リンパ球の製造方法
【課題】養子免疫療法に適用可能なリンパ球を効率よく製造する手段を提供すること。
【解決手段】（１）５μｇ／ｍＬ未満の抗ＣＤ３抗体溶液を使用して前記抗体を固定化した固相、及び／又は（２）２５μｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液を使用して前記ポリペプチドを固定化した固相、と接触させた状態でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することを特徴とするリンパ球の製造方法を提供する。前記方法により、生体への生着率、表現型の維持能力において優れたリンパ球を効率よく製造することが可能となる。
【解決手段】（１）５μｇ／ｍＬ未満の抗ＣＤ３抗体溶液を使用して前記抗体を固定化した固相、及び／又は（２）２５μｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液を使用して前記ポリペプチドを固定化した固相、と接触させた状態でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することを特徴とするリンパ球の製造方法を提供する。前記方法により、生体への生着率、表現型の維持能力において優れたリンパ球を効率よく製造することが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なリンパ球の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８マーカーを有するＣＤ８Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型あるいはＴｈ２型に分化する。ＣＤ８Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名：キラーＴ細胞、以下、ＣＴＬと記載することがある］に分化する。
【０００４】
例えば、癌の病態において、外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４の治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等から種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。
【０００５】
免疫療法の中で、体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等からＩＬ（インターロイキン）−２と抗ＣＤ３抗体の作用により拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞を移入する療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるか等の問題については、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することによる効果が、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献１〜４）。
【０００６】
近年、免疫療法に使用されるＴリンパ球は、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞を投与した方が、生体への投与においてはるかに高い治療効果が期待できることが報告されている（例えば非特許文献１）。更に、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法などにおいても、例えば癌が進行した患者の体内ではＣＴＬに誘導されうる元となるナイーブＴ細胞が少ないと考えられるため、充分な効果が期待できないことが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００７／１４２３００号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．（ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション）２００５年、第１１５巻、第１６１６〜１６２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用が奏されることについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献１〜４）。しかしながら、養子免疫療法が多様化しているという現状を考えた場合、上記文献の方法以外の、さらなる細胞増殖方法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らはリンパ球の培養、特に拡大培養の諸条件について鋭意検討を重ね、効率のよいリンパ球製造の条件を見出し、本発明を完成させた。更に、本発明の方法により製造されたリンパ球は、長いテロメアを保持していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下にリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する工程を包含するリンパ球の製造方法であって、
（１）５μｇ／ｍＬ未満の抗ＣＤ３抗体溶液を使用して前記抗体を固定化した固相、及び／又は
（２）２５μｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液を使用して前記ポリペプチドを固定化した固相
と接触させた状態でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することを特徴とするリンパ球の製造方法、
［２］固相が細胞培養用器材又は細胞培養用担体である［１］の方法、
［３］フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＶＬＡ−４結合活性、ＶＬＡ−５結合活性、へパリン結合活性から選択される結合活性を有するものである［１］の方法、
［４］フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＣＳ−１ドメイン、細胞接着ドメイン、へパリン結合ドメインから選択されるフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するものである［１］の方法、
［５］フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが配列表の配列番号９〜３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである［４］の方法、
［６］リンパ球が抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である［１］の方法、及び
［７］リンパ球に外来遺伝子を導入する工程を更に包含する［１］の方法、
に関する。
また、抗ＣＤ３抗体の単独刺激下で得られたリンパ球と比較して、テロメアが長い［１］記載の方法で得られたリンパ球に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、効率的なリンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は基礎研究や医療分野への多大な貢献が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法に関する。
本発明は、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを使用するリンパ球の製造方法において、前記の有効成分を固相に固定化する際の濃度について鋭意検討し、完成するに至ったものである。
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明に使用される、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド
本発明には、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、例えばフィブロネクチンのフラグメントを使用することができる。フィブロネクチンのフラグメントは天然から得られたもの、又は人為的に合成されたもの、遺伝子工学的に調製されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンのフラグメントを調製するための情報であるフィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００１５】
本発明において、フィブロネクチン フラグメントとしては、例えば、ＩＩＩ−８（配列番号１）、ＩＩＩ−９（配列番号２）、ＩＩＩ−１０（配列番号３）、ＩＩＩ−１１（配列番号４）、ＩＩＩ−１２（配列番号５）、ＩＩＩ−１３（配列番号６）、ＩＩＩ−１４（配列番号７）、及びＣＳ−１（配列番号８）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドや、前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドが例示される。フラグメントの長さとしては、例えば、アミノ酸の数として２０〜１０００が好ましく、１００〜８００がより好ましい。なお、本明細書において、複数個とは数個を含む概念であり、２〜１２個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜８個が更に好ましく、以下においても同様である。
【００１６】
また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性及び／又はヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００１７】
更にフィブロネクチン フラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列番号９）、Ｈ−２７１（配列番号１０）、Ｈ−２９６（配列番号１１）、ＣＨ−２７１（配列番号１２）、ＣＨ−２９６（配列番号１３）、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１４）、及びＣＨ−２９６Ｎａ（配列番号１５）からなる群より選択されるポリペプチドが例示される。
【００１８】
上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６Ｎａ、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６ＮａはＶＬＡ−４に結合する活性を有するＣＳ−１を有するポリペプチドである。更に、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６及びＣＨ−２９６Ｎａはヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。なお、ＣＨ−２９６Ｎａは血漿由来のフィブロネクチンにおける細胞結合ドメインからＣＳ−１までを含むポリペプチドである。
【００１９】
本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列番号１６）、ＣＨＶ−９０（配列番号１７）、ＣＨＶ−９２（配列番号１８）、あるいは二つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列番号１９）、ＣＨＶ−１８１（配列番号２０）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。
【００２０】
また、上記の各フラグメントに更にアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列番号２１）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。
【００２１】
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる組換えフィブロネクチン フラグメントであってもよい。
【００２２】
更に、本発明には、組換えフィブロネクチン フラグメントのほかに、改変型組換えフィブロネクチン フラグメントを使用することができる。この改変型組換えフィブロネクチン フラグメントは、同一のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を分子内に複数個含有するポリペプチドである。
【００２３】
前記の改変型組換えフィブロネクチン フラグメント（以下改変型フラグメントと記載する）の一例としては、２個以上のアミノ酸配列（ｍ）、１個以上のアミノ酸配列（ｎ）を必須領域として含むポリペプチドである。ここで、アミノ酸配列（ｍ）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部である配列番号５〜７から選択される１もしくは複数個のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列である。ただし、アミノ酸配列（ｍ）は配列番号５〜７で表されるそれぞれの同じ配列を２個以上含まないアミノ酸配列であり、配列番号５〜７で表されるアミノ酸配列の組み合わせで構成されるアミノ酸配列である。例えば、アミノ酸配列（ｍ）は、配列番号５で表されるアミノ酸配列を２個以上含まず、また配列番号６もしくは７で表されるアミノ酸配列についても同様である。また、当該ポリペプチドに存在する２個以上のアミノ酸配列（ｍ）はそれぞれ同一のアミノ酸配列を示す。
【００２４】
当該アミノ酸配列（ｍ）としては、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。ヘパリン結合活性の測定は前記の方法により実施できる。
【００２５】
アミノ酸配列（ｍ）は改変型フラグメント中に、例えば２〜５個、好適には２〜４個、より好適には２〜３個含有されていることが好ましい。
【００２６】
アミノ酸配列（ｎ）は、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインである配列番号８で表されるアミノ酸配列である。アミノ酸配列（ｎ）は改変型フラグメント中に、例えば１〜５個、好適には１〜４個、より好適には１〜３個含有されていることが好ましく、好適には改変型フラグメント中に含まれるアミノ酸配列（ｍ）と同じ個数含有されていることが好ましい。
【００２７】
改変型フラグメント中の２個以上のアミノ酸配列（ｍ）と１個以上のアミノ酸配列（ｎ）の位置関係については、本発明の所望の効果が得られるものであれば、特に限定はないが、例えば少なくとも１つのアミノ酸配列（ｍ）に対してＣ末端側にアミノ酸配列（ｎ）が連結されているものが好ましい。また、改変型フラグメント中のＮ末端側にはアミノ酸配列（ｍ）が位置しており、Ｃ末端側にはアミノ酸配列（ｎ）が位置していることが好ましい。より好適には、改変型フラグメント中において、アミノ酸配列（ｍ）とアミノ酸配列（ｎ）が交互に位置していることが好ましい。
【００２８】
この改変型フラグメントを構成するアミノ酸数としては、特に限定はないが、好適には１００〜３０００アミノ酸、より好適には１５０〜２８００アミノ酸、更に好適には２００〜２６００アミノ酸である。
【００２９】
更に、改変型フラグメントは本発明の所望の効果が得られるものであれば、その他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。例えば、メチオニンやＨｉｓタグ配列、リンカー等に由来するアミノ酸残基が含まれていても良い。改変型フラグメントポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも、所望の効果を有する限り本発明に使用することができる。
【００３０】
本発明において、改変型フラグメントとしては、例えば配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５）、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２７１−Ｈ２９６）、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２７１）、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ）が例示される。
【００３１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３２】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３３】
ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アスパラギン酸、リジン、プロリン、セリン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アスパラギン酸、リジン、プロリン、セリン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３４】
Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３５】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３６】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる
Ｈ１０５−Ｈ１０５は、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。
【００３７】
Ｈ２７１−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３８】
Ｈ２９６−Ｈ２７１は、Ｎ末端側から順に、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４で構成されるポリペプチドである。
【００３９】
１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１３のＣ末端側の１５アミノ酸、ＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、アラニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００４０】
１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５は、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。
【００４１】
Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、アラニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。なお、当該ポリペプチドは、前述のＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴと比較して、ＣＳ−１とＩＩＩ−１４の間に含まれるリンカー部分の２アミノ酸が異なるのみである。
【００４２】
Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃは、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。なお、当該ポリペプチドは、前述のＨ１０５−Ｈ１０５と比較して、ＣＳ−１とＩＩＩ−１４の間に含まれるリンカー部分の２アミノ酸が異なるのみである。
（２）リンパ球の製造方法
以下、本発明のリンパ球の製造方法について具体的に説明する。
【００４３】
本発明のリンパ球の製造方法は、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下にリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する工程を包含する方法である。抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、リンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する際に使用される固相、例えば細胞培養用器材や細胞培養用担体の表面に固定化して使用される。
【００４４】
従来、例えば抗ＣＤ３抗体は５μｇ／ｍＬの濃度の溶液を固定化すべき固相と接触されることにより、固定化処理が実施されてきた。本発明者らはこの抗ＣＤ３抗体溶液の濃度を５μｇ／ｍＬ未満とした場合であっても、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドを共存させた場合には実質的にリンパ球の増殖率の低下が起こらないことを見出した。すなわち、その効果を低下させることなく抗ＣＤ３抗体の使用量を低減させることが可能であることを見出した。
【００４５】
本発明に使用される抗ＣＤ３抗体としては、特に本発明を限定するものではないが、好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、より好適にはＯＫＴ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）、１９７９年、第２０６巻、第３４７〜３４９頁］が例示される。
【００４６】
抗ＣＤ３抗体の固定化は公知の方法で実施すればよいが、例えば、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンのフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。固定化に使用される溶液中の抗ＣＤ３抗体の濃度は０μｇ／ｍＬ超かつ５μｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは０．００１〜３μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜２μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．１〜１μｇ／ｍＬの濃度のＣＤ３抗体溶液で固定化が実施される。
【００４７】
抗ＣＤ３抗体を固定化する固相は、細胞培養に使用可能であり、リンパ球又はリンパ球の前駆細胞の培養の際に前記の細胞に接触するものであれば限定はない。例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養器材（開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に抗ＣＤ３抗体を固定化することができる。
【００４８】
本発明には、抗ＣＤ３抗体とともに前記（１）に記載されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが使用される。当該ポリペプチドを固相に固定化する際には、従来、リンパ球の培養時の固定化に使用されていた濃度（例えば２５μｇ／ｍＬ）の溶液を使用することができる。固定化時のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液の濃度は、所望のリンパ球の増殖率が得られるように適宜設定すればよい。フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの共存により、抗ＣＤ３抗体の固定化量の減少によるリンパ球の増殖率の低下が抑制される。例えば、固相の固定化に使用する溶液中の抗ＣＤ３抗体の濃度を０．０１〜３μｇ／ｍＬとした場合であっても、当該固相について１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは５μｇ／ｍＬ以上の濃度のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液による固定化処理を行っておけば、従来の抗ＣＤ３抗体の固定化量で達成される増殖率に匹敵するリンパ球の増殖率が得られる。
【００４９】
本発明の他の態様においては、前記（１）に記載されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固相への固定化が従来よりも低濃度のポリペプチドを含有する溶液で実施される。固定化に使用される溶液中のポリペプチドの濃度は０μｇ／ｍＬ超かつ２５μｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは０．５〜１５μｇ／ｍＬ、特に好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬの濃度の溶液が使用される。本態様では、抗ＣＤ３抗体の固定化に使用される溶液中の抗ＣＤ３抗体濃度には特に限定はなく、所望のリンパ球の増殖率が得られるように適宜設定すればよい。従来同様の濃度（例えば５μｇ／ｍＬ）とすることもできる。抗ＣＤ３抗体の共存により、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化量の減少によるリンパ球の増殖率の低下が抑制される。例えば、固相の固定化に使用する溶液中のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの濃度を１〜５μｇ／ｍＬとした場合であっても、当該固相について０．０５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上の濃度の抗ＣＤ３抗体溶液による固定化処理を行っておけば、従来のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化量で達成される増殖率に匹敵するリンパ球の増殖率が得られる。
【００５０】
以上に記載された、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化操作は。それぞれの成分を個別に含む２種の溶液を使用して段階的に行ってもよく、両成分を含む１種の溶液を使用して行ってもよい。
【００５１】
以上のように、従来よりも低濃度となるよう調製した抗ＣＤ３抗体やフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの溶液を使用した固定化操作により得られる培養器材も、本発明の一態様である。
【００５２】
前記の、従来よりも低濃度となるよう調製した抗ＣＤ３抗体やフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの溶液で培養用器材への前記の成分の固定化を行い、得られた培養器材でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することにより、これらの細胞は、例えば細胞増殖に関する刺激を受ける。本明細書においてはこのような刺激を「低濃度刺激」と記載することがある。
【００５３】
以下、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下でのリンパ球又はリンパ球の前駆細胞の培養を本発明の培養工程と記載する。本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において本発明の培養工程を実施することにより行われる。すなわち、リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含む場合、好適には培養初期に前記培養工程を含むことが好ましく、より好適には培養開始時に前記培養工程を含むことが好ましい。本発明を特に限定するものではないが、培養開始時から１〜７日間、好ましくは１〜５日間、本発明の培養工程が実施される。
【００５４】
本発明において使用されるリンパ球又はその前駆細胞には特に限定はない。リンパ球としては、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞等が例示される。リンパ球の前駆細胞としては、リンパ球に分化しうる能力を有する細胞もしくは当該細胞を含有する細胞集団を本発明に使用することができ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞等が例示される。培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。更に、本発明の方法は抗原特異的細胞傷害活性を付与されたＣＴＬの拡大培養にも有効である。
【００５５】
本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、例えばＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞、リンフォカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団等が挙げられる。これらのうち、本発明は、抗原特異的ＣＴＬ及びリンフォカイン活性化細胞、ナイーブＴ細胞の製造により適している。なお、本明細書においてリンフォカイン活性化細胞とは、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間培養することにより得られる機能的細胞集団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞（例えば、ナイーブＴ細胞等）も含まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性化細胞と称することとする。
【００５６】
本発明の培養工程は、ＣＴＬになり得る細胞からの抗原特異的ＣＴＬへの誘導、抗原特異的ＣＴＬの維持、もしくは抗原特異的ＣＴＬやナイーブＴ細胞等の上記のリンパ球の拡大培養を目的とするものである。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整してリンパ球の培養を行うことにより、養子免疫療法等に有用なリンパ球を製造することができる。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群をも包含し、ＣＴＬとはＣＴＬを含有する細胞群をも包含するものとする。培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００５７】
本発明の培養工程において使用される細胞培養器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００５８】
培養条件は、リンパ球の公知の培養条件で行なえばよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養器材を交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は後述のとおり、製造するリンパ球の種類によって、適宜設定することができる。
【００５９】
更に、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される化合物や、国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いて培養してもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
【００６０】
本発明のリンパ球の培養工程に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、更に後述するとおり製造するリンパ球の種類に応じて各種サイトカイン等を添加すれば良い。
【００６１】
本発明のリンパ球の培養工程においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０超〜２０容量％、特に自己由来の血清又は血漿を用いる場合、患者への負担を考慮して、０超〜５容量％とするのが好ましい。また、リンパ球の培養工程において、培地中の血清や血漿濃度は段階的に低減させることができる。例えば、リンパ球の培養工程において培地の交換や添加を行う際に、新たな培地中の血清や血漿濃度を低く調整することにより、使用する血漿や血漿を低減させてリンパ球の培養を実施することができる。このように、培地中の血清や血漿の添加量を低減させることができることは、本発明の有効な効果の１つである。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養するリンパ球と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
【００６２】
例えば、本発明の方法において、リンパ球の拡大培養を行う場合、本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００６３】
（２）−１ リンフォカイン活性化細胞の製造方法
以下、本発明の製造方法によりリンフォカイン活性化細胞を製造する例（以下、本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００６４】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法は、リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞を用いて、ＩＬ−２の存在下で本発明の培養工程を実施することを特徴とする。ここで本発明の培養工程の実施は、培養の全期間であっても一部の期間であってもよく、好適には培養開始時に本発明の培養工程を実施することが好ましい。本発明の培養工程の培養期間については、例えば１〜１０日、好適には２〜８日、より好適には３〜７日が好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点からは３日以上が好ましい。
【００６５】
リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞としては、特に限定されるものではなく、例えばＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられ、血球系細胞であれば使用できる。また、前記細胞を含有する材料、例えば末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００６６】
また、リンフォカイン活性化細胞を培養するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、細胞工学、１９９５年、第１４巻、第２２３〜２２７頁；組織培養、１９９１年、第１７巻、第１９２〜１９５頁；Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（ザ ランセット）、２０００年、第３５６巻、第８０２〜８０７頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（カレント プロトコル イン イムノロジー）、補遺 １７、ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施され、培養初期に本発明の培養工程を実施することが好ましいことは前述のとおりである。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養器材を交換する工程を行っても良い。
【００６７】
使用される培地については特に限定はなく、リンパ球の培養に適した公知の培地を使用することができる。また、本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００６８】
本発明の一つの態様では、細胞に副刺激を与えるために抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体を共存させることもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を共存させてもよい。更に、これらの成分は前述のとおり、適当な固相に固定化して使用することもできる。
【００６９】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法により得られた細胞は、実施例６及び７に記載のとおり、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞や、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の比率が高い。すなわち、当該方法により得られるリンフォカイン活性化細胞はナイーブＴ細胞を高比率に含んでいる細胞であり、養子免疫療法への利用に極めて適している。
【００７０】
更に、実施例９に記載のとおり、当該細胞は生体内での増殖・生存作用が強く、その上ナイーブＴ細胞を高比率で維持する。このことは、当該細胞が生体内で抗原提示細胞より抗原提示を受け、特異的ＣＴＬに誘導され増殖する効率が高いことを示しており、養子免疫療法への利用に非常に有用である。
【００７１】
（２）−２ 外来遺伝子の導入工程を包含する本発明のリンパ球の製造方法
本発明は、前述したリンパ球の製造方法において、更に外来遺伝子を導入する工程を包含するリンパ球の製造方法も提供する。すなわち、本発明は、その一態様として、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程を更に含むリンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００７２】
本発明のリンパ球の製造方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
【００７３】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法中の細胞増殖時に実施するのが好適である。
【００７４】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００７５】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際に導入効率を向上させる物質を使用してもよく、例えばレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）やその他のフィブロネクチン フラグメントを使用することもできる。
【００７６】
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【００７７】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００７８】
本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【００７９】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、又は人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【００８０】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）が例示される。
【００８１】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【００８２】
その他、導入する遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子や、標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域（ＣＤ３等）を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。
【００８３】
（３）本発明の製造方法により得られるリンパ球、当該リンパ球を含有する医薬、当該医薬を用いた疾患の治療方法
更に本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたリンパ球や当該リンパ球を含有する細胞集団、前期細胞集団から分離された細胞亜集団を提供する。また、本発明は当該リンパ球等を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。
【００８４】
本発明の製造方法により得られるリンパ球や細胞集団を含有する治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈より患者に投与される。当該治療剤は後述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製されたリンパ球や細胞集団を有効成分として、例えば、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜決定でき、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０５〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、５×１０５〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０６〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。通常、リンパ球は注射や点滴により静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与される。
【００８５】
本発明の医薬の投与においては、特に限定はないが、例えば、治療しようとする疾病に対してワクチンとして機能しうる成分とともに投与することもできる。例えば、がんの治療に際しては腫瘍抗原、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、人為的操作により増殖能を失った腫瘍組織由来の細胞や、腫瘍組織からの抽出物などを投与することもできる。また、当該医薬の投与においては、リンパ球刺激因子、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ，ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β等）、ケモカイン等を適宜投与することもできる。なお、本願明細書において、リンパ球刺激因子とはリンパ球増殖因子を包含するものである。
【００８６】
本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、白血病等の悪性腫瘍疾患やウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患（例えば肝炎、インフルエンザ、ＡＩＤＳ、結核、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、深在性真菌症）が例示される。また、前述のように更に外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
【００８７】
本発明の方法により製造されるリンパ球の医薬の製造における使用、例えばがん性疾患や感染性疾患治療用の医薬の製造における使用も本発明に包含される。
【００８８】
また、本発明の別の態様として、前記医薬を用いた疾患の治療方法が提供される。当該疾患の治療方法は、前述のリンパ球の製造方法により製造されたリンパ球を用いることを特徴とし、当該医薬の投与の諸条件については、公知の養子免疫療法や前述の医薬の投与の開示に従って実施できる。
【００８９】
前記のとおり、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下に拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞はナイーブＴ細胞を高比率に含んでいる。ナイーブＴ細胞は、生体に移植された後に抗原提示細胞により抗原の提示を受け、この抗原を認識するＣＴＬやヘルパーＴ細胞などに分化することにより、治療が望まれる疾患への治療効果を発揮できるようになる。
【００９０】
下記実施例に示すように、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下に拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞は、他の方法で拡大培養されたリフォカイン活性化細胞よりもテロメアが長く、輸注後の生体内において、長期生存が可能である。また他の方法で拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞よりも高い生着率を示す。すなわち、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下に拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞は、生体内において安定に維持されることができ、より高い頻度で抗原提示されるため、優れた治療効果を奏する。すなわち本発明により、固定化された抗ＣＤ３抗体、固定化されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びＩＬ−２の存在下に拡大培養された、生体に投与された後に高い生体内生着率、安定した表現型の維持率を示し、より高い頻度で抗原提示されるリンフォカイン活性化細胞が提供される。また固定化された抗ＣＤ３抗体、固定化されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びＩＬ−２の存在下にリンパ球又はリンパ球前駆細胞を拡大培養する工程を包含する、生体に投与された後に高い生体内生着率、安定した表現型の維持率を示し、より高い頻度で抗原提示されるリンフォカイン活性化細胞の製造方法が提供される。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
【００９２】
調製例１ フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＦＮフラグメント）の調製
Ｃ−２７４（フィブロネクチンの細胞結合ドメインからなるポリペプチド、配列番号９）、Ｈ−２７１（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインからなるポリペプチド、配列番号１０）、Ｈ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド、配列番号１１）、ＣＨ−２７１（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインからなるポリペプチド、配列番号１２）、Ｃ−ＣＳ１（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド、配列番号１４）は、それぞれＪ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（ジャーナル オブ バイオケミストリー）、１９９１年、第１１０巻、第２８４〜２９１頁の記載に基づいて調製した。
【００９３】
Ｈ２９６−Ｈ２９６（配列番号２２）、Ｈ１０５−Ｈ１０５（配列番号２８）は特許文献４の記載に基づいて調製した。
【００９４】
実施例１ 凍結ＰＢＭＣにおける細胞増殖の促進−１
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られた健常人より成分採血を実施後、採血液をＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて、ＰＢＭＣを回収した。採取したＰＢＭＣはＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製又は和光純薬社製）に懸濁後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ヒト血清アルブミン（ブミネート：バクスター社製、以下ＨＳＡと記載）を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製）で洗浄後、各実験に供した。
【００９５】
（２）抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）及びレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製、以下ＣＨ−２９６と記載）を固定化した。すなわち９６穴細胞培養プレート（コーニング社製）に０．０１−５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液（テルモ社製）あるいは、０．０１−５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体及び１−２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を８０μＬ／ウエルずつ添加した。この培養器材を室温で５時間インキュベート後、培養器材から当該ＡＣＤ−Ａ液を吸引除去後、各ウエルをダルベッコＰＢＳ（日水製薬社製又はインビトロジェン社製、以下ＤＰＢＳと記載）で２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【００９６】
（３）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例１−（１）で分離したＰＢＭＣ ０．３×１０５ｃｅｌｌｓを０．５％ヒトＡＢ型血清（ＬＯＮＺＡ社製、以下血清と記載）、終濃度２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（製剤名Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、カイロン社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１ ０．２ｍＬに懸濁し、実施例１−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養３日目に終濃度０．１ｍＣｉ／ｍＬ チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を含む０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を１０μＬ／ウエルずつ添加し、３７℃（５％ＣＯ２存在下）で１６時間インキュベートした。培養後の細胞をセルハーベスター（ＳＫＡＴＯＲＯＮ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、ＦｉｌｔｅｒＭＡＴ（ＳＫＡＴＯＲＯＮ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）上に回収し、エタノール（ナカライテスク社製）で固定後、水で洗浄し、乾燥させた。細胞へのチミジン取り込み活性は、細胞が固定化されたＦｉｌｔｅｒＭＡＴの放射活性を、Ａｑｕａｓｏｌ−２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）をシンチレーションカクテルとして、液体シンチレーションカウンターＬＳ６５００（ベックマン・コールター社製）により測定することで評価した。２人のドナーについて試験を行い、各群における放射活性の値（ｃｐｍ）を表１−１及び表１−２に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【００９７】
【表１−１】
【００９８】
【表１−２】
【００９９】
表１−１及び表１−２に示されるように、どちらのドナーにおいても、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したプレートを使用した場合には固定化時の抗ＣＤ３抗体濃度の低下に伴ってチミジン取り込み活性の低下が見られた。しかしながら、０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液による固定化と５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液による固定化を組み合わせた場合のチミジン取り込み活性は、従来のプロトコルである５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液と２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を組み合わせた場合と同等であった。すなわち、固定化時の抗ＣＤ３抗体の濃度を低下させても、ＣＨ−２９６を共存させることで従来どおりの細胞増殖促進効果が得られることが示された。
【０１００】
実施例２ 凍結ＰＢＭＣにおける細胞増殖の促進−２
（１）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例１と同様の方法で、細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、抗ＣＤ３抗体の固定化には０．１μｇ／ｍＬ溶液を使用し、ＣＨ−２９６以外のＦＮフラグメントとしてＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｈ−２７１、ＣＨ−２７１、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５を表中の各濃度（５−２０μｇ／ｍＬ）に調製して、抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントを固定化した。各組み合わせの結果の放射活性の値を表２に示す。なお、表中の値はＮ＝３の平均値を示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
表２に示されるように、０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液により固定化を行ったプレートであっても、更にＦＮフラグメントを固定化した場合の放射活性は、抗ＣＤ３抗体のみが前記の濃度で固定化されている場合の放射活性よりも高く、それぞれチミジン取り込み量が多いことが確認された。すなわち０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液による固定化と各濃度のＦＮフラグメントの固定化の組み合わせにおける細胞増殖促進効果が示された。
【０１０３】
実施例３ 新鮮ＰＢＭＣにおける細胞増殖の促進
（１）ＰＢＭＣ及び非働化済み血漿の分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを用いた５０ｍＬ分の採血を実施後、遠心し血漿画分とＰＢＭＣを含む細胞画分をそれぞれ回収した。血漿画分は、５６℃、３０分非働化処理を行った後、遠心後の上清を非働化済み血漿として回収し、各実験に供した。細胞画分は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅによりＰＢＭＣを回収、洗浄し、各実験に供した。
【０１０４】
（２）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例１と同様の方法で、細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、抗ＣＤ３抗体の固定化には０．０１−５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液を使用し、ＣＨ−２９６非固定化群とＣＨ−２９６を５μｇ／ｍＬの溶液で固定化した抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化群を作製した。また、培養用培地は前記の非働化済み血漿を終濃度０．６％となるよう含有させたＧＴ−Ｔ５５１（以下０．６％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１と記載）を使用した。
【０１０５】
各群における放射活性の値を表３に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
表３に示されるように、新鮮ＰＢＭＣに対して０．０１−１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液と５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を組み合わせて固定化を行ったプレートで刺激を行った場合のチミジン取り込み活性は、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液と５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を組み合わせた場合に匹敵することが確認された。すなわち低濃度の抗ＣＤ３抗体溶液での固定化でもＣＨ−２９６溶液と組み合わせることで細胞増殖促進効果が示された。
【０１０８】
実施例４ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における細胞増殖の促進−１
（１）ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞の調製
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４８穴細胞培養用プレート（コーニング社製）に１ｍＬ播種した。更に、ＩＬ−２を終濃度１００Ｕ／ｍＬ、Ｐｈｙｔｏｈｅｍａａｇｌｕｔｉｎｉｎ（シグマ社製）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培養４日目に、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、培養７日目、１１日目には、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を添加した。培地添加時には各回ともＩＬ−２を終濃度５０Ｕ／ｍＬとなるように添加した。Ｔ２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）にて培養を継続し、１４日目の細胞懸濁液を回収してｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞として各実験に供した。
【０１０９】
（２）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例４−（１）で調製したｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞を用いて、実施例１と同様の方法で、細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、抗ＣＤ３抗体は０．０１−０．３μｇ／ｍＬ溶液で固定化を実施したうえ、ＣＨ−２９６を使用しない抗ＣＤ３抗体のみ固定化した群と、更に１−１０μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液で固定化を行った抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６とを固定化した群を設定した。なお２人のドナー由来のｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞について試験を行った。各初期刺激条件における放射活性の値を表４−１（ドナーＡ由来ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞）及び表４−２（ドナーＢ由来ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞）に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【０１１０】
【表４−１】
【０１１１】
【表４−２】
【０１１２】
表４−１、表４−２に示されるように、ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期刺激として抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度を０．０１−０．３μｇ／ｍＬに低下させた場合であっても、抗ＣＤ３抗体に加えて５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬの溶液でＣＨ−２９６を固定化した場合には、いずれのドナーにおいても高いチミジン取り込み活性が確認された。すなわち新鮮ＰＢＭＣと同様に、Ｔ細胞に純化されたｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞においても低濃度抗ＣＤ３抗体溶液とＣＨ−２９６溶液を組み合わせて固定化したプレートで細胞増殖が促進されることが示された。
【０１１３】
実施例５ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における細胞増殖の促進−２
（１）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例４と同様の方法で細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、細胞の刺激は実施例２と同様の方法で行った。各初期刺激条件の結果の放射活性の値を表５に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
表５に示されるように、０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液で固定化を行い、かつＦＮフラグメントを共存させた場合には、ＦＮフラグメントを使用しない場合よりも放射活性が高く、チミジン取り込み量が多いことが確認された。すなわち、固定化時の抗ＣＤ３抗体溶液の濃度を低下させたことに起因する細胞増殖促進効果の低下を、各ＦＮフラグメントが抑制しうることが示された。
【０１１６】
実施例６ ＦＮフラグメントＣＨ−２９６を用いた低濃度刺激によるリンパ球の拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
１２ウエルプレート（コーニング社製）に０．０３−１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液、あるいは０．０３−１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を０．４５ｍＬ／ウエルずつ添加したのち５％ＣＯ２中、３７℃で５時間インキュベートした。使用直前に当該ＡＣＤ−Ａ液を吸引、除去後、各ウエルをＤＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０１１７】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例６−（１）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ―２９６固定化プレートに０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を４．７７ｍＬ／ウエルで添加しておき、次いで実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した細胞懸濁液を０．５３ｍＬ／ウエルずつ添加した。各ウエルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いて約８．３倍希釈し、この希釈液約７．８ｍＬをＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、更に終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始７日目及び１０日目には、各群の培養液をＧＴ−Ｔ５５１を用いて２倍希釈して終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、得られた培養液１５．６ｍＬをＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移して培養を継続した。培養開始後７日目、１０日目及び１３日目に生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。その結果を表６−１に示す。表６−１は培養開始時を１とした時のそれぞれの日での拡大培養率（倍）を示す。なお、表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０１１８】
【表６−１】
【０１１９】
表６−１に示されるように、低濃度の溶液を使用して抗ＣＤ３抗体及びＣＨ―２９６が固定化された器材を用いた（低濃度刺激条件と呼ぶ）培養を含む工程により、抗ＣＤ３抗体単独での刺激と比較してリンパ球の拡大培養がより強く促進されることが確認された。
【０１２０】
（３）培養後のリンパ球のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例６−（２）で調製した培養開始７日目、１０日目及び１３日目の細胞をＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（ベックマンコールター社製）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により染色後、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）により解析した。その結果を表６−２に示す。表６−２はＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の比率（％）を示す。なお表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０１２１】
【表６−２】
【０１２２】
表６−２に示されるように、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、抗ＣＤ３抗体のみを固定化した対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。すなわち、抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度が低くても、ＣＨ−２９６を組み合わせて用いることにより、生体内で高い細胞傷害活性を示す細胞への分化能の高いＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性のナイーブＴ細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。
【０１２３】
実施例７ ＣＨ−２９６、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒト４−１ＢＢ抗体及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒト４−１ＢＢ抗体の固定化
抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）のみ、抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）及びＣＨ−２９６（５μｇ／ｍＬ溶液）、抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）及び抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍＬ溶液）、抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）及び抗４−１ＢＢ抗体（５μｇ／ｍＬ溶液）を含むＡＣＤ−Ａ液を、それぞれバッグ面積が８６ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） ２１５（タカラバイオ社製）に１０．４ｍＬ／バッグずつ添加し、５％ＣＯ２中３７℃で５時間インキュベートした。上記のバッグは使用前に当該ＡＣＤ−Ａ液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後各実験に供した。
【０１２４】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例３−（１）と同様の方法で４ドナーより分離した各ＰＢＭＣ ０．６×１０７ｃｅｌｌｓを１２０ｍＬの０．６％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１に懸濁し、実施例７−（１）で作製した固定化条件の異なるＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） ２１５にそれぞれ添加した。なおＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については、１％血清含有ＤＰＢＳで洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８：インビトロジェン社製）を細胞数に対して３倍量添加し使用した。次に各バッグに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） ２１５内の細胞を懸濁し、この懸濁液１２０ｍＬを３８０ｍＬの０．６％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いて希釈して何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｅｖａ（タカラバイオ社製）に移した。いずれの群についても終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、培養開始７日目には各バッグに細胞懸濁液と等量のＧＴ−Ｔ５５１を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１０日目には各バッグ内の細胞懸濁液を５００ｍＬ抜き取った後、等量のＧＴ−Ｔ５５１をバッグに添加し、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１０日目及び１４日目に生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。４ドナーの平均値を表７−１に示す。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については３ドナーについて実施したため、３ドナーの平均値で示す。なお、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については、生細胞数計測時に細胞懸濁液から磁気ビーズ分離装置ＭＰＣ−１（インビトロジェン社製）を用いてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去した。なお表中において「＋」は「及び」を意味し、以降の表においても同様である。
【０１２５】
【表７−１】
【０１２６】
表７−１に示されるように、培養日数にかかわらず、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用することで、他群と比較して、高い拡大培養率が得られた。このことから、低濃度の溶液を用いて成分を固定化した培養器材を使用する手法においても、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはリンパ球拡大培養時に好適に使用できることが明らかとなった。
【０１２７】
（３）ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析
実施例７−（２）で調製した培養１０日目及び培養１４日目の細胞を実施例６−（３）と同様の方法でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析を行った。なお、ＣＤ６２Ｌは測定していない。それぞれの陽性細胞の含有比率の４ドナー平均値を表７−２に示す。なお、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については３ドナーの平均値である。また、培養１０日目の抗ＣＤ３抗体使用群の２ドナーについては解析に必要な細胞数が得られず未実施であったため、２ドナーの平均値を示す。
【０１２８】
【表７−２】
【０１２９】
表７−２に示されるように、培養日数にかかわらず、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用することで、他群と比較して、高い比率でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞集団が得られた。当該実施例より、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性のナイーブＴ細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例８ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける生着、ナイーブＴ細胞比率
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、固定化時の濃度は、抗ＣＤ３抗体は５μｇ／ｍＬとし、ＣＨ−２９６は２５μｇ／ｍＬとした。また、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群を設定した。
【０１３１】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社製）８週齢雌１２匹を以下の表８−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０１３２】
【表８−１】
【０１３３】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
抗アシアロＧＭ１抗体処理はＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいてＮＫ細胞を除去しヒト細胞の生着を高めることが知られている。細胞の投与前日に、抗アシアロＧＭ１抗体溶液（和光純薬社製）２０μｌを０．４％ＨＳＡ含有生理食塩水０．３８ｍＬで希釈し、その全量をマウスの腹腔内に投与した。
【０１３４】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例８−（１）で凍結保存したリンパ球を３７℃水浴中にて急速融解した。各リンパ球は３．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるように４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁し投与用の細胞とした。細胞投与前にすべてのマウスをＸ線照射（３５０Ｒ）し、準備した細胞を０．３ｍＬ尾静脈内に投与した。
【０１３５】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着
細胞投与後７日目及び１４日目にマウスより尾静脈採血を実施し、フローサイトメトリーにより移入したマウス末梢血中のヒトリンパ球の陽性率を％キメリズム［ヒトＣＤ３陽性細胞含有率／（ヒトＣＤ３陽性細胞含有率＋マウスＣＤ４５陽性細胞含有率）×１００％］として解析した。染色はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）、ＰＥ標識ラット抗マウスＣＤ４５抗体（ベックマンコールター社製）を用いた。抗体反応後、ＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血作業を２回繰り返した後、ＤＰＢＳに懸濁しフローサイトメトリーに供した。その結果を表８−２に示す。表８−２はマウス末梢血中のヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）を示し、Ｎ＝４の平均値を示す。
【０１３６】
【表８−２】
【０１３７】
表８−２に示されるように、細胞投与後７日目及び１４日目についてＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、高い％キメリズムを示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内でより高い生着能を有することが明らかとなった。
【０１３８】
（６）末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（５）と同様の方法でＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）により細胞の染色を行った。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均を表８−３に示す。
【０１３９】
【表８−３】
【０１４０】
表８−３より、細胞投与後７日目及び１４日目についてＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激するとＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性のナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内においてもその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【０１４１】
実施例９ 低濃度刺激条件により拡大培養したリンパ球のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける生着、ナイーブＴ細胞比率検討
（１）リンパ球の拡大培養
実施例７−（２）と同様の方法で１０日間リンパ球拡大培養を行った。なお、抗ＣＤ３抗体を固定化時の濃度を５μｇ／ｍＬとした群（ＯＫＴ３−Ｔ群）、抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬ、ＣＨ−２９６を２５μｇ／ｍＬとして固定化した群（ＲＮ−Ｔ群）を追加した。なおＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した群は試験していない。
【０１４２】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス９週齢雌２５匹を以下の表９−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝５とした。
【０１４３】
【表９−１】
【０１４４】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０１４５】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例９−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法により投与した。なお、投与用の細胞は５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０１４６】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着
実施例８−（５）と同様にして、細胞投与後７日目のマウス末梢血中のヒトＴ細胞の％キメリズムを検討した。
【０１４７】
その結果を表９−２に示す。なお、表９−２は各群の平均値を示す。
【０１４８】
【表９−２】
【０１４９】
表９−２より、細胞投与７日目において低濃度刺激条件であるＲＮ（Ｌ）−Ｔ群は、ＣＤ２８（Ｌ）−Ｔ群と同程度に、他群より高い％キメリズムを示した。つまり、低濃度刺激条件で製造した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内で初期の段階でより高い生着能を有することが明らかとなった。
【０１５０】
（６）末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（６）と同様の方法で染色を実施した。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均を表９−３に示す。
【０１５１】
【表９−３】
【０１５２】
表９−３より、細胞投与後７日目についてＲＮ（Ｌ）−Ｔ群は、他の低刺激条件の群に比較して、移入したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。低濃度の抗ＣＤ３抗体溶液、ＣＨ−２９６溶液で固定化が実施された培養器材を使用し製造したリンパ球は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内においても移植前の表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【０１５３】
実施例１０ ＮＯＧマウスにおける生着、細胞ポピュレーション検討
（１）リンパ球の拡大培養
実施例７−（２）と同様の方法で１０日間リンパ球拡大培養を行った。なお、刺激条件は実施例８−（１）と同様とした。
【０１５４】
（２）マウスと群構成
ＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ―ｓｃｉｄ，ＩＬ―２γ ＫＯ）（（財）実験動物中央研究所製）８週齢雌１２匹を以下の表１０−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０１５５】
【表１０−１】
【０１５６】
（３）投与細胞の調製と投与
実施例１０−（１）で調製したリンパ球を５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう溶媒（４％ＨＳＡ含有生理食塩水）に懸濁し、尾静脈内に投与した。
【０１５７】
（４）末梢血中ヒトＴ細胞の生着
実施例８−（５）と同様にして、細胞投与後８日目、１４日目、２１日目、２８日目のマウス末梢血中のヒトＴ細胞の％キメリズムを検討した。
その結果を表１０−２に示す。なお、表１０−２は各群の平均値を示す。
【０１５８】
【表１０−２】
【０１５９】
表１０−２より、特に細胞投与後２１日目までの初期の段階でＲＮ−Ｔ群が他群に比較して高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造した細胞は、ＮＯＧマウスの生体内で初期の段階でより高い生着能を有することが明らかとなった。
【０１６０】
（５）マウス末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４、ＣＤ８陽性率の検討
実施例１０−（４）と同様にして、細胞投与後１４日目、２１日目、２８日目の末梢血中のヒトＴ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８陽性率を検討した。染色は実施例８−（５）に用いた抗体にＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター社製）を加えた。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率はヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団を１００％とし、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を引いて求めた。その結果を表１０−３に示す。
【０１６１】
【表１０−３】
【０１６２】
表１０−３より、細胞投与後、日数を経るにつれてＣＤ８Ｔ細胞の比が減少するが、ＲＮ−Ｔ群においては２８日目において他群に比較してＣＤ８Ｔ陽性率が高い値を示した。すなわち、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造した細胞はＮＯＧマウスの生体内で高いＣＤ８Ｔ細胞比率を保って生着できることが明らかとなった。
【０１６３】
（６）末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（６）と同様の方法で染色を実施した。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均を表１０−４に示す。
【０１６４】
【表１０−４】
【０１６５】
表１０−４より、細胞投与後いずれの段階においてもＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造するとＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＧマウスの生体内においてもその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【０１６６】
実施例１１ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＲＮ−Ｔのリンパ組織への集積
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、培養には抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍＬ溶液を固定化に使用）のみを固定化したバッグ、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６（５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液、２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を固定化に使用）を固定化したバッグを使用した。また、実施例７と同様のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激群を設定した。
【０１６７】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社製）８週齢雌１２匹を以下の表１１−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０１６８】
【表１１−１】
【０１６９】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０１７０】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１１−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法によりＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに投与した。なお、投与用の細胞は７．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０１７１】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着及び絶対数の検討
細胞投与後７日目にマウスより尾静脈採血を実施し、移入したヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）及び絶対数［血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数（個／μＬ）］をフローサイトメトリーにより測定した。すなわち、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＥ標識ラット抗マウスＣＤ４５抗体と蛍光粒子浮遊液であるＦｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ（ベックマンコールター社製）の混合液に等量の血液を添加し反応後、ＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒを用いた溶血操作を施してフローサイトメトリーに供した。その結果を表１１−２に示す。なお、表１１−２はマウス末梢血中のヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）及び血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数（個／μＬ）を、Ｎ＝４の平均値で示す。
【０１７２】
【表１１−２】
【０１７３】
表１１−２に示されるように、細胞投与後７日目のＲＮ−Ｔ群は他群と同等の高い％キメリズムを示したが、血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数は他群と比較してきわめて高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、移植後の体内での増殖能が高いことが示された。
【０１７４】
（６）末梢リンパ組織へのヒトＴ細胞の生着及び集積の解析
細胞投与後７日目にマウスをネンブタール麻酔下で開腹、腹大動・静脈をハサミで切断することで放血殺した。その後に脾臓と左右両側の鼠径リンパ節を摘出した。鼠径リンパ節は各群４匹分をまとめて細胞調製に供した。摘出した脾臓及びリンパ節はスライドガラスで押しつぶして分散させ、細胞懸濁液としてフローサイトメトリー用のサンプルとした。脾臓についてはＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒによる溶血操作を実施した。染色はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体を用いた。その結果を表１１−３に示す。なお、表１１−３は脾臓及び鼠径リンパ節のヒトリンパ球の陽性率（％）を示す。脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。
【０１７５】
【表１１−３】
【０１７６】
表１１−３に示されるように、細胞投与後７日目におけるヒトＴ細胞のマウス末梢リンパ組織での生着は、脾臓及びリンパ節ともＲＮ−Ｔ群で高い結果を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内で末梢リンパ組織での生着が他群に比べて高いことが明らかとなった。
【０１７７】
ヒトＴ細胞の鼠径リンパ節への集積をチュルク染色液によるカウントにより解析した。得られた細胞数と表１１−３のリンパ節でのヒトＴ細胞の陽性率から鼠径リンパ節でのヒトＴ細胞の細胞数を求めた。その結果を表１１−４に示す。
【０１７８】
【表１１−４】
【０１７９】
表１１−４に示されるように、細胞投与後７日目におけるＲＮ−Ｔ群の鼠径リンパ節の細胞数は他群に比べて著しく高いとの結果が示された。また、この細胞数の増加は投与されたヒトＴ細胞の集積に起因することが示唆された。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、体内でリンパ節へ集積する能力が高いことが明らかとなった。
【０１８０】
（７）末梢リンパ組織中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例１１−（６）で調製された細胞について、実施例８−（６）と同様の方法でＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体により染色を行った。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。結果を表１１−５に示す。なお、脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。
【０１８１】
【表１１−５】
【０１８２】
表１１−５のとおり、細胞投与後７日目の脾臓においてＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高いことが示されたが、リンパ節では同程度の高含有率であった。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激するとナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内において脾臓に生着するヒトＴ細胞はその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。リンパ節に生着するヒトＴ細胞はいずれもＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高いことから、ナイーブＴ細胞の表現型の高い細胞がリンパ節に集積しやすいことが明らかとなった。
【０１８３】
実施例１２ リンパ球拡大培養におけるテロメラーゼ活性の定量、テロメア長の検出及びＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞の解析
（１）ＰＢＭＣの分離及び非働化済み血漿の分離
実施例３−（１）と同様の方法で、ＰＢＭＣ及び非働化済み血漿を分離し、各実験に供した。
【０１８４】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
培養面積が７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製）に終濃度０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液あるいは、終濃度０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及び終濃度５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を９．１ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で５時間インキュベートした。その後、固定化液を除去し使用直前にＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０１８５】
（３）リンパ球の拡大培養
実施例１２−（１）で分離したＰＢＭC １．０５×１０７ｃｅｌｌｓを、終濃度２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１ １０４．５ｍＬに懸濁した後、実施例１２−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化フラスコ、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化フラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。４日目に各条件の培養液を１％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いて８．３６倍希釈し、この希釈液のうち２３４ｍＬを何も固定化していない、バッグ面積が３００ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｅｖａに移し、更に終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、７日目には各バッグに培養液と等量のＧＴ−Ｔ５５１を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１０日目には、各群の培養液を２３４ｍＬ抜き取った後、等量のＧＴ−Ｔ５５１及び終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、１５日目まで培養を継続した。培養開始後４日目、７日目、１０日目及び１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。その結果を表１２−１及び表１２−２に示す。
【０１８６】
【表１２−１】
【０１８７】
【表１２−２】
【０１８８】
（４）培養後のリンパ球のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の解析
実施例１２−（３）で調製した培養４日目、７日目、１０日目及び１５日目の細胞を用いて実施例６−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の解析を行った（ＣＤ６２Ｌ陽性細胞については解析せず）。それぞれの陽性細胞の含有比率を表１２−３及び表１２−４に示す。
【０１８９】
【表１２−３】
【０１９０】
【表１２−４】
【０１９１】
（５）細胞の保存
実施例１２−（３）で拡大培養を実施した培養４日目のリンパ球 ２×１０５ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬマイクロチューブ（トレフ社製）に回収し、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳを１ｍＬ添加し、同様の遠心条件で遠心分離した。上清を除去し、沈渣（細胞）をディープフリーザー内で−８０℃保存した。なお、使用時には、これら保存細胞を氷上で解凍し、テロメラーゼ活性の定量実験に供した。また、実施例１２−（３）で拡大培養を実施した培養４日目、７日目、１０日目及び１５日目のリンパ球を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、使用時には、これら保存細胞を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、テロメア長の検出実験及びＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞の解析実験に供した。
【０１９２】
（６）テロメラーゼ活性の定量
実施例１２−（５）で凍結保存した沈渣（細胞）を氷上で解凍し、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法を原理とするテロメラーゼ活性定量キット、Ｔｅｌｏ ＴＡＧＧＧ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ ＰＬＵＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いてテロメラーゼ活性を定量した。キットに添付されている資料の方法に従って測定後、下記式１（数１）より、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（以下ＲＴＡと記載）値を求めた。表１２−５に結果を示す。
【０１９３】
【数１】
【０１９４】
ＡＳ：サンプルの吸光度
ＡＳＯ：熱処理サンプルの吸光度
ＡＳ，ＩＳ：内部標準の吸光度
ＡＴＳ８：対照鋳型の吸光度
ＡＴＳ８，０：溶解液の吸光度
ＡＴＳ，ＩＳ：対照鋳型の内部標準の吸光度
【０１９５】
【表１２−５】
【０１９６】
表１２−５に示されるように、どちらのドナーにおいても、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したフラスコを使用することで、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したフラスコを使用した場合と比較して、高いＲＴＡ値が得られた。すなわち当該実施例より、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、高いテロメラーゼ活性を保持するリンパ球が得られることが明らかとなった。
【０１９７】
（７）テロメア長の検出
実施例１２−（５）で凍結保存したリンパ球を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して調製した細胞を、フローサイトメトリーによるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を原理とするテロメア長の検出キット、テロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣ標識 フローサイトメトリー用（ダコジャパン社製）を用いてテロメア長の検出を行った。キットに添付されている資料の方法に従って１３０１細胞を比較対照として測定後、下記式２（数２）より、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｌｅｎｇｔｈ（以下ＲＴＬと記載）値を求めた。表１２−６に結果を示す。
【０１９８】
【数２】
【０１９９】
ＰＳ：プローブ有りサンプルのＦＬ１ Ｍｅａn Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度、以下ＭＦＩと記載）
Ｐ０Ｓ：プローブ無しサンプルのＦＬ１ ＭＦＩ
ＰＣ：プローブ有り対照細胞のＦＬ１ ＭＦＩ
Ｐ０Ｃ：プローブ無しの対照細胞のＦＬ１ ＭＦＩ
ＩＣ：対照細胞のＤＮＡ ｉｎｄｅｘ＝２
ＩＳ：サンプル細胞のＤＮＡ ｉｎｄｅｘ＝１
【０２００】
【表１２−６】
【０２０１】
表１２−６に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したフラスコを使用することで、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したフラスコを使用した場合と比較して、高いＲＴＬ値が得られた。すなわち当該実施例より、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、より長いテロメアを保持するリンパ球が得られることが明らかとなった。
【０２０２】
（８）培養後のリンパ球のＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞の解析
実施例１２−（５）で凍結保存した培養１０日目及び１５日目のリンパ球を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して調製した細胞を実施例６−（３）と同様の方法でＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター社製）により染色後、フローサイトメトリーにより解析した。その陽性細胞の含有比率を表１２−７に示す。
【０２０３】
【表１２−７】
【０２０４】
表１２−７に示されるように、どちらのドナーにおいても、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したフラスコを使用することで、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したフラスコを使用した場合と比較して、高いＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞比率が得られた。ＮＫＧ２Ｄ分子はＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化、細胞傷害性応答及びＩＦＮ−γ産生能に関与する重要な分子であり、免疫抑制下では発現が低下することが知られているが、当該実施例よりリンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、より高効率でＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞が得られることが明らかとなった。
【０２０５】
実施例１３ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期活性化抗原の検討
（１）ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞の調製
実施例４と同様の方法でｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞の調製を行った。ただし、培養０日目は培養面積が２５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（コーニング社製）を用いてＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬ添加した。培養７日目、１１日目には、０．７５〜０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を添加した。この時、ＩＬ−２を終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。１３日目の細胞懸濁液を回収してｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞として各実験に供した。
【０２０６】
（２）抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した。すなわち６穴細胞培養プレート（コーニング社製）に０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液あるいは、０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体及び１．５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を１ｍＬ／ウエルずつ添加した。この培養器材を室温で５時間インキュベート後、培養器材から当該ＡＣＤ−Ａ液を吸引除去後、各ウエルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０２０７】
（３）細胞の初期活性化抗原の検討
実施例１３−（１）で調製したｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞 １．５×１０６ｃｅｌｌｓを０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１、３ｍＬに懸濁し、実施例１３−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。１６時間後に細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により染色後、フローサイトメトリーにより解析した。４８時間後に細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（ダコ社製）により染色後、同様に解析した。その結果を表１３−１に示す。なお表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０２０８】
【表１３−１】
【０２０９】
表１３−１に示されるように、ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期刺激として抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度を０．３μｇ／ｍＬにした場合、抗ＣＤ３抗体に１．５μｇ／ｍＬの溶液でＣＨ−２９６を固定化した場合には、リンパ球の初期活性化抗原であるＣＤ６９の発現上昇が確認された。同様にＣＤ６９に遅れて活性化に伴って発現が上昇するＣＤ２５においても低濃度抗ＣＤ３抗体にＣＨ−２９６を固定化した場合において優位にその発現が上昇することが確認された。すわなち、低濃度抗ＣＤ３抗体溶液とＣＨ−２９６溶液を組み合わせて固定化したプレートで細胞を刺激することで、初期活性化抗原の発現上昇が促進されることが示された。
【０２１０】
実施例１４ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬ発現の検討
（１）細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現の検討
実施例１３−（１）で調製したｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞を、実施例１３−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。１６時間後に細胞を回収し、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（ベックマンコールター社製）の方法に従って、ＰＥ標識マウス抗ヒトＢｃｌ−ｘＬ抗体（ベックマンコールター社製）で細胞内染色を行なった。この細胞をフローサイトメトリーにより解析した。その結果を表１４−１に示す。なお表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０２１１】
【表１４−１】
【０２１２】
表１４−１に示されるように、ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期刺激として抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度を０．３μｇ／ｍＬ及びＣＨ−２９６を１．５μｇ／ｍＬ固定化した場合に、アポトーシスを抑制する働きのあるＢｃｌ−ｘＬの発現強度が上昇することが確認された。
【０２１３】
実施例１５ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＲＮ−Ｔ細胞生着の経時的変化の検討
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化時の濃度は、抗ＣＤ３抗体は５μｇ／ｍＬ及びＣＨ−２９６は２５μｇ／ｍＬとした。
【０２１４】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス７週齢雌１０匹を使用した。投与後１日目、３日目、６日目、８日目、１４日目に２匹ずつ最終日とし、血液中及び各組織でのヒトＴ細胞の生着を検討した。
【０２１５】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０２１６】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１５−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法により投与した。なお、投与用の細胞は８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０２１７】
（５）血液中及び組織中ヒトＴ細胞の生着
細胞投与後１日目、３日目、６日目、８日目、１４日目にマウスより採血あるいは組織を摘出した。検討した部位は尾静脈、下大静脈、脾臓、鼠径リンパ節、骨髄、胸腺である。実施例８−（５）と同様にして、尾静脈及び下大静脈中のヒトＴ細胞の％キメリズムを検討した。結果を表１５−１に示す。また、実施例１１−（６）と同様にして、各組織のヒトリンパ球の陽性率（％）を検討した。このとき、脾臓及び骨髄についてはＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒによる溶血操作を実施した。結果を表１５−２に示す。
【０２１８】
【表１５−１】
【０２１９】
【表１５−２】
＊ｎ．ｔ．は組織の摘出ができなかったことを示す。
【０２２０】
表１５−１に示されるように、細胞投与後３日目から１４日目についてＲＮ−Ｔ細胞は、血液中において高い％キメリズムを示した。また、組織におけるＲＮ−Ｔ細胞の経時的変化を検討したところ、表１５−２に示されるように、脾臓においては３日目と６日目で８０％以上のヒトリンパ球の陽性率（％）が確認できた。鼠径リンパ節は免疫不全マウスであるＮＯＤ／ｓｃｉｄにおいては発達していない組織であるが、６日目以降で肉眼的にも大きくなっていることが確認でき、６日目及び１４日目で約４５％以上のヒトリンパ球の陽性率（％）が確認できた。胸腺については６日目、骨髄については３日目において、ヒトリンパ球の陽性率（％）が上昇する傾向が見られたが、１４日目では数％程度の陽性率に減少した。
【０２２１】
（６）血液中及び組織中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（６）と同様にヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均の結果を表１５−３に示す。
【０２２２】
【表１５−３】
【０２２３】
表１５−３より、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率（％）は、各組織間で同程度の陽性率を示した。血液中及び組織に集積したＲＮ−Ｔ細胞は、６日目以降で投与前と同等かそれ以上のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率を示すことが明らかとなった。
【０２２４】
実施例１６ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＲＮ−Ｔのリンパ組織への集積
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１０日目及び１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、初期刺激方法は実施例１１−（１）と同様にした。
【０２２５】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス８週齢雌２４匹を以下の表１６−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０２２６】
【表１６−１】
【０２２７】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０２２８】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１６−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法によりＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに投与した。なお、投与用の細胞は７．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０２２９】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着及び絶対数の検討
実施例１１−（５）と同様にして、細胞投与後５日目及び７日目にマウスより尾静脈採血を実施し、移入したヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）及び絶対数［血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数（個／μＬ）］をフローサイトメトリーにより測定した。Ｎ＝４の平均値の結果を表１６−２に示す。
【０２３０】
【表１６−２】
【０２３１】
表１６−２に示されるように、細胞投与後５日目及び７日目のＲＮ−Ｔ群は他群と同等の高い％キメリズムを示したが、細胞投与後５日目においては血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数は他群と比較して高い値を示した。培養１０日間と１４日間での％キメリズムは同程度であったが、末梢血中におけるｈＣＤ３陽性細胞の絶対数は１０日間培養の細胞で高い傾向が示された。
【０２３２】
（６）末梢リンパ組織へのヒトＴ細胞の生着及び集積の解析
実施例１１−（６）と同様にして、細胞投与後７日目の末梢リンパ組織へのヒトＴ細胞の生着を解析した。脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。それぞれの結果を表１６−３に示す。
【０２３３】
【表１６−３】
【０２３４】
表１６−３に示されるように、細胞投与後７日目におけるヒトＴ細胞の脾臓での生着はＲＮ−Ｔ群とＯＫＴ３−Ｔ群で高い結果を示し、リンパ節での生着はＲＮ−Ｔ群で高い結果を示した。培養１０日間と１４日間では、１０日間培養の群でやや高い生着を示した。すなわち、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内で末梢リンパ組織での生着が他群に比べて高いことが明らかとなった。
【０２３５】
次に、ヒトＴ細胞の鼠径リンパ節への集積を解析した。得られた細胞数と表１６−３のリンパ節でのヒトＴ細胞の陽性率から鼠径リンパ節でのヒトＴ細胞の細胞数を求めた。その結果を表１６−４に示す。
【０２３６】
【表１６−４】
【０２３７】
表１６−４に示されるように、細胞投与後７日目におけるＲＮ−Ｔ群の鼠径リンパ節の細胞数は培養日数に関わらず、他群に比べて高い結果が示された。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、体内でリンパ節へ集積する能力が高いことが明らかとなった。
【０２３８】
（７）末梢血中及び末梢リンパ組織中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例１６−（６）で調製された細胞について、実施例８−（６）と同様の方法でＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体により染色を行った。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。その結果を表１６−５に示す。なお、脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。
【０２３９】
【表１６−５】
【０２４０】
表１６−５に示されるように、細胞投与後７日目の末梢血、脾臓、鼠径リンパ節に生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率はＲＮ−Ｔ群において、多くは他群と同等かそれより高いことが示された。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激するとナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内においる末梢血及び末梢リンパ組織に生着するヒトＴ細胞はその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２４１】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、生体への生着率、表現型の維持能力において優れており、養子免疫療法をはじめとする医療分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２４２】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named CH-296Na.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:21 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:22 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:23 ; Fibronectin fragment named H296-H296-H296-HT.
SEQ ID NO:24 ; Fibronectin fragment named CH296-CH296-HT.
SEQ ID NO:25 ; Fibronectin fragment named H105-H105-HT.
SEQ ID NO:26 ; Fibronectin fragment named H296-H296-HT.
SEQ ID NO:27 ; Fibronectin fragment named H296-H296-H296.
SEQ ID NO:28 ; Fibronectin fragment named H105-H105.
SEQ ID NO:29 ; Fibronectin fragment named H271-H296.
SEQ ID NO:30 ; Fibronectin fragment named H296-H271.
SEQ ID NO:31 ; Fibronectin fragment named 15aaH105-H105-HT.
SEQ ID NO:32 ; Fibronectin fragment named 15aaH105-H105.
SEQ ID NO:33 ; Fibronectin fragment named H105-H105Nc-HT
SEQ ID NO:34 ; Fibronectin fragment named H105-H105Nc.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なリンパ球の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８マーカーを有するＣＤ８Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型あるいはＴｈ２型に分化する。ＣＤ８Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名：キラーＴ細胞、以下、ＣＴＬと記載することがある］に分化する。
【０００４】
例えば、癌の病態において、外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４の治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等から種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。
【０００５】
免疫療法の中で、体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等からＩＬ（インターロイキン）−２と抗ＣＤ３抗体の作用により拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞を移入する療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるか等の問題については、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することによる効果が、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献１〜４）。
【０００６】
近年、免疫療法に使用されるＴリンパ球は、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞を投与した方が、生体への投与においてはるかに高い治療効果が期待できることが報告されている（例えば非特許文献１）。更に、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法などにおいても、例えば癌が進行した患者の体内ではＣＴＬに誘導されうる元となるナイーブＴ細胞が少ないと考えられるため、充分な効果が期待できないことが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００７／１４２３００号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．（ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション）２００５年、第１１５巻、第１６１６〜１６２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用が奏されることについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献１〜４）。しかしながら、養子免疫療法が多様化しているという現状を考えた場合、上記文献の方法以外の、さらなる細胞増殖方法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らはリンパ球の培養、特に拡大培養の諸条件について鋭意検討を重ね、効率のよいリンパ球製造の条件を見出し、本発明を完成させた。更に、本発明の方法により製造されたリンパ球は、長いテロメアを保持していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下にリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する工程を包含するリンパ球の製造方法であって、
（１）５μｇ／ｍＬ未満の抗ＣＤ３抗体溶液を使用して前記抗体を固定化した固相、及び／又は
（２）２５μｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液を使用して前記ポリペプチドを固定化した固相
と接触させた状態でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することを特徴とするリンパ球の製造方法、
［２］固相が細胞培養用器材又は細胞培養用担体である［１］の方法、
［３］フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＶＬＡ−４結合活性、ＶＬＡ−５結合活性、へパリン結合活性から選択される結合活性を有するものである［１］の方法、
［４］フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＣＳ−１ドメイン、細胞接着ドメイン、へパリン結合ドメインから選択されるフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するものである［１］の方法、
［５］フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが配列表の配列番号９〜３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである［４］の方法、
［６］リンパ球が抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である［１］の方法、及び
［７］リンパ球に外来遺伝子を導入する工程を更に包含する［１］の方法、
に関する。
また、抗ＣＤ３抗体の単独刺激下で得られたリンパ球と比較して、テロメアが長い［１］記載の方法で得られたリンパ球に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、効率的なリンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は基礎研究や医療分野への多大な貢献が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法に関する。
本発明は、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを使用するリンパ球の製造方法において、前記の有効成分を固相に固定化する際の濃度について鋭意検討し、完成するに至ったものである。
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明に使用される、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド
本発明には、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、例えばフィブロネクチンのフラグメントを使用することができる。フィブロネクチンのフラグメントは天然から得られたもの、又は人為的に合成されたもの、遺伝子工学的に調製されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンのフラグメントを調製するための情報であるフィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００１５】
本発明において、フィブロネクチン フラグメントとしては、例えば、ＩＩＩ−８（配列番号１）、ＩＩＩ−９（配列番号２）、ＩＩＩ−１０（配列番号３）、ＩＩＩ−１１（配列番号４）、ＩＩＩ−１２（配列番号５）、ＩＩＩ−１３（配列番号６）、ＩＩＩ−１４（配列番号７）、及びＣＳ−１（配列番号８）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドや、前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドが例示される。フラグメントの長さとしては、例えば、アミノ酸の数として２０〜１０００が好ましく、１００〜８００がより好ましい。なお、本明細書において、複数個とは数個を含む概念であり、２〜１２個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜８個が更に好ましく、以下においても同様である。
【００１６】
また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性及び／又はヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００１７】
更にフィブロネクチン フラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列番号９）、Ｈ−２７１（配列番号１０）、Ｈ−２９６（配列番号１１）、ＣＨ−２７１（配列番号１２）、ＣＨ−２９６（配列番号１３）、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１４）、及びＣＨ−２９６Ｎａ（配列番号１５）からなる群より選択されるポリペプチドが例示される。
【００１８】
上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６Ｎａ、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６ＮａはＶＬＡ−４に結合する活性を有するＣＳ−１を有するポリペプチドである。更に、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６及びＣＨ−２９６Ｎａはヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。なお、ＣＨ−２９６Ｎａは血漿由来のフィブロネクチンにおける細胞結合ドメインからＣＳ−１までを含むポリペプチドである。
【００１９】
本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列番号１６）、ＣＨＶ−９０（配列番号１７）、ＣＨＶ−９２（配列番号１８）、あるいは二つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列番号１９）、ＣＨＶ−１８１（配列番号２０）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。
【００２０】
また、上記の各フラグメントに更にアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列番号２１）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。
【００２１】
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる組換えフィブロネクチン フラグメントであってもよい。
【００２２】
更に、本発明には、組換えフィブロネクチン フラグメントのほかに、改変型組換えフィブロネクチン フラグメントを使用することができる。この改変型組換えフィブロネクチン フラグメントは、同一のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を分子内に複数個含有するポリペプチドである。
【００２３】
前記の改変型組換えフィブロネクチン フラグメント（以下改変型フラグメントと記載する）の一例としては、２個以上のアミノ酸配列（ｍ）、１個以上のアミノ酸配列（ｎ）を必須領域として含むポリペプチドである。ここで、アミノ酸配列（ｍ）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部である配列番号５〜７から選択される１もしくは複数個のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列である。ただし、アミノ酸配列（ｍ）は配列番号５〜７で表されるそれぞれの同じ配列を２個以上含まないアミノ酸配列であり、配列番号５〜７で表されるアミノ酸配列の組み合わせで構成されるアミノ酸配列である。例えば、アミノ酸配列（ｍ）は、配列番号５で表されるアミノ酸配列を２個以上含まず、また配列番号６もしくは７で表されるアミノ酸配列についても同様である。また、当該ポリペプチドに存在する２個以上のアミノ酸配列（ｍ）はそれぞれ同一のアミノ酸配列を示す。
【００２４】
当該アミノ酸配列（ｍ）としては、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。ヘパリン結合活性の測定は前記の方法により実施できる。
【００２５】
アミノ酸配列（ｍ）は改変型フラグメント中に、例えば２〜５個、好適には２〜４個、より好適には２〜３個含有されていることが好ましい。
【００２６】
アミノ酸配列（ｎ）は、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインである配列番号８で表されるアミノ酸配列である。アミノ酸配列（ｎ）は改変型フラグメント中に、例えば１〜５個、好適には１〜４個、より好適には１〜３個含有されていることが好ましく、好適には改変型フラグメント中に含まれるアミノ酸配列（ｍ）と同じ個数含有されていることが好ましい。
【００２７】
改変型フラグメント中の２個以上のアミノ酸配列（ｍ）と１個以上のアミノ酸配列（ｎ）の位置関係については、本発明の所望の効果が得られるものであれば、特に限定はないが、例えば少なくとも１つのアミノ酸配列（ｍ）に対してＣ末端側にアミノ酸配列（ｎ）が連結されているものが好ましい。また、改変型フラグメント中のＮ末端側にはアミノ酸配列（ｍ）が位置しており、Ｃ末端側にはアミノ酸配列（ｎ）が位置していることが好ましい。より好適には、改変型フラグメント中において、アミノ酸配列（ｍ）とアミノ酸配列（ｎ）が交互に位置していることが好ましい。
【００２８】
この改変型フラグメントを構成するアミノ酸数としては、特に限定はないが、好適には１００〜３０００アミノ酸、より好適には１５０〜２８００アミノ酸、更に好適には２００〜２６００アミノ酸である。
【００２９】
更に、改変型フラグメントは本発明の所望の効果が得られるものであれば、その他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。例えば、メチオニンやＨｉｓタグ配列、リンカー等に由来するアミノ酸残基が含まれていても良い。改変型フラグメントポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも、所望の効果を有する限り本発明に使用することができる。
【００３０】
本発明において、改変型フラグメントとしては、例えば配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴ）、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴ）、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６）、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５）、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２７１−Ｈ２９６）、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２７１）、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴ）、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５）、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴ）、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ）が例示される。
【００３１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３２】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３３】
ＣＨ２９６−ＣＨ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アスパラギン酸、リジン、プロリン、セリン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アスパラギン酸、リジン、プロリン、セリン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３４】
Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３５】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、ヒスチジン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３６】
Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ２９６−Ｈ２９６−Ｈ２９６−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる
Ｈ１０５−Ｈ１０５は、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ１０５−Ｈ１０５−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。
【００３７】
Ｈ２７１−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００３８】
Ｈ２９６−Ｈ２７１は、Ｎ末端側から順に、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４で構成されるポリペプチドである。
【００３９】
１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１３のＣ末端側の１５アミノ酸、ＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、アラニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。
【００４０】
１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５は、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、１５ａａＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。
【００４１】
Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴは、Ｎ末端側から順にＨｉｓタグ配列（ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨ）、メチオニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、アラニン、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。なお、当該ポリペプチドは、前述のＨ１０５−Ｈ１０５−ＨＴと比較して、ＣＳ−１とＩＩＩ−１４の間に含まれるリンカー部分の２アミノ酸が異なるのみである。
【００４２】
Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃは、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴのＮ末端側のＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドであり、Ｈ１０５−Ｈ１０５Ｎｃ−ＨＴから公知の方法でＨｉｓタグ配列を切断して製造することができる。なお、当該ポリペプチドは、前述のＨ１０５−Ｈ１０５と比較して、ＣＳ−１とＩＩＩ−１４の間に含まれるリンカー部分の２アミノ酸が異なるのみである。
（２）リンパ球の製造方法
以下、本発明のリンパ球の製造方法について具体的に説明する。
【００４３】
本発明のリンパ球の製造方法は、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下にリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する工程を包含する方法である。抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、リンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する際に使用される固相、例えば細胞培養用器材や細胞培養用担体の表面に固定化して使用される。
【００４４】
従来、例えば抗ＣＤ３抗体は５μｇ／ｍＬの濃度の溶液を固定化すべき固相と接触されることにより、固定化処理が実施されてきた。本発明者らはこの抗ＣＤ３抗体溶液の濃度を５μｇ／ｍＬ未満とした場合であっても、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドを共存させた場合には実質的にリンパ球の増殖率の低下が起こらないことを見出した。すなわち、その効果を低下させることなく抗ＣＤ３抗体の使用量を低減させることが可能であることを見出した。
【００４５】
本発明に使用される抗ＣＤ３抗体としては、特に本発明を限定するものではないが、好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、より好適にはＯＫＴ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）、１９７９年、第２０６巻、第３４７〜３４９頁］が例示される。
【００４６】
抗ＣＤ３抗体の固定化は公知の方法で実施すればよいが、例えば、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンのフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。固定化に使用される溶液中の抗ＣＤ３抗体の濃度は０μｇ／ｍＬ超かつ５μｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは０．００１〜３μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜２μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．１〜１μｇ／ｍＬの濃度のＣＤ３抗体溶液で固定化が実施される。
【００４７】
抗ＣＤ３抗体を固定化する固相は、細胞培養に使用可能であり、リンパ球又はリンパ球の前駆細胞の培養の際に前記の細胞に接触するものであれば限定はない。例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養器材（開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に抗ＣＤ３抗体を固定化することができる。
【００４８】
本発明には、抗ＣＤ３抗体とともに前記（１）に記載されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが使用される。当該ポリペプチドを固相に固定化する際には、従来、リンパ球の培養時の固定化に使用されていた濃度（例えば２５μｇ／ｍＬ）の溶液を使用することができる。固定化時のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液の濃度は、所望のリンパ球の増殖率が得られるように適宜設定すればよい。フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの共存により、抗ＣＤ３抗体の固定化量の減少によるリンパ球の増殖率の低下が抑制される。例えば、固相の固定化に使用する溶液中の抗ＣＤ３抗体の濃度を０．０１〜３μｇ／ｍＬとした場合であっても、当該固相について１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは５μｇ／ｍＬ以上の濃度のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液による固定化処理を行っておけば、従来の抗ＣＤ３抗体の固定化量で達成される増殖率に匹敵するリンパ球の増殖率が得られる。
【００４９】
本発明の他の態様においては、前記（１）に記載されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固相への固定化が従来よりも低濃度のポリペプチドを含有する溶液で実施される。固定化に使用される溶液中のポリペプチドの濃度は０μｇ／ｍＬ超かつ２５μｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは０．５〜１５μｇ／ｍＬ、特に好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬの濃度の溶液が使用される。本態様では、抗ＣＤ３抗体の固定化に使用される溶液中の抗ＣＤ３抗体濃度には特に限定はなく、所望のリンパ球の増殖率が得られるように適宜設定すればよい。従来同様の濃度（例えば５μｇ／ｍＬ）とすることもできる。抗ＣＤ３抗体の共存により、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化量の減少によるリンパ球の増殖率の低下が抑制される。例えば、固相の固定化に使用する溶液中のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの濃度を１〜５μｇ／ｍＬとした場合であっても、当該固相について０．０５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上の濃度の抗ＣＤ３抗体溶液による固定化処理を行っておけば、従来のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化量で達成される増殖率に匹敵するリンパ球の増殖率が得られる。
【００５０】
以上に記載された、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの固定化操作は。それぞれの成分を個別に含む２種の溶液を使用して段階的に行ってもよく、両成分を含む１種の溶液を使用して行ってもよい。
【００５１】
以上のように、従来よりも低濃度となるよう調製した抗ＣＤ３抗体やフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの溶液を使用した固定化操作により得られる培養器材も、本発明の一態様である。
【００５２】
前記の、従来よりも低濃度となるよう調製した抗ＣＤ３抗体やフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの溶液で培養用器材への前記の成分の固定化を行い、得られた培養器材でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することにより、これらの細胞は、例えば細胞増殖に関する刺激を受ける。本明細書においてはこのような刺激を「低濃度刺激」と記載することがある。
【００５３】
以下、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下でのリンパ球又はリンパ球の前駆細胞の培養を本発明の培養工程と記載する。本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において本発明の培養工程を実施することにより行われる。すなわち、リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含む場合、好適には培養初期に前記培養工程を含むことが好ましく、より好適には培養開始時に前記培養工程を含むことが好ましい。本発明を特に限定するものではないが、培養開始時から１〜７日間、好ましくは１〜５日間、本発明の培養工程が実施される。
【００５４】
本発明において使用されるリンパ球又はその前駆細胞には特に限定はない。リンパ球としては、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞等が例示される。リンパ球の前駆細胞としては、リンパ球に分化しうる能力を有する細胞もしくは当該細胞を含有する細胞集団を本発明に使用することができ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞等が例示される。培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。更に、本発明の方法は抗原特異的細胞傷害活性を付与されたＣＴＬの拡大培養にも有効である。
【００５５】
本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、例えばＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞、リンフォカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団等が挙げられる。これらのうち、本発明は、抗原特異的ＣＴＬ及びリンフォカイン活性化細胞、ナイーブＴ細胞の製造により適している。なお、本明細書においてリンフォカイン活性化細胞とは、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間培養することにより得られる機能的細胞集団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞（例えば、ナイーブＴ細胞等）も含まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性化細胞と称することとする。
【００５６】
本発明の培養工程は、ＣＴＬになり得る細胞からの抗原特異的ＣＴＬへの誘導、抗原特異的ＣＴＬの維持、もしくは抗原特異的ＣＴＬやナイーブＴ細胞等の上記のリンパ球の拡大培養を目的とするものである。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整してリンパ球の培養を行うことにより、養子免疫療法等に有用なリンパ球を製造することができる。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群をも包含し、ＣＴＬとはＣＴＬを含有する細胞群をも包含するものとする。培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００５７】
本発明の培養工程において使用される細胞培養器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００５８】
培養条件は、リンパ球の公知の培養条件で行なえばよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養器材を交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は後述のとおり、製造するリンパ球の種類によって、適宜設定することができる。
【００５９】
更に、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖及びそれらの塩からなる群より選択される化合物や、国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いて培養してもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
【００６０】
本発明のリンパ球の培養工程に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、更に後述するとおり製造するリンパ球の種類に応じて各種サイトカイン等を添加すれば良い。
【００６１】
本発明のリンパ球の培養工程においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０超〜２０容量％、特に自己由来の血清又は血漿を用いる場合、患者への負担を考慮して、０超〜５容量％とするのが好ましい。また、リンパ球の培養工程において、培地中の血清や血漿濃度は段階的に低減させることができる。例えば、リンパ球の培養工程において培地の交換や添加を行う際に、新たな培地中の血清や血漿濃度を低く調整することにより、使用する血漿や血漿を低減させてリンパ球の培養を実施することができる。このように、培地中の血清や血漿の添加量を低減させることができることは、本発明の有効な効果の１つである。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養するリンパ球と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
【００６２】
例えば、本発明の方法において、リンパ球の拡大培養を行う場合、本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００６３】
（２）−１ リンフォカイン活性化細胞の製造方法
以下、本発明の製造方法によりリンフォカイン活性化細胞を製造する例（以下、本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００６４】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法は、リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞を用いて、ＩＬ−２の存在下で本発明の培養工程を実施することを特徴とする。ここで本発明の培養工程の実施は、培養の全期間であっても一部の期間であってもよく、好適には培養開始時に本発明の培養工程を実施することが好ましい。本発明の培養工程の培養期間については、例えば１〜１０日、好適には２〜８日、より好適には３〜７日が好ましく、より高い拡大培養率を実現する観点からは３日以上が好ましい。
【００６５】
リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞としては、特に限定されるものではなく、例えばＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、骨髄細胞、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられ、血球系細胞であれば使用できる。また、前記細胞を含有する材料、例えば末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００６６】
また、リンフォカイン活性化細胞を培養するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、細胞工学、１９９５年、第１４巻、第２２３〜２２７頁；組織培養、１９９１年、第１７巻、第１９２〜１９５頁；Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（ザ ランセット）、２０００年、第３５６巻、第８０２〜８０７頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（カレント プロトコル イン イムノロジー）、補遺 １７、ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施され、培養初期に本発明の培養工程を実施することが好ましいことは前述のとおりである。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養器材を交換する工程を行っても良い。
【００６７】
使用される培地については特に限定はなく、リンパ球の培養に適した公知の培地を使用することができる。また、本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００６８】
本発明の一つの態様では、細胞に副刺激を与えるために抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体を共存させることもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を共存させてもよい。更に、これらの成分は前述のとおり、適当な固相に固定化して使用することもできる。
【００６９】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法により得られた細胞は、実施例６及び７に記載のとおり、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞や、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の比率が高い。すなわち、当該方法により得られるリンフォカイン活性化細胞はナイーブＴ細胞を高比率に含んでいる細胞であり、養子免疫療法への利用に極めて適している。
【００７０】
更に、実施例９に記載のとおり、当該細胞は生体内での増殖・生存作用が強く、その上ナイーブＴ細胞を高比率で維持する。このことは、当該細胞が生体内で抗原提示細胞より抗原提示を受け、特異的ＣＴＬに誘導され増殖する効率が高いことを示しており、養子免疫療法への利用に非常に有用である。
【００７１】
（２）−２ 外来遺伝子の導入工程を包含する本発明のリンパ球の製造方法
本発明は、前述したリンパ球の製造方法において、更に外来遺伝子を導入する工程を包含するリンパ球の製造方法も提供する。すなわち、本発明は、その一態様として、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程を更に含むリンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００７２】
本発明のリンパ球の製造方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
【００７３】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法中の細胞増殖時に実施するのが好適である。
【００７４】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００７５】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際に導入効率を向上させる物質を使用してもよく、例えばレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）やその他のフィブロネクチン フラグメントを使用することもできる。
【００７６】
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【００７７】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００７８】
本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【００７９】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、又は人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【００８０】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）が例示される。
【００８１】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【００８２】
その他、導入する遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子や、標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域（ＣＤ３等）を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。
【００８３】
（３）本発明の製造方法により得られるリンパ球、当該リンパ球を含有する医薬、当該医薬を用いた疾患の治療方法
更に本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたリンパ球や当該リンパ球を含有する細胞集団、前期細胞集団から分離された細胞亜集団を提供する。また、本発明は当該リンパ球等を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。
【００８４】
本発明の製造方法により得られるリンパ球や細胞集団を含有する治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈より患者に投与される。当該治療剤は後述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製されたリンパ球や細胞集団を有効成分として、例えば、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜決定でき、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０５〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、５×１０５〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０６〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。通常、リンパ球は注射や点滴により静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与される。
【００８５】
本発明の医薬の投与においては、特に限定はないが、例えば、治療しようとする疾病に対してワクチンとして機能しうる成分とともに投与することもできる。例えば、がんの治療に際しては腫瘍抗原、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、人為的操作により増殖能を失った腫瘍組織由来の細胞や、腫瘍組織からの抽出物などを投与することもできる。また、当該医薬の投与においては、リンパ球刺激因子、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ，ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β等）、ケモカイン等を適宜投与することもできる。なお、本願明細書において、リンパ球刺激因子とはリンパ球増殖因子を包含するものである。
【００８６】
本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、白血病等の悪性腫瘍疾患やウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患（例えば肝炎、インフルエンザ、ＡＩＤＳ、結核、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、深在性真菌症）が例示される。また、前述のように更に外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
【００８７】
本発明の方法により製造されるリンパ球の医薬の製造における使用、例えばがん性疾患や感染性疾患治療用の医薬の製造における使用も本発明に包含される。
【００８８】
また、本発明の別の態様として、前記医薬を用いた疾患の治療方法が提供される。当該疾患の治療方法は、前述のリンパ球の製造方法により製造されたリンパ球を用いることを特徴とし、当該医薬の投与の諸条件については、公知の養子免疫療法や前述の医薬の投与の開示に従って実施できる。
【００８９】
前記のとおり、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下に拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞はナイーブＴ細胞を高比率に含んでいる。ナイーブＴ細胞は、生体に移植された後に抗原提示細胞により抗原の提示を受け、この抗原を認識するＣＴＬやヘルパーＴ細胞などに分化することにより、治療が望まれる疾患への治療効果を発揮できるようになる。
【００９０】
下記実施例に示すように、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下に拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞は、他の方法で拡大培養されたリフォカイン活性化細胞よりもテロメアが長く、輸注後の生体内において、長期生存が可能である。また他の方法で拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞よりも高い生着率を示す。すなわち、抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下に拡大培養されたリンフォカイン活性化細胞は、生体内において安定に維持されることができ、より高い頻度で抗原提示されるため、優れた治療効果を奏する。すなわち本発明により、固定化された抗ＣＤ３抗体、固定化されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びＩＬ−２の存在下に拡大培養された、生体に投与された後に高い生体内生着率、安定した表現型の維持率を示し、より高い頻度で抗原提示されるリンフォカイン活性化細胞が提供される。また固定化された抗ＣＤ３抗体、固定化されたフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びＩＬ−２の存在下にリンパ球又はリンパ球前駆細胞を拡大培養する工程を包含する、生体に投与された後に高い生体内生着率、安定した表現型の維持率を示し、より高い頻度で抗原提示されるリンフォカイン活性化細胞の製造方法が提供される。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
【００９２】
調製例１ フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＦＮフラグメント）の調製
Ｃ−２７４（フィブロネクチンの細胞結合ドメインからなるポリペプチド、配列番号９）、Ｈ−２７１（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインからなるポリペプチド、配列番号１０）、Ｈ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド、配列番号１１）、ＣＨ−２７１（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインからなるポリペプチド、配列番号１２）、Ｃ−ＣＳ１（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド、配列番号１４）は、それぞれＪ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（ジャーナル オブ バイオケミストリー）、１９９１年、第１１０巻、第２８４〜２９１頁の記載に基づいて調製した。
【００９３】
Ｈ２９６−Ｈ２９６（配列番号２２）、Ｈ１０５−Ｈ１０５（配列番号２８）は特許文献４の記載に基づいて調製した。
【００９４】
実施例１ 凍結ＰＢＭＣにおける細胞増殖の促進−１
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られた健常人より成分採血を実施後、採血液をＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて、ＰＢＭＣを回収した。採取したＰＢＭＣはＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製又は和光純薬社製）に懸濁後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ヒト血清アルブミン（ブミネート：バクスター社製、以下ＨＳＡと記載）を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製）で洗浄後、各実験に供した。
【００９５】
（２）抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）及びレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製、以下ＣＨ−２９６と記載）を固定化した。すなわち９６穴細胞培養プレート（コーニング社製）に０．０１−５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液（テルモ社製）あるいは、０．０１−５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体及び１−２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を８０μＬ／ウエルずつ添加した。この培養器材を室温で５時間インキュベート後、培養器材から当該ＡＣＤ−Ａ液を吸引除去後、各ウエルをダルベッコＰＢＳ（日水製薬社製又はインビトロジェン社製、以下ＤＰＢＳと記載）で２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【００９６】
（３）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例１−（１）で分離したＰＢＭＣ ０．３×１０５ｃｅｌｌｓを０．５％ヒトＡＢ型血清（ＬＯＮＺＡ社製、以下血清と記載）、終濃度２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（製剤名Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、カイロン社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１ ０．２ｍＬに懸濁し、実施例１−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養３日目に終濃度０．１ｍＣｉ／ｍＬ チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を含む０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を１０μＬ／ウエルずつ添加し、３７℃（５％ＣＯ２存在下）で１６時間インキュベートした。培養後の細胞をセルハーベスター（ＳＫＡＴＯＲＯＮ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、ＦｉｌｔｅｒＭＡＴ（ＳＫＡＴＯＲＯＮ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）上に回収し、エタノール（ナカライテスク社製）で固定後、水で洗浄し、乾燥させた。細胞へのチミジン取り込み活性は、細胞が固定化されたＦｉｌｔｅｒＭＡＴの放射活性を、Ａｑｕａｓｏｌ−２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）をシンチレーションカクテルとして、液体シンチレーションカウンターＬＳ６５００（ベックマン・コールター社製）により測定することで評価した。２人のドナーについて試験を行い、各群における放射活性の値（ｃｐｍ）を表１−１及び表１−２に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【００９７】
【表１−１】
【００９８】
【表１−２】
【００９９】
表１−１及び表１−２に示されるように、どちらのドナーにおいても、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したプレートを使用した場合には固定化時の抗ＣＤ３抗体濃度の低下に伴ってチミジン取り込み活性の低下が見られた。しかしながら、０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液による固定化と５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液による固定化を組み合わせた場合のチミジン取り込み活性は、従来のプロトコルである５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液と２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を組み合わせた場合と同等であった。すなわち、固定化時の抗ＣＤ３抗体の濃度を低下させても、ＣＨ−２９６を共存させることで従来どおりの細胞増殖促進効果が得られることが示された。
【０１００】
実施例２ 凍結ＰＢＭＣにおける細胞増殖の促進−２
（１）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例１と同様の方法で、細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、抗ＣＤ３抗体の固定化には０．１μｇ／ｍＬ溶液を使用し、ＣＨ−２９６以外のＦＮフラグメントとしてＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｈ−２７１、ＣＨ−２７１、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ２９６−Ｈ２９６、Ｈ１０５−Ｈ１０５を表中の各濃度（５−２０μｇ／ｍＬ）に調製して、抗ＣＤ３抗体と各ＦＮフラグメントを固定化した。各組み合わせの結果の放射活性の値を表２に示す。なお、表中の値はＮ＝３の平均値を示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
表２に示されるように、０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液により固定化を行ったプレートであっても、更にＦＮフラグメントを固定化した場合の放射活性は、抗ＣＤ３抗体のみが前記の濃度で固定化されている場合の放射活性よりも高く、それぞれチミジン取り込み量が多いことが確認された。すなわち０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液による固定化と各濃度のＦＮフラグメントの固定化の組み合わせにおける細胞増殖促進効果が示された。
【０１０３】
実施例３ 新鮮ＰＢＭＣにおける細胞増殖の促進
（１）ＰＢＭＣ及び非働化済み血漿の分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを用いた５０ｍＬ分の採血を実施後、遠心し血漿画分とＰＢＭＣを含む細胞画分をそれぞれ回収した。血漿画分は、５６℃、３０分非働化処理を行った後、遠心後の上清を非働化済み血漿として回収し、各実験に供した。細胞画分は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅによりＰＢＭＣを回収、洗浄し、各実験に供した。
【０１０４】
（２）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例１と同様の方法で、細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、抗ＣＤ３抗体の固定化には０．０１−５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液を使用し、ＣＨ−２９６非固定化群とＣＨ−２９６を５μｇ／ｍＬの溶液で固定化した抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化群を作製した。また、培養用培地は前記の非働化済み血漿を終濃度０．６％となるよう含有させたＧＴ−Ｔ５５１（以下０．６％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１と記載）を使用した。
【０１０５】
各群における放射活性の値を表３に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
表３に示されるように、新鮮ＰＢＭＣに対して０．０１−１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液と５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を組み合わせて固定化を行ったプレートで刺激を行った場合のチミジン取り込み活性は、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液と５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を組み合わせた場合に匹敵することが確認された。すなわち低濃度の抗ＣＤ３抗体溶液での固定化でもＣＨ−２９６溶液と組み合わせることで細胞増殖促進効果が示された。
【０１０８】
実施例４ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における細胞増殖の促進−１
（１）ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞の調製
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、４８穴細胞培養用プレート（コーニング社製）に１ｍＬ播種した。更に、ＩＬ−２を終濃度１００Ｕ／ｍＬ、Ｐｈｙｔｏｈｅｍａａｇｌｕｔｉｎｉｎ（シグマ社製）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培養４日目に、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、培養７日目、１１日目には、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を添加した。培地添加時には各回ともＩＬ−２を終濃度５０Ｕ／ｍＬとなるように添加した。Ｔ２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）にて培養を継続し、１４日目の細胞懸濁液を回収してｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞として各実験に供した。
【０１０９】
（２）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例４−（１）で調製したｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞を用いて、実施例１と同様の方法で、細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、抗ＣＤ３抗体は０．０１−０．３μｇ／ｍＬ溶液で固定化を実施したうえ、ＣＨ−２９６を使用しない抗ＣＤ３抗体のみ固定化した群と、更に１−１０μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液で固定化を行った抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６とを固定化した群を設定した。なお２人のドナー由来のｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞について試験を行った。各初期刺激条件における放射活性の値を表４−１（ドナーＡ由来ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞）及び表４−２（ドナーＢ由来ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞）に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【０１１０】
【表４−１】
【０１１１】
【表４−２】
【０１１２】
表４−１、表４−２に示されるように、ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期刺激として抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度を０．０１−０．３μｇ／ｍＬに低下させた場合であっても、抗ＣＤ３抗体に加えて５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬの溶液でＣＨ−２９６を固定化した場合には、いずれのドナーにおいても高いチミジン取り込み活性が確認された。すなわち新鮮ＰＢＭＣと同様に、Ｔ細胞に純化されたｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞においても低濃度抗ＣＤ３抗体溶液とＣＨ−２９６溶液を組み合わせて固定化したプレートで細胞増殖が促進されることが示された。
【０１１３】
実施例５ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における細胞増殖の促進−２
（１）細胞の培養とチミジン取り込み試験
実施例４と同様の方法で細胞の培養とチミジン取り込み試験を行った。ただし、細胞の刺激は実施例２と同様の方法で行った。各初期刺激条件の結果の放射活性の値を表５に示す。なお、表中の値はＮ＝４の平均値を示す。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
表５に示されるように、０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液で固定化を行い、かつＦＮフラグメントを共存させた場合には、ＦＮフラグメントを使用しない場合よりも放射活性が高く、チミジン取り込み量が多いことが確認された。すなわち、固定化時の抗ＣＤ３抗体溶液の濃度を低下させたことに起因する細胞増殖促進効果の低下を、各ＦＮフラグメントが抑制しうることが示された。
【０１１６】
実施例６ ＦＮフラグメントＣＨ−２９６を用いた低濃度刺激によるリンパ球の拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
１２ウエルプレート（コーニング社製）に０．０３−１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液、あるいは０．０３−１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を０．４５ｍＬ／ウエルずつ添加したのち５％ＣＯ２中、３７℃で５時間インキュベートした。使用直前に当該ＡＣＤ−Ａ液を吸引、除去後、各ウエルをＤＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０１１７】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例６−（１）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ―２９６固定化プレートに０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を４．７７ｍＬ／ウエルで添加しておき、次いで実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した細胞懸濁液を０．５３ｍＬ／ウエルずつ添加した。各ウエルに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いて約８．３倍希釈し、この希釈液約７．８ｍＬをＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、更に終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始７日目及び１０日目には、各群の培養液をＧＴ−Ｔ５５１を用いて２倍希釈して終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、得られた培養液１５．６ｍＬをＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移して培養を継続した。培養開始後７日目、１０日目及び１３日目に生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。その結果を表６−１に示す。表６−１は培養開始時を１とした時のそれぞれの日での拡大培養率（倍）を示す。なお、表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０１１８】
【表６−１】
【０１１９】
表６−１に示されるように、低濃度の溶液を使用して抗ＣＤ３抗体及びＣＨ―２９６が固定化された器材を用いた（低濃度刺激条件と呼ぶ）培養を含む工程により、抗ＣＤ３抗体単独での刺激と比較してリンパ球の拡大培養がより強く促進されることが確認された。
【０１２０】
（３）培養後のリンパ球のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例６−（２）で調製した培養開始７日目、１０日目及び１３日目の細胞をＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（ベックマンコールター社製）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により染色後、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）により解析した。その結果を表６−２に示す。表６−２はＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の比率（％）を示す。なお表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０１２１】
【表６−２】
【０１２２】
表６−２に示されるように、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、抗ＣＤ３抗体のみを固定化した対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。すなわち、抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度が低くても、ＣＨ−２９６を組み合わせて用いることにより、生体内で高い細胞傷害活性を示す細胞への分化能の高いＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性のナイーブＴ細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。
【０１２３】
実施例７ ＣＨ−２９６、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒト４−１ＢＢ抗体及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒト４−１ＢＢ抗体の固定化
抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）のみ、抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）及びＣＨ−２９６（５μｇ／ｍＬ溶液）、抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）及び抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍＬ溶液）、抗ＣＤ３抗体（０．３μｇ／ｍＬ溶液）及び抗４−１ＢＢ抗体（５μｇ／ｍＬ溶液）を含むＡＣＤ−Ａ液を、それぞれバッグ面積が８６ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） ２１５（タカラバイオ社製）に１０．４ｍＬ／バッグずつ添加し、５％ＣＯ２中３７℃で５時間インキュベートした。上記のバッグは使用前に当該ＡＣＤ−Ａ液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後各実験に供した。
【０１２４】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例３−（１）と同様の方法で４ドナーより分離した各ＰＢＭＣ ０．６×１０７ｃｅｌｌｓを１２０ｍＬの０．６％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１に懸濁し、実施例７−（１）で作製した固定化条件の異なるＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） ２１５にそれぞれ添加した。なおＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については、１％血清含有ＤＰＢＳで洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８：インビトロジェン社製）を細胞数に対して３倍量添加し使用した。次に各バッグに終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） ２１５内の細胞を懸濁し、この懸濁液１２０ｍＬを３８０ｍＬの０．６％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いて希釈して何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｅｖａ（タカラバイオ社製）に移した。いずれの群についても終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、培養開始７日目には各バッグに細胞懸濁液と等量のＧＴ−Ｔ５５１を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１０日目には各バッグ内の細胞懸濁液を５００ｍＬ抜き取った後、等量のＧＴ−Ｔ５５１をバッグに添加し、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１０日目及び１４日目に生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。４ドナーの平均値を表７−１に示す。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については３ドナーについて実施したため、３ドナーの平均値で示す。なお、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については、生細胞数計測時に細胞懸濁液から磁気ビーズ分離装置ＭＰＣ−１（インビトロジェン社製）を用いてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去した。なお表中において「＋」は「及び」を意味し、以降の表においても同様である。
【０１２５】
【表７−１】
【０１２６】
表７−１に示されるように、培養日数にかかわらず、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用することで、他群と比較して、高い拡大培養率が得られた。このことから、低濃度の溶液を用いて成分を固定化した培養器材を使用する手法においても、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはリンパ球拡大培養時に好適に使用できることが明らかとなった。
【０１２７】
（３）ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析
実施例７−（２）で調製した培養１０日目及び培養１４日目の細胞を実施例６−（３）と同様の方法でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析を行った。なお、ＣＤ６２Ｌは測定していない。それぞれの陽性細胞の含有比率の４ドナー平均値を表７−２に示す。なお、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群については３ドナーの平均値である。また、培養１０日目の抗ＣＤ３抗体使用群の２ドナーについては解析に必要な細胞数が得られず未実施であったため、２ドナーの平均値を示す。
【０１２８】
【表７−２】
【０１２９】
表７−２に示されるように、培養日数にかかわらず、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用することで、他群と比較して、高い比率でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞集団が得られた。当該実施例より、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性のナイーブＴ細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例８ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける生着、ナイーブＴ細胞比率
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、固定化時の濃度は、抗ＣＤ３抗体は５μｇ／ｍＬとし、ＣＨ−２９６は２５μｇ／ｍＬとした。また、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ使用群を設定した。
【０１３１】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社製）８週齢雌１２匹を以下の表８−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０１３２】
【表８−１】
【０１３３】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
抗アシアロＧＭ１抗体処理はＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいてＮＫ細胞を除去しヒト細胞の生着を高めることが知られている。細胞の投与前日に、抗アシアロＧＭ１抗体溶液（和光純薬社製）２０μｌを０．４％ＨＳＡ含有生理食塩水０．３８ｍＬで希釈し、その全量をマウスの腹腔内に投与した。
【０１３４】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例８−（１）で凍結保存したリンパ球を３７℃水浴中にて急速融解した。各リンパ球は３．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるように４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁し投与用の細胞とした。細胞投与前にすべてのマウスをＸ線照射（３５０Ｒ）し、準備した細胞を０．３ｍＬ尾静脈内に投与した。
【０１３５】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着
細胞投与後７日目及び１４日目にマウスより尾静脈採血を実施し、フローサイトメトリーにより移入したマウス末梢血中のヒトリンパ球の陽性率を％キメリズム［ヒトＣＤ３陽性細胞含有率／（ヒトＣＤ３陽性細胞含有率＋マウスＣＤ４５陽性細胞含有率）×１００％］として解析した。染色はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）、ＰＥ標識ラット抗マウスＣＤ４５抗体（ベックマンコールター社製）を用いた。抗体反応後、ＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血作業を２回繰り返した後、ＤＰＢＳに懸濁しフローサイトメトリーに供した。その結果を表８−２に示す。表８−２はマウス末梢血中のヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）を示し、Ｎ＝４の平均値を示す。
【０１３６】
【表８−２】
【０１３７】
表８−２に示されるように、細胞投与後７日目及び１４日目についてＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、高い％キメリズムを示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内でより高い生着能を有することが明らかとなった。
【０１３８】
（６）末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（５）と同様の方法でＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）により細胞の染色を行った。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均を表８−３に示す。
【０１３９】
【表８−３】
【０１４０】
表８−３より、細胞投与後７日目及び１４日目についてＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激するとＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性のナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内においてもその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【０１４１】
実施例９ 低濃度刺激条件により拡大培養したリンパ球のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける生着、ナイーブＴ細胞比率検討
（１）リンパ球の拡大培養
実施例７−（２）と同様の方法で１０日間リンパ球拡大培養を行った。なお、抗ＣＤ３抗体を固定化時の濃度を５μｇ／ｍＬとした群（ＯＫＴ３−Ｔ群）、抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬ、ＣＨ−２９６を２５μｇ／ｍＬとして固定化した群（ＲＮ−Ｔ群）を追加した。なおＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した群は試験していない。
【０１４２】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス９週齢雌２５匹を以下の表９−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝５とした。
【０１４３】
【表９−１】
【０１４４】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０１４５】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例９−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法により投与した。なお、投与用の細胞は５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０１４６】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着
実施例８−（５）と同様にして、細胞投与後７日目のマウス末梢血中のヒトＴ細胞の％キメリズムを検討した。
【０１４７】
その結果を表９−２に示す。なお、表９−２は各群の平均値を示す。
【０１４８】
【表９−２】
【０１４９】
表９−２より、細胞投与７日目において低濃度刺激条件であるＲＮ（Ｌ）−Ｔ群は、ＣＤ２８（Ｌ）−Ｔ群と同程度に、他群より高い％キメリズムを示した。つまり、低濃度刺激条件で製造した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内で初期の段階でより高い生着能を有することが明らかとなった。
【０１５０】
（６）末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（６）と同様の方法で染色を実施した。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均を表９−３に示す。
【０１５１】
【表９−３】
【０１５２】
表９−３より、細胞投与後７日目についてＲＮ（Ｌ）−Ｔ群は、他の低刺激条件の群に比較して、移入したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。低濃度の抗ＣＤ３抗体溶液、ＣＨ−２９６溶液で固定化が実施された培養器材を使用し製造したリンパ球は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内においても移植前の表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【０１５３】
実施例１０ ＮＯＧマウスにおける生着、細胞ポピュレーション検討
（１）リンパ球の拡大培養
実施例７−（２）と同様の方法で１０日間リンパ球拡大培養を行った。なお、刺激条件は実施例８−（１）と同様とした。
【０１５４】
（２）マウスと群構成
ＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ―ｓｃｉｄ，ＩＬ―２γ ＫＯ）（（財）実験動物中央研究所製）８週齢雌１２匹を以下の表１０−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０１５５】
【表１０−１】
【０１５６】
（３）投与細胞の調製と投与
実施例１０−（１）で調製したリンパ球を５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう溶媒（４％ＨＳＡ含有生理食塩水）に懸濁し、尾静脈内に投与した。
【０１５７】
（４）末梢血中ヒトＴ細胞の生着
実施例８−（５）と同様にして、細胞投与後８日目、１４日目、２１日目、２８日目のマウス末梢血中のヒトＴ細胞の％キメリズムを検討した。
その結果を表１０−２に示す。なお、表１０−２は各群の平均値を示す。
【０１５８】
【表１０−２】
【０１５９】
表１０−２より、特に細胞投与後２１日目までの初期の段階でＲＮ−Ｔ群が他群に比較して高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造した細胞は、ＮＯＧマウスの生体内で初期の段階でより高い生着能を有することが明らかとなった。
【０１６０】
（５）マウス末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４、ＣＤ８陽性率の検討
実施例１０−（４）と同様にして、細胞投与後１４日目、２１日目、２８日目の末梢血中のヒトＴ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８陽性率を検討した。染色は実施例８−（５）に用いた抗体にＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター社製）を加えた。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率はヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団を１００％とし、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を引いて求めた。その結果を表１０−３に示す。
【０１６１】
【表１０−３】
【０１６２】
表１０−３より、細胞投与後、日数を経るにつれてＣＤ８Ｔ細胞の比が減少するが、ＲＮ−Ｔ群においては２８日目において他群に比較してＣＤ８Ｔ陽性率が高い値を示した。すなわち、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造した細胞はＮＯＧマウスの生体内で高いＣＤ８Ｔ細胞比率を保って生着できることが明らかとなった。
【０１６３】
（６）末梢血中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（６）と同様の方法で染色を実施した。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均を表１０−４に示す。
【０１６４】
【表１０−４】
【０１６５】
表１０−４より、細胞投与後いずれの段階においてもＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を使用し製造するとＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＧマウスの生体内においてもその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【０１６６】
実施例１１ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＲＮ−Ｔのリンパ組織への集積
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、培養には抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍＬ溶液を固定化に使用）のみを固定化したバッグ、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６（５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体溶液、２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６溶液を固定化に使用）を固定化したバッグを使用した。また、実施例７と同様のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激群を設定した。
【０１６７】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社製）８週齢雌１２匹を以下の表１１−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０１６８】
【表１１−１】
【０１６９】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０１７０】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１１−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法によりＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに投与した。なお、投与用の細胞は７．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０１７１】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着及び絶対数の検討
細胞投与後７日目にマウスより尾静脈採血を実施し、移入したヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）及び絶対数［血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数（個／μＬ）］をフローサイトメトリーにより測定した。すなわち、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＥ標識ラット抗マウスＣＤ４５抗体と蛍光粒子浮遊液であるＦｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ（ベックマンコールター社製）の混合液に等量の血液を添加し反応後、ＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒを用いた溶血操作を施してフローサイトメトリーに供した。その結果を表１１−２に示す。なお、表１１−２はマウス末梢血中のヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）及び血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数（個／μＬ）を、Ｎ＝４の平均値で示す。
【０１７２】
【表１１−２】
【０１７３】
表１１−２に示されるように、細胞投与後７日目のＲＮ−Ｔ群は他群と同等の高い％キメリズムを示したが、血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数は他群と比較してきわめて高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、移植後の体内での増殖能が高いことが示された。
【０１７４】
（６）末梢リンパ組織へのヒトＴ細胞の生着及び集積の解析
細胞投与後７日目にマウスをネンブタール麻酔下で開腹、腹大動・静脈をハサミで切断することで放血殺した。その後に脾臓と左右両側の鼠径リンパ節を摘出した。鼠径リンパ節は各群４匹分をまとめて細胞調製に供した。摘出した脾臓及びリンパ節はスライドガラスで押しつぶして分散させ、細胞懸濁液としてフローサイトメトリー用のサンプルとした。脾臓についてはＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒによる溶血操作を実施した。染色はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体を用いた。その結果を表１１−３に示す。なお、表１１−３は脾臓及び鼠径リンパ節のヒトリンパ球の陽性率（％）を示す。脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。
【０１７５】
【表１１−３】
【０１７６】
表１１−３に示されるように、細胞投与後７日目におけるヒトＴ細胞のマウス末梢リンパ組織での生着は、脾臓及びリンパ節ともＲＮ−Ｔ群で高い結果を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内で末梢リンパ組織での生着が他群に比べて高いことが明らかとなった。
【０１７７】
ヒトＴ細胞の鼠径リンパ節への集積をチュルク染色液によるカウントにより解析した。得られた細胞数と表１１−３のリンパ節でのヒトＴ細胞の陽性率から鼠径リンパ節でのヒトＴ細胞の細胞数を求めた。その結果を表１１−４に示す。
【０１７８】
【表１１−４】
【０１７９】
表１１−４に示されるように、細胞投与後７日目におけるＲＮ−Ｔ群の鼠径リンパ節の細胞数は他群に比べて著しく高いとの結果が示された。また、この細胞数の増加は投与されたヒトＴ細胞の集積に起因することが示唆された。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、体内でリンパ節へ集積する能力が高いことが明らかとなった。
【０１８０】
（７）末梢リンパ組織中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例１１−（６）で調製された細胞について、実施例８−（６）と同様の方法でＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体により染色を行った。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。結果を表１１−５に示す。なお、脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。
【０１８１】
【表１１−５】
【０１８２】
表１１−５のとおり、細胞投与後７日目の脾臓においてＲＮ−Ｔ群は、他群と比較して、生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高いことが示されたが、リンパ節では同程度の高含有率であった。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激するとナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内において脾臓に生着するヒトＴ細胞はその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。リンパ節に生着するヒトＴ細胞はいずれもＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高いことから、ナイーブＴ細胞の表現型の高い細胞がリンパ節に集積しやすいことが明らかとなった。
【０１８３】
実施例１２ リンパ球拡大培養におけるテロメラーゼ活性の定量、テロメア長の検出及びＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞の解析
（１）ＰＢＭＣの分離及び非働化済み血漿の分離
実施例３−（１）と同様の方法で、ＰＢＭＣ及び非働化済み血漿を分離し、各実験に供した。
【０１８４】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
培養面積が７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製）に終濃度０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液あるいは、終濃度０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及び終濃度５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を９．１ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で５時間インキュベートした。その後、固定化液を除去し使用直前にＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０１８５】
（３）リンパ球の拡大培養
実施例１２−（１）で分離したＰＢＭC １．０５×１０７ｃｅｌｌｓを、終濃度２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１ １０４．５ｍＬに懸濁した後、実施例１２−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化フラスコ、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化フラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。４日目に各条件の培養液を１％血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１を用いて８．３６倍希釈し、この希釈液のうち２３４ｍＬを何も固定化していない、バッグ面積が３００ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｅｖａに移し、更に終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、７日目には各バッグに培養液と等量のＧＴ−Ｔ５５１を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。１０日目には、各群の培養液を２３４ｍＬ抜き取った後、等量のＧＴ−Ｔ５５１及び終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、１５日目まで培養を継続した。培養開始後４日目、７日目、１０日目及び１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。その結果を表１２−１及び表１２−２に示す。
【０１８６】
【表１２−１】
【０１８７】
【表１２−２】
【０１８８】
（４）培養後のリンパ球のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の解析
実施例１２−（３）で調製した培養４日目、７日目、１０日目及び１５日目の細胞を用いて実施例６−（３）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の解析を行った（ＣＤ６２Ｌ陽性細胞については解析せず）。それぞれの陽性細胞の含有比率を表１２−３及び表１２−４に示す。
【０１８９】
【表１２−３】
【０１９０】
【表１２−４】
【０１９１】
（５）細胞の保存
実施例１２−（３）で拡大培養を実施した培養４日目のリンパ球 ２×１０５ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬマイクロチューブ（トレフ社製）に回収し、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳを１ｍＬ添加し、同様の遠心条件で遠心分離した。上清を除去し、沈渣（細胞）をディープフリーザー内で−８０℃保存した。なお、使用時には、これら保存細胞を氷上で解凍し、テロメラーゼ活性の定量実験に供した。また、実施例１２−（３）で拡大培養を実施した培養４日目、７日目、１０日目及び１５日目のリンパ球を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、使用時には、これら保存細胞を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、テロメア長の検出実験及びＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞の解析実験に供した。
【０１９２】
（６）テロメラーゼ活性の定量
実施例１２−（５）で凍結保存した沈渣（細胞）を氷上で解凍し、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法を原理とするテロメラーゼ活性定量キット、Ｔｅｌｏ ＴＡＧＧＧ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ ＰＬＵＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いてテロメラーゼ活性を定量した。キットに添付されている資料の方法に従って測定後、下記式１（数１）より、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（以下ＲＴＡと記載）値を求めた。表１２−５に結果を示す。
【０１９３】
【数１】
【０１９４】
ＡＳ：サンプルの吸光度
ＡＳＯ：熱処理サンプルの吸光度
ＡＳ，ＩＳ：内部標準の吸光度
ＡＴＳ８：対照鋳型の吸光度
ＡＴＳ８，０：溶解液の吸光度
ＡＴＳ，ＩＳ：対照鋳型の内部標準の吸光度
【０１９５】
【表１２−５】
【０１９６】
表１２−５に示されるように、どちらのドナーにおいても、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したフラスコを使用することで、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したフラスコを使用した場合と比較して、高いＲＴＡ値が得られた。すなわち当該実施例より、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、高いテロメラーゼ活性を保持するリンパ球が得られることが明らかとなった。
【０１９７】
（７）テロメア長の検出
実施例１２−（５）で凍結保存したリンパ球を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して調製した細胞を、フローサイトメトリーによるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を原理とするテロメア長の検出キット、テロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣ標識 フローサイトメトリー用（ダコジャパン社製）を用いてテロメア長の検出を行った。キットに添付されている資料の方法に従って１３０１細胞を比較対照として測定後、下記式２（数２）より、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｌｅｎｇｔｈ（以下ＲＴＬと記載）値を求めた。表１２−６に結果を示す。
【０１９８】
【数２】
【０１９９】
ＰＳ：プローブ有りサンプルのＦＬ１ Ｍｅａn Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（平均蛍光強度、以下ＭＦＩと記載）
Ｐ０Ｓ：プローブ無しサンプルのＦＬ１ ＭＦＩ
ＰＣ：プローブ有り対照細胞のＦＬ１ ＭＦＩ
Ｐ０Ｃ：プローブ無しの対照細胞のＦＬ１ ＭＦＩ
ＩＣ：対照細胞のＤＮＡ ｉｎｄｅｘ＝２
ＩＳ：サンプル細胞のＤＮＡ ｉｎｄｅｘ＝１
【０２００】
【表１２−６】
【０２０１】
表１２−６に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したフラスコを使用することで、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したフラスコを使用した場合と比較して、高いＲＴＬ値が得られた。すなわち当該実施例より、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、より長いテロメアを保持するリンパ球が得られることが明らかとなった。
【０２０２】
（８）培養後のリンパ球のＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞の解析
実施例１２−（５）で凍結保存した培養１０日目及び１５日目のリンパ球を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して調製した細胞を実施例６−（３）と同様の方法でＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター社製）により染色後、フローサイトメトリーにより解析した。その陽性細胞の含有比率を表１２−７に示す。
【０２０３】
【表１２−７】
【０２０４】
表１２−７に示されるように、どちらのドナーにおいても、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したフラスコを使用することで、抗ＣＤ３抗体のみを固定化したフラスコを使用した場合と比較して、高いＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞比率が得られた。ＮＫＧ２Ｄ分子はＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化、細胞傷害性応答及びＩＦＮ−γ産生能に関与する重要な分子であり、免疫抑制下では発現が低下することが知られているが、当該実施例よりリンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６による低濃度刺激を施すことにより、より高効率でＮＫＧ２Ｄ陽性ＣＤ８陽性細胞が得られることが明らかとなった。
【０２０５】
実施例１３ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期活性化抗原の検討
（１）ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞の調製
実施例４と同様の方法でｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞の調製を行った。ただし、培養０日目は培養面積が２５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（コーニング社製）を用いてＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬ添加した。培養７日目、１１日目には、０．７５〜０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１を添加した。この時、ＩＬ−２を終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。１３日目の細胞懸濁液を回収してｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞として各実験に供した。
【０２０６】
（２）抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した。すなわち６穴細胞培養プレート（コーニング社製）に０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体のみを含むＡＣＤ−Ａ液あるいは、０．３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体及び１．５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を１ｍＬ／ウエルずつ添加した。この培養器材を室温で５時間インキュベート後、培養器材から当該ＡＣＤ−Ａ液を吸引除去後、各ウエルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０２０７】
（３）細胞の初期活性化抗原の検討
実施例１３−（１）で調製したｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞 １．５×１０６ｃｅｌｌｓを０．５％血清含有ＧＴ−Ｔ５５１、３ｍＬに懸濁し、実施例１３−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。１６時間後に細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により染色後、フローサイトメトリーにより解析した。４８時間後に細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（ダコ社製）により染色後、同様に解析した。その結果を表１３−１に示す。なお表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０２０８】
【表１３−１】
【０２０９】
表１３−１に示されるように、ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期刺激として抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度を０．３μｇ／ｍＬにした場合、抗ＣＤ３抗体に１．５μｇ／ｍＬの溶液でＣＨ−２９６を固定化した場合には、リンパ球の初期活性化抗原であるＣＤ６９の発現上昇が確認された。同様にＣＤ６９に遅れて活性化に伴って発現が上昇するＣＤ２５においても低濃度抗ＣＤ３抗体にＣＨ−２９６を固定化した場合において優位にその発現が上昇することが確認された。すわなち、低濃度抗ＣＤ３抗体溶液とＣＨ−２９６溶液を組み合わせて固定化したプレートで細胞を刺激することで、初期活性化抗原の発現上昇が促進されることが示された。
【０２１０】
実施例１４ ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬ発現の検討
（１）細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現の検討
実施例１３−（１）で調製したｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞を、実施例１３−（２）で調製した抗ＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。１６時間後に細胞を回収し、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（ベックマンコールター社製）の方法に従って、ＰＥ標識マウス抗ヒトＢｃｌ−ｘＬ抗体（ベックマンコールター社製）で細胞内染色を行なった。この細胞をフローサイトメトリーにより解析した。その結果を表１４−１に示す。なお表中の値はＮ＝２の平均値を示す。
【０２１１】
【表１４−１】
【０２１２】
表１４−１に示されるように、ｒｅｓｔｉｎｇＴ細胞における初期刺激として抗ＣＤ３抗体の固定化時の濃度を０．３μｇ／ｍＬ及びＣＨ−２９６を１．５μｇ／ｍＬ固定化した場合に、アポトーシスを抑制する働きのあるＢｃｌ−ｘＬの発現強度が上昇することが確認された。
【０２１３】
実施例１５ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＲＮ−Ｔ細胞生着の経時的変化の検討
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化時の濃度は、抗ＣＤ３抗体は５μｇ／ｍＬ及びＣＨ−２９６は２５μｇ／ｍＬとした。
【０２１４】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス７週齢雌１０匹を使用した。投与後１日目、３日目、６日目、８日目、１４日目に２匹ずつ最終日とし、血液中及び各組織でのヒトＴ細胞の生着を検討した。
【０２１５】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０２１６】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１５−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法により投与した。なお、投与用の細胞は８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０２１７】
（５）血液中及び組織中ヒトＴ細胞の生着
細胞投与後１日目、３日目、６日目、８日目、１４日目にマウスより採血あるいは組織を摘出した。検討した部位は尾静脈、下大静脈、脾臓、鼠径リンパ節、骨髄、胸腺である。実施例８−（５）と同様にして、尾静脈及び下大静脈中のヒトＴ細胞の％キメリズムを検討した。結果を表１５−１に示す。また、実施例１１−（６）と同様にして、各組織のヒトリンパ球の陽性率（％）を検討した。このとき、脾臓及び骨髄についてはＡＣＫ ｂｕｆｆｅｒによる溶血操作を実施した。結果を表１５−２に示す。
【０２１８】
【表１５−１】
【０２１９】
【表１５−２】
＊ｎ．ｔ．は組織の摘出ができなかったことを示す。
【０２２０】
表１５−１に示されるように、細胞投与後３日目から１４日目についてＲＮ−Ｔ細胞は、血液中において高い％キメリズムを示した。また、組織におけるＲＮ−Ｔ細胞の経時的変化を検討したところ、表１５−２に示されるように、脾臓においては３日目と６日目で８０％以上のヒトリンパ球の陽性率（％）が確認できた。鼠径リンパ節は免疫不全マウスであるＮＯＤ／ｓｃｉｄにおいては発達していない組織であるが、６日目以降で肉眼的にも大きくなっていることが確認でき、６日目及び１４日目で約４５％以上のヒトリンパ球の陽性率（％）が確認できた。胸腺については６日目、骨髄については３日目において、ヒトリンパ球の陽性率（％）が上昇する傾向が見られたが、１４日目では数％程度の陽性率に減少した。
【０２２１】
（６）血液中及び組織中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例８−（６）と同様にヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。各群の平均の結果を表１５−３に示す。
【０２２２】
【表１５−３】
【０２２３】
表１５−３より、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率（％）は、各組織間で同程度の陽性率を示した。血液中及び組織に集積したＲＮ−Ｔ細胞は、６日目以降で投与前と同等かそれ以上のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率を示すことが明らかとなった。
【０２２４】
実施例１６ ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＲＮ−Ｔのリンパ組織への集積
（１）リンパ球の調製
実施例７−（２）と同様の方法でリンパ球拡大培養を行い、培養１０日目及び１４日目の細胞を実施例１−（１）と同様の方法で凍結保存した。なお、初期刺激方法は実施例１１−（１）と同様にした。
【０２２５】
（２）マウスと群構成
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス８週齢雌２４匹を以下の表１６−１に示す群構成とした。なお、各群はＮ＝４とした。
【０２２６】
【表１６−１】
【０２２７】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
実施例８−（３）と同様にして抗アシアロＧＭ１抗体を細胞投与前日に腹腔内に投与した。
【０２２８】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１６−（１）で調製したリンパ球を実施例８−（４）と同様の方法によりＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに投与した。なお、投与用の細胞は７．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／マウスになるよう４％ＨＳＡ含有生理食塩水に懸濁した。
【０２２９】
（５）末梢血中ヒトＴ細胞の生着及び絶対数の検討
実施例１１−（５）と同様にして、細胞投与後５日目及び７日目にマウスより尾静脈採血を実施し、移入したヒトリンパ球の陽性率（％キメリズム）及び絶対数［血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数（個／μＬ）］をフローサイトメトリーにより測定した。Ｎ＝４の平均値の結果を表１６−２に示す。
【０２３０】
【表１６−２】
【０２３１】
表１６−２に示されるように、細胞投与後５日目及び７日目のＲＮ−Ｔ群は他群と同等の高い％キメリズムを示したが、細胞投与後５日目においては血液１μＬあたりのｈＣＤ３陽性細胞数は他群と比較して高い値を示した。培養１０日間と１４日間での％キメリズムは同程度であったが、末梢血中におけるｈＣＤ３陽性細胞の絶対数は１０日間培養の細胞で高い傾向が示された。
【０２３２】
（６）末梢リンパ組織へのヒトＴ細胞の生着及び集積の解析
実施例１１−（６）と同様にして、細胞投与後７日目の末梢リンパ組織へのヒトＴ細胞の生着を解析した。脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。それぞれの結果を表１６−３に示す。
【０２３３】
【表１６−３】
【０２３４】
表１６−３に示されるように、細胞投与後７日目におけるヒトＴ細胞の脾臓での生着はＲＮ−Ｔ群とＯＫＴ３−Ｔ群で高い結果を示し、リンパ節での生着はＲＮ−Ｔ群で高い結果を示した。培養１０日間と１４日間では、１０日間培養の群でやや高い生着を示した。すなわち、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内で末梢リンパ組織での生着が他群に比べて高いことが明らかとなった。
【０２３５】
次に、ヒトＴ細胞の鼠径リンパ節への集積を解析した。得られた細胞数と表１６−３のリンパ節でのヒトＴ細胞の陽性率から鼠径リンパ節でのヒトＴ細胞の細胞数を求めた。その結果を表１６−４に示す。
【０２３６】
【表１６−４】
【０２３７】
表１６−４に示されるように、細胞投与後７日目におけるＲＮ−Ｔ群の鼠径リンパ節の細胞数は培養日数に関わらず、他群に比べて高い結果が示された。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、体内でリンパ節へ集積する能力が高いことが明らかとなった。
【０２３８】
（７）末梢血中及び末梢リンパ組織中ヒトＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例１６−（６）で調製された細胞について、実施例８−（６）と同様の方法でＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体により染色を行った。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。その結果を表１６−５に示す。なお、脾臓についてはＮ＝４の平均値を示す。
【０２３９】
【表１６−５】
【０２４０】
表１６−５に示されるように、細胞投与後７日目の末梢血、脾臓、鼠径リンパ節に生着したヒトリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率はＲＮ−Ｔ群において、多くは他群と同等かそれより高いことが示された。抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激するとナイーブＴ細胞が効率よく増殖するが、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの生体内においる末梢血及び末梢リンパ組織に生着するヒトＴ細胞はその表現型を高いまま維持することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２４１】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、生体への生着率、表現型の維持能力において優れており、養子免疫療法をはじめとする医療分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２４２】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named CH-296Na.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:21 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:22 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:23 ; Fibronectin fragment named H296-H296-H296-HT.
SEQ ID NO:24 ; Fibronectin fragment named CH296-CH296-HT.
SEQ ID NO:25 ; Fibronectin fragment named H105-H105-HT.
SEQ ID NO:26 ; Fibronectin fragment named H296-H296-HT.
SEQ ID NO:27 ; Fibronectin fragment named H296-H296-H296.
SEQ ID NO:28 ; Fibronectin fragment named H105-H105.
SEQ ID NO:29 ; Fibronectin fragment named H271-H296.
SEQ ID NO:30 ; Fibronectin fragment named H296-H271.
SEQ ID NO:31 ; Fibronectin fragment named 15aaH105-H105-HT.
SEQ ID NO:32 ; Fibronectin fragment named 15aaH105-H105.
SEQ ID NO:33 ; Fibronectin fragment named H105-H105Nc-HT
SEQ ID NO:34 ; Fibronectin fragment named H105-H105Nc.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下にリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する工程を包含するリンパ球の製造方法であって、
（１）５μｇ／ｍＬ未満の抗ＣＤ３抗体溶液を使用して前記抗体を固定化した固相、及び／又は
（２）２５μｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液を使用して前記ポリペプチドを固定化した固相
と接触させた状態でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することを特徴とするリンパ球の製造方法。
【請求項２】
固相が細胞培養用器材又は細胞培養用担体である請求項１記載の方法。
【請求項３】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＶＬＡ−４結合活性、ＶＬＡ−５結合活性、へパリン結合活性から選択される結合活性を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＣＳ−１ドメイン、細胞接着ドメイン、へパリン結合ドメインから選択されるフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが配列表の配列番号９〜３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項４記載の方法。
【請求項６】
リンパ球が抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である請求項１記載の方法。
【請求項７】
リンパ球に外来遺伝子を導入する工程を更に包含する請求項１記載の方法。
【請求項１】
抗ＣＤ３抗体とフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下にリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養する工程を包含するリンパ球の製造方法であって、
（１）５μｇ／ｍＬ未満の抗ＣＤ３抗体溶液を使用して前記抗体を固定化した固相、及び／又は
（２）２５μｇ／ｍＬ未満のフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチド溶液を使用して前記ポリペプチドを固定化した固相
と接触させた状態でリンパ球又はリンパ球の前駆細胞を培養することを特徴とするリンパ球の製造方法。
【請求項２】
固相が細胞培養用器材又は細胞培養用担体である請求項１記載の方法。
【請求項３】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＶＬＡ−４結合活性、ＶＬＡ−５結合活性、へパリン結合活性から選択される結合活性を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＣＳ−１ドメイン、細胞接着ドメイン、へパリン結合ドメインから選択されるフィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが配列表の配列番号９〜３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項４記載の方法。
【請求項６】
リンパ球が抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である請求項１記載の方法。
【請求項７】
リンパ球に外来遺伝子を導入する工程を更に包含する請求項１記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−９４１２３（Ｐ２０１０−９４１２３Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１２６６８（Ｐ２００９−２１２６６８）
【出願日】平成２１年９月１５日（２００９．９．１５）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１５日（２００９．９．１５）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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