたる範囲に結び付いている。それに応じて、多くのビタミン、ホルモン、昆虫忌避剤、医薬、フレーバー及びフレグランスは、この極めて多くの部類の化合物の中で見出されており、これら全てが、イソプレン単位と呼ばれる５個の炭素の単位から出発して製造される。
【０００３】
テルペンは、それらの構造中に存在しているイソプレン単位の数により分類されることができる：モノテルペン（Ｃ10）、セスキテルペン（Ｃ15）、ジテルペン（Ｃ20）、トリテルペン（Ｃ30）、テトラテルペン（Ｃ40）及びポリテルペン（Ｃn、ｎ≧４５）。植物界は、多数の異なる構造を表すモノテルペン及びセスキテルペンの高い多様性を有する。
【０００４】
高級テルペン、例えばセスキテルペンの化学合成は極めて複雑であり、かつ環境的に受け入れることができるそれらの製造方法はまだ実現されていない。故に、本発明の第一の対象は、特定のテルペンを効率的に製造するか又は蓄積する一方で、多段階の化学合成を回避する方法を提供することである。
【０００５】
テルペンの生合成の経路に関する研究は、全てのテルペンへの共通のＣ5−前駆物質がイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）であることを明らかにした。ＩＰＰ生合成のための２つの別個の経路が植物中に同時に存在する。メバロン酸経路（ＭＶＡ）は、サイトゾル中に小胞体に関連して見出され、かつデオキシキシルロース又はメチル−Ｄ−エリトリトールリン酸経路（ＤＯＸＰ／ＭＥＰ）とも呼ばれる非メバロン酸経路は、高等植物の色素体中に見出される。出発産物、介在される酵素及び触媒反応は双方の経路で異なり、かつ、高等植物の細胞中でこれらは並行して働き、かつ互いに補完する。それに応じて、細胞質中のＭＶＡ経路は、ステロール、セスキテルペン及びポリテルペンの生合成の要因であるのに対し、色素体（ＭＥＰ経路）は、モノテルペン、ジテルペン、例えばカウレン（Ｃ20）、及びポリテルペン、例えばカロテノイド（Ｃ40）及びプラストキノン−９（Ｃ45）の合成のためのＣ5−単位を提供する。
【０００６】
ＩＰＰの合成に続いて、これはプレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）により繰り返して縮合されて、各部類のテルペンのためのテルペン前駆物質である非環状プレニル二リン酸、すなわち、モノテルペンのためのゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）及びセスキテルペンのためのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が形成される。これらの前駆物質はそしてまた、テルペンシンターゼ又はシクラーゼのための基質として利用され、これらは、テルペン、例えばモノテルペン、及びセスキテルペンシンターゼの各部類に特異的である。テルペンシンターゼは、複雑な多段階環化を触媒して、テルペン化合物の炭素骨格の大きな多様性を形成することができる。
【０００７】
特定のテルペンシンターゼを単離することが試みられており、かつ国際公開(WO)第2004/031376号パンフレットには、クベボール、バレンセン及びゲルマクレンシンターゼをコードする遺伝子の単離が報告されている。エシェリキア コリ(E. coli)細胞が、これらの遺伝子を有するプラスミドで形質転換された場合に、相応するフレグランス化合物は、培養基中に見出されることができた。一般的に、テルペンシンターゼの異種発現と関係がある先行技術を鑑みて、一対象は、なおより高い量で特定のテルペンを蓄積する手段及び方法を提供することである。
【０００８】
米国特許(US)第5,589,619号明細書、米国特許(US)第5,365,017号明細書、米国特許(US)第5,349,126号明細書及び米国特許(US)第5,349,126号明細書には、トランスジェニック植物中でのスクアレン及びステロール蓄積を増加させる方法が開示されている。しかしながら、これらの参照文献は、どのようにしてその他の部類のテルペン、例えばモノテルペン及びセスキテルペンの蓄積が増加されることができたかについて言及しない。
【０００９】
トランスジェニック植物の製造は、米国特許(US)第6,841,717号明細書の対象でもあり、前記明細書はＭＥＰ経路に関連した遺伝子に関する。この参照文献は、葉緑体輸送ペプチドに結合され、故にトランスジェニック植物を生産するのに使用されたＨＭＢＰＰシンターゼ（ＧＣＰＥタンパク質）をコードするＤＮＡ分子を教示する。この参照文献はトコフェロール基質の蓄積を扱う一方で、どのようにしてその他のテルペン化合物が有効に蓄積されることができるかを言及しない。
【００１０】
本発明者らは、選択された特定のテルペンを生産するか又は蓄積するという問題に取り組む。好ましくは、予め決定されただけでなく、興味のあるいずれかのテルペンも生産するのに適している方法が提供される。故に、前記対象は、例えば、上記で示されたいずれかのセスキテルペン、例えばクベボール、バレンセン、ゲルマクレン、パチュロールの蓄積を可能にするが、しかし、その他のテルペン、特にモノテルペンを蓄積するのにも適している系を提供することである。この問題はこれまで先行技術により解決されておらず、後者は基本的に、ＭＶＡ又はＭＥＰ経路において変性された性質を有する組換え生物を示唆しており、かつ特定のテルペン最終産物が蓄積されることを観察している。
【００１１】
本発明のさらなる対象は、選択されたいずれかのテルペン、好ましくはセスキテルペンを、立体化学的に純粋な形で及び信頼できかつ費用対効果が大きい生産基盤を伴って、生産する手段を提供することである。
【００１２】
発明の要約
注目に値することに、本発明者らは、テルペンシンターゼ（ＴＳ）及びレギュレーションされていない形のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）を発現するように生物を形質転換するのに成功し、かつＴＳにより合成される高収率のテルペンを得た。意外なことに、ＴＳをコードする異種の遺伝子単独で形質転換された植物中で、テルペン蓄積は、検出可能であったが、しかし僅かであり、かつＴＳタンパク質発現レベルと相互に関係していなかった。本発明の重要な利点は、所望のいずれかのテルペンが、選択されたテルペンのシンターゼをコードするヌクレオチド配列が知られているか又は定型的に単離されることができる場合に、いずれかの植物中で蓄積されることができることである。これは、好ましくは植物のサイトゾルへ、ＨＭＧＲ及びテルペンを合成することのできる酵素、すなわちＴＳである少なくとも２つの遺伝子産物をターゲティングすることにより可能である。
【００１３】
それに応じて、本発明は、第一の態様において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）をコードする導入遺伝子を発現する植物を提供する。
【００１４】
第二の態様において、本発明は、付加的な遺伝子を含んでなるように形質転換された植物を提供し、前記遺伝子は少なくともＨＭＧＲ及びＴＳをコードする。
【００１５】
第三の態様において、本発明は、少なくとも１つのＰＲＴ及び／又は少なくとも１つのＴＳをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを提供する。
【００１６】
第四の態様において、本発明は、形質転換植物を製造する方法を提供し、前記方法は、付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、前記の付加的な遺伝子はＨＭＧＲ及びＴＳをコードし、及び前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる。
【００１７】
第五の態様において、本発明は、本請求の範囲及び明細書に詳細に説明される通り、形質転換植物を製造するさらなる方法を提供する。
【００１８】
さらなる一態様において、本発明は、植物中のテルペンの含量を改変する方法を提供し、前記方法は植物を形質転換する方法の段階を含んでなる。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、テルペンを生産する方法を提供し、前記方法は、本発明の植物又は形質転換植物を製造する方法により得ることができる植物からテルペンを単離する段階を含んでなる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、改変されたテルペン含量を有する植物を生産するための、ＨＭＧＲ及びＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子の使用を提供する。
【００２１】
図面の簡単な説明
図中で、
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、部分Ａ及びＢ中で、対照タバコ系統（部分Ｂ）、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）及びセスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）をコードする導入遺伝子の双方で形質転換されたもの、部分Ａ、のＧＣ−ＭＳ分析を示す。クロマトグラムＡ中のピーク１０は、部分Ｃ中でＭＳにより分析され、かつ基準パチュロール（Ｄ）との比較によりパチュロールと同定されることができた。ピーク３を内標準（３−α−セドレン）として使用した。
【００２２】
図２は、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）、セスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）、又は双方を過剰発現する再生産されたトランスジェニック植物系統中のｍＲＮＡ発現レベルを定量的に示す。
【００２３】
図３は、再生産されたトランスジェニック植物中での免疫学的検出により測定された通りの、トランスジェニック植物中のパチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）及び融合タンパク質ＦＰＳ−ＰＴＳタンパク質のタンパク質発現レベル（ウェスタンブロッティング）を示す。
【００２４】
図４は、異なる構成体で形質転換された植物の葉中のパチュロール含量を示す。比較は、高収率のパチュロール（新鮮な葉ＦＷ ＞５００ng/g）が、トランスジェニックＨＭＧＲ及びＰＴＳの双方を発現する植物（８ＰＴＳ）中で蓄積されたことを明らかにする。トランスジェニックＰＴＳのみを発現する植物（２ＰＴＳ）は典型的に、パチュロール５００ng/g未満を蓄積する。
【００２５】
図５は、植物のアグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)媒介形質転換に適しているベクター（"ｐＢＤＯＮ"）の体制を示しており、この中で、ａｔｔｐ２配列とａｔｔｐ１配列（ｃｍ ｃｃｄＢ）との間の領域は、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び場合によりＰＲＴを保有する(harbour)ために試験管内で及び部位−特異的に再結合されることができる。前記ベクターは、実施例においてさらに詳細に論じられる通り、植物の形質転換のための境界配列領域、プロモーター、ターミネーター及びａｔｔｐ１／２組換え配列を含んでなる。
【００２６】
図６Ａ及び図６Ｂは、図５のベクターｐＢＤＯＮ中への部位−特異的な組換えにより挿入されるべき、ａｔｔｐ２とａｔｔｐ１配列との間に、それぞれ、１つ又は２つの遺伝子を含んでなるヘルパーベクター（"ｐＴＭＯＮ"及び"ｐＴＤＵＡＬ"）を示す。図６Ａは、ｐＢＤＯＮベクター中へ一回で１つの遺伝子を挿入するのに適しているヘルパーベクターを示すのに対し、図６Ｂは、ｐＢＤＯＮ中へ一回で２つの遺伝子を挿入するのに適しているヘルパーベクターを示す。前記ベクターは、実施例においてさらに詳細に論じられる通り、プロモーター、ターミネーター、ａｔｔＢ１／２組換え及びプレースホルダー配列"遺伝子１"及び"遺伝子２"を含んでなる。
【００２７】
図７は、異なる植物形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の体制を示す。ＨＰＴ領域は、ハイグロマイシン耐性を提供し、ＰＴＳは、セスキテルペン（パチュロール）シンターゼをコードし、ＬＩＳは、モノテルペン（リモネン）シンターゼをコードし、ＦＰＳ及びＧＰＳは、プレニルトランスフェラーゼ（それぞれファルネシル二リン酸シンターゼ及びゲラニル二リン酸シンターゼ）をコードする。前記ベクターはさらに、適したプロモーター及びターミネーター配列を含んでなる。
【００２８】
図８は、ｐＢＤＯＮベクター（図５）の構成を略示的に示す。
【００２９】
図９は、ｐＴＭＯＮヘルパーベクター（図６Ａ）の構成を略示的に示す。
【００３０】
図１０部分Ｉ及び図１０部分ＩＩは、ｐＴＤＵＡＬヘルパーベクター（図６Ｂ）の構成を略示的に示す。
【００３１】
図１１は、トランスジェニック植物における過剰発現のための（Ａ）リモネンシンターゼ（ＬＩＳ）及び（Ｂ）リモネンシンターゼ＋ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）発現ベクターの構成を略示的に示す。
【００３２】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、トランスジェニック植物中でのパチュロール蓄積への、ＰＴＳ及びＦＰＳの過剰発現との組合せでの、切断された(truncated)形のＨＭＧＲの過剰発現の寄与を説明する。部分Ａは、ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ又はＰＴＳ−ＦＰＳ遺伝子融合で最初に遺伝子操作された(engineered)植物と、切断されたＨＭＧＲ（ΔＨＭＧＲ）遺伝子で遺伝子操作された植物との間で実施された遺伝子交雑を説明する。部分Ｂは、生じた後代植物のパチュロール蓄積についての評価の結果を示す。親系統（白色で示されている）中のパチュロールレベル（μg/g新鮮な質量）は、相応する後代系統（相反交雑−黒色及び灰色）に対して示されており、グラフの上部の数は、ＨＭＧＲ遺伝子の添加によるパチュロール蓄積における平均した倍量の改善を示す。ΔＨＭＧＲ親系統（Ｐ２）は、少しもパチュロールを蓄積しなかった。
【００３３】
図１３Ａは、［１−13Ｃ］−グルコース上で成長した実生中でＭＥＰ又はＭＶＡ経路を経て生合成されたパチュロールにおける予測される13Ｃ標識パターンを示す。
【００３４】
図１３Ｂは、12Ｃ−グルコースが供給された植物により合成されたパチュロール（上部のパネル）、対、［１−13Ｃ］−グルコースからサイトゾル（真ん中）又は色素体（下部）の生合成に関して遺伝子操作された植物による合成について、ＭＳ親イオンを比較する。
【００３５】
図１４は、モノテルペン（リモネン）シンターゼ（ＬＩＳ）をコードする導入遺伝子で形質転換された植物、及び更に加えてゲラニル二リン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を有する系統１ｄ及び３ａ中でのリモネン生産を示す。
【００３６】
配列表は、本発明の形質転換植物の製造において使用されるヌクレオチド配列を示す。配列番号１は、パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）をコードする配列を示す。この配列の、例えばＨｉｓタグをコードするヌクレオチド配列と融合された、変異体も使用された。配列番号２は、鳥類のファルネシル二リン酸（ＦＰＳ）をコードするヌクレオチド配列である。配列番号３は、９ｂｐリンカー配列（ｂｐ１１３５−１１４３）を含む、ＰＴＳ（ｂｐ１１４４−２８０２）と融合された鳥類のＦＰＳ（ｂｐ１−１１３４）、（ＦＰＳ−ＰＴＳ）のヌクレオチド配列を示す。配列番号４は、色素体ターゲティング信号が除去されている、柑橘類由来のリモネンシンターゼ（ＬＩＳ）をコードするヌクレオチド配列である。配列番号５は、色素体ターゲティング信号が除去されている、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）をコードするヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号６〜４８は、本発明のために使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号４９〜５７は、ポリクローナル抗体、すなわちそれぞれ、ＰＴＳ（５０〜５４）及びＦＰＳ（５５〜４８）のための抗体を製造するのに使用されるペプチド配列である。
【００３９】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）をコードする導入遺伝子を発現する植物を提供する。
【００４０】
この植物は、いずれの植物であってよく、好ましくは、本発明により形質転換されるのに適している植物である。好ましくは、前記植物は、本来、高い量のテルペンを生産する植物である。例えば、前記植物は、ナス科(Solanaceae)、イネ科(Poaceae)又はシソ科(Lamiaceae)のファミリーから選択される。例えば、前記植物は、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、モロコシ属(Sorghum)、アラビドプシス(Arabidopsis)、ウマゴヤシ属(Medicago)（アルファルファ）、ワタ(Gossypium)（木綿）、アブラナ属(Brassica)（セイヨウアブラナ）の属から選択される。好ましくは、前記植物は、タバコ(Nicotiana tabacum)の種に属する。
【００４１】
"発現する"、"発現"等、例えば"遺伝子を発現する"という用語は、遺伝子がｍＲＮＡに転写され、かつ発現された遺伝子によりコードされるタンパク質が植物中に見出される事実を呼ぶ。"発現する"という用語はまた、"過剰発現"を包含し、後者は、非トランスジェニック植物中で測定される以上のｍＲＮＡ、タンパク質及び／又は酵素活性のレベルを呼ぶ。
【００４２】
"導入遺伝子"という用語は、外来生物、一般的に導入遺伝子を含んでなる植物以外の種類又は種から単離される遺伝子を含んでなるヌクレオチド配列を呼ぶ。
【００４３】
"導入遺伝子"という言葉中に存在するような、"遺伝子"という用語は、例えば、本発明の植物によって、示された活性を有するタンパク質、例えばテルペンシンターゼに翻訳されることができるヌクレオチド配列を呼ぶ。本発明のためには、"遺伝子"という用語は、植物中で発現される最終的なタンパク質構成体が、上述の活性を示す限りは、非コード領域も含みうる。
【００４４】
それに応じて、酵素、例えばＨＭＧＲをコードする遺伝子は、例えば導入遺伝子を含めて、少なくとも１つのポリペプチドの製造のための情報を含んでなるヌクレオチド配列を呼ぶ。
【００４５】
本発明はさらに、付加的な遺伝子を含んでなるように形質転換された植物を提供し、前記遺伝子は少なくともＨＭＧＲ及びＴＳをコードする。
【００４６】
"形質転換された"、例えば形質転換植物という用語は、植物が遺伝子操作にかけられている事実を呼ぶ。"形質転換植物"は、形質転換されている個々の植物の無性（栄養性）及び有性で誘導された後代を含む。例えば、非形質転換植物で個々に形質転換されている植物を交雑することにより得られた植物は、後代が、本発明により必要とされる通りの付加的な遺伝子及び／又は導入遺伝子を含有する場合に、本発明により包含される。
【００４７】
本明細書の範囲内で"含んでなる(comprises)"という言葉は、"とりわけ、含む"ことを意味するとみなされる。"から専らなる"と解釈されることを意図するものではない。
【００４８】
"付加的な遺伝子"を含んでなるように形質転換された植物という用語は、遺伝子操作前にこの位置に存在しなかった、植物の全ゲノムのいずれかの位置（核、ミトコンドリア及び色素体）中へ挿入された新しい又は外来ＤＮＡ（例えば、遺伝子）を、遺伝子操作のために含んでなる植物を呼ぶ。
【００４９】
本発明の植物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする遺伝子を含んでなる。ＨＭＧＲは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａをメバロン酸に還元的脱アシル化するのを触媒することのできる酵素である。ＨＭＧＲという用語は、ＨＭＧＲの全ての部類、特に部類Ｉ及びＩＩを包含する。ＨＭＲＧという用語は、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．３４を有する酵素を包含する。ＨＭＧＲ類は、全ての真核生物中並びに多くの細菌中に存在する。
【００５０】
本発明は、特定のＨＭＧＲをコードする特定のヌクレオチド配列に限定されるものではなく、しばしばそれとは反対に、いずれかのＨＭＧＲが、本発明のために選択されることができる。故に、当業者は、文献からか又は公的データベースからＨＭＧＲをコードするいずれかの生物から単離されるいずれかの遺伝子を選択することができる。それに加えて、当業者は、ＨＭＧＲ類をコードする新規遺伝子を、例えば、いずれかの生物から、定型的に単離することができる。多様な生物由来のＨＭＧＲ類をコードする６０を上回るヌクレオチド配列が、既に単離されており、かつ当業者に容易に入手可能であることを考慮すれば、特定のＨＭＧＲ類の一覧は本明細書で提供される必要はない。
【００５１】
好ましくは、ＨＭＧＲ遺伝子は、本発明の植物とは異種である。より好ましくは、非植物ＨＭＧＲであり、例えば動物から単離されるＨＭＧＲ遺伝子が使用される。
【００５２】
好ましくは、前記遺伝子は、可溶性の及び膜結合されていないＨＭＧＲをコードする。これは、ヌクレオチド配列によりコードされる膜−結合領域を切断し、かつ膜結合領域を欠いているＨＭＧＲをコードするヌクレオチド配列を使用することにより達成されることができる。選択的に、膜ドメインを欠くＨＭＧＲをコードする遺伝子は、大形リーシュマニア(Leishmania major)から単離されており、かつ本発明のために使用されることもできる。
【００５３】
好ましくは、ＨＭＧＲをコードする遺伝子は、強い、レギュレーションされていない構成性プロモーターの指示の下にある。
【００５４】
ＨＭＧＲをコードする及び／又はＨＭＧＲを過剰発現する付加的な遺伝子を含んでなるタバコ植物は、例えば、米国特許(US)第5,306,862号明細書、米国特許(US)第5,349,126号明細書、米国特許(US)第5365,017号明細書、米国特許(US)第5,589,619号明細書に開示されており、これらの全てが、参照により本明細書に明示的に取り込まれる。これらの植物は、本発明のために使用されることができ、かつＴＳをコードする少なくとも導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子のコピーを含んでなるように形質転換されることができる。
【００５５】
本発明の植物は、ＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる。ＴＳ類は、与えられた前駆物質化合物からのテルペンの形成を触媒する酵素である。好ましい一実施態様によれば、ＴＳは、モノテルペンシンターゼ及び／又はセスキテルペンシンターゼである。モノテルペンシンターゼは、前駆物質としてのゲラニル二リン酸を用いてモノテルペン（Ｃ10−化合物）の形成を触媒する酵素である。セスキテルペンシンターゼは、ファルネシル二リン酸からのセスキテルペン（Ｃ15）の形成を触媒することのできる酵素である。
【００５６】
故に、常にメバロン酸を産生するＨＭＧＲ類とは対照的に、本発明のＴＳは、異なる反応生成物を有する異なる酵素から選択されることができる。それに応じて、ＴＳという用語は、全体で多数の異なるテルペン化合物を合成することのできる多くの異なるＴＳ類を呼ぶ。
【００５７】
故に、本発明の重要な利点は、所望のいずれかのＴＳを選択するという大きな選択権である。当業者が生産したいか又は本発明の植物中に蓄積させたいテルペンに応じて、それぞれのテルペンを合成することのできるヌクレオチド配列が自由に選択されることができる。このようにして、本発明は、興味のあるいずれかのテルペンの生産のための費用効率的な基盤を提供する。
【００５８】
本発明の原理を説明するために、遺伝情報が入手可能である幾つかのＴＳは、例として提供される：モノテルペンシンターゼの例は、リモネンシンターゼ（ＬＳ）（Ohara他, 2003）及びＳ−リナロールシンターゼ（ＬＩＳ）である。（Lucker他, 2001）。
【００５９】
好ましい一実施態様によれば、前記ＴＳは、セスキテルペンシンターゼである。多数のセスキテルペンがこれまで記載されていることを考慮すれば、相応する数のセスキテルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼをコードする遺伝子が選択されることができるプールとして利用されることができる。それに応じて、セスキテルペンシンターゼをコードする遺伝子は、公的に利用できるデータベースからか、文献からか、又は当業者が定型的な実験及び十分知られた単離手順によって生物から容易に単離することができるこれまで未発見の遺伝子から、選択されることができる。例えば、ＴＳは、β−カリオフィレン、α−フムレン、ゲルマクレンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、バレンセン、アリストロケン、ベチスピラジエン、パチュロール、クベボール、γ−クルクメン、（−）−ゲルマクレンＤ、（＋）−ゲルマクレンＤ、ビシクロ−ゲルマクレン及び／又はδ−カジネンシンターゼを合成することができる。上記セスキテルペンを合成することのできる一部のＴＳ類の遺伝子は、国際出願PCT/IB/2004/003836号及び国際公開(WO)第2004/031376号パンフレットに開示されている。
【００６０】
例えば、ＴＳにより合成されることができるテルペンは、フレグランス、フレーバー、医薬、殺虫剤、殺真菌剤及び／又は除草剤である。好ましくは、フレグランスである。
【００６１】
"テルペン"は、環状又は非環状であってよい、イソプレン単位（Ｃ5Ｈ8）をベースとするか又はこれから構成された炭化水素である。本発明のためには、"テルペン"、"モノテルペン"、"ジテルペン"及び／又は"セスキテルペン"という用語は、テルペン誘導体、例えばテルペノイドも含み、これらは、例えば、ヒドロキシル化、異性化、酸化還元反応、ジメチル化又はアシル化のような官能化の１つ又はそれ以上の段階を経験した炭化水素を含む。
【００６２】
ＨＭＧＲ及びＴＳをコードする遺伝子は、例えば、ＴＳ及びＨＭＧＲ活性の双方を有する融合タンパク質をコードする１つの単一遺伝子の形で存在していてよい。
【００６３】
好ましい一実施態様によれば、本発明の植物はさらに、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）をコードする導入遺伝子を発現するか、又はＰＲＴをコードする付加的な遺伝子を含んでなるように形質転換される。
【００６４】
ポリプレニル二リン酸シンターゼ又はポリプレニルピロリン酸シンターゼとも呼ばれるプレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及び１つ又はそれ以上のＩＰＰ残基、例えばファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又は他のものを含むアルキル化段階を触媒する酵素である。ＰＲＴという用語はまた、多様なテルペノイドファミリーのためのポリプレニル二リン酸前駆物質をもたらす一反応又は一連の反応を触媒することのできる１つ又は幾つかの別個の酵素を含む。故に、ＰＲＴをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、本発明のためには、単量体、二量体、三量体、四量体及び低重合体のタンパク質のホモ混合物及びヘテロ混合物を含んでなる四次構造を有するポリペプチドをコードする配列を包含する。特に、ＰＲＴは、単量体、ヘテロ二量体及び／又はホモ二量体であってよい。ペパーミント(Mentha piperita)の油胞由来のゲラニル二リン酸シンターゼは、本発明により包含されるある特定のＰＲＴ類の複雑な遺伝子体制のための例として利用されることができる、それというのも、この酵素は精製されており、かつヘテロ二量体であることが判明しており、その際に双方のサブユニットは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆物質からＧＰＰを生産するのに必要とされる。
【００６５】
好ましくは、ＰＲＴ類は、例えば、ＥＣ番号ＥＣ２．５．１の下に分類される酵素を包含する。
【００６６】
好ましい一実施態様において、ＰＲＴをコードする少なくとも１つの遺伝子は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）シンターゼ及び／又はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）である。ＧＰＰ及びＦＰＰは、それぞれ、モノテルペン及びセスキテルペンのための前駆物質である。
【００６７】
ジメチル−アリル−トランストランスフェラーゼとも呼ばれるゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）は、ＰＲＴ類の例である。
【００６８】
好ましい一実施態様によれば、ＰＲＴはファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）である。ＦＰＳ類は、例えば、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）とＩＰＰとの縮合によりファルネシル二リン酸に変換するのを触媒する酵素である。好ましくは、ＦＰＳは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を、アリル性二リン酸、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）と、ついで生じたゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）と順次縮合させて最終生成物ファルネシル二リン酸に変換するのを触媒することができる。
【００６９】
好ましくは、遺伝子ＰＲＴは、本発明の植物中の選択されたＴＳのための前駆物質を提供するように選択される。例えば、植物が、セスキテルペンシンターゼをコードする付加的な遺伝子を含んでなる場合には、これはさらに、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする付加的な遺伝子を含んでなる。
【００７０】
ＨＭＧＲ類及びＴＳ類をコードする遺伝子に類似して、ＰＲＴ類をコードする遺伝子は、公的に入手可能であり、かつ多様な起源から当業者により選択されることができる。ＨＭＧＲ類、ＰＲＴ類及び／又はＴＳをコードするヌクレオチド配列を得るために適している公的に入手可能なデータベースは、例えば、European Bioinformatics Instituteのデータベース、（http://www.ebi.ac.uk/swissprot/index.html）、ＥＸＰＡＳＹデータベース（http://www.expasy.org/enzyme/）、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）及び多数のその他のものである。本発明のために使用されることができる、当業者に入手可能なＦＰＳ類の多数の可能性を説明する単なる目的のために、イプス ピニ(Ips pini)から単離されたゲラニル二リン酸シンターゼ（NCBI受入れ番号(AN): AY 953508.1）、ビブリオ フィシェリ(Vibrio fischeri)から単離されたファルネシル二リン酸シンターゼ（NCBI AN: YP 203660）、及びTarshis他(1994)により報告された鳥類のファルネシル二リン酸シンターゼが引用されることができる。もちろん、その他のいずれかのＰＲＴが、いずれかのデータベース又は起源から選択されることができる。
【００７１】
好ましい実施態様によれば、付加的な遺伝子及び／又は遺伝子の産物は、植物の細胞のサイトゾルに向けられている。遺伝子産物は、多様な手段によって植物のサイトゾルに向けられていてよい。例えば、植物は、核染色体中の遺伝子のコピーを含んでなるように形質転換されることができ、その際に前記遺伝子は、いずれの色素体ターゲティング配列、及び／又はその他のいずれの細胞小器官ターゲティング情報を含まない。これは、例えば、しばしば色素体−ターゲティング配列を含んでなる知られたモノテルペンシンターゼの多くについては関連性があり、その際に活性のそれらの原理部位は色素体である。この場合に、色素体ターゲティング配列は、ＴＳ及び／又はＰＲＴをコードする付加的な遺伝子及び／又は導入遺伝子から、植物をそれで形質転換する前に、除去されるべきである。それに応じて、好ましい一実施態様において、前記の遺伝子及び／又は導入遺伝子は、植物の核中で発現される。好ましくは、それらは植物染色体の一部である。
【００７２】
好ましくは、本発明の植物中に存在する付加的な遺伝子及び／又は導入遺伝子によりコードされる遺伝子産物（ＴＳ、ＨＭＧＲ、場合によりＰＴＲ）は、活性である。好ましくは、それらは、生体内で及び／又は試験管内で活性である。標準アッセイは、形質転換植物中の酵素の活性を決定するのに使用されることができる。形質転換植物中のＨＭＧＲ活性を定量的に評価するためのアッセイは、米国特許（ＵＳ）第5,349,126号明細書、例２に開示されており、その際にChappell他, Plant Physiol., 85:469-473 (1987)の方法が参照される。国際公開(WO)第04/031376号パンフレット、例４には、セスキテルペンシンターゼのための酵素機能アッセイが開示されている。上記参照文献に開示された双方のアッセイは、参照により本明細書に取り込まれる。ＰＲＴ活性を評価するためのアッセイは、文献にも見出されることができる。
【００７３】
好ましい一実施態様において、本発明の植物は、自然のままの非形質転換植物に比較した場合に、導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子によりコードされるＴＳにより合成されることができるテルペンの少なくとも１．２倍を蓄積する。好ましくは、形質転換植物は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、より好ましくは少なくとも４倍及び最も好ましくは少なくとも６倍だけ特定のテルペンを蓄積する。
【００７４】
本発明の別の実施態様によれば、形質転換植物は、導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子によりコードされたＴＳにより合成されることができるテルペンを、新鮮な葉１gあたり少なくとも４００ng蓄積する。好ましくは、形質転換植物は、形質転換植物中に存在する組換えＴＳにより合成されることができる特定のテルペン少なくとも５００ng、より好ましくは少なくとも８００ng、一層より好ましくは少なくとも１０００ng、さらにより好ましくは少なくとも２０００ng、一層より好ましくは少なくとも５０００ng、さらにより好ましくは７０００ng及びなおさらにより好ましくは少なくとも８μgを蓄積する。最も好ましくは、形質転換植物は、新鮮な葉１gあたり、特定のテルペンを少なくとも１００００ng又はそれ以上ですら蓄積する。例えば、形質転換植物は、新鮮な葉１gあたりテルペン２〜１６μg、好ましくは４〜１２μgを蓄積する。特定のテルペンの量は、乾物の質量で表現されることもできる。この場合に、乾物の植物材料及び特に葉は、新鮮な質量についての値の約１０％に相応する。それに応じて、乾燥した葉１gあたりテルペン少なくとも４、５、８、１０、２０、５０、７０又は１００μgが蓄積される。
【００７５】
自然のままの非形質転換植物が既に、ＴＳにより合成されることができる特定のテルペンを生産する場合に、形質転換植物に妥当な値は、非形質転換植物中に本来存在する特定のテルペンの量に付け加えられる。
【００７６】
本発明の植物中の特定のテルペンの含量の決定のために、テルペンを生産するか又は蓄積するいずれかの植物器官が参照として採取されることができる。好ましくは、同じ齢を有する緑色の葉（好ましくは成熟した葉）は、それぞれ、形質転換植物及び非形質転換植物から比較のために採取される。分析は、好ましくは、実施例に概説されたプロトコル"テルペン分析"に従って実施される。好ましくは、新鮮な葉は、植物から切り取った直後に分析される。葉は収穫後に冷凍されてよく、かつ冷凍した状態で分析されてよい。
【００７７】
好ましい一実施態様によれば、本発明による形質転換植物は、試料呼称"８ｈｓＰＴＳ−１０"及びＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０６でＡＴＣＣに寄託された形質転換されたタバコ(Nicotiana tabacum cv Xanthi)である。
【００７８】
好ましくは、形質転換植物は、選択された野生型遺伝子中にノックアウト、ダウンレギュレーション、欠失又はその他の形の有害突然変異を含んでなっていてよく、これらは炭素フラックスを、従来のテルペンから本発明のＴＳの経路へ逸脱するのに適しているテルペン生合成の経路に関与する。好ましくは、これらの従来の、その他のテルペン経路は、ダウンレギュレーションされる。例えば、本発明の植物は、ステロール、ポリプレノイド、フィトール及びカロテノイドの合成をもたらすＦＰＰ、ＧＰＰ及び／又はＧＧＰＰシンターゼをコードする遺伝子の下流に、１つ又はそれ以上の非官能性又は減少された官能性の遺伝子を有していてよい。このようにして、炭素フラックスは、特定のテルペンの合成の方へより効率的に向けられることができる。
【００７９】
本発明は、少なくとも１つのＰＲＴ及び／又は少なくとも１つのＴＳをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターはさらに、ＨＭＧＲをコードする遺伝子を含んでなるヌクレオチド配列を含んでなる。好ましくは、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴからなる群から選択される１つ、２つ又は全てをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターは、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴに結合された色素体ターゲティング配列を含まない。
【００８０】
好ましくは、前記ベクターはさらに、色素体ターゲティング配列及びそれぞれ、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴのための遺伝子を含むヌクレオチド配列の好ましくは上流及び下流に、プロモーター及びターミネーター配列を含んでなる。好ましくは、前記ベクターは、強い構成性プロモーターを含んでなる。プロモーターの商業的に入手可能な例は、ＦＭＶ、ゴマノハグサモザイクウイルス、ＡＣＴ２、アクチン、ＭＡＳ、マンノピンシンターゼ及びＮＯＳプロモーターである。好ましくは、前記プロモーターは、形質転換されていない宿主植物の対照及び／又はフィードバックレギュレーション機構から独立して選択される。好ましくは、組換えＨＭＧＲ及びＴＳは、上流のプロモーター配列を有する。より好ましくは、それらは各々異なるプロモーター配列を有する。
【００８１】
場合により、前記ベクターは、抗体結合に適しているタグ、例えばＨｉｓ−タグ及び／又はｍｙｃタグをさらに含んでなることができる。
【００８２】
好ましくは、本発明のベクターはさらに、形質転換植物を選択するのに適しているマーカーを含んでなる。例えば、前記ベクターは、ハイグロマイシン又はカナマイシン耐性を付与する遺伝子、又は首尾良く形質転換植物を選択するのに適しているその他のいずれかの種類のマーカーを含んでなっていてよい。
【００８３】
好ましくは、本発明のベクターはさらに、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び場合によりＰＲＴに隣接し、任意のプロモーター、ターミネーター及び／又はタギング配列を含む、左側及び右側のＴ−ＤＮＡ境界配列領域、並びに構造遺伝子を植物核ゲノム中へ移転する及び組み込むのを促進するための植物耐性マーカーを含んでなる。
【００８４】
それに応じて、本発明のベクターは好ましくは、ＨＭＧＲ、ＰＲＴ及び／又はＴＳをコードする構造遺伝子、及び植物ゲノム中への挿入を促進する左側及び右側の境界配列領域により挟まれた、形質転換植物の選択のためのマーカーを含んでなる。
【００８５】
好ましくは、前記ベクターはさらに、左側及び右側境界配列領域の外側に、ベクターを含んでなる細菌をクローニングするために使用されるか又は植物の形質転換のために使用されるポジティブ細菌形質転換体（アグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)）を選択するためのマーカーを含んでなる。
【００８６】
好ましい実施態様において、本発明のベクターは、試料参照"ｐＢｈｓＰＴＳ"及びＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６７０７でＡＴＣＣに寄託されたプラスミドである。
【００８７】
一態様において、本発明は、形質転換植物を製造する方法に関するものであり、前記方法は、付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、前記の付加的な遺伝子はＨＭＧＲ及びＴＳをコードし、及び前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる。
【００８８】
植物材料を形質転換する段階のために、植物を本発明の遺伝子で形質転換するいずれかの方法が使用されることができる。例えば、保護細胞壁をはがした植物細胞は、ある特定の膜−作用物質で又は電気穿孔法で処理された場合に、純粋なＤＮＡを吸収する。ＤＮＡは、極めて薄いガラス針を用いてターゲット植物細胞中へマイクロインジェクションされることができる。植物形質転換の最近開発された方法である、バイオリスティック(biolistics)は、静電パルス、空気圧又は黒色火薬衝撃を用いて、ＤＮＡでコーティングされたタングステン又は金の極めて小さい粒子を細胞中へ加速することを含む。
【００８９】
本発明者らは、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換で良好な結果を得た。好ましくは、植物核染色体ＤＮＡ中への構造遺伝子の組み込みを可能にするヌクレオチド配列により挟まれた、本発明の構造遺伝子の少なくとも１つを含んでなるプラスミド構成体（ベクター）、例えば上記で開示されたものが使用される。
【００９０】
それに応じて、本発明の植物、方法又は使用の一実施態様において、ＨＭＧＲ、ＴＳ及び存在する場合にはＰＲＴをコードする遺伝子は、好ましくは色素体ターゲティング配列を欠いている、核遺伝子である。これらの遺伝子は好ましくは、本発明の植物の核染色体中に存在する。
【００９１】
例えばＨＭＧＲ、ＴＳ及び／又はＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ構成体での植物材料の形質転換は、標準法により実施されることができ、Schardl他, Gene (1987) 6: 61:1-11; Berger他, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:8402-8406;及びHorsch他, Science (1985) 27:1229-1231参照、後者の方法は、タバコ(Nicotiana tabacum)を形質転換するのに特に適している"葉片法"を記載する。
【００９２】
本発明の方法はさらに、形質転換植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる。形質転換植物材料から植物全体を再生産する方法は、当業者により定型的に適用される。例えば、Horsch他(1985)により開示された方法が使用されることができる。一般的に、アグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)を有する挿入ＤＮＡにより接種された葉のセグメントは、カルス及び再生産される植物シュートが明らかになるまで、選択培地中で成長されてよい。サイズが１〜３cmのシュートは、根発生を刺激するために抗生物質を含有するＴ−培地（Schardl, 1987）に移されてよい。一度根系が定着されれば、小さな植物は、商業的に入手可能な鉢植え用土に移されてよく、かつ温室中で繁殖させてよい。それに応じて、好ましい一実施態様において、形質転換植物を製造する方法はさらに、形質転換植物を培養する段階を含んでなる。
【００９３】
一態様において、本発明は、形質転換植物を製造するさらなる方法を提供し、前記方法は、ＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体で一番目の植物材料を形質転換する段階、ＨＭＧＲをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる少なくとも１つのＤＮＡ構成体で二番目の植物材料を形質転換する段階、それぞれ、一番目及び二番目の形質転換植物材料から一番目及び二番目の植物を再生産する段階、一番目及び二番目の植物を交雑する段階及び、交雑により得られた後代から、ＴＳをコードする遺伝子及びＨＭＧＲをコードする遺伝子の双方を含んでなる植物について選択する段階を含んでなる。
【００９４】
好ましい一実施態様において、ＴＳをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体が、又はＨＭＧＲをコードする遺伝子を含んでなる遺伝子構成体が、さらにＰＲＴを含んでなる。
【００９５】
上記の方法は、本発明の形質転換植物を得る選択的な方法であり、前記方法において、異なる植物材料が、ＨＭＧＲ又はＴＳをコードする構造遺伝子で別個に形質転換され、かつ少なくとも２つの組換え遺伝子の１つのみを含んでなる形質転換植物が再生産される。
【００９６】
次の段階において、有性で誘導された後代は、組換え型の、異種の及び／又はトランスジェニックのＨＭＧＲ ＤＮＡを有する植物を、組換え型の、異種の及び／又はトランスジェニックのＴＳ ＤＮＡを含んでなる植物と交雑することから得られる。好ましくは、交雑は、メンデル交雑とも呼ばれる遺伝交雑を呼ぶ。これは典型的に、他家受粉により行われることができる。後代の中では、組換えＰＲＴ並びにＴＳの双方を発現する個体が選択される。例えば、既にＨＭＧＲを過剰発現する植物、例えば米国特許(US)第5306862号明細書、米国特許(US)第5349126号明細書、米国特許(US)第5365017号明細書及び米国特許(US)第5589619号明細書に開示されたものは、例えば、ＴＳをコードする導入遺伝子を含んでなるように形質転換された植物と交雑されてよい。同じ方法で（メンデル交雑）、ＰＲＴをコードする導入遺伝子が導入されることができる。
【００９７】
それに応じて、一実施態様において、前記方法はさらに、一番目及び／又は二番目の再生産された植物、又は一番目及び二番目の再生産された植物を交雑することから得られた植物を、ＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなるように形質転換された植物と交雑する段階を提供する。
【００９８】
選択的に、ＰＲＴをコードする付加的な導入遺伝子は、既にＨＭＧＲを過剰発現する及び／又は付加的な遺伝子を含んでなる及び／又はＴＳをコードする導入遺伝子を、ＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体と共に発現する植物を形質転換することにより、導入されることができる。
【００９９】
形質転換植物を製造する本発明の方法は、形質転換植物中の所望のテルペンの蓄積を得るという目的を有する。故に、形質転換植物は、好ましくは、植物中に高い量のテルペンを蓄積する形質転換体に関してスクリーニングされる。故に、形質転換植物を製造する方法の段階は、植物中のテルペンの含量を改変する方法として同様に適しており、その後者の方法は、本発明のさらに好ましい実施態様を表す。類似して、上記で開示された方法及び植物はまた、本発明の一態様を説明し、これは、改変されたテルペン含量、及び好ましくは増加された含量の特定のテルペンを有する植物を製造するための、ＨＭＧＲ及び／又はＴＳをコードする遺伝子、及び、場合によりＰＲＴをコードするさらに少なくとも１つの遺伝子の使用である。
【０１００】
本発明はさらに、テルペンを生産する方法に関するものであり、前記方法は、本発明の植物からか、又は形質転換植物を製造する方法により得ることができる植物から、テルペンを単離する段階を含んでなる。形質転換植物は、好ましくは十分に高い収率で及び／又は十分に大きな規模で培養及び収穫されることができ、本方法を経済的に好都合にすることができる。本発明の特定のテルペンは、有機溶剤抽出又は蒸留を含めた当工業界において使用されるいずれかの方法により単離されることができ、かつガスクロマトグラフィー（ＧＣ）−質量分析法（ＭＳ）により定量化及び／又は同定されることができる。
【０１０１】
実施例
次の例は、本発明を説明するためのものであり、結果として範囲を限定するものではない。実施例の方法及びプロトコルは、特定の材料又はキットの製造者により供給される標準プロトコルに従って、又はSambrook他(1989)及びAusubel他(1987)により定義された次の十分確立されたプロトコルにより一般的に実施される。
【０１０２】
使用された全てのプライマーは、添付された配列表に一覧にされている。一部の方法又はプロトコル段階のために文献が参照され、この文献は以下により詳細にさらに一覧にされており、かつ参照により本明細書に明示的に取り込まれる。
【０１０３】
例１：植物材料の選択
以下１４−８と呼ぶ、切断されたハムスターヒドロキシメチル−グルタリル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を含有するタバコ(Nicotiana tobacum)‘Xanthi’系統のホモ接合系統、及び以下１４−２と呼ぶ、導入遺伝子の欠いているＦ２分離同胞系統を、Chappell他(1995)により及び米国特許(US)第5306862号明細書、米国特許(US)第5349126号明細書、米国特許(US)第5365017号明細書に記載された通りに発生させた。簡単に言えば、最初にChin他(1984)により特性決定されたハムスター遺伝子を、ヌクレオチド２８〜１０２３を除去することにより改変して、δ−２２７ ＨＭＧＲと呼ばれる遺伝子の切断された形を生産した。切断されたＨＭＧＲ ｃＤＮＡのＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１フラグメントを単離し、中間体プラスミドベクターであるｐＫＹＬＸ ６１中へ挿入し、その構成体のＥｃｏＲ１／Ｃｌａ１フラグメントを、その後にｐＫＹＬＸ７１の相応する部位中へ挿入して、ｐＫＹＬＸ７１−切断されたＨＭＧＲ遺伝子構成体を生産した。Ｔｉ−プラスミド系列ｐＫＹＬＸ６１及び７１を、Schardl他（1987）により発生させた。
【０１０４】
ｐＫＹＬＸ７１−ＨＭＧＲプラスミドを、無力化した(disarmed)ＴｉプラスミドＧＶ３８５０を保有するアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)中へ、標準トリペアレンタルメイティング手順（Schardl他, 1987）を用いて起動した。タバコ(Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi)の葉片を植物材料として使用し、ｐＫＹＬＸ７１−ＨＭＧＲ構成体を有するアグロバクテリウム(Agrobacterium)で接種し、トランスジェニック植物をSchardl他(1987)及びHorsch他(1985)に記載された標準の形質転換及び再生産プロトコルを用いて再生産した。
【０１０５】
最初に形質転換され、かつ再生産された植物（Ｒ０世代）を、成長させ、自家受粉させ、その後の種を収集した（Ｒ１世代）。Ｒ１種子を、標準の温室条件下に個々の植物として成長させ、自家受粉させ、Ｒ２種子世代を収集した。その後に、Ｒ２種子世代を、ＨＭＧＲ導入遺伝子の存在に関してスクリーニングした。
【０１０６】
ＨＭＧＲ導入遺伝子構成体の存在に関するスクリーニングは初めに、ｐＫＹＬＸ７１−ＨＭＧＲ構成体の部分として植物中へ遺伝子操作されたカナマイシン耐性マーカーの存在に基づいていた（Chappell他, 1995）。カナマイシン１００mg/Lを含有する発芽培地上にプレーティングした種を、光退色を示す発芽された実生（全て白色の実生、カナマイシン耐性マーカーの欠けているもの及び故に導入遺伝子構成体の欠けているホモ接合系統）対全ての緑色の実生（カナマイシン耐性マーカーを保有する緑色の実生、及び故に導入遺伝子構成体を有するホモ接合系統）について記録した。これらの同定された系統からの種を、その後に温室中で繁殖させ（カナマイシン選択を有しない）、ステロールに関する化学分析により遺伝子操作したＨＭＧＲ構成体の存在に関してスクリーニングした（Chappell他, 1995）。系統１４−８は、対照植物よりも２〜１０倍高いステロールレベルを示し、かつ全ての実生がカナマイシンの存在で正常に成長したのに対し、系統１４−２は、形質転換されていない対照植物に匹敵しうるステロールレベルを有し、かつカナマイシンの存在で発芽された実生は全て光退色された白色であった。
【０１０７】
植物系統１４−８（ＨＭＧＲ−過剰発現）及び１４−２（対照）を、その後の全ての形質転換作業において使用した。
【０１０８】
例２〜５．組換え及び植物形質転換ベクターの構成
ハイグロマイシン選択マーカー（Hajdukiewicz他, 1994）を、形質転換植物のための選択マーカーを作り出すために選んだ。新しいベクターを、Hartley他(2000)により記載された通り、適切な組換えクローニング部位を用いて遺伝子操作した。
【０１０９】
例２：ｐＢＤＯＮベクターの発生
ｐＢＩ１０１ベクター（Invitrogen、カールズバッド、CA）を制限酵素Ｓｐｈ１及びＳｓｔ１で消化し、プラスミドベクターに相応するＤＮＡフラグメント（ＲＢ境界配列及びＮＰＴＩＩ遺伝子カセットを含まない）を、アガロースゲル精製により単離した（Sambrook他, 1989）、図８中（１）。並行して、ｃｃｄｂ遺伝子及びクロロアムフェニカル(chloroamphenical)耐性遺伝子を含むａｔｔｐ組換えカセットを、ｐＤＯＮ２２１ベクター（Invitrogen、カールズバッド、CA）から、プライマーＡｔｔｐ１−ＳｓｔＩ−ＦＷ及びＡｔｔｐ２−ＳｐｈＩ−ＲＶで標準ＰＣＲ条件を用いて増幅させた（２）。ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントをＳｐｈ１／Ｓｓｔ１酵素で制限し、ゲル精製し、前記の類似して消化したｐＢＩ１０１ベクターの相応する部位中へ連結して、中間体ｐＢａｔｔｐベクターが生じた（３）。
【０１１０】
ハイグロマイシン遺伝子カセットを２段階プロセスで製造した。最初に、ハイグロマイシン遺伝子（ＨＰＴ）及びＣａＵＴＲ（終止配列）を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（Cambia、キャンベラ、AU）ベクターから、ＰＣＲプライマーＨＰＴ−ＮｏｔＩ−ＦＤ及びＨＰＴ−Ｘｂａ１−ＲＶを用いてＰＣＲ増幅させ、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen、マディソン、WI）中へＴ／Ａクローニングして（ＰＣＲ反応混合物から直接的にＴａｑ−増幅されたＰＣＲ産物）、ｐＴＨＰＴが生じた（４）。右側境界配列（ＲＢ）及びＮＯＳ−プロモーター（Ｐ−ＮＯＳ）領域を、ＰＣＲプライマーＴＢ−ＳｐｈＩ−ＦＤ及びＴＢ−ＮｏｔＩ−ＲＶを用いてｐＢＩ１０１から増幅させ（５）、ついでｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中へＴ／Ａクローニングして、ベクターｐＴＲＢＰが生じた（６）。ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを、ベクターｐＴＨＰＴから、Ｎｏｔ１／Ｘｂａ１での消化を経て放出し（７）、類似して消化されたｐＴＲＢＰベクター中へクローニングして、ベクターｐＴＲＢＰＨＰＴＴが生じた（８）。ＮＯＳプロモーター−ハイグロマイシン−ＣａＵＴＲカセットを、ついで、このベクターから、プライマーＴＢ−ＳｐｈＩ−ＦＤ及びＨＰＴ−ＳｐｈＩ−Ｒを用いて増幅させた（９）。増幅させた産物をＳｐｈ１で消化し、ｐＢａｔｔｐの相応する部位中へ連結し、ｐＢＤＯＮベクターが生じた（１０）。
【０１１１】
ｐＢＤＯＮ Ｔｉ−ベクター（図５、９）は、細菌中の選択のためのＴ−ＤＮＡ領域及び植物形質転換選択のためのハイグロマイシン遺伝子（ＨＰＴ）の外側に、ＮＰＴＩＩ選択マーカーを含有する。それゆえ、埋め込まれたａｔｔｐカセットは、ｐＢＤＯＮベクター中へのａｔｔＢ部位で挟まれたターゲット遺伝子構成体の簡単な挿入を提供する。
【０１１２】
ａｔｔＢ部位を有するヘルパーベクターの発生：
２つの異なるａｔｔＢヘルパーベクターを、図９及び１０に与えられたプロトコルに従って構成した。ｐＢＤＯＮベクター中への、一方は単一遺伝子挿入（ｐＴＭＯＮ、図６Ａ）について及び他方は２つのターゲット遺伝子挿入（ｐＴＤＵＡＬ、図６Ｂ）。
【０１１３】
例３：ｐＴＭＯＮベクターの生産（図９）
ｐＴＭＯＮベクターを、改変されたｐＢＩ１０１ベクターから、Ｎｄｅ１制限部位及びプライマーＣＳＭＶ−ＡＴＴＢ１−ＳＧＦＩ−ＦＤ中へ埋め込まれたａｔｔＢ１配列を含有する前方のＰＣＲプライマー、及びＥｃｏＲ１部位を含有するリバースプライマーＣＳＭＶ−ＥＣＯＲＩ−ＲＶで、カッサバモザイクウイルス（Ｐｃｖ）プロモーターを最初に増幅することにより構成した（１１）。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター（Promega、マディソン、WI）中へＴ／Ａクローニングし（１２）、ついでＮｄｅ１／ＥｃｏＲ１消化産物として再単離した。単離された消化産物（１３）を、ｐＥＣＶＳベクター、任意のプレースホルダー遺伝子、"遺伝子１"、ＮＣＢＩ受入れ番号ＣＱ８１３５０８）を保有するｐＥＴ２８ａ誘導体の相応する制限部位中へ連結して、ｐＥＰＣＶＳを生産した（１４）。
【０１１４】
並行して、ｐＢＩ１０１のＮＯＳターミネーター（ＴＮＯＳ）配列を、前方のプライマーＴｎｏｓ−ＸｈｏＩ−ＦＷ及びリバースプライマーＴｎｏｓ−ａｔｔＢ２−ＲＶで増幅して、ａｔｔＢ２組換え部位をＴＮＯＳ配列の下流で組み込んだ。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中へＴ／Ａクローニングし、ｐＴＴＮＯＳベクターが生じた（１５）。ｐＥＰＣＶＳ（１６）のＮｄｅ１／Ｘｈｏ１消化フラグメントをその後に、ｐＴＴＮＯＳの相応する部位中へ連結して、ｐＴＭＯＮ（１７）を生産した（図６Ａ、９）。
【０１１５】
ｐＴＭＯＮベクターを、カッサバモザイクウイルスプロモーター（Ｐｃｖ）（Frey他, 2001）の後ろに単一ターゲット遺伝子の挿入のために構成し、Ｎｏｓターミネーター配列が続いた。
【０１１６】
一部の場合に、Ｈｉｓタグ配列を、ＥｃｏＲ１での消化によりｐＴＭＯＮベクター中へ遺伝子操作し、プライマーペアＨｉｓ−ＥｃｏＦ及びＨｉｓ−ＥｃｏＲでのリンカー／ライゲーションが続いた。その後の突然変異を、Ｈｉｓ−タグオープンリーディングフレーム配列を完全に破壊するが、しかし都合のよいＡｓｃ１及びＥｃｏＲ１制限部位を維持するように設計した。これは、プライマーｍＨｉｓＰＴＳ−Ｆ及びｍＨｉｓＰＴＳ−Ｒでの標準ＰＣＲ反応条件を用いて達成され、ＰＣＲ反応産物を細菌中へ形質転換して、突然変異したｐＴＭＯＮプラスミドを回収した。
【０１１７】
例４：ｐＴＤＵＡＬベクターの生産（図１０ Ｉ及びＩＩ）
ｐＴＤＵＡＬベクターを多段階プロセスで構成した（図１０、部分１及び２）。最初に、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（Ｐｃａ）（Benfy他, 1990）を、ｐＢＩ１２１ベクター(Invitrogen)から、プライマーＰＣａＭＶ−ＸｂａＩ−ＦＷ及びＰＣａＭＶ−ＳｐｅＩ−ＲＶを用いて増幅させ、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中へＴ／Ａクローニングした（１８）。プロモーター要素をその後に、このベクターからＸｂａ１及びＳｐｅ１での消化により放出した（１９）。並行して、任意のプレースホルダー遺伝子（"遺伝子２"）を、エリシター処理された細胞培養物（PCT/US06/02265）から得られたヒオシアムス ムチクス(Hyoscyamus muticus) ｃＤＮＡライブラリーから、プライマー７１２０Ｄ−ＳｐｅＩ−ＦＷ及び７１２０Ｄ−ＫｐｎＩ−ＲＶで増幅させ、Ｓｐｅ１／Ｋｐｎ１での消化及びｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの相応する部位中へのライゲーションが続き、ｐＴＨＰＯが生じる（２０）。ｐＴＨＰＯをついでＸｂａ１／Ｓｐｅ１で消化し、類似してｐＴＰＣａから放出されたＣａＭＶプロモーターフラグメントを一緒に連結して、ｐＴＰＨＰＯを得た（２１）。
【０１１８】
ｐＴＰＨＰＯを形成するために並行して、ＮＯＳターミネーター配列を、ｐＧＴＮＯＳベクターからプライマーＴｎｏｓ−ＫｐｎＩ−ＦＷ及びＴｎｏｓ−ａｔｔＢ２−ＲＶ３で増幅させ、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター（２２）中へＴ／Ａクローニングし、Ｋｐｎ１及びＳａｃ１でのｐＧＴＮＯＳＫプラスミドの消化によるその後のフラグメントの再単離が続いた（２３）。このフラグメントを、ついで、ｐＴＰＨＰＯの相応する制限部位中へクローニングし、ｐＴＰＨＰＯＴを生じさせた（図１０の部分１）（２４）。
【０１１９】
ｐＴＤＵＡＬベクターを構成する最終段階において、ａｔｔＢ１部位から、挿入されたテルペンシンターゼ遺伝子の下流のｎｏｓ−ターミネーター配列にわたるｐＴＭＯＮベクターのフラグメント（２５）を、標準ＰＣＲ条件を用いて増幅させた。増幅産物がプライマーＣｓＭＶ−ａｔｔＢ１−Ｓｇｆ Ｉ−ＦＤ及びＴＮＯＳ−ＸｂａＩ−ＲＶを有して得られ、これをまた、フラグメント上の末端Ｓｐｈ１及びＸｂａ１部位を遺伝子操作した。ＰＣＲフラグメントを、消化し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの相応するＳｐｈ１／Ｘｂａ１部位中へ連結して、ｐＴＰＣＶＳＴが生じた（２６）。最後に、ｐＴＰＨＰＯＴからのＸｂａ１ないしＳａｃ１消化フラグメント（２７）を、ｐＴＰＣＶＳＴの相応する部位中へ連結して、ｐＴＤＵＡＬベクター（２５）を生じさせ、これは、強い構成性発現プロモーターの下流の２遺伝子配列の挿入を可能にする（図１０、部分２）。
【０１２０】
ｐＴＤＵＡＬベクター（図６Ｂ）を、トランスジェニック植物中へ２つの遺伝子を挿入するために設計した。一番目の遺伝子の発現は、カッサバモザイクウイルスプロモーター(Frey他, 2001)により向けられるのに対し、二番目の遺伝子の発現は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター(Benfey他, 1990)により向けられる。
【０１２１】
前記のｐＴＭＯＮ構成体になされた改変に類似して、一部の場合にＨｉｓタグ配列を、ＥｃｏＲ１での消化、引き続きプライマーペアＨｉｓ−ＥｃｏＦ及びＨｉｓ−ＥｃｏＲでのリンカー／ライゲーションにより、ｐＴＤＵＡＬベクター中へ遺伝子操作した。その後の突然変異を、Ｈｉｓタグオープンリーディングフレーム配列を完全に破壊するが、しかし都合のよいＡｓｃ１及びＥｃｏＲ１制限部位を維持するようにも設計した。これを、プライマーｍＨｉｓＰＴＳ−Ｆ及びｍＨｉｓＰＴＳ−Ｒでの標準ＰＣＲ反応条件を用いて達成され、ＰＣＲ反応産物を細菌中へ形質転換して、突然変異したｐＴＤＵＡＬプラスミドを回収した。
【０１２２】
例５：パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）及びパチュロールシンターゼ＋ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰ）過剰発現ベクターの構成
ＰＴＳ及びＰＴＳ＋ＦＰＳ発現ベクターの生産は、ｐＴＭＯＮ、ｐＴＤＵＡＬ及びｐＢＤＯＮベクターと関連している適切な組換えクローニング部位によって大いに促進された。ＰＴＳ（国際公開(WO)第2004/031376号パンフレット）又はＦＰＳ遺伝子（Tarshis他, 1994）を、それぞれ、プライマーペアＰＴＳ−ＡｓｃＦ及びＰＴＳ−ＸｈｏＲ、又はＦＰＰ−ＳｐｅＦＷ及びＦＰＰ−ＫｐｎＲＶで増幅させ、Ａｓｃ１／Ｘｈｏ１又はＳｐｅ１／Ｋｐｎ１のいずれかで消化し、ついで、ｐＴＭＯＮ又はｐＴＤＵＡＬベクターの相応する部位中へ連結した。ＦＰＳ−ＰＴＳ遺伝子融合を、ＦＰＳ遺伝子をプライマーＦＰＳ−ＡｓｃＦ及びＦＰＳ−ＡｓｃＲで増幅し、生じたＰＣＲフラグメントをＡｓｃ１で消化し、このフラグメントをｐＴＭＯＮ及びｐＴＤＵＡＬベクター中のＰＴＳ遺伝子に対して５′に見出される相応するＡｓｃ１部位中へ連結することによって生成させた。生じたプラスミドを、ついで、相応するＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ及びＦＰＳ−ＰＴＳ遺伝子カセットを標準組換えクローニング（Hartley他, 2000）によりｐＢＤＯＮベクター中へ起動するために使用して、Ｔｉ−プラスミドベクターのファミリーを生じさせた（図７）。図７に示された一番目のカセットに相応するＨｉｓタグを有し、ＰＴＳをコードする遺伝子を含んでなるプラスミドｐＢＤＯＮベクターを寄託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０７で寄託した。
【０１２３】
例６：植物形質転換及び再生産
個々のｐＢＤＯＮベクター構成体（図５、７）を、電気穿孔法によるアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)系統ＧＶ３８５０（Mersereau他, 1990）及びカナマイシン耐性について選択された形質転換体中へ形質転換した。選択されたコロニーを、限定されたＤＮＡ配列決定法により導入遺伝子構成体について検証し、その後に、カナマイシン１００mg/Lを含有するＬＢ培地５０mL中で成長させた。０．６〜０．８に等しいＯＤ６００を有する一晩の培養物を、遠心分離により濃縮し、新鮮なＬＢ培地３０mL（抗生物質を有しない）中に再懸濁させ、前に記載された通り葉外植片の接種のために使用した（Chappell他, 1995; Horsch他, 1985）。簡単に言えば、無菌条件下で成長した植物からの葉を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)培養物中へ入れ、約１cmセグメントに切断し、葉セグメントを非選択的培地プレート上にプレーティングした（Murashige及びSkoog, 1962）。３日後、葉外植片を、ハイグロマイシン１５μg/mL（Invitrogen、カールズバッド、CA）及びセホタキシム５００μg/mL（Bioworld、ダブリン、OH）を含有する培地プレートに及びその後に一週間同じ選択培地に、カルス及び再生産された植物シュートが明らかになるまで、移した。サイズが１〜３cmのシュートを、ついで、根発生を刺激するためにＴ−培地（Murashige及びSkoog、1962）（同じ抗生物質を含有する）へ移した。一度根系が定着されれば、小さな植物を商業的に入手可能な鉢植え用土に移し、温室中で繁殖させた。
【０１２４】
例７：テルペン分析
例６において得られた形質転換植物の葉材料から抽出されたセスキテルペンを、同定し、ＧＣ−ＭＳ分析により定量した。２００〜５００mgの冷凍した葉試料を、液体窒素中で粉砕し、ついで、外標準としてα−セドレン２００ngを含有するヘキサン：酢酸エチル混合物３mL（ｖ／ｖ ８５：１５）で抽出した。抽出物を、酢酸エチル：ヘキサンの同じ８５：１５混合物で溶離されるシリカカラム上に試料を流すことにより部分的に精製した。溶離液を、アリコート１μLをＧＣ−ＭＳにより分析する前に、窒素流下に、３０μL濃縮した（Takahashi S, 2005）。試料を、Restec Rtx-5キャピラリーカラム（３０m×０．３２mm、相厚さ０．２５μm）を備えたTrace GC-MS(ThermoFinnigan、サマセット、NJ)上へ注入し、スプリットレスモードで２５０℃のインジェクタ温度で及び７０℃の初期オーブン温度で１min、引き続き１minあたり４℃勾配で２３０℃まで操作した。マススペクトルを、３５から３００までの原子質量単位にわたり、７０eVで記録し、検証のためにライブラリー標準（ＮＩＳＴライブラリー）及び基準の標準と比較した。
【０１２５】
パチュロールの量の評価は、パチュロール及び内標準についての全イオンモニタリングにより得られたピーク面積の比に基づいていた。α−セドレン及びパチュロールの応答因子を、相応する標準の同じ量の同時注入により計算し、かつ生じた較正因子を計算に含めた。同じ方法を、リモネン及びその他のテルペン分子の定量化に使用した。
【０１２６】
図１は、セスキテルペン含量についての、対照タバコ系統（ＷＴ）及びＨＭＧＲ及びＰＴＳ遺伝子構成体で形質転換されたもののテルペン分析の結果を示す。図１中で、ＨｉｓＰＴＳ遺伝子構成体で形質転換されたＨＭＧＲ過剰発現系統についての全イオンクロマトグラム（図１Ａ）は、対照植物（ＨＭＧＲのみで形質転換された）のそれと比較される（図１Ｂ）。ピークを、入手可能な標準とのそれらのマススペクトルの比較によるか、又はＮＩＳＴライブラリーにおいて入手可能なスペクトルマッチにより、同定した。例えば、ピーク１２についてのＭＳ（Ｃ）は、基準パチュロールについてのＭＳ（Ｄ）と比較される。その他のピーク同定：１−β−パチュレン；２−β−エレメン；３−α−セドレン（内標準）；４−カリオフィレン；５−α−グアイエン；６−未知；７−α−パチュレン；８−セイケレン；９−未知、１０−δ−グアイエン；１１−グロブロール；及び１２−パチュロール。
【０１２７】
図１は、ＧＣ−ＭＣ分析の結果であり、かつ興味のある特定のサイトゾル標的テルペン（パチュロール）シンターゼ及びＨＭＧＲをコードする遺伝子で特異的に形質転換された植物（Ａ）が、野生型（Ｂ）と比較した場合に改変されたテルペン含量及び同じパチュロールシンターゼにより合成されたその他のテルペンに加えて蓄積されたパチュロールを有していたことを説明する。
【０１２８】
図４は、ＰＴＳをコードする組換え遺伝子で形質転換された植物の葉中のセスキテルペン（パチュロール）含量の定量分析であり、この際に"ＰＴＳ"単独では、ＰＴＳをコードする組換え遺伝子を保有する形質転換体と呼び、"ＦＰＳ−ＰＴＳ"は、ＰＴＳをコードする遺伝子に融合されたＦＰＳをコードする遺伝子を呼び、かつ"ＦＰＳ＋ＰＴＳ"は、ＰＴＳ及びＦＰＳをコードする分離した遺伝子を呼ぶ。１４−８＋ＰＴＳ（８ＰＴＳ）は、本発明によるＨＭＧＲ遺伝子を過剰発現する植物を呼ぶのに対し、１４−２＋ＰＴＳ植物（２ＰＴＳ、２ＦＰＳ−ＰＴＳ、２ＰＴＳ＋ＦＰＳ）はＨＭＧＲを過剰発現しない。図４中の植物８ＰＴＳ １０の種子を、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０６で寄託した。
【０１２９】
図４において、ＴＳ（ＰＴＳ）をコードする遺伝子単独での植物の形質転換により、タンパク質の検出可能な発現が観察され、かつタンパク質発現レベルと相互に関係していたが、しかしパチュロール蓄積は僅かであったことがわかる。ＴＳをＦＰＳと同時発現させることにより、パチュロールの蓄積は中程度に増加した。対照的に、１４−８系統中のＰＴＳの発現（ＨＭＧＲ過剰発現） 高いパチュロールレベルは、図４中の同じ系統と比較して、ＰＴＳタンパク質発現レベル（図３中の系統１０）と直接的に相互に関係していることが観察される。このことは、テルペン蓄積へのＨＭＧＲの強い寄与を明らかに証明することになる。
【０１３０】
例８：本発明の植物を得るためのメンデル交雑
１４−８系統を有する形質転換植物を得るのが困難であるために、古典的なメンデル交雑を、ＰＴＳ単独で（ＰＴＳ）、ＦＰＰシンターゼを有するＰＴＳ（ＰＴＳ＋ＦＰＳ）を、又はＨＭＧＲと共にＦＰＰシンターゼを有する融合タンパク質（ＦＰＳ−ＰＴＳ）として、過剰発現する植物系統を生産するために使用した。ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ又はＦＰＳ−ＰＴＳのいずれかを発現させるために遺伝子操作したトランスジェニック植物系統を、ハイグロマイシン（１５mg/L）の存在で初めに発芽させ、抗生物質耐性植物（所望の構成体を含んでなる）のみを成長させた（親系統Ｐ１）。親系統Ｐ２は、切断されたＨＭＧＲ遺伝子（１４−８）についてホモ接合であり（Chappell他、1995）、選択せずに発芽させ、かつ成長させた。相反交雑（２つの親系統の間での花粉交換）によりＦ１後代種が生じ、これらを、カナマイシン（５０mg/L）及びハイグロマイシン（１５mg/L）の存在で発芽させ、生じた耐性植物を例７で前記の通りパチュロール蓄積について評価した。これらの二重耐性植物は、図１２（部分Ａ）中に説明される通り、切断されたＨＭＧＲをコードする一番目の構成体及びＰＴＳ、ＦＰＳ＋ＰＴＳ又はＦＰＳ−ＰＴＳのいずれかをコードする二番目の構成体の二重挿入を有する。
【０１３１】
生じた後代植物であるＦ１世代植物を、ついで、ＧＣ−ＭＳによるパチュロールのそこでの蓄積について評価した。図１２の部分Ｂ中に、親系統（白色で示されている）中のパチュロールレベルは、相応する後代系統（相反交雑 − 黒色及び灰色）に対して示されている。ΔＨＭＧＲ親系統（Ｐ２）は、少しもパチュロールを蓄積しなかった。以下の第１表は、同じ評価の数値を示す。結果は、サイトゾル中でのパチュロール生合成の遺伝子操作が、レギュレーションされていない形のＨＭＧＲの同時の遺伝子操作により有意に高められていることを証明する。交雑から生じた全ての後代植物について、パチュロール生産の１．５〜１５倍の増加が観察された。
【０１３２】
第１表：異なる形質転換植物及び遺伝子交雑に続く後代中のパチュロール含量
【表１】
【０１３３】
例９：ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
各系統の全ＲＮＡを、Trizol試薬を用いて製造者（Invitrogen Life Technologies、カールズバッド、CA）に従い若葉５００mgから単離した。ファーストストランドｃＤＮＡを、反応緩衝液中の全ＲＮＡ５μg、オリゴｄＴ１２−１６プライマー２００ng及び逆転写酵素（Superscript II、Invitrogen Life Technologies）を有する２０μL反応及び製造者により推奨された通りの条件中で合成した。ＲＮａｓｅ Ｈ １μLをその後に、ｃＤＮＡ調製物に添加し、３７℃で１時間定温保持して、相補的ＲＮＡを除去した。
【０１３４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を、異なるトランスジェニック系統中でのｍＲＮＡレベルを決定するのに使用した。リニアＰＣＲ増幅のための最適濃度を、添加したｃＤＮＡ鋳型の量を変え、かつＰＣＲサイクルの数（１０、１５、２０、２５及び３０）を用いることにより決定した。プライマーＰＴＳ−８Ｆ及びＰＴＳ−１６０Ｒを、ＰＴＳ遺伝子を増幅させるのに使用したのに対し、ＦＰＰ−１Ｆ及びＦＰＰ−１６０Ｒを、ＦＰＳ遺伝子のために使用した。他のプライマー対であるＲＢＣＳ−ＦＷ及びＲＢＣＳ−ＲＶを、内標準としてのＲＵＢｉｓＣＯスモールサブユニット遺伝子を増幅させるのに使用した。典型的なＰＣＲ条件は、混合物２５μLの合計で、１×Ｔａｑ緩衝液（製造者により供給された通り）、ＭｇＣｌ2 １．５mM、ｄＮＴＰ混合物 ０．２mM、各プライマー０．５μM、ｃＤＮＡ １．２５μL及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位からなっていた。ＰＣＲ増幅を２０温度サイクルにわたって実施し、それぞれ、９４℃で３０secの変性、６０℃で３０secのアニール、及び７２℃で６０secの延長からなっていた。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色し、撮影した。
【０１３５】
ＰＴＳ及びＦＰＳ ｍＲＮＡ分析の結果は、図２に示されている。前記図は、パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）遺伝子を有する構成体、又はパチュロールシンターゼ及びＦＰＳ遺伝子（ＰＴＳ＋ＦＰＳ）を有する構成体、又はＦＰＳ及びＰＴＳの融合タンパク質（ＦＰＳ−ＰＴＳ）をコードする構成体で形質転換された植物から単離されたｍＲＮＡから誘導されたＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。ＲＢＣＳは、ＲｕｂｉｓｃｏスモールサブユニットｍＲＮＡから誘導されたＲＴ−ＰＣＲ産物であり、野生型（ＷＴ）及びトランスジェニック植物中に存在し、かつ内標準として利用される。
【０１３６】
野生型（ＷＴ）植物はＰＴＳ又はＦＰＳを発現しなかったことがわかる。ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ及びＰＴＳ−ＦＰＳ構成体を保有する系統の大部分が、に検出可能なレベルのＰＴＳ ｍＲＮＡを発現したが、しかし、パチュロール蓄積は、ＰＴＳ ｍＲＮＡ発現レベルと相対的に乏しく相互に関係していた。
【０１３７】
例１０：ウェスタンブロッティング分析
４〜５の合成されたペプチドの混合物を、ＰＴＳ及びＦＰＳの抗体を製造するための抗原として使用した。抗原ペプチドを、フリーソフトウエア(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)により予測し、ＦＰＳについて直接的な３Ｄ構造分析（ＰＤＢ：１ＦＰＳ）又はＰＴＳについて入手可能な構造ＥＡＳ（ＰＤＢ：５ＥＡＳ）とのホモロジーモデル比較により選択した。ＰＴＳについて５つの抗原ペプチド（ＰＴＳ４６：ＥＥＬＫＶＥＬ；ＰＴＳ１０８：ＨＡＴＡＬＳＦＲＬＬＲＱＨＧＹＲＶＳＣＥ；ＰＴＳ３５３：ＤＥＥＬＩＫＬＧＡＰＹＲＡ；ＰＴＳ４６２：ＨＶＲＴＡＶＥＣＹＭＥ；ＰＴＳ４７５：ＫＶＧＫＱＥＶＶＳＥ）、及びＦＰＳについて４つの抗原ペプチド（ＦＰＰ４１：ＥＦＶＧＦＦＰＱＩＶＲ；ＦＰＰ５９：ＧＨＰＥＶＧＤＡＶＡＲＬＫＥＶＬＱＹ；ＦＰＰ２１８：ＹＫＡＩＶＫＹＫＴＡＦ−ＹＳＦＹＬＰＶＡＡ；ＦＰＰ３２０：ＰＥＫＶＡＫＶＫＥＬＹＥＡ）を設計した。全てのペプチドを、Sigma-Genosys（The Woodland、TX）により免疫学的グレードで１０mgスケールで合成した。それぞれのペプチド混合物を、ついで、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）キャリヤータンパク質に接合させ、Strategic Biosolutions（Windham、ME）によりウサギ中へ注入した。ＰＴＳ及びＦＰＳのためのポリクローナル抗体を、精製したＰＴＳ又はＦＰＳタンパク質と結合されるＣＮＢＲ−活性化セファロース４Ｂ樹脂を用いて製造された分取用抗原アフィニティーカラムにより製造者の指示書に従い（Amersham Biosciences、バッキンガムシア、英国）さらに精製した。
【０１３８】
トランスジェニック植物材料中のＰＴＳ及びＦＰＳタンパク質レベルを測定するために、若葉材料１００mgを、液体窒素中で粉砕し、ついで８００μLの８０mMリン酸カリウム（ｐＨ ７．０）、１０％グリセリン、１０mMメタ重亜硫酸ナトリウム、１５mM ＭｇＣｌ2、１０mMアスコルビン酸ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン及び１４mM β−メルカプトエタノールで抽出した。粗製タンパク質抽出物を、卓上型小型遠心機中で４℃で最高速度で２０min遠心分離し、生じた上澄みをタンパク質源として使用した。上澄みタンパク質４０μgを含有する試料を、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロース膜(BIO-RAD、Hercules、CA)中へブロッティングした。膜を、精製したＰＴＳ又はＦＰＳ抗体を添加する前に、５％乾燥乳を含有する標準Tween 80／トリス−緩衝液処理塩水（ＴＴＢＳ）遮断溶液で遮断した。膜を、ついで、振とうしながら室温で３〜７時間定温保持し、ＴＴＢＳで３回洗浄し、ついで、ヤギペルオキシダーゼ標識付けした抗ウサギＩｇＧ（Kirkegaard and Perry Laboratories、ゲーサーズバーグ、MD）と共にＴＴＢＳ遮断溶液中で室温でさらに３時間定温保持した。二次抗体の化学ルミネセンス検出を、ＥＣＬ試薬キットを用いて製造者の指示書に従い実施した（Amersham Biosciences、バッキンガムシア、英国）。
【０１３９】
トランスジェニック植物中のパチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）及びファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）タンパク質の発現レベルは、図３に示されている。図３中のレーン上部の数は、パチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）遺伝子、又はパチュロールシンターゼ及びＦＰＳ遺伝子を含有する構成体（ＰＴＳ＋ＦＰＳ）、又はＦＰＳ及びＰＴＳの融合タンパク質をコードする構成体（ＦＰＳ−ＰＴＳ）を含有するように遺伝子操作された独立したトランスジェニック植物系統を表す。結果は、テルペンシンターゼ遺伝子（パチュロールシンターゼ）単独で（２ＰＴＳ）又は融合タンパク質をコードする遺伝子（２ＰＴＳ−ＦＰＳ）での形質転換により得られたトランスジェニック植物について、及びテルペンシンターゼ遺伝子での形質転換により得られ、かつさらにトランスジェニックＨＭＧＲ遺伝子（８ＰＴＳ）を含んでなるか又はさらにトランスジェニックＦＰＰシンターゼ（２ＰＴＳ＋ＦＰＳ）を含んでなる植物について、示されている。使用されたポジティブコントロールは、ＰＴＳ及びＦＰＳタンパク質（それぞれレーンＰＴＳ及びＦＰＳ）であり、これらのタンパク質を過剰発現するように形質転換された細菌から精製されたものである。レーンＷＴ１は、野生型植物の葉から抽出する。レーンＷＴ１は、ＨＭＧＲ遺伝子を発現する植物のみの葉から抽出する。パネルＡは、ＰＴＳ抗体を用いて試験した膜を示し、かつパネルＢは、ＦＰＳ抗体を用いて試験した膜を示す。
【０１４０】
図３において、タンパク質が野生型植物中で免疫学的に検出されなかったことがわかる。分析されたトランスジェニック系統の大部分については、ＰＴＳ及び／又はＦＰＳタンパク質は、葉抽出物中で検出されることができ、かつ葉中の組換えタンパク質の発現レベルは、テルペン（パチュロール）蓄積のレベルと相互に関係していた。
【０１４１】
例１１：本発明の植物中でのテルペン合成に使用される経路を示すための［１−13Ｃ］−グルコース標識
蓄積されたパチュロール中の炭素の生合成起源を決定するために、標識実験を実施し、かつ本発明の植物を、パチュロールの色素体生産について遺伝子操作した植物(PCT/IB2006/051198)と比較した。８ＰＴＳ１０（サイトゾル中でＰＴＳを発現するトランスジェニック植物系統）及び２ｔｐＰＴＳ＋ｔｐＦＰＳ１２（色素体）の種を、ハイグロマイシン（１５mg/l）を添加した固体ＭＳ培地上で発芽させた。
【０１４２】
ＧＣ−ＭＳ分析のためには、３４週齢実生を、その後に、スクロースを有しない液体ＭＳ培地５mlを含有する２５mlフラスコ中へ移し、暗所で穏やかに振とうしながら（１２５rpm）、定温保持した。１日後、［１−13Ｃ］−グルコース(Sigma) １００mgを培地中へ添加し、植物材料を毎日収集した。ＧＣ分析のために、試料１００mgを、例７に記載された通りに抽出した。
【０１４３】
ＮＭＲ分析のためには、上記の２つのトランスジェニック系統の１０００実生を使用し、その際に１００実生を、［１−13Ｃ］−グルコース１gを添加した液体ＭＳ培地５０mlを含有する２５０mlフラスコ中で成長させた。全ての標識付けした実生を１週間後に収集し、上記の通り抽出した。濃縮した抽出物（３ml）を、ついで、シリカＴＬＣプレート及び展開溶剤としてヘキサン：酢酸エチル（９：１）を用いる分取ＴＬＣ分離により精製した。
【０１４４】
系統２ｔｐＰＴＳ＋ｔｐＦＰＳ１２からの精製した13Ｃ−標識付けしたパチュロール２５０μg及び８ＰＴＳ１０からの５００μgを、その後に、１３Ｃ−ＮＭＲ（７５０mHz、ＣＤＣｌ3、University of Illinois、シャンペーン、ILのChemistry DepartmentにおけるBob Coatesによる）により分析した。炭素の位置及び豊富化を、対照植物から精製された標識付けしていないパチュロールに対して割り当てた。
【０１４５】
図１３Ａは、［１−13Ｃ］−グルコースが供給されたトランスジェニック実生中での、それぞれ、ＭＶＡ及びＭＥＰ経路から出現するＩＰＰから合成されたパチュロール中の予測された13Ｃ標識パターンを示している。ＭＶＡ経路のＩＰＰから合成されたパチュロールは、位置１、３、５、７、９、１２、１３、１４及び１５で９個の13Ｃ−炭素を有することが予測されるのに対し、ＭＥＰ経路からのその対応物は、単に６個の13Ｃ−炭素、すなわち位置２、６、８、１２、１３及び１５で有することが予想される。
【０１４６】
ＧＣ−ＭＳ分析の結果は、図１３Ｂに示されており、この中で、図ｂは、12Ｃ−グルコースが供給された植物（対照）により合成されたパチュロール、及び図ｃ及びｄは、（サイトゾル）ＭＶＡ及び（色素体）ＭＥＰ経路により13Ｃ−グルコースが供給された植物が製造するパチュロールについてのＭＳ親イオンを、それぞれ示す。13Ｃが供給された植物から出現するパチュロールはより重いイオンを有し、その際に、効果は、色素体パチュロールではあまり顕著ではないことがわかる：サイトゾル経路が遺伝子操作された場合に、主要な親イオンのマスが２２２から２２５にシフトし、かつＭ＋８マス親イオンが観察されることができ；及び葉緑体経路が遺伝子操作された場合に、主要な親イオンのマスが２２４にシフトし、かつＭ＋６マス親イオンが観察されることができる。これらの観察は、標識予測と一致している。ＮＭＲ分析の結果は、以下の第２表に示されている。
【０１４７】
第２表：１−Ｃ13−グルコースからサイトゾルＭＶＡ及び色素体ＭＥＰ経路により合成されるパチュロール中への13Ｃ豊富化
【表２】
【０１４８】
図１３に示された予測された標識パターンに従って、第２表は、サイトゾル中に発現されるＰＴＳを有する植物からのパチュロール中に、炭素原子１、３、５、７、９、１２、１３、１４及び１５が１３Ｃで豊富化されることを示している。標識は故に、セスキテルペンが、ＭＶＡ経路から生じるＩＰＰから実際に合成され、かつ色素体経路の寄与が目下存在することを示している。
【０１４９】
例１２：植物中でのサイトゾルのモノテルペン生合成の遺伝子操作。
【０１５０】
図７に示された発現ベクターを、ＰＴＳ遺伝子についてシトラスリモネンシンターゼ遺伝子（ＬＩＳ）（GenBank受入れAF514287）、及びＦＰＳ遺伝子についてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子（ＧＰＳ）（GenBank受入れＡＴＨ１７３７６）を、原ＰＴＳ及びＦＰＳ発現ベクター中へ置換クローニングすることにより、図１１に説明されている通り生産した。ＬＩＳ及びＧＰＳ遺伝子は、それぞれ、レモンフルーツ又はアラビドプシス(Arabidopsis)植物から単離されたＲＮＡ由来のそれぞれの遺伝子の逆転写−ＰＣＲ増幅により得られた。ＲＮＡを、ＲＮＡ-Trizol(invitrogen)試薬を用いて製造者プロトコルに従い抽出し、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを用いてファーストストランドｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲ増幅を、ＧＰＳの増幅のためのＡｔＧＰＳ−ＳｐｅＦ及びＡｔＧＰＳ−ＫｐｎＲプライマー組合せ及びＬＩＳの増幅のためのＬＩＳ−ＡｓｃＦ及びＬＩＳ−ＸｈｏＲプライマー組合せを用いて実施した（３０、３１）。これらのプライマーを、色素体ターゲティング信号をコードするヌクレオチド配列を除去し、開始コドンを導入し、かつ制限酵素認識部位を導入するように設計した。ＬＩＳ遺伝子を含有するＰＣＲ産物（３２）をＸｈｏＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された原ＰＴＳ発現ベクター（３３）の相応する部位中へ連結した（３４）。生じたベクター（３５）を、植物中でのＬＩＳ発現に使用した。ＬＩＳ及びＧＰＳ発現ベクターの構成のために、前記の通り得られたＧＰＳ遺伝子（３６）を含有するＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化されたＰＴＳ＋ＦＰＳ発現ベクター（３７）中へ連結して（３８）、ベクター３９が得られた（図１１）。ＬＩＳ遺伝子を有し、かつＸｈｏＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で消化したＰＣＲ産物（３２）を前記の通り得て、同じ酵素で最初に消化されたベクター４０中へ連結した（４２）。生じたベクター（４１）を、植物中でＬＩＳ及びＧＰＳを発現するのに使用した。
【０１５１】
植物を例６に従って形質転換し、例７に従ってリモネン蓄積について評価した。図１５において、リモネンが、サイトゾル経路について遺伝子操作された植物中に蓄積され、かつ一部の植物についてはＧＰＳとＬＩＳとの同時発現がリモネンの蓄積を増加させたことがわかる。
【０１５２】
参照文献
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (1987) Current Protocols in Molecular Biology.
Benfey PN, Chua NH (1990) The Cauliflower Mosaic Virus-35s Promoter - Combinatorial Regulation Of Transcription In Plants. Science 250: 959-966
Chappell J, WoIf F, Proulx J, Cuellar R, Saunders C (1995) Is The Reaction Catalyzed By 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme- A Reductase A Rate-Limiting Step For Isoprenoid Biosynthesis In Plants. Plant Physiology 109: 1337-1343
Chin DJ, Gil G, Russell DW, Liscum L, Luskey KL, Basu SK, Okayama H, Berg P, Goldstein JL, Brown MS (1984) Nucleotide- Sequence Of 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl Coenzyme- A Reductase, A Glycoprotein Of Endoplasmic-Reticulum. Nature 308: 613-617
Frey PM, Scharer-Hernandez NG, Futterer J, Potrykus I, Puonti-Kaerlas J (2001) Simultaneous analysis of the bidirectional African cassava mosaic virus promoter activity using two different luciferase genes. Virus Genes 22: 231-242
Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The Small, Versatile Ppzp Family Of Agrobacterium Binary Vectors For Plant Transformation. Plant Molecular Biology 25: 989-994
Hartley JL, Temple GF, Brasch MA (2000) DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research 10: 1788-1795
Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) A Simple And General-Method For Transferring Genes Into Plants. Science 227: 1229-1231
Lucker他(2001) Expression of Clarkia S-linalool synthase in transgenic petunia plants results in the accumulation of S-linalyl-beta-D-glucopyranoside; Plant J. (4):315-24
Mau CJ, West CA (1994) Cloning of casbene synthase cDNA: evidence for conserved structural features among terpenoid cyclases in plants Proc Natl Acad Sci USA; 91(18):8497-501.
Mersereau M, Pazour GJ, Das A (1990) Efficient Transformation Of Agrobacterium-Tumefaciens By Electroporation. Gene 90: 149-151
Murashige T, Skoog F (1962) A Revised Medium For Rapid Growth And Bio Assays With Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum 15: 473 -&
Ohara他(2003) Limonene production in tobacco with Perilla limonene synthase cDNA. J. Exp. Bot.
Peters他 (2000) Biochemistry;39(50): 15592-602
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning - a laboratory manual (2nd Edition). Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY Schardl CL, Byrd AD, Benzion G, Altschuler MA, Hildebrand DF, Hunt AG (1987)
Design And Construction Of A Versatile System For The Expression Of Foreign Genes In Plants. Gene 61: 1-11
Shirai, K., Masuda, K. and Oosawa, K. 2002. Cloning and Sequencing of Ent-kKaurene Synthase CDNA from Cucumber. Acta Hort. (ISHS) 588:317-320
Takahashi S, Zhao Y, O'Maille PE, Greenhagen BT, Noel JP, Coates RM, Chappell J (2005) Kinetic and molecular analysis of 5-epiaristolochene-1,3-dihydroxylase, a cytochrome P450 enzyme catalyzing successvie hydroxylations of sesquiterpenes. Journal of Biological Chemistry 280: 3686-3696
Tarshis LC, Yan MJ, Poulter CD, Sacchettini JC (1994) Crystal-Structure Of Recombinant Farnesyl Diphosphate Synthase At 2.6-Angstrom Resolution. Biochemistry 33: 10871-10877
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１Ａ】ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）及びセスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）をコードする導入遺伝子の双方で形質転換された系統のＧＣ−ＭＳ分析を示す図。
【図１Ｂ】対照タバコ系統のＧＣ−ＭＳ分析を示す図。
【図１Ｃ】クロマトグラムＡ中のピーク１０のＭＳによる分析を示す図。
【図１Ｄ】基準パチュロール（Ｄ）のＭＳによる分析を示す図。
【図２】ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）、セスキテルペン（パチュロール）シンターゼ（ＰＴＳ）、又は双方を過剰発現する再生産されたトランスジェニック植物系統中のｍＲＮＡ発現レベルを定量的に示す図。
【図３】再生産されたトランスジェニック植物中での免疫学的検出により測定された通りの、トランスジェニック植物中のパチュロールシンターゼ（ＰＴＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）及び融合タンパク質ＦＰＳ−ＰＴＳタンパク質のタンパク質発現レベル（ウェスタンブロッティング）を示す図。
【図４】異なる構成体で形質転換された植物の葉中のパチュロール含量を示す図。
【図５】植物のアグロバクテリウム ツメファシエンス(A. tumefaciens)媒介形質転換に適しているベクター（"ｐＢＤＯＮ"）の体制を示す図。
【図６Ａ】図５のベクターｐＢＤＯＮ中への部位−特異的な組換えにより挿入されるべき、ａｔｔｐ２とａｔｔｐ１配列との間に、１つの遺伝子を含んでなるヘルパーベクター（"ｐＴＭＯＮ"）を示す図。
【図６Ｂ】図５のベクターｐＢＤＯＮ中への部位−特異的な組換えにより挿入されるべき、ａｔｔｐ２とａｔｔｐ１配列との間に、それぞれ、２つの遺伝子を含んでなるヘルパーベクター（"ｐＴＤＵＡＬ"）を示す図。
【図７】異なる植物形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の体制を示す図。
【図８】ｐＢＤＯＮベクター（図５）の構成を略示的に示す図。
【図９】ｐＴＭＯＮヘルパーベクター（図６Ａ）の構成を略示的に示す図。
【図１０−Ｉ】ｐＴＤＵＡＬヘルパーベクター（図６Ｂ）の構成を略示的に示す図。
【図１０−ＩＩ】ｐＴＤＵＡＬヘルパーベクター（図６Ｂ）の構成を略示的に示す図。
【図１１】トランスジェニック植物における過剰発現のための（Ａ）リモネンシンターゼ（ＬＩＳ）及び（Ｂ）リモネンシンターゼ＋ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）発現ベクターの構成を略示的に示す図。
【図１２Ａ】ＰＴＳ、ＰＴＳ＋ＦＰＳ又はＰＴＳ−ＦＰＳ遺伝子融合で最初に遺伝子操作された(engineered)植物と、切断されたＨＭＧＲ（ΔＨＭＧＲ）遺伝子で遺伝子操作された植物との間で実施された遺伝子交雑を説明する図。
【図１２Ｂ】トランスジェニック植物中でのパチュロール蓄積への、ＰＴＳ及びＦＰＳの過剰発現との組合せでの、切断された(truncated)形のＨＭＧＲの過剰発現の寄与を説明する図。
【図１３Ａ】［１−13Ｃ］−グルコース上で成長した実生中でＭＥＰ又はＭＶＡ経路を経て生合成されたパチュロールにおける予測される13Ｃ標識パターンを示す図。
【図１３Ｂ】12Ｃ−グルコースが供給された植物により合成されたパチュロール（上部のパネル）、対、［１−13Ｃ］−グルコースからサイトゾル（真ん中）又は色素体（下部）の生合成に関して遺伝子操作された植物による合成について、ＭＳ親イオンを比較する図。
【図１４】モノテルペン（リモネン）シンターゼ（ＬＩＳ）をコードする導入遺伝子で形質転換された植物、及び更に加えてゲラニル二リン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を有する系統１ｄ及び３ａ中でのリモネン生産を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）をコードする導入遺伝子を発現する、植物。
【請求項２】
さらにプレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）をコードする導入遺伝子を発現する、請求項１記載の植物。
【請求項３】
導入遺伝子の産物が、植物の細胞のサイトゾルに向けられている、請求項１から２までのいずれか１項記載の植物。
【請求項４】
ＴＳが、モノテルペンシンターゼ及び／又はセスキテルペンシンターゼである、請求項１から３までのいずれか１項記載の植物。
【請求項５】
ＰＲＴをコードする遺伝子が、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）及び／又はファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）をコードする遺伝子である、請求項２、４、５及び／又は６のいずれか１項記載の植物。
【請求項６】
導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子が核遺伝子である、請求項１から５までのいずれか１項記載の植物。
【請求項７】
導入遺伝子を含んでない自然のままの植物に比較して、導入遺伝子によりコードされるＴＳにより合成されることができるテルペンを少なくとも１．２倍蓄積する、請求項１から６までのいずれか１項記載の植物。
【請求項８】
導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子によりコードされるＴＳにより合成されることができるテルペンを、新鮮な葉１gあたり少なくとも４００ng蓄積する、請求項１から７までのいずれか１項記載の形質転換植物。
【請求項９】
少なくとも１つのＰＲＴ及び／又は少なくとも１つのＴＳをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。
【請求項１０】
形質転換植物を製造する方法であって、前記方法は、
・付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、前記の付加的な遺伝子はＨＭＧＲ及びＴＳをコードし、及び
・前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる、形質転換植物を製造する方法。
【請求項１１】
形質転換植物を製造する方法であって、前記方法は、
・ＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体で一番目の植物材料を形質転換する段階；
・ＨＭＧＲをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる少なくとも１つのＤＮＡ構成体で二番目の植物材料を形質転換する段階；
・それぞれ、一番目及び二番目の形質転換植物材料から一番目及び二番目の植物を再生産する段階；
・一番目及び二番目の植物を交雑する段階；及び、
・交雑により得られた後代から、ＴＳをコードする遺伝子及びＨＭＧＲをコードする遺伝子の双方を含んでなる植物について選択する段階を含んでなる、形質転換植物を製造する方法。
【請求項１２】
ＴＳをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体が、又はＨＭＧＲをコードする遺伝子を含んでなる遺伝子構成体が、さらにＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
一番目及び／又は二番目の再生産された植物、又は一番目及び二番目の再生産された植物を交雑することから得られた植物を、ＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなるように形質転換された植物と交雑する段階をさらに含んでなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
植物中のテルペンの含量を改変する方法であって、前記方法が、請求項１０から１３までのいずれか１項記載の段階を含んでなる、植物中のテルペンの含量を改変する方法。
【請求項１５】
テルペンを生産する方法であって、前記方法が、請求項１から９までのいずれか１項記載の植物からか、又は請求項１１から１５までのいずれか１項記載の方法から得られた植物から、テルペンを単離する段階を含んでなる、テルペンを生産する方法。
【請求項１６】
改変されたテルペン含量を有する植物を生産するための、ＨＭＧＲ及びＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子の使用。
【請求項１７】
ＨＭＧＲ、ＴＳ及び存在する場合にはＰＲＴをコードする遺伝子が、色素体ターゲティング配列を欠いている核遺伝子である、請求項１から８までのいずれか１項記載の植物、請求項１０から１５までのいずれか１項記載の方法、及び／又は請求項１６記載の使用。
【請求項１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ（ＴＳ）をコードする導入遺伝子を発現する、植物。
【請求項２】
さらにプレニルトランスフェラーゼ（ＰＲＴ）をコードする導入遺伝子を発現する、請求項１記載の植物。
【請求項３】
導入遺伝子の産物が、植物の細胞のサイトゾルに向けられている、請求項１から２までのいずれか１項記載の植物。
【請求項４】
ＴＳが、モノテルペンシンターゼ及び／又はセスキテルペンシンターゼである、請求項１から３までのいずれか１項記載の植物。
【請求項５】
ＰＲＴをコードする遺伝子が、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＳ）及び／又はファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ）をコードする遺伝子である、請求項２、４、５及び／又は６のいずれか１項記載の植物。
【請求項６】
導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子が核遺伝子である、請求項１から５までのいずれか１項記載の植物。
【請求項７】
導入遺伝子を含んでない自然のままの植物に比較して、導入遺伝子によりコードされるＴＳにより合成されることができるテルペンを少なくとも１．２倍蓄積する、請求項１から６までのいずれか１項記載の植物。
【請求項８】
導入遺伝子及び／又は付加的な遺伝子によりコードされるＴＳにより合成されることができるテルペンを、新鮮な葉１gあたり少なくとも４００ng蓄積する、請求項１から７までのいずれか１項記載の形質転換植物。
【請求項９】
少なくとも１つのＰＲＴ及び／又は少なくとも１つのＴＳをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。
【請求項１０】
形質転換植物を製造する方法であって、前記方法は、
・付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、前記の付加的な遺伝子はＨＭＧＲ及びＴＳをコードし、及び
・前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる、形質転換植物を製造する方法。
【請求項１１】
形質転換植物を製造する方法であって、前記方法は、
・ＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体で一番目の植物材料を形質転換する段階；
・ＨＭＧＲをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる少なくとも１つのＤＮＡ構成体で二番目の植物材料を形質転換する段階；
・それぞれ、一番目及び二番目の形質転換植物材料から一番目及び二番目の植物を再生産する段階；
・一番目及び二番目の植物を交雑する段階；及び、
・交雑により得られた後代から、ＴＳをコードする遺伝子及びＨＭＧＲをコードする遺伝子の双方を含んでなる植物について選択する段階を含んでなる、形質転換植物を製造する方法。
【請求項１２】
ＴＳをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ構成体が、又はＨＭＧＲをコードする遺伝子を含んでなる遺伝子構成体が、さらにＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
一番目及び／又は二番目の再生産された植物、又は一番目及び二番目の再生産された植物を交雑することから得られた植物を、ＰＲＴをコードする遺伝子を含んでなるように形質転換された植物と交雑する段階をさらに含んでなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
植物中のテルペンの含量を改変する方法であって、前記方法が、請求項１０から１３までのいずれか１項記載の段階を含んでなる、植物中のテルペンの含量を改変する方法。
【請求項１５】
テルペンを生産する方法であって、前記方法が、請求項１から９までのいずれか１項記載の植物からか、又は請求項１１から１５までのいずれか１項記載の方法から得られた植物から、テルペンを単離する段階を含んでなる、テルペンを生産する方法。
【請求項１６】
改変されたテルペン含量を有する植物を生産するための、ＨＭＧＲ及びＴＳをコードする少なくとも１つの遺伝子の使用。
【請求項１７】
ＨＭＧＲ、ＴＳ及び存在する場合にはＰＲＴをコードする遺伝子が、色素体ターゲティング配列を欠いている核遺伝子である、請求項１から８までのいずれか１項記載の植物、請求項１０から１５までのいずれか１項記載の方法、及び／又は請求項１６記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−Ｉ】
【図１０−ＩＩ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−Ｉ】
【図１０−ＩＩ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５０００１２（Ｐ２００９−５０００１２Ａ）
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９０５０（Ｐ２００８−５１９０５０）
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０５２０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００４１０４
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０８００４５２４）ユニバーシティー オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＫＥＮＴＵＣＫＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ａ１４４ Ａｓｔｅｃｃ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ ４０５０６−０２８６， ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０５２０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００４１０４
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０８００４５２４）ユニバーシティー オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＫＥＮＴＵＣＫＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ａ１４４ Ａｓｔｅｃｃ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ ４０５０６−０２８６， ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
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