ラクトバチルス属細菌の定量方法
【課題】正確、簡便かつ迅速なラクトバチルス属細菌の定量が可能な、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法を提供する。
【解決手段】蛍光色素で標識された、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡにハイブリダイズさせる工程、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス属細菌を定量する工程、を含む、ラクトバチルス属細菌の定量方法。
【解決手段】蛍光色素で標識された、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡにハイブリダイズさせる工程、特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス属細菌を定量する工程、を含む、ラクトバチルス属細菌の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌の１種であるラクトバチルス属細菌は、ヒトの腸内、口腔内、表皮等に棲息するヒトの常在菌であり、ある種のラクトバチルス属細菌は免疫賦活など、ヒトに有益な機能をもたらす。また、ラクトバチルス属細菌は、ヨーグルト、乳酸菌飲料の製造など、飲食品製造において古くから用いられている。一方、ラクトバチルス属細菌は、酸性条件下にあっても耐酸性能・増殖能を有し、飲食品の汚染事故の原因菌ともなり得る。そのため、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保にあっては、ラクトバチルス属細菌の制御が非常に重要である。このように、ラクトバチルス属細菌は産業上功罪の両面を有する微生物であり、ラクトバチルス属細菌を正確に検出、定量する技術が求められている。
【０００３】
ラクトバチルス属細菌を検出する方法としては、特定の選択培地を用いて嫌気的に培養し、培地からラクトバチルス属細菌のＤＮＡを抽出し、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により特定領域のＤＮＡ断片を増幅し、確認する方法が知られている。特許文献１〜２及び非特許文献１には、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる、ラクトバチルス属細菌検出用核酸プライマーが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２１２１４０号公報
【特許文献２】特開２００８−２８９３７９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Walter J．et al.，Appl．Environ．Microbiol.，67，p．2578-2585，2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、正確、簡便かつ迅速なラクトバチルス属細菌の定量が可能な、ラクトバチルス属細菌の定量方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能な定量キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、特許文献１〜２及び非特許文献１に記載されている、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーについて検討を行った。その結果、後述の実施例でも示すように、前記プライマーを用いた場合、ラクトバチルス属細菌だけではなく、ヒトに対する病原性を有する白色ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）や、ヒトのニキビの原因菌の１種であるプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）も検出されることが明らかになった。したがって、特許文献１〜２及び非特許文献１に記載のプライマーを用いた従来の方法では、ラクトバチルス属細菌と、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスとを区別することができず、試料に含まれるラクトバチルス属細菌を正確に定量することができない。さらに、前記方法によりラクトバチルス属細菌を正確に定量するには、ラクトバチルス属細菌の同定工程が必要となり、迅速性に欠ける。
【０００８】
上記問題点に鑑み、本発明者は鋭意検討を行った。具体的には、プロピオニバクテリウム・アクネスの検出に配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが用いられているが（例えば、Eishi Y．et al.，J．Clin．Microbiol.，40，p．198-204，2002参照）、データベースで検索したところ、プロピオニバクテリウム・アクネス以外にラクトバチルス属細菌も配列番号３に記載の塩基配列を有することを見出した。さらに、ラクトバチルス属細菌、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスのうち、配列番号１〜３に記載の塩基配列全てを有するのは、ラクトバチルス属細菌のみであることを見出した。これらの知見に基づき、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに蛍光色素で標識された配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いて、プローブのハイブリダイゼーション及びＤＮＡ断片の増幅反応を行うことでラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見出した。さらには、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブに代えて、白色ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡには存在しない、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いることによっても、ラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び
測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、
を含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
【００１０】
また、本発明は、前記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の定量方法によれば、正確、簡便かつ迅速にラクトバチルス属細菌を定量することができる。また、本発明の定量キットは、前記方法に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）JCM 1132株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp．lactis）BCRC 11051株の１６Ｓ ｒＲＮＡの全塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図３】スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）ATCC 14990株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図４】スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Staphylococcus aureus subsp．aureus）ATCC 12600株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図５】プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）JCM 6473株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図６】実施例における、ラクトバチルス属細菌の定量結果を示す図である。
【図７】比較例における、ラクトバチルス属細菌の定量結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のラクトバチルス属細菌の定量方法は、蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、を含むものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
本発明の方法によれば、従来のラクトバチルス属細菌の検出方法においてラクトバチルス属細菌とともに検出される白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別でき、被検体に含まれるラクトバチルス属細菌を網羅的に定量することができる。
なお、本発明において、「ラクトバチルス属細菌の定量」とは、被検体におけるラクトバチルス属細菌密度の定量、被検体におけるラクトバチルス属細菌由来のＤＮＡ量の定量、などを特徴的に指すものとする。
また、本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１４】
本発明における「ラクトバチルス属細菌」とは、グラム陽性桿菌であり、乳酸を産生する微生物の総称である。ラクトバチルス属細菌としては、下記のものが知られているが、本発明はこれらに制限するものではない。
【００１５】
【表１】
【００１６】
発明者等は、図１〜５及び後述の実施例で示すように、ラクトバチルス属細菌、並びに白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の解析を行った。その結果、ラクトバチルス属細菌に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡの領域を見い出した。そして、この可変領域にハイブリダイズ可能な少なくとも３種のオリゴヌクレオチドを用いることにより、ラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見い出した。
【００１７】
本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する、ラクトバチルス属細菌類、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を図１〜５及び配列番号７〜１１に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号７〜１１に記載の塩基配列は、それぞれ、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）JCM 1132株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp．lactis）BCRC 11051株の１６Ｓ ｒＲＮＡの全塩基配列、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）ATCC 14990株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Staphylococcus aureus subsp．aureus）ATCC 12600株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列及びプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）JCM 6473株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を示す。
【００１８】
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac1 primerともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac2 primerともいう）はそれぞれ、図１〜２に示すように、配列番号７に記載の塩基配列のうち３３３位〜３５１位までの領域及び６６０位〜６７７位までの領域、並びに配列番号８に記載の塩基配列のうち３６７位〜３８５位までの領域及び６９４位〜７１１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、図３〜４に示すように、配列番号９及び１０に記載の塩基配列のうち６６２位〜６７９位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。しかし、配列番号９及び１０に記載の塩基配列には、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。さらに、図５に示すように、配列番号１１に記載の塩基配列には、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。
【００１９】
前記（ｃ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac3 probeともいう）は、図１〜２に示すように、配列番号７に記載の塩基配列のうち５２７位〜５５０位までの領域及び配列番号８に記載の塩基配列のうち５６１位〜５８４位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、図３〜４に示すように、配列番号９及び１０に記載の塩基配列には、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。また、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、図５に示すように、配列番号１１に記載の塩基配列のうち５１８位〜５４１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。
【００２０】
上記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の解析結果に基づき、蛍光色素で標識された、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせ、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅反応を行い、該増幅反応によって発光する蛍光の強度を検出することにより、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別して検体中のラクトバチルス属細菌を網羅的に定量する。
【００２１】
さらに、後述の実施例でも示すように、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を解析した結果、ほぼ全てのラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中に、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドの塩基配列と同じ配列が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域と前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域との間に存在することが明らかとなった。したがって、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブに代えて、前記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）からなるプローブを用いても、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別して検体中のラクトバチルス属細菌とを網羅的に定量することができることを見い出した。
【００２２】
本発明に用いる前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個）の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド又はハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法（Science，227，1435，1985）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２３】
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００２４】
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製したり、試薬メーカーから購入することができる。また、ラクトバチルス属細菌の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
【００２５】
前記プローブの標識に用いる蛍光色素は、オリゴヌクレオチドを標識して、核酸の測定及び検出に通常用いられるものを使用できる。具体的には、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類（例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）やテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）又はこれらの誘導体）、Ａｌｅｘａ類、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン（rhodamine）又はその誘導体（例えば、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミンＢ、ローダミン６ＧＰ、ローダミン３ＧＯ、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等）、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ｒｅｄ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）類（商標名；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製、米国）、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類が挙げられる。このうち、フルオレセイン又はその誘導体類が好ましく、ＦＡＭがより好ましい。
【００２６】
オリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識するには、通常の標識法のうちの所望のものを利用することができる（例えば、Nature Biotechnology、第14巻、第303〜308頁、1996年；Applied and Environmental Microbiology、第63巻、第1143〜1147頁、1997年；Nucleic acids Research、第24巻、第4532〜4535頁、1996年参照）。
例えば、5’末端に蛍光色素を結合させる場合は、先ず常法に従って5’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ2)n−ＳＨ基を導入する。この場合、ｎは３〜８の整数、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、オリゴヌクレオチドの3’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの3’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ2)n−ＮＨ2基を導入する。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば−(ＣＨ2)n−ＳＨ基を導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７の整数である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光体基又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、核酸プローブの鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（例えば、Analytical Biochemistry、第225巻、第32−38頁（1998年参照））。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００２７】
本発明に用いるプローブは、発光が抑制された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドであり、ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片の標的配列にハイブリダイズし、該配列の増幅反応により該蛍光色素が発光し、増幅反応中に蛍光が減衰しないものが好ましい。
【００２８】
標的核酸にハイブリダイズしたときに蛍光の発光を抑制するには通常の方法を採用することができる。例えば、２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブを用いる方法、蛍光標識されたプローブの末端においてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対形成時に蛍光発光が抑制される蛍光物質を用いる方法、などを採用することができる。
２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブを用いる場合、前記消光剤としては、その吸収スペクトルと前記蛍光色素の蛍光スペクトルとがオーバーラップするものが好ましく、具体的には、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ類（商標名、Biosearch Technologies社製）、ＱＸＬ５２０等のＱＸＬ類（商標名；ＡｎａＳｐｅｃ社）、Iowa black FQ（商品名）、Iowa black RQ（商品名）、ＢＯＤＩＰＹＦＬ及びＱＳＹ７ｄｙｅが挙げられ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡが好ましく、ＴＡＭＲＡがより好ましい。
蛍光標識されたプローブの末端においてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対形成時に蛍光発光が抑制される蛍光色素を用いる場合、前記蛍光色素の具体例としては、フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ボデピー類、ローダミン又はその誘導体（例えば、ＣＲ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
【００２９】
本発明に用いるプローブは、２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブが好ましく、5’末端側が蛍光色素で標識され、3’末端側が消光剤で修飾されており、ラクトバチルス属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光するプローブがより好ましい。
【００３０】
本発明において、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる１種又は２種以上のプローブを用いることができる。
本発明において、前記プローブをラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる条件としては特に制限はない。
【００３１】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片の増幅を行う。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが迅速性及び簡便性の観点から好ましい。
【００３２】
ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９０〜９８℃で１秒間〜１５分間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応及びＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０〜７０℃で１０〜９０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約２０〜４０サイクル行う。
【００３３】
ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては特に制限はなく、一般的に核酸増幅反応に使用できるものであればよい。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼの中には、エキソヌクレアーゼ活性を有するものがある。しかし、このようなＤＮＡポリメラーゼを用いると、増幅反応中に標識プローブを分解し、分解された標識プローブが非特異的にＤＮＡにハイブリダイズする場合がある。したがって、本発明において、エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
【００３４】
本発明において、前記増幅反応の際又は前記増幅反応の後、増幅反応により、プローブがハイブリダイズする標的核酸から遊離した蛍光色素の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定手段としては特に制限はなく、蛍光顕微鏡等通常の手段を採用することができる。
また、本発明において、前記増幅反応と蛍光強度の測定を同時（リアルタイム）に行う方法（例えば、リアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法）により行ってもよい。
【００３５】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、ラクトバチルス属細菌の定量を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００３６】
本発明のラクトバチルス属細菌の定量キットは、前記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含むものである。このキットは、ラクトバチルス属細菌の定量方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プローブ及びプライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、細菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
試験例１
インターネット上でRibosomal Database Project II（RDPII）（http://rdp.cme.msu.edu/）に公開されている解析ソフト（Probe mach）を用いて、同データベースに登録されているラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び／又は配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれているかの確認を行った。なお、解析方法は解析ソフトの操作方法に従った。その結果を表２〜４に示す。表２〜４において、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれている場合は「○」、含まれていない場合「−」と記載した。
さらに、同データベースに登録されているブドウ球菌科細菌、ブドウ球菌属細菌、乳酸桿菌科細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス科細菌、ロイコノストック科細菌、連鎖球菌科細菌及びプロピオニバクテリア科細菌の数、並びに、配列番号１〜６のいずれかに記載の各塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に含まれている細菌の数を確認した。その結果を表５〜６に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】
表２〜５に示したように、ほぼ全てのラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれることが明らかとなった。
これに対して、表５及び６に示したように、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、の両者とも１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に含むラクトバチルス属細菌以外の細菌類は存在しない。
このように、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれるのは、ラクトバチルス属細菌に限られることが判明した。
【００４５】
実施例
（１）プライマーの設計
配列番号１の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Lac1 primer）及び配列番号２の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Lac2 primer）を設計し、つくばオリゴ（株）に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
また、配列番号３の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブ（Lac3 probe）（5’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾し、3’末端を消光剤ＴＡＭＲＡで修飾したTaqMan PCR用プローブ）を、つくばオリゴ（株）に合成依頼し入手した。
【００４６】
（２）検体の調製
本発明の有効性の評価に用いる微生物としては、白色ブドウ球菌JCM2414T株、黄色ブドウ球菌JCM2413株、プロピオニバクテリウム・アクネスJCM6425株、ラクトバチルス・アシドフィルスJCM1021株、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティスJCM1107株を用いた。
白色ブドウ球菌JCM2414T株、黄色ブドウ球菌JCM2413株及びプロピオニバクテリウム・アクネスJCM6425株は、SCDLP寒天培地（日本製薬社製）にて３７℃で１日培養した。ラクトバチルス・アシドフィルスJCM1021株及びラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティスJCM1107株は、MRS寒天培地（和光純薬社製）にて３７℃で２日間培養した。
【００４７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、PBS溶液１ｍＬに懸濁後、14000rpmにて3分間遠心分離を行い、さらに上清を除去して、菌体を回収した。
回収した菌体に、下記表７に示す組成のDNA Isilation buffer２００μＬ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール水溶液（25:24:1[vol/vol/vol]、Invitrogen社）２００μＬ及び高圧滅菌したガラスビース（粒径約０．１ｍｍ、アズワン社）３００ｍｇを添加し、ボルテックスにて５分間攪拌した。14000rpm、２０℃で１０分間遠心分離を行い、水相１５０μＬを回収した。この水相に共沈剤（エタ沈メイト、和光純薬工業社）１μＬ及び３Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH5.2）１５μＬを添加した。さらに、１００％エタノールを３７５μＬ（回収量の２．５倍量）加え、14000rpm、４℃で１０分間、遠心分離してＤＮＡペレットとし、上清を除去した。沈殿に７０％エタノール２００μＬを添加し、14000rpm、４℃で１０分間遠心分離して沈殿の洗浄を行った。上清を除去して回収したＤＮＡペレットを滅菌水５０μＬに再溶解し、回収したＤＮＡを精製した。
なお、前記DNA Isilation bufferは、１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液２ｍＬ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１ｍＬ、１Ｍ ＮａＣｌ溶液１ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）溶液１ｍＬ及び滅菌水４ｍＬを混合し、フィルター滅菌して調製した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
（４）ラクトバチルス属細菌の定量
前記（３）で調製したゲノムＤＮＡ溶液をＤＮＡテンプレートとし、下記組成のＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液
ゲノムＤＮＡ溶液 ５μＬ
TaqMan Universal PCR Master Mix
（DNAポリメラーゼ試薬、商品名、アプライドバイオシステムズ社） １５μＬ
Lac1 primer（配列番号１） ２５０ｎＭ
Lac2 primer（配列番号２） ２５０ｎＭ
Lac3 probe（配列番号３) １００ｎＭ
滅菌水 バランス
全量 ３０μＬ
【００５０】
前記ＰＣＲ反応液について、下記PCR条件で、リアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりＰＣＲ反応を行い、下記蛍光検出装置及び制御ソフトウェアを用いてＤＮＡ量の定量を行っった。
＜PCR条件＞
1.変性温度：95℃、10分
2.変性温度：95℃、15秒
3.アニール及び伸長反応温度：60℃、60秒
（上記2〜3の反応を最大40サイクル繰り返した。）
＜蛍光検出装置＞
7500 Real Time PCR System（商品名、アプライドバイオシステムズ社）
＜制御ソフトウェア＞
7500 System SDS Software（商品名、アプライドバイオシステムズ社）
定量結果を図６に示す。
【００５１】
図６の結果からも明らかなように、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを組み合わせて用いることにより、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡ断片を増幅させることなくラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ断片のみが増幅され、ＤＮＡ断片の増幅に伴って傾向強度も増大し、正確な乳酸菌の定量が可能となることが確認された。
【００５２】
比較例
DNAポリメラーゼ試薬としてTaqMan Universal PCR Master Mixに代えてPower SYBR Green Master Mix（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、Lac3 probeをＰＣＲ反応液には添加しなかったこと以外は同様にして、実施例と同様の試験操作を行った。その結果を図７に示す。
【００５３】
図７の結果からも明らかなように、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーのみを用いてＤＮＡ断片の増幅を行った場合、ラクトバチルス属細菌だけではなく、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡも増幅されてしまう。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いた従来のラクトバチルス属細菌の検出方法では、ラクトバチルス属細菌を特異的に検出することはできず、ラクトバチルス属細菌の定量を正確に行うこともできない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌の１種であるラクトバチルス属細菌は、ヒトの腸内、口腔内、表皮等に棲息するヒトの常在菌であり、ある種のラクトバチルス属細菌は免疫賦活など、ヒトに有益な機能をもたらす。また、ラクトバチルス属細菌は、ヨーグルト、乳酸菌飲料の製造など、飲食品製造において古くから用いられている。一方、ラクトバチルス属細菌は、酸性条件下にあっても耐酸性能・増殖能を有し、飲食品の汚染事故の原因菌ともなり得る。そのため、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保にあっては、ラクトバチルス属細菌の制御が非常に重要である。このように、ラクトバチルス属細菌は産業上功罪の両面を有する微生物であり、ラクトバチルス属細菌を正確に検出、定量する技術が求められている。
【０００３】
ラクトバチルス属細菌を検出する方法としては、特定の選択培地を用いて嫌気的に培養し、培地からラクトバチルス属細菌のＤＮＡを抽出し、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により特定領域のＤＮＡ断片を増幅し、確認する方法が知られている。特許文献１〜２及び非特許文献１には、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる、ラクトバチルス属細菌検出用核酸プライマーが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２１２１４０号公報
【特許文献２】特開２００８−２８９３７９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Walter J．et al.，Appl．Environ．Microbiol.，67，p．2578-2585，2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、正確、簡便かつ迅速なラクトバチルス属細菌の定量が可能な、ラクトバチルス属細菌の定量方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能な定量キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、特許文献１〜２及び非特許文献１に記載されている、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーについて検討を行った。その結果、後述の実施例でも示すように、前記プライマーを用いた場合、ラクトバチルス属細菌だけではなく、ヒトに対する病原性を有する白色ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）や、ヒトのニキビの原因菌の１種であるプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）も検出されることが明らかになった。したがって、特許文献１〜２及び非特許文献１に記載のプライマーを用いた従来の方法では、ラクトバチルス属細菌と、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスとを区別することができず、試料に含まれるラクトバチルス属細菌を正確に定量することができない。さらに、前記方法によりラクトバチルス属細菌を正確に定量するには、ラクトバチルス属細菌の同定工程が必要となり、迅速性に欠ける。
【０００８】
上記問題点に鑑み、本発明者は鋭意検討を行った。具体的には、プロピオニバクテリウム・アクネスの検出に配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが用いられているが（例えば、Eishi Y．et al.，J．Clin．Microbiol.，40，p．198-204，2002参照）、データベースで検索したところ、プロピオニバクテリウム・アクネス以外にラクトバチルス属細菌も配列番号３に記載の塩基配列を有することを見出した。さらに、ラクトバチルス属細菌、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスのうち、配列番号１〜３に記載の塩基配列全てを有するのは、ラクトバチルス属細菌のみであることを見出した。これらの知見に基づき、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに蛍光色素で標識された配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いて、プローブのハイブリダイゼーション及びＤＮＡ断片の増幅反応を行うことでラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見出した。さらには、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブに代えて、白色ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡには存在しない、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いることによっても、ラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び
測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、
を含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
【００１０】
また、本発明は、前記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の定量方法によれば、正確、簡便かつ迅速にラクトバチルス属細菌を定量することができる。また、本発明の定量キットは、前記方法に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）JCM 1132株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図２】ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp．lactis）BCRC 11051株の１６Ｓ ｒＲＮＡの全塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図３】スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）ATCC 14990株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図４】スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Staphylococcus aureus subsp．aureus）ATCC 12600株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図５】プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）JCM 6473株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、及び前記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列における本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図６】実施例における、ラクトバチルス属細菌の定量結果を示す図である。
【図７】比較例における、ラクトバチルス属細菌の定量結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のラクトバチルス属細菌の定量方法は、蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、を含むものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
本発明の方法によれば、従来のラクトバチルス属細菌の検出方法においてラクトバチルス属細菌とともに検出される白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別でき、被検体に含まれるラクトバチルス属細菌を網羅的に定量することができる。
なお、本発明において、「ラクトバチルス属細菌の定量」とは、被検体におけるラクトバチルス属細菌密度の定量、被検体におけるラクトバチルス属細菌由来のＤＮＡ量の定量、などを特徴的に指すものとする。
また、本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１４】
本発明における「ラクトバチルス属細菌」とは、グラム陽性桿菌であり、乳酸を産生する微生物の総称である。ラクトバチルス属細菌としては、下記のものが知られているが、本発明はこれらに制限するものではない。
【００１５】
【表１】
【００１６】
発明者等は、図１〜５及び後述の実施例で示すように、ラクトバチルス属細菌、並びに白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の解析を行った。その結果、ラクトバチルス属細菌に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡの領域を見い出した。そして、この可変領域にハイブリダイズ可能な少なくとも３種のオリゴヌクレオチドを用いることにより、ラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見い出した。
【００１７】
本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する、ラクトバチルス属細菌類、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を図１〜５及び配列番号７〜１１に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号７〜１１に記載の塩基配列は、それぞれ、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）JCM 1132株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp．lactis）BCRC 11051株の１６Ｓ ｒＲＮＡの全塩基配列、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）ATCC 14990株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Staphylococcus aureus subsp．aureus）ATCC 12600株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列及びプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）JCM 6473株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を示す。
【００１８】
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac1 primerともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac2 primerともいう）はそれぞれ、図１〜２に示すように、配列番号７に記載の塩基配列のうち３３３位〜３５１位までの領域及び６６０位〜６７７位までの領域、並びに配列番号８に記載の塩基配列のうち３６７位〜３８５位までの領域及び６９４位〜７１１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、図３〜４に示すように、配列番号９及び１０に記載の塩基配列のうち６６２位〜６７９位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。しかし、配列番号９及び１０に記載の塩基配列には、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。さらに、図５に示すように、配列番号１１に記載の塩基配列には、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。
【００１９】
前記（ｃ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac3 probeともいう）は、図１〜２に示すように、配列番号７に記載の塩基配列のうち５２７位〜５５０位までの領域及び配列番号８に記載の塩基配列のうち５６１位〜５８４位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、図３〜４に示すように、配列番号９及び１０に記載の塩基配列には、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。また、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、図５に示すように、配列番号１１に記載の塩基配列のうち５１８位〜５４１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。
【００２０】
上記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の解析結果に基づき、蛍光色素で標識された、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせ、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅反応を行い、該増幅反応によって発光する蛍光の強度を検出することにより、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別して検体中のラクトバチルス属細菌を網羅的に定量する。
【００２１】
さらに、後述の実施例でも示すように、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を解析した結果、ほぼ全てのラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中に、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドの塩基配列と同じ配列が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域と前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域との間に存在することが明らかとなった。したがって、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブに代えて、前記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）からなるプローブを用いても、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別して検体中のラクトバチルス属細菌とを網羅的に定量することができることを見い出した。
【００２２】
本発明に用いる前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個）の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド又はハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法（Science，227，1435，1985）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２３】
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００２４】
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製したり、試薬メーカーから購入することができる。また、ラクトバチルス属細菌の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
【００２５】
前記プローブの標識に用いる蛍光色素は、オリゴヌクレオチドを標識して、核酸の測定及び検出に通常用いられるものを使用できる。具体的には、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類（例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）やテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）又はこれらの誘導体）、Ａｌｅｘａ類、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン（rhodamine）又はその誘導体（例えば、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミンＢ、ローダミン６ＧＰ、ローダミン３ＧＯ、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等）、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ｒｅｄ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）類（商標名；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製、米国）、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類が挙げられる。このうち、フルオレセイン又はその誘導体類が好ましく、ＦＡＭがより好ましい。
【００２６】
オリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識するには、通常の標識法のうちの所望のものを利用することができる（例えば、Nature Biotechnology、第14巻、第303〜308頁、1996年；Applied and Environmental Microbiology、第63巻、第1143〜1147頁、1997年；Nucleic acids Research、第24巻、第4532〜4535頁、1996年参照）。
例えば、5’末端に蛍光色素を結合させる場合は、先ず常法に従って5’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ2)n−ＳＨ基を導入する。この場合、ｎは３〜８の整数、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、オリゴヌクレオチドの3’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの3’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ2)n−ＮＨ2基を導入する。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば−(ＣＨ2)n−ＳＨ基を導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７の整数である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光体基又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、核酸プローブの鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（例えば、Analytical Biochemistry、第225巻、第32−38頁（1998年参照））。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００２７】
本発明に用いるプローブは、発光が抑制された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドであり、ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片の標的配列にハイブリダイズし、該配列の増幅反応により該蛍光色素が発光し、増幅反応中に蛍光が減衰しないものが好ましい。
【００２８】
標的核酸にハイブリダイズしたときに蛍光の発光を抑制するには通常の方法を採用することができる。例えば、２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブを用いる方法、蛍光標識されたプローブの末端においてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対形成時に蛍光発光が抑制される蛍光物質を用いる方法、などを採用することができる。
２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブを用いる場合、前記消光剤としては、その吸収スペクトルと前記蛍光色素の蛍光スペクトルとがオーバーラップするものが好ましく、具体的には、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ類（商標名、Biosearch Technologies社製）、ＱＸＬ５２０等のＱＸＬ類（商標名；ＡｎａＳｐｅｃ社）、Iowa black FQ（商品名）、Iowa black RQ（商品名）、ＢＯＤＩＰＹＦＬ及びＱＳＹ７ｄｙｅが挙げられ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡが好ましく、ＴＡＭＲＡがより好ましい。
蛍光標識されたプローブの末端においてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対形成時に蛍光発光が抑制される蛍光色素を用いる場合、前記蛍光色素の具体例としては、フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ボデピー類、ローダミン又はその誘導体（例えば、ＣＲ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
【００２９】
本発明に用いるプローブは、２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブが好ましく、5’末端側が蛍光色素で標識され、3’末端側が消光剤で修飾されており、ラクトバチルス属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光するプローブがより好ましい。
【００３０】
本発明において、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる１種又は２種以上のプローブを用いることができる。
本発明において、前記プローブをラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる条件としては特に制限はない。
【００３１】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片の増幅を行う。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが迅速性及び簡便性の観点から好ましい。
【００３２】
ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９０〜９８℃で１秒間〜１５分間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応及びＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０〜７０℃で１０〜９０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約２０〜４０サイクル行う。
【００３３】
ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては特に制限はなく、一般的に核酸増幅反応に使用できるものであればよい。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼの中には、エキソヌクレアーゼ活性を有するものがある。しかし、このようなＤＮＡポリメラーゼを用いると、増幅反応中に標識プローブを分解し、分解された標識プローブが非特異的にＤＮＡにハイブリダイズする場合がある。したがって、本発明において、エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
【００３４】
本発明において、前記増幅反応の際又は前記増幅反応の後、増幅反応により、プローブがハイブリダイズする標的核酸から遊離した蛍光色素の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定手段としては特に制限はなく、蛍光顕微鏡等通常の手段を採用することができる。
また、本発明において、前記増幅反応と蛍光強度の測定を同時（リアルタイム）に行う方法（例えば、リアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法）により行ってもよい。
【００３５】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、ラクトバチルス属細菌の定量を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００３６】
本発明のラクトバチルス属細菌の定量キットは、前記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含むものである。このキットは、ラクトバチルス属細菌の定量方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プローブ及びプライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、細菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
試験例１
インターネット上でRibosomal Database Project II（RDPII）（http://rdp.cme.msu.edu/）に公開されている解析ソフト（Probe mach）を用いて、同データベースに登録されているラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び／又は配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれているかの確認を行った。なお、解析方法は解析ソフトの操作方法に従った。その結果を表２〜４に示す。表２〜４において、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれている場合は「○」、含まれていない場合「−」と記載した。
さらに、同データベースに登録されているブドウ球菌科細菌、ブドウ球菌属細菌、乳酸桿菌科細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス科細菌、ロイコノストック科細菌、連鎖球菌科細菌及びプロピオニバクテリア科細菌の数、並びに、配列番号１〜６のいずれかに記載の各塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に含まれている細菌の数を確認した。その結果を表５〜６に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】
表２〜５に示したように、ほぼ全てのラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれることが明らかとなった。
これに対して、表５及び６に示したように、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、の両者とも１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に含むラクトバチルス属細菌以外の細菌類は存在しない。
このように、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれるのは、ラクトバチルス属細菌に限られることが判明した。
【００４５】
実施例
（１）プライマーの設計
配列番号１の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Lac1 primer）及び配列番号２の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Lac2 primer）を設計し、つくばオリゴ（株）に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
また、配列番号３の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブ（Lac3 probe）（5’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾し、3’末端を消光剤ＴＡＭＲＡで修飾したTaqMan PCR用プローブ）を、つくばオリゴ（株）に合成依頼し入手した。
【００４６】
（２）検体の調製
本発明の有効性の評価に用いる微生物としては、白色ブドウ球菌JCM2414T株、黄色ブドウ球菌JCM2413株、プロピオニバクテリウム・アクネスJCM6425株、ラクトバチルス・アシドフィルスJCM1021株、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティスJCM1107株を用いた。
白色ブドウ球菌JCM2414T株、黄色ブドウ球菌JCM2413株及びプロピオニバクテリウム・アクネスJCM6425株は、SCDLP寒天培地（日本製薬社製）にて３７℃で１日培養した。ラクトバチルス・アシドフィルスJCM1021株及びラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティスJCM1107株は、MRS寒天培地（和光純薬社製）にて３７℃で２日間培養した。
【００４７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、PBS溶液１ｍＬに懸濁後、14000rpmにて3分間遠心分離を行い、さらに上清を除去して、菌体を回収した。
回収した菌体に、下記表７に示す組成のDNA Isilation buffer２００μＬ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール水溶液（25:24:1[vol/vol/vol]、Invitrogen社）２００μＬ及び高圧滅菌したガラスビース（粒径約０．１ｍｍ、アズワン社）３００ｍｇを添加し、ボルテックスにて５分間攪拌した。14000rpm、２０℃で１０分間遠心分離を行い、水相１５０μＬを回収した。この水相に共沈剤（エタ沈メイト、和光純薬工業社）１μＬ及び３Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH5.2）１５μＬを添加した。さらに、１００％エタノールを３７５μＬ（回収量の２．５倍量）加え、14000rpm、４℃で１０分間、遠心分離してＤＮＡペレットとし、上清を除去した。沈殿に７０％エタノール２００μＬを添加し、14000rpm、４℃で１０分間遠心分離して沈殿の洗浄を行った。上清を除去して回収したＤＮＡペレットを滅菌水５０μＬに再溶解し、回収したＤＮＡを精製した。
なお、前記DNA Isilation bufferは、１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液２ｍＬ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１ｍＬ、１Ｍ ＮａＣｌ溶液１ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）溶液１ｍＬ及び滅菌水４ｍＬを混合し、フィルター滅菌して調製した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
（４）ラクトバチルス属細菌の定量
前記（３）で調製したゲノムＤＮＡ溶液をＤＮＡテンプレートとし、下記組成のＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液
ゲノムＤＮＡ溶液 ５μＬ
TaqMan Universal PCR Master Mix
（DNAポリメラーゼ試薬、商品名、アプライドバイオシステムズ社） １５μＬ
Lac1 primer（配列番号１） ２５０ｎＭ
Lac2 primer（配列番号２） ２５０ｎＭ
Lac3 probe（配列番号３) １００ｎＭ
滅菌水 バランス
全量 ３０μＬ
【００５０】
前記ＰＣＲ反応液について、下記PCR条件で、リアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりＰＣＲ反応を行い、下記蛍光検出装置及び制御ソフトウェアを用いてＤＮＡ量の定量を行っった。
＜PCR条件＞
1.変性温度：95℃、10分
2.変性温度：95℃、15秒
3.アニール及び伸長反応温度：60℃、60秒
（上記2〜3の反応を最大40サイクル繰り返した。）
＜蛍光検出装置＞
7500 Real Time PCR System（商品名、アプライドバイオシステムズ社）
＜制御ソフトウェア＞
7500 System SDS Software（商品名、アプライドバイオシステムズ社）
定量結果を図６に示す。
【００５１】
図６の結果からも明らかなように、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを組み合わせて用いることにより、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡ断片を増幅させることなくラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ断片のみが増幅され、ＤＮＡ断片の増幅に伴って傾向強度も増大し、正確な乳酸菌の定量が可能となることが確認された。
【００５２】
比較例
DNAポリメラーゼ試薬としてTaqMan Universal PCR Master Mixに代えてPower SYBR Green Master Mix（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、Lac3 probeをＰＣＲ反応液には添加しなかったこと以外は同様にして、実施例と同様の試験操作を行った。その結果を図７に示す。
【００５３】
図７の結果からも明らかなように、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーのみを用いてＤＮＡ断片の増幅を行った場合、ラクトバチルス属細菌だけではなく、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡも増幅されてしまう。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いた従来のラクトバチルス属細菌の検出方法では、ラクトバチルス属細菌を特異的に検出することはできず、ラクトバチルス属細菌の定量を正確に行うこともできない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び
測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、
を含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う、請求項２記載の定量方法。
【請求項３】
前記増幅反応及び前記蛍光強度の測定をリアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う、請求項１又は２記載の定量方法。
【請求項４】
前記プローブの5’末端側が蛍光色素で標識され、前記プローブの3’末端側が消光剤で修飾されており、前記プローブがラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光する、請求項１〜３のいずれか記載の定量方法。
【請求項５】
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量キット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
【請求項６】
前記プローブの5’末端側が蛍光色素で標識され、前記プローブの3’末端側が消光剤で修飾されており、前記プローブがラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光する、請求項５記載の定量キット。
【請求項１】
蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び
測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、
を含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う、請求項２記載の定量方法。
【請求項３】
前記増幅反応及び前記蛍光強度の測定をリアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う、請求項１又は２記載の定量方法。
【請求項４】
前記プローブの5’末端側が蛍光色素で標識され、前記プローブの3’末端側が消光剤で修飾されており、前記プローブがラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光する、請求項１〜３のいずれか記載の定量方法。
【請求項５】
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量キット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
【請求項６】
前記プローブの5’末端側が蛍光色素で標識され、前記プローブの3’末端側が消光剤で修飾されており、前記プローブがラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光する、請求項５記載の定量キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１８７０６７（Ｐ２０１２−１８７０６７Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４２５（Ｐ２０１１−５４４２５）
【出願日】平成２３年３月１１日（２０１１．３．１１）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１１日（２０１１．３．１１）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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