乳腺特異的ヒトエリトロポエチン発現ベクター、これを用いた形質転換動物及びこれを用いたヒトエリトロポエチンの産生方法
乳腺特異的ヒトエリトロポエチン発現ベクター、これを用いた形質転換動物及びこれを用いたヒトエリトロポエチンの産生方法を提供する。
本発明のｈＥＰＯ発現形質転換動物は、乳腺特異的にエリトロポエチンを発現し、既存の方法に比べて極めて高濃度にて乳汁中にエリトロポエチンを発現する。
また、本発明の形質転換動物から産生されたｈＥＰＯタンパク質は市販中の同種タンパク質が示す以上の安定性及び優れた生理活性を示す。
従って、本発明のｈＥＰＯ発現ベクター及び形質転換動物は既存のｈＥＰＯよりも優れた生理活性を有するｈＥＰＯタンパク質を産生する上で有効に使用可能である。
本発明のｈＥＰＯ発現形質転換動物は、乳腺特異的にエリトロポエチンを発現し、既存の方法に比べて極めて高濃度にて乳汁中にエリトロポエチンを発現する。
また、本発明の形質転換動物から産生されたｈＥＰＯタンパク質は市販中の同種タンパク質が示す以上の安定性及び優れた生理活性を示す。
従って、本発明のｈＥＰＯ発現ベクター及び形質転換動物は既存のｈＥＰＯよりも優れた生理活性を有するｈＥＰＯタンパク質を産生する上で有効に使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳腺特異的ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）発現ベクター、これを用いた形質転換動物及びこれを用いたＥＰＯの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリトロポエチン（erythropoietin；ＥＰＯ）は胎児の肝や成人の腎臓において主として生成される糖タンパク質であって、赤血球生成を促進し、赤血球数を維持するのに重要な役割を果たす造血ホルモンである。
【０００３】
天然型ヒトＥＰＯは分子量が約３４〜３８ｋｄであり、２４、３８、８３番アミノ酸にＮ-結合型糖鎖結合部位を有しており、且つ、１２６番アミノ酸にＯ-結合型糖鎖結合部位を有しているが、これらの糖鎖部分はＥＰＯの生体内活性に欠かせない役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯは赤血球の形成に欠かせないものであるため、貧血、特に腎臓性貧血の治療に有効であり、ＨＩＶ−感染患者のＡＺＴ治療と関連する貧血、化学治療中の非骨髄癌患者の貧血などの治療にＥＰＯが利用されている。
【０００５】
かような医薬分野において経済的な付加価値が高いＥＰＯなどの産生を極大化させるために、細胞培養法によるＥＰＯの量産方法が汎用されてきている。しかしながら、この方法は、動物の血液を培養培地として利用するため生産コストが高くつき、培養技術に関する専門的な知識が要求される。また、培地成分に含有されている動物のＥＰＯと新たに産生されたＥＰＯを完全に分離することが不可能であるため最終的に得られるＥＰＯの純度が低く、該方法により製造された組換えヒトＥＰＯの場合には天然型ＥＰＯタンパク質とグリコシル化の状態が同一ではないため生理活性も低いという不都合を有している。
【０００６】
これに対し、形質転換動物を用いた目的タンパク質の産生方法は、動物が分泌する体液中に目的タンパク質が含まれるため、既存の細胞培養法に比べて目的タンパク質の分離および精製が容易であり、活性もまた高く維持されることから、この分野に対する関心が急増している。
【０００７】
これまでの形質転換動物の産生技術において目的タンパク質を産生する組織は主としてタンパク質の発現率が高いと知られている乳腺組織である。
【０００８】
しかしながら、これまで開発された乳腺特異的プロモーターを用いて形質転換された動物のタンパク質の産生効率は実際に極めて低いレベルに留まっており、また、既存に報告された乳腺特異的ベクターの場合に異所性発現を示すなど種々の問題点がある。
大韓民国公開特許第２００１−８１４５６号公報は、マウスの乳腺から分離したＷＡＰプロモーター及びヒトのＥＰＯゲノム遺伝子を含むＥＰＯ形質転換発現ベクター並びにその形質転換豚について開示している。
【０００９】
また、大韓民国公開特許第１０−２００４−１０１７９３号公報は、牛のβ-カゼインプロモーターを用いて乳腺においてヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）を発現する形質転換複製牛について開示している。
【００１０】
しかしながら、ｈＥＰＯの乳汁内濃度及び産生されたＥＰＯの活性に対する結果は全くないため、この方法により産生されたｈＥＰＯが実用化できるかどうかは全く推察することができない。
【００１１】
そこで、本発明者は、乳腺においてのみ特異的にヒトＥＰＯを高効率にて産生する発現ベクターを製作し、これを導入した形質転換動物が高い生理活性を有するヒトＥＰＯを産生することを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】大韓民国公開特許第２００１−８１４５６号公報
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２００４−１０１７９３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】A. Gokana, J.J. Winchenn , A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118
【非特許文献２】Parekh RB, et al. (1989) N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of human recombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells and a murine cell line. Biochemistry 28: 7670-7679
【非特許文献３】Tam RC, et al. (1991) Comparisons of human, rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing: differences between serum and urinary erythropoietins. Br J Haematol 79: 504-511
【非特許文献４】Prather, R. S., et al. 1995. In vitro development of embryos from sinclair miniature pigs: A preliminary report. Theriogenology, 43:1001-1007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、乳腺特異的にヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質を発現するベクターを提供するところにある。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、前記ベクターを導入して形質転換された動物の体細胞を提供するところにある。
【００１６】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを導入した形質転換動物を提供するところにある。
【００１７】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを用いた形質転換動物の産生方法を提供するところにある。
【００１８】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記形質転換動物を用いたヒトエリトロポエチンの産生方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、乳腺特異的にヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質を発現する発現ベクターを提供する。
【００２０】
本発明は、乳腺特異的プロモーターであるβ-カゼインプロモーターＤＮＡ配列、その３’側にヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするＤＮＡ配列及びｈＥＰＯ遺伝子の３’側にＷＰＲＥ ＤＮＡ配列を含むｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを提供する。
【００２１】
本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにおいて、前記ｈＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は、これに制限されるものではないが、例えば、配列番号１のＤＮＡ配列であることができる。
【００２２】
本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにおいて、前記β-カゼインプロモーターＤＮＡ配列は、これに制限されるものではないが、例えば、配列番号２のＤＮＡ配列であることができる。
【００２３】
本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにおいて、前記ＷＰＲＥ ＤＮＡ配列は、これに制限されるものではないが、例えば、配列番号３のＤＮＡ配列であることができる。
【００２４】
本発明において、β-カゼインプロモーターＤＮＡ配列、ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするＤＮＡ配列及びＷＰＲＥ ＤＮＡ配列は、上述した配列の他にも、これらのＤＮＡ配列のうち１以上の塩基が欠失、置換されたり、１以上の塩基がこれらのＤＮＡ配列に挿入または付加された、配列同一性を有するこれらの均等物を含む。
【００２５】
具体的に、本発明においては、山羊のβ-カゼインプロモーターを含むｐＢＣ１発現ベクターに配列番号１のヒトＥＰＯ遺伝子を挿入して、ＥＰＯの乳腺特異的な発現を可能にする発現ベクターｐＢＣ１−ｈＥＰＯを提供する。
【００２６】
本発明の発現ベクターｐＢＣ１−ｈＥＰＯは、必要に応じて、インシュレータ、またはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節領域（ＷＰＲＥ：woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element）、ネオマイシン抵抗性遺伝子などをさらに含むことにより、形質転換細胞株を構築し易くし、目的タンパク質発現量の極大化及び発現の安定性を図ることができる。
【００２７】
インシュレータはプロモーターの近くに存在する調節因子の影響を促進し、位置非依存的な発現を促進する因子であり、β-カゼインプロモーターの調節下にタンパク質を安定的に発現できるようにする。
【００２８】
ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡの安定化に寄与してタンパク質合成量を増大可能な調節因子であって、β-カゼインプロモーターの調節下にタンパク質を大量に発現できるようにする。ＷＰＲＥの塩基配列は配列番号３に記載の通りである。
【００２９】
ネオマイシン抵抗性遺伝子は細胞株の構築時に使用されるＧ４１８試薬に対して抵抗性を示す遺伝子であり、β-カゼインプロモーターの調節下にタンパク質を発現する動物細胞株の構築時に効率的な選択的標識遺伝子として働くことができる。ネオマイシン抵抗性遺伝子の塩基配列は配列番号４に記載の通りである。
【００３０】
本発明は前記調節因子をさらに含む発現ベクターの好適な例として、ＷＰＲＥを含むｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター及び前記ｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにネオマイシン抵抗性遺伝子をさらに含むｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターを提供する。
【００３１】
前記ベクターは本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクター内ＥＰＯ遺伝子の３’側にＷＰＲＥを挿入したり、ここにさらにネオマイシン抵抗性遺伝子を挿入することにより製造される。
【００３２】
上述した本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯは２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ １１１５９ＢＰで寄託された。
【００３３】
また、本発明の発現ベクターは、必要に応じて、調節因子、すなわち、別のプロモーター、エンハンサー、選択的標識遺伝子、５’非翻訳領域（5’-untranslated region：５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（3’-untranslated region：３’−ＵＴＲ）、ポリアデニル化信号、リボソーム結合配列、ゲノムの特定部位に挿入可能な塩基配列、またはイントロンを適切な位置にさらに含むことができる。
【００３４】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを用いて形質転換させた体細胞を提供する。
本発明の一実施例においては、製作された前記形質転換豚の体細胞は２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ １１１６０ＢＰで寄託された。
【００３５】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを用いて形質転換させた体細胞を脱核された卵子に核移殖して製造された受精卵を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを用いて形質転換させた動物を提供する。
【００３７】
本発明の発現ベクターで形質転換可能な動物は、乳汁を分泌するあらゆる動物、すなわち、豚、マウス、牛、山羊、羊、馬または犬などを含む。
【００３８】
本発明の発現ベクターを用いた形質転換動物の生産方法は通常の方法による。
【００３９】
例えば、形質転換しようとする動物がマウスである場合、健康な個体から受精卵を採取し、受精卵に本発明の発現ベクターを導入した後、精管結紮マウスを用いて偽妊娠マウスを得、これを代理母として卵管内に受精卵を移殖した後、代理母から得られた子孫のうち形質転換された個体を選別する。
【００４０】
形質転換しようとする動物が豚である場合、先ず、健康な個体から卵母細胞を採取し、体外成熟用培養液において培養する。また、豚胎児から採取、培養した供与体細胞に本発明の発現ベクターを導入した後、ベクターの導入された体細胞を選別、培養する。前記体外成熟された卵子から核を除去し、この空間に供与細胞を注入した後、電気融合を通じて核移殖が完了した卵子の供与細胞と細胞質を融合させた後に体外培養する。この複製受精卵を過排卵を誘導した受卵豚に移殖した後、受卵豚から得られた子孫のうち形質転換された個体を選別する。
【００４１】
この後、形質転換されたことが確認された個体から乳汁を集めた後、目的タンパク質を分離および精製することにより有用タンパク質を産生する（A. Gokana, J.J. Winchenn , A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118 ）。
【００４２】
また、本発明は、形質転換動物から産生された乳汁中に発現されたエリトロポエチンを分離・精製する方法を含むヒトエリトロポエチンの産生方法を提供する。
【００４３】
本発明のヒトエリトロポエチンの産生方法において、分離および精製方法としては通常的に使用される方法を使用することができ、具体的には、濾過法またはクロマトグラフィ法などが挙げられる。
【００４４】
このようにして製造される本発明の形質転換動物は乳腺特異的にエリトロポエチンを発現し、既存の方法に比べて極めて高濃度にて乳汁中にエリトロポエチンを発現する。なお、特異的に授乳期中の肺胞細胞においてのみＥＰＯタンパク質を発現する。
【００４５】
その例として、本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯで形質転換されたマウスの場合、２００，０００ＩＵ〜４００，０００ＩＵ／mlレベルの高いＥＰＯ発現率を示す。そもそもＥＰＯは胎児の早期死亡を誘発するため発現させ難いタンパク質であるにも関わらず、本願発明の形質転換動物においては既存の乳腺特異的プロモーターを用いて製造された形質転換動物の乳汁内タンパク質発現率に比べて１０００倍以上の高い発現率を示す。
【００４６】
また、本発明の形質転換動物から産生されたＥＰＯタンパク質は市販中の同種タンパク質が示す以上の安定性及び優れた生理活性を示す。
【００４７】
その例として、本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯで形質転換されたマウスから得られたＥＰＯはシアル酸を多量含有していて、赤血球（ＲＢＣ：red blood cells）前駆細胞に作用して優れたタンパク質活性を示す。
【００４８】
また、本発明の形質転換動物から産生されたＥＰＯタンパク質を投与時に血液内血小板、赤血球、血色素、ヘマトクリットを増大させるといった作用効果を示す。
【００４９】
このため、本発明のＥＰＯ発現ベクター及び形質転換動物は既存のＥＰＯよりも優れた生理活性を有するＥＰＯタンパク質を産生する上で有効に使用可能である。
【００５０】
以下、本発明への理解に一助となるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例により本発明の内容が限定されることはない。
【発明の効果】
【００５１】
本発明のｈＥＰＯ発現形質転換動物は乳腺特異的にエリトロポエチンを発現し、既存の方法に比べて極めて高濃度にて乳汁中にエリトロポエチンを発現する。
【００５２】
また、本発明の形質転換動物から産生されたｈＥＰＯタンパク質は市販中の同種タンパク質が示す以上の安定性及び優れた生理活性を示す。
【００５３】
さらに、本発明の形質転換動物から産生されたｈＥＰＯタンパク質を投与時に血液内血小板、赤血球、血色素、ヘマトクリットを増大させるといった作用効果を示す。このため、本発明のｈＥＰＯ発現ベクター及び形質転換動物は既存のｈＥＰＯよりも優れた生理活性を有するｈＥＰＯタンパク質を産生する上で有効に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターの構造を示す。
【図２】図２は、本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターの構造を示す。
【図３】図３は、本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターの構造を確認したＰＣＲ結果を示す。
【図４】図４は、実験用マウスの乳腺、肝、ＣＨＯ細胞におけるグリコシル化への関与遺伝子の発現様相を分析した結果を示す。
【図５】図５は、本発明のｈＥＰＯ発現ベクターで形質転換させたマウスにおけるｈＥＰＯ発現有無を観察した結果を示す。
【図６】図６は、本発明の形質転換マウスの乳腺組織におけるｈＥＰＯタンパク質の発現を観察した結果図である。
【図７】図７は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯタンパク質を分析した結果図である。
【図８】図８は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯと腎不全症患者の血清内ＥＰＯの２次元電気泳動ゲル写真である。
【図９】図９は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯとエポエチンαのオリゴ糖分析結果である。
【図１０】図１０は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯのインビトロ活性測定結果である。
【図１１】図１１は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯのインビボ活性測定結果である。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］本発明の最適な乳腺特異的ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）発現ベクターの製作
【００５６】
本発明は乳腺においてｈＥＰＯを分泌する最適ベクターを構築した。
【００５７】
１）ｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターの構築
本発明の乳腺特異的発現ベクターを製作するために、山羊のβ-カゼインプロモーターを有しているInvitrogen社製のｐＢＣ１を用いて、この制限酵素ＸｈｏＩ位置にヒトエリトロポエチンゲノムＤＮＡ（配列番号１）をクローニングした。
【００５８】
２）ｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターの構築
ｈＥＰＯの発現量を増大させるために、前記ｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターにＷＰＲＥ遺伝子を挿入した。
ＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element）はｍＲＮＡの安定化に寄与して、最終タンパク質の合成を増大させるのに関与すると報告された調節因子である。
【００５９】
これらのＷＰＲＥ調節因子をｈＥＰＯの直後に連結してＥＰＯの転写時にｍＲＮＡが一緒に製造されるようにするために、前記１）のｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターからＸｈｏＩ制限酵素の位置に挿入した。
【００６０】
ＷＰＲＥは肝炎ウイルスから順方向プライマー５’−ＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号５）と逆方向プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６）を用いて０．６ｋｂの長さのＰＣＲ産物を増幅し、これをｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。Ｔ−ベクターにクローニングされた０．６ｋｂ ＷＰＲＥをＳａｌＩ及びＸｈｏＩ制限酵素にて切断して挿入断片部位を準備し、ｐＢＣ１−ｈＥＰＯをＸｈｏ１制限酵素にて切断して準備したベクターとライゲーションして２３９７５ｂｐのｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを構築した。
【００６１】
３）ｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターの構築
乳腺特異的なβ-カゼインプロモーターの調節下にｈＥＰＯの産生を極大化可能なベクターだけを有する細胞を効果的に選択するために、ｎｅｏ遺伝子（neomycin-resistance gene）をクローニングした。
【００６２】
Ｇ４１８ドラッグに抵抗可能なｎｅｏ’遺伝子はｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech，Catalog #6085-1）から順方向プライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号７）と逆方向プライマー５’−ＣＧＡＴＣＧＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣ−３’（配列番号８）を用いて１．９ｋｂのＰＣＲ産物を増幅して得、この後、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。
Ｔ−ベクターにクローニングされた１．９ｋｂ ｎｅｏ遺伝子はＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素にて切断して挿入部位を準備した。また、前記２）のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターのａｍｐ’遺伝子（ampicillin-resistance gene）部位をＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素にて切断して除去した後にベクター部位を準備した。
【００６３】
このようにして準備された挿入断片及びベクター部位をライゲーションすることにより、既存に構築されたｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターにＷＰＲＥ調節因子とｎｅｏ遺伝子が挿入されたｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターを構築した。
【００６４】
この結果として得られた本発明の発現ベクターの構造が図１に示されており、乳腺特異的プロモーターであるβ-カゼインプロモーターの調節下においてｈＥＰＯを発現することになる。
【００６５】
これをｐＢＣ１−５’＋ＷＰＲＥ−Ｒプライマー対及びｈＥＰＯ３＋ＷＰＲＥ−Ｒプライマー対を用いたＰＣＲを通じて３ｋｂ及び１．５ｋｂのＰＣＲ産物を得ることにより、ｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターの製作が正常になされたことを確認した（図２及び図３）。
【００６６】
上述した本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯは２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院に寄託番号ＫＣＴＣ １１１５９ＢＰで寄託された。
ｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯはＷＰＲＥ調節因子の導入によりＥＰＯタンパク質合成が格段に増大され、且つ、ｎｅｏ’遺伝子の挿入は細胞株の構築に極めて効率的な選択的標識遺伝子として活用される。
【００６７】
［実施例２］ｈＥＰＯ発現形質転換動物の製作及び発現されたｈＥＰＯタンパク質の分析
【００６８】
本発明の乳腺特異的ｈＥＰＯ発現形質転換マウスの産生による生理活性確認及び安定性評価のために下記の実験を行った。
【００６９】
１）マウスの乳腺においてグリコシル化に関与する遺伝子の発現様相分析
【００７０】
タンパク質のグリコシル化はタンパク質の翻訳後修飾の一過程であり、タンパク質の機能を強化して決定する上で重要な役割を果たすことが知られている。このようなグリコシル化は大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、動物細胞またはマウスなどの実験動物においてタンパク質発現時にそれぞれ異なる様相として現れる。これらの中で、ヒトと進化段階が類似している実験動物から産生されたタンパク質のグリコシル化の度合いがヒト生体内において産生されたタンパク質のグリコシル化の度合いと類似していることが知られている。
【００７１】
このため、インビボにて組換えされたヒトＥＰＯタンパク質のグリコシル化に関与するグリコシルトランスフェラーゼの発現をマウスの乳腺、肝及びＥＰＯの産生に有効に利用されているＣＨＯ細胞株において確認した（図４）。
【００７２】
先ず、マウスの乳腺と肝及びＣＨＯ細胞株から全体ＲＮＡを分離した後、３種類のグリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ−V、ＧｎＴ−IIIとＦｕｃ−ＴIV）のプライマー対（表１）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７３】
【表１】
【００７４】
その結果、図４に示すように、２種類のグリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ−IIIとＧｎＴ−V）は肝とＣＨＯ細胞株よりも乳腺（Ｍ.Ｇ.）において相対的に高く発現されることを確認することができ、他のグリコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−Ｔ）もＣＨＯ細胞株よりも乳腺（Ｍ.Ｇ.）において相対的に高く発現されることを確認することができた。
【００７５】
このため、乳腺由来組換えヒトＥＰＯは現在ＣＨＯ細胞株から産生されて市販されているＥＰＯと比較したときにタンパク質のグリコシル化に優れていて、タンパク質の生理活性だけではなく、質的にも区別されることが分かる。
【００７６】
２）形質転換マウスの産生
前記実施例１において構築した乳腺特異的なβ-カゼインプロモーターの調節下にＥＰＯを発現する２３ｋｂのｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクター（図１）を用い、微細注入によって形質転換マウスを製作した（韓国Macrogen社製）。
【００７７】
形質転換マウスとしてはＢＤＦ１（Ｃ５８７ＢＬ／６ ＤＢＡ）を使用し、７３８個の受精卵にｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯを注入し、これらの中で７００個の受精卵を３０匹の代理母に移殖した。数週後に生まれた合計８５匹の生存マウスのうち９匹が形質転換されたことをＰＣＲとゲノムサザンブロットの結果を通じて確認した（表２及び図５Ｂ）。
【００７８】
ＰＣＲに使用したプライマーはＴＧチェック用順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１９）とＴＧチェック用逆方向プライマー５’−ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡ−３’（配列番号２０）であり、このＰＣＲ予想産物のサイズは６００ｂｐであった。
【００７９】
サザンブロットに使用したプローブはｈＥＰＯゲノムＤＮＡであり、配列番号１の配列を含む２.３ｋｂ全体遺伝子を使用した。
【００８０】
図５Ｂは、乳腺特異的にＥＰＯを発現する形質転換マウスのうち代表的な２ラインとして選択されたライン６及びライン３７において確認されたＥＰＯ遺伝子のＰＣＲ及びサザンブロット結果を示す。図５Ｂの結果から、ＥＰＯ遺伝子が染色体内に約１０〜３０コピー挿入され、生殖細胞を通じて次の世代までＥＰＯ遺伝子が伝達されることを確認した。
【００８１】
【表２】
【００８２】
３）形質転換マウスにおけるＥＰＯの乳腺特異的発現確認
前記２）において製作した形質転換マウスにおいてＥＰＯ遺伝子が乳腺特異的に発現されるかどうかを確認した。
【００８３】
先ず、前記形質転換されたマウスから樹立したライン６及びライン３７マウスの種々の組織（乳腺、脳、腎臓、心臓、脾臟、肝、子宮、肺）からそれぞれＲＮＡを抽出した後に当業界における通常的な方法によりＲＴ−ＰＣＲとノーザンブロット分析を行った。
【００８４】
ＥＰＯ ｃＤＮＡを探知するために、ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ｈＥＰＯ特異的プライマーとして順方向プライマー５’−ＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴ−３’（配列番号２１）と逆方向プライマー５’−ＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２２）を使用した。
【００８５】
ノーザンブロット分析に使用したプローブはＥＰＯ full genomic ＤＮＡであって、サザンブロット分析に使用した２．３ｋｂと同じプローブを使用した。
図５Ｃを参照すると、ＲＴ−ＰＣＲ結果から、乳腺（mammary gland：Ｍ.Ｇ.）においては強く発現されるのに対し、腎臓（kidney：Ｋ）において極めて弱く発現されるということが確認された。また、図５Ｄのノーザンブロット分析結果からは、ＥＰＯ遺伝子が他の組織においては全く発現せず、単に乳腺（Ｍ.Ｇ.）においてのみ特異的に発現されることを確認した。（図中、Ｂ：脳、Ｈ：心臓、Ｓ：脾臟、Ｌ：肝、Ｕ：子宮、Ｌｕ：肺を意味する。）
【００８６】
また、形質転換マウスにおけるＥＰＯタンパク質の発現有無及び発現細胞の種類を調べるために、組織に対して免疫組織化学法を行い、このとき、ＥＰＯ抗体としては、Anti-human antibody（ＡＢ−２８６−ＮＡ、Ｒ＆Ｄシステム社製）を使用した。
その結果を図６に示す。
図６Ａの対照群マウスの妊娠１６日目の乳腺においてはＥＰＯの発現を確認することができなかった。これに対し、形質転換マウスの妊娠１６日目（図６Ｂ）と分娩後５日目（図６Ｃ）においては乳腺肺胞細胞においてＥＰＯが発現することを確認することができ、分娩後１６日目（図６Ｄ）においては乳腺肺胞細胞が退行してＥＰＯの発現がなくなることを確認した。
【００８７】
図６に示すように、本発明のｈＥＰＯ形質転換マウスにおいては、授乳期中の乳腺肺胞細胞においてのみＥＰＯタンパク質が特異的な発現を示すことを確認することができた。
【００８８】
４）発現されるＥＰＯタンパク質の分析及び安定性確認
前記２）において製作した形質転換マウスの乳汁中に発現されるＥＰＯタンパク質及びその濃度を当業界における通常的なウェスタンブロット分析法により確認し、このとき、ＥＰＯ抗体としては抗ヒト抗体（（anti-human antibody）（ＡＢ−２８６−ＮＡ，Ｒ＆Ｄシステム社製））を使用した。
その結果を図７に示す。
【００８９】
図７Ａは、形質転換マウスの乳汁を用いたウェスタンブロット分析結果を示すものであり、図中、レーン１と２は陽性対照群であって、ＧＳＴが結合されているＥＰＯ抗原５ｎｇ、１０ｎｇを示すものであり、レーン３は対照群マウスの乳汁、レーン４と５はそれぞれ形質転換マウスライン６と３７の乳汁内のＥＰＯを示すものである。
【００９０】
図７Ａから明らかなように、本発明の形質転換マウス乳汁において３４ＫＤａ分子量を有するタンパク質が発現されることを確認し、これは、全体タンパク質のうち０．７−１．４％を占めている。
【００９１】
また、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯのグリコシル化パターンを確認するために、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ、またはＮ−グリコシダーゼ−Ｆ及びＯ−グリコシダーゼにて切断した後、ウェスタンブロットを実施した。
図７Ｂ中、レーン１は乳汁由来ＥＰＯ、レーン２はＮ−グリコシダーゼ−Ｆにて切断したＥＰＯ、レーン３はＮ−グリコシダーゼ−ＦとＯ−グリコシダーゼにて切断したＥＰＯを示すものである。
【００９２】
図７Ｂの結果から、Ｎ−グリコシル化部位３個とＯ−グリコシル化部位が切断されて最終的に１８ＫＤａのＥＰＯを確認することにより後修飾が正常になされたことを確認した。
【００９３】
また、本発明のｈＥＰＯ形質転換マウスの乳汁内ＥＰＯの濃度を確認するために、ＥＬＩＳＡキット（Human Erythropoietin ELISA，#01630，stem cell technology社製）を用いて定量分析した結果、授乳期１−５日の間に約２００，０００−４００，０００ＩＵ／mlが発現されることを確認した（表３）。
【００９４】
【表３】
【００９５】
また、ＥＰＯの安定性を確認するために形質転換されたマウスの乳汁から産生されたヒトＥＰＯと腎不全症患者の血液を用いて２Ｄ分析を行った。
【００９６】
図８に示す２Ｄ分析結果から、形質転換マウス由来ＥＰＯは電荷とサイズが異種的に現れることが分かる。
【００９７】
一般的にタンパク末端にシアル酸などの糖鎖が多いほどＰＩ値が低下するが、図８において形質転換されたライン６と３７のマウスの乳汁において組換えされたヒトＥＰＯは対照群と腎不全症患者の血清よりも酸性状態を示し、シアル酸を多量含有していることを確認することができる。これに対し、対照群と腎不全症患者の血液は非シアル状態であることを確認した。
【００９８】
シアル酸などの糖鎖はタンパク質の構造と機能に影響を与え、シアル状態のＥＰＯはＲＢＣ前駆細胞に作用してタンパク質活性を有し、非シアル状態のＥＰＯは肝受容体と結合して尿として排出されて活性を有さないことが報告されている（Parekh RB, et al. (1989) N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of human recombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells and a murine cell line. Biochemistry 28: 7670-7679; Tam RC, et al. (1991) Comparisons of human, rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing: differences between serum and urinary erythropoietins. Br J Haematol 79: 504-511）。
【００９９】
これより、本願発明のＥＰＯ発現形質転換マウスから産生されたｈＥＰＯはＲＢＣ前駆細胞に作用してｈＥＰＯタンパク質活性を有することが理解される。
【０１００】
５）形質転換マウスの乳汁からのｈＥＰＯ分離
先ず、本発明の形質転換マウスの乳汁３mlを１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６.８）２０mlに懸濁して膜フィルターに収容し、４℃、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６.８）１，０００mlにて２回一晩中透析した。透析を終えた懸濁液を遠心分離管に移して４，０００ｒｐｍにて３０分間冷蔵遠心分離して沈渣を取り除いた。
【０１０１】
上清約２０mlをｐＭ１００膜（Amicon）フィルターにて濾過し、その濾液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）３００mlに懸濁した後、予め１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）にて十分に平衡化させたＤＥＡＥ sephadex column（２Φ×１５ｃｍ，bed volume ４０）に３ml／minの流速にて注入した。その後、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）５００mlにてカラムを十分に洗浄した後、０ｍＭから３２５ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝液にてグラジエント溶出（各分画のサイズ：３ml、流速：２１ml／ｈ）した。
【０１０２】
前記溶出された各分画のうちＥＰＯを含有する分画を集めた後、これをｐＭ-１０膜にて濾過し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.２）にて３回洗浄して３mlに濃縮した。この液を同じ緩衝液にて予め平衡化させたSephadex Ｇ−１００（２Ｆ １００ｃｍ）に注入した後に流速２４ml／ｈ、分画サイズ３ｍにて溶出した。
【０１０３】
前記溶出された各分画のうちＥＰＯを含有する分画をさらに集めてｐＭ-１０膜にて濾過した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）にて希釈して下記のように免疫精製法を実施した。
【０１０４】
１．ＩｇＧを分離するために、採取した腹水液をProtein-G agarose affinity systemを用いて精製した。
【０１０５】
先ず、腹水液を５倍の結合緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）に希釈し、Protein-A agaroseカラムに徐々に流した後、同じ緩衝液にて洗浄した。洗浄が十分に終わった後、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ，０．０１％アジ化ナトリウム，ｐＨ２.７）にて溶出した。溶出物は同量の中性化緩衝液（１Ｍ Tris，０．０１％アジ化ナトリウム，ｐＨ９）入りチューブに溶出した。この一連の過程は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行い、クマシブルー染色にて確認した。この抗体溶液は３ＬのＰＢＳ溶液にて透析を３日間６回繰り返し行い、抗体量を定量した後に実験に供試した。
【０１０６】
２．免疫親和カラムの製造
上記において精製されたＩｇＧ ５０ｍｇを水素カーボネート緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８. ３）にて４℃において一晩透析した。ＣＮＢｒにより活性化された３ｇのSepharosｅ ４Ｂ（Pharmacia）を１ｍＭ塩酸にて多数回洗浄した。概ね１２mlのゲルをカラムに注ぎ込んで水素カーボネート緩衝液にて洗浄して平衡化させた後、ＩｇＧを入れて一晩中徐々に攪拌しながら反応させた。その後、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８.８）溶液にて常温において３時間震とうして、反応せずに残留している活性化残基を中和した。最終的に３０mlのカーボネート緩衝溶液にて３回、そして３０mlの０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２.５）溶液にて１回洗浄した。０．２％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ緩衝溶液に入れ替え、使用時まで４℃において保管した。
【０１０７】
３．免疫精製
準備されたカラムを０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．５）にて前処理して平衡を維持した。希釈したサンプル溶液２０mlを４℃において一晩中丁寧に攪拌しながらゲルに吸着させ、ゲルをカラムに注ぎ込んだ後、前処理緩衝溶液にて十分に洗浄し、０．１Ｍアセテート緩衝溶液（ｐＨ４．５）を６０ml／ｈの速度にて洗い流した。ゲルに結合したＥＰＯを３０mlの０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２.５）溶液にて溶出した。溶出された分画は直ちに１Ｍトリス溶液（ｐＨ９）を加えて早い時間内にｐＨ７．５まで滴定した。その後、ｐＭ-１０膜（Amicon）をもって溶出された分画を濃縮してｈＥＰＯタンパク質を得た。
【０１０８】
６）ＥＰＯ分子のオリゴ糖分析
本発明の形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯのオリゴ糖構造をＨＰＬＣを用いて分析し、グリコタンパク質の対照群としては、ウシ血清フェツイン（bovine serum fetuin，Glycosciences）、商品化されたエリトロポエチンであるエポエチンα（ＬＧ生命科学）を使用した。
【０１０９】
図９の結果中、Ａはウシ血清フェツイン、Ｂは形質転換マウス由来ｈＥＰＯ、Ｃはエポエチンαを示す。
【０１１０】
図９に示すように、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯはＣＨＯ細胞株由来エポエチンαと比較したときに類似するモノ−、ジ−、トリ−の酸性オリゴ糖を有するものの、添加されたテトラ−酸性オリゴ糖の構造は一層多量に有することを確認した。これは、グリコシル化に関与する酵素による形質転換動物におけるＥＰＯの発現時に翻訳後修飾が正常的になされ、このため、乳腺から産生されたＥＰＯは医薬用に使用し易いということを意味する。
そして、その数値を表４に示す。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
７）形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯの活性確認
７−Ａ）形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯのインビトロ活性確認
本発明の形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯのインビトロ活性を確認するために下記の実験を行った。
【０１１３】
ＥＰＯはＥＰＯ受容体（ＥＰＯ receptor，ＥＰＯＲ）と結合して転写因子であるＳＴＡＴ５を活性化させることが知られている。このため、ＳＴＡＴ５が含まれているＢＣＬ−ＸＬルシフェラーゼ発現ベクターを構築した後、ＥＰＯＲが発現されるＭＣＦ−７細胞株（ヒト乳房癌細胞株）に安定的に発現できるようにＢＣＬ−ＸＬルシフェラーゼ発現ベクターを導入した。この細胞（２×１０５／３５ｍｍプレート）に本発明の形質転換マウスのｒｈＥＰＯを含む乳汁タンパク質をそれぞれ０ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μgの量にて１６時間処理した。
【０１１４】
陰性対照群としては、一般的な乳汁タンパク質１μgを細胞（２×１０５／３５ｍｍプレート）に処理し、陽性対照群としてのエポエチンαは１０ＩＵ、１００ＩＵにて処理した。処理１６時間後、相対的なルシフェラーゼ活性をMicroplate Luminometer（Perkin Elmer）を用いて測定した。その結果を図１０に示す。
【０１１５】
図１０の結果から、ＭＣＦ−７細胞に濃度別に形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯを添加した結果、容量依存的な方式によりルシフェラーゼの活性が増大することを確認した。このような増大の度合いはエポエチンα処理時におけるルシフェラーゼ活性度の増大とほとんど同様であるため、本発明の形質転換マウスの乳汁由来ｈＥＰＯが優れたインビトロ活性を示すことが分かった。
【０１１６】
７−Ｂ）形質転換マウスの乳汁内ＥＰＯのインビボの生理活性確認
また、本発明の形質転換マウスの乳汁内ＥＰＯのインビボの生理活性を確認するために、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯを対照群マウスに注入した後（２００ｎｇ／Ｋｇ、１回静脈注射）、時間別に血液を採取して成分を分析した。
その結果を図１１に示す。
【０１１７】
図１１に示すように、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯを添加した結果、時間依存的な方式により血小板、赤血球、血色素、ヘマトクリットが増大することを確認した。このような増大の度合いはエポエチンα処理時における増大の度合いとほとんど同様であることが分かり、その結果、本発明の形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯが優れたインビボ活性を示すことが分かった。
【０１１８】
［実施例３］本発明のＥＰＯ発現ベクターを導入した体細胞を用いた形質転換複製豚の生産製造
【０１１９】
前記実施例１において製造した本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯを導入して体細胞を用いた形質転換複製豚を下記のようにして製造した。
【０１２０】
Ａ）培養液の準備
卵母細胞の体外成熟に使用した培養液はＮＣＳＵ ２３培養液を基本培養液としてBaxter（Baxter Healthcare Co.，U.S.A.）から水１リットルに製造し、これを０．２μmフィルター（Gelman Sci.，U.S.A.）にて濾過した後、ｐＨ７．２〜７．３に調整して５０ml組織培養フラスコ（Falcon，U.S.A.）に４５mlずつ分注して４℃の冷蔵庫に保管しながら約２週間使用した。
【０１２１】
体外成熟用培養液はＮＣＳＵ ２３培養液に１０％卵胞液、０．１mg／mlシステイン、０．０１μg／mlＥＧＦ、１０ＩＵ／mlｅＣＧ及び１０ＩＵ／mlｈＣＧを添加して製造した。体外培養液はＮＣＳＵ ２３培養液に０．４％ ＢＳＡを添加して使用した。
豚卵胞液は２〜７mmサイズの卵胞から卵胞液を採取して１，９００×ｇにて３回遠心分離し、最終的に０．２μmフィルターにて濾過した後、−２０℃の冷蔵庫に保管して使用した。
【０１２２】
Ｂ）卵母細胞の採卵
この実施例において使用した卵巣は屠畜場において屠殺直後に卵巣を摘出してフェニシリンＧ（１００units／ml）及びストレプトマイシン（１００μg／ml）含有生理食塩水（３０〜３５℃）入り魔法瓶に入れて３〜４時間内に実験室に持ち運び、未成熟卵母細胞を採卵する前に卵巣周りの脂肪と結合組織を除去し、生理食塩水にて３〜４回洗浄した後、１８−Ｇ針付き２０ml注射器を用いて２〜７mmの可視卵胞を吸入して卵母細胞を採卵した。卵母細胞の採取時に使用された培養液としては、０．１mg／ml ＰＶＡ添加ＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ（Prather, R. S., et al. 1995. In vitro development of embryos from sinclair miniature pigs: A preliminary report. Theriogenology, 43:1001-1007）を使用した。
【０１２３】
吸入された卵胞液は５〜１０分間静置させた後、沈殿された下部液を５mlのピペットにて吸入して直径６０mm培養皿に移して４０×倍率の倒立顕微鏡（Olympus Co.,Japan）下で卵母細胞を集めた後、体外成熟用基本培養液ＮＣＳＵ ２３にて４〜５回洗浄しながら選抜した。卵母細胞の選抜は卵球細胞の付着度合いと細胞質の充実度に応じて実施し、少なくとも２層以上の卵球細胞層から構成されており、細胞質が均一で且つ充実したものを選抜して下記の実施例に使用した。
【０１２４】
Ｃ）卵母細胞の体外成熟
卵母細胞の体外成熟は体外成熟用培養液を４−ウェルディッシュ（Nunc,Denmark）に５００μlずつ分注して１８時間以上前培養を実施して平衡を誘導した後、体外成熟用培養液に卵球細胞が２層以上であり、且つ、細胞質が充実した１００〜１５０個の卵母細胞を入れ、５％ＣＯ２、９８〜９９％湿度、３９℃のＣＯ２インキュベーターにおいて２０〜２２時間ホルモンが添加された体外成熟用培養液において培養した。次いで、次の２０〜２２時間はホルモン未添加の培養液において培養して合計４０〜４４時間培養した。
【０１２５】
Ｄ）ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）を発現する遺伝子の導入及び的中のためのベクターの製造
前記実施例１に記載の方法に従いヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）を発現するｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターを製作した。
【０１２６】
Ｅ）供与体細胞の採取、培養及び細胞株の確立
この実験に供試された供与体細胞は妊娠３０日齢の豚胎児の組織を採取して利用した。
採取した胎児の頭、四枝及び内臓を除く残りの全体組織を細切して０．０５％トリプシン（Gibco,USA）とＥＤＴＡ（Sigma,USA）が添加されたＤ−ＰＢＳに入れて３分間処理した後、遠心分離を実施してトリプシンとＥＤＴＡを除去した。
【０１２７】
分離された細胞には１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭを加え、２５cm3フラスコ（Falcon,USA）に分注してＣＯ２インキュベーターにおいて培養し、培養１２時間後に底面に付着できなかった細胞は除去し、１０％ＦＢＳが添加された新鮮なＤＭＥＭに交替しながら３〜５日間培養した。継代培養は、供与細胞がフラスコに８０％以上生長したとき、０．０５％トリプシンとＥＤＴＡを処理して浮遊させた後、１／３〜１／４ずつ分けて１０回以上継代して培養した。
【０１２８】
継代培養した供与細胞は１０％ＤＭＳＯが添加されたＤＭＥＭ培養液において凍結保存しておき、核移殖に使用するときには３８〜３９℃の温水に融解して凍結保護剤を除去した後、１０％ＦＢＳが添加された新鮮なＤＭＥＭ培養液により１回継代培養した後に細胞が培養皿に単層を十分に形成して密集状態で２〜３日程度培養することにより細胞周期上のＧ０やＧ１段階に誘導した後に供与細胞として使用した。
【０１２９】
Ｆ）確立された体細胞への外来遺伝子の導入
前記実施例１において製造して−２０℃において保管したｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ ＤＮＡを取り出して溶かした後、使用直前に冷蔵保管したEffectene（Qiagen社製）を用いてそれぞれ混ざらないように注意してＥ-チューブにＤＮＡ濃度が２μg／mlになるように入れて表示した後、Qiagen kit内のエンハンサー８μlをそれぞれチューブに徐々に入れた。
【０１３０】
ＤＮＡ＋エンハンサー＋バッファＥＣの量が合計１５０μlになるように計算してバッファーＥＣを入れ、これを１秒間ボルテックスした後、ＲＴにおいて２〜５分間放置した。ここにEffectene２５μlをそれぞれ入れた後にピペッティングしてＲＴにおいて５〜１０分間放置した。
【０１３１】
また、前記Ｅ）において準備された、培養皿に５０〜８０％敷かれた繊維芽細胞はＤ−ＰＢＳにて約２〜３回１０分間洗浄した後、ＦＢＳ未添加ＤＭＥＭ培地を４mlずつそれぞれ入れた後にインキュベーターに入れておいた。
【０１３２】
１０分後にそれぞれＥ−チューブにＦＢＳ未添加ＤＭＥＭを１mlまで充填してピペッティングしてよく混ぜ、繊維芽細胞及びＤＭＥＭが４ml入れられている皿に入れて遺伝子細胞内に導入した後、インキュベーターにおいてさらに１２〜１８時間放置した。１２〜１８時間後にＤ−ＰＢＳにて洗浄した後にさらにＦＢＳが１０％添加されたＤＭＥＭに交替した。
【０１３３】
Ｇ）ＥＰＯが導入された体細胞ラインの選別、継代培養及び凍結保存
前記Ｆ）において遺伝子細胞内に導入した日から７２時間後から濃度約６００〜８００μg／mlのＧ４１８を用いて約２週間ネオマイシン抵抗性を有する細胞を選別した。このようにして選別された繊維芽細胞は普通３〜５日程度であれば敷かれるようにして継代培養した。
【０１３４】
詳しくは、分離する細胞の培養容器から培養培地を除去し、その培養容器にトリプシン＋ＥＤＴＡ０．２５％を約１．５ml入れてインキュベーターに約３〜５分間入れておいた。顕微鏡にて観察して約７０％ほど細胞が離れている状態であるときにインキュベーターから取り出して、全容ピペットを用いて予め準備しておいたＤ−ＰＢＳが約１０mlほど入れられている１５mlチューブに入れて１５００ＲＰＭにて約３分間遠心分離した。上清除去後に下のペレットに１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ＋Ｇ４１８を約３mlほど入れて十分にペレットを分散させた後、培養容器に入れてインキュベーターにおいて培養した。
細胞の凍結保存のためには前記遠心分離後に得られたペレットにＤＭＳＯを約１mlほど入れて十分にペレットを分散させた後、クライオチューブに入れて−７０℃の極低温槽（ディープフリーザー）において２４時間保管後に−１９６℃の液体窒素タンクに入れて保管した。
【０１３５】
このような本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯが導入された豚体細胞は２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院に寄託番号ＫＣＴＣ １１１６０ＢＰで寄託された。
【０１３６】
Ｈ）核移殖に供与される凍結体細胞の融解及び準備
１．融解：解凍する細胞を貯蔵庫から取り出して３７℃の水槽において解凍した。予め準備しておいたＤ−ＰＢＳが約１０mlほど入れられている１５mlチューブに入れて１５００ＲＰＭにて約３分間遠心分離した。上清除去後にペレットに１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ＋Ｇ４１８を約３mlほど入れて十分にペレットを分散させた後にこれを培養容器に入れ、これをさらにインキュベーターに入れて培養した。
【０１３７】
２.供与核の準備：普通、供与細胞の準備は４−ウェルディッシュにおいて行うが、分離する細胞の培養培地を除去し、皿にトリプシン＋ＥＤＴＡを約２００μlほど入れてインキュベーターに約３〜５分間放置しておいた。顕微鏡にて観察して約７０％ほど細胞が離れている状態であるときにインキュベーターから取り出して２００μlピペットにより細胞を分離して供与細胞準備用培養培地が約３mlほど入れられている皿に入れて細胞を分散させた後、使用時までインキュベーターに入れておいた。
【０１３８】
Ｉ）核移殖
核移殖に使用されたピペットは直径が１ｍｍである毛細管（Narishige，Japan）を用いて補正用、脱核用及び注入用ピペットをそれぞれ製作した。補正用ピペットの外径は１５０〜１８０μm、脱核用及び注入用ピペットは外径を３０〜４０μmに調節した。製作が完了したピペットはＰＶＰにてコーティング処理した後に使用した。体外成熟された受核卵子を０．１％ヒアルロニダーゼ（Sigma,USA）が添加されたＤ−ＰＢＳに入れて卵球細胞を除去し、ＰＶＡ−ＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳにて３回〜４回洗浄した後、０．０５Ｍスクロース（Sigma,USA）及び０．４％ＢＳＡが添加された培養液において細胞質が良好であり且つ第１極体がはっきりと見える卵子だけを選別して使用した。
【０１３９】
核移殖はＮＣＳＵ−２３に０．４％ＢＳＡが添加された培養液小滴に７．５μg／mlのサイトカラシンＢ（Sigma,USA）と０．０５Ｍスクロースを添加して約３０％程度の細胞質を吸入することにより核を除去した。
【０１４０】
上記において脱核した卵子は細胞質が除去された空間にＧ０期やＧ１期に誘導した供与細胞をロードして細胞質と付着しないようにして注入した。供与細胞が注入された卵子は電気融合をするまでＮＣＳＵ−２３に０．４％ＢＳＡが添加されたＩＶＣ培養液にて処理した。
【０１４１】
Ｊ）核移殖受精卵の融合及び活性化
核移殖が完了した卵子の供与細胞と細胞質の融合は電気細胞融合装置（ＢＴＸ，ＵＳＡ）により実施した。このとき、電気融合培養液としては、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２（Sigma,USA）及び０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２（Sigma,USA）が添加された０．２８Ｍマンニトール（Sigma,USA）溶液を使用し、この培養液中において２〜３分間平衡を実施した後、核移殖卵を電気融合用チャンバーに移して両電極の間に一列に注入し、核は電極の陽極（＋）側に向かわせ、細胞質は陰極（−）側に向かわせて電気刺激を加えた。電気融合及び活性化は１５０Ｖ、５０μsec、２パルスを与えて、受精卵の融合と電気活性化を同時処理した。
【０１４２】
核移殖受精卵の融合と活性化を誘導した後、サイトカラシンＢに４時間処理後、０．４％ＢＳＡが添加された培養液において体外培養を実施した。
【０１４３】
Ｋ）受卵豚の準備
複製受精卵を移殖するために妊娠３０〜４０日目の受卵豚にＰＧＦ２αを筋肉注射して流産を誘導した後、２４時間が経過したときにＰＧＦ２αとＰＭＳＧを同時に注射した。その後、７２時間が経過したときにｈＣＧを筋肉注射して過排卵を実施した。４８時間後に複製受精卵を移殖した。
【０１４４】
Ｌ）受精卵の移殖及び妊娠診断
豚の複製受精卵を移殖して産子を産生する目的で外科的な方法により受精卵移殖を行った。先ず、ホルモン処理された受卵豚はケタミンとロムプンを耳静脈に注入して全身麻酔を実施した。麻酔された受卵豚の正中線を中心に広範に剃刀を用いて毛を除去し、消毒を行った。その後、正中線に沿って約１０〜１５ｃｍを切開して子宮を露出させた後、卵巣表面の出血体もしくは卵胞状態を確認し、次いで、複製された受精卵を卵管膨大部に注入した。一部の受卵豚は複製受精卵の体内発達有無を確認するために移殖後７日目に外科的な方法により開腹して移殖された受精卵の発達率を調べてみた。なお、受卵豚の妊娠有無は受精卵移殖後２７〜３０日目に超音波診断器を用いて確認した。
【０１４５】
生産された子豚においてＰＣＲとゲノムサザンブロットにより確認して、乳腺特異的にＥＰＯを発現する形質転換豚が生産されることを確認した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳腺特異的ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）発現ベクター、これを用いた形質転換動物及びこれを用いたＥＰＯの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリトロポエチン（erythropoietin；ＥＰＯ）は胎児の肝や成人の腎臓において主として生成される糖タンパク質であって、赤血球生成を促進し、赤血球数を維持するのに重要な役割を果たす造血ホルモンである。
【０００３】
天然型ヒトＥＰＯは分子量が約３４〜３８ｋｄであり、２４、３８、８３番アミノ酸にＮ-結合型糖鎖結合部位を有しており、且つ、１２６番アミノ酸にＯ-結合型糖鎖結合部位を有しているが、これらの糖鎖部分はＥＰＯの生体内活性に欠かせない役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯは赤血球の形成に欠かせないものであるため、貧血、特に腎臓性貧血の治療に有効であり、ＨＩＶ−感染患者のＡＺＴ治療と関連する貧血、化学治療中の非骨髄癌患者の貧血などの治療にＥＰＯが利用されている。
【０００５】
かような医薬分野において経済的な付加価値が高いＥＰＯなどの産生を極大化させるために、細胞培養法によるＥＰＯの量産方法が汎用されてきている。しかしながら、この方法は、動物の血液を培養培地として利用するため生産コストが高くつき、培養技術に関する専門的な知識が要求される。また、培地成分に含有されている動物のＥＰＯと新たに産生されたＥＰＯを完全に分離することが不可能であるため最終的に得られるＥＰＯの純度が低く、該方法により製造された組換えヒトＥＰＯの場合には天然型ＥＰＯタンパク質とグリコシル化の状態が同一ではないため生理活性も低いという不都合を有している。
【０００６】
これに対し、形質転換動物を用いた目的タンパク質の産生方法は、動物が分泌する体液中に目的タンパク質が含まれるため、既存の細胞培養法に比べて目的タンパク質の分離および精製が容易であり、活性もまた高く維持されることから、この分野に対する関心が急増している。
【０００７】
これまでの形質転換動物の産生技術において目的タンパク質を産生する組織は主としてタンパク質の発現率が高いと知られている乳腺組織である。
【０００８】
しかしながら、これまで開発された乳腺特異的プロモーターを用いて形質転換された動物のタンパク質の産生効率は実際に極めて低いレベルに留まっており、また、既存に報告された乳腺特異的ベクターの場合に異所性発現を示すなど種々の問題点がある。
大韓民国公開特許第２００１−８１４５６号公報は、マウスの乳腺から分離したＷＡＰプロモーター及びヒトのＥＰＯゲノム遺伝子を含むＥＰＯ形質転換発現ベクター並びにその形質転換豚について開示している。
【０００９】
また、大韓民国公開特許第１０−２００４−１０１７９３号公報は、牛のβ-カゼインプロモーターを用いて乳腺においてヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）を発現する形質転換複製牛について開示している。
【００１０】
しかしながら、ｈＥＰＯの乳汁内濃度及び産生されたＥＰＯの活性に対する結果は全くないため、この方法により産生されたｈＥＰＯが実用化できるかどうかは全く推察することができない。
【００１１】
そこで、本発明者は、乳腺においてのみ特異的にヒトＥＰＯを高効率にて産生する発現ベクターを製作し、これを導入した形質転換動物が高い生理活性を有するヒトＥＰＯを産生することを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】大韓民国公開特許第２００１−８１４５６号公報
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２００４−１０１７９３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】A. Gokana, J.J. Winchenn , A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118
【非特許文献２】Parekh RB, et al. (1989) N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of human recombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells and a murine cell line. Biochemistry 28: 7670-7679
【非特許文献３】Tam RC, et al. (1991) Comparisons of human, rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing: differences between serum and urinary erythropoietins. Br J Haematol 79: 504-511
【非特許文献４】Prather, R. S., et al. 1995. In vitro development of embryos from sinclair miniature pigs: A preliminary report. Theriogenology, 43:1001-1007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、乳腺特異的にヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質を発現するベクターを提供するところにある。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、前記ベクターを導入して形質転換された動物の体細胞を提供するところにある。
【００１６】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを導入した形質転換動物を提供するところにある。
【００１７】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを用いた形質転換動物の産生方法を提供するところにある。
【００１８】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記形質転換動物を用いたヒトエリトロポエチンの産生方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、乳腺特異的にヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質を発現する発現ベクターを提供する。
【００２０】
本発明は、乳腺特異的プロモーターであるβ-カゼインプロモーターＤＮＡ配列、その３’側にヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするＤＮＡ配列及びｈＥＰＯ遺伝子の３’側にＷＰＲＥ ＤＮＡ配列を含むｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを提供する。
【００２１】
本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにおいて、前記ｈＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は、これに制限されるものではないが、例えば、配列番号１のＤＮＡ配列であることができる。
【００２２】
本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにおいて、前記β-カゼインプロモーターＤＮＡ配列は、これに制限されるものではないが、例えば、配列番号２のＤＮＡ配列であることができる。
【００２３】
本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにおいて、前記ＷＰＲＥ ＤＮＡ配列は、これに制限されるものではないが、例えば、配列番号３のＤＮＡ配列であることができる。
【００２４】
本発明において、β-カゼインプロモーターＤＮＡ配列、ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするＤＮＡ配列及びＷＰＲＥ ＤＮＡ配列は、上述した配列の他にも、これらのＤＮＡ配列のうち１以上の塩基が欠失、置換されたり、１以上の塩基がこれらのＤＮＡ配列に挿入または付加された、配列同一性を有するこれらの均等物を含む。
【００２５】
具体的に、本発明においては、山羊のβ-カゼインプロモーターを含むｐＢＣ１発現ベクターに配列番号１のヒトＥＰＯ遺伝子を挿入して、ＥＰＯの乳腺特異的な発現を可能にする発現ベクターｐＢＣ１−ｈＥＰＯを提供する。
【００２６】
本発明の発現ベクターｐＢＣ１−ｈＥＰＯは、必要に応じて、インシュレータ、またはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節領域（ＷＰＲＥ：woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element）、ネオマイシン抵抗性遺伝子などをさらに含むことにより、形質転換細胞株を構築し易くし、目的タンパク質発現量の極大化及び発現の安定性を図ることができる。
【００２７】
インシュレータはプロモーターの近くに存在する調節因子の影響を促進し、位置非依存的な発現を促進する因子であり、β-カゼインプロモーターの調節下にタンパク質を安定的に発現できるようにする。
【００２８】
ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡの安定化に寄与してタンパク質合成量を増大可能な調節因子であって、β-カゼインプロモーターの調節下にタンパク質を大量に発現できるようにする。ＷＰＲＥの塩基配列は配列番号３に記載の通りである。
【００２９】
ネオマイシン抵抗性遺伝子は細胞株の構築時に使用されるＧ４１８試薬に対して抵抗性を示す遺伝子であり、β-カゼインプロモーターの調節下にタンパク質を発現する動物細胞株の構築時に効率的な選択的標識遺伝子として働くことができる。ネオマイシン抵抗性遺伝子の塩基配列は配列番号４に記載の通りである。
【００３０】
本発明は前記調節因子をさらに含む発現ベクターの好適な例として、ＷＰＲＥを含むｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター及び前記ｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターにネオマイシン抵抗性遺伝子をさらに含むｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターを提供する。
【００３１】
前記ベクターは本発明のｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクター内ＥＰＯ遺伝子の３’側にＷＰＲＥを挿入したり、ここにさらにネオマイシン抵抗性遺伝子を挿入することにより製造される。
【００３２】
上述した本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯは２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ １１１５９ＢＰで寄託された。
【００３３】
また、本発明の発現ベクターは、必要に応じて、調節因子、すなわち、別のプロモーター、エンハンサー、選択的標識遺伝子、５’非翻訳領域（5’-untranslated region：５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（3’-untranslated region：３’−ＵＴＲ）、ポリアデニル化信号、リボソーム結合配列、ゲノムの特定部位に挿入可能な塩基配列、またはイントロンを適切な位置にさらに含むことができる。
【００３４】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを用いて形質転換させた体細胞を提供する。
本発明の一実施例においては、製作された前記形質転換豚の体細胞は２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ １１１６０ＢＰで寄託された。
【００３５】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを用いて形質転換させた体細胞を脱核された卵子に核移殖して製造された受精卵を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを用いて形質転換させた動物を提供する。
【００３７】
本発明の発現ベクターで形質転換可能な動物は、乳汁を分泌するあらゆる動物、すなわち、豚、マウス、牛、山羊、羊、馬または犬などを含む。
【００３８】
本発明の発現ベクターを用いた形質転換動物の生産方法は通常の方法による。
【００３９】
例えば、形質転換しようとする動物がマウスである場合、健康な個体から受精卵を採取し、受精卵に本発明の発現ベクターを導入した後、精管結紮マウスを用いて偽妊娠マウスを得、これを代理母として卵管内に受精卵を移殖した後、代理母から得られた子孫のうち形質転換された個体を選別する。
【００４０】
形質転換しようとする動物が豚である場合、先ず、健康な個体から卵母細胞を採取し、体外成熟用培養液において培養する。また、豚胎児から採取、培養した供与体細胞に本発明の発現ベクターを導入した後、ベクターの導入された体細胞を選別、培養する。前記体外成熟された卵子から核を除去し、この空間に供与細胞を注入した後、電気融合を通じて核移殖が完了した卵子の供与細胞と細胞質を融合させた後に体外培養する。この複製受精卵を過排卵を誘導した受卵豚に移殖した後、受卵豚から得られた子孫のうち形質転換された個体を選別する。
【００４１】
この後、形質転換されたことが確認された個体から乳汁を集めた後、目的タンパク質を分離および精製することにより有用タンパク質を産生する（A. Gokana, J.J. Winchenn , A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118 ）。
【００４２】
また、本発明は、形質転換動物から産生された乳汁中に発現されたエリトロポエチンを分離・精製する方法を含むヒトエリトロポエチンの産生方法を提供する。
【００４３】
本発明のヒトエリトロポエチンの産生方法において、分離および精製方法としては通常的に使用される方法を使用することができ、具体的には、濾過法またはクロマトグラフィ法などが挙げられる。
【００４４】
このようにして製造される本発明の形質転換動物は乳腺特異的にエリトロポエチンを発現し、既存の方法に比べて極めて高濃度にて乳汁中にエリトロポエチンを発現する。なお、特異的に授乳期中の肺胞細胞においてのみＥＰＯタンパク質を発現する。
【００４５】
その例として、本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯで形質転換されたマウスの場合、２００，０００ＩＵ〜４００，０００ＩＵ／mlレベルの高いＥＰＯ発現率を示す。そもそもＥＰＯは胎児の早期死亡を誘発するため発現させ難いタンパク質であるにも関わらず、本願発明の形質転換動物においては既存の乳腺特異的プロモーターを用いて製造された形質転換動物の乳汁内タンパク質発現率に比べて１０００倍以上の高い発現率を示す。
【００４６】
また、本発明の形質転換動物から産生されたＥＰＯタンパク質は市販中の同種タンパク質が示す以上の安定性及び優れた生理活性を示す。
【００４７】
その例として、本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯで形質転換されたマウスから得られたＥＰＯはシアル酸を多量含有していて、赤血球（ＲＢＣ：red blood cells）前駆細胞に作用して優れたタンパク質活性を示す。
【００４８】
また、本発明の形質転換動物から産生されたＥＰＯタンパク質を投与時に血液内血小板、赤血球、血色素、ヘマトクリットを増大させるといった作用効果を示す。
【００４９】
このため、本発明のＥＰＯ発現ベクター及び形質転換動物は既存のＥＰＯよりも優れた生理活性を有するＥＰＯタンパク質を産生する上で有効に使用可能である。
【００５０】
以下、本発明への理解に一助となるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例により本発明の内容が限定されることはない。
【発明の効果】
【００５１】
本発明のｈＥＰＯ発現形質転換動物は乳腺特異的にエリトロポエチンを発現し、既存の方法に比べて極めて高濃度にて乳汁中にエリトロポエチンを発現する。
【００５２】
また、本発明の形質転換動物から産生されたｈＥＰＯタンパク質は市販中の同種タンパク質が示す以上の安定性及び優れた生理活性を示す。
【００５３】
さらに、本発明の形質転換動物から産生されたｈＥＰＯタンパク質を投与時に血液内血小板、赤血球、血色素、ヘマトクリットを増大させるといった作用効果を示す。このため、本発明のｈＥＰＯ発現ベクター及び形質転換動物は既存のｈＥＰＯよりも優れた生理活性を有するｈＥＰＯタンパク質を産生する上で有効に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターの構造を示す。
【図２】図２は、本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターの構造を示す。
【図３】図３は、本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターの構造を確認したＰＣＲ結果を示す。
【図４】図４は、実験用マウスの乳腺、肝、ＣＨＯ細胞におけるグリコシル化への関与遺伝子の発現様相を分析した結果を示す。
【図５】図５は、本発明のｈＥＰＯ発現ベクターで形質転換させたマウスにおけるｈＥＰＯ発現有無を観察した結果を示す。
【図６】図６は、本発明の形質転換マウスの乳腺組織におけるｈＥＰＯタンパク質の発現を観察した結果図である。
【図７】図７は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯタンパク質を分析した結果図である。
【図８】図８は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯと腎不全症患者の血清内ＥＰＯの２次元電気泳動ゲル写真である。
【図９】図９は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯとエポエチンαのオリゴ糖分析結果である。
【図１０】図１０は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯのインビトロ活性測定結果である。
【図１１】図１１は、本発明の形質転換マウスの乳汁から産生されたｈＥＰＯのインビボ活性測定結果である。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］本発明の最適な乳腺特異的ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）発現ベクターの製作
【００５６】
本発明は乳腺においてｈＥＰＯを分泌する最適ベクターを構築した。
【００５７】
１）ｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターの構築
本発明の乳腺特異的発現ベクターを製作するために、山羊のβ-カゼインプロモーターを有しているInvitrogen社製のｐＢＣ１を用いて、この制限酵素ＸｈｏＩ位置にヒトエリトロポエチンゲノムＤＮＡ（配列番号１）をクローニングした。
【００５８】
２）ｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターの構築
ｈＥＰＯの発現量を増大させるために、前記ｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターにＷＰＲＥ遺伝子を挿入した。
ＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element）はｍＲＮＡの安定化に寄与して、最終タンパク質の合成を増大させるのに関与すると報告された調節因子である。
【００５９】
これらのＷＰＲＥ調節因子をｈＥＰＯの直後に連結してＥＰＯの転写時にｍＲＮＡが一緒に製造されるようにするために、前記１）のｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターからＸｈｏＩ制限酵素の位置に挿入した。
【００６０】
ＷＰＲＥは肝炎ウイルスから順方向プライマー５’−ＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号５）と逆方向プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６）を用いて０．６ｋｂの長さのＰＣＲ産物を増幅し、これをｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。Ｔ−ベクターにクローニングされた０．６ｋｂ ＷＰＲＥをＳａｌＩ及びＸｈｏＩ制限酵素にて切断して挿入断片部位を準備し、ｐＢＣ１−ｈＥＰＯをＸｈｏ１制限酵素にて切断して準備したベクターとライゲーションして２３９７５ｂｐのｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを構築した。
【００６１】
３）ｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターの構築
乳腺特異的なβ-カゼインプロモーターの調節下にｈＥＰＯの産生を極大化可能なベクターだけを有する細胞を効果的に選択するために、ｎｅｏ遺伝子（neomycin-resistance gene）をクローニングした。
【００６２】
Ｇ４１８ドラッグに抵抗可能なｎｅｏ’遺伝子はｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech，Catalog #6085-1）から順方向プライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号７）と逆方向プライマー５’−ＣＧＡＴＣＧＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣ−３’（配列番号８）を用いて１．９ｋｂのＰＣＲ産物を増幅して得、この後、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。
Ｔ−ベクターにクローニングされた１．９ｋｂ ｎｅｏ遺伝子はＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素にて切断して挿入部位を準備した。また、前記２）のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターのａｍｐ’遺伝子（ampicillin-resistance gene）部位をＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素にて切断して除去した後にベクター部位を準備した。
【００６３】
このようにして準備された挿入断片及びベクター部位をライゲーションすることにより、既存に構築されたｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクターにＷＰＲＥ調節因子とｎｅｏ遺伝子が挿入されたｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターを構築した。
【００６４】
この結果として得られた本発明の発現ベクターの構造が図１に示されており、乳腺特異的プロモーターであるβ-カゼインプロモーターの調節下においてｈＥＰＯを発現することになる。
【００６５】
これをｐＢＣ１−５’＋ＷＰＲＥ−Ｒプライマー対及びｈＥＰＯ３＋ＷＰＲＥ−Ｒプライマー対を用いたＰＣＲを通じて３ｋｂ及び１．５ｋｂのＰＣＲ産物を得ることにより、ｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクターの製作が正常になされたことを確認した（図２及び図３）。
【００６６】
上述した本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯは２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院に寄託番号ＫＣＴＣ １１１５９ＢＰで寄託された。
ｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯはＷＰＲＥ調節因子の導入によりＥＰＯタンパク質合成が格段に増大され、且つ、ｎｅｏ’遺伝子の挿入は細胞株の構築に極めて効率的な選択的標識遺伝子として活用される。
【００６７】
［実施例２］ｈＥＰＯ発現形質転換動物の製作及び発現されたｈＥＰＯタンパク質の分析
【００６８】
本発明の乳腺特異的ｈＥＰＯ発現形質転換マウスの産生による生理活性確認及び安定性評価のために下記の実験を行った。
【００６９】
１）マウスの乳腺においてグリコシル化に関与する遺伝子の発現様相分析
【００７０】
タンパク質のグリコシル化はタンパク質の翻訳後修飾の一過程であり、タンパク質の機能を強化して決定する上で重要な役割を果たすことが知られている。このようなグリコシル化は大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、動物細胞またはマウスなどの実験動物においてタンパク質発現時にそれぞれ異なる様相として現れる。これらの中で、ヒトと進化段階が類似している実験動物から産生されたタンパク質のグリコシル化の度合いがヒト生体内において産生されたタンパク質のグリコシル化の度合いと類似していることが知られている。
【００７１】
このため、インビボにて組換えされたヒトＥＰＯタンパク質のグリコシル化に関与するグリコシルトランスフェラーゼの発現をマウスの乳腺、肝及びＥＰＯの産生に有効に利用されているＣＨＯ細胞株において確認した（図４）。
【００７２】
先ず、マウスの乳腺と肝及びＣＨＯ細胞株から全体ＲＮＡを分離した後、３種類のグリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ−V、ＧｎＴ−IIIとＦｕｃ−ＴIV）のプライマー対（表１）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７３】
【表１】
【００７４】
その結果、図４に示すように、２種類のグリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ−IIIとＧｎＴ−V）は肝とＣＨＯ細胞株よりも乳腺（Ｍ.Ｇ.）において相対的に高く発現されることを確認することができ、他のグリコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−Ｔ）もＣＨＯ細胞株よりも乳腺（Ｍ.Ｇ.）において相対的に高く発現されることを確認することができた。
【００７５】
このため、乳腺由来組換えヒトＥＰＯは現在ＣＨＯ細胞株から産生されて市販されているＥＰＯと比較したときにタンパク質のグリコシル化に優れていて、タンパク質の生理活性だけではなく、質的にも区別されることが分かる。
【００７６】
２）形質転換マウスの産生
前記実施例１において構築した乳腺特異的なβ-カゼインプロモーターの調節下にＥＰＯを発現する２３ｋｂのｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクター（図１）を用い、微細注入によって形質転換マウスを製作した（韓国Macrogen社製）。
【００７７】
形質転換マウスとしてはＢＤＦ１（Ｃ５８７ＢＬ／６ ＤＢＡ）を使用し、７３８個の受精卵にｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯを注入し、これらの中で７００個の受精卵を３０匹の代理母に移殖した。数週後に生まれた合計８５匹の生存マウスのうち９匹が形質転換されたことをＰＣＲとゲノムサザンブロットの結果を通じて確認した（表２及び図５Ｂ）。
【００７８】
ＰＣＲに使用したプライマーはＴＧチェック用順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１９）とＴＧチェック用逆方向プライマー５’−ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡ−３’（配列番号２０）であり、このＰＣＲ予想産物のサイズは６００ｂｐであった。
【００７９】
サザンブロットに使用したプローブはｈＥＰＯゲノムＤＮＡであり、配列番号１の配列を含む２.３ｋｂ全体遺伝子を使用した。
【００８０】
図５Ｂは、乳腺特異的にＥＰＯを発現する形質転換マウスのうち代表的な２ラインとして選択されたライン６及びライン３７において確認されたＥＰＯ遺伝子のＰＣＲ及びサザンブロット結果を示す。図５Ｂの結果から、ＥＰＯ遺伝子が染色体内に約１０〜３０コピー挿入され、生殖細胞を通じて次の世代までＥＰＯ遺伝子が伝達されることを確認した。
【００８１】
【表２】
【００８２】
３）形質転換マウスにおけるＥＰＯの乳腺特異的発現確認
前記２）において製作した形質転換マウスにおいてＥＰＯ遺伝子が乳腺特異的に発現されるかどうかを確認した。
【００８３】
先ず、前記形質転換されたマウスから樹立したライン６及びライン３７マウスの種々の組織（乳腺、脳、腎臓、心臓、脾臟、肝、子宮、肺）からそれぞれＲＮＡを抽出した後に当業界における通常的な方法によりＲＴ−ＰＣＲとノーザンブロット分析を行った。
【００８４】
ＥＰＯ ｃＤＮＡを探知するために、ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ｈＥＰＯ特異的プライマーとして順方向プライマー５’−ＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴ−３’（配列番号２１）と逆方向プライマー５’−ＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２２）を使用した。
【００８５】
ノーザンブロット分析に使用したプローブはＥＰＯ full genomic ＤＮＡであって、サザンブロット分析に使用した２．３ｋｂと同じプローブを使用した。
図５Ｃを参照すると、ＲＴ−ＰＣＲ結果から、乳腺（mammary gland：Ｍ.Ｇ.）においては強く発現されるのに対し、腎臓（kidney：Ｋ）において極めて弱く発現されるということが確認された。また、図５Ｄのノーザンブロット分析結果からは、ＥＰＯ遺伝子が他の組織においては全く発現せず、単に乳腺（Ｍ.Ｇ.）においてのみ特異的に発現されることを確認した。（図中、Ｂ：脳、Ｈ：心臓、Ｓ：脾臟、Ｌ：肝、Ｕ：子宮、Ｌｕ：肺を意味する。）
【００８６】
また、形質転換マウスにおけるＥＰＯタンパク質の発現有無及び発現細胞の種類を調べるために、組織に対して免疫組織化学法を行い、このとき、ＥＰＯ抗体としては、Anti-human antibody（ＡＢ−２８６−ＮＡ、Ｒ＆Ｄシステム社製）を使用した。
その結果を図６に示す。
図６Ａの対照群マウスの妊娠１６日目の乳腺においてはＥＰＯの発現を確認することができなかった。これに対し、形質転換マウスの妊娠１６日目（図６Ｂ）と分娩後５日目（図６Ｃ）においては乳腺肺胞細胞においてＥＰＯが発現することを確認することができ、分娩後１６日目（図６Ｄ）においては乳腺肺胞細胞が退行してＥＰＯの発現がなくなることを確認した。
【００８７】
図６に示すように、本発明のｈＥＰＯ形質転換マウスにおいては、授乳期中の乳腺肺胞細胞においてのみＥＰＯタンパク質が特異的な発現を示すことを確認することができた。
【００８８】
４）発現されるＥＰＯタンパク質の分析及び安定性確認
前記２）において製作した形質転換マウスの乳汁中に発現されるＥＰＯタンパク質及びその濃度を当業界における通常的なウェスタンブロット分析法により確認し、このとき、ＥＰＯ抗体としては抗ヒト抗体（（anti-human antibody）（ＡＢ−２８６−ＮＡ，Ｒ＆Ｄシステム社製））を使用した。
その結果を図７に示す。
【００８９】
図７Ａは、形質転換マウスの乳汁を用いたウェスタンブロット分析結果を示すものであり、図中、レーン１と２は陽性対照群であって、ＧＳＴが結合されているＥＰＯ抗原５ｎｇ、１０ｎｇを示すものであり、レーン３は対照群マウスの乳汁、レーン４と５はそれぞれ形質転換マウスライン６と３７の乳汁内のＥＰＯを示すものである。
【００９０】
図７Ａから明らかなように、本発明の形質転換マウス乳汁において３４ＫＤａ分子量を有するタンパク質が発現されることを確認し、これは、全体タンパク質のうち０．７−１．４％を占めている。
【００９１】
また、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯのグリコシル化パターンを確認するために、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ、またはＮ−グリコシダーゼ−Ｆ及びＯ−グリコシダーゼにて切断した後、ウェスタンブロットを実施した。
図７Ｂ中、レーン１は乳汁由来ＥＰＯ、レーン２はＮ−グリコシダーゼ−Ｆにて切断したＥＰＯ、レーン３はＮ−グリコシダーゼ−ＦとＯ−グリコシダーゼにて切断したＥＰＯを示すものである。
【００９２】
図７Ｂの結果から、Ｎ−グリコシル化部位３個とＯ−グリコシル化部位が切断されて最終的に１８ＫＤａのＥＰＯを確認することにより後修飾が正常になされたことを確認した。
【００９３】
また、本発明のｈＥＰＯ形質転換マウスの乳汁内ＥＰＯの濃度を確認するために、ＥＬＩＳＡキット（Human Erythropoietin ELISA，#01630，stem cell technology社製）を用いて定量分析した結果、授乳期１−５日の間に約２００，０００−４００，０００ＩＵ／mlが発現されることを確認した（表３）。
【００９４】
【表３】
【００９５】
また、ＥＰＯの安定性を確認するために形質転換されたマウスの乳汁から産生されたヒトＥＰＯと腎不全症患者の血液を用いて２Ｄ分析を行った。
【００９６】
図８に示す２Ｄ分析結果から、形質転換マウス由来ＥＰＯは電荷とサイズが異種的に現れることが分かる。
【００９７】
一般的にタンパク末端にシアル酸などの糖鎖が多いほどＰＩ値が低下するが、図８において形質転換されたライン６と３７のマウスの乳汁において組換えされたヒトＥＰＯは対照群と腎不全症患者の血清よりも酸性状態を示し、シアル酸を多量含有していることを確認することができる。これに対し、対照群と腎不全症患者の血液は非シアル状態であることを確認した。
【００９８】
シアル酸などの糖鎖はタンパク質の構造と機能に影響を与え、シアル状態のＥＰＯはＲＢＣ前駆細胞に作用してタンパク質活性を有し、非シアル状態のＥＰＯは肝受容体と結合して尿として排出されて活性を有さないことが報告されている（Parekh RB, et al. (1989) N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of human recombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells and a murine cell line. Biochemistry 28: 7670-7679; Tam RC, et al. (1991) Comparisons of human, rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing: differences between serum and urinary erythropoietins. Br J Haematol 79: 504-511）。
【００９９】
これより、本願発明のＥＰＯ発現形質転換マウスから産生されたｈＥＰＯはＲＢＣ前駆細胞に作用してｈＥＰＯタンパク質活性を有することが理解される。
【０１００】
５）形質転換マウスの乳汁からのｈＥＰＯ分離
先ず、本発明の形質転換マウスの乳汁３mlを１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６.８）２０mlに懸濁して膜フィルターに収容し、４℃、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６.８）１，０００mlにて２回一晩中透析した。透析を終えた懸濁液を遠心分離管に移して４，０００ｒｐｍにて３０分間冷蔵遠心分離して沈渣を取り除いた。
【０１０１】
上清約２０mlをｐＭ１００膜（Amicon）フィルターにて濾過し、その濾液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）３００mlに懸濁した後、予め１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）にて十分に平衡化させたＤＥＡＥ sephadex column（２Φ×１５ｃｍ，bed volume ４０）に３ml／minの流速にて注入した。その後、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）５００mlにてカラムを十分に洗浄した後、０ｍＭから３２５ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝液にてグラジエント溶出（各分画のサイズ：３ml、流速：２１ml／ｈ）した。
【０１０２】
前記溶出された各分画のうちＥＰＯを含有する分画を集めた後、これをｐＭ-１０膜にて濾過し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.２）にて３回洗浄して３mlに濃縮した。この液を同じ緩衝液にて予め平衡化させたSephadex Ｇ−１００（２Ｆ １００ｃｍ）に注入した後に流速２４ml／ｈ、分画サイズ３ｍにて溶出した。
【０１０３】
前記溶出された各分画のうちＥＰＯを含有する分画をさらに集めてｐＭ-１０膜にて濾過した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）にて希釈して下記のように免疫精製法を実施した。
【０１０４】
１．ＩｇＧを分離するために、採取した腹水液をProtein-G agarose affinity systemを用いて精製した。
【０１０５】
先ず、腹水液を５倍の結合緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）に希釈し、Protein-A agaroseカラムに徐々に流した後、同じ緩衝液にて洗浄した。洗浄が十分に終わった後、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ，０．０１％アジ化ナトリウム，ｐＨ２.７）にて溶出した。溶出物は同量の中性化緩衝液（１Ｍ Tris，０．０１％アジ化ナトリウム，ｐＨ９）入りチューブに溶出した。この一連の過程は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行い、クマシブルー染色にて確認した。この抗体溶液は３ＬのＰＢＳ溶液にて透析を３日間６回繰り返し行い、抗体量を定量した後に実験に供試した。
【０１０６】
２．免疫親和カラムの製造
上記において精製されたＩｇＧ ５０ｍｇを水素カーボネート緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８. ３）にて４℃において一晩透析した。ＣＮＢｒにより活性化された３ｇのSepharosｅ ４Ｂ（Pharmacia）を１ｍＭ塩酸にて多数回洗浄した。概ね１２mlのゲルをカラムに注ぎ込んで水素カーボネート緩衝液にて洗浄して平衡化させた後、ＩｇＧを入れて一晩中徐々に攪拌しながら反応させた。その後、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８.８）溶液にて常温において３時間震とうして、反応せずに残留している活性化残基を中和した。最終的に３０mlのカーボネート緩衝溶液にて３回、そして３０mlの０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２.５）溶液にて１回洗浄した。０．２％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ緩衝溶液に入れ替え、使用時まで４℃において保管した。
【０１０７】
３．免疫精製
準備されたカラムを０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．５）にて前処理して平衡を維持した。希釈したサンプル溶液２０mlを４℃において一晩中丁寧に攪拌しながらゲルに吸着させ、ゲルをカラムに注ぎ込んだ後、前処理緩衝溶液にて十分に洗浄し、０．１Ｍアセテート緩衝溶液（ｐＨ４．５）を６０ml／ｈの速度にて洗い流した。ゲルに結合したＥＰＯを３０mlの０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２.５）溶液にて溶出した。溶出された分画は直ちに１Ｍトリス溶液（ｐＨ９）を加えて早い時間内にｐＨ７．５まで滴定した。その後、ｐＭ-１０膜（Amicon）をもって溶出された分画を濃縮してｈＥＰＯタンパク質を得た。
【０１０８】
６）ＥＰＯ分子のオリゴ糖分析
本発明の形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯのオリゴ糖構造をＨＰＬＣを用いて分析し、グリコタンパク質の対照群としては、ウシ血清フェツイン（bovine serum fetuin，Glycosciences）、商品化されたエリトロポエチンであるエポエチンα（ＬＧ生命科学）を使用した。
【０１０９】
図９の結果中、Ａはウシ血清フェツイン、Ｂは形質転換マウス由来ｈＥＰＯ、Ｃはエポエチンαを示す。
【０１１０】
図９に示すように、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯはＣＨＯ細胞株由来エポエチンαと比較したときに類似するモノ−、ジ−、トリ−の酸性オリゴ糖を有するものの、添加されたテトラ−酸性オリゴ糖の構造は一層多量に有することを確認した。これは、グリコシル化に関与する酵素による形質転換動物におけるＥＰＯの発現時に翻訳後修飾が正常的になされ、このため、乳腺から産生されたＥＰＯは医薬用に使用し易いということを意味する。
そして、その数値を表４に示す。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
７）形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯの活性確認
７−Ａ）形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯのインビトロ活性確認
本発明の形質転換マウスの乳汁内ｈＥＰＯのインビトロ活性を確認するために下記の実験を行った。
【０１１３】
ＥＰＯはＥＰＯ受容体（ＥＰＯ receptor，ＥＰＯＲ）と結合して転写因子であるＳＴＡＴ５を活性化させることが知られている。このため、ＳＴＡＴ５が含まれているＢＣＬ−ＸＬルシフェラーゼ発現ベクターを構築した後、ＥＰＯＲが発現されるＭＣＦ−７細胞株（ヒト乳房癌細胞株）に安定的に発現できるようにＢＣＬ−ＸＬルシフェラーゼ発現ベクターを導入した。この細胞（２×１０５／３５ｍｍプレート）に本発明の形質転換マウスのｒｈＥＰＯを含む乳汁タンパク質をそれぞれ０ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μgの量にて１６時間処理した。
【０１１４】
陰性対照群としては、一般的な乳汁タンパク質１μgを細胞（２×１０５／３５ｍｍプレート）に処理し、陽性対照群としてのエポエチンαは１０ＩＵ、１００ＩＵにて処理した。処理１６時間後、相対的なルシフェラーゼ活性をMicroplate Luminometer（Perkin Elmer）を用いて測定した。その結果を図１０に示す。
【０１１５】
図１０の結果から、ＭＣＦ−７細胞に濃度別に形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯを添加した結果、容量依存的な方式によりルシフェラーゼの活性が増大することを確認した。このような増大の度合いはエポエチンα処理時におけるルシフェラーゼ活性度の増大とほとんど同様であるため、本発明の形質転換マウスの乳汁由来ｈＥＰＯが優れたインビトロ活性を示すことが分かった。
【０１１６】
７−Ｂ）形質転換マウスの乳汁内ＥＰＯのインビボの生理活性確認
また、本発明の形質転換マウスの乳汁内ＥＰＯのインビボの生理活性を確認するために、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯを対照群マウスに注入した後（２００ｎｇ／Ｋｇ、１回静脈注射）、時間別に血液を採取して成分を分析した。
その結果を図１１に示す。
【０１１７】
図１１に示すように、形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯを添加した結果、時間依存的な方式により血小板、赤血球、血色素、ヘマトクリットが増大することを確認した。このような増大の度合いはエポエチンα処理時における増大の度合いとほとんど同様であることが分かり、その結果、本発明の形質転換マウスの乳汁由来ＥＰＯが優れたインビボ活性を示すことが分かった。
【０１１８】
［実施例３］本発明のＥＰＯ発現ベクターを導入した体細胞を用いた形質転換複製豚の生産製造
【０１１９】
前記実施例１において製造した本発明の発現ベクターｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯを導入して体細胞を用いた形質転換複製豚を下記のようにして製造した。
【０１２０】
Ａ）培養液の準備
卵母細胞の体外成熟に使用した培養液はＮＣＳＵ ２３培養液を基本培養液としてBaxter（Baxter Healthcare Co.，U.S.A.）から水１リットルに製造し、これを０．２μmフィルター（Gelman Sci.，U.S.A.）にて濾過した後、ｐＨ７．２〜７．３に調整して５０ml組織培養フラスコ（Falcon，U.S.A.）に４５mlずつ分注して４℃の冷蔵庫に保管しながら約２週間使用した。
【０１２１】
体外成熟用培養液はＮＣＳＵ ２３培養液に１０％卵胞液、０．１mg／mlシステイン、０．０１μg／mlＥＧＦ、１０ＩＵ／mlｅＣＧ及び１０ＩＵ／mlｈＣＧを添加して製造した。体外培養液はＮＣＳＵ ２３培養液に０．４％ ＢＳＡを添加して使用した。
豚卵胞液は２〜７mmサイズの卵胞から卵胞液を採取して１，９００×ｇにて３回遠心分離し、最終的に０．２μmフィルターにて濾過した後、−２０℃の冷蔵庫に保管して使用した。
【０１２２】
Ｂ）卵母細胞の採卵
この実施例において使用した卵巣は屠畜場において屠殺直後に卵巣を摘出してフェニシリンＧ（１００units／ml）及びストレプトマイシン（１００μg／ml）含有生理食塩水（３０〜３５℃）入り魔法瓶に入れて３〜４時間内に実験室に持ち運び、未成熟卵母細胞を採卵する前に卵巣周りの脂肪と結合組織を除去し、生理食塩水にて３〜４回洗浄した後、１８−Ｇ針付き２０ml注射器を用いて２〜７mmの可視卵胞を吸入して卵母細胞を採卵した。卵母細胞の採取時に使用された培養液としては、０．１mg／ml ＰＶＡ添加ＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ（Prather, R. S., et al. 1995. In vitro development of embryos from sinclair miniature pigs: A preliminary report. Theriogenology, 43:1001-1007）を使用した。
【０１２３】
吸入された卵胞液は５〜１０分間静置させた後、沈殿された下部液を５mlのピペットにて吸入して直径６０mm培養皿に移して４０×倍率の倒立顕微鏡（Olympus Co.,Japan）下で卵母細胞を集めた後、体外成熟用基本培養液ＮＣＳＵ ２３にて４〜５回洗浄しながら選抜した。卵母細胞の選抜は卵球細胞の付着度合いと細胞質の充実度に応じて実施し、少なくとも２層以上の卵球細胞層から構成されており、細胞質が均一で且つ充実したものを選抜して下記の実施例に使用した。
【０１２４】
Ｃ）卵母細胞の体外成熟
卵母細胞の体外成熟は体外成熟用培養液を４−ウェルディッシュ（Nunc,Denmark）に５００μlずつ分注して１８時間以上前培養を実施して平衡を誘導した後、体外成熟用培養液に卵球細胞が２層以上であり、且つ、細胞質が充実した１００〜１５０個の卵母細胞を入れ、５％ＣＯ２、９８〜９９％湿度、３９℃のＣＯ２インキュベーターにおいて２０〜２２時間ホルモンが添加された体外成熟用培養液において培養した。次いで、次の２０〜２２時間はホルモン未添加の培養液において培養して合計４０〜４４時間培養した。
【０１２５】
Ｄ）ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）を発現する遺伝子の導入及び的中のためのベクターの製造
前記実施例１に記載の方法に従いヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）を発現するｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ発現ベクターを製作した。
【０１２６】
Ｅ）供与体細胞の採取、培養及び細胞株の確立
この実験に供試された供与体細胞は妊娠３０日齢の豚胎児の組織を採取して利用した。
採取した胎児の頭、四枝及び内臓を除く残りの全体組織を細切して０．０５％トリプシン（Gibco,USA）とＥＤＴＡ（Sigma,USA）が添加されたＤ−ＰＢＳに入れて３分間処理した後、遠心分離を実施してトリプシンとＥＤＴＡを除去した。
【０１２７】
分離された細胞には１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭを加え、２５cm3フラスコ（Falcon,USA）に分注してＣＯ２インキュベーターにおいて培養し、培養１２時間後に底面に付着できなかった細胞は除去し、１０％ＦＢＳが添加された新鮮なＤＭＥＭに交替しながら３〜５日間培養した。継代培養は、供与細胞がフラスコに８０％以上生長したとき、０．０５％トリプシンとＥＤＴＡを処理して浮遊させた後、１／３〜１／４ずつ分けて１０回以上継代して培養した。
【０１２８】
継代培養した供与細胞は１０％ＤＭＳＯが添加されたＤＭＥＭ培養液において凍結保存しておき、核移殖に使用するときには３８〜３９℃の温水に融解して凍結保護剤を除去した後、１０％ＦＢＳが添加された新鮮なＤＭＥＭ培養液により１回継代培養した後に細胞が培養皿に単層を十分に形成して密集状態で２〜３日程度培養することにより細胞周期上のＧ０やＧ１段階に誘導した後に供与細胞として使用した。
【０１２９】
Ｆ）確立された体細胞への外来遺伝子の導入
前記実施例１において製造して−２０℃において保管したｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯ ＤＮＡを取り出して溶かした後、使用直前に冷蔵保管したEffectene（Qiagen社製）を用いてそれぞれ混ざらないように注意してＥ-チューブにＤＮＡ濃度が２μg／mlになるように入れて表示した後、Qiagen kit内のエンハンサー８μlをそれぞれチューブに徐々に入れた。
【０１３０】
ＤＮＡ＋エンハンサー＋バッファＥＣの量が合計１５０μlになるように計算してバッファーＥＣを入れ、これを１秒間ボルテックスした後、ＲＴにおいて２〜５分間放置した。ここにEffectene２５μlをそれぞれ入れた後にピペッティングしてＲＴにおいて５〜１０分間放置した。
【０１３１】
また、前記Ｅ）において準備された、培養皿に５０〜８０％敷かれた繊維芽細胞はＤ−ＰＢＳにて約２〜３回１０分間洗浄した後、ＦＢＳ未添加ＤＭＥＭ培地を４mlずつそれぞれ入れた後にインキュベーターに入れておいた。
【０１３２】
１０分後にそれぞれＥ−チューブにＦＢＳ未添加ＤＭＥＭを１mlまで充填してピペッティングしてよく混ぜ、繊維芽細胞及びＤＭＥＭが４ml入れられている皿に入れて遺伝子細胞内に導入した後、インキュベーターにおいてさらに１２〜１８時間放置した。１２〜１８時間後にＤ−ＰＢＳにて洗浄した後にさらにＦＢＳが１０％添加されたＤＭＥＭに交替した。
【０１３３】
Ｇ）ＥＰＯが導入された体細胞ラインの選別、継代培養及び凍結保存
前記Ｆ）において遺伝子細胞内に導入した日から７２時間後から濃度約６００〜８００μg／mlのＧ４１８を用いて約２週間ネオマイシン抵抗性を有する細胞を選別した。このようにして選別された繊維芽細胞は普通３〜５日程度であれば敷かれるようにして継代培養した。
【０１３４】
詳しくは、分離する細胞の培養容器から培養培地を除去し、その培養容器にトリプシン＋ＥＤＴＡ０．２５％を約１．５ml入れてインキュベーターに約３〜５分間入れておいた。顕微鏡にて観察して約７０％ほど細胞が離れている状態であるときにインキュベーターから取り出して、全容ピペットを用いて予め準備しておいたＤ−ＰＢＳが約１０mlほど入れられている１５mlチューブに入れて１５００ＲＰＭにて約３分間遠心分離した。上清除去後に下のペレットに１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ＋Ｇ４１８を約３mlほど入れて十分にペレットを分散させた後、培養容器に入れてインキュベーターにおいて培養した。
細胞の凍結保存のためには前記遠心分離後に得られたペレットにＤＭＳＯを約１mlほど入れて十分にペレットを分散させた後、クライオチューブに入れて−７０℃の極低温槽（ディープフリーザー）において２４時間保管後に−１９６℃の液体窒素タンクに入れて保管した。
【０１３５】
このような本発明のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯが導入された豚体細胞は２００７年７月２６日付けにて韓国生命工学研究院に寄託番号ＫＣＴＣ １１１６０ＢＰで寄託された。
【０１３６】
Ｈ）核移殖に供与される凍結体細胞の融解及び準備
１．融解：解凍する細胞を貯蔵庫から取り出して３７℃の水槽において解凍した。予め準備しておいたＤ−ＰＢＳが約１０mlほど入れられている１５mlチューブに入れて１５００ＲＰＭにて約３分間遠心分離した。上清除去後にペレットに１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ＋Ｇ４１８を約３mlほど入れて十分にペレットを分散させた後にこれを培養容器に入れ、これをさらにインキュベーターに入れて培養した。
【０１３７】
２.供与核の準備：普通、供与細胞の準備は４−ウェルディッシュにおいて行うが、分離する細胞の培養培地を除去し、皿にトリプシン＋ＥＤＴＡを約２００μlほど入れてインキュベーターに約３〜５分間放置しておいた。顕微鏡にて観察して約７０％ほど細胞が離れている状態であるときにインキュベーターから取り出して２００μlピペットにより細胞を分離して供与細胞準備用培養培地が約３mlほど入れられている皿に入れて細胞を分散させた後、使用時までインキュベーターに入れておいた。
【０１３８】
Ｉ）核移殖
核移殖に使用されたピペットは直径が１ｍｍである毛細管（Narishige，Japan）を用いて補正用、脱核用及び注入用ピペットをそれぞれ製作した。補正用ピペットの外径は１５０〜１８０μm、脱核用及び注入用ピペットは外径を３０〜４０μmに調節した。製作が完了したピペットはＰＶＰにてコーティング処理した後に使用した。体外成熟された受核卵子を０．１％ヒアルロニダーゼ（Sigma,USA）が添加されたＤ−ＰＢＳに入れて卵球細胞を除去し、ＰＶＡ−ＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳにて３回〜４回洗浄した後、０．０５Ｍスクロース（Sigma,USA）及び０．４％ＢＳＡが添加された培養液において細胞質が良好であり且つ第１極体がはっきりと見える卵子だけを選別して使用した。
【０１３９】
核移殖はＮＣＳＵ−２３に０．４％ＢＳＡが添加された培養液小滴に７．５μg／mlのサイトカラシンＢ（Sigma,USA）と０．０５Ｍスクロースを添加して約３０％程度の細胞質を吸入することにより核を除去した。
【０１４０】
上記において脱核した卵子は細胞質が除去された空間にＧ０期やＧ１期に誘導した供与細胞をロードして細胞質と付着しないようにして注入した。供与細胞が注入された卵子は電気融合をするまでＮＣＳＵ−２３に０．４％ＢＳＡが添加されたＩＶＣ培養液にて処理した。
【０１４１】
Ｊ）核移殖受精卵の融合及び活性化
核移殖が完了した卵子の供与細胞と細胞質の融合は電気細胞融合装置（ＢＴＸ，ＵＳＡ）により実施した。このとき、電気融合培養液としては、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２（Sigma,USA）及び０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２（Sigma,USA）が添加された０．２８Ｍマンニトール（Sigma,USA）溶液を使用し、この培養液中において２〜３分間平衡を実施した後、核移殖卵を電気融合用チャンバーに移して両電極の間に一列に注入し、核は電極の陽極（＋）側に向かわせ、細胞質は陰極（−）側に向かわせて電気刺激を加えた。電気融合及び活性化は１５０Ｖ、５０μsec、２パルスを与えて、受精卵の融合と電気活性化を同時処理した。
【０１４２】
核移殖受精卵の融合と活性化を誘導した後、サイトカラシンＢに４時間処理後、０．４％ＢＳＡが添加された培養液において体外培養を実施した。
【０１４３】
Ｋ）受卵豚の準備
複製受精卵を移殖するために妊娠３０〜４０日目の受卵豚にＰＧＦ２αを筋肉注射して流産を誘導した後、２４時間が経過したときにＰＧＦ２αとＰＭＳＧを同時に注射した。その後、７２時間が経過したときにｈＣＧを筋肉注射して過排卵を実施した。４８時間後に複製受精卵を移殖した。
【０１４４】
Ｌ）受精卵の移殖及び妊娠診断
豚の複製受精卵を移殖して産子を産生する目的で外科的な方法により受精卵移殖を行った。先ず、ホルモン処理された受卵豚はケタミンとロムプンを耳静脈に注入して全身麻酔を実施した。麻酔された受卵豚の正中線を中心に広範に剃刀を用いて毛を除去し、消毒を行った。その後、正中線に沿って約１０〜１５ｃｍを切開して子宮を露出させた後、卵巣表面の出血体もしくは卵胞状態を確認し、次いで、複製された受精卵を卵管膨大部に注入した。一部の受卵豚は複製受精卵の体内発達有無を確認するために移殖後７日目に外科的な方法により開腹して移殖された受精卵の発達率を調べてみた。なお、受卵豚の妊娠有無は受精卵移殖後２７〜３０日目に超音波診断器を用いて確認した。
【０１４５】
生産された子豚においてＰＣＲとゲノムサザンブロットにより確認して、乳腺特異的にＥＰＯを発現する形質転換豚が生産されることを確認した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳腺特異的プロモーターであるβ-カゼインプロモーターＤＮＡ配列、その３´側に ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするＤＮＡ配列及びｈＥＰＯ遺伝子の３´側にウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節領域（ＷＰＲＥ）ＤＮＡ配列を含むｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項２】
前記ｈＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１のＤＮＡ配列である請求項１に記載のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項３】
前記β-カゼインプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号２のＤＮＡ配列である請求項１に記載のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項４】
前記ＷＰＲＥ ＤＮＡ配列は、配列番号３のＤＮＡ配列である請求項１に記載のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のベクターに選択的標識遺伝子としてネオマイシン抵抗性遺伝子をさらに含むｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクター。
【請求項６】
前記ネオマイシン抵抗性遺伝子のＤＮＡ配列は、配列番号４のＤＮＡ配列である請求項５に記載のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクター。
【請求項７】
寄託番号ＫＣＴＣ １１１５９ＢＰで寄託されたものである請求項６に記載のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクター。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の発現ベクターを導入して形質転換させたヒトを除く動物の体細胞。
【請求項９】
寄託番号ＫＣＴＣ １１１６０ＢＰで寄託されたものであるｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯが導入された請求項８に記載の豚の体細胞。
【請求項１０】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入して形質転換させたヒトを除く動物の体細胞を脱核されたヒトを除く動物の卵子に核移殖して製造された受精卵。
【請求項１１】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入して形質転換させたヒトを除く形質転換動物。
【請求項１２】
前記形質転換動物は、豚、マウス、牛、山羊、羊、馬及び犬よりなる群から選ばれるいずれか１種である請求項１１に記載の形質転換動物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の形質転換動物から産生された乳汁中に発現されたエリトロポエチンを分離・精製する段階を含むヒトエリトロポエチンの産生方法。
【請求項１４】
前記形質転換動物は、豚、マウス、牛、山羊、羊、馬及び犬よりなる群から選ばれるいずれか１種である請求項１３に記載のヒトエリトロポエチンの産生方法。
【請求項１】
乳腺特異的プロモーターであるβ-カゼインプロモーターＤＮＡ配列、その３´側に ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするＤＮＡ配列及びｈＥＰＯ遺伝子の３´側にウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節領域（ＷＰＲＥ）ＤＮＡ配列を含むｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項２】
前記ｈＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１のＤＮＡ配列である請求項１に記載のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項３】
前記β-カゼインプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号２のＤＮＡ配列である請求項１に記載のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項４】
前記ＷＰＲＥ ＤＮＡ配列は、配列番号３のＤＮＡ配列である請求項１に記載のｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のベクターに選択的標識遺伝子としてネオマイシン抵抗性遺伝子をさらに含むｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクター。
【請求項６】
前記ネオマイシン抵抗性遺伝子のＤＮＡ配列は、配列番号４のＤＮＡ配列である請求項５に記載のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクター。
【請求項７】
寄託番号ＫＣＴＣ １１１５９ＢＰで寄託されたものである請求項６に記載のｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯベクター。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の発現ベクターを導入して形質転換させたヒトを除く動物の体細胞。
【請求項９】
寄託番号ＫＣＴＣ １１１６０ＢＰで寄託されたものであるｐＢＣ１／ｈＥＰＯ／ＮＥＯが導入された請求項８に記載の豚の体細胞。
【請求項１０】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入して形質転換させたヒトを除く動物の体細胞を脱核されたヒトを除く動物の卵子に核移殖して製造された受精卵。
【請求項１１】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入して形質転換させたヒトを除く形質転換動物。
【請求項１２】
前記形質転換動物は、豚、マウス、牛、山羊、羊、馬及び犬よりなる群から選ばれるいずれか１種である請求項１１に記載の形質転換動物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の形質転換動物から産生された乳汁中に発現されたエリトロポエチンを分離・精製する段階を含むヒトエリトロポエチンの産生方法。
【請求項１４】
前記形質転換動物は、豚、マウス、牛、山羊、羊、馬及び犬よりなる群から選ばれるいずれか１種である請求項１３に記載のヒトエリトロポエチンの産生方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３５４９６（Ｐ２０１０−５３５４９６Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９８４３（Ｐ２０１０−５１９８４３）
【出願日】平成１９年８月８日（２００７．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３８０８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２０２５２
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５１００３５７８３）チョ−エー・ファーム・カンパニー・リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月８日（２００７．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３８０８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２０２５２
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５１００３５７８３）チョ−エー・ファーム・カンパニー・リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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