両親媒性ポリマーとＢＭＰファミリーに属する骨形成タンパク質との複合体
【課題】物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を提供する。
【解決手段】本発明は、物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体であって、前記両親媒性ポリマーは、疎水性置換基及び親水基により官能化された親水性多糖類骨格を含有し；前記ＢＭＰは、治療上有効なＢＭＰ（骨形成タンパク質）の群より選択され；前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は７００以下であることを特徴とする複合体に関する。本発明はまた、水性溶媒中にてタンパク質を変性し得るいかなる有機溶媒も存在しない両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の製造方法にも関する。本発明はさらに、本発明の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の治療用組成物に関する。
【解決手段】本発明は、物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体であって、前記両親媒性ポリマーは、疎水性置換基及び親水基により官能化された親水性多糖類骨格を含有し；前記ＢＭＰは、治療上有効なＢＭＰ（骨形成タンパク質）の群より選択され；前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は７００以下であることを特徴とする複合体に関する。本発明はまた、水性溶媒中にてタンパク質を変性し得るいかなる有機溶媒も存在しない両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の製造方法にも関する。本発明はさらに、本発明の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の治療用組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性ポリマーと骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーに属する骨形成タンパク質との水溶性の新規な複合体に関するものであって、該複合体は、物理的及び化学的に安定であり、そしてそれ故、生体外及び生体内の両方におけるＢＭＰの物理的及び化学的安定性を改良するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成誘発の機構に含まれる成長因子である。ＢＭＰは骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、１９６５年にＵｒｉｓｔにより最初に特定された（非特許文献１）。皮質骨から単離されるこれらタンパク質は、非常に種々の動物の骨形成を誘発し得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＢＭＰは、翻訳後成熟の後に１０４ないし１３９残基の長さを有するプロペプチドの形態で発現する。それらの配列は非常に一致しており、且つ類似の三次元構造を有している。特に、それらは、所謂“システイン集団（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｋｎｏｔ）”を形成する分子内ジスルフィド結合に包含される６個のシステイン残基を有している（非特許文献２及び３）。それらのうちの数種は、ダイマーの形成を導く分子内ジスルフィド結合に包含される７番目のシステインを有している（非特許文献２）。
【０００４】
それらの活性形態において、ＢＭＰは、Ｉｓｒａｅｌ等により記載されるように、ホモダイマーとして及びヘテロダイマーとしてさえ会合する（非特許文献４）。ダイマー状ＢＭＰは、ＢＭＰＲ型の膜透過受容体と相互作用する（非特許文献５）。この認識は、特にＳｍａｄタンパク質を含有する一連の細胞内シグナル伝達を引き起こし、このことが標的遺伝子の活性化又は抑制化を誘発する。
【０００５】
ＢＭＰ１及び３を除いて、ＢＭＰは、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｔｏｕｓ ｃｅｌｌ）を分化させるのに直接的な且つ間接的な役割を果しており、このことが骨芽細胞へのその分化を誘発する（非特許文献６）。それらはまた、走化性の特性を有し、且つ増殖、分化及び血管形成を誘発する。
【０００６】
幾種かのヒト組換体ＢＭＰ、特にｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７は、ヒトの生体内での骨形成を誘発する能力を明らかに示しており、そして幾つかの医療用途のため承認されている。このように、ヒト組換体ＢＭＰ−２、即ち国際的な一般名に従うとジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、米国ではインフーズ（ＩｎＦｕｓｅ）（登録商標）、そして欧州ではインダクトＯｓ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ）（登録商標）の名称で販売される製品中に配合されている。この製品は、腰椎融合に対して、及び非結合骨折として既知であるもののための脛骨の骨再生に対して処方される。腰椎の融合のためのインフーズの場合、外科的処置はまず第一に、ｒｈＢＭＰ−２溶液中にコラーゲンスポンジを浸し、その後、腰椎間に前もって移植された中空ケージ（ＬＴケージ）にそのスポンジを置く。
【０００７】
ヒト組換体ＢＭＰ−７、即ち国際的な一般名に従うとエプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、ＢＭＰ−２と同じ治療指標を有し、２つの製品、即ち脛骨の開裂骨折に対するＯＰ−１インプラント（ＯＰ−１Ｉｍｐｌａｎｔ）及び腰椎融合に対するＯＰ−１パテ（ＯＰ−１Ｐｕｔｔｙ）の基盤を形成している。ＯＰ−１インプラントは、ｒｈＢＭＰ−７及び０．９％生理的食塩水が吸収されたコラーゲンを含有する粉末からなる。得られたペーストはその後、外科的処置中に骨折部に適用される。ＯＰ−１パテは、一方がｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンを含み、他方がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、２種類の粉末の形態で存在する。外科的処置中に、ＣＭＣは０．９％生理的食塩水によって再構成され、そしてｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンと混合される。こうして得られたペーストは、治療部位に適用される。
【０００８】
現在市販されているすべてのタンパク質のうち、ＢＭＰは、それらの高い疎水性及び生理的ｐＨでの非常に低い溶解度を導くそれらの凝集性によって卓越している。ＢＭＰ−２の場合には、これらの特性は臨床学的にＢＭＰ−２を改良するための研究の範囲内で立証されており、生理学的条件においてはそれほど溶解性でなく、且つ凝集する傾向にある（非特許文献７、８、９）。こうして、Ａｂｂａｔｉｅｌｌｏ及びＰｏｒｔｅｒ（非特許文献１０）は、低イオン強度の緩衝液中で、ｐＨが４．５よりも高くなった場合に、ＢＭＰ−２がますます不溶性となることを示した。タンパク質の沈澱は６．５よりも高いｐＨにて観察されるが、Ｆｒｉｅｓｓにより示されているように、塩化物イオン及び／又は硫酸イオンの存在下で低ｐＨ（５０ｍＭのＮａＣｌとｐＨ５．８、及び５ｍＭのＮａ２ＳＯ４とｐＨ５．５）においても観察される（非特許文献８）。生理学的条件におけるＢＭＰ−２の処方はそれ故、それ自体で問題である。
【０００９】
ＢＭＰのこの物理的不安定性の問題の別の例は、特許文献１において、Ｂｉｏｐｈａｒｍにより、ＢＭＰ−１４のサブクラス由来のタンパク質である、またＭＰ−５２としても既知である、成長及び分化因子のＧＤＦ−５を用いて明らかにされている。ＧＤＦ−５の特性は、ＢＭＰ−２のそれと非常に似通って、凍結乾燥物の不安定性にあり、溶液の再形成の間に凝縮しそして完全に再溶解され得ない傾向にあることが観察されている。これら２つの現象は、タンパク質の不可逆的な凝集と関連している。この問題を解決するために、凍結乾燥前にマンニトールが添加され、そしてこのことがこれら固体状態での問題の防止を可能にする。しかしながら、マンニトールは単に、生体外にて低水準の安定性を与えるに過ぎず、生体内での物理的不安定性を防止していない。
【００１０】
これら成長因子の物理的特性により負わされる制約を考慮すると、製品インフーズは、ｒｈＢＭＰ−２の溶解度及び物理的安定性を確実にするために、酸性ｐＨにおいて（酢酸緩衝液、ｐＨ４）且つ界面活性剤（ポリソルベート８０）の存在下において配合されなければならない。
【００１１】
治療用のタンパク質ベースの薬物の製造業者は、タンパク質の物理的安定性の問題に非常に大きく影響されている。実際に、ＢＭＰ凝集物の形成は、
・生物学的活性種の数の減少、
・生物活性又は吸収速度の変化、
・前記凝集物に対する潜在的な免疫学的応答、
・製品のオパール色による望ましくない外観、
・濾過装置及び注射器の閉塞
をもたらす可能性がある。
【００１２】
所望の治療効果を得るために、生理学的投与量よりも１０，０００因子も大きい非常に実質的な治療のためのＢＭＰ投与量を使用することが必要とされる。このことは、数ミリグラムのｒｈＢＭＰ−２が投与されるので特に、インフーズのような製品を用いた脊椎融合の治療の場合である。投与されるこの多量のＢＭＰは、溶液中の高濃度のＢＭＰ、およそ１．５ｍｇ／ｍＬで処理しなければならないことを意味する。この濃度において、ＢＭＰはたやすく凝集し、それ故物理的に不安定となる。供給される溶液は酸性緩衝液及び界面活性剤を使用する。しかしながら、治療用途に関して、酸性であり且つ界面活性剤を含有する溶液を使用することは問題である。
【００１３】
これら物理的及び化学的安定性の問題を解決するために、幾つかの解決法が開発されている。
【００１４】
第一に、ヘパリン及びヘパランスルフェートが内因性の安定分子であるため、これら多糖類がＢＭＰを包含する成長因子を安定化させるために既知である（非特許文献１１）。しかしながら、ヘパリン及びヘパランスルフェートは、かなりの抗凝固性及び抗補体活性を有しているため、医薬組成物には使用され得ない。
【００１５】
Ｈｕｂｂｅｌｌは、フィブリン型のマトリックス内のタンパク質を安定化するために、前記タンパク質とベクターとの間に化学結合を形成することを包含する、タンパク質をグラフト化する方法を記載している。前記結合は、酵素により分解され得る融合タンパク質を用いて作られる。刊行物の非特許文献１２に報告されているこの方法は、実際に、凝集を防止することによってタンパク質を物理的に安定化させることを可能にしている。しかしながら、前記方法は、いずれ治療効果及び安全性が示されなければならないＢＭＰ−２類似体の使用を必要とする。
【００１６】
特許文献２において、Ｓｔｕｐｐ他は、成長因子のベクトル化、特にＢＭＰ−２のベクトル化のための両親媒性ペプチドを記載している。前記両親媒性ペプチドは、末端アルキル鎖、親水性ペプチド配列及びＢＭＰ−２の結合を付与するエピトープから形成されている。前記ペプチドは、疎水基が凝集する中心部において、ロッド型の巨大分子構造を形成するように溶液中で配列される。アミノ酸は周辺において、水との親和性及びタンパク質の結合を可能にする。しかしながら、前記ペプチドは、その複合初期構造により免疫学的な危険を与える。
【００１７】
特許文献３において、Ｔａｋａｏｋａ他は、骨再生用途のためのＢＭＰのベクトル化を取り扱った。著者は、前記タンパク質の放出を制御することを可能にする新規乳酸及び／又はグリコール酸ベースの、ｐ−ジオキサノンベースの及びポリエチレングリコールベースのポリマーを改良した。しかしながら、著者は、物理的又は化学的安定性の点で前記成長因子に関連したいずれの問題をも示していない。さらには、前記ポリマーは水溶性でなく、水を吸収してゲルを形成する。他方、前記ポリマーは有機溶媒に溶解性であり、アセトンに溶解される。従ってポリマー−ＢＭＰ−２製剤の形成は、タンパク質を変性させる危険がある有機溶剤の使用を必要とする（非特許文献１３）。
【００１８】
特許文献４において、Ｗｙｅｔｈは、ＢＭＰのベクトル化のために疎水基（ベンジルアルコール）により修飾されたヒアルロン酸を記載している。このポリマーにおいて、疎水基の含量は５０ないし１００％であるため、ポリマーは水に溶解されず、水を吸収し得る。この場合、前記吸湿性ポリマーはタンパク質と水溶性複合体を形成し得ず、そのためＢＭＰの安定性の問題を解決する。この型の製剤がまた、Ｆｉｄｉａ ｅｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの名称で特許文献５に開示されているが、開示されている製剤は複合体を形成しておらず、例示されている多糖類は水に不溶であり、５０％を越える疎水性エステル基を含有している。
【００１９】
特許文献６において、Ｂｒｏｄｂｅｃｋ他は、ＢＭＰのベクトル化のためにＰＬＡＧＡを使用している。前記ポリマーは水に不溶であり、そのためタンパク質との水溶性複合体を形成し得ない。本願出願人とは対照的に、著者の目的は、ＰＬＡＧＡから形成された固体中のＢＭＰを水性溶媒中で不溶化することであり、タンパク質を変性させる危険のある有機溶媒の使用をさらに必要とする。
【００２０】
例として、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（非特許文献１４）という題名の下で発行されたＢｌａｎｑｕａｅｒｔ他及びＢａｒｒｉｔａｕｌｔ他による研究は、種々の成長因子と相互作用すると信じられているベンジルアミンにより修飾されたデキストランの使用を記載している。該ポリマーは治療活性を有するものと記載されている。著者はまた、これらデキストランの幾つか、そしてより特に、カルボキシメチル基（ＣＭ）、ベンジルアミド基（Ｂ）及びスルホネート基（Ｓ）により置換されたデキストラン（ＣＭＤＢＳ化合物）が、成長因子の添加なしに骨再構成の刺激を可能にすることを主張している（非特許文献１５）。
【００２１】
同様の方法に従うと、特許文献７において、Ｂｌａｃｈａｎｔ他は、トリメチルホスフェートを用いてポリマー鎖を架橋することにより不溶化されたベンジルアミン及びスルフェートにより修飾されたデキストランを記載している。水性媒質中のこのスポンジは、このタンパク質に保持され得るためにＢＭＰリザーバとして作用する。架橋前に、両親媒性ポリマーは、ゲル電気泳動による相互作用試験に示されるように、ＢＭＰ−２と複合体を形成する。しかしながら、用いられるポリマー／ＢＭＰ質量比は非常に高く、５，０００を超える。溶液中での複合体の解離を導くかなり弱いポリマー／タンパク質相互作用のため、この高い比率が用いられる。また、ＢＭＰの化学的又は物理的安定化が記載されていない。この型の比率は、医薬品の開発において許容され得ない。
【００２２】
ベンジルアミンは特に毒性を有するおそれがあり、上記２つの特許文献で記載されているポリマーの生体適合性を損なうおそれがあることは知られている。
【００２３】
骨再構成のためのこの型のタンパク質の生薬製剤は、賦形剤の安全要件を必然的に満たさなければならず、そしてこの要件を満たすために、生体適合性のある化合物を用いることだけでなく、有効成分に関しその量を制限することもまた必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第２００４１３２６５３号明細書
【特許文献２】米国特許第２００５０２０９１４５号明細書
【特許文献３】米国特許第６２５８３８２号明細書
【特許文献４】米国特許第２００５／０２８７１３５号明細書
【特許文献５】欧州特許第１４５４６４０号明細書
【特許文献６】ニュージーランド国特許第５３０７０１号明細書
【特許文献７】フランス国特許第２７９４６４９号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｕｒｉｓｔ ＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６５；１５０，８９３
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ Ｃ．２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８７，１０３
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ ＭＰ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３；２３１，４４５
【非特許文献４】Ｉｓｒａｅｌ ＤＩ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６，１３（３−４），２９１
【非特許文献５】Ｍｕｎｄｙ他 Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ２００４，２２（４），２３３
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ Ｈ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，８５Ａ １５４４−１５５２
【非特許文献７】Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ，２００４ Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２００４；２２（２），３７６
【非特許文献８】Ｆｒｉｅｓｓ，Ｗ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｓｈａｋｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｔｈｅｓｉｓ Ａａｃｈｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ １９９９
【非特許文献９】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＤＨ，Ｔｈｅｓｉｓ Ｍｕｎｃｈｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ ２００５
【非特許文献１０】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９７，６，Ｓｕｐｐｌ ２９９
【非特許文献１１】Ｒｕｐｐｅｔ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，２９５
【非特許文献１２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００５，８９，３，２５３
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１９，３３２
【非特許文献１４】１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，第４４巻,第６３頁ないし第７２頁
【非特許文献１５】１９９９，Ｂｏｎｅ，１７，６，４９９−５０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
従って、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されるＢＭＰのような骨形成タンパク質の溶解化及び安定化を可能とする注射製剤を開発するという問題は、満足できる手法では解決されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、７００よりも低いポリマー／ＢＭＰ質量比にて生体適合性である骨形成タンパク質と両親媒性ポリマーとの安定な水溶性複合体の形成を可能にする。この複合体は、
・生体外及び生体内における生理的ｐＨでのその疎水性により生じるＢＭＰの凝集を防止すること、
・３７℃にて細胞の存在下でＢＭＰを安定化させること、
を可能にする。
【００２８】
前記水溶性複合体は、有機溶媒を使用する必要なしに完全に水性媒質中で形成される。
【００２９】
従って本発明は、物理的及び化学的に安定且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体であって、
前記両親媒性ポリマーは、下記の一般式：
【化１】
［式中、
Ｒ、Ｒ１は、同一又は異なっていてもよく、結合部又は１ないし１８個の炭素原子を含有する連鎖を表し、前記連鎖は、場合によっては、枝分れし及び／又は不飽和であっても、且つ、１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又は／及びＳを含有していてもよく、
Ｆ、Ｆ’は、同一又は異なっていてもよく、エステル、チオエステル、アミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、エーテル、チオエーテル又はアミンを表し、
Ｘは、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｙは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｈｙは、下記の群：
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし３０のアルキル基、
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアルキルアリール基、或いは直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアリールアルキル基、及び
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい炭素原子数８ないし３０の多環式基
からなる群より選択される疎水基を表すが、但し、Ｈｙはベンジルアミンを表すものではなく、
ｎ及びｏは１ないし３の数であり、
ｈは、モノマー単位に関する疎水性パターンのモル分率を表すものであって、０．０１ないし０．５であり、
ｘは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし２．０であり、
ｙは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし０．５である。］
で表される疎水性置換基と親水基により官能化された親水性多糖類骨格により形成されており、
前記ＢＭＰは、治療上有効なＢＭＰ（骨形成タンパク質）の群より選択され、
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は７００以下であることを特徴とする、複合体に関する。
【００３０】
１つの態様において、本発明に従う複合体にあっては、前記多糖類が、上記定義されたように、式中、ｙ＝０である一般式Ｉで表される多糖類より選択される。
【００３１】
１つの態様において、本発明に従う複合体にあっては、前記多糖類が、上記定義されたように、式中、Ｘがカルボキシレートを表す一般式Ｉで表される多糖類より選択される。
【００３２】
１つの態様において、本発明に従う複合体にあっては、本発明に従う多糖類が、基Ｒが以下の群：
【化２】
より選択されることを特徴とする。
【００３３】
１つの態様において、本発明は、前記ポリマー／ＢＭＰ質量比が６００以下であることを特徴とする複合体に関する。
【００３４】
１つの態様において、本発明は、前記ポリマー／ＢＭＰ質量比が５００以下であることを特徴とする複合体に関する。
【００３５】
治療上の使用のためのＢＭＰ濃度は、溶液中におよそ１．５ｍｇ／ｍＬである。比率が７００を超えると、１．０ｇ／ｍＬの両親媒性ポリマーを含有する組成物が得られる。前記ポリマー濃度に基づくと、製剤は、例えば粘度に関して、治療用途としてもはや適していない物理化学的な挙動を有する。
【００３６】
本発明は、ＢＭＰが、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されることを特徴とする複合体に関する。
【００３７】
両親媒性ポリマーの置換基は、制御されたか又は統計的な手法で分布されている。ブロックコポリマー及び交互コポリマーが、制御された置換基の分布を有するポリマー例である。
ランダムコポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
｜ ｜ ｜
疎水基 疎水基 疎水基
ブロックコポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
｜ ｜ ｜
疎水基 疎水基 疎水基
交互コポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
｜ ｜ ｜
疎水基 疎水基 疎水基
【００３８】
従って、１つの態様において、本発明はまた、前記ポリマーが、置換基が任意の手法で分布したポリマーより選択されることを特徴とする両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体に関する。
【００３９】
１つの態様において、前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ガラクツロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン及びセルロースからなる群より選択される。
【００４０】
前記セルロースの群は、酸により官能化されたセルロース、例えばカルボキシメチルセルロースからなる。
【００４１】
前記デキストランの群は、酸により官能化されたデキストラン、例えばカルボキシメチルデキストランからなる。
【００４２】
１つの態様において、前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸及びキトサンからなる群より選択される。
【００４３】
これら種々の多糖類は、以下：
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
として表され得る。
【００４４】
前記多糖類は、１０ないし１００００の平均重合度ｍを有し得る。
【００４５】
１つの態様において、多糖類は、１０ないし１０００の平均重合度ｍを有する。
【００４６】
１つの態様において、多糖類は、１０ないし５００の平均重合度ｍを有する。
【００４７】
１つの態様において、本発明はまた、前記疎水基Ｈｙが、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選択される疎水性の天然アミノ酸、或いはそれらのアルコール誘導体、脱カルボン酸誘導体、エステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体に関する。
【００４８】
１つの態様において、本発明はまた、前記疎水基Ｈｙが、トリプトファン或いはトリプトファンのエステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体に関する。
【００４９】
トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミンがトリプトファン誘導体の例である。
【００５０】
１つの態様において、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体は可逆的である。
【００５１】
使用されるポリマーは、当業者に既知の方法に従い合成されるか、或いはシグマ−アルドリッヒ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＮＯＦ社（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）又はカルボメル社（ＣａｒｂｏＭｅｒ Ｉｎｃ．）のような供給者から入手される。
【００５２】
ＢＭＰは、当業者に既知の方法に従い得られるヒト組み替え体ＢＭＰより選択されるか、或いはリサーチダイアグノスチック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．）（ＵＳＡ）のような供給者から入手される。
【００５３】
ＢＭＰは高い疎水性の成長因子である。生理的ｐＨにて、該タンパク質の疎水性は凝集そしてその後の沈澱をもたらす。本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体は、生理的ｐＨの溶液中での前記タンパク質の物理的安定化を可能にする。
【００５４】
物理的又は化学的分解とは、タンパク質の生物学的活性を低下させる、凝集のような物理的事象を意味するか、或いはタンパク質分解のような化学的事象を意味する。
【００５５】
同時に、タンパク質の物理的又は化学的安定化とは、タンパク質の生物学的活性を維持する作用を意味する。
【００５６】
複合体の安定性は、ＢＭＰの安定性を測定することにより観察される。
【００５７】
両親媒性ポリマーを用いたタンパク質の安定化は従って、特に以下の試験：
・ゲル電気泳動を用いた両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を明らかにするための試験
・３７℃及び中性ｐＨにて行われる両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体中の細胞の存在下でのＢＭＰの熱安定性の試験
・生理的ｐＨでの前記複合体中のＢＭＰの物理的安定性についての試験
を行うことにより証明され得る。
【００５８】
電気泳動を用いた両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を明らかにするための試験は、電界を用いてイオンを置換することに基づいている。アニオン複合体はアノードに向かって泳動し、そしてカチオン複合体はカソードに向かって泳動する。泳動後、タンパク質は、毛管現象によってＰＶＤＦメンブランに転移され、そしてペルオキシダーゼと結合した第二抗体により認知される前記タンパク質の特定の抗体により明らかとされる。単独では泳動しないタンパク質；即ち両親媒性ポリマーと結合されたタンパク質は、複合体の全電荷に応じてアノード又はカソードに向かって泳動する。
【００５９】
細胞の存在下でのＢＭＰの熱安定性の試験は、３７℃にて且つ中性ｐＨにて行われ、そしてＣ２Ｃ１２筋芽細胞を含有する培地中にＢＭＰ溶液を沈積させることを包含する。溶液中のＢＭＰ濃度は、沈積が行われた後（２日目）及び５日間の培養の後（７日目）のＥＬＩＳＡ法により決定される。ＢＭＰの生物学的活性は、骨芽細胞への筋芽細胞の分化中の２日目ないし７日目に生成されたアルカリホスファターゼの活性をアッセイすることにより評価される。
【００６０】
生理的ｐＨでのＢＭＰの物理的安定性についての試験は、一般的に酸性ｐＨにあるタンパク質のもとの緩衝液を、７．４のｐＨを有するＰＢＳ溶液に交換することによって、タンパク質溶液を生理的ｐＨにすることに基づいている。交換の最後においてＢＭＰを一定濃度に維持する一方で、３回の交換が行われる。該プロセスの最後における溶液中のＢＭＰ濃度は、遠心分離後のＥＬＩＳＡ法により決定される。この試験は、濃縮されたＢＭＰ−２溶液を、ｐＨ７．４に固定された緩衝液を用いて希釈することによっても行われ得る。
【００６１】
本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体は、タンパク質を変性させるおそれのあるいかなる有機溶媒も存在させずに、ＢＭＰ及び両親媒性ポリマーを生理的ｐＨの水性溶液中に入れることにより形成される。両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の形成は自発であり、ＢＭＰと両親媒性ポリマーとの間に共有結合は含有されていない。この会合は、実質的に疎水性且つイオン相互作用である弱小な結合により形成される。複合体の形成は有機溶媒を必要としない。
【００６２】
本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の形成の証拠を高めるために、所望によりその他の試験が行われ得る。
・円偏光二色性により決定されるＢＭＰの三次元構造を維持するための試験。
・ストレス下、生理的ｐＨでの本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体中のＢＭＰの安定性の試験。ストレスは、塩等の存在下での特定の攪拌法であり得る。
・サーモリシンのようなタンパク質分解酵素に対する耐性の試験。
【００６３】
本発明により解決される問題の１つは、タンパク質の改良された安定性であり、それ故生体外及び生体内での維持された生物学的活性である。前記生物学的活性は、骨芽細胞への筋芽細胞の分化についてのＢＭＰの性能を示す分化試験により評価され得る。前記分化は、
・細胞培地中で生成されたアルカリホスファターゼの活性のアッセイ、
・アルカリホスファターゼを生成する細胞の染色、
・細胞培地中に生成されたオステオカルシンのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
を用いて測定され得る。
【００６４】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を含有することを特徴とする、治療用組成物にも関する。
【００６５】
治療用組成物とは、ヒト用又は動物用薬物に用いられ得る組成物を意味する。
【００６６】
本発明に従う治療用組成物は、好ましくは局所的に適用され、且つ溶質、ゲル、クリーム、凍結乾燥物、粉体又はペーストの形態で存在し得る組成物である。
【００６７】
本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体とともに配合され得る賦形剤の性質は、当業者の一般知識に従い、その投与形態に応じて選択される。
【００６８】
従って、本発明に従う組成物がペーストの形態にある場合、前記ペーストは、例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸三カルシウム及びコラーゲンのような製品から得られる。
【００６９】
製剤のパラメータを調節するために、ｐＨを調節するための緩衝液、等張性の調節を可能にする薬剤、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、ｍ−クレゾール又はフェノールのような防腐剤、或いはまたＬ−塩酸リジンのような抗酸化剤として、他の賦形剤が本発明において用いられ得る。
【００７０】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ１．５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ投与を可能とすることを特徴とする。
【００７１】
本発明はまた、生体内で骨形成を誘発する治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の使用にも関する。
【００７２】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を含有する治療用組成物を治療部位に適用することからなることを特徴とする、ヒト又は動物用の治療方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
両親媒性ポリマーの合成
実施例１：トリプトファンエチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ−１）
この両親媒性ポリマーを、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０、及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。クロロギ酸エチル及びＮ−メチルモルホリンを用いた有機溶媒中での慣用のカップリング法に従い、トリプトファンエチルエステルをポリマーの酸にグラフトした。反応媒体を水中に希釈し、そして１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを７に調節した後、ポリマーを限外濾過により精製した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｒｐＯＥｔ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５
を特徴としていた。
【００７４】
実施例２：トリプトファンにより修飾されたカルボキシメチルデキストランナトリウム塩（ＡＰ２）
ＡＰ−１の塩基性加水分解により両親媒性ポリマーを得た。両親媒性ポリマー１の水溶液（３１ｍｇ／ｍＬで６４ｍＬ）に水酸化ナトリウム１Ｎ（３．７９ｍＬ）を添加して、ｐＨ１２．７とした。得られた溶液を周囲温度にて一晩攪拌した。水（ＮａＣｌ ０．９％及びＨ２Ｏ）に対する透析により、ポリマーを精製した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｒｐＯＮａ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート、トリプトファンカルボキシレート）置換度が１
を特徴としていた。
【００７５】
実施例３：フェニルアラニンエチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ３）
この両親媒性ポリマーを、実施例１に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＰｈｅＯＥｔ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００７６】
実施例４：チロシンメチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ４）
この両親媒性ポリマーを、実施例１に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｙｒＯＭｅ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００７７】
実施例５：トリプトファンエチルエステルにより修飾されたデキストランコハク酸（ＡＰ５）
この両親媒性ポリマーを、文献（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｈａｖｅｓ，Ｍａｎｕｅｌ他，ｐｏｌｙｍｅｒ １９９８，３９（１３），２７５１−２７５７）に従い得られた、糖単位当りのコハク酸置換度が１．０及び７０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するデキストランコハク酸から合成した。クロロギ酸エチル及びＮ−メチルモルホリンを用いた有機溶媒中での慣用のカップリング法に従い、トリプトファンエチルエステルをポリマーの酸にグラフトした。反応媒体を水中に希釈し、そして１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを７に調節した後、ポリマーを限外濾過により精製した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｒｐＯＥｔ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（コハク酸カルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００７８】
比較例１：ドデシルアミンにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ６）
この両親媒性ポリマーを、実施例１に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのドデシルアミン置換度が０．１０、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．９０
を特徴としていた。
【００７９】
比較例２：ベンジルアミンにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ７）
この両親媒性ポリマーは、特許文献７に記載されており、
・糖単位当りのベンジルアミン置換度が０．４５、
・糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００８０】
電気泳動による両親媒性ポリマーに対するＢＭＰ−２の親和性
ＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー複合体の製造
Ｈ２Ｏ／ＡｃＮ／ＴＦＡ（６４．９／３５／０．１％）緩衝液中の０．２８ｍｇ／ｍＬＢＭＰ−２溶液の５μＬを、ｐＨ７．４によって緩衝化された１００ｍｇ／ｍＬのＡＰ溶液の７μＬに添加した。この溶液を０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて１４μＬとした。この溶液は、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２濃度、及び１：５００のＢＭＰ−２／ＡＰ比を有していた。この溶液を、周囲温度にて３０分間素早く攪拌した。
【００８１】
ＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー複合体の証明
ＢＭＰ−２／ＡＰ溶液を泳動用緩衝液（ｐＨ７を有するトリスアセテート溶液）で２０倍に希釈した。希釈溶液の２μＬをその後、水８μＬ及びローディング用緩衝液７μＬ（水中のグリセロール、トリスアセテート及びブロモフェノールブルー）に添加した。このＢＭＰ−２を１０ｎｇ及びＡＰを５μＬ含有する１７μＬを、０．８％アガロースゲルのウェルに沈積した。電気泳動チャンバを閉じ、そしてジェネレータを３０Ｖに設定した。泳動を１時間継続した。
【００８２】
泳動後、ゲルを、電界の下でアノードに置いたＰＶＤＦメンブランに転移させた（２０分間，１５Ｖ，バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）からのトランス−ブロットＳＤ（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ））。メンブランを、周囲温度にて１時間、脱脂粉乳を用いて飽和させ、そしてその後、ＢＭＰ−２の第一抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最後に、第二抗体であるウサギ抗ヤギＨＲＰとともにインキュベートした（周囲温度にて１時間）。Ｏｐｔｉ−４ＣＮに対してＨＲＰを反応させることにより、現像を行った。反応生成物が可視光を吸収するので、染色が十分となったときに現像を停止させた。
【００８３】
ＢＭＰ−２がＡＰと複合体を形成すると、該複合体は沈積位置から０．７ｃｍの単一スポットの形態で検出される（アノードへの泳動）。ＢＭＰ−２が単独であるか又はＡＰと複合体を形成していない場合には、泳動されていないため、沈積位置にてそれが検出される。
【００８４】
５種のポリマーについての結果を下記表に示す。
【表１】
【００８５】
生理的ｐＨにおける両親媒性ポリマーの存在下でのＢＭＰ−２の安定性
ＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー複合体の製造
Ｈ２Ｏ／ＡｃＮ／ＴＦＡ（６４．９／３５／０．１％）緩衝液中の０．２８ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２溶液から出発して、種々の溶液を製造した。
１．水中に希釈することにより得られた０．０８４ｍｇ／ｍＬＢＭＰ−２溶液
２．１４ｍｇ／ｍＬのＡＰ溶液を用いてＢＭＰ−２を希釈することにより得られた、０．０８４／９．８ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー溶液。
各々の溶液をその後、ｐＨ７．４及び３００ｍＯｓｍを有するＰＢＳ１０ｍＭ溶液を用いて１：１０に希釈し、そしてその後、マイクロコン細胞遠心分離（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ｃｅｌｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて再濃縮した（ＹＭ１０，１０ｋＤ，５００μＬ）。この操作を２回繰り返した。３回の洗浄後、各々の溶液を遠心分離し、そして上澄み中のＢＭＰ−２の濃度を、ＥＬＩＳＡ法により決定した。
【００８６】
対照とするために、０．０８４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２溶液の一部について、いかなる洗浄もしなかった。０．０８４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２溶液の別の一部を、１ｍＭのＨＣｌ溶液（ｐＨ３）を用いて３回洗浄した。この緩衝液は、ＢＭＰ−２を安定化させるのに既知であるが、医薬用途には適合しない。
【００８７】
いかなる洗浄も受けなかったＢＭＰ−２溶液のＥＬＩＳＡアッセイは、８３．４μＬのＢＭＰ−２濃度を与えた。この数値は１００％ＢＭＰ−２に相当する。ＰＢＳを用いた３回の洗浄の最後におけるその他の溶液のＥＬＩＳＡにより決定された濃度が、未洗浄のＢＭＰ−２の上記数値に加えられた。得られたＢＭＰ−２のパーセンテージを下記の表に示す。
【表２】
【００８８】
ＢＭＰ−２と複合体を形成し得るＡＰは、生理的ｐＨにおいてＢＭＰ−２を安定にさせた。ＡＰが存在しない場合においては、ＢＭＰ−２は、生理的ｐＨの溶液中にもはや存在しなかった。同様に、ＢＭＰ−２と複合体を形成しなかったＡＰの存在下においても、タンパク質は溶液中にもはや存在しなかった。
【００８９】
３７℃の且つ生理的ｐＨの培地中での両親媒性ポリマーの存在下でのＢＭＰ−２の安定性及び生物学的活性
０日目に、Ｃ２Ｃ１２細胞（マウスの筋肉細胞）を、１０％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭを含有する９６ウェルの培養プレートに播種し（ウェル当り７０００細胞）、そしてその後、オーブン中に２４時間置いた。１日目に、細胞の付着後に、培地を、２％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭで２４時間置き換えた。２日目に、培地を、ＢＭＰ−２のみの溶液（０．３μｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−２／ＡＰ１複合体の溶液（０．３／１５０μｇ／ｍＬ，１：５００の比）を補った２％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭで置き換えた。複合体を、２％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭ中にＢＭＰ−２及びＡＰを別々に希釈することにより製造した。沈積させる前に、タンパク質／ＡＰ１混合物を１時間静置させた。７日目に、即ち沈積して５日後に、残存するＢＭＰ−２をＥＬＩＳＡによりアッセイするために上澄みを採取した。
【表３】
細胞を接触させて５日後に、単独であったＢＭＰ−２の５％未満が残存したが、ＡＰ１とともに混合された場合には、４０％を超えるＢＭＰ−２が残存した。
【００９０】
同様の実験の７日目に、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、その後５０μＬの溶解緩衝液を用いて溶解させ、そして、凍結（−８０℃）／解凍（３７℃）のサイクルを３回行った。アルカリホスファターゼの酵素活性を、４０５ｎｍにて吸収する基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェートに対する溶解質において測定した。この活性は、マイクロＢＣＡにより測定されたタンパク質の量まで低下し、そしてそれ故タンパク質のｎｍｏｌ ｐｎＰ／分．μｇで表した。
【表４】
ＢＭＰ−２は、複合体によって、生存条件下で５日間よりも長く安定化されたが、それ自体単独では、そのような期間安定ではなかった。
ＢＭＰ−２活性は、細胞分化のゆっくりとした進行によって明らかであり、ＢＭＰ−２複合体は、ＢＭＰ−２単独よりも生体外においてより高い活性であった。
【００９１】
酵素分解に対するＢＭＰ−２ポリマーを用いた保護
ＢＭＰ−２／ポリマー複合体の製造
ＴＦＡアセトニトリル緩衝液中の０．３１５ｍｇ／ｍＬ ＢＭＰ−２溶液の１９μＬを、６６ｍｇ／ｍＬポリマー（ＰＡ２）溶液の４．６μＬに、７．５のｐＨを有するトリス５０ｍＭの５０μＬに、２５μｇ／ｍＬサーモリシンの６０μＬに、そしてＨ２Ｏ３６６．４μＬに添加した。いずれのポリマーも含有しない同様の溶液を対照として製造した。これら２種の溶液において、サーモリシンはタンパク質の２５％である（質量／質量）。
【００９２】
消化動態：
サーモリシンを含有するＢＭＰ−２単独の溶液及び複合体の溶液を６０℃にて６時間インキュベートした。Ｔ＝０．２０分、１時間、２時間及び６時間にて２０μＬの試料を採取した。各々の試料を採取したとき、酵素反応を阻害するために２５０ｍＭ ＥＤＴＡの５μＬを直ちに添加し、即ち、５０ｍＭの最終濃度であった。その後、試料を−２０℃にて凍結させた。
【００９３】
現像：
１５％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルから形成したウエスタンブロットを使用して、現像を行った。各々の試料の７μＬ（ＢＭＰ−２の６５ｎｇを含有する）を、ＳＤＳを含有するＬａｅｍｍｌｉローディング用緩衝液の７μＬと混合した。その後、試料を９５℃にて１０分間変性し、その後、１５％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに沈積した。対照として、等量のＢＭＰ−２（６５ｎｇ）及びサーモリシン（１６．２５ｎｇ）をもゲルに沈積した。電気泳動チャンバを閉じ、そしてジェネレータを１２５Ｖに設定した。泳動を１時間１５分間継続した。
【００９４】
泳動後、バイオラッド転移系を用いて、１００ボルトにて１時間、ゲルをＰＶＤＦメンブランに転移させた。メンブランをその後、周囲温度にて１時間、脱脂粉乳を用いて飽和させ、そしてその後、ＢＭＰ−２の第一抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最終的に、ＨＲＰと結合する第二抗体とともにインキュベートした（周囲温度にて１時間）。Ｏｐｔｉ−４ＣＮにおいてＨＲＰを反応させることにより現像を行った。反応生成物が可視光を吸収するので、染色が十分となったときに現像を停止させた。
【００９５】
ＢＭＰ−２が単独であると、２０分後により低分子量のバンドの出現が観察され、このことは、サーモリシンによるタンパク質の分解であると解釈される。ポリマーの存在下においては、このバンドは存在せず、このことは、ポリマーが分解に対してタンパク質を保護していることを示している。
ポリマーがサーモリシンの作用を阻害していないことをチェックした後には、得られた結果が、ポリマーＰＡ２が酵素分解に対してＢＭＰ−２を有効に保護していることを示すものと結論され得る。
【００９６】
生理的ｐＨの水中において複合体の形態にあるＢＭＰ−２の可溶化
生理的ｐＨでのＢＭＰ−２の溶解度
ＢＭＰ−２は８．５の等電点を有しており、このことは生理的ｐＨにおいて、ＢＭＰ−２がその低い溶解度と関連していることを意味している。このことは、ＢＭＰ−２を用いた酸溶液を中和するための実験によって示され得る。
【００９７】
生理的ｐＨでのＢＭＰ−２／ＰＡ２複合体の溶解度
清澄な１．５ｍｇ／ｍＬ ＢＭＰ−２溶液を、酸性緩衝液（インフーズ緩衝液，ｐＨ４．５）中で製造した。７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＡ２を得るために、凍結乾燥したＰＡ２を前記溶液に添加した。このＢＭＰ−２／ＰＡ２複合溶液をその後、ホスフェート緩衝液を添加することによって中和して、７．４のｐＨを得た（１．２ｍｇ／ｍＬの最終ＢＭＰ−２濃度及び６０ｍｇ／ｍＬの最終ＰＡ２濃度）。ｐＨ７．４にてＢＭＰ−２は完全に溶解し、凝集体は見られなかった。ＢＭＰ−２／ＰＡ２複合体の形態における、生理的ｐＨでのＢＭＰ−２の溶解度は、それ故大きく高められた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性ポリマーと骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーに属する骨形成タンパク質との水溶性の新規な複合体に関するものであって、該複合体は、物理的及び化学的に安定であり、そしてそれ故、生体外及び生体内の両方におけるＢＭＰの物理的及び化学的安定性を改良するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成誘発の機構に含まれる成長因子である。ＢＭＰは骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、１９６５年にＵｒｉｓｔにより最初に特定された（非特許文献１）。皮質骨から単離されるこれらタンパク質は、非常に種々の動物の骨形成を誘発し得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＢＭＰは、翻訳後成熟の後に１０４ないし１３９残基の長さを有するプロペプチドの形態で発現する。それらの配列は非常に一致しており、且つ類似の三次元構造を有している。特に、それらは、所謂“システイン集団（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｋｎｏｔ）”を形成する分子内ジスルフィド結合に包含される６個のシステイン残基を有している（非特許文献２及び３）。それらのうちの数種は、ダイマーの形成を導く分子内ジスルフィド結合に包含される７番目のシステインを有している（非特許文献２）。
【０００４】
それらの活性形態において、ＢＭＰは、Ｉｓｒａｅｌ等により記載されるように、ホモダイマーとして及びヘテロダイマーとしてさえ会合する（非特許文献４）。ダイマー状ＢＭＰは、ＢＭＰＲ型の膜透過受容体と相互作用する（非特許文献５）。この認識は、特にＳｍａｄタンパク質を含有する一連の細胞内シグナル伝達を引き起こし、このことが標的遺伝子の活性化又は抑制化を誘発する。
【０００５】
ＢＭＰ１及び３を除いて、ＢＭＰは、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｔｏｕｓ ｃｅｌｌ）を分化させるのに直接的な且つ間接的な役割を果しており、このことが骨芽細胞へのその分化を誘発する（非特許文献６）。それらはまた、走化性の特性を有し、且つ増殖、分化及び血管形成を誘発する。
【０００６】
幾種かのヒト組換体ＢＭＰ、特にｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７は、ヒトの生体内での骨形成を誘発する能力を明らかに示しており、そして幾つかの医療用途のため承認されている。このように、ヒト組換体ＢＭＰ−２、即ち国際的な一般名に従うとジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、米国ではインフーズ（ＩｎＦｕｓｅ）（登録商標）、そして欧州ではインダクトＯｓ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ）（登録商標）の名称で販売される製品中に配合されている。この製品は、腰椎融合に対して、及び非結合骨折として既知であるもののための脛骨の骨再生に対して処方される。腰椎の融合のためのインフーズの場合、外科的処置はまず第一に、ｒｈＢＭＰ−２溶液中にコラーゲンスポンジを浸し、その後、腰椎間に前もって移植された中空ケージ（ＬＴケージ）にそのスポンジを置く。
【０００７】
ヒト組換体ＢＭＰ−７、即ち国際的な一般名に従うとエプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、ＢＭＰ−２と同じ治療指標を有し、２つの製品、即ち脛骨の開裂骨折に対するＯＰ−１インプラント（ＯＰ−１Ｉｍｐｌａｎｔ）及び腰椎融合に対するＯＰ−１パテ（ＯＰ−１Ｐｕｔｔｙ）の基盤を形成している。ＯＰ−１インプラントは、ｒｈＢＭＰ−７及び０．９％生理的食塩水が吸収されたコラーゲンを含有する粉末からなる。得られたペーストはその後、外科的処置中に骨折部に適用される。ＯＰ−１パテは、一方がｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンを含み、他方がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、２種類の粉末の形態で存在する。外科的処置中に、ＣＭＣは０．９％生理的食塩水によって再構成され、そしてｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンと混合される。こうして得られたペーストは、治療部位に適用される。
【０００８】
現在市販されているすべてのタンパク質のうち、ＢＭＰは、それらの高い疎水性及び生理的ｐＨでの非常に低い溶解度を導くそれらの凝集性によって卓越している。ＢＭＰ−２の場合には、これらの特性は臨床学的にＢＭＰ−２を改良するための研究の範囲内で立証されており、生理学的条件においてはそれほど溶解性でなく、且つ凝集する傾向にある（非特許文献７、８、９）。こうして、Ａｂｂａｔｉｅｌｌｏ及びＰｏｒｔｅｒ（非特許文献１０）は、低イオン強度の緩衝液中で、ｐＨが４．５よりも高くなった場合に、ＢＭＰ−２がますます不溶性となることを示した。タンパク質の沈澱は６．５よりも高いｐＨにて観察されるが、Ｆｒｉｅｓｓにより示されているように、塩化物イオン及び／又は硫酸イオンの存在下で低ｐＨ（５０ｍＭのＮａＣｌとｐＨ５．８、及び５ｍＭのＮａ２ＳＯ４とｐＨ５．５）においても観察される（非特許文献８）。生理学的条件におけるＢＭＰ−２の処方はそれ故、それ自体で問題である。
【０００９】
ＢＭＰのこの物理的不安定性の問題の別の例は、特許文献１において、Ｂｉｏｐｈａｒｍにより、ＢＭＰ−１４のサブクラス由来のタンパク質である、またＭＰ−５２としても既知である、成長及び分化因子のＧＤＦ−５を用いて明らかにされている。ＧＤＦ−５の特性は、ＢＭＰ−２のそれと非常に似通って、凍結乾燥物の不安定性にあり、溶液の再形成の間に凝縮しそして完全に再溶解され得ない傾向にあることが観察されている。これら２つの現象は、タンパク質の不可逆的な凝集と関連している。この問題を解決するために、凍結乾燥前にマンニトールが添加され、そしてこのことがこれら固体状態での問題の防止を可能にする。しかしながら、マンニトールは単に、生体外にて低水準の安定性を与えるに過ぎず、生体内での物理的不安定性を防止していない。
【００１０】
これら成長因子の物理的特性により負わされる制約を考慮すると、製品インフーズは、ｒｈＢＭＰ−２の溶解度及び物理的安定性を確実にするために、酸性ｐＨにおいて（酢酸緩衝液、ｐＨ４）且つ界面活性剤（ポリソルベート８０）の存在下において配合されなければならない。
【００１１】
治療用のタンパク質ベースの薬物の製造業者は、タンパク質の物理的安定性の問題に非常に大きく影響されている。実際に、ＢＭＰ凝集物の形成は、
・生物学的活性種の数の減少、
・生物活性又は吸収速度の変化、
・前記凝集物に対する潜在的な免疫学的応答、
・製品のオパール色による望ましくない外観、
・濾過装置及び注射器の閉塞
をもたらす可能性がある。
【００１２】
所望の治療効果を得るために、生理学的投与量よりも１０，０００因子も大きい非常に実質的な治療のためのＢＭＰ投与量を使用することが必要とされる。このことは、数ミリグラムのｒｈＢＭＰ−２が投与されるので特に、インフーズのような製品を用いた脊椎融合の治療の場合である。投与されるこの多量のＢＭＰは、溶液中の高濃度のＢＭＰ、およそ１．５ｍｇ／ｍＬで処理しなければならないことを意味する。この濃度において、ＢＭＰはたやすく凝集し、それ故物理的に不安定となる。供給される溶液は酸性緩衝液及び界面活性剤を使用する。しかしながら、治療用途に関して、酸性であり且つ界面活性剤を含有する溶液を使用することは問題である。
【００１３】
これら物理的及び化学的安定性の問題を解決するために、幾つかの解決法が開発されている。
【００１４】
第一に、ヘパリン及びヘパランスルフェートが内因性の安定分子であるため、これら多糖類がＢＭＰを包含する成長因子を安定化させるために既知である（非特許文献１１）。しかしながら、ヘパリン及びヘパランスルフェートは、かなりの抗凝固性及び抗補体活性を有しているため、医薬組成物には使用され得ない。
【００１５】
Ｈｕｂｂｅｌｌは、フィブリン型のマトリックス内のタンパク質を安定化するために、前記タンパク質とベクターとの間に化学結合を形成することを包含する、タンパク質をグラフト化する方法を記載している。前記結合は、酵素により分解され得る融合タンパク質を用いて作られる。刊行物の非特許文献１２に報告されているこの方法は、実際に、凝集を防止することによってタンパク質を物理的に安定化させることを可能にしている。しかしながら、前記方法は、いずれ治療効果及び安全性が示されなければならないＢＭＰ−２類似体の使用を必要とする。
【００１６】
特許文献２において、Ｓｔｕｐｐ他は、成長因子のベクトル化、特にＢＭＰ−２のベクトル化のための両親媒性ペプチドを記載している。前記両親媒性ペプチドは、末端アルキル鎖、親水性ペプチド配列及びＢＭＰ−２の結合を付与するエピトープから形成されている。前記ペプチドは、疎水基が凝集する中心部において、ロッド型の巨大分子構造を形成するように溶液中で配列される。アミノ酸は周辺において、水との親和性及びタンパク質の結合を可能にする。しかしながら、前記ペプチドは、その複合初期構造により免疫学的な危険を与える。
【００１７】
特許文献３において、Ｔａｋａｏｋａ他は、骨再生用途のためのＢＭＰのベクトル化を取り扱った。著者は、前記タンパク質の放出を制御することを可能にする新規乳酸及び／又はグリコール酸ベースの、ｐ−ジオキサノンベースの及びポリエチレングリコールベースのポリマーを改良した。しかしながら、著者は、物理的又は化学的安定性の点で前記成長因子に関連したいずれの問題をも示していない。さらには、前記ポリマーは水溶性でなく、水を吸収してゲルを形成する。他方、前記ポリマーは有機溶媒に溶解性であり、アセトンに溶解される。従ってポリマー−ＢＭＰ−２製剤の形成は、タンパク質を変性させる危険がある有機溶剤の使用を必要とする（非特許文献１３）。
【００１８】
特許文献４において、Ｗｙｅｔｈは、ＢＭＰのベクトル化のために疎水基（ベンジルアルコール）により修飾されたヒアルロン酸を記載している。このポリマーにおいて、疎水基の含量は５０ないし１００％であるため、ポリマーは水に溶解されず、水を吸収し得る。この場合、前記吸湿性ポリマーはタンパク質と水溶性複合体を形成し得ず、そのためＢＭＰの安定性の問題を解決する。この型の製剤がまた、Ｆｉｄｉａ ｅｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの名称で特許文献５に開示されているが、開示されている製剤は複合体を形成しておらず、例示されている多糖類は水に不溶であり、５０％を越える疎水性エステル基を含有している。
【００１９】
特許文献６において、Ｂｒｏｄｂｅｃｋ他は、ＢＭＰのベクトル化のためにＰＬＡＧＡを使用している。前記ポリマーは水に不溶であり、そのためタンパク質との水溶性複合体を形成し得ない。本願出願人とは対照的に、著者の目的は、ＰＬＡＧＡから形成された固体中のＢＭＰを水性溶媒中で不溶化することであり、タンパク質を変性させる危険のある有機溶媒の使用をさらに必要とする。
【００２０】
例として、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（非特許文献１４）という題名の下で発行されたＢｌａｎｑｕａｅｒｔ他及びＢａｒｒｉｔａｕｌｔ他による研究は、種々の成長因子と相互作用すると信じられているベンジルアミンにより修飾されたデキストランの使用を記載している。該ポリマーは治療活性を有するものと記載されている。著者はまた、これらデキストランの幾つか、そしてより特に、カルボキシメチル基（ＣＭ）、ベンジルアミド基（Ｂ）及びスルホネート基（Ｓ）により置換されたデキストラン（ＣＭＤＢＳ化合物）が、成長因子の添加なしに骨再構成の刺激を可能にすることを主張している（非特許文献１５）。
【００２１】
同様の方法に従うと、特許文献７において、Ｂｌａｃｈａｎｔ他は、トリメチルホスフェートを用いてポリマー鎖を架橋することにより不溶化されたベンジルアミン及びスルフェートにより修飾されたデキストランを記載している。水性媒質中のこのスポンジは、このタンパク質に保持され得るためにＢＭＰリザーバとして作用する。架橋前に、両親媒性ポリマーは、ゲル電気泳動による相互作用試験に示されるように、ＢＭＰ−２と複合体を形成する。しかしながら、用いられるポリマー／ＢＭＰ質量比は非常に高く、５，０００を超える。溶液中での複合体の解離を導くかなり弱いポリマー／タンパク質相互作用のため、この高い比率が用いられる。また、ＢＭＰの化学的又は物理的安定化が記載されていない。この型の比率は、医薬品の開発において許容され得ない。
【００２２】
ベンジルアミンは特に毒性を有するおそれがあり、上記２つの特許文献で記載されているポリマーの生体適合性を損なうおそれがあることは知られている。
【００２３】
骨再構成のためのこの型のタンパク質の生薬製剤は、賦形剤の安全要件を必然的に満たさなければならず、そしてこの要件を満たすために、生体適合性のある化合物を用いることだけでなく、有効成分に関しその量を制限することもまた必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第２００４１３２６５３号明細書
【特許文献２】米国特許第２００５０２０９１４５号明細書
【特許文献３】米国特許第６２５８３８２号明細書
【特許文献４】米国特許第２００５／０２８７１３５号明細書
【特許文献５】欧州特許第１４５４６４０号明細書
【特許文献６】ニュージーランド国特許第５３０７０１号明細書
【特許文献７】フランス国特許第２７９４６４９号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｕｒｉｓｔ ＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６５；１５０，８９３
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ Ｃ．２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８７，１０３
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ ＭＰ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３；２３１，４４５
【非特許文献４】Ｉｓｒａｅｌ ＤＩ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６，１３（３−４），２９１
【非特許文献５】Ｍｕｎｄｙ他 Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ２００４，２２（４），２３３
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ Ｈ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，８５Ａ １５４４−１５５２
【非特許文献７】Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ，２００４ Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２００４；２２（２），３７６
【非特許文献８】Ｆｒｉｅｓｓ，Ｗ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｓｈａｋｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｔｈｅｓｉｓ Ａａｃｈｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ １９９９
【非特許文献９】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＤＨ，Ｔｈｅｓｉｓ Ｍｕｎｃｈｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ ２００５
【非特許文献１０】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９７，６，Ｓｕｐｐｌ ２９９
【非特許文献１１】Ｒｕｐｐｅｔ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，２９５
【非特許文献１２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００５，８９，３，２５３
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１９，３３２
【非特許文献１４】１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，第４４巻,第６３頁ないし第７２頁
【非特許文献１５】１９９９，Ｂｏｎｅ，１７，６，４９９−５０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
従って、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されるＢＭＰのような骨形成タンパク質の溶解化及び安定化を可能とする注射製剤を開発するという問題は、満足できる手法では解決されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、７００よりも低いポリマー／ＢＭＰ質量比にて生体適合性である骨形成タンパク質と両親媒性ポリマーとの安定な水溶性複合体の形成を可能にする。この複合体は、
・生体外及び生体内における生理的ｐＨでのその疎水性により生じるＢＭＰの凝集を防止すること、
・３７℃にて細胞の存在下でＢＭＰを安定化させること、
を可能にする。
【００２８】
前記水溶性複合体は、有機溶媒を使用する必要なしに完全に水性媒質中で形成される。
【００２９】
従って本発明は、物理的及び化学的に安定且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体であって、
前記両親媒性ポリマーは、下記の一般式：
【化１】
［式中、
Ｒ、Ｒ１は、同一又は異なっていてもよく、結合部又は１ないし１８個の炭素原子を含有する連鎖を表し、前記連鎖は、場合によっては、枝分れし及び／又は不飽和であっても、且つ、１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又は／及びＳを含有していてもよく、
Ｆ、Ｆ’は、同一又は異なっていてもよく、エステル、チオエステル、アミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、エーテル、チオエーテル又はアミンを表し、
Ｘは、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｙは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｈｙは、下記の群：
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし３０のアルキル基、
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアルキルアリール基、或いは直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアリールアルキル基、及び
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい炭素原子数８ないし３０の多環式基
からなる群より選択される疎水基を表すが、但し、Ｈｙはベンジルアミンを表すものではなく、
ｎ及びｏは１ないし３の数であり、
ｈは、モノマー単位に関する疎水性パターンのモル分率を表すものであって、０．０１ないし０．５であり、
ｘは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし２．０であり、
ｙは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし０．５である。］
で表される疎水性置換基と親水基により官能化された親水性多糖類骨格により形成されており、
前記ＢＭＰは、治療上有効なＢＭＰ（骨形成タンパク質）の群より選択され、
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は７００以下であることを特徴とする、複合体に関する。
【００３０】
１つの態様において、本発明に従う複合体にあっては、前記多糖類が、上記定義されたように、式中、ｙ＝０である一般式Ｉで表される多糖類より選択される。
【００３１】
１つの態様において、本発明に従う複合体にあっては、前記多糖類が、上記定義されたように、式中、Ｘがカルボキシレートを表す一般式Ｉで表される多糖類より選択される。
【００３２】
１つの態様において、本発明に従う複合体にあっては、本発明に従う多糖類が、基Ｒが以下の群：
【化２】
より選択されることを特徴とする。
【００３３】
１つの態様において、本発明は、前記ポリマー／ＢＭＰ質量比が６００以下であることを特徴とする複合体に関する。
【００３４】
１つの態様において、本発明は、前記ポリマー／ＢＭＰ質量比が５００以下であることを特徴とする複合体に関する。
【００３５】
治療上の使用のためのＢＭＰ濃度は、溶液中におよそ１．５ｍｇ／ｍＬである。比率が７００を超えると、１．０ｇ／ｍＬの両親媒性ポリマーを含有する組成物が得られる。前記ポリマー濃度に基づくと、製剤は、例えば粘度に関して、治療用途としてもはや適していない物理化学的な挙動を有する。
【００３６】
本発明は、ＢＭＰが、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されることを特徴とする複合体に関する。
【００３７】
両親媒性ポリマーの置換基は、制御されたか又は統計的な手法で分布されている。ブロックコポリマー及び交互コポリマーが、制御された置換基の分布を有するポリマー例である。
ランダムコポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
｜ ｜ ｜
疎水基 疎水基 疎水基
ブロックコポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
｜ ｜ ｜
疎水基 疎水基 疎水基
交互コポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
｜ ｜ ｜
疎水基 疎水基 疎水基
【００３８】
従って、１つの態様において、本発明はまた、前記ポリマーが、置換基が任意の手法で分布したポリマーより選択されることを特徴とする両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体に関する。
【００３９】
１つの態様において、前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸、キトサン、ガラクツロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン及びセルロースからなる群より選択される。
【００４０】
前記セルロースの群は、酸により官能化されたセルロース、例えばカルボキシメチルセルロースからなる。
【００４１】
前記デキストランの群は、酸により官能化されたデキストラン、例えばカルボキシメチルデキストランからなる。
【００４２】
１つの態様において、前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸及びキトサンからなる群より選択される。
【００４３】
これら種々の多糖類は、以下：
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
として表され得る。
【００４４】
前記多糖類は、１０ないし１００００の平均重合度ｍを有し得る。
【００４５】
１つの態様において、多糖類は、１０ないし１０００の平均重合度ｍを有する。
【００４６】
１つの態様において、多糖類は、１０ないし５００の平均重合度ｍを有する。
【００４７】
１つの態様において、本発明はまた、前記疎水基Ｈｙが、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選択される疎水性の天然アミノ酸、或いはそれらのアルコール誘導体、脱カルボン酸誘導体、エステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体に関する。
【００４８】
１つの態様において、本発明はまた、前記疎水基Ｈｙが、トリプトファン或いはトリプトファンのエステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体に関する。
【００４９】
トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミンがトリプトファン誘導体の例である。
【００５０】
１つの態様において、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体は可逆的である。
【００５１】
使用されるポリマーは、当業者に既知の方法に従い合成されるか、或いはシグマ−アルドリッヒ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＮＯＦ社（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）又はカルボメル社（ＣａｒｂｏＭｅｒ Ｉｎｃ．）のような供給者から入手される。
【００５２】
ＢＭＰは、当業者に既知の方法に従い得られるヒト組み替え体ＢＭＰより選択されるか、或いはリサーチダイアグノスチック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．）（ＵＳＡ）のような供給者から入手される。
【００５３】
ＢＭＰは高い疎水性の成長因子である。生理的ｐＨにて、該タンパク質の疎水性は凝集そしてその後の沈澱をもたらす。本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体は、生理的ｐＨの溶液中での前記タンパク質の物理的安定化を可能にする。
【００５４】
物理的又は化学的分解とは、タンパク質の生物学的活性を低下させる、凝集のような物理的事象を意味するか、或いはタンパク質分解のような化学的事象を意味する。
【００５５】
同時に、タンパク質の物理的又は化学的安定化とは、タンパク質の生物学的活性を維持する作用を意味する。
【００５６】
複合体の安定性は、ＢＭＰの安定性を測定することにより観察される。
【００５７】
両親媒性ポリマーを用いたタンパク質の安定化は従って、特に以下の試験：
・ゲル電気泳動を用いた両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を明らかにするための試験
・３７℃及び中性ｐＨにて行われる両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体中の細胞の存在下でのＢＭＰの熱安定性の試験
・生理的ｐＨでの前記複合体中のＢＭＰの物理的安定性についての試験
を行うことにより証明され得る。
【００５８】
電気泳動を用いた両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を明らかにするための試験は、電界を用いてイオンを置換することに基づいている。アニオン複合体はアノードに向かって泳動し、そしてカチオン複合体はカソードに向かって泳動する。泳動後、タンパク質は、毛管現象によってＰＶＤＦメンブランに転移され、そしてペルオキシダーゼと結合した第二抗体により認知される前記タンパク質の特定の抗体により明らかとされる。単独では泳動しないタンパク質；即ち両親媒性ポリマーと結合されたタンパク質は、複合体の全電荷に応じてアノード又はカソードに向かって泳動する。
【００５９】
細胞の存在下でのＢＭＰの熱安定性の試験は、３７℃にて且つ中性ｐＨにて行われ、そしてＣ２Ｃ１２筋芽細胞を含有する培地中にＢＭＰ溶液を沈積させることを包含する。溶液中のＢＭＰ濃度は、沈積が行われた後（２日目）及び５日間の培養の後（７日目）のＥＬＩＳＡ法により決定される。ＢＭＰの生物学的活性は、骨芽細胞への筋芽細胞の分化中の２日目ないし７日目に生成されたアルカリホスファターゼの活性をアッセイすることにより評価される。
【００６０】
生理的ｐＨでのＢＭＰの物理的安定性についての試験は、一般的に酸性ｐＨにあるタンパク質のもとの緩衝液を、７．４のｐＨを有するＰＢＳ溶液に交換することによって、タンパク質溶液を生理的ｐＨにすることに基づいている。交換の最後においてＢＭＰを一定濃度に維持する一方で、３回の交換が行われる。該プロセスの最後における溶液中のＢＭＰ濃度は、遠心分離後のＥＬＩＳＡ法により決定される。この試験は、濃縮されたＢＭＰ−２溶液を、ｐＨ７．４に固定された緩衝液を用いて希釈することによっても行われ得る。
【００６１】
本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体は、タンパク質を変性させるおそれのあるいかなる有機溶媒も存在させずに、ＢＭＰ及び両親媒性ポリマーを生理的ｐＨの水性溶液中に入れることにより形成される。両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の形成は自発であり、ＢＭＰと両親媒性ポリマーとの間に共有結合は含有されていない。この会合は、実質的に疎水性且つイオン相互作用である弱小な結合により形成される。複合体の形成は有機溶媒を必要としない。
【００６２】
本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の形成の証拠を高めるために、所望によりその他の試験が行われ得る。
・円偏光二色性により決定されるＢＭＰの三次元構造を維持するための試験。
・ストレス下、生理的ｐＨでの本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体中のＢＭＰの安定性の試験。ストレスは、塩等の存在下での特定の攪拌法であり得る。
・サーモリシンのようなタンパク質分解酵素に対する耐性の試験。
【００６３】
本発明により解決される問題の１つは、タンパク質の改良された安定性であり、それ故生体外及び生体内での維持された生物学的活性である。前記生物学的活性は、骨芽細胞への筋芽細胞の分化についてのＢＭＰの性能を示す分化試験により評価され得る。前記分化は、
・細胞培地中で生成されたアルカリホスファターゼの活性のアッセイ、
・アルカリホスファターゼを生成する細胞の染色、
・細胞培地中に生成されたオステオカルシンのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
を用いて測定され得る。
【００６４】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を含有することを特徴とする、治療用組成物にも関する。
【００６５】
治療用組成物とは、ヒト用又は動物用薬物に用いられ得る組成物を意味する。
【００６６】
本発明に従う治療用組成物は、好ましくは局所的に適用され、且つ溶質、ゲル、クリーム、凍結乾燥物、粉体又はペーストの形態で存在し得る組成物である。
【００６７】
本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体とともに配合され得る賦形剤の性質は、当業者の一般知識に従い、その投与形態に応じて選択される。
【００６８】
従って、本発明に従う組成物がペーストの形態にある場合、前記ペーストは、例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸三カルシウム及びコラーゲンのような製品から得られる。
【００６９】
製剤のパラメータを調節するために、ｐＨを調節するための緩衝液、等張性の調節を可能にする薬剤、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、ｍ−クレゾール又はフェノールのような防腐剤、或いはまたＬ−塩酸リジンのような抗酸化剤として、他の賦形剤が本発明において用いられ得る。
【００７０】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ１．５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ投与を可能とすることを特徴とする。
【００７１】
本発明はまた、生体内で骨形成を誘発する治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の使用にも関する。
【００７２】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を含有する治療用組成物を治療部位に適用することからなることを特徴とする、ヒト又は動物用の治療方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
両親媒性ポリマーの合成
実施例１：トリプトファンエチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ−１）
この両親媒性ポリマーを、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０、及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。クロロギ酸エチル及びＮ−メチルモルホリンを用いた有機溶媒中での慣用のカップリング法に従い、トリプトファンエチルエステルをポリマーの酸にグラフトした。反応媒体を水中に希釈し、そして１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを７に調節した後、ポリマーを限外濾過により精製した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｒｐＯＥｔ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５
を特徴としていた。
【００７４】
実施例２：トリプトファンにより修飾されたカルボキシメチルデキストランナトリウム塩（ＡＰ２）
ＡＰ−１の塩基性加水分解により両親媒性ポリマーを得た。両親媒性ポリマー１の水溶液（３１ｍｇ／ｍＬで６４ｍＬ）に水酸化ナトリウム１Ｎ（３．７９ｍＬ）を添加して、ｐＨ１２．７とした。得られた溶液を周囲温度にて一晩攪拌した。水（ＮａＣｌ ０．９％及びＨ２Ｏ）に対する透析により、ポリマーを精製した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｒｐＯＮａ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート、トリプトファンカルボキシレート）置換度が１
を特徴としていた。
【００７５】
実施例３：フェニルアラニンエチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ３）
この両親媒性ポリマーを、実施例１に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＰｈｅＯＥｔ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００７６】
実施例４：チロシンメチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ４）
この両親媒性ポリマーを、実施例１に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｙｒＯＭｅ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００７７】
実施例５：トリプトファンエチルエステルにより修飾されたデキストランコハク酸（ＡＰ５）
この両親媒性ポリマーを、文献（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｈａｖｅｓ，Ｍａｎｕｅｌ他，ｐｏｌｙｍｅｒ １９９８，３９（１３），２７５１−２７５７）に従い得られた、糖単位当りのコハク酸置換度が１．０及び７０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するデキストランコハク酸から合成した。クロロギ酸エチル及びＮ−メチルモルホリンを用いた有機溶媒中での慣用のカップリング法に従い、トリプトファンエチルエステルをポリマーの酸にグラフトした。反応媒体を水中に希釈し、そして１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを７に調節した後、ポリマーを限外濾過により精製した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのＴｒｐＯＥｔ置換度が０．４５、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（コハク酸カルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００７８】
比較例１：ドデシルアミンにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ６）
この両親媒性ポリマーを、実施例１に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が１．０及び６０ｋｇ／モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤにおけるＲＭＮ１Ｈにより決定された、糖単位当りのドデシルアミン置換度が０．１０、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．９０
を特徴としていた。
【００７９】
比較例２：ベンジルアミンにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＡＰ７）
この両親媒性ポリマーは、特許文献７に記載されており、
・糖単位当りのベンジルアミン置換度が０．４５、
・糖単位当りのカルボキシレート（メチルカルボキシレート）置換度が０．５５、
を特徴としていた。
【００８０】
電気泳動による両親媒性ポリマーに対するＢＭＰ−２の親和性
ＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー複合体の製造
Ｈ２Ｏ／ＡｃＮ／ＴＦＡ（６４．９／３５／０．１％）緩衝液中の０．２８ｍｇ／ｍＬＢＭＰ−２溶液の５μＬを、ｐＨ７．４によって緩衝化された１００ｍｇ／ｍＬのＡＰ溶液の７μＬに添加した。この溶液を０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて１４μＬとした。この溶液は、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２濃度、及び１：５００のＢＭＰ−２／ＡＰ比を有していた。この溶液を、周囲温度にて３０分間素早く攪拌した。
【００８１】
ＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー複合体の証明
ＢＭＰ−２／ＡＰ溶液を泳動用緩衝液（ｐＨ７を有するトリスアセテート溶液）で２０倍に希釈した。希釈溶液の２μＬをその後、水８μＬ及びローディング用緩衝液７μＬ（水中のグリセロール、トリスアセテート及びブロモフェノールブルー）に添加した。このＢＭＰ−２を１０ｎｇ及びＡＰを５μＬ含有する１７μＬを、０．８％アガロースゲルのウェルに沈積した。電気泳動チャンバを閉じ、そしてジェネレータを３０Ｖに設定した。泳動を１時間継続した。
【００８２】
泳動後、ゲルを、電界の下でアノードに置いたＰＶＤＦメンブランに転移させた（２０分間，１５Ｖ，バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）からのトランス−ブロットＳＤ（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ））。メンブランを、周囲温度にて１時間、脱脂粉乳を用いて飽和させ、そしてその後、ＢＭＰ−２の第一抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最後に、第二抗体であるウサギ抗ヤギＨＲＰとともにインキュベートした（周囲温度にて１時間）。Ｏｐｔｉ−４ＣＮに対してＨＲＰを反応させることにより、現像を行った。反応生成物が可視光を吸収するので、染色が十分となったときに現像を停止させた。
【００８３】
ＢＭＰ−２がＡＰと複合体を形成すると、該複合体は沈積位置から０．７ｃｍの単一スポットの形態で検出される（アノードへの泳動）。ＢＭＰ−２が単独であるか又はＡＰと複合体を形成していない場合には、泳動されていないため、沈積位置にてそれが検出される。
【００８４】
５種のポリマーについての結果を下記表に示す。
【表１】
【００８５】
生理的ｐＨにおける両親媒性ポリマーの存在下でのＢＭＰ−２の安定性
ＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー複合体の製造
Ｈ２Ｏ／ＡｃＮ／ＴＦＡ（６４．９／３５／０．１％）緩衝液中の０．２８ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２溶液から出発して、種々の溶液を製造した。
１．水中に希釈することにより得られた０．０８４ｍｇ／ｍＬＢＭＰ−２溶液
２．１４ｍｇ／ｍＬのＡＰ溶液を用いてＢＭＰ−２を希釈することにより得られた、０．０８４／９．８ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２／両親媒性ポリマー溶液。
各々の溶液をその後、ｐＨ７．４及び３００ｍＯｓｍを有するＰＢＳ１０ｍＭ溶液を用いて１：１０に希釈し、そしてその後、マイクロコン細胞遠心分離（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ｃｅｌｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて再濃縮した（ＹＭ１０，１０ｋＤ，５００μＬ）。この操作を２回繰り返した。３回の洗浄後、各々の溶液を遠心分離し、そして上澄み中のＢＭＰ−２の濃度を、ＥＬＩＳＡ法により決定した。
【００８６】
対照とするために、０．０８４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２溶液の一部について、いかなる洗浄もしなかった。０．０８４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−２溶液の別の一部を、１ｍＭのＨＣｌ溶液（ｐＨ３）を用いて３回洗浄した。この緩衝液は、ＢＭＰ−２を安定化させるのに既知であるが、医薬用途には適合しない。
【００８７】
いかなる洗浄も受けなかったＢＭＰ−２溶液のＥＬＩＳＡアッセイは、８３．４μＬのＢＭＰ−２濃度を与えた。この数値は１００％ＢＭＰ−２に相当する。ＰＢＳを用いた３回の洗浄の最後におけるその他の溶液のＥＬＩＳＡにより決定された濃度が、未洗浄のＢＭＰ−２の上記数値に加えられた。得られたＢＭＰ−２のパーセンテージを下記の表に示す。
【表２】
【００８８】
ＢＭＰ−２と複合体を形成し得るＡＰは、生理的ｐＨにおいてＢＭＰ−２を安定にさせた。ＡＰが存在しない場合においては、ＢＭＰ−２は、生理的ｐＨの溶液中にもはや存在しなかった。同様に、ＢＭＰ−２と複合体を形成しなかったＡＰの存在下においても、タンパク質は溶液中にもはや存在しなかった。
【００８９】
３７℃の且つ生理的ｐＨの培地中での両親媒性ポリマーの存在下でのＢＭＰ−２の安定性及び生物学的活性
０日目に、Ｃ２Ｃ１２細胞（マウスの筋肉細胞）を、１０％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭを含有する９６ウェルの培養プレートに播種し（ウェル当り７０００細胞）、そしてその後、オーブン中に２４時間置いた。１日目に、細胞の付着後に、培地を、２％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭで２４時間置き換えた。２日目に、培地を、ＢＭＰ−２のみの溶液（０．３μｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−２／ＡＰ１複合体の溶液（０．３／１５０μｇ／ｍＬ，１：５００の比）を補った２％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭで置き換えた。複合体を、２％ＦＶＳ及び１％ＴＢＡを含有するＤＭＥＭ中にＢＭＰ−２及びＡＰを別々に希釈することにより製造した。沈積させる前に、タンパク質／ＡＰ１混合物を１時間静置させた。７日目に、即ち沈積して５日後に、残存するＢＭＰ−２をＥＬＩＳＡによりアッセイするために上澄みを採取した。
【表３】
細胞を接触させて５日後に、単独であったＢＭＰ−２の５％未満が残存したが、ＡＰ１とともに混合された場合には、４０％を超えるＢＭＰ−２が残存した。
【００９０】
同様の実験の７日目に、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、その後５０μＬの溶解緩衝液を用いて溶解させ、そして、凍結（−８０℃）／解凍（３７℃）のサイクルを３回行った。アルカリホスファターゼの酵素活性を、４０５ｎｍにて吸収する基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェートに対する溶解質において測定した。この活性は、マイクロＢＣＡにより測定されたタンパク質の量まで低下し、そしてそれ故タンパク質のｎｍｏｌ ｐｎＰ／分．μｇで表した。
【表４】
ＢＭＰ−２は、複合体によって、生存条件下で５日間よりも長く安定化されたが、それ自体単独では、そのような期間安定ではなかった。
ＢＭＰ−２活性は、細胞分化のゆっくりとした進行によって明らかであり、ＢＭＰ−２複合体は、ＢＭＰ−２単独よりも生体外においてより高い活性であった。
【００９１】
酵素分解に対するＢＭＰ−２ポリマーを用いた保護
ＢＭＰ−２／ポリマー複合体の製造
ＴＦＡアセトニトリル緩衝液中の０．３１５ｍｇ／ｍＬ ＢＭＰ−２溶液の１９μＬを、６６ｍｇ／ｍＬポリマー（ＰＡ２）溶液の４．６μＬに、７．５のｐＨを有するトリス５０ｍＭの５０μＬに、２５μｇ／ｍＬサーモリシンの６０μＬに、そしてＨ２Ｏ３６６．４μＬに添加した。いずれのポリマーも含有しない同様の溶液を対照として製造した。これら２種の溶液において、サーモリシンはタンパク質の２５％である（質量／質量）。
【００９２】
消化動態：
サーモリシンを含有するＢＭＰ−２単独の溶液及び複合体の溶液を６０℃にて６時間インキュベートした。Ｔ＝０．２０分、１時間、２時間及び６時間にて２０μＬの試料を採取した。各々の試料を採取したとき、酵素反応を阻害するために２５０ｍＭ ＥＤＴＡの５μＬを直ちに添加し、即ち、５０ｍＭの最終濃度であった。その後、試料を−２０℃にて凍結させた。
【００９３】
現像：
１５％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルから形成したウエスタンブロットを使用して、現像を行った。各々の試料の７μＬ（ＢＭＰ−２の６５ｎｇを含有する）を、ＳＤＳを含有するＬａｅｍｍｌｉローディング用緩衝液の７μＬと混合した。その後、試料を９５℃にて１０分間変性し、その後、１５％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに沈積した。対照として、等量のＢＭＰ−２（６５ｎｇ）及びサーモリシン（１６．２５ｎｇ）をもゲルに沈積した。電気泳動チャンバを閉じ、そしてジェネレータを１２５Ｖに設定した。泳動を１時間１５分間継続した。
【００９４】
泳動後、バイオラッド転移系を用いて、１００ボルトにて１時間、ゲルをＰＶＤＦメンブランに転移させた。メンブランをその後、周囲温度にて１時間、脱脂粉乳を用いて飽和させ、そしてその後、ＢＭＰ−２の第一抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最終的に、ＨＲＰと結合する第二抗体とともにインキュベートした（周囲温度にて１時間）。Ｏｐｔｉ−４ＣＮにおいてＨＲＰを反応させることにより現像を行った。反応生成物が可視光を吸収するので、染色が十分となったときに現像を停止させた。
【００９５】
ＢＭＰ−２が単独であると、２０分後により低分子量のバンドの出現が観察され、このことは、サーモリシンによるタンパク質の分解であると解釈される。ポリマーの存在下においては、このバンドは存在せず、このことは、ポリマーが分解に対してタンパク質を保護していることを示している。
ポリマーがサーモリシンの作用を阻害していないことをチェックした後には、得られた結果が、ポリマーＰＡ２が酵素分解に対してＢＭＰ−２を有効に保護していることを示すものと結論され得る。
【００９６】
生理的ｐＨの水中において複合体の形態にあるＢＭＰ−２の可溶化
生理的ｐＨでのＢＭＰ−２の溶解度
ＢＭＰ−２は８．５の等電点を有しており、このことは生理的ｐＨにおいて、ＢＭＰ−２がその低い溶解度と関連していることを意味している。このことは、ＢＭＰ−２を用いた酸溶液を中和するための実験によって示され得る。
【００９７】
生理的ｐＨでのＢＭＰ−２／ＰＡ２複合体の溶解度
清澄な１．５ｍｇ／ｍＬ ＢＭＰ−２溶液を、酸性緩衝液（インフーズ緩衝液，ｐＨ４．５）中で製造した。７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＡ２を得るために、凍結乾燥したＰＡ２を前記溶液に添加した。このＢＭＰ−２／ＰＡ２複合溶液をその後、ホスフェート緩衝液を添加することによって中和して、７．４のｐＨを得た（１．２ｍｇ／ｍＬの最終ＢＭＰ−２濃度及び６０ｍｇ／ｍＬの最終ＰＡ２濃度）。ｐＨ７．４にてＢＭＰ−２は完全に溶解し、凝集体は見られなかった。ＢＭＰ−２／ＰＡ２複合体の形態における、生理的ｐＨでのＢＭＰ−２の溶解度は、それ故大きく高められた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体であって、前記両親媒性ポリマーは、下記の一般式：
【化１】
［式中、
Ｒ、Ｒ１は、同一又は異なっていてもよく、結合部又は１ないし１８個の炭素原子を含有する連鎖を表し、前記連鎖は、場合によっては、枝分れし及び／又は不飽和であっても、且つ、１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又は／及びＳを含有していてもよく、
Ｆ、Ｆ’は、同一又は異なっていてもよく、エステル、チオエステル、アミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、エーテル、チオエーテル又はアミンを表し、
Ｘは、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｙは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｈｙは、下記の群：
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし３０のアルキル基、
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアルキルアリール基、或いは直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアリールアルキル基、及び
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい炭素原子数８ないし３０の多環式基
からなる群より選択される疎水基を表すが、但し、Ｈｙはベンジルアミンを表すものではなく、
ｎ及びｏは１ないし３の数であり、
ｈは、モノマー単位に関する疎水性パターンのモル分率を表すものであって、０．０１ないし０．５であり、
ｘは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし２．０であり、
ｙは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし０．５である。］
で表される疎水性置換基と親水基により官能化された親水性多糖類骨格により形成されており、
前記ＢＭＰは、治療上有効なＢＭＰ（骨形成タンパク質）の群より選択され、
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は７００以下であることを特徴とする、複合体。
【請求項２】
前記多糖類は、式中、ｙ＝０である一般式Ｉで表される多糖類より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記多糖類は、式中、Ｘがカルボキシレートを表す一般式Ｉで表される多糖類より選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は、６００以下であることを特徴とする、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は、５００以下であることを特徴とする、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記ＢＭＰは、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記ポリマーは、置換基が任意の手法で分布したポリマーより選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記多糖類は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎｅｓ）、アルギン酸、キトサン、ガラクツロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン及びセルロースからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記セルロースの群は、酸により官能化されたセルロース、例えばカルボキシメチルセルロースからなることを特徴とする、請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記デキストランの群は、酸により官能化されたデキストラン、例えばカルボキシメチルデキストランからなることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸及びキトサンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記疎水基Ｈｙは、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選択される疎水性の天然アミノ酸、或いはそれらのアルコール誘導体、脱カルボン酸誘導体、エステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記疎水基Ｈｙは、トリプトファン或いはトリプトファンのエステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、請求項１ないし１２のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
前記両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の形成は、可逆的であることを特徴とする、請求項１ないし１３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＢＭＰは、生理的ｐＨにて安定であることを特徴とする、請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ＢＭＰは、３７℃及び中性ｐＨにて生物学的活性を示すことを特徴とする、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ポリマー／ＢＭＰ複合体は、水性溶媒中にて且つタンパク質を変性し得る有機溶媒なしに製造されることを特徴とする、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を含有することを特徴とする、治療用組成物。
【請求項１９】
およそ１．５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ投与を可能とすることを特徴とする、請求項１８に記載の治療用組成物。
【請求項２０】
生体内で骨形成を誘発する治療用組成物の製造のための、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の使用。
【請求項１】
物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体であって、前記両親媒性ポリマーは、下記の一般式：
【化１】
［式中、
Ｒ、Ｒ１は、同一又は異なっていてもよく、結合部又は１ないし１８個の炭素原子を含有する連鎖を表し、前記連鎖は、場合によっては、枝分れし及び／又は不飽和であっても、且つ、１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又は／及びＳを含有していてもよく、
Ｆ、Ｆ’は、同一又は異なっていてもよく、エステル、チオエステル、アミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、エーテル、チオエーテル又はアミンを表し、
Ｘは、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｙは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Ｈｙは、下記の群：
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし３０のアルキル基、
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアルキルアリール基、或いは直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数８ないし１８のアリールアルキル基、及び
・不飽和であってもよく、及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ又はＳを含有していてもよい炭素原子数８ないし３０の多環式基
からなる群より選択される疎水基を表すが、但し、Ｈｙはベンジルアミンを表すものではなく、
ｎ及びｏは１ないし３の数であり、
ｈは、モノマー単位に関する疎水性パターンのモル分率を表すものであって、０．０１ないし０．５であり、
ｘは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし２．０であり、
ｙは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、０ないし０．５である。］
で表される疎水性置換基と親水基により官能化された親水性多糖類骨格により形成されており、
前記ＢＭＰは、治療上有効なＢＭＰ（骨形成タンパク質）の群より選択され、
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は７００以下であることを特徴とする、複合体。
【請求項２】
前記多糖類は、式中、ｙ＝０である一般式Ｉで表される多糖類より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記多糖類は、式中、Ｘがカルボキシレートを表す一般式Ｉで表される多糖類より選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は、６００以下であることを特徴とする、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記ポリマー／ＢＭＰ質量比は、５００以下であることを特徴とする、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記ＢＭＰは、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記ポリマーは、置換基が任意の手法で分布したポリマーより選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記多糖類は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎｅｓ）、アルギン酸、キトサン、ガラクツロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン及びセルロースからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記セルロースの群は、酸により官能化されたセルロース、例えばカルボキシメチルセルロースからなることを特徴とする、請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記デキストランの群は、酸により官能化されたデキストラン、例えばカルボキシメチルデキストランからなることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸及びキトサンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記疎水基Ｈｙは、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選択される疎水性の天然アミノ酸、或いはそれらのアルコール誘導体、脱カルボン酸誘導体、エステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記疎水基Ｈｙは、トリプトファン或いはトリプトファンのエステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、請求項１ないし１２のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
前記両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の形成は、可逆的であることを特徴とする、請求項１ないし１３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＢＭＰは、生理的ｐＨにて安定であることを特徴とする、請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ＢＭＰは、３７℃及び中性ｐＨにて生物学的活性を示すことを特徴とする、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ポリマー／ＢＭＰ複合体は、水性溶媒中にて且つタンパク質を変性し得る有機溶媒なしに製造されることを特徴とする、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体を含有することを特徴とする、治療用組成物。
【請求項１９】
およそ１．５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ投与を可能とすることを特徴とする、請求項１８に記載の治療用組成物。
【請求項２０】
生体内で骨形成を誘発する治療用組成物の製造のための、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の両親媒性ポリマー−ＢＭＰ複合体の使用。
【公表番号】特表２０１０−５３４７０８（Ｐ２０１０−５３４７０８Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１８６３７（Ｐ２０１０−５１８６３７）
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９８３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１６１３１
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５０８０９００８８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９８３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１６１３１
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５０８０９００８８）
【Ｆターム（参考）】
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