レンチウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類作製法及びそれによって得られる遺伝子導入鳥類
本発明は、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクター、該レンチウイルスベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる組み換え鳥類宿主とその作製法、該レンチウイルスベクターを感染させることよりなるトランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を提供する。また、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法、並びに、上記の方法で作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を提供する。本発明は、外皮タンパクをＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターを鳥類初期胚に感染させることにより作製されたトランスジェニック鳥類である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レンチウイルスベクターによって外来性遺伝子を鳥類培養細胞に導入する方法に関する。また本発明は、レンチウイルスベクターによって外来性遺伝子を受精卵初期胚に導入することによるトランスジェニックキメラ鳥類の作製法ならびに該作製法により得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年数多くの品目が上市されている抗体医薬品は、現在動物細胞リアクターしか生産手段がないため、価格が高くなることがその普及を妨げている要因である。医薬品として使用されるモノクローナル抗体のように複雑な構造を持ち、その安定性、活性発現に糖鎖が必要なタンパク質の安価な生産手段として、トランスジェニック技術を応用した動物工場が注目を浴びている。
【０００３】
ウシ、ヤギ、ヒツジ等哺乳類の乳汁に生理活性物質を安価に産生させる試みが実用に近づいているが、これらの動物はトランスジェニックを作製し、目的物が生産されるようになるまでの時間が１〜２年と長いという欠点がある。
【０００４】
一方性成熟までの期間が短く、効率的なタンパク生産動物である家禽鳥類の卵に生理活性物質を産生させる鳥類トランスジェニックは、動物工場として有望であるが、鳥類体細胞に外来遺伝子を導入した安定なトランスジェニックを作製するには独特の困難があり、実用化には至っていない（特許文献１参照）。
【０００５】
トランスジェニック鳥類作製が困難である理由のひとつは、その受精卵を１細胞期に取得し、人工的に培養するのが至難なことである。Ｐｅｒｒｙは、鶏の卵割前細胞を手術的に取得し、体外で培養するシステムを確立したが（非特許文献１参照）、この方法によっても鳥類細胞の前核が卵黄に被われて識別不可能なため、核移植によるトランスジェニック作製は不可能である。
【０００６】
そのため鳥類受精卵への外来遺伝子導入は、リポフェクション、エレクトロポレーション等による細胞質への遺伝子注入に限られており、導入遺伝子を意図的に染色体に組み込むことができなかった。
【０００７】
本発明者らは鋭意研究を重ね、遺伝子治療にも応用されている安全な自己複製能欠失型レトロウイルスベクターを使用し、効率的に目的遺伝子を導入するトランスジェニック鳥類の作製法を見出した（特許文献２参照）。これにより、安全かつ効率的に複数の導入遺伝子コピー数をもつトランスジェニック鳥類の作製が可能となった。またこの手法によれば、導入遺伝子は高い効率で次世代に伝達されることもわかり、物質生産システムとしての遺伝子導入鳥類の利用が実用に近づいた。
また、レトロウイルスにより導入された遺伝子の不活性化は、導入時期に依存するという新規な知見を生かした、タンパク発現方法も見出した。
【０００８】
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入法は、高い導入効率で染色体ＤＮＡへ外来遺伝子を導入し、トランスジェニック鳥類を作製する現在唯一の方法である。しかし、レトロウイルスベクターで導入された外来遺伝子は、メチル化されることにより不活性化され（サイレンシングと呼ばれる現象）、目的とするタンパク質が発現しないことが問題だった。
【０００９】
このサイレンシングは、生体による防御システムと考えられるが、動物工場としてのトランスジェニック作製には障害となる。
Ｖｅｒｍａらが開発したレンチウイルスベクターは、神経系のように分化して増殖を停止した細胞にも遺伝子導入でき、かつ導入遺伝子の不活性化を伴わないことが知られているが、サイレンシングにも耐性である（非特許文献２参照）。
【００１０】
Ｐｆｅｉｆｅｒらは、このレンチウイルスベクターを使ってトランスジェニックマウスを作製することに成功し、その体細胞で導入タンパクが発現することを報告している（非特許文献３参照）。
【００１１】
このレンチウイルスベクターを、トランスジェニック鳥類作製に応用しようとの試みが報告されているが、レンチウイルスは、通常鳥類細胞には感染しない。
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ ０３／０１４３４４ Ａ２ ＶＩＲＡＧＥＮ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ（２００１）
【特許文献２】特開２００２−１７６８８０号公報
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｙ、Ｍ．Ｍ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３１
【非特許文献２】Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍら（２０００）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１，９１
【非特許文献３】Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ａら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９，２１４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
先に述べたような、導入遺伝子不活性化のメカニズムを解明していくことによるトランスジェニック鳥類実用化の検討とともに、レトロウイルスの種類によってはサイレンシングが起こりにくいとの知見から、鳥類への有効な遺伝子導入法の開発も試みてきた。レトロウイルスの一種であるレンチウイルス類を使ったベクターの応用はその試みのひとつである。
【００１４】
しかし、レンチウイルスはそのままでは鳥類細胞に感染しないため、これをトランスジェニック鳥類作製に応用するには、鳥類細胞へ感染するレンチウイルスベクターの開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
先に述べたようにレンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターの一種であるが、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するような、一般的なレトロウイルスベクターとは異なる性質を有している。
【００１６】
レトロウイルスベクターは通常増殖期の細胞にしか感染せず、分化した静止期の細胞に遺伝子を導入することはできなかった。しかしレンチウイルスに由来する新しいベクターは、増殖細胞のみならず神経細胞のような静止期の細胞にも感染できるため、その応用範囲が広い。また、一般的なレトロウイルスベクターで問題となる導入遺伝子の不活性化（サイレンシング）が起きないことも知られている。
【００１７】
レンチウイルスが鳥類細胞に感染した例は報告されておらず、レンチウイルスベクターをトランスジェニック鳥類作製に応用するには、ベクターを鳥類細胞に感染させる工夫が必要である。
【００１８】
本発明者らは検討を重ね、外皮タンパクをＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターがニワトリ培養細胞に外来遺伝子を導入できることを見出し、本発明に至った。
【００１９】
すなわち、本発明の第一の発明は、ＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させることによるトランスジェニック鳥類及びその子孫の作製法であり、また本発明の第二の発明は、該作製法において作られたレンチウイルスベクター、組み換え鳥類宿主及びトランスジェニック鳥類である。
【００２０】
具体的には、本発明は、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクター、該レンチウイルスベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる組み換え鳥類宿主とその作製法、該レンチウイルスベクターを感染させることよりなるトランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法、並びに、上記の方法で作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫である。
【００２１】
先に述べたＰｆｅｉｆｅｒらは、受精卵を酸性タイロード液で処理し、透明帯を除去することにより、レンチウイルスをマウス受精卵に感染させているが、本発明者らによるＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスは、無処理の鳥類細胞に感染できる。この細胞前処理の簡便な感染性レンチウイルスベクターも、本発明の１つである。
【００２２】
レンチウイルスベクターをトランスジェニック鳥類作製に応用する際の利点のひとつは、生殖系列への遺伝子導入による完全体子孫（Ｇ１）作製の可能性の高さであり、もうひとつはサイレンシング回避による導入遺伝子に由来するタンパク生産量の増大である。
【００２３】
本発明は、このようにタンパク生産に有利なトランスジェニック鳥類の作製法を開示する。また該作製法による遺伝子導入鳥類を開示する。
この方法により作製されたトランスジェニック鳥類は、タンパク質の生産に利用できるほか、鳥類の品種改良等にも有効である。
【００２４】
以下に本発明を詳述する。
本発明で使用されるレンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＢＩＶ（Ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）由来レンチウイルスベクター等が挙げられる。本発明で使用するレンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ由来のものが好ましく、ＨＩＶ−１由来のものがより好ましい。
【００２５】
安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるウイルスは、ウイルス粒子の複製に必要な遺伝子を分割してプラスミドとして後から加えることにより、ウイルスを発現すると共に、複製に必要な制御遺伝子を除いて自己複製能を欠失させたウイルスであることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、鳥類宿主にこのウイルスベクターを感染可能とするため、外皮タンパクを人工的にＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス由来）シュードタイプとしたウイルスベクターを用いる。ＶＳＶ−Ｇの受容体は膜成分であるリン脂質であり、これは鳥類細胞膜にも共通に存在することから、通常は鳥類宿主に感染しないレンチウイルスを感染可能とすることができる。
上記鳥類宿主としては、鳥類受精卵初期胚、鳥類宿主細胞等が挙げられる。
【００２７】
パッケージング細胞またはヘルパーウイルス等を利用することにより調製されたシュードタイプのウイルスベクターは、好ましくは通常のマイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、５３３）により、鳥類受精卵初期胚へ、また、血管内、心臓内を介して鳥類宿主細胞へ導入される。遺伝子導入法としてはこの他にもリポフェクションやエレクトロポレーション法等が考えられる。
鳥類宿主細胞としては、例えば、繊維芽細胞、多能性幹細胞、始原生殖細胞等が挙げられる。
上述のベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる、組み換え鳥類宿主及びその作製法も、本発明の１つである。
【００２８】
本発明に用いるレンチウイルスベクターは、異種遺伝子を含むものが好ましい。
本発明によりレンチウイルスベクターを用いて鳥類に導入される異種遺伝子は特に限定されないが、マーカー遺伝子や目的タンパク質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールするプロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等により構成される。上記異種遺伝子としては、構造遺伝子を含むものが好ましく、さらにマーカー遺伝子を含むものがより好ましい。
【００２９】
上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、例えばＧＦＰ（グリーン・フルオレッセント・プロテイン）等の蛍光タンパク質をコードした遺伝子が挙げられる。本発明に用いるレンチウイルスベクターは、ＧＦＰ遺伝子及び／又はＬａｃＺが組み込まれているものが好ましい。
【００３０】
上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては特に限定されず、ヒトモノクローナル抗体などの遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子、１本鎖抗体をコードした遺伝子などが挙げられる。また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での蓄積がよいことから、ヒトＩｇＧクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒトＩｇＧ１、ウズラＩｇＧ２、ニワトリＩｇＧ２やマウスＩｇＧ２のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。
また好ましい上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメラ抗体とは、２種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。
【００３１】
従来マウスハイブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来であるため、ヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。上記キメラ抗体としては、例えば、抗ヒトＣＤ２抗体、抗ＣＤ２０受容体抗体、抗ＴＮＦ抗体など当該欠点を改良し、拒絶反応をなくしたキメラ抗体が挙げられ、すでに医薬品として上市されているものもある。
【００３２】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子を使用することにより、従来生産が困難だった抗体医薬品を安価に大量生産することができる。
【００３３】
上記プロモーター遺伝子としては、構成的なプロモーターが挙げられる。抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、ニワトリβアクチンプロモーターが挙げられる。
【００３４】
本発明により作製されるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫は、レンチウイルスベクターによって外来抗体遺伝子等が導入された場合、導入遺伝子に由来するタンパク質を、血中、卵白中あるいは卵黄中に生産することができる。これらのタンパク質は鳥類細胞により糖鎖の修飾を受けるため、活性、安定性のうえで有利である。
【００３５】
本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えばニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましく、より好ましくはニワトリである。
【００３６】
次に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法について説明する。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法は、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むものである。
当該作製法の１つとして、鳥類受精卵放卵直後の胚盤葉期（ステージＸ）の初期胚へ複製能欠失型レンチウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法が挙げられる。また、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レンチウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も可能である。また鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から２４時間以降の初期胚へ複製能欠失型レンチウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も、本発明の作製法の１つとして挙げられる。
より好ましくは、上記初期胚に形成される心臓内または血管内へ、複製能欠失型レンチウイルスベクターをマイクロインジェクションする方法である。
【００３７】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法では、放卵直後（ステージＸ）の受精卵に複製能欠失型レンチウイルスベクターをマイクロインジェクションすることが好ましい。
放卵後の受精卵の初期発生についてニワトリを例にとると、まず輸卵管内で受精した卵は、受精後約１．５時間で卵割を開始する。細胞質がつながったまま盤割が始まった卵は、１日かけて体外に放出される間に分裂し、約６万個の細胞からなる胚盤葉と呼ばれる胚になる（胚盤葉期）。この胚盤葉は、卵黄中央部の直径３〜４ｍｍの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成されるころに起こり、原条が形成され、胚盤葉は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経て、排卵から２２日目に孵化する。胚盤葉期は、ステージＸとも呼ばれ、この時期の細胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の受精卵を使用している。
【００３８】
本発明では、異種遺伝子を胚に導入するための時期は、特に限定されず、ステージＸ以前、ステージＸ、またはステージＸ以降でもよい。サイレンシングが起こりにくい観点から、好ましくはステージＸ以降、より好ましくは孵卵開始より４８時間目以降、もっとも好ましくは孵卵開始後５５時間目に、異種遺伝子を胚に導入する。
本発明においては放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件、例えばニワトリならば３７．７〜３７．８℃、湿度５０〜７０％程度の孵化に適した環境条件においた時間を０時間とし、経時的にマイクロインジェクションを行った。ウズラでは孵卵開始から３６時間後、ニワトリでは孵卵開始後５０時間頃から、卵黄上に血管系の形成が観察され、心臓に分化する器官の脈動が観察できた。
【００３９】
上述の遺伝子を導入した受精卵の孵化には、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）等が応用できる。
【００４０】
本発明の作製法において使用するレンチウイルスベクター、導入する遺伝子、遺伝子導入鳥類としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
なお本発明の作製法において、「レンチウイルスに由来しない遺伝子」としては、マーカー遺伝子、構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子が挙げられる。
【００４１】
本発明の作製法においては、レンチウイルスベクターの感染時期が、胚盤葉期であることが好ましい。またレンチウイルスウイルスベクターの感染時期が、胚盤葉期を除くそれ以降の時期であることが好ましく、その場合レンチウイルスベクターの感染個所が、初期心臓内あるいは血管内であることが好ましい。
本発明の作製法においては、レンチウイルスベクターの感染法がマイクロインジェクション法であることが好ましい。
【００４２】
本発明の作製法では、好ましくは１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ以上のタイターを持つレンチウイルスベクターを、インジェクション、好ましくはマイクロインジェクションすることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ましい。
本発明において、ウイルスタイターの測定は、Ｘ−Ｇａｌ染色法又は蛍光タンパク検出法により行う。
【００４３】
本発明の作製法で、受精卵に遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイク状に導入遺伝子をもったトランスジェニック鳥類として成長する。この一世代目の遺伝子導入鳥類を、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。
このような本発明の作製法によって得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫も、本発明の１つである。
【００４４】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の子孫は、自体公知の育種技術にしたがって生産することができる。関連技術は当分野で周知であり、それらは雑種形成、同系交配、戻し交雑、多系統交配、種間雑種形成等を含むが、これらに限定されない。具体的には、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と非トランスジェニック鳥類、あるいはＧ０トランスジェニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する二世代目、三世代目は、これらが導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する個体として成長する。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類個体から導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、代々Ｇ１〜Ｇ２〜Ｇ３トランスジェニック鳥類と称する。
【００４５】
本発明によるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を同種の非トランスジェニック鳥類あるいは配偶型Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジェニック鳥類を作製できる。完全なトランスジェニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換えタンパク質の産生量が増加することが期待できる。更に、安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジェニック鳥類の系統を確立することで、タンパク産生システムとしての品質の安定化が可能である。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の、外皮をＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクター感染による鳥類受精卵初期胚を孵化することにより、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製することができる。
また本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法は、生理活性タンパク質、例えば医療用抗体の遺伝子を導入し、血中、卵中に抗体を効率的に発現することができる鳥類の作製を可能にする。更に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を用いたタンパク質生産法は、例えば医療用抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を作製し、抗体を鳥類の血清、卵中から回収、精製することからなる、効率よい抗体生産を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
β−ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺの調製
ｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺベクターコンストラクトは以下のようにして作製した。
まず、以下のようにしてｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰを作製した。ＧＦＰを増幅させるためのプライマー５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１）と５‘−ＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’（配列番号２）を化学合成した。鋳型としてｐＧｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてＰＣＲを行いＧＦＰ断片を増幅した。この増幅した溶液をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）のマニュアルに従いｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、ｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰを作製した。
【００４８】
また、以下のようにしてｐＬＮΔＡβを作製した。
１．プラスミドｐＬＸＲＮ（クロンテック社製）からラウス・ザルコーマ・ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＲＳＶを作製した。
２．プラスミドｐＣＭＶβ（クロンテック社製）からβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、プラスミドｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩサイトへ挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にβ−Ｇａｌ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ｌａｃＺとした。
３．ｐＢｌｕｅ／ＲＳＶからＲＳＶプロモーター断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩによって切り出した。ｐＺｅｏ／ｌａｃＺからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出した。制限酵素ＸｈｏＩによって処理したプラスミドｐＬＮＨＸ（クロンテック社製）のベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮＲβを作製した。
４．ｐＬＮＨＸから一連のモロニー・ミューリン・ザルコーマ・ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）５’−ロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）、ウイルス・パッケージング・シグナル及びネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を含む断片を、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＬＸＲＮのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＸＬを作製した。
５．ｐＺｅｏ／ｌａｃＺからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＺＬを作製した。
【００４９】
６．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｇｔｃｔａｇａｇｇａａｔｔｃａｇｔｇｇｔｔｃｇ−３’（配列番号３）及び５’−ｃｃａｇｇａｔｃｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇ−３’（配列番号４、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５５℃／３０秒→７２℃／１分３０秒：３５サイクル；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製））により、プラスミドｐＭｉｗＺ（Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆ．Ｄｅｖ．２９：１８１−１８５）からＲＳＶプロモーターとニワトリβアクチン（Ａｃｔ）プロモーターのハイブリッドプロモータ（Ｍｉｗプロモーター）の５’領域断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｕｎＩによって切り出し、プラスミドｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ギブコＢＲＬ社製）のＢａｍＨＩ、ＭｕｎＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＧｍｉｗ５’を作製した。
７．ｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター５’側中央領域断片を制限酵素ＭｕｎＩ及びＣｌａＩによって切り出し、ｐＧｍｉｗ５’のＭｕｎＩ、ＣｌａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＧｍｉｗ５’−２を作製した。
８．ｐＧｍｉｗ５’−２からＭｉｗプロモーター５’領域及び５’側中央領域を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗ５’を作製した。
９．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃａａａｇｃｔｔｇｃｃｇｃａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号５、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔａｃｃｔａｇｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇｃｇｇａｇｇａａｃ−３’（配列番号６、下線部はＢｌｎＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９８℃／１５秒→６０℃／３０秒→７２℃／３０秒：３５サイクル）によりｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター３’領域断片を増幅後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭｉｗ３’を作製した。
【００５０】
１０．ｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター３’側中央領域断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｂｏＩＩによって切り出した。ｐＬＭｉｗ３’からＭｉｗプロモーター３’領域断片を制限酵素ＭｂｏＩＩ及びＫｐｎＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗ５’のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩサイトへ上記切り出した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗを作製した。
１１．ｐＢｌｕｅ／ＭｉｗからＭｉｗプロモーター全長を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｌｎＩによって切り出し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｌｎＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭＬを作製した。
１２．ｐＬＭＬからＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ａｃｔを作製した。
１３．ｐＬＭＬからＭｉｗプロモーター断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって処理したｐＬＺＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭβＬを作製した。
１４．ｐＢｌｕｅ／ＡｃｔからＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＢｌｎＩによって切り出した。ｐＬＭβＬからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＮＲβのベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮＡβを作製した。
１５．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｔｔａｇｃｔａｇｃｔｇｃａｇｃｔｃａｇｔｇｃａｔｇｃａｃ−３’（配列番号７、下線部はＮｈｅＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔａａｔｃｔａｇａａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇｃ−３’（配列番号８、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９８℃／１５秒→６０℃／３０秒→６８℃／２分：３０サイクル）によりｐＭｉｗＺからイントロン欠失アクチン（ΔＡｃｔ）プロモーター断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ（ＸｈｏＩ制限酵素サイトは増幅断片中に存在）及びＸｂａＩによってΔＡｃｔプロモーターの一部を含む断片を切り出した。ΔＡｃｔプロモーターの残りの部分とβ−Ｇａｌ遺伝子を含む断片をｐＬＮＡβから制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出した。制限酵素ＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＮＡβのベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮΔＡβを作製した。
ｐＬＮΔＡβをＳｐｅＩ、ＸｈｏＩで切断したｌａｃＺ遺伝子をｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰのＳｐｅＩ、ＸｈｏＩサイトにつないでｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺを作製した。
図１にｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺの構造を示す。
【実施例２】
【００５１】
β−ガラクトシダーゼ発現複製能欠失レンチウイルスベクターの調製
レンチウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞２９３ＦＴ（インビトロジェン社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュに５×１０６細胞植え、培養した。翌日９０％コンフルエントになったところで培地を新鮮な抗生物質の入っていないＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、欠損しているベクター構成要素を４種のプラスミド（培養ディッシュ１枚当たりＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘより個別に調製したｇａｇ／ｐｏｌをコードしたｐＬＰ１を６．５μｇ、ＲｅｖをコードしたｐＬＰ２を２．５μｇ、ｐＬＰ／ＶＳＶ−Ｇ外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇを３．５μｇと実施例１で調製したｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺを１０μｇ）をリポフェクション法で導入した。遺伝子導入した翌日に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除去した。この培養上清を２５，０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間遠心を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に５０μｌのＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。得られた溶液にポリブレン（シグマ社製）を８μｇ／ｍＬとなるように加えウイルス液とした。
このようにして得られた高タイターウイルスベクターは、３．７×１０６ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００５２】
ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にＨｅＬａ細胞（ヒト由来上皮様細胞株、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を直径２４ｗｅｌｌのディッシュに１．５×１０４細胞植え培養した。１０２から１０６倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍＬ加え、４８時間後に細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）にて２回洗浄した後、固定液（５０％グルタルアルデヒド（東京化成工業社製）をＰＢＳにて２００倍希釈したもの）を細胞が浸るぐらい入れ４℃で１０分放置した。その後固定液を抜きＰＢＳで３回洗浄後Ｘ−Ｇａｌ染色液（５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（宝酒造社製））を加え３７℃で３時間以上染色した後、青く染まっている細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合（ｃｆｕ／ｍＬ）
【実施例３】
【００５３】
ニワトリ、ウズラ繊維芽細胞の調製
ニワトリ繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ウズラ繊維芽細胞（ＱＥＦ）は、以下のように調製した。
ニワトリ、ウズラ受精卵を孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で５日間孵卵した（３７．９℃、湿度６５％）。胚を卵殻から取り出し、培養ディッシュに移して滅菌した０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）にて洗浄し、頭部、羽、足、内臓をハサミで取り除いた。遠心管に胚組織を移し、０．２５％トリプシン溶液（シグマ社製）２ｍＬを加えて、ピペッティングを繰り返し、細胞を破砕、懸濁した。懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートしたのち、ダルベッコ変法イーグル培地（インビトロジェン社製）を入れて反応を止め、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して細胞を分離した。上清を捨て、再度ダルベッコ変法イーグル培地を加え、培養ディッシュに播種した。培養は３７℃、５％ＣＯ２環境で行った。
【実施例４】
【００５４】
細胞種によるレンチウイルスベクター力価の違い
実施例２で調製したレンチウイルスベクターを培養細胞に導入し、発現したウイルス粒子のタイターを調べることにより細胞種によるレンチウイルスベクター感染力を調べた。
【００５５】
細胞はＨｅＬａ（アメリカン・タイプ・カルチャーより入手）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨｓｗｉｓｓマウス由来繊維芽細胞様細胞株、アメリカン・タイプ・カルチャーより入手）、実施例３で調製したＣＥＦ、ＱＥＦを１．５×１０４個播種し（ダルベッコ変法イーグル培地）、翌日ウイルスを含む培地に交換し、２日間培養し、上清中のウイルスタイターを実施例２の方法で検定した。
【００５６】
同様にして、実施例２で作製したβ−ガラクトシダーゼ発現レンチウイルスを各細胞種に感染し、発現するβ−ガラクトシダーゼの活性を測定し、細胞種によるレンチウイルス感染性の指標とした。
【００５７】
β−ガラクトシダーゼ活性測定は、以下のようにして行った。
培養細胞を０．２５％トリプシン溶液（シグマ社製）処理し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を集めた。ペレットを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）にて洗浄し、０．８ｍＬの反応バッファー（１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業製）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、２ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．５））を加えて超音波破砕し、細胞液を得た。
０．６ｍＬの細胞液を、３７℃で８時間インキュベートし、あらかじめ暖めておいた４ｍｇ／ｍＬのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（シグマ社製）を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した液０．１ｍＬを添加した。反応後０．３ｍＬの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（和光純薬工業製）を加え、吸光度計にて４２０ｎｍの波長強度を計測した。
β−ガラクトシダーゼの活性はＯＮＰＧｕｎｉｔで表した（１ｕｎｉｔ：１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールが１分間に生成されるときの活性）。３回実験を行い、その平均値をβ−ガラクトシダーゼ活性とした。
β−ガラクトシダーゼを発現するレンチウイルスベクターを各細胞種に感染させ、生ずるウイルス粒子の力価を定量することで、細胞種によるレンチウイルス感染力を比較した。
【００５８】
結果を表１に示す。表１において、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｉｔｅｒは、ＨｅＬａに感染したときのウイルスタイターを１００とした時の、各細胞のタイターを示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
高いレンチウイルス感染性が確認されているヒト由来ＨｅＬａ細胞と比較した相対的感染力を調べたところ、外皮タンパクをＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスは、ニワトリ由来繊維芽細胞に対し、ＨｅＬａの約３０％の感染力を示した。
【００６１】
β−ガラクトシダーゼ発現レンチウイルスベクターを、様々なウイルス量で各細胞種に感染させ、導入された遺伝子に由来する酵素活性を調べた。これはレンチウイルス感染力と、遺伝子導入能力の指標である。結果を図２に示す。
ＶＳＶ−Ｇ化レンチウイルスベクターは、ニワトリ繊維芽細胞に対し、ＨｅＬａの約１／２のβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。
【００６２】
レンチウイルスベクターが、鳥類細胞に感染した例は報告されていないが、外皮をＶＳＶ−Ｇ化することにより、ＨｅＬａと比較して１／２〜１／３の感染力で遺伝子を導入できることが確認された。
【実施例５】
【００６３】
抗プリオンｓｃＦｖＦｃとグリーン・フルオレッセン・プロテイン（ＧＦＰ）発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗの調製
抗プリオンｓｃＦｖＦｃとＧＦＰ発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗは以下のようにして作製した。我々が以前作製したコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＷＯ２００４／０１６０８１）より、ＮｈｅＩで切断しｓｃＦｖＦｃ領域を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）（ストラタジーン社製）のＸｂａＩサイトに挿入してｐＢｌｕｅ−ｓｃＦｖＦｃを作製した。このｐＢｌｕｅ−ｓｃＦｖＦｃより、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩで切断しｓｃＦｖＦｃ領域を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃよりアクチンプロモーター領域をＮｏｔＩ、ＮｈｅＩで切り出しこの２断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のＮｏｔＩサイトに同時に挿入し、ｐＢｌｕｅ−Ｐａｃｔ−ｓｃＦｖＦｃを作製した。先述したｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰよりＧＦＰ領域をＳｐｅＩ、ＸｂａＩで切り出しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のＳｐｅＩ、ＸｂａＩサイトに挿入してｐＢｌｕｅＧＦＰを作製した。ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（クロンテック社製）よりＰＧＫプロモーター領域をＸｈｏＩ、ＰｓｔＩで切り出しｐＢｌｕｅＧＦＰのＸｈｏＩ、ＰｓｔＩサイトに挿入してｐＢｌｕｅ−Ｐｐｇｋ−ＧＦＰを作製した。このｐＢｌｕｅ−Ｐｐｇｋ−ＧＦＰからＰＧＫプロモーター領域とＧＦＰをＸｈｏＩで切り出し、再びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のＸｈｏＩサイトに挿入しｐＢｌｕｅＸＰｐｇ−ＧＦＰを作製した。ｐＢｌｕｅＸＰｐｇ−ＧＦＰからＰＧＫプロモーター領域とＧＦＰをＣｌａＩ、ＫｐｎＩで切り出しｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰのＣｌａＩ、ＫｐｎＩサイトに挿入しｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＧＦＰを作製した。ＧＦＰをエンハンスドＧＦＰ（ＥＧＦＰ）に代えるため、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（クロンテック社製）をテンプレートとし、プライマーＥＧＦＰｄｉｒｅｃｔ（ＢａｍＨＩ）５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号９；下線はＢａｍＨＩサイト）とプライマーＥＧＦＰｒｅｖｅｒｓｅ（ＫｐｎＩ）５’−ＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１０；下線はＫｐｎＩサイト）を用いてＰＣＲによりＥＧＦＰを増幅した。増幅したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで切断しｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＧＦＰのＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＥＧＦＰを作製した。ｐＢｌｕｅ−Ｐａｃｔ−ｓｃＦｖＦｃよりアクチンプロモーターとｓｃＦｖＦｃ領域をＣｌａＩで切り出し、ｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＥＧＦＰのＣｌａＩサイトに挿入してｐＬｅｎｔｉ−ＰａｃｔｓｃＦｖＦｃ−ＰｐｇｋＥＧＦＰを作製した。ｃｅｎｔｒａｌ ＤＮＡ ｆｌａｐ（ｃＤｆ）配列を挿入するためにｐＬＰ１（インビトロジェン社製）を鋳型としてプライマーｃＤｆｄｉｒｅｃｔ ５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴ−３’（配列番号１１；下線はＸｂａＩサイト）とプライマーｃＤｆｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１２；下線はＸｂａＩサイト）を用いてＰＣＲによりｃＤｆを増幅した。増幅したＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを作製した。最後にＷｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＷＰＲＥ）をＰＣＲで増幅するためにプライマーＷＰＲＥ（ｄｉｒｅｃｔ ＫｐｎＩ）５’−ＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１３；下線はＫｐｎＩサイト）とプライマーＷＰＲＥ（ｒｅｖｅｒｓｅ ＫｐｎＩ）５’−ＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号１４；下線はＫｐｎＩサイト）を用いて増幅した。この増幅した産物をＫｐｎＩで切断し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥのＫｐｎＩサイトに挿入してｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗを作製した（図３）。
【実施例６】
【００６４】
ｓｃＦｖＦｃおよびＧＦＰ発現Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリの作製
まず、ウイルスベクターを実施例２記載の方法で調製した。調製したマーカーがＧＦＰのウイルスベクターでのタイター測定は以下のように行った。測定の前日にＨｅＬａ細胞を直径２４ｗｅｌｌのディッシュに１．５×１０４細胞植え培養した。１０２から１０６倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、４８時間後に培地をＰＢＳに代え蛍光顕微鏡によりＧＦＰ遺伝子を発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合（ｃｆｕ／ｍｌ）
このようにして調製したウイルスのタイターは２．２×１０７ｃｆｕ／ｍｌから７．７×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
このウイルス溶液を特開２００２−１７６８８０記載の方法により産卵直後のニワトリ胚に導入した。また、ウイルスベクターを導入したニワトリ胚の培養は特開２００２−１７６８８０記載の方法により培養し孵化させてｓｃＦｖＦｃおよびＧＦＰ遺伝子発現Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリを作製した。
【実施例７】
【００６５】
ＥＬＩＳＡ法による血清中のｓｃＦｖＦｃ濃度の測定
実施例６により作製されたＧ０トランスジェニックキメラニワトリを２０〜４０日飼育して雛を成長させた後、翼下静脈より採血を行い血液サンプルを得た。得られた血液を３７℃で１時間インキュベートした後１５，０００ｒｐｍで５分遠心分離を行い上清を血清とした。ＰＢＳで希釈した抗Ｆｃ抗体（コスモバイオ社製）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｇ／ｗｅｌｌ入れ４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄した後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液−２％スキムミルクを１５０μｌ／ｗｅｌｌ入れた。室温で２時間放置後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄し、採取した血清サンプルを１００μｌ入れ、室温で２時間放置した。その後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で希釈したＰｅｒｏｘｉｄｅ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＦｃ抗体（コスモバイオ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、室温で１時間放置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液でｗｅｌｌを４回洗浄し、発色液（１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（片山化学工業製）を１ｍｌのメタノールに溶解し蒸留水で１００ｍｌとしたものに１０μｌの過酸化水素水（和光純薬工業製）を加えて調製した）１００μｌをｗｅｌｌに加えた。３０分から１時間後、８Ｍ濃硫酸５０μｌをｗｅｌｌに添加して反応を止め、４９０ｎｍの蛍光強度をプレートリーダーで測定し、標準検量線から濃度を計算した。この標準検量線の作製は、標準Ｆｃ（コスモバイオ社製）を用いて行った。
これにより測定した血清中のｓｃＦｖＦｃ濃度は表２に示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
このように外皮をＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターによって、ニワトリ受精卵初期胚に遺伝子を導入することにより、目的タンパクを発現するＧ０トランスジェニックキメラニワトリの作製が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の、外皮をＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクター感染による鳥類受精卵初期胚を孵化することにより、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製することができる。
また本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法は、生理活性タンパク質、例えば医療用抗体の遺伝子を導入し、血中、卵中に抗体を効率的に発現することができる鳥類の作製を可能にする。更に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を用いたタンパク質生産法は、例えば医療用抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を作製し、抗体を鳥類の血清、卵中から回収、精製することからなる、効率よい抗体生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】後述の実施例１で調製したβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺの構造を示す。Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅはブラスチシジン耐性遺伝子を、Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅはアンピシリン耐性遺伝子を示す。Ψはパッケージングシグナル配列を示す。ＣＭＶＰｒｏはＣＭＶプロモーター遺伝子を示す。ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を示す。５‘ＬＴＲ及び３’ＬＴＲΔＵ３はそれぞれＣＭＶのロングターミナルリピート配列を示す。
【図２】細胞種によるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。横軸は、タイターが１．７±０．３×１０６ｃｆｕ／ｍＬのウイルスの添加液量を示す。縦軸はＵｎｉｔで表されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。Ｍｏｃｋは対照を表す。
【図３】抗プリオンｓｃＦｖＦｃとグリーン・フルオレッセン・プロテイン（ＧＦＰ）発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗの構造を示す。ｂｌａはブラスチシジン耐性遺伝子を示す。Ψはパッケージングシグナル配列を示す。ｐａｃｔはニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を示す。ｓｃＦｖ−Ｆｃは１本鎖抗体構造遺伝子を示す。ＥＧＦＰはグルーン・フルオレッセン・プロテイン（ＧＦＰ）構造遺伝子を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レンチウイルスベクターによって外来性遺伝子を鳥類培養細胞に導入する方法に関する。また本発明は、レンチウイルスベクターによって外来性遺伝子を受精卵初期胚に導入することによるトランスジェニックキメラ鳥類の作製法ならびに該作製法により得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年数多くの品目が上市されている抗体医薬品は、現在動物細胞リアクターしか生産手段がないため、価格が高くなることがその普及を妨げている要因である。医薬品として使用されるモノクローナル抗体のように複雑な構造を持ち、その安定性、活性発現に糖鎖が必要なタンパク質の安価な生産手段として、トランスジェニック技術を応用した動物工場が注目を浴びている。
【０００３】
ウシ、ヤギ、ヒツジ等哺乳類の乳汁に生理活性物質を安価に産生させる試みが実用に近づいているが、これらの動物はトランスジェニックを作製し、目的物が生産されるようになるまでの時間が１〜２年と長いという欠点がある。
【０００４】
一方性成熟までの期間が短く、効率的なタンパク生産動物である家禽鳥類の卵に生理活性物質を産生させる鳥類トランスジェニックは、動物工場として有望であるが、鳥類体細胞に外来遺伝子を導入した安定なトランスジェニックを作製するには独特の困難があり、実用化には至っていない（特許文献１参照）。
【０００５】
トランスジェニック鳥類作製が困難である理由のひとつは、その受精卵を１細胞期に取得し、人工的に培養するのが至難なことである。Ｐｅｒｒｙは、鶏の卵割前細胞を手術的に取得し、体外で培養するシステムを確立したが（非特許文献１参照）、この方法によっても鳥類細胞の前核が卵黄に被われて識別不可能なため、核移植によるトランスジェニック作製は不可能である。
【０００６】
そのため鳥類受精卵への外来遺伝子導入は、リポフェクション、エレクトロポレーション等による細胞質への遺伝子注入に限られており、導入遺伝子を意図的に染色体に組み込むことができなかった。
【０００７】
本発明者らは鋭意研究を重ね、遺伝子治療にも応用されている安全な自己複製能欠失型レトロウイルスベクターを使用し、効率的に目的遺伝子を導入するトランスジェニック鳥類の作製法を見出した（特許文献２参照）。これにより、安全かつ効率的に複数の導入遺伝子コピー数をもつトランスジェニック鳥類の作製が可能となった。またこの手法によれば、導入遺伝子は高い効率で次世代に伝達されることもわかり、物質生産システムとしての遺伝子導入鳥類の利用が実用に近づいた。
また、レトロウイルスにより導入された遺伝子の不活性化は、導入時期に依存するという新規な知見を生かした、タンパク発現方法も見出した。
【０００８】
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入法は、高い導入効率で染色体ＤＮＡへ外来遺伝子を導入し、トランスジェニック鳥類を作製する現在唯一の方法である。しかし、レトロウイルスベクターで導入された外来遺伝子は、メチル化されることにより不活性化され（サイレンシングと呼ばれる現象）、目的とするタンパク質が発現しないことが問題だった。
【０００９】
このサイレンシングは、生体による防御システムと考えられるが、動物工場としてのトランスジェニック作製には障害となる。
Ｖｅｒｍａらが開発したレンチウイルスベクターは、神経系のように分化して増殖を停止した細胞にも遺伝子導入でき、かつ導入遺伝子の不活性化を伴わないことが知られているが、サイレンシングにも耐性である（非特許文献２参照）。
【００１０】
Ｐｆｅｉｆｅｒらは、このレンチウイルスベクターを使ってトランスジェニックマウスを作製することに成功し、その体細胞で導入タンパクが発現することを報告している（非特許文献３参照）。
【００１１】
このレンチウイルスベクターを、トランスジェニック鳥類作製に応用しようとの試みが報告されているが、レンチウイルスは、通常鳥類細胞には感染しない。
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ ０３／０１４３４４ Ａ２ ＶＩＲＡＧＥＮ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ（２００１）
【特許文献２】特開２００２−１７６８８０号公報
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｙ、Ｍ．Ｍ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３１
【非特許文献２】Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍら（２０００）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１，９１
【非特許文献３】Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ａら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９，２１４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
先に述べたような、導入遺伝子不活性化のメカニズムを解明していくことによるトランスジェニック鳥類実用化の検討とともに、レトロウイルスの種類によってはサイレンシングが起こりにくいとの知見から、鳥類への有効な遺伝子導入法の開発も試みてきた。レトロウイルスの一種であるレンチウイルス類を使ったベクターの応用はその試みのひとつである。
【００１４】
しかし、レンチウイルスはそのままでは鳥類細胞に感染しないため、これをトランスジェニック鳥類作製に応用するには、鳥類細胞へ感染するレンチウイルスベクターの開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
先に述べたようにレンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターの一種であるが、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するような、一般的なレトロウイルスベクターとは異なる性質を有している。
【００１６】
レトロウイルスベクターは通常増殖期の細胞にしか感染せず、分化した静止期の細胞に遺伝子を導入することはできなかった。しかしレンチウイルスに由来する新しいベクターは、増殖細胞のみならず神経細胞のような静止期の細胞にも感染できるため、その応用範囲が広い。また、一般的なレトロウイルスベクターで問題となる導入遺伝子の不活性化（サイレンシング）が起きないことも知られている。
【００１７】
レンチウイルスが鳥類細胞に感染した例は報告されておらず、レンチウイルスベクターをトランスジェニック鳥類作製に応用するには、ベクターを鳥類細胞に感染させる工夫が必要である。
【００１８】
本発明者らは検討を重ね、外皮タンパクをＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターがニワトリ培養細胞に外来遺伝子を導入できることを見出し、本発明に至った。
【００１９】
すなわち、本発明の第一の発明は、ＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させることによるトランスジェニック鳥類及びその子孫の作製法であり、また本発明の第二の発明は、該作製法において作られたレンチウイルスベクター、組み換え鳥類宿主及びトランスジェニック鳥類である。
【００２０】
具体的には、本発明は、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクター、該レンチウイルスベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる組み換え鳥類宿主とその作製法、該レンチウイルスベクターを感染させることよりなるトランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法、並びに、上記の方法で作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫である。
【００２１】
先に述べたＰｆｅｉｆｅｒらは、受精卵を酸性タイロード液で処理し、透明帯を除去することにより、レンチウイルスをマウス受精卵に感染させているが、本発明者らによるＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスは、無処理の鳥類細胞に感染できる。この細胞前処理の簡便な感染性レンチウイルスベクターも、本発明の１つである。
【００２２】
レンチウイルスベクターをトランスジェニック鳥類作製に応用する際の利点のひとつは、生殖系列への遺伝子導入による完全体子孫（Ｇ１）作製の可能性の高さであり、もうひとつはサイレンシング回避による導入遺伝子に由来するタンパク生産量の増大である。
【００２３】
本発明は、このようにタンパク生産に有利なトランスジェニック鳥類の作製法を開示する。また該作製法による遺伝子導入鳥類を開示する。
この方法により作製されたトランスジェニック鳥類は、タンパク質の生産に利用できるほか、鳥類の品種改良等にも有効である。
【００２４】
以下に本発明を詳述する。
本発明で使用されるレンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＢＩＶ（Ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）由来レンチウイルスベクター等が挙げられる。本発明で使用するレンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ由来のものが好ましく、ＨＩＶ−１由来のものがより好ましい。
【００２５】
安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるウイルスは、ウイルス粒子の複製に必要な遺伝子を分割してプラスミドとして後から加えることにより、ウイルスを発現すると共に、複製に必要な制御遺伝子を除いて自己複製能を欠失させたウイルスであることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、鳥類宿主にこのウイルスベクターを感染可能とするため、外皮タンパクを人工的にＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス由来）シュードタイプとしたウイルスベクターを用いる。ＶＳＶ−Ｇの受容体は膜成分であるリン脂質であり、これは鳥類細胞膜にも共通に存在することから、通常は鳥類宿主に感染しないレンチウイルスを感染可能とすることができる。
上記鳥類宿主としては、鳥類受精卵初期胚、鳥類宿主細胞等が挙げられる。
【００２７】
パッケージング細胞またはヘルパーウイルス等を利用することにより調製されたシュードタイプのウイルスベクターは、好ましくは通常のマイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、５３３）により、鳥類受精卵初期胚へ、また、血管内、心臓内を介して鳥類宿主細胞へ導入される。遺伝子導入法としてはこの他にもリポフェクションやエレクトロポレーション法等が考えられる。
鳥類宿主細胞としては、例えば、繊維芽細胞、多能性幹細胞、始原生殖細胞等が挙げられる。
上述のベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる、組み換え鳥類宿主及びその作製法も、本発明の１つである。
【００２８】
本発明に用いるレンチウイルスベクターは、異種遺伝子を含むものが好ましい。
本発明によりレンチウイルスベクターを用いて鳥類に導入される異種遺伝子は特に限定されないが、マーカー遺伝子や目的タンパク質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールするプロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等により構成される。上記異種遺伝子としては、構造遺伝子を含むものが好ましく、さらにマーカー遺伝子を含むものがより好ましい。
【００２９】
上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、例えばＧＦＰ（グリーン・フルオレッセント・プロテイン）等の蛍光タンパク質をコードした遺伝子が挙げられる。本発明に用いるレンチウイルスベクターは、ＧＦＰ遺伝子及び／又はＬａｃＺが組み込まれているものが好ましい。
【００３０】
上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては特に限定されず、ヒトモノクローナル抗体などの遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子、１本鎖抗体をコードした遺伝子などが挙げられる。また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での蓄積がよいことから、ヒトＩｇＧクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒトＩｇＧ１、ウズラＩｇＧ２、ニワトリＩｇＧ２やマウスＩｇＧ２のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。
また好ましい上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメラ抗体とは、２種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。
【００３１】
従来マウスハイブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来であるため、ヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。上記キメラ抗体としては、例えば、抗ヒトＣＤ２抗体、抗ＣＤ２０受容体抗体、抗ＴＮＦ抗体など当該欠点を改良し、拒絶反応をなくしたキメラ抗体が挙げられ、すでに医薬品として上市されているものもある。
【００３２】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子を使用することにより、従来生産が困難だった抗体医薬品を安価に大量生産することができる。
【００３３】
上記プロモーター遺伝子としては、構成的なプロモーターが挙げられる。抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、ニワトリβアクチンプロモーターが挙げられる。
【００３４】
本発明により作製されるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫は、レンチウイルスベクターによって外来抗体遺伝子等が導入された場合、導入遺伝子に由来するタンパク質を、血中、卵白中あるいは卵黄中に生産することができる。これらのタンパク質は鳥類細胞により糖鎖の修飾を受けるため、活性、安定性のうえで有利である。
【００３５】
本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えばニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましく、より好ましくはニワトリである。
【００３６】
次に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法について説明する。
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法は、外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むものである。
当該作製法の１つとして、鳥類受精卵放卵直後の胚盤葉期（ステージＸ）の初期胚へ複製能欠失型レンチウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法が挙げられる。また、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レンチウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も可能である。また鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から２４時間以降の初期胚へ複製能欠失型レンチウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も、本発明の作製法の１つとして挙げられる。
より好ましくは、上記初期胚に形成される心臓内または血管内へ、複製能欠失型レンチウイルスベクターをマイクロインジェクションする方法である。
【００３７】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法では、放卵直後（ステージＸ）の受精卵に複製能欠失型レンチウイルスベクターをマイクロインジェクションすることが好ましい。
放卵後の受精卵の初期発生についてニワトリを例にとると、まず輸卵管内で受精した卵は、受精後約１．５時間で卵割を開始する。細胞質がつながったまま盤割が始まった卵は、１日かけて体外に放出される間に分裂し、約６万個の細胞からなる胚盤葉と呼ばれる胚になる（胚盤葉期）。この胚盤葉は、卵黄中央部の直径３〜４ｍｍの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成されるころに起こり、原条が形成され、胚盤葉は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経て、排卵から２２日目に孵化する。胚盤葉期は、ステージＸとも呼ばれ、この時期の細胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の受精卵を使用している。
【００３８】
本発明では、異種遺伝子を胚に導入するための時期は、特に限定されず、ステージＸ以前、ステージＸ、またはステージＸ以降でもよい。サイレンシングが起こりにくい観点から、好ましくはステージＸ以降、より好ましくは孵卵開始より４８時間目以降、もっとも好ましくは孵卵開始後５５時間目に、異種遺伝子を胚に導入する。
本発明においては放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件、例えばニワトリならば３７．７〜３７．８℃、湿度５０〜７０％程度の孵化に適した環境条件においた時間を０時間とし、経時的にマイクロインジェクションを行った。ウズラでは孵卵開始から３６時間後、ニワトリでは孵卵開始後５０時間頃から、卵黄上に血管系の形成が観察され、心臓に分化する器官の脈動が観察できた。
【００３９】
上述の遺伝子を導入した受精卵の孵化には、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）等が応用できる。
【００４０】
本発明の作製法において使用するレンチウイルスベクター、導入する遺伝子、遺伝子導入鳥類としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
なお本発明の作製法において、「レンチウイルスに由来しない遺伝子」としては、マーカー遺伝子、構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子が挙げられる。
【００４１】
本発明の作製法においては、レンチウイルスベクターの感染時期が、胚盤葉期であることが好ましい。またレンチウイルスウイルスベクターの感染時期が、胚盤葉期を除くそれ以降の時期であることが好ましく、その場合レンチウイルスベクターの感染個所が、初期心臓内あるいは血管内であることが好ましい。
本発明の作製法においては、レンチウイルスベクターの感染法がマイクロインジェクション法であることが好ましい。
【００４２】
本発明の作製法では、好ましくは１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ以上のタイターを持つレンチウイルスベクターを、インジェクション、好ましくはマイクロインジェクションすることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ましい。
本発明において、ウイルスタイターの測定は、Ｘ−Ｇａｌ染色法又は蛍光タンパク検出法により行う。
【００４３】
本発明の作製法で、受精卵に遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイク状に導入遺伝子をもったトランスジェニック鳥類として成長する。この一世代目の遺伝子導入鳥類を、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。
このような本発明の作製法によって得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫も、本発明の１つである。
【００４４】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の子孫は、自体公知の育種技術にしたがって生産することができる。関連技術は当分野で周知であり、それらは雑種形成、同系交配、戻し交雑、多系統交配、種間雑種形成等を含むが、これらに限定されない。具体的には、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と非トランスジェニック鳥類、あるいはＧ０トランスジェニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する二世代目、三世代目は、これらが導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する個体として成長する。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類個体から導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、代々Ｇ１〜Ｇ２〜Ｇ３トランスジェニック鳥類と称する。
【００４５】
本発明によるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を同種の非トランスジェニック鳥類あるいは配偶型Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジェニック鳥類を作製できる。完全なトランスジェニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換えタンパク質の産生量が増加することが期待できる。更に、安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジェニック鳥類の系統を確立することで、タンパク産生システムとしての品質の安定化が可能である。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の、外皮をＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクター感染による鳥類受精卵初期胚を孵化することにより、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製することができる。
また本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法は、生理活性タンパク質、例えば医療用抗体の遺伝子を導入し、血中、卵中に抗体を効率的に発現することができる鳥類の作製を可能にする。更に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を用いたタンパク質生産法は、例えば医療用抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を作製し、抗体を鳥類の血清、卵中から回収、精製することからなる、効率よい抗体生産を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
β−ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺの調製
ｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺベクターコンストラクトは以下のようにして作製した。
まず、以下のようにしてｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰを作製した。ＧＦＰを増幅させるためのプライマー５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１）と５‘−ＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’（配列番号２）を化学合成した。鋳型としてｐＧｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてＰＣＲを行いＧＦＰ断片を増幅した。この増幅した溶液をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）のマニュアルに従いｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、ｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰを作製した。
【００４８】
また、以下のようにしてｐＬＮΔＡβを作製した。
１．プラスミドｐＬＸＲＮ（クロンテック社製）からラウス・ザルコーマ・ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＲＳＶを作製した。
２．プラスミドｐＣＭＶβ（クロンテック社製）からβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、プラスミドｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩサイトへ挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にβ−Ｇａｌ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ｌａｃＺとした。
３．ｐＢｌｕｅ／ＲＳＶからＲＳＶプロモーター断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩによって切り出した。ｐＺｅｏ／ｌａｃＺからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出した。制限酵素ＸｈｏＩによって処理したプラスミドｐＬＮＨＸ（クロンテック社製）のベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮＲβを作製した。
４．ｐＬＮＨＸから一連のモロニー・ミューリン・ザルコーマ・ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）５’−ロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）、ウイルス・パッケージング・シグナル及びネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を含む断片を、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＬＸＲＮのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＸＬを作製した。
５．ｐＺｅｏ／ｌａｃＺからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＺＬを作製した。
【００４９】
６．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｇｔｃｔａｇａｇｇａａｔｔｃａｇｔｇｇｔｔｃｇ−３’（配列番号３）及び５’−ｃｃａｇｇａｔｃｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇ−３’（配列番号４、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５５℃／３０秒→７２℃／１分３０秒：３５サイクル；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製））により、プラスミドｐＭｉｗＺ（Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆ．Ｄｅｖ．２９：１８１−１８５）からＲＳＶプロモーターとニワトリβアクチン（Ａｃｔ）プロモーターのハイブリッドプロモータ（Ｍｉｗプロモーター）の５’領域断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｕｎＩによって切り出し、プラスミドｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ギブコＢＲＬ社製）のＢａｍＨＩ、ＭｕｎＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＧｍｉｗ５’を作製した。
７．ｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター５’側中央領域断片を制限酵素ＭｕｎＩ及びＣｌａＩによって切り出し、ｐＧｍｉｗ５’のＭｕｎＩ、ＣｌａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＧｍｉｗ５’−２を作製した。
８．ｐＧｍｉｗ５’−２からＭｉｗプロモーター５’領域及び５’側中央領域を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗ５’を作製した。
９．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃａａａｇｃｔｔｇｃｃｇｃａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号５、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔａｃｃｔａｇｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇｃｇｇａｇｇａａｃ−３’（配列番号６、下線部はＢｌｎＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９８℃／１５秒→６０℃／３０秒→７２℃／３０秒：３５サイクル）によりｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター３’領域断片を増幅後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭｉｗ３’を作製した。
【００５０】
１０．ｐＭｉｗＺからＭｉｗプロモーター３’側中央領域断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｂｏＩＩによって切り出した。ｐＬＭｉｗ３’からＭｉｗプロモーター３’領域断片を制限酵素ＭｂｏＩＩ及びＫｐｎＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗ５’のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩサイトへ上記切り出した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｍｉｗを作製した。
１１．ｐＢｌｕｅ／ＭｉｗからＭｉｗプロモーター全長を含む断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｌｎＩによって切り出し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｌｎＩによって処理したｐＬＸＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭＬを作製した。
１２．ｐＬＭＬからＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ａｃｔを作製した。
１３．ｐＬＭＬからＭｉｗプロモーター断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって処理したｐＬＺＬのベクター断片に連結し、プラスミドｐＬＭβＬを作製した。
１４．ｐＢｌｕｅ／ＡｃｔからＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＢｌｎＩによって切り出した。ｐＬＭβＬからβ−Ｇａｌ遺伝子断片を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＮＲβのベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮＡβを作製した。
１５．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｔｔｔａｇｃｔａｇｃｔｇｃａｇｃｔｃａｇｔｇｃａｔｇｃａｃ−３’（配列番号７、下線部はＮｈｅＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔａａｔｃｔａｇａａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇｃ−３’（配列番号８、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９８℃／１５秒→６０℃／３０秒→６８℃／２分：３０サイクル）によりｐＭｉｗＺからイントロン欠失アクチン（ΔＡｃｔ）プロモーター断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ（ＸｈｏＩ制限酵素サイトは増幅断片中に存在）及びＸｂａＩによってΔＡｃｔプロモーターの一部を含む断片を切り出した。ΔＡｃｔプロモーターの残りの部分とβ−Ｇａｌ遺伝子を含む断片をｐＬＮＡβから制限酵素ＢｌｎＩ及びＢｇｌＩＩによって切り出した。制限酵素ＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩによって処理したｐＬＮＡβのベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＬＮΔＡβを作製した。
ｐＬＮΔＡβをＳｐｅＩ、ＸｈｏＩで切断したｌａｃＺ遺伝子をｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰのＳｐｅＩ、ＸｈｏＩサイトにつないでｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺを作製した。
図１にｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺの構造を示す。
【実施例２】
【００５１】
β−ガラクトシダーゼ発現複製能欠失レンチウイルスベクターの調製
レンチウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞２９３ＦＴ（インビトロジェン社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュに５×１０６細胞植え、培養した。翌日９０％コンフルエントになったところで培地を新鮮な抗生物質の入っていないＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、欠損しているベクター構成要素を４種のプラスミド（培養ディッシュ１枚当たりＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘより個別に調製したｇａｇ／ｐｏｌをコードしたｐＬＰ１を６．５μｇ、ＲｅｖをコードしたｐＬＰ２を２．５μｇ、ｐＬＰ／ＶＳＶ−Ｇ外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇを３．５μｇと実施例１で調製したｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺを１０μｇ）をリポフェクション法で導入した。遺伝子導入した翌日に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除去した。この培養上清を２５，０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間遠心を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に５０μｌのＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。得られた溶液にポリブレン（シグマ社製）を８μｇ／ｍＬとなるように加えウイルス液とした。
このようにして得られた高タイターウイルスベクターは、３．７×１０６ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００５２】
ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にＨｅＬａ細胞（ヒト由来上皮様細胞株、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を直径２４ｗｅｌｌのディッシュに１．５×１０４細胞植え培養した。１０２から１０６倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍＬ加え、４８時間後に細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）にて２回洗浄した後、固定液（５０％グルタルアルデヒド（東京化成工業社製）をＰＢＳにて２００倍希釈したもの）を細胞が浸るぐらい入れ４℃で１０分放置した。その後固定液を抜きＰＢＳで３回洗浄後Ｘ−Ｇａｌ染色液（５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（宝酒造社製））を加え３７℃で３時間以上染色した後、青く染まっている細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合（ｃｆｕ／ｍＬ）
【実施例３】
【００５３】
ニワトリ、ウズラ繊維芽細胞の調製
ニワトリ繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ウズラ繊維芽細胞（ＱＥＦ）は、以下のように調製した。
ニワトリ、ウズラ受精卵を孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で５日間孵卵した（３７．９℃、湿度６５％）。胚を卵殻から取り出し、培養ディッシュに移して滅菌した０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）にて洗浄し、頭部、羽、足、内臓をハサミで取り除いた。遠心管に胚組織を移し、０．２５％トリプシン溶液（シグマ社製）２ｍＬを加えて、ピペッティングを繰り返し、細胞を破砕、懸濁した。懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートしたのち、ダルベッコ変法イーグル培地（インビトロジェン社製）を入れて反応を止め、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して細胞を分離した。上清を捨て、再度ダルベッコ変法イーグル培地を加え、培養ディッシュに播種した。培養は３７℃、５％ＣＯ２環境で行った。
【実施例４】
【００５４】
細胞種によるレンチウイルスベクター力価の違い
実施例２で調製したレンチウイルスベクターを培養細胞に導入し、発現したウイルス粒子のタイターを調べることにより細胞種によるレンチウイルスベクター感染力を調べた。
【００５５】
細胞はＨｅＬａ（アメリカン・タイプ・カルチャーより入手）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨｓｗｉｓｓマウス由来繊維芽細胞様細胞株、アメリカン・タイプ・カルチャーより入手）、実施例３で調製したＣＥＦ、ＱＥＦを１．５×１０４個播種し（ダルベッコ変法イーグル培地）、翌日ウイルスを含む培地に交換し、２日間培養し、上清中のウイルスタイターを実施例２の方法で検定した。
【００５６】
同様にして、実施例２で作製したβ−ガラクトシダーゼ発現レンチウイルスを各細胞種に感染し、発現するβ−ガラクトシダーゼの活性を測定し、細胞種によるレンチウイルス感染性の指標とした。
【００５７】
β−ガラクトシダーゼ活性測定は、以下のようにして行った。
培養細胞を０．２５％トリプシン溶液（シグマ社製）処理し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を集めた。ペレットを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）にて洗浄し、０．８ｍＬの反応バッファー（１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業製）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、２ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．５））を加えて超音波破砕し、細胞液を得た。
０．６ｍＬの細胞液を、３７℃で８時間インキュベートし、あらかじめ暖めておいた４ｍｇ／ｍＬのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（シグマ社製）を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した液０．１ｍＬを添加した。反応後０．３ｍＬの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（和光純薬工業製）を加え、吸光度計にて４２０ｎｍの波長強度を計測した。
β−ガラクトシダーゼの活性はＯＮＰＧｕｎｉｔで表した（１ｕｎｉｔ：１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールが１分間に生成されるときの活性）。３回実験を行い、その平均値をβ−ガラクトシダーゼ活性とした。
β−ガラクトシダーゼを発現するレンチウイルスベクターを各細胞種に感染させ、生ずるウイルス粒子の力価を定量することで、細胞種によるレンチウイルス感染力を比較した。
【００５８】
結果を表１に示す。表１において、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｉｔｅｒは、ＨｅＬａに感染したときのウイルスタイターを１００とした時の、各細胞のタイターを示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
高いレンチウイルス感染性が確認されているヒト由来ＨｅＬａ細胞と比較した相対的感染力を調べたところ、外皮タンパクをＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスは、ニワトリ由来繊維芽細胞に対し、ＨｅＬａの約３０％の感染力を示した。
【００６１】
β−ガラクトシダーゼ発現レンチウイルスベクターを、様々なウイルス量で各細胞種に感染させ、導入された遺伝子に由来する酵素活性を調べた。これはレンチウイルス感染力と、遺伝子導入能力の指標である。結果を図２に示す。
ＶＳＶ−Ｇ化レンチウイルスベクターは、ニワトリ繊維芽細胞に対し、ＨｅＬａの約１／２のβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。
【００６２】
レンチウイルスベクターが、鳥類細胞に感染した例は報告されていないが、外皮をＶＳＶ−Ｇ化することにより、ＨｅＬａと比較して１／２〜１／３の感染力で遺伝子を導入できることが確認された。
【実施例５】
【００６３】
抗プリオンｓｃＦｖＦｃとグリーン・フルオレッセン・プロテイン（ＧＦＰ）発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗの調製
抗プリオンｓｃＦｖＦｃとＧＦＰ発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗは以下のようにして作製した。我々が以前作製したコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＷＯ２００４／０１６０８１）より、ＮｈｅＩで切断しｓｃＦｖＦｃ領域を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）（ストラタジーン社製）のＸｂａＩサイトに挿入してｐＢｌｕｅ−ｓｃＦｖＦｃを作製した。このｐＢｌｕｅ−ｓｃＦｖＦｃより、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩで切断しｓｃＦｖＦｃ領域を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃよりアクチンプロモーター領域をＮｏｔＩ、ＮｈｅＩで切り出しこの２断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のＮｏｔＩサイトに同時に挿入し、ｐＢｌｕｅ−Ｐａｃｔ−ｓｃＦｖＦｃを作製した。先述したｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰよりＧＦＰ領域をＳｐｅＩ、ＸｂａＩで切り出しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のＳｐｅＩ、ＸｂａＩサイトに挿入してｐＢｌｕｅＧＦＰを作製した。ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（クロンテック社製）よりＰＧＫプロモーター領域をＸｈｏＩ、ＰｓｔＩで切り出しｐＢｌｕｅＧＦＰのＸｈｏＩ、ＰｓｔＩサイトに挿入してｐＢｌｕｅ−Ｐｐｇｋ−ＧＦＰを作製した。このｐＢｌｕｅ−Ｐｐｇｋ−ＧＦＰからＰＧＫプロモーター領域とＧＦＰをＸｈｏＩで切り出し、再びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のＸｈｏＩサイトに挿入しｐＢｌｕｅＸＰｐｇ−ＧＦＰを作製した。ｐＢｌｕｅＸＰｐｇ−ＧＦＰからＰＧＫプロモーター領域とＧＦＰをＣｌａＩ、ＫｐｎＩで切り出しｐＬｅｎｔｉ６／ＴＯＰＯ−ＧＦＰのＣｌａＩ、ＫｐｎＩサイトに挿入しｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＧＦＰを作製した。ＧＦＰをエンハンスドＧＦＰ（ＥＧＦＰ）に代えるため、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（クロンテック社製）をテンプレートとし、プライマーＥＧＦＰｄｉｒｅｃｔ（ＢａｍＨＩ）５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号９；下線はＢａｍＨＩサイト）とプライマーＥＧＦＰｒｅｖｅｒｓｅ（ＫｐｎＩ）５’−ＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１０；下線はＫｐｎＩサイト）を用いてＰＣＲによりＥＧＦＰを増幅した。増幅したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで切断しｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＧＦＰのＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＥＧＦＰを作製した。ｐＢｌｕｅ−Ｐａｃｔ−ｓｃＦｖＦｃよりアクチンプロモーターとｓｃＦｖＦｃ領域をＣｌａＩで切り出し、ｐＬｅｎｔｉ−ＰｐｇｋＥＧＦＰのＣｌａＩサイトに挿入してｐＬｅｎｔｉ−ＰａｃｔｓｃＦｖＦｃ−ＰｐｇｋＥＧＦＰを作製した。ｃｅｎｔｒａｌ ＤＮＡ ｆｌａｐ（ｃＤｆ）配列を挿入するためにｐＬＰ１（インビトロジェン社製）を鋳型としてプライマーｃＤｆｄｉｒｅｃｔ ５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴ−３’（配列番号１１；下線はＸｂａＩサイト）とプライマーｃＤｆｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１２；下線はＸｂａＩサイト）を用いてＰＣＲによりｃＤｆを増幅した。増幅したＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを作製した。最後にＷｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＷＰＲＥ）をＰＣＲで増幅するためにプライマーＷＰＲＥ（ｄｉｒｅｃｔ ＫｐｎＩ）５’−ＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１３；下線はＫｐｎＩサイト）とプライマーＷＰＲＥ（ｒｅｖｅｒｓｅ ＫｐｎＩ）５’−ＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号１４；下線はＫｐｎＩサイト）を用いて増幅した。この増幅した産物をＫｐｎＩで切断し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥのＫｐｎＩサイトに挿入してｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗを作製した（図３）。
【実施例６】
【００６４】
ｓｃＦｖＦｃおよびＧＦＰ発現Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリの作製
まず、ウイルスベクターを実施例２記載の方法で調製した。調製したマーカーがＧＦＰのウイルスベクターでのタイター測定は以下のように行った。測定の前日にＨｅＬａ細胞を直径２４ｗｅｌｌのディッシュに１．５×１０４細胞植え培養した。１０２から１０６倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、４８時間後に培地をＰＢＳに代え蛍光顕微鏡によりＧＦＰ遺伝子を発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合（ｃｆｕ／ｍｌ）
このようにして調製したウイルスのタイターは２．２×１０７ｃｆｕ／ｍｌから７．７×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
このウイルス溶液を特開２００２−１７６８８０記載の方法により産卵直後のニワトリ胚に導入した。また、ウイルスベクターを導入したニワトリ胚の培養は特開２００２−１７６８８０記載の方法により培養し孵化させてｓｃＦｖＦｃおよびＧＦＰ遺伝子発現Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリを作製した。
【実施例７】
【００６５】
ＥＬＩＳＡ法による血清中のｓｃＦｖＦｃ濃度の測定
実施例６により作製されたＧ０トランスジェニックキメラニワトリを２０〜４０日飼育して雛を成長させた後、翼下静脈より採血を行い血液サンプルを得た。得られた血液を３７℃で１時間インキュベートした後１５，０００ｒｐｍで５分遠心分離を行い上清を血清とした。ＰＢＳで希釈した抗Ｆｃ抗体（コスモバイオ社製）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｇ／ｗｅｌｌ入れ４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄した後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液−２％スキムミルクを１５０μｌ／ｗｅｌｌ入れた。室温で２時間放置後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄し、採取した血清サンプルを１００μｌ入れ、室温で２時間放置した。その後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で希釈したＰｅｒｏｘｉｄｅ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＦｃ抗体（コスモバイオ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、室温で１時間放置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液でｗｅｌｌを４回洗浄し、発色液（１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（片山化学工業製）を１ｍｌのメタノールに溶解し蒸留水で１００ｍｌとしたものに１０μｌの過酸化水素水（和光純薬工業製）を加えて調製した）１００μｌをｗｅｌｌに加えた。３０分から１時間後、８Ｍ濃硫酸５０μｌをｗｅｌｌに添加して反応を止め、４９０ｎｍの蛍光強度をプレートリーダーで測定し、標準検量線から濃度を計算した。この標準検量線の作製は、標準Ｆｃ（コスモバイオ社製）を用いて行った。
これにより測定した血清中のｓｃＦｖＦｃ濃度は表２に示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
このように外皮をＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクターによって、ニワトリ受精卵初期胚に遺伝子を導入することにより、目的タンパクを発現するＧ０トランスジェニックキメラニワトリの作製が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の、外皮をＶＳＶ−Ｇ化したレンチウイルスベクター感染による鳥類受精卵初期胚を孵化することにより、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製することができる。
また本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法は、生理活性タンパク質、例えば医療用抗体の遺伝子を導入し、血中、卵中に抗体を効率的に発現することができる鳥類の作製を可能にする。更に本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を用いたタンパク質生産法は、例えば医療用抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫を作製し、抗体を鳥類の血清、卵中から回収、精製することからなる、効率よい抗体生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】後述の実施例１で調製したβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ−ｌａｃＺの構造を示す。Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅはブラスチシジン耐性遺伝子を、Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅはアンピシリン耐性遺伝子を示す。Ψはパッケージングシグナル配列を示す。ＣＭＶＰｒｏはＣＭＶプロモーター遺伝子を示す。ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を示す。５‘ＬＴＲ及び３’ＬＴＲΔＵ３はそれぞれＣＭＶのロングターミナルリピート配列を示す。
【図２】細胞種によるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。横軸は、タイターが１．７±０．３×１０６ｃｆｕ／ｍＬのウイルスの添加液量を示す。縦軸はＵｎｉｔで表されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。Ｍｏｃｋは対照を表す。
【図３】抗プリオンｓｃＦｖＦｃとグリーン・フルオレッセン・プロテイン（ＧＦＰ）発現ベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥ−Ｗの構造を示す。ｂｌａはブラスチシジン耐性遺伝子を示す。Ψはパッケージングシグナル配列を示す。ｐａｃｔはニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を示す。ｓｃＦｖ−Ｆｃは１本鎖抗体構造遺伝子を示す。ＥＧＦＰはグルーン・フルオレッセン・プロテイン（ＧＦＰ）構造遺伝子を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含む、レンチウイルスベクター。
【請求項２】
複製能欠失型である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
さらに、異種遺伝子を含む、請求項１または２記載のベクター。
【請求項４】
該異種遺伝子が構造遺伝子を含む、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
該異種遺伝子がさらにマーカー遺伝子を含む、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
請求項１ないし３いずれか１項記載のベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる、組み換え鳥類宿主。
【請求項７】
該ベクターが構造遺伝子を含む、請求項６記載の組み換え鳥類宿主。
【請求項８】
該鳥類宿主が受精卵初期胚である、請求項６または７記載の組み換え鳥類宿主。
【請求項９】
請求項１ないし３いずれか１項記載のベクターを感染させることよりなる、トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫。
【請求項１０】
該ベクターが構造遺伝子を含む、請求項９記載のトランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫。
【請求項１１】
請求項１ないし４いずれか１項記載のベクターを鳥類宿主に感染させることを含む、組み換え鳥類宿主の作製法。
【請求項１２】
該鳥類宿主が、受精卵初期胚である、請求項１１記載の作製法。
【請求項１３】
外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１４】
レンチウイルスベクターが複製能欠失型である請求項１３記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１５】
レンチウイルスベクターがＨＩＶ−１由来である請求項１３または１４記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１６】
レンチウイルスベクターにＧＦＰ遺伝子及び／又はＬａｃＺが組み込まれている請求項１３〜１５いずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１７】
レンチウイルスベクターの感染時期が、胚盤葉期を除くそれ以降の時期である請求項１３〜１６のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１８】
レンチウイルスベクターの感染個所が、初期胚心臓内あるいは血管内である請求項１７記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１９】
レンチウイルスベクターの感染法がマイクロインジェクション法である請求項１３〜１８のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項２０】
鳥類がニワトリである請求項１３〜１９のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項２１】
１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ以上のタイターをもつレンチウイルスベクターをインジェクションすることを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニック鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか１項記載の作製法で作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫。
【請求項１】
外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含む、レンチウイルスベクター。
【請求項２】
複製能欠失型である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
さらに、異種遺伝子を含む、請求項１または２記載のベクター。
【請求項４】
該異種遺伝子が構造遺伝子を含む、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
該異種遺伝子がさらにマーカー遺伝子を含む、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
請求項１ないし３いずれか１項記載のベクターを鳥類宿主に感染させることよりなる、組み換え鳥類宿主。
【請求項７】
該ベクターが構造遺伝子を含む、請求項６記載の組み換え鳥類宿主。
【請求項８】
該鳥類宿主が受精卵初期胚である、請求項６または７記載の組み換え鳥類宿主。
【請求項９】
請求項１ないし３いずれか１項記載のベクターを感染させることよりなる、トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫。
【請求項１０】
該ベクターが構造遺伝子を含む、請求項９記載のトランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫。
【請求項１１】
請求項１ないし４いずれか１項記載のベクターを鳥類宿主に感染させることを含む、組み換え鳥類宿主の作製法。
【請求項１２】
該鳥類宿主が、受精卵初期胚である、請求項１１記載の作製法。
【請求項１３】
外皮タンパクがＶＳＶ−Ｇを含むレンチウイルスベクターを鳥類受精卵初期胚に感染させ、およびその胚を孵化させることを含むＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１４】
レンチウイルスベクターが複製能欠失型である請求項１３記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１５】
レンチウイルスベクターがＨＩＶ−１由来である請求項１３または１４記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１６】
レンチウイルスベクターにＧＦＰ遺伝子及び／又はＬａｃＺが組み込まれている請求項１３〜１５いずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１７】
レンチウイルスベクターの感染時期が、胚盤葉期を除くそれ以降の時期である請求項１３〜１６のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１８】
レンチウイルスベクターの感染個所が、初期胚心臓内あるいは血管内である請求項１７記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項１９】
レンチウイルスベクターの感染法がマイクロインジェクション法である請求項１３〜１８のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項２０】
鳥類がニワトリである請求項１３〜１９のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項２１】
１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ以上のタイターをもつレンチウイルスベクターをインジェクションすることを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか１項記載のＧ０トランスジェニック鳥類及びその子孫の作製法。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか１項記載の作製法で作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７６９
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３４８０（Ｐ２００５−５１３４８０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２３８８
【国際出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５９８０９１８６０）財団法人名古屋産業科学研究所 (23)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２３８８
【国際出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５９８０９１８６０）財団法人名古屋産業科学研究所 (23)
【Ｆターム（参考）】
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