中性ｐＨ長寿命プレキャスト電気泳動ゲルのためのシステム
【課題】分離が中性ｐＨで行われ、そしてタンパク質が完全に還元されたままである、ゲルおよびバッファーシステムを提供すること。
【解決手段】ゲル電気泳動のためのシステムであって、以下を包含する、システム：
２つの端部を有する電気泳動ゲル；該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、ｐＫが中性付近の一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されており；
該カソードバッファーは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されている。
【解決手段】ゲル電気泳動のためのシステムであって、以下を包含する、システム：
２つの端部を有する電気泳動ゲル；該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、ｐＫが中性付近の一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されており；
該カソードバッファーは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル電気泳動のための技術に関する。より詳細には、本発明は、ほぼ中性ｐＨでのゲル電気泳動のための新規なシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲル電気泳動は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、およびタンパク質のような生体分子を分離するための通常の手段である。ゲル電気泳動において、この分子は、かけられた電場により分子がフィルタリングゲル中を移動する割合によって、バンドに分離される。
【０００３】
この技術を用いる基本的な装置は、ガラスチューブに封入された、あるいはガラスまたはプラスチックプレート間にスラブとして挟まれたゲルからなる。このゲルは、オープンモレキュラーネットワーク構造を有し、電気伝導性の緩衝化された塩の溶液で飽和されている細孔を規定している。ゲル中のこれらの細孔は、移動するマクロ分子が通過し得るのに十分に大きい。
【０００４】
ゲルは、チャンバー中にバッファー溶液と接触するように置かれ、ゲルと電力供給源のカソードまたはアノードとの間を電気的に接触させる。マクロ分子および追跡用色素を含有するサンプルが、ゲルの一番上に置かれる。電位をゲルにかけると、サンプルのマクロ分子および追跡用色素は、ゲルの底に向かって移動する。電気泳動は、追跡用色素がゲルの末端に到達する直前に停止される。次いで、分離されたマクロ分子のバンドの位置が測定される。移動度が既知の追跡用色素およびマクロ分子と比べて、特定のバンドが移動した距離を比較することによって、他のマクロ分子の移動度が測定され得る。次いで、マクロ分子のサイズが計算され得る。
【０００５】
ゲル中のマクロ分子の移動速度は、３つの主要なファクターに依存している：ゲルの多孔度；マクロ分子のサイズおよび形；そしてマクロ分子の電荷密度である。これらの３つのファクターが精密に制御され、ゲルごとならびにサンプルごとに再現性があるということが、効果的な電気泳動システムにとって重要である。しかし、ゲル間の均一性を維持することは困難である。なぜなら、これらのファクターのそれぞれは、ゲルシステムの化学における多くの変数に対して敏感であるからである。
【０００６】
ポリアクリルアミドゲルが、通常、電気泳動に使用される。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、言い換えればＰＡＧＥが一般的である。なぜなら、このゲルは、光学的に透明で、電気的に中性であり、そして孔径の範囲に応じて作製され得るからである。ポリアクリルアミドゲルの多孔度は、ゲルに含まれるアクリルアミドモノマーと架橋剤モノマーとの全パーセント（「％Ｔ」）によって、ある程度規定される。濃度が高ければ高いほど、ポリアクリルアミドマトリックスの鎖の間にある空間は小さくなり、従ってゲル中の細孔は小さくなる。８％ポリアクリルアミドゲルは、１２％ポリアクリルアミドゲルよりも大きな細孔を有する。従って、８％ポリアクリルアミドゲルでは、所定の形状、サイズ、および電荷密度を有するマクロ分子は、より早く移動し得る。より小さいマクロ分子を分離する場合には、一般に、より小さな孔径を有するゲル（例えば、２０％ゲル）を使用するのが好ましい。反対に、より大きなマクロ分子を分離するには、より大きな孔径を有するゲル（例えば、８％ゲル）がしばしば使用される。
【０００７】
孔径はまた、ゲルを重合するために使用される架橋剤の量に依存する。任意の所定の全モノマー濃度における、ポリアクリルアミドゲルについての最小孔径は、全モノマーの架橋剤に対する比が約２０：１である場合に得られる（この比は、通常「５％Ｃ」と表現さ
れる）。
【０００８】
いくつかのファクターにより、ゲルの孔径において望ましくない変化が起こり得る。孔径は、製造の際の不完全なゲル重合により増大され得る。重合後のポリアクリルアミドゲルの加水分解は、固定負電荷を作りだし、そしてゲル中の架橋が分解され得る。これにより、分離能が低下し、そして孔径は増大する。理想のゲルシステムは、再現性のある孔径を有し、固定電荷を有しない（または、少なくとも一定量を有する）べきであり、そして化学的な特性の変化または加水分解に起因する孔径の変化に対して抵抗力があるべきである。
【０００９】
マクロ分子のサイズは、種々のマクロ分子間で異なる；より小さく、よりコンパクトなマクロ分子であればあるほど、マクロ分子は所定のゲルの細孔中をより容易に移動することになる。一定の電荷密度ならば、マクロ分子の移動の速度は、そのサイズの対数に反比例する。
【００１０】
正確で再現性のある電気泳動のためには、好ましくは一定のタイプのマクロ分子が、ゲルの単一の型について選択されるべきである。ゲル電気泳動の際にタンパク質の形の均一性の維持が困難であることの１つは、ジスルフィド結合が１対のシステインアミノ酸の酸化により形成され得るということである。タンパク質の異なる酸化形態は、次いで、異なる形状を有することとなり、それゆえ、ゲル中の移動は、わずかに異なる移動度を有する泳動となる（通常、完全に還元されたタンパク質よりも早くなる。なぜなら、最大ストークス半径および最小移動度が、完全に折りたたまれていない形態で起こるはずだからである）。不均一混合物の形態では、明らかにバンドはブロードになる。ジスルフィド結合の形成を防ぐためには、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤が、通常、泳動のためのサンプルに加えられる。
【００１１】
移動する分子の電荷密度は、ゲル中の移動の速度に影響を及ぼす第３のファクターである。電荷密度が高ければ高いほど、より強い力が電場によってマクロ分子にかけられ、そしてサイズおよび形状の制限を条件とすると、移動速度がより早くなる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において、マクロ分子の電荷密度は、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）を系に添加することによって制御される。ＳＤＳ分子は、マクロ分子と会合し、そして均一の電荷密度を、分子固有の（ｉｎｎａｔｅ）電荷の影響を実質的になくするようにマクロ分子に与える。
【００１２】
ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、通常、塩基性ｐＨで注がれ、そして泳動される。タンパク質を分離するために使用される最も一般的なＰＡＧＥバッファーシステムは、Ｏｒｎｓｔｅｉｎ（１）によって開発されたもの、およびＬａｅｍｍｌｉ（２）によってＳＤＳとの使用のために改変されたものである。Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ
２２７，６８０−６８６。このＬａｅｍｍｌｉバッファーシステムは、分離ゲル中の、ＨＣｌでｐＨ８．８に滴定された０．３７５Ｍ Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン）からなる。スタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）は、ｐＨ ６．８に滴定された、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓからなる。アノードおよびカソード泳動バッファーは、０．０２４Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１９２Ｍ グリシン、０．１％ ＳＤＳを含む。別のバッファーシステムが、Ｓｃｈａｅｇｇｅｒおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗによって開示されている。Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９。スタッキングゲルは、ＨＣｌでｐＨ ８．４５に滴定された、０．７５Ｍ Ｔｒｉｓを含む。分離ゲルは、ＨＣｌでｐＨ８．４５に滴定された０．９Ｍ Ｔｒｉｓを含む。カソードバッファーは、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、０．１％ ＳＤＳを含む。アノードバッファーは、ＨＣｌでｐＨ ８．９に滴定された、０．２Ｍ Ｔｒｉｓを含む。これらのシステムの両方とも、Ｔｒｉｓは、「共通イオン」であり、ゲル中およびアノードおよびカソードバッファー中に存在する。
【００１３】
Ｌａｅｍｍｌｉシステムにおいて、スタッキングゲル中のトレーリング相（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｐｈａｓｅ）のｐＨは、約８．９である。分離ゲル中において、トレーリング相のｐＨは、約９．７である。このｐＨでは、中性ｐＨにおいてよりも、タンパク質の第１級アミノ基は、未重合アクリルアミドと容易に反応し、チオール基はより酸化を受けて、ジスルフィドとなりやすく、あるいは未重合のポリアクリルアミドとの反応をより多く受け、そしてアクリルアミド自身は加水分解を受ける。
【００１４】
均一性および予測性の必要性は、プレキャスト電気泳動ゲル（外部の業者によって製造され、次いで電気泳動が行われる研究室に輸送される）においては大きくなる。プレキャストゲルは、上述した特性をコントロールしなければならず、そしてこれらは、輸送および貯蔵を通じてこのコントロールが保持され得なければならない。多くのプレキャストゲルの寿命は、ゲルバッファーの高ｐＨで保存される間のアクリルアミドの加水分解についての可能性によって制限される。
【００１５】
ポリアクリルアミドゲルが加水分解により分解を受け、そして寿命が制限されるということが、高ｐＨゲルの欠点である。
【００１６】
タンパク質が、未重合アクリルアミドと容易に反応し、そのことによりペプチド配列決定のようなタンパク質の次の分析の妨げとなり得ることも、高ｐＨゲルのさらなる欠点である。
【００１７】
チオール基が、ジスルフィドまで酸化を受け、そのことにより分離したマクロ分子の分離能を低下させることも、高ｐＨゲルのさらなる欠点である。
【非特許文献１】Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８６
【非特許文献２】Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、未重合アクリルアミドとのタンパク質の反応を減らし、それにより収率および分離能を高める、中性ゲルシステムを作製することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、遊離チオール基からのジスルフィドの形成を防ぎ、それにより収率および分離能を高める、中性ゲルシステムを作製することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、加水分解によるポリアクリルアミドゲルの分解を減少し、それによりプレキャストゲルの有用である寿命を増加させる、中性ゲルシステムを作製することである。
【００２１】
本発明に従って、出願人は、分離が中性ｐＨで行われ、そしてタンパク質が完全に還元されたままである、ゲルおよびバッファーシステムを記載する。本発明の上記および他の目的ならびに利点は、以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ゲル電気泳動のためのシステムを提供する。このシステムは、以下を包含する：
２つの端部を有する電気泳動ゲル；該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、ｐＫが中性付近の一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されており；
該カソードバッファーは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されている。
【００２３】
１つの実施形態において、上記一価有機アミンは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓである。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記ゲルは、ポリアクリルアミドゲルである。
【００２５】
より好ましい実施形態において、上記カソードバッファー溶液は、亜硫酸塩を含む。
【００２６】
より好ましい実施形態において、上記カソードバッファー溶液は、負に荷電したチオールを含む。
【００２７】
より好ましい実施形態において、上前記カソードバッファー溶液は、ＴＧＡを含む。
【００２８】
より好ましい実施形態において、上前記アノードバッファーは、ＴＲＩＳを含む。
【００２９】
別の局面において、本発明は、ゲル電気泳動のためのシステムを提供する。このシステムは、以下を包含する：
２つの端部を有するプレキャストポリアクリルアミド電気泳動ゲル；
該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されたＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含み；
該カソードバッファーは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されている。
【００３０】
１つの実施形態において、上記アノードバッファーは、ＴＲＩＳを含む。
【００３１】
別の実施形態において、上記カソードバッファーは、亜硫酸塩を含む。
【００３２】
別の実施形態において、上記カソードバッファーは、負に荷電したチオールを含む。
【００３３】
別の実施形態において、上記カソードバッファーは、ＴＧＡを含む。
【００３４】
別の局面において、本発明は、ゲル電気泳動のためのシステムを提供する。このシステムは、以下を包含する：
２つの端部を有するプレキャストポリアクリルアミド電気泳動ゲル；
ここで、該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、そして 該カソードバッファーは、亜硫酸塩を含む。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
出願人は、分離が中性ｐＨで行われそしてタンパク質が完全に還元されたままである、ゲルおよびバッファーシステムを記載する。好都合なことに、この中性ｐＨでは、タンパク質の第１級アミノ基は、未重合アクリルアミドと容易に反応することがより少ない。なぜなら、タンパク質のアミノ基のプロトン化は、アクリルアミドまたは他の関連したブロッキング剤に対する、これらの反応性を非常に減少させるためである。さらに、この中性ｐＨにおいて、チオール基は、より高いｐＨにおいてよりも酸化を受けにくく、そしてポリアクリルアミド自身も、より加水分解を受けにくい。
【００３６】
その結果、ゲルマトリックスおよびストック溶液の改良された安定性を有するゲルシステムとなる。このシステムに従って調製されるゲルは、冷却下で１年を越える期間、アクリルアミドの加水分解に起因する性能の損失なしに、貯蔵され得る。また、還元剤を有していないストックバッファー、および重合開始剤を有していないストックゲル溶液は、少なくとも数週間、室温で、性能の損失なく貯蔵され得る。さらなる利益は、単一のゲルの手法（スタッキングおよび分離ゲルのために同じバッファーを使用する）が、２つの異なるランニングバッファーを用いて使用され、２つの分離システムが提供され得ることである。この特徴を用いると、例えば、８％ゲルで、２〜２００ｋＤａの範囲のタンパク質の分離をカバーし得る。
【００３７】
本発明の１つの実施態様において、約３％と約２５％（％Ｔ）との間のアクリルアミドのポリアクリルアミドゲルは、ゲルバッファーを用いて、約１％〜約６％の架橋剤（％Ｃ）を用いて重合される。このゲルバッファーは、中性近くのｐＫを有する第１級有機アミンまたは置換アミンを含み、約半分（モル基準で）のＨＣｌで滴定されており、その結果、該バッファーのｐＨがほぼ中性である。好ましい実施態様において、このゲルは、ＨＣｌで滴定された、ビス−トリス［ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］を含むゲルバッファーを用いて、約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を用いて重合される。異なる分離特性が、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）またはＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファーのいずれかを用いて、ゲルを泳動することによって得られ得る。２ｍＭ〜１０ｍＭ ＴＧＡまたは２ｍＭ〜１０ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムが、ランニングバッファーに添加され、電気泳動の際のゲルにおける還元環境を保持する。この実施態様および他の実施態様は、以下の例示および比較の実施例を参照することによって理解され得る。
【実施例】
【００３８】
（実施例）
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、およびＭＯＰＳを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から購入した。チオグリコール酸（ＴＧＡ）、ＤＴＴ、およびメルカプトエタノール（ＢＭＥ）をＳｉｇｍａから購入した。全ての他の薬品は、標準的な供給元からの「極めて純粋な（ｕｌｔｒａ ｐｕｒｅ）」または「電気泳動用」の試薬であった。ゲルを、Ｎｏｖｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）製の１ｍｍ厚のミニゲルカセットにキャストし、そしてＮｏｖｅｘミニセルで流した（ｒｕｎ）。
【００３９】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分離ゲルおよびスタッキングゲルを、３０％Ｔ／２．５％Ｃアクリルアミド／ＢＩＳストック溶液および７Ｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓストック溶液（２．５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，１．５Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ ６．５）から調製した。分離ゲルを調製するために、ストック溶液を超純水とブレンドして、最終濃度を８％Ｔ、０．３５７Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓにし、これに０．２μｌ／ｍｌ テメド（ｔｅｍｅｄ）を添加した。脱気後、２．０μｌ／ｍｌのＡＰＳの１０％溶液を添加し、ゲルをすぐにカセットに注ぎ、次いで水でオーバーレイした。重合を室温で少なくとも３０分間続け、水を除去し、４％スタッキングゲルをのせた。このスタッキングゲルは、得られる最終濃度が４％Ｔであり、ｔｅｍｅｄ濃度を０．４μｌ／ｍｌまで増加させ、そしてＡＰＳを５．０μｌ／ｍｌまで増加させたことを除いて、分離ゲルと同じ様式で調製した。
【００４０】
ＭＯＰＳランニングバッファーは、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（またはＴＲＩＳ）、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなっていた。ＭＥＳランニングバッファーは、５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（またはＴＲＩＳ）、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなっていた。サンプルバッファー（２Ｘ）は、０．２５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＨＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｓｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ、および２００ｍＭ ＤＴＴからなっていた。タンパク質標準のセットを含有するサンプルを、適用前に１５分間７０度で加熱した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、鶏卵オバルブミン、アルキル化インシュリンＡおよびＢ鎖、大豆トリプシンインヒビター、およびウシ赤血球炭酸脱水酵素が、この標準に含まれていた。サンプル容量は、全ての場合において５μｌであった。
【００４１】
（実施例１）
タンパク質標準を、還元剤の非存在下でＭＯＰＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。得られた分離パターンは、追跡用色素とともにスタック（ｓｔａｃｋ）中に残っているタンパク質２０，０００およびそれより小さい残存物について、８％ ＴＲＩＳ／グリシンゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ）上で得られたものと非常に類似していた。ＢＳＡバンドはいくぶん拡散し、そしてアノードの方にシフトした。オバルブミンのバンドもまた、いくぶん拡散した。
【００４２】
（実施例２）
タンパク質標準を、カソードバッファー中のＴＧＡの存在下、ＭＯＰＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。これについても、分離パターンは、追跡用色素とともにスタック中に残っているタンパク質２０，０００およびそれより小さな残存物について、８％ ＴＲＩＳ／グリシンゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ）上で得られたものと非常に類似していた。カソードバッファー中、還元剤である５ｍＭ ＴＧＡの存在により、タンパク質ＢＳＡおよびオバルブミンのより良好な分離が、ＴＧＡなしのゲル泳動と比較して提供された。
【００４３】
（実施例３）
タンパク質標準を、カソードバッファー中の重亜硫酸ナトリウムの存在下、ＭＯＰＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。これについても、分離パターンは、追跡用色素とともにスタック中に残っているタンパク質２０，０００およびそれより小さな残存物について、８％ ＴＲＩＳ／グリシンゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ）上で得られたものと非常に類似していた。カソードバッファー中、還元剤である５ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムの存在により、タンパク質ＢＳＡおよびオバルブミンのより良好な分離が、重亜硫酸ナトリウムなしのゲル泳動と比較して提供された。
【００４４】
（実施例４）
タンパク質標準を、還元剤の非存在下でＭＥＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。タンパク質の分離は、１２％ ＴＲＩＳ／トリシン（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ）ゲルから得られたものと非常に類似していた。全てのタンパク質は、インシュリンＡおよびＢ鎖（それぞれ、３５００および２５００ダルトン）を含むスタックから分かれた。ゲルをＴＧＡなしで泳動する場合には、大豆トリプシンインヒビターは、より目立ったダブレットを有していた。
【００４５】
（実施例５）
タンパク質標準を、カソードバッファー中のＴＧＡの存在下で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＭＥＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／Ｃｌゲル上で分離した。これについても、全てのタンパク質は、インシュリンＡおよびＢ鎖（それぞれ、３５００および２５００ダルトン）を含むスタックから分かれた。カソードバッファー中の還元剤である５ｍＭ ＴＧＡの存在により、タンパク質大豆トリプシンインヒビターのより良好な分離が提供された。炭酸脱水酵素は、試験された全ての条件下で、引き締まって鋭いバンドとして泳動した。
【００４６】
（実施例６）
タンパク質標準を、カソードバッファー中の重亜硫酸ナトリウムの存在下で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＭＥＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／Ｃｌゲル上で分離した。これについても、全てのタンパク質は、インシュリンＡおよびＢ鎖（それぞれ、３５００および２５００ダルトン）を含むスタックから分かれた。カソードバッファー中の還元剤である５ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムの存在により、タンパク質大豆トリプシンインヒビターのより良好な分離が提供された。炭酸脱水酵素は、試験された全ての条件下で、引き締まって鋭いバンドとして泳動した。
【００４７】
得られるシステムは通常使用されるＬａｅｍｍｌｉおよびＳｃｈａｅｇｇｅｒゲルシステムに類似した分離特性を有しているので、ＭＥＳおよびＭＯＰＳが望ましいランニングバッファーとして選択されるが、所定の範囲のバッファーは、このシステムの使用に適切であるこということが見出された。良好な結果を提供するさらなるバッファーには、ＡＣＥＳ（［Ｎ−（２−アセトアミド）］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（２−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）がある。
【００４８】
ＴＧＡも重亜硫酸ナトリウムも存在しない泳動の場合にバンドのブローディングおよび／または移動度のシフトをいくらか示す全てのタンパク質は、共通して、複数のシステイン（例えば、ＢＳＡは３５個のシステインを有する）を含む組成を有する。一方、いつもきれいに泳動する炭酸脱水酵素は、システインを有していない。さらに、還元されたタンパク質が泳動前にアルキル化される場合にも、これらは、還元剤の非存在下でさえ鋭い均一なバンドとして泳動する。
【００４９】
システイン含有タンパク質は、サンプルバッファー中に１００ｍＭ メルカプトエタノールまたはＤＴＴを含むがランニングバッファー中にＴＧＡを含まないものを用いて泳動した場合には、一般に中性のシステムよりもＬａｅｍｍｌｉシステムにおいて、より鋭いバンドとなるようである。ｐＨが増加するにつれてチオールがより酸化されやすくなるので、ｐＨのより高いＬａｅｍｍｌｉシステムでは、少なくとも中性ｐＨシステムにおいて言われているのと同じぐらいにはジスルフィドの酸化が起こることが予測され得る。しかし、ＤＴＴおよび類似の「中性」チオール還元剤は、弱酸（ｐＫａは約ｐＨ８〜９）である。従って、塩基性ｐＨでは、これらの還元剤はゲル中に移動し、そして十分な濃度で存在する場合には、スルフヒドリルの酸化に対していくらかの保護を提供する。中性の分離ｐＨにおいては、サンプルバッファーからのＤＴＴは荷電していない形態であり、そしてサンプルウェル中に残る。従って、還元剤はゲル中に移動しない。
【００５０】
中性ｐＨでの電気泳動の際にタンパク質の還元形態を保持するためには、中性ｐＨでゲル中に移動する還元剤を使用することが有利であることが見出された。重亜硫酸ナトリウム（２〜１０ｍＭ）が、電気泳動の際にゲル中の還元環境を保持することが見出された。十分に還元されたＴＧＡ（または同様に負に荷電したチオール）も、同様の濃度で同様の結果を与える。しかし、部分酸化されたＴＧＡは、タンパク質チオールの部分酸化を促進する。タンパク質チオールの還元（酸化）はジスルフィド交換により起こるので、該タンパク質中における還元チオールの酸化チオールに対する比は、実質的に、ＴＧＡ中の還元チオールの酸化チオールに対する比を反映する。反対に、スルファイトは、スルフェートまで酸化し、ゲルにおいて見られる条件下での酸化還元反応には参加しない。それゆえ、スルファイトの部分酸化生成体におけるスルファイト／スルフェート比にかかわらず、十分なスルファイトが残存する限り、タンパク質はチオール酸化に対して保護される。
【００５１】
ＴＲＩＳが、分離の品質において明らかな影響を及ぼすことなく、ランニングバッファー中のＢｉｓ−Ｔｒｉｓの代わりとなり得ることがまた見出された。タンパク質を意図的に分離後に改変する場合には、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓが好適であり得る。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは第３級アミンであり、そして第１級アミンと反応するタンパク質改変剤とは干渉しない。しかし、ＴＲＩＳが、ルーチンの使用には好ましい選択である。なぜなら、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓよりも明らかに低い費用で入手可能であるからである。
【００５２】
本発明を好ましい実施態様について説明してきたが、それらの種々の改変は当業者にとっては明らかであることが理解されるべきである。上記の開示は、本発明を限定するようには意図または解釈されず、またはそうでなくとも、あらゆる上記の他の実施態様、適用、変形、および等価の改変を排除するようにも意図または解釈されず、本発明は、ここに添付した請求の範囲およびそれらの等価のものによってのみに限定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル電気泳動のための技術に関する。より詳細には、本発明は、ほぼ中性ｐＨでのゲル電気泳動のための新規なシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲル電気泳動は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、およびタンパク質のような生体分子を分離するための通常の手段である。ゲル電気泳動において、この分子は、かけられた電場により分子がフィルタリングゲル中を移動する割合によって、バンドに分離される。
【０００３】
この技術を用いる基本的な装置は、ガラスチューブに封入された、あるいはガラスまたはプラスチックプレート間にスラブとして挟まれたゲルからなる。このゲルは、オープンモレキュラーネットワーク構造を有し、電気伝導性の緩衝化された塩の溶液で飽和されている細孔を規定している。ゲル中のこれらの細孔は、移動するマクロ分子が通過し得るのに十分に大きい。
【０００４】
ゲルは、チャンバー中にバッファー溶液と接触するように置かれ、ゲルと電力供給源のカソードまたはアノードとの間を電気的に接触させる。マクロ分子および追跡用色素を含有するサンプルが、ゲルの一番上に置かれる。電位をゲルにかけると、サンプルのマクロ分子および追跡用色素は、ゲルの底に向かって移動する。電気泳動は、追跡用色素がゲルの末端に到達する直前に停止される。次いで、分離されたマクロ分子のバンドの位置が測定される。移動度が既知の追跡用色素およびマクロ分子と比べて、特定のバンドが移動した距離を比較することによって、他のマクロ分子の移動度が測定され得る。次いで、マクロ分子のサイズが計算され得る。
【０００５】
ゲル中のマクロ分子の移動速度は、３つの主要なファクターに依存している：ゲルの多孔度；マクロ分子のサイズおよび形；そしてマクロ分子の電荷密度である。これらの３つのファクターが精密に制御され、ゲルごとならびにサンプルごとに再現性があるということが、効果的な電気泳動システムにとって重要である。しかし、ゲル間の均一性を維持することは困難である。なぜなら、これらのファクターのそれぞれは、ゲルシステムの化学における多くの変数に対して敏感であるからである。
【０００６】
ポリアクリルアミドゲルが、通常、電気泳動に使用される。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、言い換えればＰＡＧＥが一般的である。なぜなら、このゲルは、光学的に透明で、電気的に中性であり、そして孔径の範囲に応じて作製され得るからである。ポリアクリルアミドゲルの多孔度は、ゲルに含まれるアクリルアミドモノマーと架橋剤モノマーとの全パーセント（「％Ｔ」）によって、ある程度規定される。濃度が高ければ高いほど、ポリアクリルアミドマトリックスの鎖の間にある空間は小さくなり、従ってゲル中の細孔は小さくなる。８％ポリアクリルアミドゲルは、１２％ポリアクリルアミドゲルよりも大きな細孔を有する。従って、８％ポリアクリルアミドゲルでは、所定の形状、サイズ、および電荷密度を有するマクロ分子は、より早く移動し得る。より小さいマクロ分子を分離する場合には、一般に、より小さな孔径を有するゲル（例えば、２０％ゲル）を使用するのが好ましい。反対に、より大きなマクロ分子を分離するには、より大きな孔径を有するゲル（例えば、８％ゲル）がしばしば使用される。
【０００７】
孔径はまた、ゲルを重合するために使用される架橋剤の量に依存する。任意の所定の全モノマー濃度における、ポリアクリルアミドゲルについての最小孔径は、全モノマーの架橋剤に対する比が約２０：１である場合に得られる（この比は、通常「５％Ｃ」と表現さ
れる）。
【０００８】
いくつかのファクターにより、ゲルの孔径において望ましくない変化が起こり得る。孔径は、製造の際の不完全なゲル重合により増大され得る。重合後のポリアクリルアミドゲルの加水分解は、固定負電荷を作りだし、そしてゲル中の架橋が分解され得る。これにより、分離能が低下し、そして孔径は増大する。理想のゲルシステムは、再現性のある孔径を有し、固定電荷を有しない（または、少なくとも一定量を有する）べきであり、そして化学的な特性の変化または加水分解に起因する孔径の変化に対して抵抗力があるべきである。
【０００９】
マクロ分子のサイズは、種々のマクロ分子間で異なる；より小さく、よりコンパクトなマクロ分子であればあるほど、マクロ分子は所定のゲルの細孔中をより容易に移動することになる。一定の電荷密度ならば、マクロ分子の移動の速度は、そのサイズの対数に反比例する。
【００１０】
正確で再現性のある電気泳動のためには、好ましくは一定のタイプのマクロ分子が、ゲルの単一の型について選択されるべきである。ゲル電気泳動の際にタンパク質の形の均一性の維持が困難であることの１つは、ジスルフィド結合が１対のシステインアミノ酸の酸化により形成され得るということである。タンパク質の異なる酸化形態は、次いで、異なる形状を有することとなり、それゆえ、ゲル中の移動は、わずかに異なる移動度を有する泳動となる（通常、完全に還元されたタンパク質よりも早くなる。なぜなら、最大ストークス半径および最小移動度が、完全に折りたたまれていない形態で起こるはずだからである）。不均一混合物の形態では、明らかにバンドはブロードになる。ジスルフィド結合の形成を防ぐためには、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤が、通常、泳動のためのサンプルに加えられる。
【００１１】
移動する分子の電荷密度は、ゲル中の移動の速度に影響を及ぼす第３のファクターである。電荷密度が高ければ高いほど、より強い力が電場によってマクロ分子にかけられ、そしてサイズおよび形状の制限を条件とすると、移動速度がより早くなる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において、マクロ分子の電荷密度は、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）を系に添加することによって制御される。ＳＤＳ分子は、マクロ分子と会合し、そして均一の電荷密度を、分子固有の（ｉｎｎａｔｅ）電荷の影響を実質的になくするようにマクロ分子に与える。
【００１２】
ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、通常、塩基性ｐＨで注がれ、そして泳動される。タンパク質を分離するために使用される最も一般的なＰＡＧＥバッファーシステムは、Ｏｒｎｓｔｅｉｎ（１）によって開発されたもの、およびＬａｅｍｍｌｉ（２）によってＳＤＳとの使用のために改変されたものである。Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ
２２７，６８０−６８６。このＬａｅｍｍｌｉバッファーシステムは、分離ゲル中の、ＨＣｌでｐＨ８．８に滴定された０．３７５Ｍ Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン）からなる。スタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）は、ｐＨ ６．８に滴定された、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓからなる。アノードおよびカソード泳動バッファーは、０．０２４Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１９２Ｍ グリシン、０．１％ ＳＤＳを含む。別のバッファーシステムが、Ｓｃｈａｅｇｇｅｒおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗによって開示されている。Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９。スタッキングゲルは、ＨＣｌでｐＨ ８．４５に滴定された、０．７５Ｍ Ｔｒｉｓを含む。分離ゲルは、ＨＣｌでｐＨ８．４５に滴定された０．９Ｍ Ｔｒｉｓを含む。カソードバッファーは、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、０．１％ ＳＤＳを含む。アノードバッファーは、ＨＣｌでｐＨ ８．９に滴定された、０．２Ｍ Ｔｒｉｓを含む。これらのシステムの両方とも、Ｔｒｉｓは、「共通イオン」であり、ゲル中およびアノードおよびカソードバッファー中に存在する。
【００１３】
Ｌａｅｍｍｌｉシステムにおいて、スタッキングゲル中のトレーリング相（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｐｈａｓｅ）のｐＨは、約８．９である。分離ゲル中において、トレーリング相のｐＨは、約９．７である。このｐＨでは、中性ｐＨにおいてよりも、タンパク質の第１級アミノ基は、未重合アクリルアミドと容易に反応し、チオール基はより酸化を受けて、ジスルフィドとなりやすく、あるいは未重合のポリアクリルアミドとの反応をより多く受け、そしてアクリルアミド自身は加水分解を受ける。
【００１４】
均一性および予測性の必要性は、プレキャスト電気泳動ゲル（外部の業者によって製造され、次いで電気泳動が行われる研究室に輸送される）においては大きくなる。プレキャストゲルは、上述した特性をコントロールしなければならず、そしてこれらは、輸送および貯蔵を通じてこのコントロールが保持され得なければならない。多くのプレキャストゲルの寿命は、ゲルバッファーの高ｐＨで保存される間のアクリルアミドの加水分解についての可能性によって制限される。
【００１５】
ポリアクリルアミドゲルが加水分解により分解を受け、そして寿命が制限されるということが、高ｐＨゲルの欠点である。
【００１６】
タンパク質が、未重合アクリルアミドと容易に反応し、そのことによりペプチド配列決定のようなタンパク質の次の分析の妨げとなり得ることも、高ｐＨゲルのさらなる欠点である。
【００１７】
チオール基が、ジスルフィドまで酸化を受け、そのことにより分離したマクロ分子の分離能を低下させることも、高ｐＨゲルのさらなる欠点である。
【非特許文献１】Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８６
【非特許文献２】Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．およびｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、未重合アクリルアミドとのタンパク質の反応を減らし、それにより収率および分離能を高める、中性ゲルシステムを作製することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、遊離チオール基からのジスルフィドの形成を防ぎ、それにより収率および分離能を高める、中性ゲルシステムを作製することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、加水分解によるポリアクリルアミドゲルの分解を減少し、それによりプレキャストゲルの有用である寿命を増加させる、中性ゲルシステムを作製することである。
【００２１】
本発明に従って、出願人は、分離が中性ｐＨで行われ、そしてタンパク質が完全に還元されたままである、ゲルおよびバッファーシステムを記載する。本発明の上記および他の目的ならびに利点は、以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ゲル電気泳動のためのシステムを提供する。このシステムは、以下を包含する：
２つの端部を有する電気泳動ゲル；該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、ｐＫが中性付近の一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されており；
該カソードバッファーは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されている。
【００２３】
１つの実施形態において、上記一価有機アミンは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓである。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記ゲルは、ポリアクリルアミドゲルである。
【００２５】
より好ましい実施形態において、上記カソードバッファー溶液は、亜硫酸塩を含む。
【００２６】
より好ましい実施形態において、上記カソードバッファー溶液は、負に荷電したチオールを含む。
【００２７】
より好ましい実施形態において、上前記カソードバッファー溶液は、ＴＧＡを含む。
【００２８】
より好ましい実施形態において、上前記アノードバッファーは、ＴＲＩＳを含む。
【００２９】
別の局面において、本発明は、ゲル電気泳動のためのシステムを提供する。このシステムは、以下を包含する：
２つの端部を有するプレキャストポリアクリルアミド電気泳動ゲル；
該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されたＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含み；
該カソードバッファーは、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されている。
【００３０】
１つの実施形態において、上記アノードバッファーは、ＴＲＩＳを含む。
【００３１】
別の実施形態において、上記カソードバッファーは、亜硫酸塩を含む。
【００３２】
別の実施形態において、上記カソードバッファーは、負に荷電したチオールを含む。
【００３３】
別の実施形態において、上記カソードバッファーは、ＴＧＡを含む。
【００３４】
別の局面において、本発明は、ゲル電気泳動のためのシステムを提供する。このシステムは、以下を包含する：
２つの端部を有するプレキャストポリアクリルアミド電気泳動ゲル；
ここで、該ゲルは、ゲルバッファー溶液で飽和されており；
該ゲルの一端は、アノードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルの他端は、カソードバッファー溶液と接触しており；
該ゲルバッファー溶液は、一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、そして 該カソードバッファーは、亜硫酸塩を含む。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
出願人は、分離が中性ｐＨで行われそしてタンパク質が完全に還元されたままである、ゲルおよびバッファーシステムを記載する。好都合なことに、この中性ｐＨでは、タンパク質の第１級アミノ基は、未重合アクリルアミドと容易に反応することがより少ない。なぜなら、タンパク質のアミノ基のプロトン化は、アクリルアミドまたは他の関連したブロッキング剤に対する、これらの反応性を非常に減少させるためである。さらに、この中性ｐＨにおいて、チオール基は、より高いｐＨにおいてよりも酸化を受けにくく、そしてポリアクリルアミド自身も、より加水分解を受けにくい。
【００３６】
その結果、ゲルマトリックスおよびストック溶液の改良された安定性を有するゲルシステムとなる。このシステムに従って調製されるゲルは、冷却下で１年を越える期間、アクリルアミドの加水分解に起因する性能の損失なしに、貯蔵され得る。また、還元剤を有していないストックバッファー、および重合開始剤を有していないストックゲル溶液は、少なくとも数週間、室温で、性能の損失なく貯蔵され得る。さらなる利益は、単一のゲルの手法（スタッキングおよび分離ゲルのために同じバッファーを使用する）が、２つの異なるランニングバッファーを用いて使用され、２つの分離システムが提供され得ることである。この特徴を用いると、例えば、８％ゲルで、２〜２００ｋＤａの範囲のタンパク質の分離をカバーし得る。
【００３７】
本発明の１つの実施態様において、約３％と約２５％（％Ｔ）との間のアクリルアミドのポリアクリルアミドゲルは、ゲルバッファーを用いて、約１％〜約６％の架橋剤（％Ｃ）を用いて重合される。このゲルバッファーは、中性近くのｐＫを有する第１級有機アミンまたは置換アミンを含み、約半分（モル基準で）のＨＣｌで滴定されており、その結果、該バッファーのｐＨがほぼ中性である。好ましい実施態様において、このゲルは、ＨＣｌで滴定された、ビス−トリス［ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］を含むゲルバッファーを用いて、約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を用いて重合される。異なる分離特性が、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）またはＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファーのいずれかを用いて、ゲルを泳動することによって得られ得る。２ｍＭ〜１０ｍＭ ＴＧＡまたは２ｍＭ〜１０ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムが、ランニングバッファーに添加され、電気泳動の際のゲルにおける還元環境を保持する。この実施態様および他の実施態様は、以下の例示および比較の実施例を参照することによって理解され得る。
【実施例】
【００３８】
（実施例）
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、およびＭＯＰＳを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から購入した。チオグリコール酸（ＴＧＡ）、ＤＴＴ、およびメルカプトエタノール（ＢＭＥ）をＳｉｇｍａから購入した。全ての他の薬品は、標準的な供給元からの「極めて純粋な（ｕｌｔｒａ ｐｕｒｅ）」または「電気泳動用」の試薬であった。ゲルを、Ｎｏｖｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）製の１ｍｍ厚のミニゲルカセットにキャストし、そしてＮｏｖｅｘミニセルで流した（ｒｕｎ）。
【００３９】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分離ゲルおよびスタッキングゲルを、３０％Ｔ／２．５％Ｃアクリルアミド／ＢＩＳストック溶液および７Ｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓストック溶液（２．５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，１．５Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ ６．５）から調製した。分離ゲルを調製するために、ストック溶液を超純水とブレンドして、最終濃度を８％Ｔ、０．３５７Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓにし、これに０．２μｌ／ｍｌ テメド（ｔｅｍｅｄ）を添加した。脱気後、２．０μｌ／ｍｌのＡＰＳの１０％溶液を添加し、ゲルをすぐにカセットに注ぎ、次いで水でオーバーレイした。重合を室温で少なくとも３０分間続け、水を除去し、４％スタッキングゲルをのせた。このスタッキングゲルは、得られる最終濃度が４％Ｔであり、ｔｅｍｅｄ濃度を０．４μｌ／ｍｌまで増加させ、そしてＡＰＳを５．０μｌ／ｍｌまで増加させたことを除いて、分離ゲルと同じ様式で調製した。
【００４０】
ＭＯＰＳランニングバッファーは、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（またはＴＲＩＳ）、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなっていた。ＭＥＳランニングバッファーは、５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（またはＴＲＩＳ）、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなっていた。サンプルバッファー（２Ｘ）は、０．２５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＨＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｓｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ、および２００ｍＭ ＤＴＴからなっていた。タンパク質標準のセットを含有するサンプルを、適用前に１５分間７０度で加熱した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、鶏卵オバルブミン、アルキル化インシュリンＡおよびＢ鎖、大豆トリプシンインヒビター、およびウシ赤血球炭酸脱水酵素が、この標準に含まれていた。サンプル容量は、全ての場合において５μｌであった。
【００４１】
（実施例１）
タンパク質標準を、還元剤の非存在下でＭＯＰＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。得られた分離パターンは、追跡用色素とともにスタック（ｓｔａｃｋ）中に残っているタンパク質２０，０００およびそれより小さい残存物について、８％ ＴＲＩＳ／グリシンゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ）上で得られたものと非常に類似していた。ＢＳＡバンドはいくぶん拡散し、そしてアノードの方にシフトした。オバルブミンのバンドもまた、いくぶん拡散した。
【００４２】
（実施例２）
タンパク質標準を、カソードバッファー中のＴＧＡの存在下、ＭＯＰＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。これについても、分離パターンは、追跡用色素とともにスタック中に残っているタンパク質２０，０００およびそれより小さな残存物について、８％ ＴＲＩＳ／グリシンゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ）上で得られたものと非常に類似していた。カソードバッファー中、還元剤である５ｍＭ ＴＧＡの存在により、タンパク質ＢＳＡおよびオバルブミンのより良好な分離が、ＴＧＡなしのゲル泳動と比較して提供された。
【００４３】
（実施例３）
タンパク質標準を、カソードバッファー中の重亜硫酸ナトリウムの存在下、ＭＯＰＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。これについても、分離パターンは、追跡用色素とともにスタック中に残っているタンパク質２０，０００およびそれより小さな残存物について、８％ ＴＲＩＳ／グリシンゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ）上で得られたものと非常に類似していた。カソードバッファー中、還元剤である５ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムの存在により、タンパク質ＢＳＡおよびオバルブミンのより良好な分離が、重亜硫酸ナトリウムなしのゲル泳動と比較して提供された。
【００４４】
（実施例４）
タンパク質標準を、還元剤の非存在下でＭＥＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。タンパク質の分離は、１２％ ＴＲＩＳ／トリシン（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ）ゲルから得られたものと非常に類似していた。全てのタンパク質は、インシュリンＡおよびＢ鎖（それぞれ、３５００および２５００ダルトン）を含むスタックから分かれた。ゲルをＴＧＡなしで泳動する場合には、大豆トリプシンインヒビターは、より目立ったダブレットを有していた。
【００４５】
（実施例５）
タンパク質標準を、カソードバッファー中のＴＧＡの存在下で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＭＥＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／Ｃｌゲル上で分離した。これについても、全てのタンパク質は、インシュリンＡおよびＢ鎖（それぞれ、３５００および２５００ダルトン）を含むスタックから分かれた。カソードバッファー中の還元剤である５ｍＭ ＴＧＡの存在により、タンパク質大豆トリプシンインヒビターのより良好な分離が提供された。炭酸脱水酵素は、試験された全ての条件下で、引き締まって鋭いバンドとして泳動した。
【００４６】
（実施例６）
タンパク質標準を、カソードバッファー中の重亜硫酸ナトリウムの存在下で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＭＥＳランニングバッファーを用いて８％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／Ｃｌゲル上で分離した。これについても、全てのタンパク質は、インシュリンＡおよびＢ鎖（それぞれ、３５００および２５００ダルトン）を含むスタックから分かれた。カソードバッファー中の還元剤である５ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムの存在により、タンパク質大豆トリプシンインヒビターのより良好な分離が提供された。炭酸脱水酵素は、試験された全ての条件下で、引き締まって鋭いバンドとして泳動した。
【００４７】
得られるシステムは通常使用されるＬａｅｍｍｌｉおよびＳｃｈａｅｇｇｅｒゲルシステムに類似した分離特性を有しているので、ＭＥＳおよびＭＯＰＳが望ましいランニングバッファーとして選択されるが、所定の範囲のバッファーは、このシステムの使用に適切であるこということが見出された。良好な結果を提供するさらなるバッファーには、ＡＣＥＳ（［Ｎ−（２−アセトアミド）］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（２−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）がある。
【００４８】
ＴＧＡも重亜硫酸ナトリウムも存在しない泳動の場合にバンドのブローディングおよび／または移動度のシフトをいくらか示す全てのタンパク質は、共通して、複数のシステイン（例えば、ＢＳＡは３５個のシステインを有する）を含む組成を有する。一方、いつもきれいに泳動する炭酸脱水酵素は、システインを有していない。さらに、還元されたタンパク質が泳動前にアルキル化される場合にも、これらは、還元剤の非存在下でさえ鋭い均一なバンドとして泳動する。
【００４９】
システイン含有タンパク質は、サンプルバッファー中に１００ｍＭ メルカプトエタノールまたはＤＴＴを含むがランニングバッファー中にＴＧＡを含まないものを用いて泳動した場合には、一般に中性のシステムよりもＬａｅｍｍｌｉシステムにおいて、より鋭いバンドとなるようである。ｐＨが増加するにつれてチオールがより酸化されやすくなるので、ｐＨのより高いＬａｅｍｍｌｉシステムでは、少なくとも中性ｐＨシステムにおいて言われているのと同じぐらいにはジスルフィドの酸化が起こることが予測され得る。しかし、ＤＴＴおよび類似の「中性」チオール還元剤は、弱酸（ｐＫａは約ｐＨ８〜９）である。従って、塩基性ｐＨでは、これらの還元剤はゲル中に移動し、そして十分な濃度で存在する場合には、スルフヒドリルの酸化に対していくらかの保護を提供する。中性の分離ｐＨにおいては、サンプルバッファーからのＤＴＴは荷電していない形態であり、そしてサンプルウェル中に残る。従って、還元剤はゲル中に移動しない。
【００５０】
中性ｐＨでの電気泳動の際にタンパク質の還元形態を保持するためには、中性ｐＨでゲル中に移動する還元剤を使用することが有利であることが見出された。重亜硫酸ナトリウム（２〜１０ｍＭ）が、電気泳動の際にゲル中の還元環境を保持することが見出された。十分に還元されたＴＧＡ（または同様に負に荷電したチオール）も、同様の濃度で同様の結果を与える。しかし、部分酸化されたＴＧＡは、タンパク質チオールの部分酸化を促進する。タンパク質チオールの還元（酸化）はジスルフィド交換により起こるので、該タンパク質中における還元チオールの酸化チオールに対する比は、実質的に、ＴＧＡ中の還元チオールの酸化チオールに対する比を反映する。反対に、スルファイトは、スルフェートまで酸化し、ゲルにおいて見られる条件下での酸化還元反応には参加しない。それゆえ、スルファイトの部分酸化生成体におけるスルファイト／スルフェート比にかかわらず、十分なスルファイトが残存する限り、タンパク質はチオール酸化に対して保護される。
【００５１】
ＴＲＩＳが、分離の品質において明らかな影響を及ぼすことなく、ランニングバッファー中のＢｉｓ−Ｔｒｉｓの代わりとなり得ることがまた見出された。タンパク質を意図的に分離後に改変する場合には、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓが好適であり得る。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓは第３級アミンであり、そして第１級アミンと反応するタンパク質改変剤とは干渉しない。しかし、ＴＲＩＳが、ルーチンの使用には好ましい選択である。なぜなら、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓよりも明らかに低い費用で入手可能であるからである。
【００５２】
本発明を好ましい実施態様について説明してきたが、それらの種々の改変は当業者にとっては明らかであることが理解されるべきである。上記の開示は、本発明を限定するようには意図または解釈されず、またはそうでなくとも、あらゆる上記の他の実施態様、適用、変形、および等価の改変を排除するようにも意図または解釈されず、本発明は、ここに添付した請求の範囲およびそれらの等価のものによってのみに限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【公開番号】特開２００６−１７７９８６（Ｐ２００６−１７７９８６Ａ）
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８９５２６（Ｐ２００６−８９５２６）
【出願日】平成１８年３月２８日（２００６．３．２８）
【分割の表示】特願２００４−６６４３７（Ｐ２００４−６６４３７）の分割
【原出願日】平成７年３月２９日（１９９５．３．２９）
【出願人】（５０２２２１２８２）インヴィトロジェン コーポレーション (113)
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２８日（２００６．３．２８）
【分割の表示】特願２００４−６６４３７（Ｐ２００４−６６４３７）の分割
【原出願日】平成７年３月２９日（１９９５．３．２９）
【出願人】（５０２２２１２８２）インヴィトロジェン コーポレーション (113)
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