リン脂質の加水分解方法及び塩基交換方法
【課題】 ホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応を効率よく行う方法を提供する。
【解決手段】 リン脂質と、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される少なくとも１種のヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を塩基交換する方法。
【解決手段】 リン脂質と、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される少なくとも１種のヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を塩基交換する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤと略す）を用いたリン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＬＤは、リン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応を触媒することが知られている。ＰＬＤは、例えば、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略す）又はホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略す）のようなリン脂質と、受容体であるアルコールとの間の塩基交換反応を触媒する。例えば、アルコールとしてグリセロールを用いた場合には、ホスファチジルグリセロール（以下、ＰＧと略す）が生産される。また、アルコールとしてセリンを用いた場合には、ホスファチジルセリン（以下、ＰＳと略す）が生産される。一方、受容体としてアルコールの代わりに水を用いた場合には、リン脂質の加水分解反応が進行し、ホスファチジン酸（以下、ＰＡと略す）が生産される。
【０００３】
一般的に、ＰＬＤを用いたリン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応は、水相及び有機溶媒相からなる二相系で行われる。水相は、主としてＰＬＤ、反応受容体、ｐＨ緩衝液、無機塩等を含む。一方、有機溶媒相は、主として親油性であるリン脂質等を含む。この二相系の反応は、水相と有機溶媒相とを適宜に攪拌、混合して接触させることにより行われる（例えば、特許文献１を参照）。
しかし、上記の二相系反応では、反応に必要な成分が二相に分かれて存在するため、攪拌等の操作によって水相と有機溶媒相とを十分に接触させなければ反応が効率よく進行しないという問題点があった。
【０００４】
上記の問題を解決するために、Ｗ／Ｏ型エマルジョン中でホスファチジル基転移反応を行う方法（特許文献２を参照）、カルシウム塩の存在下において、水性条件下でホスファチジルセリンを製造する方法（特許文献３を参照）等の改良方法が報告されている。
しかし、これらの改良方法では、反応系中に、本来反応には不必要な界面活性剤又はカルシウムが存在することになり、生成物の単離工程が複雑化する等の問題点が生じ、好ましい製造方法とはいえない。
【０００５】
また、有機溶媒にリン脂質を溶解した均一相で反応を行う方法も報告されている（特許文献４、５を参照）。これらの方法では、リン脂質を十分溶解するため有機溶媒として炭素数４以上のエステル類や炭素数５以上のケトン類等を使用しており、得られた生成物を単離するため、更に別の有機溶媒を使用するかクロマトグラフィーを用いる必要があった。
【特許文献１】特開２００１−１８６８９８号公報
【特許文献２】特開２００４−２１５５２８号公報
【特許文献３】特開２０００−３３３６８９号公報
【特許文献４】特開昭６３−２４５６８４号公報
【特許文献５】特開昭６３−２４５６８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述の種々の問題点を解決し、ＰＬＤを用いたリン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応を効率よく行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、リン脂質を溶解せず、従来は酵素失活作用が強いと言われていたアセトンを含む均一溶媒系で、ＰＬＤによるリン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応が効率よく進行し、単離工程が更に簡便になることを見出した。
すなわち、本発明は、リン脂質と、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される少なくとも１種のヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を塩基交換する方法を提供する。
さらに、本発明は、リン脂質と水とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を加水分解する方法を提供する。
好ましくは、これらの方法において使用されるホスホリパーゼＤは、微生物由来である。
更に好ましくは、これらの方法において使用されるホスホリパーゼＤは、放線菌由来である。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のリン脂質の塩基交換方法及び加水分解方法は、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物、又は、リン脂質と水とを、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含むものである。
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法では、アセトンと水からなる均一相で反応を行う。上記「アセトンと水からなる均一相」とは、２５℃で１時間静置してもアセトンと水が層分離を起こさない相を意味し、エマルションを除く。
アセトンは、これまで酵素失活作用が強い化合物とされ、使用する場合であってもその配合量が限定されていたが、本発明の塩基交換方法及び加水分解方法ではその含有量に関係なく反応を行うことができる。
上記塩基交換方法では、アセトンの含有量は、ヒドロキシル基含有化合物の種類にもよるが、反応効率がよい点で好ましくは全化合物の合計量に対して１５〜７０質量％である。なお、アセトンと水との量比は特に限定されないが、好ましくは、（アセトン：水）が１：３〜５：１である。
上記加水分解方法における好ましいアセトンの含有量及びアセトンと水との量比は、上記塩基交換方法と同じである。
本発明のリン脂質の塩基交換方法及び加水分解方法において、リン脂質は通常アセトンと水からなる均一相中で溶解せず、分散又は沈殿した状態で、ヒドロキシル基含有化合物又は水と反応する。リン脂質が分散又は沈殿のいずれの状態となるかは反応系中のアセトンの含有量に依存し、アセトンが少ないと分散する傾向にある。但し、上記塩基交換方法において、ヒドロキシル基含有化合物としてグリセロールを用いた場合、グリセロールの添加量によってはリン脂質が溶解して反応系が溶液になる場合もある。
【０００９】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法において用いる水としては、イオン交換水、精製水、蒸留水、水道水等が挙げられる。さらに、これらに酢酸等を含有させてｐＨ調整のための緩衝液としてもよい。好ましくは、イオン交換水、精製水又は蒸留水が用いられる。
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法において、アセトンと水以外の他の溶媒は添加しなくてもよいが、均一相の状態を維持できる範囲で添加することができる。このような他の溶媒としては、例えばヘプタン等が挙げられる。
本発明では、アセトンと水からなる均一相中で塩基交換反応又は加水分解反応を行うので、界面活性剤やカルシウム塩を添加することなく効率よく反応を行うことができるが、界面活性剤やカルシウム塩等の塩を用いてもよい。
【００１０】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法に用いられるリン脂質は、いかなる起源のものでもよい。リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物、当該抽出物を精製したもの、合成リン脂質等が好適に用いられる。このようなリン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、これらの混合物等が挙げられる。上記リン脂質は、単独で用いてもよいし、２種以上を同時に用いてもよく、一般的には、大豆レシチン、卵黄レシチン又は菜種レシチン等が用いられる。
リン脂質の純度は、好ましくは、上記の化合物の全質量を基準として２０〜９９．５質量％である。また、上記リン脂質は、本反応系中で０．１〜６０質量％用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明の塩基交換方法に用いられるヒドロキシル基含有化合物は、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される。
アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アスコルビン酸等が挙げられる。
含窒素アルコール類としては、例えば、セリンなどのアミノ酸；１−アミノ−２−プロパノールなどが挙げられる。
糖類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン等のヌクレオシド；グルコース、トレハロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が挙げられる。
ポリオール類としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
ヒドロキシ環状化合物としては、例えば、麹酸、アルブチン等が挙げられる。
上記ヒドロキシル基含有化合物は、上記リン脂質に対して１〜１００００モル％用いるのが好ましい。
【００１２】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法で用いられるＰＬＤは、リン脂質の塩基部分を加水分解する酵素である。
このようなＰＬＤとしては、植物由来（例えばキャベツ由来）のＰＬＤ、微生物由来（例えば放線菌由来）のＰＬＤ等が挙げられる。好ましくは、微生物由来のＰＬＤが用いられ、より好ましくは、放線菌由来のＰＬＤが用いられる。
【００１３】
本発明で用いられる放線菌は、ＰＬＤを生成するものであれば全て用いることができる。特に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロモノスポーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ノカルディオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、アクチノマデューラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属などに属する微生物が好ましく用いられる。
より具体的には、ストレプトマイセス・シンナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ ＩＦＯ１２８５２）、ミクロモノスポーラ・チヤルセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈａｌｃｅａ ＡＴＣＣ １２４５２）、ノカルディア・メディテラーネイ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ ＩＦＯ１３１４２）、ノカルデイオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＩＦＯ １３９０８）、アクチノマデューラ・リバノチカ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｌｉｂａｎｏｔｉｃａ ＩＦＯ １４０９５）などが挙げられる。これらの他にも、上記の属に属する放線菌であれば、公知の微生物、および自然界から単離された微生物が用いられる。また、ＰＬＤの生産性を向上させた上記微生物の変異株、および上記微生物から単離したＰＬＤ遺伝子を同種または異種の宿主に導入してＰＬＤの生産性を向上させた菌株も、本発明の方法に使用することができる。
【００１４】
ＰＬＤは、通常、上記微生物を好気的に培養して得られる。培養に用いる培地としては、微生物の培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素源としては、例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、デンプン、デキストリン、糖蜜、グリセロールなどの同化可能な炭水化物や炭化水素類などが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば特に限定されず、例えば、コーンスチープリカー、大豆粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、カゼインなどが使用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用される。
培養温度は、菌が生育し、かつＰＬＤが生成される範囲内で適宜採用することができ、通常１５〜４０℃である。培養時間は条件によって異なるが、ＰＬＤ活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、通常１〜６日程度である。
なお、ＰＬＤは菌体外に生成されるものでもよく、菌体内に生成されるものでもよい。例えば、ＰＬＤを含有する培養液でもよく、培養液あるいは培養菌体から精製した酵素であってもよい。これらはいずれも本発明の方法に使用することができる。
【００１５】
本発明で用いられるＰＬＤの使用量は、リン脂質１ｇに対し、１〜１００００単位（以下、単位Ｕを用いる）、好ましくは２０〜８０００Ｕ、さらに好ましくは１０〜１０００Ｕの範囲で選択することができる。なお、酵素活性の１Ｕは、９５％大豆ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。
【００１６】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法において、リン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応の温度は、１０〜６０℃が好ましく、２５〜５０℃がさらに好ましい。反応の所要時間は、酵素量及び／又は反応温度に依存して変動する。反応時間は、通常は、約０．５〜４８時間、好ましくは２〜６時間である。二相系の反応では、反応を十分に進行させるために水相と溶媒相とを十分に混合させる必要があるが、本発明の塩基交換方法及び加水分解方法は、アセトンと水からなる均一相で行うので、反応時に攪拌等をすることは必須ではなく、静置状態でも十分反応が進行する。しかし、反応時に攪拌、振とう等の処理を施すことを否定するものではない。
【００１７】
リン脂質の塩基交換反応及び／又は加水分解反応の終了後、得られたＰＧ、ＰＳ、ＰＡ等の単離は、例えば、減圧下で水及びアセトンを除去することにより容易に行うことができる。また、当業者によく知られた方法により、シリカゲル、アルミナゲル、逆相担体等を用いたカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等を用いて行うこともできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、均一溶媒中で反応が進行するため、静置状態であってもリン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応が効率よく進行する。さらに、水及びアセトンは、反応後に減圧下で容易に除去できるため、生成物の単離工程が複雑化するという問題も生じない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１：グリセロールを用いたリン脂質の塩基交換反応）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製、ＰＣ２０〜２５重量％、ＰＥ１５〜２０重量％）４ｇ、グリセロール２ｇを蒸留水４ｍＬに加え、常温で均一になるまで混合して混合物Ａを作成した（約１〜２時間）。混合物Ａを０．２ｇずつ１０個に分け、それぞれにＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、９個の混合物に、アセトン４μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ、２０００μＬをそれぞれ添加した。残りの１個はアセトンを添加せずに反応させる。これら１０個の混合物を、振動させながら、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、以下の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
【００２０】
使用カラム：ジーエルサイエンス社製 Ｕｎｉｓｉｌ Ｑ ＮＨ２（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：アセトニトリル／メタノール／５０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝１８５６／８７４／２７０
流速：１．３ｍＬ／分
検出：ＵＶ ２０５ｎｍ
【００２１】
実施例１の結果を表１及び図１に示す。表１及び図１は、添加したアセトンの量と生成したＰＧ量との関係を示す表及びグラフである。
表１及び図１において、
アセトン（容積％）：（添加したアセトン（μＬ）／（混合物Ａ＋アセトン）（μＬ））×１００
ＰＧ（重量％）：酵素処理後のサンプル中のＰＧ量／酵素処理後のサンプル中の全リン脂質量×１００である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
添加するアセトンの量が増えるにつれて、生成するＰＧの量が増えていき、アセトン（容積％）＝５０でＰＧ（重量％）＝６７と最大値を示した。アセトン（容積％）＝５０を超えてさらにアセトンを添加した場合、生成するＰＧの量は徐々に減少していく傾向が見られた。
【００２４】
（実施例２：セリンを用いたリン脂質の塩基交換反応）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）４ｇ、セリン飽和水溶液（２５℃）６ｇを常温で混合して混合物Ｂを作成した。混合物Ｂ０．２ｇに、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン０μＬ、４μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ、２０００μＬをそれぞれ添加した。これらの混合物を、振動させながら、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
実施例２の結果を表２及び図２に示す。表２及び図２は、添加したアセトンの量と生成したＰＳ量との関係を示す表及びグラフである。
表２及び図２において、
アセトン（容積％）：（添加したアセトン（μＬ）／（混合物Ｂ＋アセトン）（μＬ））×１００
ＰＳ（重量％）：酵素処理後のサンプル中のＰＳ量／酵素処理後のサンプル中の全リン脂質量×１００である。
【００２５】
【表２】
【００２６】
添加するアセトンの量が増えるにつれて、生成するＰＳの量が増えていき、アセトン（容積％）＝２９でＰＳ（重量％）＝３７と最大値を示した。アセトン（容積％）＝２９を超えてさらにアセトンを添加した場合、生成するＰＳの量は徐々に減少していく傾向が見られた。
【００２７】
（実施例３：リン脂質の加水分解反応）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）４ｇ、蒸留水６ｇを常温で均一になるまで混合して混合物Ｃを作成した。混合物Ｃ０．２ｇに、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン０μＬ、４μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ、２０００μＬをそれぞれ添加した。これらの混合物を、振動させながら、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
【００２８】
実施例３の結果を表３及び図３に示す。表３及び図３は、添加したアセトンの量と生成したＰＡ量との関係を示す表及びグラフである。
表３及び図３において、
アセトン（容積％）：（添加したアセトン（μＬ）／（混合物Ｃ＋アセトン）（μＬ））×１００
ＰＡ（重量％）：酵素処理後のサンプル中のＰＡ量／酵素処理後のサンプル中の全リン脂質量×１００
である。
【００２９】
【表３】
【００３０】
添加するアセトンの量が増えるにつれて、生成するＰＡの量が増えていき、アセトン（容積％）＝２９でＰＡ（重量％）＝３２と最大値を示した。アセトン（容積％）＝２９を超えてさらにアセトンを添加した場合、生成するＰＡの量は徐々に減少していく傾向が見られた。
【００３１】
（実施例４：反応温度）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）４ｇ、グリセロール２ｇを蒸留水４ｍＬに加え、常温で均一になるまで混合した（約１〜２時間）。この混合物０．２ｇに、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン１．００μＬを添加した（アセトン（容積％）＝３３に相当）。アセトンを添加したサンプルと、アセトンを添加していないサンプルとを対にして、これらの混合物を、それぞれ、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃及び６０℃で４時間静置して反応させた。反応修了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
実施例４の結果を表４及び図４に示す。表４は、アセトンを添加した系又は添加しない系において、反応温度と、ＰＣ及びＰＥの転移率と、生成したＰＧ量との関係を示す表であり、図４は、アセトンを添加した系又は添加しない系において、反応温度と、生成したＰＧ量との関係を示すグラフである。
【００３２】
表４において、
ＰＣの転移率（％）：（酵素処理前のＰＣ量−酵素処理後のＰＣ量）／（酵素処理前のＰＣ量）×１００
ＰＥの転移率（％）：（酵素処理前のＰＥ量−酵素処理後のＰＥ量）／（酵素処理前のＰＥ量）×１００
である。
また、表４及び図４において、ＰＧ（重量％）は実施例１に記載した式により計算した値である。
【００３３】
【表４】
【００３４】
いずれの反応温度においても、アセトンを添加した系では、アセトンを添加しない系よりもＰＧ（重量％）が高い結果となった。また、アセトンを添加した系において、反応温度４０〜６０℃でＰＧ（重量％）＝６７〜６８であり、２０℃の場合と比較してＰＧ（重量％）が高かった。更に、ＰＣとＰＥを比較すると、反応温度やアセトンの有無に関わらず、ＰＣの方が転移率が高かった。
【００３５】
（実施例５：緩衝液を添加した反応系）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）２．０ｇ、グリセロール０．８ｇ、及び１５０ｍＭ酢酸緩衝液３．６ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を２０００Ｕ（レシチン１ｇあたり１０００Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン３．６ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝約３６）。比較として、アセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらの混合物を、３０℃で３．５時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝６５
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝３４
【００３６】
（実施例６：緩衝液を添加した反応系）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）３．０ｇ、グリセロール１．２ｇ、及び１２５ｍＭ酢酸緩衝液４ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を２０００Ｕ（レシチン１ｇあたり６６７Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン１．８ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝約１８）。比較として、アセトン１．８ｍＬの代わりに蒸留水１．８ｍＬを添加したサンプルを別途作成した。これらのサンプルを、３０℃で３．５時間攪拌しながら反応させた。
反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝６５
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝４０
【００３７】
（実施例７）
レシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（辻製油社製、ＰＣ約７５重量％、ＰＥ約２０重量％）３．０ｇ、グリセロール１．０ｇ、及び蒸留水１．０ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物にアセトン１．０ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝１７）。さらに、この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を３００Ｕ（レシチン１ｇあたり１００Ｕ）の活性を有するように添加した。比較として、アセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらのサンプルを、３０℃で３．５時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝７３
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝３７
【００３８】
（実施例８）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）０．５ｇ、グリセロール１．０ｇ、及び蒸留水３．５ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、アセトン２．５ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝３３）。さらに、この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を２５Ｕ（レシチン１ｇあたり１００Ｕ）の活性を有するように添加した。比較として、アセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらの混合物を、４０℃で３時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝５９
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝４２
【００３９】
（実施例９）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）０．１ｇ、グリセロール０．３ｇ、及び蒸留水０．６ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、アセトン０．２ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝１７）。さらに、この混合物に、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．（フナコシ社製）由来ＰＬＤを５Ｕ（レシチン１ｇあたり５０Ｕ）の活性を有するように添加した。比較としを、４０℃で３時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝２１
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝１７
【００４０】
（実施例１０）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）０．１ｇ、グリセロール０．３ｇ、及び蒸留水０．６ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、アセトン０．２ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝１７）。さらに、この混合物に、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．（生化学工業社製）由来ＰＬＤを５Ｕ（レシチン１ｇあたり５０Ｕ）の活性を有するように添加した。比較としてレアセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらの混合物を、４０℃で３時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝６４
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝４８
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】添加したアセトンの量と生成したＰＧ量との関係を示す図である。
【図２】添加したアセトンの量と生成したＰＳ量との関係を示す図である。
【図３】添加したアセトンの量と生成したＰＡ量との関係を示す図である。
【図４】アセトンを添加した系又は添加しない系において、反応温度と、生成したＰＧ量との関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤと略す）を用いたリン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＬＤは、リン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応を触媒することが知られている。ＰＬＤは、例えば、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略す）又はホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略す）のようなリン脂質と、受容体であるアルコールとの間の塩基交換反応を触媒する。例えば、アルコールとしてグリセロールを用いた場合には、ホスファチジルグリセロール（以下、ＰＧと略す）が生産される。また、アルコールとしてセリンを用いた場合には、ホスファチジルセリン（以下、ＰＳと略す）が生産される。一方、受容体としてアルコールの代わりに水を用いた場合には、リン脂質の加水分解反応が進行し、ホスファチジン酸（以下、ＰＡと略す）が生産される。
【０００３】
一般的に、ＰＬＤを用いたリン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応は、水相及び有機溶媒相からなる二相系で行われる。水相は、主としてＰＬＤ、反応受容体、ｐＨ緩衝液、無機塩等を含む。一方、有機溶媒相は、主として親油性であるリン脂質等を含む。この二相系の反応は、水相と有機溶媒相とを適宜に攪拌、混合して接触させることにより行われる（例えば、特許文献１を参照）。
しかし、上記の二相系反応では、反応に必要な成分が二相に分かれて存在するため、攪拌等の操作によって水相と有機溶媒相とを十分に接触させなければ反応が効率よく進行しないという問題点があった。
【０００４】
上記の問題を解決するために、Ｗ／Ｏ型エマルジョン中でホスファチジル基転移反応を行う方法（特許文献２を参照）、カルシウム塩の存在下において、水性条件下でホスファチジルセリンを製造する方法（特許文献３を参照）等の改良方法が報告されている。
しかし、これらの改良方法では、反応系中に、本来反応には不必要な界面活性剤又はカルシウムが存在することになり、生成物の単離工程が複雑化する等の問題点が生じ、好ましい製造方法とはいえない。
【０００５】
また、有機溶媒にリン脂質を溶解した均一相で反応を行う方法も報告されている（特許文献４、５を参照）。これらの方法では、リン脂質を十分溶解するため有機溶媒として炭素数４以上のエステル類や炭素数５以上のケトン類等を使用しており、得られた生成物を単離するため、更に別の有機溶媒を使用するかクロマトグラフィーを用いる必要があった。
【特許文献１】特開２００１−１８６８９８号公報
【特許文献２】特開２００４−２１５５２８号公報
【特許文献３】特開２０００−３３３６８９号公報
【特許文献４】特開昭６３−２４５６８４号公報
【特許文献５】特開昭６３−２４５６８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述の種々の問題点を解決し、ＰＬＤを用いたリン脂質の加水分解反応及び塩基交換反応を効率よく行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、リン脂質を溶解せず、従来は酵素失活作用が強いと言われていたアセトンを含む均一溶媒系で、ＰＬＤによるリン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応が効率よく進行し、単離工程が更に簡便になることを見出した。
すなわち、本発明は、リン脂質と、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される少なくとも１種のヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を塩基交換する方法を提供する。
さらに、本発明は、リン脂質と水とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を加水分解する方法を提供する。
好ましくは、これらの方法において使用されるホスホリパーゼＤは、微生物由来である。
更に好ましくは、これらの方法において使用されるホスホリパーゼＤは、放線菌由来である。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のリン脂質の塩基交換方法及び加水分解方法は、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物、又は、リン脂質と水とを、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含むものである。
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法では、アセトンと水からなる均一相で反応を行う。上記「アセトンと水からなる均一相」とは、２５℃で１時間静置してもアセトンと水が層分離を起こさない相を意味し、エマルションを除く。
アセトンは、これまで酵素失活作用が強い化合物とされ、使用する場合であってもその配合量が限定されていたが、本発明の塩基交換方法及び加水分解方法ではその含有量に関係なく反応を行うことができる。
上記塩基交換方法では、アセトンの含有量は、ヒドロキシル基含有化合物の種類にもよるが、反応効率がよい点で好ましくは全化合物の合計量に対して１５〜７０質量％である。なお、アセトンと水との量比は特に限定されないが、好ましくは、（アセトン：水）が１：３〜５：１である。
上記加水分解方法における好ましいアセトンの含有量及びアセトンと水との量比は、上記塩基交換方法と同じである。
本発明のリン脂質の塩基交換方法及び加水分解方法において、リン脂質は通常アセトンと水からなる均一相中で溶解せず、分散又は沈殿した状態で、ヒドロキシル基含有化合物又は水と反応する。リン脂質が分散又は沈殿のいずれの状態となるかは反応系中のアセトンの含有量に依存し、アセトンが少ないと分散する傾向にある。但し、上記塩基交換方法において、ヒドロキシル基含有化合物としてグリセロールを用いた場合、グリセロールの添加量によってはリン脂質が溶解して反応系が溶液になる場合もある。
【０００９】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法において用いる水としては、イオン交換水、精製水、蒸留水、水道水等が挙げられる。さらに、これらに酢酸等を含有させてｐＨ調整のための緩衝液としてもよい。好ましくは、イオン交換水、精製水又は蒸留水が用いられる。
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法において、アセトンと水以外の他の溶媒は添加しなくてもよいが、均一相の状態を維持できる範囲で添加することができる。このような他の溶媒としては、例えばヘプタン等が挙げられる。
本発明では、アセトンと水からなる均一相中で塩基交換反応又は加水分解反応を行うので、界面活性剤やカルシウム塩を添加することなく効率よく反応を行うことができるが、界面活性剤やカルシウム塩等の塩を用いてもよい。
【００１０】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法に用いられるリン脂質は、いかなる起源のものでもよい。リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物、当該抽出物を精製したもの、合成リン脂質等が好適に用いられる。このようなリン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、これらの混合物等が挙げられる。上記リン脂質は、単独で用いてもよいし、２種以上を同時に用いてもよく、一般的には、大豆レシチン、卵黄レシチン又は菜種レシチン等が用いられる。
リン脂質の純度は、好ましくは、上記の化合物の全質量を基準として２０〜９９．５質量％である。また、上記リン脂質は、本反応系中で０．１〜６０質量％用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明の塩基交換方法に用いられるヒドロキシル基含有化合物は、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される。
アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アスコルビン酸等が挙げられる。
含窒素アルコール類としては、例えば、セリンなどのアミノ酸；１−アミノ−２−プロパノールなどが挙げられる。
糖類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン等のヌクレオシド；グルコース、トレハロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が挙げられる。
ポリオール類としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
ヒドロキシ環状化合物としては、例えば、麹酸、アルブチン等が挙げられる。
上記ヒドロキシル基含有化合物は、上記リン脂質に対して１〜１００００モル％用いるのが好ましい。
【００１２】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法で用いられるＰＬＤは、リン脂質の塩基部分を加水分解する酵素である。
このようなＰＬＤとしては、植物由来（例えばキャベツ由来）のＰＬＤ、微生物由来（例えば放線菌由来）のＰＬＤ等が挙げられる。好ましくは、微生物由来のＰＬＤが用いられ、より好ましくは、放線菌由来のＰＬＤが用いられる。
【００１３】
本発明で用いられる放線菌は、ＰＬＤを生成するものであれば全て用いることができる。特に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロモノスポーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ノカルディオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、アクチノマデューラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属などに属する微生物が好ましく用いられる。
より具体的には、ストレプトマイセス・シンナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ ＩＦＯ１２８５２）、ミクロモノスポーラ・チヤルセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈａｌｃｅａ ＡＴＣＣ １２４５２）、ノカルディア・メディテラーネイ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ ＩＦＯ１３１４２）、ノカルデイオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＩＦＯ １３９０８）、アクチノマデューラ・リバノチカ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｌｉｂａｎｏｔｉｃａ ＩＦＯ １４０９５）などが挙げられる。これらの他にも、上記の属に属する放線菌であれば、公知の微生物、および自然界から単離された微生物が用いられる。また、ＰＬＤの生産性を向上させた上記微生物の変異株、および上記微生物から単離したＰＬＤ遺伝子を同種または異種の宿主に導入してＰＬＤの生産性を向上させた菌株も、本発明の方法に使用することができる。
【００１４】
ＰＬＤは、通常、上記微生物を好気的に培養して得られる。培養に用いる培地としては、微生物の培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素源としては、例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、デンプン、デキストリン、糖蜜、グリセロールなどの同化可能な炭水化物や炭化水素類などが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば特に限定されず、例えば、コーンスチープリカー、大豆粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、カゼインなどが使用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用される。
培養温度は、菌が生育し、かつＰＬＤが生成される範囲内で適宜採用することができ、通常１５〜４０℃である。培養時間は条件によって異なるが、ＰＬＤ活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、通常１〜６日程度である。
なお、ＰＬＤは菌体外に生成されるものでもよく、菌体内に生成されるものでもよい。例えば、ＰＬＤを含有する培養液でもよく、培養液あるいは培養菌体から精製した酵素であってもよい。これらはいずれも本発明の方法に使用することができる。
【００１５】
本発明で用いられるＰＬＤの使用量は、リン脂質１ｇに対し、１〜１００００単位（以下、単位Ｕを用いる）、好ましくは２０〜８０００Ｕ、さらに好ましくは１０〜１０００Ｕの範囲で選択することができる。なお、酵素活性の１Ｕは、９５％大豆ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。
【００１６】
本発明の塩基交換方法及び加水分解方法において、リン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応の温度は、１０〜６０℃が好ましく、２５〜５０℃がさらに好ましい。反応の所要時間は、酵素量及び／又は反応温度に依存して変動する。反応時間は、通常は、約０．５〜４８時間、好ましくは２〜６時間である。二相系の反応では、反応を十分に進行させるために水相と溶媒相とを十分に混合させる必要があるが、本発明の塩基交換方法及び加水分解方法は、アセトンと水からなる均一相で行うので、反応時に攪拌等をすることは必須ではなく、静置状態でも十分反応が進行する。しかし、反応時に攪拌、振とう等の処理を施すことを否定するものではない。
【００１７】
リン脂質の塩基交換反応及び／又は加水分解反応の終了後、得られたＰＧ、ＰＳ、ＰＡ等の単離は、例えば、減圧下で水及びアセトンを除去することにより容易に行うことができる。また、当業者によく知られた方法により、シリカゲル、アルミナゲル、逆相担体等を用いたカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等を用いて行うこともできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、均一溶媒中で反応が進行するため、静置状態であってもリン脂質の加水分解反応及び／又は塩基交換反応が効率よく進行する。さらに、水及びアセトンは、反応後に減圧下で容易に除去できるため、生成物の単離工程が複雑化するという問題も生じない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１：グリセロールを用いたリン脂質の塩基交換反応）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製、ＰＣ２０〜２５重量％、ＰＥ１５〜２０重量％）４ｇ、グリセロール２ｇを蒸留水４ｍＬに加え、常温で均一になるまで混合して混合物Ａを作成した（約１〜２時間）。混合物Ａを０．２ｇずつ１０個に分け、それぞれにＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、９個の混合物に、アセトン４μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ、２０００μＬをそれぞれ添加した。残りの１個はアセトンを添加せずに反応させる。これら１０個の混合物を、振動させながら、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、以下の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
【００２０】
使用カラム：ジーエルサイエンス社製 Ｕｎｉｓｉｌ Ｑ ＮＨ２（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：アセトニトリル／メタノール／５０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝１８５６／８７４／２７０
流速：１．３ｍＬ／分
検出：ＵＶ ２０５ｎｍ
【００２１】
実施例１の結果を表１及び図１に示す。表１及び図１は、添加したアセトンの量と生成したＰＧ量との関係を示す表及びグラフである。
表１及び図１において、
アセトン（容積％）：（添加したアセトン（μＬ）／（混合物Ａ＋アセトン）（μＬ））×１００
ＰＧ（重量％）：酵素処理後のサンプル中のＰＧ量／酵素処理後のサンプル中の全リン脂質量×１００である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
添加するアセトンの量が増えるにつれて、生成するＰＧの量が増えていき、アセトン（容積％）＝５０でＰＧ（重量％）＝６７と最大値を示した。アセトン（容積％）＝５０を超えてさらにアセトンを添加した場合、生成するＰＧの量は徐々に減少していく傾向が見られた。
【００２４】
（実施例２：セリンを用いたリン脂質の塩基交換反応）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）４ｇ、セリン飽和水溶液（２５℃）６ｇを常温で混合して混合物Ｂを作成した。混合物Ｂ０．２ｇに、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン０μＬ、４μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ、２０００μＬをそれぞれ添加した。これらの混合物を、振動させながら、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
実施例２の結果を表２及び図２に示す。表２及び図２は、添加したアセトンの量と生成したＰＳ量との関係を示す表及びグラフである。
表２及び図２において、
アセトン（容積％）：（添加したアセトン（μＬ）／（混合物Ｂ＋アセトン）（μＬ））×１００
ＰＳ（重量％）：酵素処理後のサンプル中のＰＳ量／酵素処理後のサンプル中の全リン脂質量×１００である。
【００２５】
【表２】
【００２６】
添加するアセトンの量が増えるにつれて、生成するＰＳの量が増えていき、アセトン（容積％）＝２９でＰＳ（重量％）＝３７と最大値を示した。アセトン（容積％）＝２９を超えてさらにアセトンを添加した場合、生成するＰＳの量は徐々に減少していく傾向が見られた。
【００２７】
（実施例３：リン脂質の加水分解反応）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）４ｇ、蒸留水６ｇを常温で均一になるまで混合して混合物Ｃを作成した。混合物Ｃ０．２ｇに、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン０μＬ、４μＬ、１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ、８０μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ、２０００μＬをそれぞれ添加した。これらの混合物を、振動させながら、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
【００２８】
実施例３の結果を表３及び図３に示す。表３及び図３は、添加したアセトンの量と生成したＰＡ量との関係を示す表及びグラフである。
表３及び図３において、
アセトン（容積％）：（添加したアセトン（μＬ）／（混合物Ｃ＋アセトン）（μＬ））×１００
ＰＡ（重量％）：酵素処理後のサンプル中のＰＡ量／酵素処理後のサンプル中の全リン脂質量×１００
である。
【００２９】
【表３】
【００３０】
添加するアセトンの量が増えるにつれて、生成するＰＡの量が増えていき、アセトン（容積％）＝２９でＰＡ（重量％）＝３２と最大値を示した。アセトン（容積％）＝２９を超えてさらにアセトンを添加した場合、生成するＰＡの量は徐々に減少していく傾向が見られた。
【００３１】
（実施例４：反応温度）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）４ｇ、グリセロール２ｇを蒸留水４ｍＬに加え、常温で均一になるまで混合した（約１〜２時間）。この混合物０．２ｇに、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を１０Ｕ（レシチン１ｇあたり１２５Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン１．００μＬを添加した（アセトン（容積％）＝３３に相当）。アセトンを添加したサンプルと、アセトンを添加していないサンプルとを対にして、これらの混合物を、それぞれ、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃及び６０℃で４時間静置して反応させた。反応修了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
実施例４の結果を表４及び図４に示す。表４は、アセトンを添加した系又は添加しない系において、反応温度と、ＰＣ及びＰＥの転移率と、生成したＰＧ量との関係を示す表であり、図４は、アセトンを添加した系又は添加しない系において、反応温度と、生成したＰＧ量との関係を示すグラフである。
【００３２】
表４において、
ＰＣの転移率（％）：（酵素処理前のＰＣ量−酵素処理後のＰＣ量）／（酵素処理前のＰＣ量）×１００
ＰＥの転移率（％）：（酵素処理前のＰＥ量−酵素処理後のＰＥ量）／（酵素処理前のＰＥ量）×１００
である。
また、表４及び図４において、ＰＧ（重量％）は実施例１に記載した式により計算した値である。
【００３３】
【表４】
【００３４】
いずれの反応温度においても、アセトンを添加した系では、アセトンを添加しない系よりもＰＧ（重量％）が高い結果となった。また、アセトンを添加した系において、反応温度４０〜６０℃でＰＧ（重量％）＝６７〜６８であり、２０℃の場合と比較してＰＧ（重量％）が高かった。更に、ＰＣとＰＥを比較すると、反応温度やアセトンの有無に関わらず、ＰＣの方が転移率が高かった。
【００３５】
（実施例５：緩衝液を添加した反応系）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）２．０ｇ、グリセロール０．８ｇ、及び１５０ｍＭ酢酸緩衝液３．６ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を２０００Ｕ（レシチン１ｇあたり１０００Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン３．６ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝約３６）。比較として、アセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらの混合物を、３０℃で３．５時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝６５
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝３４
【００３６】
（実施例６：緩衝液を添加した反応系）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）３．０ｇ、グリセロール１．２ｇ、及び１２５ｍＭ酢酸緩衝液４ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を２０００Ｕ（レシチン１ｇあたり６６７Ｕ）の活性を有するように添加し、さらにアセトン１．８ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝約１８）。比較として、アセトン１．８ｍＬの代わりに蒸留水１．８ｍＬを添加したサンプルを別途作成した。これらのサンプルを、３０℃で３．５時間攪拌しながら反応させた。
反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝６５
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝４０
【００３７】
（実施例７）
レシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（辻製油社製、ＰＣ約７５重量％、ＰＥ約２０重量％）３．０ｇ、グリセロール１．０ｇ、及び蒸留水１．０ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物にアセトン１．０ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝１７）。さらに、この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を３００Ｕ（レシチン１ｇあたり１００Ｕ）の活性を有するように添加した。比較として、アセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらのサンプルを、３０℃で３．５時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝７３
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝３７
【００３８】
（実施例８）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）０．５ｇ、グリセロール１．０ｇ、及び蒸留水３．５ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、アセトン２．５ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝３３）。さらに、この混合物に、ＰＬＤナガセ（ナガセケムテックス社製）を２５Ｕ（レシチン１ｇあたり１００Ｕ）の活性を有するように添加した。比較として、アセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらの混合物を、４０℃で３時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝５９
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝４２
【００３９】
（実施例９）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）０．１ｇ、グリセロール０．３ｇ、及び蒸留水０．６ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、アセトン０．２ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝１７）。さらに、この混合物に、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．（フナコシ社製）由来ＰＬＤを５Ｕ（レシチン１ｇあたり５０Ｕ）の活性を有するように添加した。比較としを、４０℃で３時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝２１
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝１７
【００４０】
（実施例１０）
レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（ＡＤＭ社製）０．１ｇ、グリセロール０．３ｇ、及び蒸留水０．６ｇを、常温で均一になるまで混合した。この混合物に、アセトン０．２ｍＬを添加した（アセトン（容積％）＝１７）。さらに、この混合物に、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．（生化学工業社製）由来ＰＬＤを５Ｕ（レシチン１ｇあたり５０Ｕ）の活性を有するように添加した。比較としてレアセトンを添加しないサンプルを別途作成した。これらの混合物を、４０℃で３時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応物をクロロホルム／メタノール＝１：１に溶解し、上記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて反応物の分析を行った。
アセトン添加あり：ＰＧ（重量％）＝６４
アセトン添加なし：ＰＧ（重量％）＝４８
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】添加したアセトンの量と生成したＰＧ量との関係を示す図である。
【図２】添加したアセトンの量と生成したＰＳ量との関係を示す図である。
【図３】添加したアセトンの量と生成したＰＡ量との関係を示す図である。
【図４】アセトンを添加した系又は添加しない系において、反応温度と、生成したＰＧ量との関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質と、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される少なくとも１種のヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を塩基交換する方法。
【請求項２】
リン脂質と水とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を加水分解する方法。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼＤが、微生物由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼＤが、放線菌由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
リン脂質と、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、及びヒドロキシ環状化合物からなる群から選択される少なくとも１種のヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を塩基交換する方法。
【請求項２】
リン脂質と水とを、ホスホリパーゼＤの存在下、アセトンと水からなる均一相中で反応させる工程を含む、リン脂質を加水分解する方法。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼＤが、微生物由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼＤが、放線菌由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−２７１２１７（Ｐ２００６−２７１２１７Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９１４６９（Ｐ２００５−９１４６９）
【出願日】平成１７年３月２８日（２００５．３．２８）
【出願人】（０００２１４２５０）ナガセケムテックス株式会社 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２８日（２００５．３．２８）
【出願人】（０００２１４２５０）ナガセケムテックス株式会社 (173)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]